1. UVOD I PREGLED PODRUČJA ISTRAŽIVANJA

Transcription

1 1. UVOD I PREGLED PODRUČJA ISTRAŽIVANJA - 1 -

2 Alergija na hranu je u porastu u zapadnim zemljama (1-3). Dijagnosticiranje alergije na hranu predstavlja sve veći izazov radi psihosocijalnog i ekonomskog tereta koji ona nosi (4, 5). Točni podaci o proširenosti alergije na hranu, naročito za voće i orašaste plodove (osim kikirikija), nedovoljni su. Godine pokrenut je projekt EuroPrevall, s ciljem ispitivanja prevalencije alergije na hranu u zemljama Europe, interakcije genetskih čimbenika i okoliša u nastanku alergija, istraživanja biološke i biokemijske naravi alergena, dijagnostike alergija i socioekonomske analize (6). U projekt su uključene zemlje sjeverne, srednje i južne Europe, kao predstavnici svih zemljopisnih područja, te Kina i Indija, s azijskim dijelom Rusije, od izvaneuropskih zemalja. Utvrđena je lista prvenstva namirnica nad kojima će se ispitivanja provoditi. U prvu grupu prioriteta spadaju mlijeko, jaja, riba i račići, a od biljne hrane kikiriki, lješnjak, jabuka, breskva i celer. U drugu grupu spadaju kivi, gorušica, sezam, soja, orah i pšenica. Preliminarni rezultati pokazuju nekoliko činjenica: incidencija alergije na hranu viša je u dojenčadi i male djece nego u odraslih procijenjena prevalencija jako se razlikuje diljem Europe postoji zemljopisna varijabilnost u dominaciji alergije na hranu, osim alergije na kravlje mlijeko i jaja koja je podjednako zastupljena u dojenčadi i djece u prvim godinama života U dijagnostici alergije na hranu korištene su metode molekularne dijagnostike. Radi se o novom konceptu dijagnostike alergija, pri kojem se koriste pročišćene molekule dobivene ekstrakcijom iz prirodnog izvora ili tehnikama rekombinacije. Iz alergena hrane izdvojene su glavne alergene molekule pojedinog ploda, analizirana je njihova prostorna struktura, peptidna sekvenca na koju se stvaraju IgE protutijela, i kapacitet IgE vezivanja. Takvi pročišćeni alergeni fiksirani su na podlozi u obliku mikročipa (7). Republika Hrvatska nije uključena u projekt, a od nama najbližih zemalja, u projektu su Italija i Njemačka. Jedan od ciljeva projekta je i istraživanje povezanosti peludne alergije s alergijom na hranu

3 Ovo je istraživanje potaknuto spoznajom da mnoge osobe alergične na peludi pokazuju simptome nakon konzumiranja orašastih plodova i/ili voća i u praktičnom se radu proglašavaju alergičnima na hranu Epidemiološki podaci Studije su pokazale da 2-6% populacije ima alergiju na hranu, dok čak 25% populacije tijekom života ima neki oblik kliničke reakcije na hranu (2, 3). U ranoj dječjoj dobi najčešća je alergija na kravlje mlijeko i jaje, na koju se uglavnom razvije tolerancija nakon nekoliko godina (8, 9). Nisu potpuno jasni mehanizmi razvoja tolerancije, no svakako su interakcije humoralnih i celularnih mehanizama i nisu nužno vezani uz eliminaciju iz prehrane (10). Alergija na hranu biljnog porijekla, na primjer kikiriki, može trajati doživotno i predstavljati po život opasno stanje, a javlja se učestalošću od oko 1%, i to već u prvim godinama života (11). Poznato je da populacija u različitim dijelovima Europe ima različitu senzibilizaciju na pojedine peludi i hranu biljnog podrijetla, prvenstveno orašaste plodove, koštuničavo voće i soju (12, 13). Tako je, na primjer, alergija na orašaste plodove u Izraelu ispod 0,5%, dok je u Norveškoj 7%, na voće je u Švedskoj iznad 6%, dok je u Portugalu 2%. Podaci iz Portugala odnose se na odraslu populaciju. U male se djece alergijske reakcije na voće javljaju češće; prema podacima iz Norveške u čak 11,5% (14). Nije potpuno jasno što uzrokuje takvu razliku u različitim populacijama, no spominju se prehrambene navike, razlika u vegetaciji i stvaranju tolerancije indirektno putem respiratorne sluznice, te različita genetska struktura samih plodova, odnosno populacije. U male su djece česte nealergijske reakcije, potaknute istim medijatorima koji uzrokuju simptome i kod alergijskih reakcija, ali, koliko je do sada poznato, bez posredovanja IgE protutijela. Može se raditi o nespecifičnim reakcijama degranulacije mastocita i oslobađanju biogenih amina, svojstvenim ranoj dobi, ili o nedovoljno osjetljivosti sadašnjih metoda detekcije IgE protutijela. U projektu EuroPrevall - 3 -

4 dokumentirana je podjednaka prevalencija reakcija posredovanih IgE protutijelima, kao i onima koje nisu posredovane IgE protutijelima (6). Pretpostavka da se radi o alergiji na hranu znatno je češća od dokazane alergije (14). Prema različitim studijama kreće se od 3-35% na bilo koju hranu, odnosno između 0 i 4% za kikiriki (15). Alergija dokazana oralnim testom provokacije znatno je rjeđa, za kikiriki iznosi 1,6% (14). Istraživanja uzroka anafilaktičkih reakcija na hranu u djece nisu brojna, ali ima podataka da se anafilaksija javlja u djece učestalošću od 32/100000, a u 92% slučajeva uzrok je bio hrana. U djece mlađe od 3 godine kikiriki je bio zastupljen podjednako kao mlijeko i jaje Razliku u kliničkim reakcijama na pojedine plodove između zemljopisno i etnički različitih skupina uvjetuje razlika u senzibilizaciji na pojedine proteine. U zemljama zapadnog Sredozemlja alergije na voće iz porodice Rosaceae uzrokovane su senzibilizacijom na lipidni transportni protein (LTP), profilin ili senzibilizaciju na oba alergena. Nasuprot tome, izolirana senzibilizacija na PR-10 (patogenesis-related protein, engl., protein koji ima funkciju zaštite biljke od virusne ili bakterijske infekcije) i, u manjem broju, senzibilizacija na PR-10 i profilin, dominira u sjevernoj i središnjoj Europi. Senzibilizacija na LTP prisutna je i u osoba senzibiliziranih na peludi i u onih koje nisu senzibilizirane na peludi, a povezana je naročito s alergijom na breskvu. Senzibilizaciju na profiline karakterizira reakcija na nekoliko peludnih alergena, prvenstveno trava, te voća iz porodice Rosaceae. Senzibilizacija na PR-10 prvenstveno je udružena sa senzibilizacijom na brezu i alergijom na jabuku (16) Križna reaktivnost između peludi i biljne hrane Križna alergija rezultat je zajedničkih epitopa ( trodimenzijski, proteinski ili ugljikohidratni dijelovi molekule na koje se stvaraju IgE protutijela) u različitim biljnim vrstama, a klinički sindrom alergije na hranu uslijed senzibilizacije na peludi opisan je pod engleskim nazivom pollen-food syndrome (17). Najčešće se očituje simptomima oralnog alergijskog sindroma (OAS), koji uključuje senzacije u usnoj - 4 -

5 šupljini u vidu žarenja, peckanja, trnjenja, otoka sluznice, usana ili ždrijela, a spada u blaže alergijske reakcije. Javlja se na sirovo voće i povrće, najčešće konzumirano s korom, s obzirom na alergene dominantne u blažim alergijskim reakcijama koji se u najvećoj koncentraciji nalaze upravo u kori koštunićavog voća (18). Križna reaktivnost pokazuje izrazite geografske i klimatske razlike, ovisno o specifičnoj izloženosti inhalacijskim i/ili nutritivnim alergenima, tako da se podaci o učestalosti OAS-a značajno razlikuju, ovisno o podneblju gdje je istraživanje provedeno, te peludi koja prevladava. Učestalost OAS-a varira od 8% do čak 47-70% (19, 20). U srednjeeuropskim i sjevernoeuropskim državama osobe koje imaju OAS najčešće su primarno senzibilizirane na pelud breze, ambrozije i trava (21-23). Alergija na pelud breze predstavlja najčešću peludnu alergiju u sjevernoj i središnjoj Europi (23). Prema nekim autorima, i do 70% osoba alergičnih na pelud breze i drugih stabala iz porodice Fagales reagira alergijskim simptomima na biljnu hranu (24). Niz plodova ima zajedničke epitope s alergenom breze, no kliničke reakcije najčešće se javljaju nakon konzumiranja voća iz porodice Rosacea (naročito jabuka) i orašastih plodova (prvenstveno lješnjaka) (25). Interesantan je podatak da djeca alergična na peludi češće imaju anafilaktičke reakcije na hranu uslijed križne alergije u sezoni cvatnje peludi (25). Breza je u našoj zemlji najčešći razlog alergiji na pelud stabala (21,22). Kikiriki i lješnjak plodovi su na koje se često javlja križna alergijska reakcija u osoba alergičnih na pelud breze, najčešći su alergeni plodova i uzrok mogućih teških reakcija. Alergeni sadržani u plodu breskve odgovorni su za križne reakcije s peludi breze, a u dijelu stanovništva južne Europe (Španjolska, Italija) predstavljaju najčešće alergene koštuničavog voća iz porodice Rosaceae(16). Križne reakcije rezultat su primarne peludne senzibilizacije i reagiranja sa sličnim, trodimenzijskim IgE epitopima prisutnima u homolognim alergenima plodova (26). Do sada je, temeljem strukture i funkcije koju obavljaju u stanici, klasificirano 28 grupa križno reaktivnih proteina. Nisu svi od njih jednako imunogeni i nemaju svi jednak značaj za kliničke simptome. Imunogenost molekule uvjetovana je molekulskom težinom, duljinom linearnog lanca aminokiselina i stabilnom prostornom strukturom, a da bi se mogla razviti križna reaktivnost, između različitih molekula - 5 -

6 mora postojati više od 35% identične strukture (27). Pelud je nestalna mješavina različitih alergenskih i nealergenskih molekula. Alergenske molekule na koje reagira više od 50% senzibiliziranih osoba smatraju se glavnim alergenima, dok se molekule na koje reagira manje od 20% osoba smatraju sporednima. U odnosu na glavne alergene klasificiraju se molekule koje su s njima križno reaktivne (28). Klinički relevantna alergijska reakcija zahtijeva prepoznavanje barem dvaju različitih epitopa na površini alergena IgE protutijelom. Ti epitopi mogu biti specifični ili križno reaktivni. Štoviše, obrazac IgE reaktivnosti je individualan (29, 30) Nomenklatura alergena Prije otprilike tridesetak godina započinje intenzivna era izolacije i standardizacije različitih alergena koji uzrokuju IgE posredovane reakcije iz prirodnih izvora g. godine je Odbor za nazivlje Međunarodnog udruženja imunoloških društava (International Union of Immunologic Societies) uspostavilo najnoviju nomenklaturu alergena, koja se primjenjuje i danas. U međuvremenu je spektar alergena izrazito proširen, uz nastanak i rekombinantnih alergena. Prema prihvaćenom dogovoru oko terminologije, visoko pročišćeni alergeni se imenuju tako da se prvo pišu prva tri slova roda na latinskom, nakon toga prvo slovo vrste, te na koncu arapski broj koji označava pročišćene alergene vrste koji se međusobno razlikuju po zastupljenosti I homologiji. Glavni alergen označava se brojem 1. Ispred kratice za rod nalazi se oznaka za prirodno dobiven alergen (n) ili alergen dobiven rekombinacijom ( r ). Na primjer, alergen peludi breze označavao bi se kao nbet v1 (n-dobiven prirodnom ekstrakcijom, Betula Verrucosa - latinski naziv za brezu, 1 oznaka glavnog alergena breze). Prirodni alergeni moraju zadovoljiti kriterije pročišćenosti prema strogim standardima kemijske i imunokemijske analize kako bi bili standardizirani

7 1.4. Molekularna struktura alergena U mnogih alergičnih osoba koje imaju jake alergijske reakcije na konzumiranje plodova, prisutna je polisenzibilizacija na peludi i različite vrste biljne hrane. Česta je između botanički nesrodnih biljaka, pa srodnošću nije bilo moguće objasniti stvaranje IgE protutijela odgovornih za fenomen križne reaktivnosti (31). Temelj za stvaranje IgE protutijela na nesrodne biljne vrste leži u samoj strukturi molekule proteina ili ugljikohidrata, odnosno epitopu na koji se stvaraju protutijela (32, 33). Za križnu reaktivnost odgovorno je nekoliko različitih vrsta alergenskih proteina iz skupine panalergena. Filogenetski su to vrlo stari proteini, široko rasprostranjeni u biljnom svijetu, a u biljkama obavljaju obrambene ili važne metaboličke funkcije (31). Protutijela se stvaraju na proteinske ili ugljikohidratne skupine koje predstavljaju alergen. Slijedovi aminokiselina ili glikoproteinskih skupina u različitih biljnih ili životinjskih vrsta mogu biti jednake ili vrlo slične, tako da se stvaraju protutijela na čitave grupe alergenskih komponenti, te dolazi do križne reaktivnosti srodnih ili nesrodnih alergena (29). Nadalje, prostorna molekularna struktura proteinskog lanca (tzv. alergeni epitop), na koji se veže specifični IgE, različita je, podložna ili otporna na djelovanje fizikalnih ili kemijskih utjecaja, npr. želučane kiseline ili temperature. Stabilnost molekule utječe na mogućnost razvoja kliničke reakcije (34). Alergen sadržava proteine ili glikoproteine specifične za vrstu, odnosno zajedničke srodnim ili nesrodnim vrstama. Prema sadašnjoj podjeli, proteini koji izazivaju stvaranje IgE protutijela široko rasprostranjeni u prirodi, tzv. panalergeni, grupiraju se u više skupina. Najrašireniji i najznačajniji za kliničku alergologiju su: 1. proteini nalik proteinu izoliranom iz peludi breze, Bet v1 (prema Betula verrucosa, lat., alergen peludi breze), 2. profilini, 3. proteini koji vežu kalcij, 4. lipidni prijenosni proteini, LTP ( lipid transfer proteins, engl.) i 5. pričuvni proteini sjemena, 6. parvalbumini, 7. tropomiozini, 8. hitinaze i glukanaze (34, 35). Posljednjih godina razvijena je tehnologija koja ekstrakcijom iz skupnog alergena određuje pojedine alergene komponente (proteine ili glikoproteine) (36)

8 Glavni alergen breze je Bet v1, koji ima sličnu strukturu s nizom biljnih proteina, i svi čine zajedničku skupinu o kojoj se govori kao o Bet v1 skupini (31). Modele trodimenzijske strukture Bet v1 molekule i strukturno sličnih molekula iz celera i trešnje (šifre baze podataka proteina, Protein Structure Database), pokazuje slika 1 A i B (31)

9 Slika 1. Modeli trodimenzijske strukture Bet v1 molekule i strukturno sličnih molekula iz celera (Api g1) i trešnje ( Pru av1). Strukture prikazuju tipične alfa/beta nabore odgovorne za križnu reaktivnost. Strukturni elementi α-heliksa (zeleno), β-linearnih slijedova (žuto) i vezivnih peptida (sivo) prikazuje shema A, dok shema B prikazuje modele molekula s hidrofilnim (plavo) i hidrofobnim (crveno) aminokiselinama na površini. U zagradama su šifre baze podataka proteina iz Protein Structure Database ( Preuzeto iz (31) Glavnu strukturu trodimenzijske strukture Bet v1 molekule čine presavijeni sedmolančana protuparalelna β- i dvije kratke α-uzvojnice koje se omataju oko dugog C- kraja α- uzvojnice, formirajući strukturu jake hidrofobne šupljine. Druga i treća β- uzvojnica povezane su P- petljom, čestim strukturnim elementom u mnogim proteinima koji vežu nukleotide (37). P- petlja predstavlja jednu od tri najstabilnije regije na površini Bet v1 molekule i služi kao epitop za križnu reaktivnost s peludnim alergenima drugih stabala iz roda Fagaceae (38)

10 Bet v1 ima, osim alergena drveća iz porodice Fagales, križno reaktivne alergene s voćem iz porodice Rosaceae (jabuka, kruška, breskva, marelica, šljiva, trešnja), orašastim plodovima, povrćem i mahunarkama. Grupu Bet v1 srodnih alergena pokazuje tablica 1. Tablica 1. Proteini u različitim biljnim vrstama srodni proteinu Bet v1 iz breze (nomenklatura prema Odboru za nazivlje Međunarodnog udruženja imunoloških društava) drveće voće povrće leguminoze Kikiriki lješnjak i Aln g 1 Act c 8 Api g 1 Gly m 4 Ara h 8 Bet v 1 Act d 8 Dau c 1 Vig r 1 Cor a 1.04 Car b 1 Ara h 8 Cas s 1 Mal d 1 Cor a 1 Pru ar 1 Fag s 1 Pru av 1 Que a 1 Pru p 1 Pyr c 1 Aln g - Alnus glutinosa ( joha, lat.), Act c- Actinidia chinensis (kivi, lat.), Act d Actinidia deliciosa (kivi, lat.), Api g Apium graveolens (celer, lat.), Ara h Arachis hypogea (kikiriki, lat.), Bet v Betula verrusoca (breza, lat.), Car b Carpinus betula (grab, lat.), Cas s Castanea sativa (divlji kesten, lat.), Cor a Corylus avelana (lješnjak, lat.), Dau c Daucus carota (mrkva, lat.), Fag s Fagus sylvatica (bukva, lat.), Gly m Glycin max (soja, lat.), Mal d Malus domestica (jabuka, lat.), Pru ar Prunus armeniaca (marelica, lat.), Pru av Prunus avium (tešnja, lat.), Pru p Prunus persica (breskva, lat.), pyr c Pyrus communis (kruška, lat.), Que a Quercus alba (hrast, lat.), Vig r Vigna radiata (zlatni grah, lat.) Brojevi iza kratica odnose se na broj proteina, a istaknuti su plodovi koji su analizirani u ovom istraživanju

11 Premda bilo koja hrana može izazvati alergiju, relativno mali broj proteinskih skupina odgovoran je za većinu alergijskih reakcija. Vrste proteina koje, prema Breitenederu (39), uzrokuju većinu alergijskih reakcija, prikazuje tablica 2. Tablica 2. Prikaz glavnih alergena biljne hrane prema vrsti proteina, vrsti ploda i pojedinom alergenom proteinu Skupine biljnih proteina Bet v1 Vrsta hrane voće, povrće, soja Primjer alergena Gly m4 soja, Mal d1- jabuka Kupini 7S globulin kikiriki, orašasti plodovi, Ara h1 kikiriki 11S globulin leguminoze, sjemenke Ara h3 kikiriki Cistein proteaze Profilini Prolamini Nespecifični LTP 2S albumini soja, kivi voće, povrće, leguminoze žitarice voće i povrće kikiriki, orašasti plodovi, sjemenke Gly m1 soja Ara h5 kikiriki, Api g4 celer α- i γ- glijadin pšenica Mal d3 jabuka, Pru p3 breskva, Cor a8 lješnjak Ara h2 - kikiriki Api g Apium graveolens (celer, lat.), Ara h Arachis hypogea (kikiriki, lat.), Cor a Corylus avelana (lješnjak, lat.), Gly m Glycin max (soja, lat.), Mal d Malus domestica (jabuka, lat.), Pru p Prunus persica (breskva, lat.)

12 1.5. Proteinske skupine značajne za nastanak kliničkih simptoma Nisu svi od navedenih proteina koji uzrokuju simptome jednako relevantni za njihov nastanak. Stabilnost u gastrointestinalnom traktu, koja uključuje rezistenciju na želučanu kiselinu i proteaze, kao i termostabilnost alergena, preduvjeti su za nastanak kliničkih simptoma. Dogovorno su, temeljem tih osobina, podijeljeni na skupinu I i II alergena hrane (40). U skupinu I pripadaju proteini koji su termostabilni i otporni na digestiju, izazivaju senzibilizaciju intenstinalnim putem, mogu izazvati teške reakcije i najčešći su alergeni u djece. Specifični su za vrstu. To su alergeni kravljeg mlijeka (kazein, laktalbumin, laktoglobulin), jajeta (ovomukoid, ovalbumin), kikirikija (Ara h1, Ara h2, Ara h3), ribe (parvalbumin), te LTP proteina iz jabuke (Mal d3) i breskve (Pru p3). Glavninu skupine II čine široko rasprostranjeni biljni proteini, panalergeni, koji su termolabilni i podložni razgradnji želučanom kiselinom. Uzrokuju blaže kliničke reakcije (OAS) uslijed križne reaktivnosti, jer primarna senzibiliazcija uslijedi inhalacijskim alergenima. Predstavnici su PR-10 proteini i profilini iz biljnih plodova (40). Ukratko prikazujemo osobine pojedinih proteinskih skupina u biljnom svijetu i njihov značaj u nastanku kliničkih simptoma. PR -10 proteini To su proteini široko rasprostranjeni u biljnom svijetu i sudjeluju u obrani od bakterijskih i virusnih oboljenja. Nalaze se u reproduktivnim tkivima biljke (peludi, sjemenkama i plodovima). Molekule PR proteina su termolabilne, nisu otporne na probavne enzime, a mogu izazvati simptome inhalacijskim putem i ingestijom, preko sluznice gornjeg probavnog trakta. Simptomi su uglavnom blaži, tipa OAS, premda su opisani i teži simptomi, naročito za soju, a primijećeno je i pogoršanje dermatitisa. Bet v1 protein predstavnik je PR-10 proteina koji se nalaze i u drugim biljkama iz porodice Fagacea (hrast, kesten, lijeska), te u plodovima iz porodice Rosaceae

13 (jabuka, kruška, breskva, trešnja, lješnjak), (soja, kikiriki) (41-43). Apiaceae (mrkva, celer) i Fabaceae Profilini Profilini su proteini prisutni u svim eukariotskim stanicama. Oni prisutni u biljkama imaju homologiju višu od 75%. Samo 10-20% osoba senzibiliziranih na peludi ima IgE protutijela protiv profilina, no tada je križna reaktivnost između peludi, povrća i lateksa izrazito visoka. Izazivaju blage simptome inhalacijom, kontaktom i ingestijom. Teži simptomi nisu opisani (44, 45). Lipidni prijenosni proteini, LTP To su panalergeni s različitim stupnjem križne reaktivnosti. Odgovorni su za obranu biljaka od bakterija, gljivica i virusa, i smješteni su u vanjskoj ovojnici biljke. Otporni su na digestiju crijevnim enzimima i temperaturu. Mogu izazvati različitu težinu simptoma, od blagog OAS-a do anafilaksije. Postoji križna reaktivnost između nesrodnih plodova (41). Najčešći su krivci za alergiju na plodove iz porodice Rosaceae. Mnoge osobe alergične na voće iz porodice Rosacea imaju kliničke simptome nakon ingestije botanički nesrodnih plodova. S obzirom da je senzibilizacija na LTP česta i da može uzrokovati teške simptome, lješnjak, orah i kikiriki treba smatrati opasnim plodovima kod osoba alergičnih na Rosacea plodove (12). Pričuvni proteini sjemena Pričuvni proteini nužni su za rast i razvoj biljke. U tu grupu pripadaju 11S globulini, 2S albumini i 7S vicilini, koji su prisutni u većini sjemenki i orašastih plodova koji izazivaju alergije. Otporni su na temperaturu i digestiju. Predstavljaju vodeći uzrok anafilaktičkih reakcija (41, 46, 47)

14 1.6. Metode dijagnostike alergije na hranu Premda je zlatni standard dijagnostike alergije na hranu dvostruko slijepi pokus, on je u slučaju kikirikija vrlo teško provediv iz praktičnih razloga pripreme placeba, te se u praksi često koristi otvoreni test provokacije. Ubodni kožni prick test predstavlja standard in vivo dijagnostike alergija posredovanih IgE protutijelima. Današnji standard u dijagnostici alergije na hranu predstavljaju in vitro (specifični IgE, sige) i in vivo testovi (prick test, epikutani test) koji nisu dovoljno osjetljivi i specifični (35), tako da je dvostruko slijepi test oralne provokacije za sada jedini pouzdan dokaz alergije i predstavlja zlatni standard postavljanja dijagnoze (48). Alergeni koji se koriste za testiranje in vivo i in vitro sadrže alergenski ekstrakt, dakle mješavinu alergenskih i nealergenskih molekula specifične vrste, u kojoj se nalaze za plod specifične i nespecifične molekule. Znajući da se fatalne reakcije na hranu najčešće događaju na orašaste plodove (49, 50), vrlo je važno utvrditi radi li se o alergiji na plod ili je posrijedi križna alergija. Određivanjem specifičnih protutijela ili ubodnim kožnim testom nije moguće utvrditi radi li se o pravoj alergiji na hranu biljnog podrijetla ili o križnoj reaktivnosti sa srodnim peludima (29). Slijedom rezultata dosadašnjih dostupnih pretraga pacijenti su izlagani testovima opterećenja s rizikom razvoja anafilaksije, a eliminacija je bila jedini način sprječavanja alergije. Izolacijom pojedinih proteinskih molekula i analizom specifičnih IgE protutijela na nativne (n) ili rekombinantne (r) molekule, razvila se dijagnostika alergija bazirana na analizi pojedinih alergenskih komponenti (component resolved diagnostics, CRD, engl.) (36, 51). Ona otkriva sasvim novi pristup alergijama, naročito onima na hranu, i jedina pruža uvid u molekularnu strukturu alergena (36, 51, 52). Dijagnostika temeljena na određivanju specifičnih IgE protutijela na pojedine proteinske molekule alergena može kod alergije na plodove razlučiti radi li se o senzibilizaciji na proteine samog ploda ili o križnoj senzibilizaciji na srodne peludi, kakav se stupanj alergijske reakcije može očekivati, a ima pokazatelja da će se

15 temeljem rezultata individualnog alergenskog profila moći odrediti ciljana imunoterapija (34-36, 51). Ekstrahirane prirodne ili rekombinantne alergenske molekule udružene su na mikročip pločici radi istovremenog analiziranja više desetaka alergena iz male količine krvi ili seruma, što je patentirano kao komercijalni test (ISAC Immuno Solidphase Allergen Sorbent test) (53), koji se danas koristi u većini dijagnostičkih pretraga i istraživanja. ISAC test je prvi patentirani test koji za multiplu analizu alergenskih molekula koristi mikročip tehnogiju. Razvijen je na Sveučilištu u Beču, u suradnji s tvrkom VBC Genomics, kasnije preuzet i komercijaliziran od tvrtke Phadia (Uppsala, Švedska) (64), te je poznat pod nazivom ImmunoCAP ISAC. Na istom principu je kasnije razvijen je još jedan test (Advia-Centaur), a rezultati dvaju testova vrlo dobro koreliraju (54). Istraživanja povezanosti IgE protutijela na pojedine komponente alergena i kliničkih simptoma u tijeku su u različitim zemljama, a konačni odgovori glede praktičnog značenja u dijagnostici i terapiji alergijskih bolesti tek se očekuju (51, 55). Posljednjih nekoliko godina mnoštvo je kiničkih istraživanja čiji rezultati govore u prilog rutinskoj primjeni molekularne dijagnostike u alergiji na hranu, no očekivanja su možda ipak bila veća. U Republici Hrvatskoj do sada slično ispitivanje, prema dostupnoj literaturi, nije rađeno ni na odraslima niti na djeci

16 2. HIPOTEZA I CILJEVI ISTRAŽIVANJA

17 2.1. Hipoteza Analiza specifičnih IgE protutijela na pojedine alergenske komponente alergena hrane biljnog podrijetla pomaže u razlikovanju alergije od križne senzibiliziranosti u osoba senzibiliziranih na pelud breze, a pozitivan nalaz protutijela na alergenske molekule direktno je povezan s težinom kliničkih simptoma Ciljevi istraživanja 1) ispitati učestalost senzibilizacije na alergenske komponente specifične za pojedine plodove ( kikiriki, lješnjak, breskvu) u djece alergične na brezu 2) ispitati učestalost križne reaktivnosti između alergena peludi breze i plodova 3) ispitati učestalost alergije na alergene kikirikija u djece alergične na alergene breze 4) ispitati povezanost sige i ubodnog kožnog (prick) testa na alergenski ekstrakt s težinom kliničkih simptoma 5) ispitati povezanost koncentracije IgE protutijela prema specifičnim alergenskim komponentama plodova i težine alergijske reakcije

18 3. ISPITANICI I METODE

19 U ovo presječno, prospektivno istraživanje bilo je uključeno ukupno 108 djece alergične na pelud breze. Uzorci su prikupljani nerandomizirano, prilikom posjeta alergološkoj ambulanti, od listopada do prosinca godine. Analiza uzoraka izvršena je u laboratoriju Klinike za dječje bolesti Zagreb - Klaićeva (specifični IgE), laboratorijima tvrtke Genosense - Beč, Austrija te Klinike za plućne bolesti Golnik - Slovenija (ISAC testovi). Istraživanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Klinike za dječje bolesti Zagreb. Roditelj ili roditelj i ispitanik stariji od 14 godina potpisali su Obrazac informiranog pristanka. Djeca i roditelji bili su upoznati s potrebom i koristi provođenja oralnog testa opterećenja, te su posebno pristali na njegovo provođenje. Trinaestoro djece nije završilo istraživanje; jedno radi gubitka uzorka seruma, a dvanaestero radi nedostatka financijskih sredstava

20 3.1. Ispitanici Djecu uključenu u istraživanje podijelili smo u dvije skupine skupinu ispitanika (skupina A) i kontrolnu skupinu (skupina B). U svakoj je skupini početno bilo po 54 djece u dobi od 1 do 18 godina. Istraživanje nije završilo devetero ispitanika i četvero djece iz kontrolne skupine. Rezultati su obrađeni za 95 djece - 45 djece u skupini A i 50 djece u skupini B. Kao uvjet za uključenje u istraživanje morali su biti ispunjeni sljedeći kriteriji: prisutna alergijska bolest u sezoni cvatnje breze (tijekom ožujka i travnja), i to alergijski rinitis i/ili alergijska astma i/ili atopijski dermatitis, s mogućim pridruženim dijagnozama akutne urtikarije i nutritivne alergije na nespecificirane namirnice, osim plodova kikirikija, lješnjaka ili plodova porodice Rosaceae. dokazana senzibilizacija na brezu ubodnim kožnim testom (prick, engl.) i/ili postojanjem specifičnih IgE protutijela na pelud breze. U skupinu ispitanika svrstana su djeca koja su, osim spomenutog, imala simptome nakon konzumiranja orašastih plodova (kikirikija ili lješnjaka) i/ili plodova iz porodice Rosacea (jabuka, kruška, šljiva, trešnja, višnja, marelica, breskva). Podaci o simptomima dobiveni su detaljnom anamnezom od roditelja, javili su se unutar 30 minuta od konzumiranja plodova, a svrstani su u pet skupina: OAS koji uključuje peckanje, svrbež, otok sluznice usne šupljine ili usne, stezanje u ždrijelu izolirana akutna urtikarija, generalizirana ili ograničena na područje oko usta, sa ili bez angioedema bronhospazam s čujnim piskanjem ili kašljem abdominalni simptomi u vidu povraćanja, naglo nastale boli u trbuhu, sa ili bez urtikarije, sa ili bez bronhospazma

21 sindrom anafilaksije koji uključuje iznenadnu slabost, gubitak tonusa, bljedilo sa znojenjem, sa ili bez generalizirane urtikarije, sa ili bez bronhospazma Djeca koja su imala više simptoma svrstana su prema težem. Simptomi ograničeni na kožu i sluznice, koji su prošli unutar jednog sata sa ili bez antihistaminika, prema iskustvu istraživača, te navodima iz literature (56), svrstani su u grupu lakših simptoma, a uključivali su OAS i urtikariju /angioedem. Bronhospazam, abdominalni simptomi i anafilaksija svrstani su u teže simptome. Kod reakcije nakon konzumiranja orašastih plodova radilo se o jednoj epizodi, nakon čega djeca više nisu konzumirala spomenuti plod. U slučaju blagih reakcija na voće, koje su spontano prolazile, djeca su konzumirala plodove više puta i reakcije su se ponavljale. Kontrolnu skupinu činila su djeca alergična na brezu, prema ranije spomenutim kriterijima, koja su konzumirala orašaste plodove i plodove iz porodice Rosaceae bez kliničkih reakcija. U trenutku ispitivanja djeca nisu bila akutno bolesna i nisu dobivala antihistaminike, a antiastmatska terapija nije prekidana Dob i spol Ukupno 95 djece dobi od 1 do 18 godina, 59 dječaka i 36 djevojčica, podijeljeno je u dvije skupine u skupinu ispitanika (skupina A) bilo je uključeno 45 djece (27 dječaka i 18 djevojčica), u kontrolnu skupinu (skupina B) 50 djece (32 dječaka i 18 djevojčica) Kliničke dijagnoze Kliničke dijagnoze astme, alergijskog rinitisa, atopijskog dermatitisa i urtikarije postavljene su temeljem smjernica Europske akademije za alergologiju i kliničku imunologiju (EAACI ) te Globalne inicijative za astmu (GINA) (57-60)

22 3.2. Metode Djeci uključenoj u istraživanje učinjena je standardna alergološka dijagnostika alergija posredovanih IgE protutijelima prema smjernicama EAACI (61). Ona uključuje in vitro i in vivo metode. Od in vitro testova analizirane su vrijednosti ukupnog IgE i specifičnih IgE protutijela na ekstrakt peludi ili plodova, a od in vivo testova izvođen je ubodni kožni test prick metodom (u daljnjem tekstu prick test). Kao dokaz specifične senzibilizacije bio je dovoljan in vivo ili in vitro test pozitivan. Svoj djeci je učinjen ukupni IgE i sige na pelud breze. Prick test i određivanje vrijednosti sige na ekstrakt plodova nisu učinjeni svoj djeci, ali svi imaju barem jedan od navedena dva testa. Troje djece kod kojih nije učinjen prick test pružala su otpor testu i od njega se odustalo, a u 21 djeteta količina dobivenog seruma nije bila dovoljna. Analiza sige protutijela na alergenske komponente ISAC testom učinjena je svoj djeci. Otvoreni test provokacije proveden je na kikiriki, s obzirom na najčešće javljanje reakcija na kikiriki u našem uzorku djece, te iz razloga što su sva djeca koja su imala reakcije izbjegavala konzumiranje kikirikija. Drugi plodovi nisu testirani Ubodni kožni test prick metodom Test se izvodi nanošenjem kapljice alergena na alkoholom očišćenu kožu volarne strane podlaktice. Kroz kapljicu se iglom duljine 1 mm probode koža, nakon 5-10 minuta kapljica se obriše, a test se očitava nakon 15 minuta mjerenjem promjera nastale urtike u dva smjera. Urtika nastala testiranjem alergena uspoređuje se s pozitivnom i negativnom probom. Kao prva se koristi 1%-tna otopina histamina, a kao negativna kontrola fiziološka otopina. Za testiranje su korišteni komercijalni pripravci ekstrakata alergena (Allyostal, Stallergenes, Francuska). Nalaz kožnog testa

23 interpretiran je pozitivnim pri srednjoj vrijednosti promjera urtike >3 mm u odnosu na negativnu probu (62) Specifična IgE protutijela Za in vitro testove uziman je uzorak od 5-7 ml krvi u epruvete bez koagulansa (Bio Greiner, Austrija), a serum je, nakon centrifugiranja, pohranjen na -20 C do analize. Testirani su sljedeći alergeni: breza, kikiriki, lješnjak i breskva. Koncentracija sige određena je standardiziranom UniCAP imunofluorescentnom metodom (Phadia AB, Uppsala, Švedska), na selektivnom UniCAP 100 analizatoru (Phadia), koristeći reagense istog proizvođača (63). Interval pouzdanosti (confidence interval, CI, engl.) za sige je 0, kiua/l. Nalaz IgE protutijela predstavlja mješavinu IgE protutijela na različite epitope alergena. S IgE, kao i IgE protutijela na pojedine komponente (opisano u idućem poglavlju), analizirani su iz istog uzorka seruma Specifična IgE protutijela na alergenske molekule ISAC test sadržava trajnu kombinaciju od 103 alergenske molekule dobivene prirodnom ekstrakcijom ( n, natural, engl. ) ili tehnikom rekombinacije ( r, recombinant, engl. ), koje su fiksirane na solidnoj podlozi u mikročip formatu. Za analizu je potrebna količina od 20 µl seruma. Svaki alergen fiksiran je u tripletu radi višestrukih mjerenja. Vezanje sige na alergenske komponente utvrđuje se dodatkom anti- sige protutijela obilježenog fluoresceinom i očitava slikovno pomoću mikročip skenera. Rezultati se obrađuju odgovarajućim programom (Microarray Image Analysis Software, MIA, GenePix, Axon instruments, Union City, SAD) i izražavaju semikvantitativno. Kalibracija ISAC metode provedena je prema drugom Internacionalnom referentnom pripravku, IRP, 75/502, kao i metoda Uni CAP, s kojom je usporediva. Rezultati se izražavaju u ISAC standardiziranim jedinicama (ISU). Interval pouzdanosti je 0,3 do 100 ISU. Rezultati se prikazuju u 4 razreda (0-3), kako slijedi: 0 nemjerljiv (<0,3 ISU), 1 nizak (>0,3 - <1 ISU), 2 srednje visok do visok (>1 - <15 ISU), te 3 vrlo visok (>15 ISU)

24 Iz spektra protutijela sadržanih u testu analizirana su protutijela na dva glavna alergena breze - Bet v1 i Bet v2, alergene specifične za kikiriki (Ara h1, Ara h2 i Ara h), s Bet v1 križni alergen kikirikija ( Ara h8), specifične alergene lješnjaka (Cor a8 i Cor a9), te s Bet v1 križni alergen lješnjaka (Cor a1.04), alergen specifičan za breskvu (Pru p3) i s Bet v1 križni alergen breskve (Pru p1), kao predstavnik komponente prisutne u porodici Rosaceae. Slika 4 prikazuje postupak analize u testu

25 a) b) c) Slika 4. Metoda određivanja sige protutijela ISAC testom. Pločica s četiri odvojena mikročipa (a) koja se natopi serumom, spajanje sige protutijela iz seruma (crveno) s alergenom fiksiranim na podlozi (plavo), te fluorescentna anti IgE protutijela (žuto) koja očitava elektronički čitač (b), te isječak pločice na kojem su očitani rezultati testa (c)

26 Test oralne provokacije Za potvrđivanje ili odbacivanje dijagnoze alergije na kikiriki proveden je test otvorene provokacije, prema smjernicama EAACI i Niggemanna (48, 65) u 39 djece iz grupe A. Test provokacije nije učinjen u šestero djece, i to u pet slučajeva nedvojbeno jasnih težih simptoma alergije (anafilaksija, bronhospazam, abdominalni simptomi neposredno nakon konzumiranja), uz jedno od navedenog: pozitivna IgE protutijela na kikiriki >15 kiua/l, pozitivan ubodni kožni test promjera urtike >8 mm (prema (66), te pozitivan nalaz na komponente Ara h1 i Ara h2 (56, 67). U jednog djeteta kod kojeg je dokazana alergija na lješnjak također nije proveden test provokacije na kikiriki. Postavljanje dijagnoze alergije na kikiriki temeljilo se na pozitivnom otvorenom oralnom testu opterećenja s 12 g kikirikija, ili postojanju dotadašnjih klinički nedvojbeno jasnih simptoma alergije uz ranije navedene parametre in vivo i in vitro testova, bez testa provokacije, prema navodima iz literature (67). Test provokacije tumačen je pozitivnim u slučaju pojave bilo kojeg od vidljivog simptoma na koži i/ili sluznicama, bronhospazma, akutnih bolova u trbuhu, povraćanja ili dokumentiranog bljedila sa ili bez pada krvnog tlaka

27 3.3. Statistička obrada Analizom snage testa 0,80 (α razina značajnosti 0,05, učinak veličine d=0,5) utvrđen je broj ispitanika od 50 po skupini ispitanika i kontrolnoj skupini. Za statističku obradu korišten je program MedCalc verzija (MedCalc software, Mariakerke, Belgija). Podaci su analizirani s obzirom na pravilnost raspodjele Kolmogorov-Smirnovljevim testom. Obrađeni su parametrijskim ili neparametrijskim statističkim testovima, ovisno o normalnosti raspodjele i kvantitativnim ili kvalitativnim vrijednostima ( t-test, ANOVA jednosmjernim testom, Mann-Whitney U, Fisherovim ili χ 2 -testom). Kao mjere centralne tendencije prikazane su srednja vrijednost i standardna devijacija (za dob), odnosno medijan, s 95% intervalom pouzdanosti (za veličinu urtike u prick testu, vrijednosti sige). Kvantitativni podaci uspoređivani su Mann-Withneyevim testom, a vjerojatnost povezanosti kvalitativnih parametara (osnovne dijagnoze i simptoma, prisutnih specifičnih IgE protutijela i simptoma) dobivena je korištenjem χ 2 testa. Kvantitativne vrijednosti pojedinih parametara između skupina uspoređivane su Spearmanovim korelacijskim koeficijentom (rho). Dobivene vrijednosti rho znače pozitivan ili negativan stupanj povezanosti, kreću se od -1 (potpuno negativna povezanost) do 1 (potpuno pozitivna povezanost), dok vrijednosti oko 0 znače da povezanosti nema. Pojedini čimbenici dijagnostičkog postupka (promjer urtike u prick testu, sige na ekstrakt i sige na alergenske molekule), vrednovani su kao dijagnostički parametri. ROC analizom (receiver operating characteristic curve, engl.) je utvrđena granična vrijednost s najmanje lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata, postotak osjetljivosti i specifičnosti za pojavu simptoma. Područje ispod krivulje označava snagu pojedinog parametra, s time da indeks 0,9 do 1 označava izvrsnu, 0,8-0,9 dobru, a 0,7-0,8 osrednju snagu testa. Za predviđanje pojave simptoma kod pojedinog parametra (sige na alergenske komponente) korištena je binarna logistička regresija. Rezultati su

28 izraženi pomoću indeksa rizika (OR, odds ratio, engl.), čija vrijednost iznad 1,0 ukazuje na povišenu vjerojatnost pojave simptoma. Sve vrijednosti p <0,05 smatrale su se statistički signifikantnima, a interval pouzdanosti (CI, confidence interval, engl.) izražen je na 95%

29 4. REZULTATI

30 Slijedom hipoteze da određivanje protutijela na pojedine alergenske komponente alergena hrane biljnog podrijetla pomaže u razlikovanju alergije na od križne senzibiliziranosti u osoba senzibiliziranih na pelud breze, te da je nalaz protutijela na alergenske komponente direktno povezan s težinom kliničkih simptoma, prikazani su rezultati analize 95 djece alergične na brezu. Rezultate su prikazani slijedom analiziranja pojedinih parametara, tablično ili grafički

31 4.1. Razdioba prema dobi i spolu Raspon dobi sve djece uključene u istraživanje je 1-18 godina, prosječne dobi 8 godina (x±sd=8± 5); u skupini A raspon je 2-18 godina, prsječne dobi 9 godina (x±sd=9±5); u skupini B raspon je 1-18 godina, a prosječne dobi 7 godina (x±sd=7±5). Dobna razlika između skupine ispitanika i kontrolne skupine statistički nije signifikantna (Mann Whitney test p= 0,865). Tablica 3 pokazuje analizu djece po dobi, s vrijednostima raspona, aritmetičke sredine i standardne devijacije. Slika 2 pokazuje histogram djece u skupinama A i B prema dobi, s naznačenom asimetričnom razdiobom u skupini B. Tablica 3. Razdioba djece prema dobi u skupinama A i B skupina A skupina B N=45 N=50 raspon srednja SD raspon srednja SD vrijednost vrijednost DOB (g) ± ±5 SD standardna devijacija Broj djece Dob / godine a) b) Slika 2. Razdioba djece prema dobi u skupinama A (a) i B (b) Broj 12 djece Dob / godine

32 broj djece Razdioba po spolu pokazuje dominaciju dječaka u ukupnom broju, 59/95 (62%), no statistički razlika između skupine A i B nije signifikantna (p=0,893) (Slika 3) DJEČACI DJEVOJČICE skupina A skupina B Slika 3. Razdioba djece prema spolu u skupinama A i B (χ 2 test, p=0,893) 4.2. Razdioba prema dijagnozi i stupnju težine simptoma Uzete su u obzir osnovne dijagnoze astma, alergijski rinitis, nutritivna alergija (NA) i atopijski dermatitis (AD), s time da je pojedini pacijent mogao imati jednu ili više osnovnih dijagnoza. Astmu je imalo 41/95 (43%) djece, 21/45 (46%) u skupini A, te 20/50 (40%) u skupini B (p=0,653). Alergijski rinitis je imalo 80/95 (84%) djece, 35 (77%) u skupini A i 45 (90%) u skupini B (p=0,177). NA i AD je imalo 17/95 (17%) djece, s jednakim brojem u pojedinoj skupini, i to 11/45 (24%) u skupini A, te 6/50 (12%) u skupini B. Nije postojala statistički signifikantnu razlika u osnovnim dijagnozama između skupina (p=0,189). Rezultate prikazuje slika

33 50 40 broj 30 djece 20 skupina A skupina B 10 0 ASTMA RINITIS AD NA Slika 5. Raspodjela djece prema osnovnim dijagnozama u skupinama A i B (p=0,189, χ 2 test) AD= atopijski dermatitis NA= nutritivna alergija Ispitanici u skupini A podijeljeni su, prema težini simptoma nakon konzumiranja plodova, u dvije podskupine. Pojedini ispitanik je mogao imati više od jedne vrste reakcije, te premda je svrstan prema težoj, u ovoj analizi uzet je u obzir broj ukupnih simptoma i odnos s osnovnom dijagnozom. 41 dijete reagiralo je lakšim simptomima, uključujući OAS i urtikariju, a desetero djece težim (bronhospazam, anafilaksija i /ili abdominalni simptomi). Prema takvoj podjeli grupe A, osnovnu dijagnozu astme ima 18/41 (43%) djece s lakšim simptomima i 5/10 (50%) djece koja imaju teže simptome. Ne postoji statistički signifikantna razlika u dijagnozi astme u grupi s lakšim i težim simptomima (p=0,653)

34 broj djece Rinitis je imalo 23/41 (56%) djece u podskupini s lakšim simptomima, te 7/10 (70%) djece u skupini s težim simptomima, što nije statistički signifikantna razlika (p=0,177). Nutritivnu alergiju (NA) i atopijski dermatitis (AD) imalo je 10/41 (24%) djece u podskupini s lakšim simptomima, te 5/10 (50%) djece s težim simptomima. Statistički nije bila signifikantna razlika (p=0,125). Rezultate prikazuje slika lakši simptomi N=41 teži simptomi N= RINITIS ASTMA AD NA Slika 6. Podjela ispitanika prema težini simptoma i osnovnim dijagnozama (rinitis p=0,177; astma p=0,653; AD / NA p=0,125, χ 2 -test) AD atopijski dermatitis; NA nutritivna alergija Djeca s lakšim, odnosno težim simptomima ne razlikuju se prema zastupljenosti osnovnih dijagnoza

35 Želeći ispitati vjerojatnost povezanosti određene dijagnoze i njihovih kombinacija s pojavom i težinom simptoma, isti podaci su analizirani χ 2 testom, a rezultati prikazani u tablici 3. Tablica 3. Vjerojatnost povezanosti osnovnih dijagnoza s pojavom simptoma (χ 2 test) DIJAGNOZE (N=155) POJAVA SIMPTOMA LAKŠI SIMPTOMI* TEŽI SIMPTOMI** U SVE DJECE N= 45 N=41 N=10 (N= 95) ASTMA N=41 0,654 0,952 0,901 ASTMA N=18 0,320 0,018 RINITIS N=80 ASTMA i RINITIS 0,177 0,122 0,398 0,853 0,328 0,003 N=33 AD 0,189 0,020 0,018 N=17 NA 0,189 0,006 0,018 N=17 AD i NA N=10 0,091 0,004 0,003 *OAS oralni alergijski sindrom i urtikarija ** bronhospazam, abdominalni simptomi, anafilaksija U tablici su prikazane p vrijednosti, a istaknute su statistički signifikantne vrijednosti. Izolirana dijagnoza astme nije povezana s pojavom simptoma nakon konzumiranja plodova, no kada su simptomi prisutni, astma je signifikantno češće povezana s težim simptomima (p=0,018). Dijagnoza rinitisa nije signifikantno češće

36 povezana sa simptomima, ali u kombinaciji s astmom predisponira pojavi težih simptoma (p=0,003). Atopijski dermatitis i nutritivna alergija, pojedinačno i u kombinaciji, nisu povezani s pojavom simptoma, a kada su simptomi prisutni, podjednako često javljaju se lakši i teži simptomi. Kombinacija dijagnoze AD i NA (N=5) u grupi s težim simptomima (N=10) statistički je signifikantna (p=0,016, Fisherov test). Taj rezultat nije prikazan u tablici Usporedba rezultata prick testa, ukupnog i specifičnog IgE na alergenske ekstrakte i molekule Rezultati rutinske alergološke obrade vrijednost ukupnog IgE, promjer urtike prick testa i vrijednost sige protutijela na ekstrakt nutritivnih alergena prikazani su kako slijedi: Kod 42 (93%) djece iz skupine A i 48 (96%) djece iz skupine B analiziran je ukupni IgE (ku/l). U skupini A vrijednosti su ku/l, medijan 294 ku/l, 95%CI , dok je u skupini B raspon vrijednosti ku/l, medijan 207 ku/l, 95% CI Razlika između dvije skupine nije bila statistički signifikantna (Mann-Whitney tets, p= 0,051, slika 7). Prick test je učinjen kod 92 djece; 44 djece iz skupine A (98%) i 48 djece iz skupine B (96%). Specifični IgE je učinjen u 33 djece iz skupine A (73%) i 41 djeteta iz skupine B (82%). U skupini A veći je promjer urtike u prick testu na kikiriki i lješnjak, viša je i razina svakog od pojedinih sige protutijela. Razlika je statistički signifikantna za veličinu urtike u prick testu za kikiriki i lješnjak, te koncentraciju protutijela na kikiriki, lješnjak i breskvu između dviju skupina, dok razlika veličine urtike za breskvu nije statistički signifikantna. Rezultati s pojedinim vrijednostima parametara, vrijednosti medijana i 95% intervala pouzdanosti su prikazani grafički na slikama

37 p=0, kiua/l skupina A skupina B Slika 7. Razlika koncentracije vrijednosti uige (kiua/l) između skupina A i B. Linije prikazuju 95% interval pouzdanosti s prikazom medijana ( ) p<0, urtika/ 8 mm skupina A skupina B Slika 8. Usporedba veličine urtike (mm) u prick testu na kikiriki između skupina A i B. Ispitanik je prikazan kružićem ( ), a linije pokazuju granice 95% intervala pouzdanosti i medijan

38 16 14 p<0, urtika/ 8 mm skupina A skupina B Slika 9. Usporedba veličine urtike (mm) u prick testu na lješnjak između skupina A i B. Ispitanik je prikazan kružićem ( ), a linije pokazuju granice 95% intervala pouzdanosti i medijan. 9 8 p=0, urtika/ 5 mm skupina A skupina B Slika 10. Usporedba veličine urtike (mm) u prick testu na breskvu između skupina A i B. Svaki ispitanik prikazan je kružićem ( ), a medijan je prikazan linijom

39 100 p<0, kiua/l skupina A skupina B Slika 11. Usporedba vrijednosti specifičnih IgE protutijela na kikiriki između skupina A i B. Svaki ispitanik prikazan je kružićem ( ), a linije prikazuju 95% interval pouzdanosti i medijan p=0, kiua/l skupina A skupina B Slika 12. Usporedba vrijednosti specifičnih IgE protutijela na lješnjak između skupina A i B. Svaki ispitanik prikazan je kružićem ( ), a linije prikazuju 95% interval pouzdanosti i medijan

40 30 25 p=0, kiua/l skupina A skupina B Slika 13. Usporedba vrijednosti specifičnih IgE protutijela na breskvu između skupina A i B. Svaki ispitanik prikazan je kružićem ( ), a linije pokazuju 95% interval pouzdanosti i medijan Specifična IgE protutijela prema specifičnim i križnim alergenskim molekulama Glavni alergeni breze su Bet v1 i Bet v2. U naših je ispitanika signifikantno češće prisutan Bet v 1 (58/95,61%) u odnosu na Bet v2 (21/95, 22%). Budući da je Bet v1 protein onaj koji uzrokuje senzibilizaciju na strukturno jednake proteine biljaka, s njime smo uspoređivali ostale rezultate. Na slici 14 prikazane su vrijednosti sige na Bet v1 i Bet v2 u sve djece

41 p<0, ISU Bet v1 Bet v2 Slika 14. Usporedba vrijednosti specifičnih IgE protutijela na Bet v1 (N=58) i Bet v2 (N=21) u sve djece. Kružićima ( ) su prikazani pojedini ispitanici. Analizom sige protutijela na alergenske komponente razlučena su protutijela križno reaktivna s Bet v1 - Ara h8 iz kikirikija, Cor a 1.04 iz lješnjaka i Pru p1 iz breskve i ostalih plodova iz porodice Rosaceae, od specifičnih komponenti za pojedini plod: Ara h1, Ara h2 i Ara h3 za kikiriki, Cor a8 i Cor a9 za lješnjak i Pru p3 za breskvu. Križno pozitivni alergeni analizirani su zajedno s alergenima breze jer se pojavljuju podjednakom učestalošću od 56-72%, a u 85% slučajeva sva su tri prisutna u kombinaciji. Specifične alergenske komponente analizirane su samo za plodove kikirikija, lješnjaka i breskve (Ara h1, Ara h2 i Arah3 za kikiriki, Cora 8, Cor a9 za lješnjak, Pru p3 za breskvu). Za usporedbu je korišten Mann-Whitney test

42 4.5. Usporedba specifičnih IgE protutijela na Bet v1, Ara h8, Cor a1.04 i Pru p1 između skupina A i B Bet v1 je u skupini A prisutan u višim koncentracijama u odnosu na skupinu B. Vrijednosti u skupini A kreću se između ISU, s medijanom 5,8 ISU, 95% intervalom pouzdanosti 3,8-12,4; u skupini B vrijednosti su između 0-61 ISU, s medijanom 1,1 ISU i 95% intervalom pouzdanosti 0-4,5. Razlika je statistički signifikantna (p= 0,026) (Slika 15) p=0, ISU skupina A skupina B Slika 15. Usporedba vrijednosti specifičnih IgE protutijela na Bet v1 između skupina A i B. Kružićima su prikazani pojedini ispitanici ( ), a linijom je prikazan 95% interval pouzdanosti i medijan. U skupini A bilo je 20/45 (44%) djece pozitivno na Ara h8, 23/45 (51%) pozitivno na Cor a1.04, 25/45 (55%) pozitivno na Pru p1, dok je u skupini B bilo 14/50 (28%) Ara h8,19/50 (38%) Cor a1.04, te 13/50 (26%) pozitivnih na Pru p1. Vrijednosti specifičnih IgE križnih alergena analiziranih kao zajednički parametar statistički su signifikantno više u skupini A (p=0.042) (Slika 16)

43 ISU 250 p=0, grupa A grupa B Slika 16. Usporedba vrijednosti specifičnih IgE protutijela na križne alergene Ara h8, Cora a 1.04 i Pru p1 između skupina A i B. Kružićima su prikazani pojedini ispitanici ( ), a linijom je prikazan 95% interval pouzdanosti i medijan Usporedba specifičnih IgE protutijela na alergene plodova između skupina U skupini A je 10/45 (22%) djece imalo IgE protutijela na Ara h1, 11/45 (24%) djece na Ara h2, a 4/45 (8%) na Ara h3 komponentu. U grupi B 11/50 (22%) imalo je IgE na Ara h1, 5/50 (10%) na Ara h2, te 2/50 (4%) na Ara h3 komponentu. Cor a8 bio je pozitivan u 4/45 (8%), a Cor a9 u 4/50 (8%), dok je Pru p3 bio pozitivan u 7/45 (15%) djece iz grupe A. U skupini B bilo je 3/50 (6%) Cor a8, 1/50 (2%) Cor a9 i 4/50 (8%) Pru p3. Specifična IgE protutijela na Ara h1, Ara h2 te Ara h1, Ara h2 i Ara h3 alergene analizirane kao zajednička varijabla, pojavljuju se signifikantno češće i u višim koncentracijama u skupini A (p=0,032, p=0,049, p= 0,013), dok specifična IgE protutijela na komponente lješnjaka i breskve ne pokazuju signifikantne razlike između skupina A i B (p=0,072, p=0,284). Rezultati su prikazani na slikama