VPLIV STACIONARNIH IN DINAMIČNIH POGOJEV NA PRITRJEVANJE IN ODSTRANJEVANJE BAKTERIJE ESCHERICHIE COLI

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI ZDRAVSTVENA FAKULTETA SANITARNO INŽENIRSTVO 2. STOPNJE MATEJA ARLIČ VPLIV STACIONARNIH IN DINAMIČNIH POGOJEV NA PRITRJEVANJE IN ODSTRANJEVANJE BAKTERIJE ESCHERICHIE COLI IMPACT OF STATIONARY AND DYNAMIC CONDITIONS ON ADHESION AND DETACHMENT OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI MAGISTRSKO DELO MENTOR: doc. dr. Rok Fink, dipl. san. inž. SOMENTORICA: asist. dr. Martina Oder, dipl. san. inž. LJUBLJANA, 2016

2 ZAHVALA Želim se zahvaliti mentorju doc. dr. Roku Finku in somentorici asist. dr. Martini Oder za vodenje in njun čas, ki sta ga namenila zame, ter prijazno pomoč pri izdelavi moje magistrske naloge. Zahvala gre tudi doc. ddr. Klemnu Bohincu za opravljeno recenzijo in lektorici Meliti Plešnik za lektoriranje naloge. Zahvaljujem se tudi možu za moralno podporo v času pisanja magistrske naloge.

3 IZVLEČEK Oprijem bakterijskih celic na površine materialov ni nov pojav, toda tudi po več kot 60 letih raziskovanj znanstveniki še danes ne morejo z gotovostjo trditi, zakaj na nekaterih površinah biofilmi nastajajo hitreje in intenzivneje, na drugih pa ne. Na pritrjevanje in odcepljanje bakterijskih celic imajo velik vpliv strižne sile. Te nastanejo pri hidrodinamičnih pogojih laminarnega in turbulentnega toka, kar lahko s pridom uporabimo pri čiščenju cevnih sistemov s pomočjo t. i. CIP (ang. Cleaning in Place) sistema čiščenja. Namen raziskave je bil ugotoviti vpliv laminarnega in turbulentnega toka na oprijem in odcepljanje bakterije Escherichie coli na nerjavnih ploščicah AISI 304 s hrapavostjo 25 nm in 986 nm. V magistrski nalogi smo z metodo merjenja koncentracije barvila kristal vijoličnega, ki se sprosti iz predhodno obarvanih bakterijskih celic, najprej ugotavljali vpliv laminarnega in turbulentnega toka na pritrjevanje bakterij Escherichia coli. V drugem delu raziskave pa smo ugotavljali vpliv dinamičnih pogojev na odstranjevanje predhodno oprijetih bakterij s površin. Poskuse smo izvajali s pomočjo pretočne komore, s katero lahko ustvarimo turbulentni in laminarni tok. Vzporedno smo naredili tudi rastno krivuljo. Ugotovili smo, da se največ bakterijskih celic oprime, ko so izpostavljene turbulentnemu toku. Ugotovili smo tudi, da hrapavost površin vpliva na sam oprijem bakterijskih celic. Več celic se je oprijelo na bolj hrapavo površino. Hkrati pa naši rezultati kažejo, da je na bolj hrapavi površini turbulentni tok pri odstranjevanju celic bolj učinkovit kot laminarni. Pri manj hrapavi površini rezultati kažejo na to, da ni statistične razlike pri odstranjevanju bakterijskih celic s površine med laminarnim in turbulentnim tokom. Z našimi ugotovitvami smo potrdili hipotezo, da se oprijem bakterijskih celic razlikuje glede na različno hrapavost materiala. Hipotezo, ki pravi, da turbulentni tok odstrani največ bakterijskih celic ne glede na material, lahko le delno potrdimo, saj to velja le za bolj hrapave površine. Pričakovali smo, da se bo več bakterijskih celic oprijelo v stacionarnih pogojih, vendar so rezultati pokazali, da se jih največ oprime v turbulentnem toku. Na podlagi te ugotovitve smo tretjo hipotezo, ki pravi, da se največ bakterijskih celic oprime v stacionarnih pogojih, zavrnili. Ključne besede: biofilm, strižne sile, dinamični pogoji, pritrditev, odcepitev, CIP sistem čiščenja, Escherichia coli

4 ABSTRACT Adhesion of bacterial cells to material surfaces is not a new phenomenon, however the scientists even after more than 60 years of research cannot with certainty explain why on some surfaces biofilm forms faster and with more intensity than on other surfaces. Shear forces have a major influence on adhesion and detachment of bacterial cells. These forces occur under hydrodynamic conditions of laminar and turbulent flow, which can be usefully applied in cleaning of piping systems with the help of the so called CIP (Cleaning in Place) cleaning system. The purpose of this research was to determine the influence of the laminar and turbulent flow on the adhesion and detachment of bacteria Escherichia coli on AISI 304 stainless tiles with surface roughness of 25 nm and of 986 nm. In this master thesis, we first established the impact of laminar and turbulent flow on the adhesion of bacteria Escherichia coli using the method of measuring the concentration of crystal violet released from the prestained bacterial cells. In the second part of the research, we observed the impact of dynamic conditions on removing of the previously adhered bacteria from surfaces. The experiments were conducted with help of the flow chamber with which the turbulent and laminar flow can be created. In parallel, we established the growth curve. It was noted that the largest number of bacterial cells adhere when being exposed to the turbulent flow. It has also been observed that the roughness of surface impacts the adhesion of bacterial cells. More cells were adhered on surfaces with higher roughness value. At the same time our results show that in terms of removing bacterial cells from the surface, the turbulent flow is on rougher surfaces more effective than the laminar. The results show that with low surface roughness, there is no statistical difference between the laminar and the turbulent flow in terms of removing bacterial cells from the surface. These findings supported our hypothesis stating that the adhesion of bacterial cells varies according to the roughness of material. The hypothesis stating that the turbulent flow removes the most bacterial cells regardless of the material can be confirmed only partially because this applies only for surfaces with higher roughness. We expected that the largest number of bacterial cells will adhere in steady-state conditions, nevertheless the results showed that this number is largest in turbulent flow. Based on this finding, the third hypothesis stating that the adhesion of bacteria is highest under stationary conditions was discarded. Key words: biofilm, shear forces, dynamic conditions, adhesion, detachment, CIP cleaning system, Escherichia coli

5 KAZALO 1 UVOD PREGLED LITERATURE Bakterija Escherichia coli Vpliv bakterijskih lastnosti na tvorbo biofilma Vpliv lastnosti materialov na tvorbo biofilma Pritrjevanje bakterij na površine in tvorba biofilma Odcepljanje Disperzija Abrazija Erozija Vpliv strižnih sil na tvorbo in odstranjevanje biofilma CIP sistem čiščenja NAMEN IN HIPOTEZE Namen Hipoteze MATERIALI IN METODE Testne ploščice, uporabljene v raziskavi Uporabljeni bakterijski sev in izdelava rastnih krivulj Opis sistema pretočne komore Ugotavljanje vpliva strižnih sil na odcepitev in pritrditev bakterijskega seva Ugotavljanje količine bakterijskih celic na površinah Statistična obdelava podatkov: parni Studentov t-test z dvorepo porazdelitvijo REZULTATI Rastne krivulje Oprijem bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti v stacionarnih pogojih... 24

6 5.3 Oprijem bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti v dinamičnih pogojih (laminarni tok) Oprijem bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti v dinamičnih pogojih (turbulentni tok) Primerjava oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm pri treh različnih pogojih inkubacije Primerjava oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 986 nm pri treh različnih pogojih Vpliv laminarnega in turbulentnega toka na odstranjevanje pritrjenih bakterijskih celic E. coli ATCC s površin kovinskih ploščic hrapavosti 25 nm in 986 nm RAZPRAVA Rastna krivulja Oprijem bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti Vpliv laminarnega in turbulentnega toka na odstranjevanje pritrjenih bakterijskih celic E. coli ATCC s površin kovinskih ploščic SKLEP LITERATURA PRILOGE... 51

7 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Statistična analiza rezultatov izmerjene optične gostote sproščenega barvila iz oprijetih celic na površinah kovinskih ploščic hrapavosti 25 nm in 986 nm, gojene v turbulentnem toku, laminarnem toku in v stacionarnih pogojih Preglednica 2: Statistična analiza rezultatov izmerjene optične gostote sproščenega barvila iz oprijetih celic na površinah kovinskih ploščic hrapavosti 25 nm in 986 nm, gojene v turbulentnem toku, laminarnem toku in v stacionarnih pogojih Preglednica 3: Statistična analiza rezultatov izmerjene optične gostote sproščenega barvila iz oprijetih celic na površinah kovinskih ploščic hrapavosti 25 nm po izpiranju s turbulentnim tokom, z laminarnim tokom in v stacionarnih pogojih Preglednica 4: Statistična analiza rezultatov izmerjene optične gostote sproščenega barvila iz oprijetih celic na površinah kovinskih ploščic hrapavosti 986 nm po izpiranju s turbulentnim tokom, z laminarnim tokom in v stacionarnih pogojih

8 KAZALO SLIK Slika 1: Razvoj biofilma (Shunmugaperumal, 2010) Slika 2: Disperzija biofilma (Fink, 2015)... 8 Slika 3: Proces abrazije (Fink, 2015)... 9 Slika 4: Proces erozije (Fink, 2015)... 9 Slika 5: Shematski prikaz strižnih sil, ki delujejo na bakterijsko celico, povzročenih z laminarnim in turbulentnim tokom (Fink in sod., 2015) Slika 6: Sistem pretočne komore s hladilno/ogrevalno enoto, polietilenskim nosilcem in peristaltičnima črpalkama za ugotavljanje vpliva laminarnega in turbulentnega toka na pritrditev in odstranjevanje mikroorganizmov s površin materialov (foto: Fink in sod., 2015) Slika 7: Rastne krivulje bakterije E. coli ATCC 35218, gojene v stacionarnih pogojih, laminarnem toku in turbulentnem toku pri temperaturi inkubacije 37 C Slika 8: Povprečne vrednosti oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in 986 nm v stacionarnih pogojih pri temperaturi inkubacije 37 C Slika 9: Povprečne vrednosti oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in 986 nm v dinamičnih pogojih (laminarni tok) pri temperaturi inkubacije 37 C Slika 10: Povprečne vrednosti oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in 986 nm v dinamičnih pogojih (turbulentni tok) pri temperaturi inkubacije 37 C Slika 11: Povprečne vrednosti oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm v stacionarnih in dinamičnih pogojih (laminarni in turbulentni tok) pri temperaturi inkubacije 37 C Slika 12: Povprečne vrednosti oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 986 nm v stacionarnih in dinamičnih pogojih (laminarni in turbulentni tok) pri temperaturi inkubacije 37 C Slika 13: Vpliv turbulentnega in laminarnega toka na odstranjevanje pritrjenih bakterijskih celic E. coli ATCC s površin kovinskih ploščic s hrapavostjo 25 nm in 986 nm po 48 urah inkubacije (gojenja) pri temperaturi 37 C

9 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI EPS angl. extracellular polymeric substance; slo. zunajcelične polimerne snovi; CIP angl. Cleaning in Place; slo. čiščenje celotnega sistema obrata na mestu delovanja; E. coli Escherichia coli; biofilm združba mikroorganizmov, ki so pritrjeni na površino; DLVO Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek teorija; Qmax PBS AFM OD rpm Rq maksimalni pretok; fosfatni pufer; angl. Atomic Force Microscopy; slo. mikroskop na atomsko silo; optična gostota pri 620 nm; število vrtljajev na minuto; kvadratična srednja hrapavost;

10 1 UVOD Že več kot 60 let je od prvega poročanja o biofilmih, ki so prisotni na različnih površinah, še posebej v živilski industriji, okolju in biomedicini (Simões et al., 2010). V naravi obstaja več kot 99 % vseh bakterij v obliki biofilmov (Shunmugaperumal, 2010). Pritrditev na hidrofilne površine je naravna težnja mikroorganizmov, da se lahko razmnožujejo in sami sebe vgrajujejo v zaščitno plast, ki jo sestavljajo zunajcelične polimerne snovi; le-te pa tvorijo biofilm. Zunajcelične polimerne snovi (ang. Extracellular Polymeric Substance-EPS) dajejo bakterijam v biofilmu zaščito pred neugodnimi okoljskimi pogoji (tudi razkuževanjem in čiščenjem), zaradi česar lažje preživijo in se bolj razmnožujejo. Oprijem mikrobov na površine in posledična tvorba biofilma je bila raziskana na različnih površinah. Posebej problematični so v živilski industriji, kot so pivovarstvo, predelava mleka in mlečnih izdelkov, gotovi proizvodi, predelava perutninskega in rdečega mesa (Simões et al., 2010). Škodo povzročajo tako v zdravstvu kot tudi v različnih gospodarskih panogah. Nastanek in obstoj biofilmov ima za zdravstvo velike posledice, saj se jih težko nadzoruje in še težje odstranjuje z medicinskih pripomočkov. Povzročajo kvarjenje hrane in so možen vir zdravstvenih problemov, kot so alimentarne toksikoinfekcije. Posledično je nujno potrebno antibiotično zdravljenje, vendar je z večkratnim zaužitjem antibiotika tudi večja možnost, da bakterije postanejo odporne na antibiotike (Srey et al., 2013; Ciofu in Tolker-Nielsen. 2011; Capita in Alonso-Calleja, 2013). V različnih panogah v gospodarstvu velikokrat uporabljajo konvencionalni način čiščenja in dezinfekcijo površin. To lahko prispeva k neučinkovitemu nadzoru biofilmov in povečevanju njihove odpornosti. Dezinfekcijska sredstva so lahko tudi zelo korozivna in na materialih povzročajo dodatne nezaželene poškodbe površin (Paul et al., 2012). V industriji imajo ponekod zaprti cevovodni sistem iz nerjavnih materialov in vedno pogosteje uporabljajo CIP (ang. Cleaning in Place) sistem čiščenja. Ta sistem čiščenja omogoča čiščenje nedostopnih sistemov, kjer s pomočjo toka tekočine lahko ustvarijo različne dinamične pogoje. Pomembno je, da so nove raziskave usmerjene k boljšemu razumevanju nastajanja in odstranjevanja biofilmov, zato smo z našimi poskusi ugotavljali vpliv toka tekočine na nastanek in odstranjevanje biofilmov. V naši raziskavi nas je zanimalo, kakšen vpliv imata laminarni in turbulentni tok na oprijem in odstranjevanje bakterij Escherichia coli s kovinskih ploščic dveh različnih hrapavosti. 1

11 2 PREGLED LITERATURE 2.1 Bakterija Escherichia coli Escherichia coli (E. coli) je bakterija, ki jo je prvi izoliral dr. Theodor Escherich, po katerem je bakterija dobila tudi ime. E. coli je paličast, Gram-negativni bacil. Je fakultativno anaerobna bakterija, ki pogosto živi v debelem črevesju in se naravno izloča z blatom (Beloin et al., 2008). Prisotne so v prebavnem traktu človeka in živali. Izven črevesja nekateri sevi delujejo patogeno, zato je E. coli tudi indikator fekalne kontaminacije (Mikrobiološki slovar, 1994). Preživi lahko tudi v vodi. V primeru, ko bakterijo zaznamo v vodi ali hrani, je to indikator, da je voda onesnažena s fekalijami oziroma je biološko kontaminirana. Obstaja nekaj patogenih vrst, ki povzročajo bolezni. Okužbe z E. coli so prisotne po celem svetu in se uvrščajo med pomembne okužbe prebavil. Okužba se v večini primerov prenaša s hrano in se imenuje alimentarna toksikoinfekcija, kar pomeni, da se bolezen pojavi, ko ljudje zaužijejo kontaminirano hrano in le-ta povzroči infekcijo ali zastrupitev (Wiwanitkit, 2011). Neposreden prenos je možen preko rok osebja, po t. i. fekalno oralni poti, posreden prenos pa je možen s hrano in z vodo. Povzroča okužbe prebavil, sečil, dihal in sistemske okužbe (Andlovic, 2002). Za okužbo z E. coli morajo biti izpolnjeni določeni pogoji: obstajati mora vir onesnaženja, fekalno onesnaženje vode in hrane, pomanjkanje higiene, uživanje onesnažene hrane in vode, slab imunski sistem (Wiwanitkit, 2011). Pri okužbi gre za akutno vnetje črevesja, ki povzroča diarejo. Prav tako lahko pride do velike izgube vode, kar lahko predstavlja velik problem še posebej pri otrocih (Wiwanitkit, 2011). E. coli je poznana kot ena izmed bakterij, ki se prenaša s hrano. Našli so jo tudi v industriji priprave zelenjave, mesni industriji in v izdelkih, ki so pripravljeni za neposredno uživanje (Moreira et al., 2015). Pri zastrupitvah s hrano se velikokrat izkaže, da so izvor patogenih 2

12 mikroorganizmov biofilmi na površinah opreme, ki se uporablja pri pripravi hrane (Janssens et al., 2008). Teixeira et al. (2007) so ugotavljali adhezijo šestih mikroorganizmov, ki lahko povzročijo zastrupitve s hrano na različnih materialih, ki jih najpogosteje uporabljamo v kuhinjah. Ugotovili so, da lastnosti materialov bistveno ne vplivajo na oprijem mikroorganizmov na površine, ampak veliko večjo vlogo igrajo lastnosti bakterijskih celic. Zato je pomembno, da se kontrola tvorbe biofilmov izvaja v živilski dejavnosti, saj lahko s preventivnimi ukrepi preprečimo negativne vplive na zdravje ljudi (Harvey et al., 2007; Hansson et al., 2012; Jahan in Holley, 2014). 2.2 Vpliv bakterijskih lastnosti na tvorbo biofilma Pri nastajanju biofilmov imajo veliko vlogo lastnosti bakterijskih celic. Bakterije imajo poleg biokemičnih in bioloških lastnosti tudi fizikalno-kemijske lastnosti. Med te spadajo mehanska stabilnost, vezava vode, difuzija, sorpcija, masni transport, optične lastnosti in odpornost proti trenju. Te lastnosti pri biofilmu v glavnem povzročajo EPS, ki zapolnijo prostor med celicami in predstavljajo velik delež vsebnosti ogljika v biofilmu. EPS sestoji iz polisaharidov, velikih količin proteinov, nukleinske kisline in lipidov, ter vode. Tvorijo morfologijo in notranjo strukturo biofilma vključno s površinskimi porami in kanali. EPS tvorijo matriko, ki omogoča, da celice v biofilmu ohranijo svoj položaj dalj časa v primerjavi s planktonsko obliko in so zaščitene pred neugodnimi okoljskimi pogoji (Flemming et al., 2005). Kot večina površin iz naravnih materialov so tudi celične površine običajno negativno nabite in imajo lahko različne stopnje hidrofobnosti. Celične površine bakterij in njihove lastnosti se lahko spreminjajo s spremembami pogojev v okolju (Van Loosdrecht et al., 1989). Na splošno se bakterije s hidrofobnimi lastnostmi raje vežejo na hidrofobne površine, tiste s hidrofilnimi lastnostmi pa se raje vežejo na hidrofilne površine (Katsikogianni in Missirlis, 2004). Pritrditev bakterije na površino materiala ali na površino drugih celic je fizikalno-kemični fenomen. Pri tem delujejo van der Waalsove vezi in elektrostatične sile med bakterijo in površino. Velikost bakterije je okoli 0,5 do 2 µm, kar je v rangu koloidnih delcev. Zato lahko oprijem bakterije na površino opišemo s teorijo koloidnih delcev (Van Houdt in Michiels, 2010) oziroma z Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) teorijo. DLVO teorija 3

13 opisuje interakcijo med koloidnimi delci in površino. Po tej teoriji je skupna interakcija med površino in delci vsota njihovih van der Wallsovih in Coulombovih interakcij. Van der Waalsova privlačna sila je prevladujoča v bližini površine in delci se ne morejo ločiti od površine zaradi Brownovega gibanja, zato je oprijem ireverzibilen. Coulombova interakcija pa postane prevladujoča na večji razdalji od površine zaradi tega, ker moč van der Waalsove sile z oddaljenostjo močno pada (Hori in Matsumoto, 2010). 2.3 Vpliv lastnosti materialov na tvorbo biofilma Bakterijske celice se lahko pritrdijo na najrazličnejše površine in materiale, kot so tkiva, medicinske naprave, v cevnih sistemih v industriji ali v sistemu pitne vode in tudi v naravnih vodnih sistemih (Donlan, 2002). S preprostim mikroskopom je leta 1674 Antonie van Leeuwenhoek prvi odkril biofilm na površini zoba (Agle, 2007; Garrett et al., 2008). V medicini se biofilmi najpogosteje razvijejo na medicinskih napravah, kot so venski katetri, kontaktne leče, endotrahealne cevi, mehanske srčne zaklopke, srčni spodbujevalniki, protetični vsadki, urinalni katetri in slušni aparati (Donlan, 2001). Na pritrjevanje bakterijskih celic vpliva tudi hrapavost površin. Bolj hrapave površine se zlahka kolonizirajo (mikrometrska skala), saj je na razpolago večja površina za oprijem celic. Zareze na površini lahko zagotovijo ugodnejšo lokacijo za kolonizacijo, saj so na teh mestih bakterijske celice zaščitene pred vplivom strižnih sil, ker se njihov vpliv zmanjša (Yoda et al., 2014; Desrousseaux et al., 2013). Nekatere študije so pokazale, da se bakterijske celice hitreje oprimejo na hidrofobne površine, kot so na primer plastične mase, ki imajo nizko površinsko energijo, kot je na primer teflon. Težje pa se oprimejo na hidrofilne površine, kot so steklo ali kovine. Kovine imajo visoko površinsko energijo in so negativno nabite (Donlan, 2002; Myszka in Czaczyk, 2011). Poleg naštetega vpliva na oprijem tudi topografija materiala. Oprijem bakterijskih celic se zato lahko poveča tudi s povečanjem nepravilnosti na površini materiala, zato lahko velikokrat več mikroorganizmov zasledimo prav na mestih varjenja, spojih in vogalih (Fink, 2015). 4

14 2.4 Pritrjevanje bakterij na površine in tvorba biofilma Biofilm je definiran kot združba mikroorganizmov, ki so pritrjeni na površino (Costerton et al., 1995). Bakterije obstajajo v eni od dveh oblik: v planktonski obliki, kot prosto plavajoče, in kot sistemske enote, pritrjene na površini materialov v biofilmu. Bistvena pogoja za rast in razvoj biofilmov sta prisotnost mikrobov in podlaga, na katero se pritrdijo. Če ena od teh sestavin manjka, se biofilm ne more tvoriti. Biofilm je sestavljen iz celic, ki so zbrane na površini in so pogosto vgrajene v organskem polimernem matriksu mikrobnega izvora. Vezan je na podlago in je sestavljen iz številnih bakterij, ki so sočasno prilepljene s pomočjo izrastkov, kot so flageli, pili in fimbrije (Garrett et al., 2008; Habimana et al., 2014). Eden ključnih mehanizmov pri tvorbi biofilma je pritrjevanje mikroorganizmov na podlago. Proces oprijema in njegova intenzivnost sta odvisna od fizikalnih in kemijskih interakcij med mikroorganizmi in površino. Številni znanstveniki poudarjajo, da je bakterijski oprijem na površine zapleten proces, na katerega vpliva več dejavnikov, med katerimi so najpomembnejše fizikalno-kemijske lastnosti okolja (npr. temperatura in ph), lastnosti materialov (npr. hrapavost in mejni kot) ter lastnosti mikroorganizmov (Katsikogianni in Missirlis, 2004; Mains, 2008; Di Bonaventura et al., 2008; Kouider et al., 2010). 5

15 Nastanek biofilma je zapleten proces. Razdelimo ga lahko v štiri faze nastanka, zadnja, 5. faza, pa je faza odcepljanja biofilma od površin (Slika 1). Slika 1: Razvoj biofilma (Shunmugaperumal, 2010). 1. faza: površinsko pogojevanje: Snov na površini, na katero se vežejo bakterije, mora biti organskega izvora. Organska snov oblikuje plast, ki nevtralizira prekomerni površinski naboj in površinsko prosto energijo, saj bi lahko ta preprečila, da se bakterija veže na površino. Znano je, da se bakterije hitreje pritrdijo na hidrofobne nepolarne površine. Površine za pritrjevanje bakterij so pogojene z adsorpcijo organskih in anorganskih hranilnih snovi, ki vplivajo na kasnejšo pritrditev bakterije (Shunmugaperumal, 2010). 2. in 3. faza: reverzibilna in ireverzibilna pritrditev: Pritrditev celice na površino se imenuje oprijem ali adhezija in pritrditev»celica-do-celice«se imenuje kohezija (Garrett et al., 2008). V prvem koraku celične adhezije bakterijska celica pride do površine s plavanjem ali z Brownovim gibanjem in se na površino oprime reverzibilno. Ta korak predstavlja najšibkejšo povezavo v verigi dogodkov pritrditve bakterijske celice na površino (Shunmugaperumal, 2010). V naslednjem koraku bakterijska celica uporabi nanovlakna kot so pili in bički in začne proizvajati EPS, ki lahko predrejo energijsko oviro zaradi svojih majhnih radijev (Hori in Matsumoto, 2010). 4. faza: kolonizacija: Pritrjene bakterije rastejo in se delijo, s tem tvorijo mikrokolonije, ki se štejejo za osnovne enote biofilma. Kolonizacija površine z eno bakterijo vpliva na pritrditev drugih bakterij na isto površino. Končna oblika biofilma ima zapleteno zgradbo, sestavljeno iz biofilma bakterij v zunajcelični polimerni snovi v zaprtih mikrokolonijah, ki 6

16 vključujejo visoko prepustne vodne kanale s hranili in odpadnimi snovmi (Shunmugaperumal, 2010). 5. faza: odcepljanje: Odcepljanje biofilmov je odvisno od temperature, razpoložljivosti hranil, hidrodinamičnih pogojev in prisotnosti kemičnih snovi. Pasivno odcepljanje nastane zaradi zunanjih sil, kot so strig erozije biofilma, abrazija in vpliva drugih mikroorganizmov, medtem ko se aktivno odcepljanje nanaša na notranje mehanizme mikroorganizmov. 2.5 Odcepljanje Odcepljanje je zadnja, 5. faza pri tvorbi biofilma in je aktivni proces, ki je reguliran s pritrjeno populacijo (Shunmugaperumal, 2010). Glavni gonilni sili za odcepljanje sta pretok in geometrija medijev. Biofilmi, ustvarjeni pod laminarnim tokom, so manj gosti, kot so biofilmi, ustvarjeni pod turbulentnim tokom, in manj goste je relativno lahko odstraniti (Huang et al., 2013). V zrelem biofilmu lahko nekateri notranji in zunanji dejavniki vplivajo na sprostitev bakterijskih celic iz biofilma in se tako vrnejo v tok bakterijske suspenzije, ki obdaja biofilm, in tako vplivajo na njihovo širjenje (Fink, 2015). 7

17 2.5.1 Disperzija Disperzija (Slika 2) je zadnji korak v ciklu formiranja biofilma in dovoljuje bakterijskim celicam, da se vrnejo nazaj v planktonsko obliko. Disperzijo biofilma lahko sprožijo različni okoljski faktorji, kot so povečan tekočinski strig, degradacija encimov in sproščanje EPS ali površinsko vezanih proteinov (Fink, 2015). Slika 2: Disperzija biofilma (Fink, 2015) Abrazija Abrazija (Slika 3) je definirana kot odcepitev celice iz biofilma zaradi delcev v bakterijski suspenziji. Proces je odvisen od toka tekočine ter velikosti in energije suspendiranih delcev. Peščeni filtri, cevovodi za mleko in žilni sistem so primeri sistemov, kjer ima abrazija velik vpliv. Nizke sile odcepljanja povzročajo abrazijo v zunanjih porah, ki omejujejo rast biofilma, medtem ko visoke sile na površini omogočajo globlje prodiranje kisika, s čimer se poveča aktivnost biomase (Fink, 2015). 8

18 Slika 3: Proces abrazije (Fink, 2015) Erozija Erozija je opredeljena kot neprekinjeno izčrpavanje majhne količine biofilma zaradi striga tekočine v pretočnem sistemu. Celice, ki so bližje prosti tekočini, so najbolj izpostavljene strigu tekočine. Najbolj občutljive so mlade celice, ki še niso v celoti vključene v biofilm (Fink, 2015). Majhne strižne sile so dovolj, da povzročijo erozijo biofilma, ki ima nizko trdnost, medtem ko je malo verjetno, da bodo visoke strižne sile povzročile erozijo na zelo trdnih biofilmih (Laspidou, 2014). Slika 4: Proces erozije (Fink, 2015) 9

19 2.6 Vpliv strižnih sil na tvorbo in odstranjevanje biofilma Hidrodinamični pogoji so eni od ključnih parametrov, ki vplivajo na oprijem mikrobov, tvorbo in strukturo biofilma ter njihovo odcepljanje (Rochex et al., 2008). Prav tako pa vplivajo na prenos kisika in hranilnih snovi, obenem pa zaradi premikanja vode prihaja do strižnih sil, ki lahko delujejo na intenzivnost razvoja biofilma (Simões et al., 2007). Strižne sile v sistemu lahko preprečijo odlaganje in oprijem bakterij na površine (Teodosio et al., 2011). Prevladujoča sila na biofilm je strižna sila, ki deluje v smeri toka ter se povečuje z njegovo hitrostjo (Stewart, 2012). Velike strižne sile, ki jih pripisujejo turbulentnemu toku, povzročajo pritrjenim bakterijam, da se premikajo po površini vzdolž toka tekočine, in to lahko pripelje do odcepljanja (Nejadnik et al., 2007). Bakterije, ki so izpostavljene zelo počasnemu toku tekočine, lahko premagajo hidrodinamično mejno plast in njihov oprijem je odvisen samo od velikosti bakterij ter njihove gibljivosti (Busscher in Van der Mei, 2006). Kadar tok tekočine preseže kritično mejo, lahko strižne sile ob površini postanejo dovolj visoke, da preprečijo adhezijo. Na primer, v vodnih raztopinah so hitrosti tekočine od do s -1 dovolj, da preprečijo adhezijo Pseudomonas fluorescens na nerjaveče jeklo, medtem ko bi hitrost s -1 odstranila pritrjene celice (Bakker et al., 2003). Na pritrjevanje bakterijskih celic na površino materiala vplivajo strižne sile, ki izvirajo iz tekočinskega toka. Pri laminarnem toku so strižne sile omejene le na smer toka (Slika 5). V primeru turbulentnega toka pa strižne sile delujejo na bakterijsko celico iz več smeri in tako povzročajo učinkovitejše odcepljanje biofilma (Fink in sod., 2015). Znano je tudi, da turbulentni tok, za razliko od laminarnega, vpliva na zgradbo biofilma, saj velike strižne sile običajno povzročijo tanjše, gostejše in močnejše biofilme (Bakker et al., 2003). 10

20 Slika 5: Shematski prikaz strižnih sil, ki delujejo na bakterijsko celico, povzročenih z laminarnim in turbulentnim tokom (Fink in sod., 2015). Na področju tvorbe in odstranjevanja biofilmov ob prisotnosti strižnih sil je bilo narejenih veliko raziskav. Trulear in Charackis (1982) sta uporabila krožni reaktor, s katerim sta preučevala rast in odcepljanje biofilmov. Ugotovila sta, da se odcepljanje povečuje s hitrostjo tekočine in z maso biofilma. Bakke (1986) je uporabil nagle spremembe strižnih sil in ugotovil, da se je odcepitev od površine močno povečala takoj po povečanju strižne sile, vendar se je tudi hitro zmanjšala na prejšnjo raven, ko so strižne sile manjše. Peyton in Characklis (1993) sta preučevala erozijo biofilma z uporabo različnih stopenj strižnih sil v krožnem reaktorju. Naredila sta več ločenih poskusov in uporabila različne, vendar konstantne strižne sile ter zaključila, da strižna sila ne vpliva na odcepljanje biofilmov. 11

21 Choi in Morgenroth (2003) sta v svoji študiji želela prikazati kratkoročne in dolgoročne učinke nenadnih sprememb v strigu na odcepljanje biofilmov. Za rast biofilma sta uporabila krožni reaktor in naredila dva poskusa. Ugotovila sta, da pri konstantni strižni sili prevladuje erozija pri procesu odcepljanja biofilma; pri eroziji majhnih delcev ima pomemben vpliv število vrtljajev (150 rpm in 420 rpm), ki temelji na porazdelitvi velikosti delcev, medtem ko pri odcepitvi dominira masna porazdelitev odcepljenega biofilma. Povečanje strižnih sil je povzročilo pri obeh poskusih povečanje količine odcepljenih delcev in tudi premik porazdelitve velikosti delcev. Ugotovila sta tudi, da kratkoročna izpostavljenost (12 ur) nižji strižni sili zmanjša gostoto biofilma in da imajo večje strižne sile manjši vpliv na odcepljanje biofilma. Stoodley in sodelavci (1999) so želeli dokumentirati nastanek in razlike v strukturi mešanih biofilmov, ki so jih gojili pod laminarnim in turbulentnim tokom, ter ugotoviti vpliv kratkoročnih sprememb hidrodinamičnih pogojev na morfologijo in delovanje biofilmov. Uporabili so oglato stekleno pretočno cev. Po devetih dneh je bil biofilm pri laminarnih pogojih heterogen in sestavljen iz mikrokolonij. Mikrokolonije so bile okrogle oblike, njihov premer je bil velik do 100 µm. Biofilmi, ki so rasli pri turbulentnih pogojih, so imeli prav tako heterogeno sestavo mikrokolonij, vendar so bile (premer > 40 µm) razpotegnjene v smeri toka. Posamezne celice so bile pritrjene na površino v kanalih. Nastale so tudi gube in ugotovili so, da se pri turbulentnem toku lahko biofilmi prenašajo po površini. Ugotovili so tudi, da se struktura in obnašanje biofilmov razlikujeta glede na razmere obeh tokov. Paul et al. (2012) so se v svoji raziskavi osredotočili predvsem na vpliv hidrodinamičnih pogojev na strukturo biofilma. Posebno pozornost so namenili spremembi debeline in gostote celotnega biofilma. Analizirali so, kako tlak in odcepljanje delujeta na biofilm, ter prilagoditev rastnih procesov na strižne sile, da so lahko pojasnili nastalo debelino biofilma in gostoto. V raziskavi so uporabili dve vrsti reaktorjev za rast biofilmov in odcepljanje biofilmov. Ugotovili so, da če se strižna sila poveča med rastjo ali v fazi odcepljanja, debelina biofilma eksponentno pada, medtem ko se gostota povečuje. Ugotovljeno je bilo, da je za isto površino strižna sila, ki povzroči odcepljanje, v veliki meri odvisna od debeline biofilma. Zaradi uporabljene strižne sile se je pojavilo tako odcepljanje biofilmov kot tudi njihova deformacija. Avtorji navajajo, da se pri vseh analiziranih biofilmih pri izpostavljenosti pod 2 Pa pojavi odcepljanje delov biomase. Moreira et al. (2013) so v svoji raziskavi analizirali rast E. coli pod vplivom turbulentnega toka z različnim pretokom. V raziskavi so uporabili numerično simulacijo za analiziranje 12

22 tokovnih značilnosti. Ugotovili so, da je imela tvorba biofilma pri nižji stopnji pretoka prednost, ker je bil učinek strižne sile pomembnejši kot omejitev masnega prenosa. Salta et al. (2013) so v raziskavi ugotovili, da imajo manjše strižne sile vpliv na morfologijo biofilma, saj le-te oblikujejo gobasto strukturo biofilma in vmesne kanale. Velike strižne sile pa oblikujejo kompakten grozd z velikimi presledki. Fink in sodelavci (2015) so v svoji raziskavi opravili meritve na elektropoliranih in brušenih ploščicah iz nerjavnega jekla. Stopnja absorbance oprijetih celic E. coli na kovinskih površinah je bila močno odvisna od površinske hrapavosti. Stopnja adhezije bakterij na elektropolirani površini je bila večja kot pri brušeni površini. Odcepljanje pa je bilo bolj učinkovito na brušenih ploščicah kot na elektropoliranih, saj je bilo na slednjih ploščicah manj oprijetih celic pred izpostavljenostjo toku. Ugotovili so tudi, da hidrodinamični in termodinamični pogoji vplivajo na bakterijsko odstranjevanje ne glede na material. Povečana temperatura tekočine in strižna sila sta zmanjšali količino celic na nerjavnem jeklu. Lemos et al. (2015) so v svoji študiji vpliv strižnih sil ocenili glede na njihov učinek za odstranjevanje nastalih biofilmov, če so bili le-ti izpostavljeni kemičnim in mehanskim obremenitvam. Za tvorbo biofilmov so uporabili vrteči reaktor, ki omogoča simulacijo strižne sile, podobne tistim v industriji. Poustvariti so želeli nizke strižne sile, ki se ustvarijo v kolenih, robovih, ventilih in mrtvih rokavih. Uporabili so bakterijo Bacillus cereus. Poizkus so izvajali na nerjavnih ploščicah AISI 316. Biofilm je bil izpostavljen različnim pogojem (0,02, 0,12 in 0,17 Pa) sedem dni. Ugotovili so, da se gostota biofilma z naraščanjem strižne sile povečuje, medtem ko se debelina biofilma zmanjšuje. V drugem delu so ustvarjene biofilme obdelali z biocidom benzildimetildodecil amonijevim kloridom. Za odstranjevanje so uporabili večjo strižno silo. Ugotovili so, da so bili biofilmi, ustvarjeni pod manjšimi strižnimi silami, bolj odporni na odstranjevanje z biocidom. Biofilmi, ki so bili ustvarjeni pod večjimi strižnimi silami, so bili bolj odporni na mehanske vplive in kombinacijo mehanskih in kemičnih vplivov. Nastanek biofilmov na različnih površinah nemalokrat predstavlja probleme v živilski in farmacevtski industriji. Razvoja nezaželenih biofilmov pogosto ni mogoče preprečiti, saj se razvijejo tudi v neugodnih pogojih (ekstremne vrednosti ph, temperature do 95 C, velike strižne sile, uporaba razkužil). Odstranjevanje biofilmov v različnih sistemih je pogosto težko, še posebej, če nimamo neposrednega dostopa do izpostavljenih površin (Wanner et al., 2006). V takšnih primerih s pridom uporabljajo delovanje strižnih sil. Eden takšnih je 13

23 CIP sistem čiščenja različnih zaprtih cevnih sistemov, kjer za odstranjevanje biofilma uporabljajo predvsem spremembo hitrosti pretoka (Tamime, 2008) CIP sistem čiščenja CIP sistem čiščenja pomeni čiščenje celotnega sistema na mestu delovanja oziroma zaprtih cevovodnih sistemih, brez posega delavca. Postopek vključuje brizganje in pršenje tekočine na površino, in sicer tako, da sta povečana tako pretok kot tudi turbulenca. Sistem CIP učinkovito prečrpava čistila in razkužila v sistem ter ga izpira z vodo na začetku in koncu postopka. Sistem je voden z mikroprocesorji in se ga nadzoruje s senzorji (Tamime, 2008). CIP sistem je bil razvit za različne dele v proizvodnji in za dosego dobrih rezultatov pri čiščenju. V sistemu so nameščene črpalke, ki narekujejo kroženje tekočine in omogočajo samodejno kroženje tekočine, pranje in izpiranje. CIP sistem je tako mogoče opredeliti kot krožno pranje s tekočino, ki teče skozi cevi in stroje, kjer je razstavljanje aparatov pogosto prezahtevno in predrago (Memisi et al., 2015). V živilski industriji pogosto uporabljajo CIP sistem čiščenja opreme z zaprtimi sistemi za predelavo hrane, ki ima neogrevane površine, z namenom odstranjevanja mikroorganizmov ter zagotavljanja varovanja živil (Lelièvre et al., 2002; Rižnar, 2011; HACCP za čistilce, 2015). CIP sistem čiščenja v prehranski industriji navadno temelji na kombinaciji alkalne in kislinske obdelave, v kateri sta čas in temperatura ključni spremenljivki. Učinek CIP sistema čiščenja pa lahko izboljšamo z mehanskimi silami tekočinskega toka (Storgards et al., 1999). V dokumentu HACCP za čistilce (2015) strokovnjaki priporočajo črpanje čistilne raztopine skozi sisteme s hitrostjo 0,5 3 ms -1, pri čemer nastanejo šibke mehanske sile. Toda Timperley in Lawson (1980) sta v svoji raziskavi ugotovila, da se ostanek bakterij na površini zmanjša na minimum, če se povprečna pretočna hitrost ohrani pri 1,5 ms -1. Blel et al. (2007) so v svoji študiji raziskovali vpliv strižne sile na odstranjevanje spor B. cereus v CIP sistemu čiščenja na mestih, kjer pride do nenadnega zoženja ali širitve cevi. Ugotovili so, da lahko nenadno zoženje ali širitev cevi povzroči motnje pretoka in s tem vpliva na odstranitev spor s površine elementov. 14

24 Furukawa et al. (2009) so v svoji raziskavi ugotavljali učinek CIP sistema čiščenja s pomočjo čistil, aditivov za živila in drugih spojin na odstranjevanje E. coli in S. aureus na nerjavnih ploščicah. Ugotovili so, da E. coli tvori tanjše biofilme, ki so manj odporni na čiščenje kot S. aureus. Vsa čistila za CIP sistem čiščenja, ki so jih uporabili, so bila učinkovita pri odstranjevanju E. coli, vendar odstranitev biofilma ni bila popolna. 15

25 3 NAMEN IN HIPOTEZE 3.1 Namen Namen raziskave je ugotoviti vpliv laminarnega in turbulentnega toka na adhezijo in odcepljanje E. coli na nerjavnih ploščicah AISI 304 z različno hrapavostjo. Glavni cilji raziskave so: Ugotoviti učinkovitost odstranjevanja bakterij s površin pri laminarnem in turbulentnem toku. Ugotoviti, pri katerem toku, laminarnem ali turbulentnem, se bakterije hitreje in učinkoviteje oprimejo površin. Ugotoviti vlogo hrapavosti površine na samo pritrjevanje in odcepljanje mikroorganizmov. 3.2 Hipoteze I. Stopnja oprijema bakterije Escherichia coli se razlikuje na materialih z različno hrapavostjo. II. Turbulentni tok bo odstranil več bakterijskih celic z vseh materialov kot laminarni tok. III. Število oprijetih bakterijskih celic bo večje pri stacionarnih pogoji v primerjavi z dinamičnimi pogoji. 16

26 4 MATERIALI IN METODE 4.1 Testne ploščice, uporabljene v raziskavi V naši raziskavi smo uporabili kovinske ploščice iz nerjavnega jekla AISI 304, velikosti 2 x 2 cm, debeline 2 mm, ki so jih pripravili v podjetju Iskra Pio d. o. o. Ploščice so bile dodatno obdelane, tako da smo dobili materiale dveh različnih hrapavosti. Z mikroskopom na atomsko silo (ang. Atomic Force Microscopy AFM) so na Inštitutu Jožef Stefan analizirali hrapavost površin ploščic. Rezultati meritev hrapavosti so podani kot vrednosti Rq. Vrednost Rq je definirana kot kvadratična srednja hrapavost (Bohinc in sod., 2016). Na vsakem materialu so bile opravljene tri neodvisne meritve. V raziskavi smo uporabili kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in kovinske ploščice hrapavosti 986 nm. Nerjaveče jeklo AISI 304 je pri atmosferskih pogojih in prisotnosti dušikove kisline odporno na rjavenje. Material ima odlično odpornost na alkalne raztopine in tudi na organske in anorganske soli. Odporen je tudi proti koroziji na zraku (Technical Specifications of AISI 304). 17

27 4.2 Uporabljeni bakterijski sev in izdelava rastnih krivulj V raziskavi smo uporabili standardni sev bakterije Escherichia coli ATCC 35218, ki smo ga pridobili v banki mikroorganizmov (Czech Collection of Microorganisms, Brno, Češka). Uporabljeni bakterijski sev je bil izoliran iz prebavnega trakta psa in ni patogen. Bakterije iz zbirke so bile dostavljene v Slovenijo v liofilizirani obliki. Za izbrani bakterijski sev smo naredili tri rastne krivulje in preverili razmnoževanje pri različnih pogojih. Najprej smo pripravili prekonočno kulturo, ki smo jo prenesli v ustrezno količino tekočega gojišča (substrata) v razmerju 1:300. Bakterije smo gojili v hranilnem bujonu (Biolife, Italija) v treh različnih pogojih pri 37 C. Tako pripravljeno bakterijsko suspenzijo smo gojili v stacionarnih pogojih, v laminarnem toku in turbulentnem toku. Pri vseh študijah rastne krivulje smo uporabili metodo štetja bakterijskih kolonij, poraslih na trdnem gojišču. Rezultati so izraženi v logaritemskih vrednostih log CFU ml 1. Po inkubaciji smo vsakih 24 ur iz ene epruvete odvzeli 1 ml suspenzije in jo po ustrezni decimalni razredčitvi (ISO 8199, 2005) nanesli na trdno gojišče. Razmnoževanje bakterijskega seva pri vseh treh pogojih smo ugotavljali v času 0 ur ter po 24, 48 in 72 urah. Za vsak izbrani čas smo odvzeli po dva vzorca. Poskuse smo ponovili trikrat. Rezultati so predstavljeni kot povprečne vrednosti s standardnim odmikom. 18

28 4.3 Opis sistema pretočne komore Poskuse smo izvajali s pomočjo pretočne komore (Slika 6), s katero lahko ustvarimo turbulentni in laminarni tok. Zunanje dimenzije komore so 399 x 325 x 265 mm. Sestavljena je iz polietilenskega nosilca s priključkom za laminarni in turbulentni tok. Pretok tekočine skozi komoro je omogočen z dvema peristaltičnima črpalkama. Prva črpalka je za laminarni (Qmax = 20 ml min -1 ) in druga za turbulentni tok (Qmax = 1200 ml min -1 ). Turbulentni tok se ustvari zaradi padajoče vode na vzorce z višine 3 cm. To pomeni, da so ploščiče iz nerjavnega jekla izpostavljene tušu medija. Levo na sliki je hladilno/ogrevalna komora, s katero lahko zagotovimo temperaturne pogoje od 0 do + 50 C. Desno je testna celica s priključkom za turbulentni in laminarni tok. Zgornji del je snemljiv kovinski pokrov, ki omogoči ustvarjanje turbulentnega toka (Fink in sod., 2015). Slika 6: Sistem pretočne komore s hladilno/ogrevalno enoto, polietilenskim nosilcem in peristaltičnima črpalkama za ugotavljanje vpliva laminarnega in turbulentnega toka na pritrditev in odstranjevanje mikroorganizmov s površin materialov (foto: Fink in sod., 2015). 19

29 4.4 Ugotavljanje vpliva strižnih sil na odcepitev in pritrditev bakterijskega seva Vpliv toka in strižnih sil na oprijem in odcepitev bakterij s površine smo ugotavljali s pomočjo pretočne komore (Slika 6), ki omogoča laminarni in turbulentni tok. Sistem pretočne komore smo uporabili za dva ločena poskusa. V prvem poskusu smo ugotavljali vpliv laminarnega in turbulentnega toka na odstranjevanje stacionarno oprijetih bakterijskih celic s površin. Kovinske ploščice, opisane v poglavju 4.1, smo najprej izpostavili bakterijski kulturi v mikrotirskih ploščah in inkubirali pri temperaturi 37 C, 48 ur. V vsako odprtino smo vstavili po eno kovinsko ploščico, dodali 4 ml tekočega gojišča (navadni bujon) in bakterijsko kulturo v razmerju 1:300. V tem času so se bakterijske celice oprijele površin. Tako pripravljene ploščice smo nato v pretočni komori izpostavili turbulentnemu in laminarnemu toku ter spirali s PBS pufrom (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 v 1 L). Del ploščic ni bil izpostavljen tokovnim pogojem, in sicer z namenom ugotavljanja adhezije bakterijskih celic brez vpliva hidrodinamičnih pogojev. V drugem poskusu smo kovinske ploščice vstavili v polietilenski nosilec in ugotavljali oprijem bakterijskih celic na površine kovinskih ploščic pri dinamičnih pogojih. Pripravili smo 800 ml bakterijske kulture pri koncentraciji 1:300, katero smo s pomočjo peristaltične črpalke črpali preko ploščic najprej s konstantnim pretokom 20 ml min -1 in v drugem poskusu s konstantnim pretokom 1200 ml min -1. Oprijem smo ugotavljali po 24, 48 in 72 urah. Za primerjavo smo istočasno del ploščic gojili v stacionarnih pogojih v inkubatorju. 20

30 4.5 Ugotavljanje količine bakterijskih celic na površinah V literaturi zasledimo različne metode za ugotavljanje količine oprijetih bakterij na površine. Odločili smo se, da bomo uporabili metodo, ki jo je v svoji raziskavi uporabil Bohinc in sodelavci (2014) in je povzeta po O Toole et al. (1999) in Kubota et al. (2008). Gre za metodo merjenja koncentracije barvila kristal vijoličnega, ki se sprosti iz predhodno obarvanih bakterijskih celic. Količino oprijetih celic smo ugotavljali na naslednji način: ploščice z adheriranimi celicami smo najprej sprali s 5 ml PBS pufra dvakrat. S tem smo odstranili nepritrjene in slabo pritrjene bakterijske celice. Nato smo bakterije na ploščicah fiksirali z vročim zrakom 10 minut, oziroma dokler ploščice niso bile vidno suhe. Celice, ki so se pritrdile na površino smo obarvali s 3 ml barvila kristal vijolično (Merck, Germany) in počakali 5 minut. Nato smo obarvane ploščice spirali s 5 ml PBS pufra dva krat. Tako smo odstranili barvilo, ki ga bakterijske celice niso absorbirale. V naslednjem koraku smo z 800 µl 96 % etanola barvilo kristal vijolično ekstrahirali iz celic. 200 µl etanola z barvilom smo nato prenesli v mikrotitrsko ploščico in merili optično gostoto barvila s čitalcem mikrotitrskih ploščic Infinite 200 PRO, Tecan Austria GmbH, pri valovni dolžini 620 nm. Merjenje optične gostote temelji na Beer-Lambertovem zakonu. To je zakon, ki opisuje absorpcijo svetlobe skozi obarvano raztopino (IUPAC, 2006). Vzporedno z ugotavljanjem adhezije mikroorganizmov na površine kovinskih ploščic pri različnih pogojih smo pri vsakem poskusu pod enakimi pogoji poleg testnih ploščic izvajali poskuse tudi na kontrolnih ploščicah. Vsi pogoji in postopki priprave in obdelave testnih in kontrolnih ploščic so bili enaki, vendar z razliko, da pri kontrolnih nismo dodali bakterijske kulture. 21

31 4.6 Statistična obdelava podatkov: parni Studentov t-test z dvorepo porazdelitvijo Za statistično analizo rezultatov smo v raziskavi uporabili programsko orodje R (R Development Core Team, 2012). Razlike med posameznimi spremenljivkami smo analizirali s parnim Studentovim t-testom z dvorepo porazdelitvijo. Analizirali smo povprečne vrednosti glede na čas inkubacije, hrapavost materialov ali glede na pogoje inkubiranja. Analizirali smo absolutne vrednosti OD. Mejo za statistično značilne razlike smo postavili pri p 0,05 in pri rezultatih z visoko statistično značilno razliko p 0,

32 5 REZULTATI 5.1 Rastne krivulje Slika 7 prikazuje rastne krivulje E. coli ATCC v treh različnih pogojih. Vidimo lahko, da turbulentni tok v prvih 24 urah pozitivno vpliva na razmnoževanje E. coli, nato bakterije pridejo v fazo odmiranja. Število bakterij E. coli je po 24 urah inkubacije pri laminarnem toku in stacionarnih pogojih približno enako, medtem ko v primeru turbulentnega toka lahko zaznamo višje vrednosti. Po 72 urah je prišlo pri stacionarnih pogojih do odmiranja bakterij, medtem ko se pri laminarnem toku število bakterij v času 72 ur povečalo za 0,214 log CFU/ml.. 10,0 9,0 log CFU ml -1 8,0 7,0 6,0 5,0 0 ur 24 ur 48 ur 72 ur Čas inkubacije STACIONARNI LAMINARNI TURBOLENTNI Slika 7: Rastne krivulje bakterije E. coli ATCC 35218, gojene v stacionarnih pogojih, laminarnem toku in turbulentnem toku pri temperaturi inkubacije 37 C. 23

33 Optična gostota OD pri 620 nm 5.2 Oprijem bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti v stacionarnih pogojih Slika 8 prikazuje povprečne vrednosti izmerjenih OD620 oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti (25 nm in 986 nm) v stacionarnih pogojih pri treh različnih časih inkubacije. Vidimo lahko, da je število oprijetih bakterijskih celic pri vseh pogojih in časih večje pri bolj hrapavih ploščicah. V stacionarnih pogojih se pri bolj hrapavih ploščicah oprijem s časom povečuje. Na manj hrapavih ploščicah je oprijem skoraj enak v vseh treh časih. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Čas inkubacije 25 nm 986 nm Slika 8: Povprečne vrednosti izmerjenih OD620 oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in 986 nm v stacionarnih pogojih pri temperaturi inkubacije 37 C. 24

34 Optična gostota OD pri 620 nm 5.3 Oprijem bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti v dinamičnih pogojih (laminarni tok) Slika 9 prikazuje povprečne vrednosti izmerjenih OD620 oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti (25 nm in 986 nm) v dinamičnih pogojih (laminarni tok) pri treh različnih časih inkubacije. Vidimo, da je oprijem na manj hrapavih kovinskih ploščicah v laminarnem toku manjši, kot je oprijem na bolj hrapavih kovinskih ploščicah. Število oprijetih bakterijskih celic pri bolj hrapavih ploščicah s časom narašča, medtem ko je oprijem pri manj hrapavih ploščicah po 48 urah inkubacije le nekoliko večji kot po 24 urah, nato pa po 72 urah izpostavljenosti skokovito naraste. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ur 48 ur 72 ur Čas inkubacije 25 nm 986 nm Slika 9: Povprečne vrednosti izmerjenih OD620 oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in 986 nm v dinamičnih pogojih (laminarni tok) pri temperaturi inkubacije 37 C. 25

35 Optična gostota OD pri 620 nm 5.4 Oprijem bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice dveh različnih hrapavosti v dinamičnih pogojih (turbulentni tok) Slika 10 prikazuje povprečne vrednosti izmerjenih OD620 oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in 986 nm v dinamičnih pogojih (turbulentni tok) pri treh različnih časih inkubacije. Vidimo lahko, da je oprijem na manj hrapavih ploščicah manjši, kot je na bolj hrapavih kovinskih ploščicah. Pri obeh hrapavostih oprijem s časom upada. Če primerjamo rezultate oprijema z rezultati v stacionarnih pogojih in laminarnem toku, vidimo, da je oprijem celic, ki so bile izpostavljene turbulentnemu toku veliko večji kot v ostalih dveh pogojih. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ur 48 ur 72 ur Čas inkubacije 25 nm 986 nm Slika 10: Povprečne vrednosti izmerjenih OD620 oprijema bakterijskih celic E. coli ATCC na kovinske ploščice hrapavosti 25 nm in 986 nm v dinamičnih pogojih (turbulentni tok) pri temperaturi inkubacije 37 C. 26