Izvorni znanstveni članak Original Scientific Paper UDK : BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4,

Transcription

1 UDK : Izvorni znanstveni članak Original Scientific Paper ANALIZA SADRŽAJA DNA I PROLIFERACIJSKE AKTIVNOSTI TUMORSKIH STANICA PROTOČNOM CITOMETRIJOM I RAČUNALSKIM PROGRAMOM ModFIT LT U BOLESNICA SA SEROZNIM KARCINOMOM JAJNIKA Lidija Bilić-Zulle', Branka Užarević 2, Maja Kraševič', Mladen Petrovećki 2, Drago Batinić 2, Malko Marušić 2 1 Zavod za laboratorijsku dijagnostiku KBC Rijeka, 2 Zavod za imunologiju, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu i KBC Zagreb,' Zavod za patologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Rijeci SAŽETAK - Analiza sadržaja DNA (ploidija) i staničnog ciklusa protočnom, citometrijom učinjena je iz parafinskih blokova tumorskog tkiva 30 bolesnica sa. seroznim karcinomom jajnika. Dobiveni rezultati uspoređeni su s kliničko-patološkim pokazateljima, bolesti, uključujući dob, patohistološki nalaz, klinički, stadij bolesti, i preživljenje bolesnica. Slabije diferencirani tumori pokazali su veću ukupnu proliferacijskii, aktivnost tumorskih stanica, a slična sveza nađena je i u odnosu na. veći stupanj kliničkog stadija bolesti. Sveza između ploidije tumorskih stanica i kliničko-patoloških pokazatelja nije nađena. Analizom međusobne ovisnosti ispitivanih pokazatelja nađeno je da dob bolesnica, i klinički stadij bolesti imaju prognostičku vrijednost za ukupno preživljenje bolesnica, dok pokazatelji plodije i proliferacijske aktivnosti tumorskih stanica nemaju prognostički značaj. ZAHVALA Toplo se zahvaljujemo gdici Žaklini Ćavar bez čije bi izvrsne tehničke pripreme uzoraka ovaj rad bio bitno otežan. BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4,

2 Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika L. Bilić-Zulle i sur. UVOD Karcinom jajnika zloćudna je novotvorina ženskog spolnog sustava. Zbog nespecifičnih simptoma bolesti, u većine bolesnica dijagnoza se postavlja tek u uznapredovalom stadiju bolesti (1). Tumori jajnika heterogeni su s obzirom na morfološke i antigenske značajke, sadržaj receptora i osjetljivost na kemoterapiju (2). Novi pristupi istraživanju karcinoma jajnika idu u smjeru otkrivanja laboratorijskih pokazatelja biološkog poznavanja tumora kako bi se unaprijedila dijagnostika, liječenje i prognoza bolesti. Pokazateljima staničnog ciklusa pripisuje se potencijalni prognostički značaj i stoga je cilj ovog rada bio analiza sadržaja DNA i proliferacijske aktivnosti tumorskih stanica bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika, uporabom metode protočne citometrije i novog računalskog programa za analizu histograma DNA - ModFIT LT. Bolesnice MATERIJAL I METODE Analizirano je tumorsko tkivo 30 bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika primljenih i liječenih u KBC-u Rijeka u razdoblju od do godine. Sve bolesnice imale su sljedeće kliničko-patološke nalaze: patohistološki stupanj tumora, klinički stadij bolesti i preživljenje. Vrst tumora i pripadajući patohistološki stupanj određen je prema WH0 klasifikaciji (World Health Organisation: Histological Tvping of Ovarian Tumor) (3). Tumori se dijele prema stupnju diferenciranosti u tri skupine: histološkog stupnja I (dobro diferencirani tumori), II (srednje diferencirani tumori) i III (slabo diferencirani tumori). Klinički stadij određenje prema FIGO klasifikaciji (Federation International Gynecology & Obstetrics) (4), prema kojoj se razlikuju četiri klinička stadija: stadij I = tumorski rast ograničen na jajnike, stadij II = tumorski rast na jednom ili oba jajnika s proširenjem na zdjelicu, stadij III - tumorski rast na jednom ili oba jajnika s intraperitonealnim metastazama izvan zdjelice i/ili pozitivnim retroperitonealnim čvorovima; stadij IV = tumorski rast najednom ili oba jajnika s udaljenim metastazama. Materijal Tumorsko tkivo seroznog karcinoma jajnika je nakon biopsije uklopljeno u parafin i naknadno obrađeno prema standardnoj metodi po Hedleyj-u (5) i Vindelov-u (6). Svaki uzorak tumora pregledao je patolog, a za analizu je upotrijebljen najreprezentativniji dio tumora. Protočna citometrija Analiza sadržaja DNA i faza staničnog ciklusa učinjena je u Kliničkom zavodu za laboratorijsku dijagnostiku KBC Zagreb na protočnom citometru FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, SAD) uz uporabu računalskih programa - Cellquest (Becton Dickinson Immunochemistry Systems, San 256 BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4, 1996.

3 L. Bilić-Zulle i sur. Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika Jose, CA, SAD) i ModFit LT (Verity Software House, Inc., SAD, 1995) na osobnom računalu Macintosh Quadra 650. Program CellQuest služi za mjerenje uzoraka i pohranjivanje izmjerenih podataka, a program ModFit LT za analizu pohranjenih podataka. Za svaki uzorak tumorskog tkiva kroz mjerni sustav protočnog citometra propušteno je 10,000 jezgara. Jednoparametrijski histogrami (intenzitet fluorescencije x broj stanica/jezgara) analizirani su ModFit LT programom. Tumačenje histograma DNA Na temelju jednoparametrijskog histograma fluorescencije i njegovih brojčanih izvedenica dobiven je sadržaj DNA i raspodjela tumorskih stanica prema fazama staničnog ciklusa: faza G0-G1 (stanice u mirovanju), S-faza (stanice u fazi podvostručenja DNA, označava stanice u proliferaciji) i faza G2-M (stanice u diobi) (7). Histogram se tumači kao diploidan ako postoji jedan simetričan G0-G1 vršak (si. 1), dok nazočnost više od jednog vrška pokazuje Dale acquired: 9-May-96 File: BILIC LIDIJA O5 Sample: SAMPLE ID Sample lag: SAMPLE TAG Analysis type: Aulomatic analysis Prep: ParafJtn 1 - G0-G1 faza staničnog ciklusa 2 - S-faza staničnog ciklusa 3 - G2-M faza staničnog ciklusa DNA Content DIPLOID: % DipGO-GI: % al DipG2-M:9.7! % at Dp S: % G2/G1:2.00 Dip % CV:7.27 Total S-Piiase: % Extra Pop: % Debris:9.17% Aggiegales: 0.00 % Modeled Evenls: RCS: Diploid B.A.D.: 5.94 % No aggs modeieđ S-PhaseAssessment: Tissue Type: Ovaria Ploidy Status: Diploid Diploid S: High Slika 1. - Jednoparametrijski histogram DNA diploidnog tumora jajnika s pripadajućim statističkim podacima. BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4,

4 Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika L. Bilić-Zulle i sur. da se radi o aneuplodiji (si. 2) (8). Proliferacijska aktivnost tumorskih stanica izražena je kao ukupna S-faza (USF), tj. kao udio svih izmjerenih stanica u S- fazi (u postocima). USF diploidnih tumora istovjetna je izmjerenoj vrijednosti udjela stanica u S-fazi staničnog ciklusa. Kod aneuploidnih tumora je moguće ustanoviti posebno udio diploidnih i udio aneuploidnih stanica u S-fazi staničnog ciklusa. Date acquired: 9-May-96 File: BILIC LIDIJA Smrt: SAMPLE ID Sample lag: SAMPLE TAG Analysis type: Aulomalic ana!ysis Prep: ParaHin DIPLOID: 33-Tt % Dip GO-Gl: 88.08% at Dlp G2-M: 0.00 % at Dip S: 11.92% G2/G 1:2.00 Dip % CV:7.82 ANEUPLOID % Ani G0-G1: % at Ani G2-M: 6.89% at Ani S: 27.00% G2/G1: 1.90 An1 %CV:7.18D!: 1.38 Tolal S-Phase: % Exlra Pop: % Debns % Aggregates: 0.00 % Modeled Evenls: RCS: DIP G0-G1 faza staničnog ciklusa i DNA Content Diploiđ&AD % No aggsmodeled Aneuploid B.A.D.: 8.74 % NoAggs modeled Tolal B.AD.: % No aggs rr.ođelsd 2 - DIP S-faza staničnog ciklusa 3-AN G0-G1 faza staničnog ciklusa 4 - AN S-faza staničnog ciklusa 5 - AN G2-M faza staničnog ciklusa S-PhaseAssessment: TissueType: Ovaria Ploidy Status: Aneuploid Aneuploid S: High Total S: High Slika 2. - Jednoparametrijski histogram DNA aneuploidnog tumora jajnika s pripadajućim statističkim, podacima Brojčani pokazatelj stupnja ploidnosti je DNA-indeks. To je omjer relativnog sadržaja DNA G0-G1 faze staničnog ciklusa ispitivanog uzorka i relativnog sadržaja DNA stanica standarda (8). Međutim, preporuka je SAC XIV društva (Societv of Analvtical Cytology Subcommitee, 1990) da se aneuploidija DNA ne izražava putem DNA indeksa (9). Statistička obrada podataka Brojčani podaci prikazani su srednjim vrijednostima i mjerama odstupanja, a vrijednosti između skupina bolesnica uspoređene su Mann-Whitneyevim 258 BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4, 1996.

5 L. Bilić-Zulle i sur. Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika neparametrijskim testom. Kaplan-Meirova statistika korištena je za izračunavanje krivulja preživljenja, a utjecaj pokazatelja na preživljenje određen je Coxovim regresijskim testom. REZULTATI Tablica 1 prikazuje kliničko-patološke značajke 30 bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika i rezultate analize tumorskih stanica na sadržaj DNA i stanični ciklus rasta. Medijan dobi bolesnica iznosio je 50 godina, u rasponu od 17 do 76 godina. U 15 bolesnica (50,0%) otkrivenje serozni karcinom jajnika histološkog stupnja II, 7 bolesnica (23,3%) bilo je s tumorima histološkog stupnja I, a 8 bolesnica (26,7%) s tumorima histološkog stupja III. Prema kliničkoj T a b l i c a 1. Kliničko-patološke značajke 30 bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika Parametar Broj bolesnica (%) Dob, godine (medijan) (raspon) Histološki stupanj tumora (WH0)» I II III 7(23.3) 15(50.0) 8(26.7) Klinički stadij bolesti (FIGO-klasifikacija) 1 ' I II III IV 7(23.3) 6(20.0) 14(46.7) 3(10.0) Sadržaj DNA u tumorima (ploidija) diploidni aneuploidni 22(73.3) 8(26.7) USF C (%) (x±s.d.) (raspon) ( ) " I ( dobro diferencirani tumori; II ( srednje diferencirani tumori; III ( slabo diferencirani tumori. b stadij I = tumorski rast ograničen na jajnike, stadij II = tumorski rast na jednom ili oba jajnika s proširenjem na zdjelicu, stadij III = tumorski rast na jednom ili oba jajnika s intraperitonealnim metastazama izvan zdjelice i/ili pozitivnim retroperitonealnim čvorovima; stadij IV = tumorski rast najednom ili oba jajnika s udaljenim metastazama ' ukupna proliferacijska aktivnost tumorskih stanica BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4,

6 Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika L. Bilić-Zulle i sur. slici, 14 bolesnica bilo je u kliničkom stadiju III (46,7%), dok je podjednak udio bolesnica bio u kliničkom stadiju I (23.3%) i II ( 20.0%). Svega tri bolesnice (10%) bile su u kliničkom stadiju IV. Diploidni tumori nađeni su u 22 (73.3%) bolesnice, a aneuploidni tumori u 8 (26.7%) bolesnica. U ispitivanoj skupini bolesnica nisu nađeni tzv. granični (engl. border-line) tumori, niti bolesnice s tetraploidnim ili multiploidnim tumorom. Srednja vrijednost koeficijenta varijacije (CV) za sve uzorke iznosila je 7.71 (raspon ). U tri uzorka CV je bio >10, a u jednom uzorku CV iznosio je 12,1. Tablica 2 prikazuje utjecaj ukupne proliferacijske aktivnosti tumorskih stanica (izražena kao ukupna S-faza ili USF) i udjela aneuploidnih tumorskih stanica s kliničko-patološkim pokazateljima. U tumorima histološkog stupnja I USF je bila statistički značajno niža (p<0.05) od USF tumora histološkog stupnja II i III. Slično tome, USF u tumorima kliničkog stadija bila je statistički značajno niža od USF tumora kliničkog stadija III (p<0,05). Udio aneuploidnih Tablica 2. - Usporedba ukupne proliferacijske aktivnosti (USF) i udjela aneuploidnih tumorskih stanica s kliničko-patološkim pokazateljima (N=30) Parametri USF (%) (medijan, raspon) Udio aneuploidnih stanica (%) (medijan, i-aspon) Histološki stupanj (WH0) I II III 2,3 7,4 13,2 1-12,7-' 1,7-33,7 6-18,7 43,3 79,0 6,7-71 b 74,5-86,7 Klinički stadij bolesti (FIGO) I II III rv 2,2 12,7 10,6 7,4 1-21,7 C 1,1-33,7 2,3-22 7,1-21,3-71,0 63, ,9-74,5 6,7-S6,7 - ;l USF tumora histološkog stupnja I statistički se vjerodostojno razlikuje (p<0,05) od USF tumora histološkog stupnja II i III, b vidio tumorskih aneuploidnih stanica u bolesnica kliničkog stadija II statistički se vjerodostojno razlikuje (p<0.05) od udjela tumorskih aneuploidnih stanica u bolesnica kliničkog stadija III, c USF tumora u bolesnica kliničkog stadija I statistički se vjerodostojno razlikuje (p<0.05) od USF tumora u bolesnica kliničkog stadija III. stanica u tumorima histološkog stupnja II bio je značajno manji od udjela aneuploidnih stanica u tumorima histološkog stupnja III (p<0,05). Ploidija (sadržaj DNA) nije bila značajno različita u odnosu na parametre histološkog 260 BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4, 1996.

7 L. Bilić-Zulle i sur. Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika stupnja i kliničkog statusa (nije prikazano u tablici). Tablica 3 prikazuje rezultate univarijatne i multivarijatne analize utjecaja kliničko-patoloških pokazatelja na ukupno preživljenje bolesnica, a slika 3 krivulju ukupnog preživljenja bolesnica. Petogodišnje preživljenje iznosi 15,7 ± 7,2 mjeseca, a ukupno praćenje svih bolesnica obuhvatilo je 61 mjesec. Tijekom praćenja 7 bolesnica (23,3%) je preživjelo, a 23 bolesnice (76,7%) su umrle. Dob, histološki T a b l i c a 3. Utjecaj kliničko-patoloških pokazatelja na ukupno preživljenje bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika (univarijatna i multivarijatna analiza) Parametar Dob Histološki stupanj (WHO) Klinički stadij bolesti (FIGO) Ukupna proliferacijska aktivnost stanica (USF) Ploidija tumorskih stanica Univarijatna P 0,007 0,001 <0,001 0,250 0,071 Multivarijatna analiza P <0,001 0,155 0,007 0,200 0, T 0.9 g " EU H 0-5 <-n t i - 4 f < 0.3 i o : w 0-2 } i Slika l VRIJEME (mjeseci) 3. - Krivulja vjerojatnosti ukupnog preživljenja 30 bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4,

8 Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika L. Bilić-Zulle i sur. stupanj i klinički stadij bolesti statistički su vjerodostojni pojedinačni prognostički pokazatelji ukupnog preživljenja bolesnica (za sve p<0.01), dok rezultati multivarijatne analize ukazuju da su jedino dob bolesnica i klinički stadij bolesti nezavisni prognostički pokazatelji ukupnog preživljenja bolesnica. RASPRAVA Odluka o izboru terapijskog protokola u bolesnica sa karcinomom jajnika osniva se na posrednim pokazateljima biološkog potencijala tumora, prvenstveno na kliničkom stadiju bolesti i procjeni ostatne bolesti nakon kirurškog zahvata (10). Stoga pokušaji iznalaženja neposrednih pokazatelja biološkog ponašanja tumora imaju za cilj razvoj novih strategija liječenja. Među tim pokazateljima su, između ostalih, sadržaj DNA (ploidija) i proliferativna aktivnost tumorskih stanica (2,10). S ciljem boljeg upoznavanja bioloških osobitosti tumora jajnika, istražili smo pokazatelje staničnog ciklusa u 30 bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika i usporedili ih s poznatim kliničkopatološkim pokazateljima tumora jajnika. Matematička analiza parametara staničnog ciklusa učinjena je posve novim računalskim programom ModFit LT koji omogućuje ručnu i automatsku analizu histograma DNA. Pri ručnoj analizi histograma DNA postavljaju se granice (kanali) prema vizualnoj procjeni za pojedine faze staničnog ciklusa ili se unošenjem potrebnih podataka za analizu staničnog ciklusa (npr. vrsta analiziranog materijala, vrst tumora, ploidni status, vidljiva/nevidljiva G2-M faza, raspadnute stanice i agregirane stanice) bira model analize histograma. Kod ranijih programa za analizu histograma DNA bila je moguća ručna ili automatska analiza na osnovi vizualno postavljenih kanala za pojedine faze staničnog ciklusa. Pri automatskoj analizi, ModFit LT program sam odabire jedan od 82 ponuđena modela analize koji najbolje odgovara ispitivanom uzorku. Raniji programi nisu imali definirane modele. Odabir modela analize ovisi o vrsti upotrijebljenog materijala (tkiva), sadržaju DNA u tumorskim stanicama, nazočnosti raspadnutih stanica i staničnih agregata. Uz osnovne pokazatelje staničnog ciklusa program ModFit LT daje podatke o broju analiziranih stanica, pokazatelju RCS (engl. reduced chi-square test), udjelu raspadnutih i agregiranih elemenata - BAD (engl. background aggregates and debris), koeficijentu varijacije (CV) i do sada najtočniju analizu proliferacijske aktivnosti stanica uzorka, tj. udio stanica u S-fazi staničnog ciklusa (11). Pokazatelj RCS ukazuje u kolikoj mjeri izabrani model analize odgovara ispitivanom uzorku. CV je pokazatelj kvalitete pripreme uzorka, ali ovisi i o značajkama tumorskog tkiva koje se ispituje. Preporuka je da CV za parafinske blokove bude manji od 10% (12). U četiri slučaja našeg mjerenja CV je bio veći od 10% (11% i 12%). Ove uzorke smo ponovili i dobili iste vrijednosti CVi to vjerojatno zbog osobitosti samog tumorskog tkiva, a ne kvalitete pripreme uzoraka. Kvalitetna procjena udjela stanica u S-fazi staničnog ciklusa moguća je ako histogrami DNA imaju zadovoljavajuću vrijednost CV i mali udio raspadnutih i agregiranih stanica. Veća nazočnost raspadnutih stanica ima 262 BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4, 1996.

9 L. Bilić-Zulle i sur. Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika značajan utjecaj na točnost mjerenja udjela stanica u S-fazi staničnog ciklusa (povećanje udjela stanica) (13). Ranijim se programima za analizu staničnog ciklusa nije mogao točno odrediti udio stanica u S-fazi kod aneuploidnih tumora zbog preklapanja površina koje su označavale S-fazu. Udio stanica u G2-M fazi nije se uvijek mogao izraziti iz istog razloga ili zbog toga što površina koja odgovara G2-M fazi nije bila vidljiva. ModFit LT daje vrlo točnu analizu udjela tumorskih stanica u S i u G2- M fazi staničnog ciklusa i to odvojeno udjela stanica u S-fazi diploidnih i aneuplodnih tumorskih stanica, kao i ukupnu proliferacijsku aktivnost tumorskih stanica, Aneuploidni serozni karcinomi jajnika otkriveni su u 26,7% bolesnica obuhvaćenih ovim istraživanjem. Literaturni podaci o učestalosti aneuplodije u karcinomu jajnika su raznoliki, a kreću se od 19% do 70% (1,2,10). Mogući razlozi različite zastupljenosti aneuplodnih tumora u navedenim istraživanjima jesu heterogenost ispitivanih skupina tumora, vrst materijala (tumorsko tkivo ili tumorsko tkivo s primjesama nekrotičnog ili okolnog normalnog tkiva), te kvaliteta pripreme i analize uzoraka. U ovom radu ukupna proliferacijska aktivnost tumorskih stanica (izražena kao ukupna S-faza ili USF) dobro diferenciranih karcinoma jajnika statistički je značajno niža od USF srednje i slabo diferenciranih tumora. Slično tome, USF je značajno niža u bolesnica kliničkog stadija I nego u bolesnica kliničkog stadija III. Pored pokazatelja proliferacijske aktivnosti tumorskih stanica, udio aneuploidnih tumorskih stanica (što u novije vrijeme neki autori rabe u prikazu značajnosti parametara staničnog ciklusa) (10), također je bio u svezi s patohistološkom slikom tumora. U tumorima histološkog stupnja I aneuplodine stanice nisu nađene. Udio aneuploidnih tumorskih stanica statistički je značajno veći u tumorima histološkog stupnja II nego u tumorima histološkog stupnja III. Međutim, ova sveza s obzirom na klinički stadij bolesti nije utvrđena, što drugim riječima znači da nije nađena povezanost između ploidije tumorskih stanica i kliničko-patoloških pokazatelja bolesti. U našim ispitivanjima ukupno preživljenje bolesnica iznosilo je 23%, što odgovara podacima iz literature (4). Univarijatna analiza utjecaja ispitivanih pokazatelja na ukupno preživljenje bolesnica pokazala je da histološki stupanj tumora, dob bolesnice i klinički stadij bolesti (FIGO) imaju prognostički značaj, dok pokazatelji proliferacijske aktivnosti tumorskih stanica (USF) i aneuploidija tumora nisu pokazali to svojstvo. Multiparametrijska analiza izdvojila je dob bolesnica i klinički stadij bolesti kao vjerodostojne pokazatelje preživljenja bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika. Kako bi vjerodostojnost dobivenih pokazatelja staničnog ciklusa za prognozu bolesnica sa seroznim karcinomom jajnika bila veća, istraživanje bi trebalo napraviti na uzorku većeg broja bolesnica svrstanih u podjednako brojne histopatološke i kliničke skupine. BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4,

10 Sadržaj DNA u seroznim tumorima jajnika L. Bilić-Zulle i sur. FLOW CYTOMETRIC DNA PLOIDY IN PATIENTS WITH SEROUS OVARIAN CARCINOMA: ANALYSIS WITH ModFIT LT PROGRAM SUMMARY - Flow-cytometric DNA analysis was performed retrospectively from paraffin-embedded blocks in 30 patients with ovarian serous carcinoma. Tumor proliferative actwity and ploidy status ivere related to patients' age, histological stage of the tumor, FIGO classification and suruival. There was a significant correlation betuieen total proliferative activity and histological stage of the tumor, since higher proliferative activity ivas found in less differentiated tumors. However, both univariate and multivariate analysis of clinical, path.ohistological and flowcytometric da ta shoived no prognostic significance of DNA-parameters for the overall survival of patients. More studies with larger number of patients in each clinical arm are needed bcfore the value of DNA-analysis of serous ovarian cancer can be unequivocally deterniined. LITERATURA 1. Pfisterrer J, Kommoss F, Suuerbrei W, et al. Cellular DNA content and survival in advanced ovarian carcinoma. Cancer 1994;74: Kaern J, Trope CG, Krinstensen GB, Pettersen EO. Flow cvtometric DNA ploidy and S-phase heterogeneitv in advanced ovarian carcinoma. Cancer 1994:73: Serou SF, Scully RE, Sobin LH. Histological typing of ovarian tumors. Geneva: World Health Organization, Gompel C, Silverberg G. Pathology in gynecologv and obstetrics. 3rd ed. Philadelphia: J.B.Lippincott, 1985, Hcdley DW, Friedlander ML, Tayl,or IW, Rugg CA, Musgrovc EA. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry. J Histochem Cytochem 1983;31: Vindelov LL, Chriatensen. U, Nissen NI. A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Cytometry 1983; 3: Wersto RP, Liblit RL, Koss LG. Flovv cytometric DNA analvsis of human solid tumors:a review of the interpreta tion of DNA histograms. Hum Pathol 1991;22: Hiddemann W, Schumann J, Andreeff M, et al. Convention on nomenclature for DNA cytometry. Cytometry 1984;5: Hiddemann W, Schumann J, Andreeff Met al. Convention on nomenclature for DNA cytometry. Cancer Gcnet Cytogenet 1984;13: Khoo SK, Battistutta D, Hurst T, Sanderson B, Ward BG, Free K. The prognostic value of clinical, pathological and biological parameters in ovarian cancer. Cancer 1993;72: ModFIT LT User Guide, Verity Softwai-e House, Inc., SAD, Hedley DW, Shankey TV, Wheeless LL. DNA cytometry consensus conference. Cytometry 1993;14: Bagivell CB, Mayo SW, Whetstone SD, et al. DNA histogram debris theory and compensation. Cytometry 1991;12: BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 4, 1996.