MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN

Size: px
Start display at page:

Download "MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN"

Transcription

1 Jakintza-arloa: Natur Zientziak MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN Egilea: BEÑAT ZALDIBAR ARANBURU Urtea: 2006 Zuzendaria: Unibertsitatea: JUAN ANTONIO MARIGÓMEZ ALLENDE UPV/EHU ISBN:

2 Hitzaurrea Dagoeneko ia bi urte igaro dira tesia aurkeztu nuenetik eta denbora tarte horretan argiak diren zenbait aldaketa nabarmentzen dira. Tesiaren zati teorikoan aipatzen den moduan bi ildo nagusi jorratu dira. Lehendabizi moluskuen eta nagusiki muskuiluen liseri-guruineko zelulen berriztapenaren azterketa burutzen da. Horretarako, gaur egun indarrean dauden zenbait teknika immunohistokimiko erabili dira. Ohikoak eta aski ezagunak ugaztunetan baina zenbait kasutan oraindik ere ornogabeetan guztiz hedatu gabe daudenak (antigorputz espezifikoen faltagatik edota ehunen ezagutza oraindik ere oso sakona ez delako). Bigarren ildoa, moluskuen liseriepitelioan gerta daitezkeen aldaketak ingurumen-osasunaren ebaluaketan erabiltzen diren biomarkatzaileetan nolako eragina duten ikertzea izan da. Biomarkatzaileak antolakuntza maila biologiko sinpleenetan (maila zelular, molekular zein tisularrean) gertatzen diren aldaketak dira eta antolakuntza maila biologiko konplexuagoetan (populazio edo ekosistema) sortaraz daitezkeen alterazioak aurresateko lagungarriak izan daitezke. Ahalik eta erantzun goiztiarragoen bilaketa dela eta, azkenengo urteotan biologia molekularreko tresnak gero eta gehiago nabarmenduz joan dira eta omics bezala ezagutzen diren jarduerak (genomics, proteomics, metabonomics ) gero eta pisu zein garrantzi gehiago hartuz joan dira. Egungo biologiaren tendentzia ikusita, zalantzarik gabe gaur berriz ere nire tesiarekin hasiko banintz, tresna molekularren erabilpenak pisu gehiago izango luke. Hau da, zelulen proliferazioa aztertzeko immunohistokimikak egiteaz gain, hau da, proteina jakin bat ehunean lokalizatzeaz gain, proteina hori kodetzen duen RNA mezularia lokalizatzen saiatuko nintzen in situ hibridazioak eginez. Eta, biomarkatzaileen atalari dagokionez, zelula- eta ehun-mailako biomarktzaileak erabiltzeaz gain, ziur aski, maila molekularreko biomarkatzaileren bat ere (gene ezagun baten adierazpen-maila, adibidez) erabiliko nuke. Dena den, ugaztunetan aski garatuak dauden teknologia hauek, ornogabeetan, aldiz, oraindik lehendabiziko urratsak betetzen ari dituzte. Aurretik aipatutako guztia egia bada ere, urtean Valery Forbes ikertzaileak argitaratutako artikulu batean, gaur egungo biomarkatzaileen erabilpena eta tendentzia (aipatutako omics teknologia) zalantzan jartzen ditu. Bertan, biomarkatzaileak, kutsatzaileak nolako mekanismo zelular eta molekularren bitartez eragiten duten ezagutzeko baliogarriak direla esaten du, baina bere izaera prediktiboaren gainean hodei ilun bat ezartzen du. Hori dela eta, ingurumen toxikologian lan egiten dugunoi, epe luzeko esperimentu konplexuak egitera bultzatzen gaitu, beraz, ez dirudi hurrengo urteotan lan falta izango dugunik. Aldaketa klimatikoa ahaztu gabe, noski, baina hori beste historia bat da

3 ZOOLOGIA ETA ANIMALI ZELULEN BIOLOGIA SAILA DEPARTAMENTO DE ZOOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR ANIMAL MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN Beñat Zaldibar Aranburu Biologian Doktore Gradua lortzeko aurkeztutako memoria Leioa 2006ko Otsaila

4

5 Ikerlan honek hurrengo laguntzak izan ditu: Euskal Herriko Unibertsitatea (240110) proiektua ( ) eta Ikerkuntza-talde kontsolidatuei emandako laguntzak (2001. tik aurrera) Eusko Jaurlaritza (PI ) proiektua ( ) eta ETORTEK- BERRILUR proiektua ( )

6

7 ZOOLOGIA ETA ANIMALI ZELULEN BIOLOGIA SAILA DEPARTAMENTO DE ZOOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR ANIMAL MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN Beñat Zaldibar Aranburu Biologian Doktore Gradua lortzeko aurkeztutako memoria Leioa 2006ko Otsaila

8 I.- ZATI TEORIKOA Moluskuen liseri-guruina Bibalbioak (Mytilus eredua) Gastropodo itsastarrak (Littorina eredua) Lehorreko gastropodoak (Arion eredua) Liseri-guruinaren plastikotasuna Epitelioaren aldaketa morfologikoak Zelula-moten ordezkapena Liseri-guruineko epitelioko zelulen plastizitatea Epitelio-ehunen berriztapena Epitelioetako zelula amak Zelulen proliferazioa aztertzeko teknikak Fluxu-zitometria Nukleotidoen analogoen erabileran oinarrituriko teknikak H-timidinaren bitartezko markaketa...28 Bromodeoxiuridina bitartezko markaketa Antigeno nuklearren immunohistokimikan oinarrituriko teknikak...31 Ki67 antigenoaren immunohistokimika...31 PCNA antigenoaren immunohistokimika...32 Ziklinen menpeko kinasen immunohistokimika...33 Ziklinen immunohistokimika Geneen adierazpenaren azterketan oinarrituriko teknikak Zelula amen bitartez berriztaturiko epitelioak Ugaztunen epidermisa Ugaztunen hestea Ugatz-guruina Krustazeoen hepatoarea Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioak Area Listu-guruinak Ugaztunen gibela Moluskuen liseri-guruina...52

9 II.- AUZIAREN EGOERA, HIPOTESIA ETA HELBURUAK...69 III.- EMAITZAK ETA EZTABAIDA Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseriguruinean Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseriguruinean eta urdailean Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseri-guruin eta urdailean: sasoi, adin eta erregimen marealari lotutako aldamoldeak Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean Liseri-zelulen tberriztapena kadmio eta kerosenozko nahasketa baten pean esperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko epitelioan Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean eta bere eragina biomarkatzaileen gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien artean lekuzaldatze-esperimentuak IV.- ONDORIOAK ETA TESIA...217

10 Zati Teorikoa Lan honetan, estuki erlazionaturiko bi ildo nagusi jorratu dira. Lehenengoan molusku desberdinen liseri-epitelioko zelulen berriztapena nola burutzen den, eta zelulamota desberdinen kopurua eta proportzioa nola eta zein faktoreen arabera aldatzen diren aztertu da. Bigarrenean, moluskuen liseri-epitelioaren osaketa zelularrean zenbait faktorek bultzatutako aldaketek, ingurumen-toxikologian erabiltzen diren parametroen gainean norainoko eragina duten ikertu egin da. Bi ildo horiek, memoria honetan emaitza eta ondorioak aurkeztu dituzteneko 6 kapituluetan behin eta berriro uztartuko dira, jorratutako gaiak honako hauek izanik: 1) Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseriguruinean. 2) Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseriguruinean eta urdailean. 3) Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseri-guruin eta urdailean: sasoi, adin eta erregimen marealari lotutako aldamoldeak. 4) Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. 5) Liseri-zelulen berriztapena kadmio eta kerosenozko nahasketa baten pean esperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko epitelioan. 6) Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean eta bere eragina biomarkatzaileen gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien artean lekuzaldatze-esperimentuak. Zati teorikoa, bere aldetik, bi atal nagusitan antolatuta dago. Lehenengo atalean, ikerlan honetan erabilitako material biologikoa aurkeztu egin da, Mytilus galloprovincialis muskuilu, Littorina littorea magurio eta Arion ater barearen liseri-guruinen biologia zelular eta tisularrari buruz dakizkigun oinarrizko kontzeptuak azalduz, hain zuzen ere. Halaber, beharrezkoa iruditu zaigunean, beste moluskuen espezieen ezaugarriak ere aintzat hartu dira, moluskuen liseri-guruinaren azalpen integratu eta konparatua osatzeko asmoz. Oro har, liseri-guruinaren funtzioak eta bere osagai zelularren deskribapena eta funtzioak azaldu dira. Gainera, moluskuen liseri-epitelioa plastikotasun handikoa denez, zelulamoten osaketa ingurumen-faktoreen eraginaren arabera nola eta noraino alda daitekeen adierazi dugu. Halaber, zelula-moten artean nagusiak ohi diren liseri-zelulen lisosomen edukia eta egitura ingurumen-faktoreen arabera ere alda daitekeenez, eta aldaketa horiek ingurumen-toxikologian biomarkatzaile gisa erabiltzen direnez, zelula-moten osaketaren aldaketek biomarkatzaileen gainean eduki dezaketen eraginaz ere aritu gara atal honen azken parrafoetan. 3

11 Zati Teorikoa Bigarren atalean, epitelio-ehunetan zelulen berriztapena nola eman daitekeen azaltzen saiatu gara, oso laburki izan bada ere. Arestian, zelula amei buruzko zenbait oinarrizko orokortasunak adierazi dira. Gero, zelulen proliferazioa detektatzeko gaur arte erabilitako metodo ezagunenak azaldu dira. Azkenik, epitelioen berriztapenerako mekanismoen barianteak azaldu dira, hoberen ezagutzen diren zenbait epitelioren kasuen deskribapena emanez. Barianteak, duten estrategia orokorraren arabera bi taldetan sailkatu dira: (a) zelula amen bitartez berriztatzen diren epitelioak, eta (b) zelula amen partehartze zuzena ez duten epitelioak. Zati teorikoaren ostean, ikerlan honen hipotesia eta helburuak azaldu dira; emaitzei buruzko 6 kapituluen ostean, tesia eta ondorioak. Bukatzeko, memoria honen azken atala, erabilitako metodo, prozedura eta protokolo nagusiak zehazten dituen Metodologi- Eranskina dugu. 4

12 Moluskuen liseri-guruina 1.- MOLUSKUEN LISERI-GURUINA Moluskuen liseri-guruina heste ertaineko egitura da, eta elikagaiak xurgatu egiten direneko adarkatutako dibertikuluz osatuta dago. Nahiz eta molusku talde desberdinen artean aldakortasun handia egon, eskuarki organo handia da oso. Dibertikuluetan liseriketa intrazelularra gauzatzen da. Halaber, liseriketa estrazelularrean parte hartzen duten entzima batzuen sintesia ere bertan burutzen da. Oro har, elikagaien liseriketaz gain bestelako hainbat funtzio betetzen ditu, organismoaren eraenketa metabolikoa eta homeostasiaren arduradun nagusia izatea, besteak beste. Liseri-guruinak, ikerketa esparru desberdinetan interes handia piztu du. Izan ere, animali talde desberdinen liseri-traktuaren eboluzio orokorra ulertu ahal izateko gakoorganoa da. Alde batetik, liseriketa intrazelular (berezkoa izaki primitiboetan) eta estrazelularraren (berezkoa izaki eboluzionatuetan) arteko bidegurutze ebolutiboa da. Bestalde, liseri-traktu ertainari asoziaturiko guruin primitiboenetakoa dugu. Ikerlan honetan zehar erabilitako hiru molusku espezietan liseri-guruinaren antolakuntza morfofuntzionalean hiru eredu desberdin bereiz ditzakegu, zehaztasun gehiagoz banan-banan jarraian azalduko direnak Bibalbioak (Mytilus eredua) Mytilus galloprovincialis muskuilua bibalbio janari-iragazlea dugu. Iragazi beharreko partikulak, mukiaren bitartez bildu eta ezpai-palpoetarantz, eta ondoren ahorantz, garraiatzen dira. Gerora, hestegorri laburra igaro ondoren, iragazitako partikulak konplexua den urdailera heltzen dira (Salvini-Plawen, 1988). Behin urdailean, partikulak estilo kristalinoaren eraginaren ondorioz birrindu egiten dira, urdailean dauden entzima hidrolitikoek lehendabiziko liseriketa estrazelularra burutuz. Urdaila traktu ziliatu desberdinetan banatuta dago. Bertan, partikulak euren tamainaren arabera sailkatu eta banandu ondoren, liseri-guruineko dibertikuluetarantz bideratzen dira, liseri-konduktuen sistematik. Liseri-konduktu primarioak urdailetik abiatzen dira, eta beraietatik adarkatzen diren kalibre txikiagoko liseri-konduktu sekundarioak liseri-guruineko dibertikuluetara iristen dira (Morton, 1983). Liseri-guruina, anatomikoki bereizgarriak diren bi lobuluz osatuta dago, ezkerraldekoa eta eskubialdekoa, hain zuzen (Owen, 1966). Antolakuntza histologikoari dagokionez, hierarkizatutako antolakuntza lobularra ere antzeman da (1. Ird.; Basalo, 5

13 Zati Teorikoa 1998). Ehun konektibo dentsozko kapsula liseri-guruinaren bi lobuluak inguratzen ditu. Kapsula horrek loditze-gune nabarmen batzuk agertzen ditu, zeintzuetatik urdaila enkapsulatzen duen ehun konektibo dentsozko kapsularekin bat egin arte trenkada sendoak proiektatzen baitira. Horrela, dibertikuluen multzoak trenkada sendoen artean murgilduta agertu dira (lobulutxo primarioak). Lobulutxo primario bakoitza konduktu primario baten inguruan antolatuta dago. Lobulutxo primarioen barruan ehun konektibozko xaflek inguratutako lobulutxo sekundarioen taldekapenak bereizi dira. Horrela lobulutxo sekundario bakoitzean 5-10 dibertikulu daude, konduktu sekundario berari lotuta daudenak (Basalo, 1998). Urdaila zein konduktu primarioen inguruan muskulu leuna dago; konduktu sekundario eta dibertikuluetan, ordea, gero eta muskulu gutxiago agertzen da. Izatez, dibertikuluetan ez da muskulu leunaren zantzu esangarririk aurkitu (Basalo, 1998). Gaur egun molusku bibalbioentzat onartuta dagoen liseri-guruinaren eredua Mortonek proposatu zuen urtean. Eredu horren arabera, liseri-guruina, urdailetik abiatutako konduktu (primario eta sekundario) adarkatuen bitartez konektaturik dauden 1. Irudia: Masson-Golder tindaketa trikromikoaz tindatutako muskuiluaren liseriguruinaren ebakien irudiak. (A) Muskulu-ehun eta ehun konektibozko trenkada bat ikus daiteke. Gezi estuek muskulu-zelulak adierazten dituzte. Gezi lodiek trenkadaren zatirik zabalena adierazten dute. Izarrek, ehun konektibotan joriak diren trenkadaren zatirik estuenak adierazten dituzte. (B) eta (C) irudiek lagin baten gune beretsuan mikrometro batzuen distantzian hartutako bi ebakin erakusten dituzte. Geziek trenkadak adierazten dituzte. Eskala-marra: 100 μm. (Basalo-tik (1998) hartua). 6

14 Moluskuen liseri-guruina tubulu itsuz osaturik dago (2. Ird.). Dena den, ebakien gainean interpretazioak egiterakoan eredu tubular honek zenbait arazo sortu ditu. Tubuluak oso adarkatuta baldin baleude, oso luzeak ez balira behintzat, ukondo eta bihurguneen hainbat irudi behatuko lirateke ebakietan, eta irudi hauek, berriz, urriak dira. Halaber, tubuluak oso adarkatuta ez baldin baleude (Salvini-Plawen, 1988), konduktuak oso handiak izan beharko lirateke, eta ebakietan agertzen diren konduktuen ebakidurak, berriz, urriak dira. Azkenik, konduktu eta tubuluen arteko loturen bi dimentsiotako irudi eskematikoak plazaratu diren arren (Owen, 1966; Salvini-Plawen, 1988; Beninger & LePennec, 1991), eskema horiek 3-dimentsiotako (3-D) antolakuntza espaziala ezin dute argiro azaldu. Gainera, liseri-dibertikuluetan ematen den fluidoen sarrera- eta irteera-prozesuak eta liseriketa intrazelularrerako dibertikuluen epitelio-zeluletan ematen diren xurgapen-, jariapen- eta iraizpen-prozesu koordinatuak nekez azaldu daitezke eredu tubular honen arabera. Aitzitik, 3-D berreraiketak eginez, muskuiluen liseri-guruinean unitate morfofuntzionala liseri-albeoloa dela frogatu da (3. Ird.; Marigómez et al., 1995a; 1995b; Quincoces, 1995; Lekube, 1997). Liseri-albeoloak, konduktu sekundariotik irekitzen dira, 2. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako muskuiluaren liseri-guruinaren ebakinen irudiak. (A) Liseri-guruinaren ikuspegi orokorra, bertan (K) liseri-konduktuak, (G) liseri-albeoloen ganbarak eta (A) ehatz itxurako luzakinak bereiz daitezke. Ehun konektiboak liseri-egiturak inguratzen ditu. (B) Hatz itxurako luzakin baten soslaia xehetasun gehiagoz ikusten da. Bertan liseri-zelulak (LZ), eta zelula basofilikoak (ZB) bereiz daitezke. 7

15 Zati Teorikoa 3. Irudia: Mytilus galloprovincialis muskuiluen liseri-albeoloen plastikotasunaren irudi adierazgarriak. (A) 3Dberreraiketaz lortutako unitate morfofuntzionalaren 3D-modeloa. Bertan konduktua, ganbara eta bertatik ateratzen diren behatz itxurako proiekzioak (zenbakiekin adieraziak) bereizi daitezke. Ikus behatz itxurako proiekzioen tamaina itsasaldi-erregimenaren arabera nola aldatzen den (A-1, marearteko muskuilua; A-2 mareazpiko muskuilua). (B) Liseri-albeoloen morfologia eta tamainaren aldaketak ingurumen-baldintzen arabera. Estres peko egoeretan albeoloen bolumenaren proportziorik handiena ganbarari dagokio, tendentzia hori estres egoera gogortzen den heinean (gezia) markatuagoa agertzen delarik. (C) Liseriketa-faseak zati distaletatik ganbara-alderaino bidaiatzen hartzen duten zentzua (gezia). Zati distalean proiekzioak nagusiki atseden-fasean aurkitzen dira eta ganbara-aldean berriztapen-fasean, berriz. 8

16 Moluskuen liseri-guruina eta, Mortonen ereduko liseri-tubuluak ez bezala, estrukturalki konplexuak dira. Konduktutik gertuen dagoen albeoloaren zatia zabalduta agertzen da (ganbara) eta bertatik behatz itxurako luzakin tubularrak (4-10 proiekzio) proiektatzen dira. Zenbait kasutan, luzakin horiek alde distalean banatuta egon daitezke, eta konduktu sekundario eta ganbararen artean estugunea (lepoa) ere ager daiteke. Ganbara zapalduta dago, eta bere dimentsiorik txikienean ez da behatz-itxurako luzakinen kalibrea baino handiagoa. Hori dela eta, tubuluen ukondo edo adarkatze-gune moduan interpretatu da hainbat lanetan, eta zenbait kasutan ere gemazio bidez agertutako tubulu berrien sorgune gisa (Palmer, 1979). 3-D berreraiketak emandako ikuspegi berri hori, kriohausturaz lortutako laginak ekorkuntzazko mikroskopio elektronikoan aztertuz egiaztatu egin da (Basalo, 1998) (4. Ird.). Aipatutako albeoloen deskribapena muskuiluen kasuan indibiduo helduentzat baliagarria da, baina muskuilu gazteetan (maskorraren luzera <1 cm) liseri-albeoloa desberdina da oso. Ganbarak oso zabalak dira, eta bertatik dozenaka behatz-itxurako luzakin ateratzen dira. Dirudienez, muskuilu gazteen liseri-guruinean unitate morfofuntzional horien kopurua txikia izango litzateke, eta zenbait kasutan konduktu primario bakoitzetik unitate bakarra aterako litzateke (Lekube, 1997). 4. Irudia: Muskuiluen liseri-guruinaren eredu albeolotubularraren irudi eskematikoa (V. Asensioren kortesiaz) 9

17 Zati Teorikoa 5. Irudia: Liseri-zelula eta zelula basofilikoaren ultrastrukturaren irudi eskematikoa. (A) Liseri-zelularen sistema endo-lisosomiko garatuaren osagaiak bereiz daitezke. (B) Zelula basofikoaren soslaia piramidala da, eta erretiku endoplasmatiko pikortsua eta Golgi sistema oso garatuak ditu. (Owen-tik (1973) birmoldatua). Liseri-albeoloen epitelioan nagusiki 2 zelula-mota aurkitu dira, liseri-zelulak eta zelula basofilikoak (Owen, 1972) (2. eta 5. Ird.). Liseri-zelulak (5. eta 6. Ird.) azidofilikoak dira. Itxurari dagokionez prismatikoak dira, baina kubikoak ere izan daitezke. Erpinaldea, mikrobiloxkez hornituta dago. Mikrobiloxken kopurua eta garapena oso aldakorra da, zelulen egoera metabolikoaren arabera 6. Irudia: Transmisiozko mikroskopio elektroniko bidez lortutako Mytilus galloprovincialis muskuiluaren (A) liserizelula (handipena x6000) eta (B) zelula basofilikoaren (handipena x9000) irudiak. Liseri-zelulan sistema endolisosomiko garatua argiro beha daiteke. (N) nukleoa, (M) muskulua, (BL) xafla basala, (RB) hondakin-gorputza, (HL) heterolisosoma, (HP) heterofagosoma, (JC) lotura-konplexua. Zelula basofilikoa, ordea, elektrodentsoagoa da eta erretikulu endoplasmatiko pikortsua eta Golgi sistema oso garatua ditu. (N) nukleoa, (GC) Golgi-konplexua, (CT) ehun konektiboa (LF) lipofuszina. (Cajaraville-tik(1989) birmoldatua). 10

18 Moluskuen liseri-guruina (Cajaraville et al., 1991). Zelula hauek, sistema endo-lisosomiko oso garatua dute, liseriketa intrazelularra beraien funtziorik nagusiena delako (Robledo & Cajaraville, 1996). Alboetako eta oinaldeko mintzek interdigitazio eta inbaginazioak erakusten dituzte. Endozitosi-besikula, heterofagosoma, heterolisosoma, eta hondakin-gorputz ugari daude. Endozitosi-besikulak mikrobiloxkekin erlazionaturik agertzen dira, zelularen erpinaldean (Owen, 1970; Pal, 1972; Henry et al., 1991). Heterofagosomak, besikula erregularrak eta tamaina aldakorrekoak dira, eta, orokorrean, hauek ere erpinaldean deskribatu dira (Owen, 1973). Heterolisosomak, zelularen erdialdean agertzen dira, heterofagosomak baino handiagoak eta esferikoak dira, eta beraien barneko materiala oso heterogeneoa da. Azkenik, hondakin-gorputzak zelularen oinaldean agertzen dira. Hondakin-gorputz horiek argira askatzen dira, konduktu primario eta sekundarioen argietan ere aurkitu direlarik (Cajaraville, 1989). Zelula-basofilikoak (5. eta 6. Ird), liseri-zelulak baino kopuru txikiagotan agertzen dira liseri-hodietan. Itxura piramidala dute, eta erpinaldean mikrobiloxkak dituzte. Mintzak, oinaldean zein alboetan, inbaginazio txikiak ditu. Zelula hauen ezaugarri garrantzitsuena basofilia da, duten erretikulu endoplasmatiko pikortsu ugaria dela eta (Henry, 1987). Horretaz gain, Golgi aparatua ere oso garatua dute. Nukleoa orokorrean zelularen oinaldean agertzen da. Autore batzuk, bigarren zelula basofiliko bat deskribatu dute, Cardium edule (Owen, 1970) edo Mytilus edulis (Thompson et al., 1974) moluskuetan. Bigarren zelula basofiliko hori, flagelatua omen da. Bibalbioen liseri-epitelioaren morfologia aldakorra da, izan ere liseriketa prozesua ziklikoa eta dinamikoa denez, aurrera doan heinean liseri-albeoloen epitelioek liseriketafase desberdinei dagozkien itxura desberdinak erakusten dituzte (7. Ird., Langton, 1975; Robinson & Langton, 1980; Morton, 1983): (a) I mota edo atseden-fasea; (b) II mota edo xurgatze-fasea, (c) III mota edo desegite-fasea; eta (d) IV mota edo berregite-fasea. Prozesuaren koordinazioa dela eta, eredu tubularrean oinarrituta molusku bibalbioen artean klasikoki bi motatako liseriketa-jarduera bereiztu dira: monofasikoa eta bifasikoa. Liseriketa monofasikoan, liseri-guruinean tubulu-mota bakarra izango litzateke nagusi une bakoitzean, fotoperiodo edo eta itsasaldiaren arabera. Jarduera-mota hori Dreissena polymorpha, Cardium edule, Ostrea edulis eta Scrobicularia plana espezieetan deskribatu da (Morton, 1969; 1970; 1971; Owen, 1972). Liseriketa monofasikoan liseriketaziklo bakoitzean, hau da, itsasaldi-ziklo bakoitzean, II motako tubuluek, I motako tubuluak ordezkatzen dituzte, eta amaieran III motako tubuluak dira nagusi. Liseriketa bifasikoan, ordea, aldi berean bi tubulu-mota nagusituko lirateke. Prozesu hau Lasaea rubra, Cardium edule eta Ostrea edulis espezieetan deskribatu da (McQuiston, 1969; Owen, 1972). Kasu 11

19 Zati Teorikoa horretan, III motako tubuluen proportzioa liseriketa prozesuan zehar konstante mantentzen da, eta I eta II motako tubuluen artean txandakatzea suertatzen da itsasaldi-zikloan zehar (McQuiston, 1969). Edozein modutan, tubulu guztietara elikagaia aldi berean, neurri berean eta konposizio berarekin heltzen ez denez, liseri-guruinean 4 liseriketa-faseak (tubulu-motak) bereiz daitezke aldi berean, proportzio oso desberdinetan bada ere (McQuiston, 1969; Robinson & Langton, 1980; Robinson, 1983). Lau tubulu-moten existentzian oinarrituz, liseriketa intrazelularra azaltzeko teoria bat plazaratu zen (Morton, 1983; Henry, 1987; Beninger & Le Pennec, 1991). Elikagaiak heldu bitartean, tubuluak atseden-fasean egongo ziren. Elikagaiak tubuluetara iristerakoan, liseri-zelulek elikagaiak xurgatuko lituzkete (xurgatze-fasea), eta liseriketa bukatzearekin batera zelula asko deuseztatuko ziren (desegite-fasea). Azkenik, hurrengo liseriketa-zikloari ekin ahal izateko, epitelioa zelula berriez hornituko zen (berregite-fasea). Teoria horren arabera, liseriketa-zikloa eta epitelioaren berriztapen-zikloa koordinaturik egongo ziren (Morton, 1983), eta zelulen berriztapen masiboa ordu gutxitako epean suertatu beharko zen. Hau da, liseri-epitelioan zelulen berriztapen-maila izugarri handia izan beharko litzateke, eta liseri-tubuluetako epitelioa partzialki (liseriketa difasikoa) edo guztiz (liseriketa monofasikoa) berriztatua izango litzateke elikatze-ziklo bakoitzeko, etengabe. Aitzitik, epitelio-zelulen zatiketa ez da batere konspikuoa liseri-epitelioan (Marigómez et al., 1998a). 7. Irudia: Liseriketa prozesuan zehar muskuiluen liseri-epitelioak hartzen dituen morfologia desberdinak. (A) Atseden-fasea, (B) Xurgatze-fasea, (C) Desegitefasea (D) Berregite-fasea. (Langton-tik (1975) birmoldatua). 12

20 Moluskuen liseri-guruina Eredu albeolarra aintzat hartzean, tubulu-moten existentziaren eta euren txandakatze-ereduaren esangura fisiologikoa oso bestelakoa dela frogatu da. Izan ere, M. galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruinean egindako 3-D berreraiketek, liseriketafaseak zati distaletatik ganbara-alderaino bidaiatzen duten eta albeolo bereko luzakinetan zehar modu sinkronikoan aurrera egiten duten uhinen moduan agertzen direla erakutsi dute (3C Ird.; Marigómez et al., 1995a; 1995b). Hau da, luzakinen zati distalen epitelioan atseden-fasea nagusitzen den bitartean, hurrengo lakainetan xurgatze- eta desegite-fase txandakatuak agertzen dira, ustezko berregite-fasea ganbara-alderantz nagusituz doalarik (Quincoces, 1995). Bestalde, entzima- eta lektina-histokimika, eta morfometria aplikatuz, liseri-zelulen ezaugarrietan oinarritutako liseriketa-faseen esangura fisiologikoa berraztertu 8. Irudia: ß-Glukuronidasa entzimaren (A) eta WGA lektinaren bidezko N-azetil glukosamina hondarren (B) detektapen histokimikoa liseri-guruineko epitelioan liseriketa-fase desberdinetan. Sailkapen klasikoaren arabera: A- 1/B-1 atseden-fasea izango litzateke, A-2/B-2 xurgatze-fasea, A-3/B-3 desegite-fasea eta A-4/B-4 berregite-fasea. Jarduera entzimatiko eta lektinen emaitzen arabera, liseriketa-faseen sailkapena aldatu beharko litzateke. Atsedenfasea, xurgatze-fasea izan beharko litzateke (WGA marka bortitza epitelioaren erpinaldean (B-1)), xurgatze-fasea, liseritze-fasea (entzimaren jarduera nabarmena eta WGA markaketa lisosometan (A-2 eta B-2)), desegite-fasea, liseritze-fase berantiarra (oso lisosoma handiak (A-3)) eta berregite-fasea, atseden-fasea (lisosoma txiki eta urriak eta WGA markaketa difuso eta ahula epitelioan zehar barreiatuta (A-4 eta B-4)). 13

21 Zati Teorikoa da (8. Ird., Marigómez, argitaratu gabe). Berregite-fase "klasikoa" delakoa seguruenik atseden-faseari legokioke, liseri-zeluletan lisosoma urriak izanik, ezaugarri histokimikoek hori adierazi baitute. Izan ere, marearteko muskuiluak uretatik kanpo nahiko denbora igaro ondoren (hau da, elikatzerik ez dutenean), IV-motako tubuluen morfologia nagusitzen da (Cajaraville et al., 1991; 1992). Halaber, datu berriek mantentze-fase "klasikoa" xurgapenfaseari legokiokeela erakutsi dute, eta desegite-fase delakoan dauden albeoloak xurgapen-fase berantiarrari edo liseriketa intrazelularraren fase aurreratuari legozkieke (Marigómez, argitaratu gabe). Interpretazio berri honetan, epitelioaren berriztapena inolaz ere kontuan hartu ez dena azpimarratzekoa da Gastropodo itsastarrak (Littorina eredua) Prosobrankio itsastarretan, urdailetik atera ostean elikagaia liseri-guruinera heltzen da. Liseri-guruina, gonadarekin batera agertzen da, liseri-gurina/gonada konplexua izeneko organoa osatuz (9. Ird.). Liseri-guruinak normalean erraien parterik handiena 9. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako magurioaren liseri-guruina/gonada konplexuaren ebakinen irudiak.(a) Ikuspegi orokorra, bertan liseri-gurineko dibertikuluak eta gonada-folikuluak tartekatuak ikus daitezke.(b) Liseri-azino baten soslaia xehetasun gehiagoz beha daiteke. Bertan liseri-zelulak (LZ) eta zelula basofilikoak (ZB) bereizi daitezke. 14

22 Moluskuen liseri-guruina betetzen du; ugalketa garaian izan ezik, noiz gonadaren tamaina asko emendatzen baita. Hala ere, liseri-guruinean tamaina desberdineko 2 lobulu bereiz daitezke, orokorrean ezkerreko lobulua handiagoa delarik. Urdaileko aurrealdera 3 konduktu labur eta adarkatugabez lotuta dago liseri-guruina. Liseri-guruina hainbat azino adarkatuez osatuta dago (Fretter & Graham, 1962), eta bertan elikagaien xurgapena eta liseriketa zein hondakinen andeatzea eta iraiztea burutzen dira (Merdsoy & Farley, 1973). Prosobrankio itsastarren liseri-guruinean oinarrizko bi zelula-mota daude, liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia (10. Ird.). Liseri-zelula, (syn., guruin-zelula, xurgapen-zelula, zelula hepatiko, gibel-zelula, bakuolo-zelula, zelula jariatzaile) kolumnarra da, eta erpinaldean mikrobiloxka ugari eta proteinetan joriak diren pikor zitoplasmatikoak dauzka (Lufty & Demian, 1967; Mason 1983; Voltzow, 1994). Oinaldean, zenbaitetan errefringentea izan daitekeen eduki heterogeneoa duten besikulak agertzen dira. Tamaina txikiko nukleoa, orokorrean erdialdean edo oinaldean kokatzen da. Zelula-mota honen zeregin nagusia liseriketa intrazelularra burutzea da (Voltzow, 1994). 10. Irudia: Liseri-zelula eta zelula basofilikoaren irudi eskematikoak. (A) Zelula basofikoaren soslai piramidala eta erretiku endoplasmatiko garatua ikus daitezke, beste organuluekin batera. (B) Liseri-zelula egitura kolumnarra dauka eta morfologia desberdinak har ditzake liseriketa fasearen arabera. (cl), zilioa; (cr), zilioaren gorputz basala; (mv), mikrobiloxkak; (ps), proteinazko jariapen-pikorrak; (cy), zitosola; (gr), pikor mineralizatuak; (rer), erretikulu endoplasmatiko pikortsua; (mi), mitokondrioa; (sv), iraizte-pikorra (gb), diktiosoma; (lin), tolesdura laterala; (nu), nukleoa; (nue), nukleoloa; (bin), tolesdura basala; (bl), xafla-basala; (m), muskulua; (hae), hemozianina; (lu), lumena; (dv), liseri-bakuoloa; (li), lipidoa, (pv), pinozitosi pikorra; (rb), hondakin-gorputza. (Mason-etik (1983) hartua). 15

23 Zati Teorikoa Zelula basofilikoa, (syn., zelula jariatzailea, kripta-zelula, iraizte-zelula, hartzitzezelula) liseri-zelula baino urriagoa da (Lufty & Demian, 1967; Mason 1983; Voltzow, 1994). Hematoxilina-eosinaz tindatzerakoan, zitoplasma liseri-zelularena baino askoz basofilikoagoa suertatzen da, izena hortik datorkiolarik. Itxura piramidala edo konokara izanik, banaka zein 3-4 zeluletako multzoetan ager daiteke, askotan liseri-tubuluen ertz periferikoei asoziatuta. Nukleolo oso nabarmena daukan nukleo handia ageri da oinaldean. Erretikulu endoplasmatiko pikortsua oso garatua dago, eta nukleoaren inguruan kokatzen da. Bestalde, mintz-pikor zitoplasmatikoen presentzia nabarmena da. Batez ere erpinaldean dauden pikor batzuk oso elektrodentsoak dira, eta seguruenik jariapenproteinez osatuta daude. Oinalderagontz sakabanaturik dauden beste pikorretan, ordea, fosfato kaltzikoa dugu osagai nagusi (Mason, 1983; Marigómez et al., 1990). Zelula basofilikoek, kaltzioaren garraioan eta metaketan parte hartzen dute, eta liseriketa estrazelularrerako entzimak jariatzen dituzte (Owen, 1956; Fretter & Graham, 1962; Merdsoy & Farley, 1973; Mason, 1983). Magurioen liseri-guruinean, nahiz eta muskuiluetan deskribatzen diren "tubulumota" desberdinak ez agertu, liseri-zelulen pikorren kopuru eta morfologiaren arabera liseriketa-prozesuarekin erlazionatutako 3 edo 4 fase bereiztu dira (11. Ird., Sáez et al., 1990). Xurgapen-fasean pikor eosinofilikoak agertzen dira erpinaldeko ertzean, eta apur bat beherago purpura kolorea hartzen duten pikor ilunak. Liseriketa-fase goiztiarrean 11. Irudia: Liseri-zelulek liserike-fase desberdinetan erakusten dituzten morfologia desberdinen irudi eskematikoa. (A) Xurgatze-fasea. Bertan zelularen erpinaldean pikor eosinofilikoak agertzen dira, eta euren azpian pikor ilun eta txikiagoak agertzen dira. (B) Liseriketa-fase goiztiarra. Pikor eosinofilikoak erpinaldean ageri dira eta pikor ilunak oinalderantz zabaltzen dira. (C) Liseriketa-fase berantiarra. Erpinaldean pikor eosinofilikoek darraite eta oinaldean pikor ilunekin batera lipofuszinen antzeko pikor horiak ageri dira. Pikor horiok fase honen karakteristikoak dira. (D) Iraizte-fasea. Erpinaldean urriak diren pikor eosinofilikoak zenbait kasutan bakuoloen barruan ageri dira. Lipofuszinen antzeko pikorrak oso nabarmenak dira (Sáez et al.-etik (1990) hartuta). 16

24 Moluskuen liseri-guruina aipatutako pikor ilunagoak zelula osoan zehar barreiaturik agertzen dira. Liseriketa-fase berantiarrean, pikor ilunetaz gain lipofuszinen antzeko pikor horiak oinaldean nabarmentzen hasten dira (Sáez et al., 1990). Azkenik, iraizte-fasean pikor gutxiago agertzen dira, eta bakuolo txikien zein lipofuszina-pikorren presentzia nabaria da. Prozesu hori, itsasaldien erregimenarekin estuki erlazionatuta dago. Izan ere, liseriketa batez ere itsasbeherako egoeretan gauzatzen da (Sáez et al., 1990) Lehorreko gastropodoak (Arion eredua) Arion ater barearen liseri-guruina gorputzaren atal handia betetzen du, eta anatomikoki bereizgarriak diren bi guruin-zatitan bananduta dago: aurreko guruin-zatia, normalean txikiena, eta atzeko guruin-zatia. Bi guruin-zati horiek, papoarekin (aurreko guruin-zatia) eta urdailarekin (atzeko guruin-zatia) bi konduktu bereizien bitartez komunikatuta daude (Roach, 1968). Guruin-zati horiek, aurrekoa zein atzekoa, hainbat lobulutan daude bananduta (12. Ird., Runham & Hunter, 1970). Lobulu bakoitza, adarkatuak zein multzoka agertzen diren hainbat dibertikuluz osatuta dago. Liseridibertikuluak unitate adenomerikoz daude osaturik. Unitate adenomerikoan (13. Ird.), liserikonduktu izeneko gune zentral zabala dago, eta bertatik azino-itxurako zabalguneak adarkatzen dira (liseri-azinoak). 12. Irudia: Arion ater barearen liseri-sistemaren irudi eskematikoa. Bertan elikagaien liseriketan parte hartzen duten organo desberdinak ageri dira eta liseri-guruinaren izaera lobularra bereiz daiteke. (Argaud & Bounoure-tik (1910) birmoldatua). 17

25 Zati Teorikoa Liseri-konduktuen zein liseri-azinoen epitelioak berdintsuak dira, eta zelula-mota berdinez osatuta daude (13. eta 14. Ird.). Liseri-konduktuak kalibre txikiko iraizte-kanal izeneko konduktuetara irekitzen dira, gerora papo zein urdailarekin konektatzen duten konduktuetara zabaltzen direnak. Iraizte-kanalen epitelioa ziliatua da. Zilioen mugimenduei esker elikagaiak liseri-konduktuetatik kanporantz bultzatzen dira. Bestalde, liseriguruinaren konduktuen inguruan ehun konektibo eta muskulu-ehun oso garatuak daude. Muskulu horrek, urdaileko uzkurketekin batera, elikagaiak liseri-guruinerantz barneratzen dituelarik (Walker, 1972; Luchtel et al., 1997). Liseri-azino eta -konduktuen epitelioan 3 zelula-mota deskribatu dira: liseri-zelula, iraizte-zelula eta kaltzio-zelula (Walker, 1969; Moya, 1973; Babula & Wielinska, 1988) (15. eta 16. Ird.). Autore batzuen arabera, laugarren zelula-mota bat ere egongo litzateke, estua eta desberdintzatu gabea, Deroceras reticulatum barearen kasuan beste 3 zelula-moten aitzindaritzat jo dena (Walker, 1972). Aitzitik, Walker-en (1971) arabera, liseri-zelula iraiztezelula bilaka liteke. Izan ere, beste autore batzuek ere, iraizte-zelulak liseri-zelula heldu edo zaharkitutzat hartu dituzte (Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Liseri-zelula kolumnarra da (35-40 μm-ko altuera). Erpinaldean mikrobiloxkak eta endozitosi-besikulak agertzen ditu. Bertan, lisosomak ere aurkitu dira (Bowen, 1970; Triebskorn, 1991), endozitosi-besikulekin fusionatuz gero fagolisosomak ematen dituztenak. Fagolisosomek, zenbait tindaketaz kolore berdea hartzen dute, eta horregatik green granules (pikor berde) izena eman zaie. Erpinaldeko pikor berde horietan elikagaien 13. Irudia: Liseri-konduktu eta liserialbeoloen irudi eskematikoa. Bertan egitura lobulatuak eta liseri-guruinaren osagai desberdinak ikus daitezke. 1.- Iraizte-kanala, 2.- Iraizte-kanalaren epitelioa, 3.- Kapilarea, 4.- Kapilarearen zeharkako sekzioa, 5.- Kapilarearen ebakidura ukondo baten altueran, 6.- Liseri-konduktu bati atxikitutako eta hainbat azinoz inguratutako kapilarea, 7.- Liserikonduktua 8.- Aktibo dagoen epitelioaren irudi eskematikoa, 9.- Inaktibo dagoen epitelioaren irudi eskematikoa, 10.- Azinoen gainazaleko ikuspegi orokorra (Marigómez). 18

26 Moluskuen liseri-guruina eskurapena eta liseriketa burutzen dira. Oinalderagontz askoz handiagoak diren eta liseriketaren hondakinak diren lipofuszinez osatuta dauden yellow granules (pikor hori) agertzen dira (Walker, 1972). Nukleoa oinaldean kokaturik dago, eta bere inguruan erretikulu endoplasmatikoa, Golgi aparatua eta zenbait kasutan glukogenoa eta lipidotantak ere agertzen dira (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Ezaugarri utrastruktural berezia manosoma izeneko mintz-egitura dugu (Baumforth et al., 1998). Manosomek, sei hodiko errosetatan antolatuta daude, eta hornidura entzimatikoa espezifikoa (manitol oxidasa) dute (Moya & Rallo, 1975; Czarna et al., 1985; Baumforth et al., 1998). Dirudienez, manosomak gastropodo lurtarren liseri-zeluletan arruntak dira (David & Götze, 1963). Oinaldeko zitoplasman, ioi-garraioarekin erlazionatutako fosfatasa alkalino jarduera behatu da (Bowen & Davies, 1971). Liseri-zelulek liseriketa-prozesuan zehar itxura desberdina erakutsi dezakete, altueraz zein mikrobiloxken eta pikor zitoplasmatikoen kopurua aldatuz (Sumner, 1965). Kaltzio-zelulak (syn., kripta-zelula; zelula jariatzailea) itxura piramidala duten zelulak dira (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Erpinaldean mikrobiloxkak dituzte, 14. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako barearen liseri-guruinaren ebakien irudiak. (A) Liseri-guruinaren ikuspegi orokorra, bertan liseri-azino (A) eta -konduktuak (K) ikus daitezke. (B) Liseri-azino baten soslaia detaile gehiagoz beha daiteke. Bertan liseri-zelulak (LZ), iraizte-zelulak (IZ) eta kaltzio-zelulak (KZ) bereizi daitezke. 19

27 Zati Teorikoa 15. Irudia: Liseri-zelula, kaltzio-zelula eta iraizte-zelularen (A) eta (B) Liseri-zelularen egitura kolumnarra eta sistema endo-lisosomiko garatua bereiz daiteke. (C) Kaltzio-zelularen soslaia piramidala da eta kaltzio pikorrak errez bereiz daitezke. (D) Iraizte-zelularen bakuolo handia da zelula-mota honen egiturarik bereizgarriena. (Walker-tik (1972) birmoldatua). eta horien azpian mitokondrioak, erretikulu endoplasmatiko leuna eta hainbat besikula pleomorfiko agertzen dira. Zelularen erdialdean proteinetan joriak diren besikulak paraturik daude. Oinaldean, nabarmenki handia den nukleoa aurkitu da. Lipido-tantak xafla basalaren gaineko zitoplasmaren eremuan ager daitezke. Zelulan zehar material heterogeneoa duten pikor biribilak ageri dira tipikoki. Pikor horiek, geruza kontzentrikoz paratutako matrizea dute, X-izpien mikroanalisia eta beste metodoen bitartez, behintzat Helix aspersa barraskilo eta Arion rufus barearen kasuetan frogatu denez, kaltzio, 16. Irudia: Transmisiozko mikroskopio elektroniko bidez lortutako bareen (A) liseri-zelula (handipena x 2500), (B) kaltzio-zelula (handipena x31400) eta (C) iraizte-zelularen (handipena x3500) irudiak. Liseri-zelulan sistema endolisosomiko garatua beha daiteke. Kaltzio-zelulan, pikorren geruza kontzentrikoak bereiz daitezke. Iraizte-zelularen erpinaldean dagoen bakuolo handian izaera desberdineko pikorrak ikus daitezke. (Luchtel et al-tik (1997) birmoldatua). 20

28 Moluskuen liseri-guruina magnesio eta fosforoz (CaMgP 2 O 7 moduan) osatuta dagoena (Howard et al., 1981; Mason & Simkiss, 1982; Janssen, 1985). Horregatik, pikor horiei kaltzio-esferula izena eman zaie, eta zelulei kaltzio-zelularena. Hala ere, beste zenbait elementu ere badaudela egiaztatu da, manganesoa, burdina, kobaltoa eta zinka, besteak beste (Simkiss, 1981; Mason & Simkiss, 1982, Recio et al., 1988). Kaltzio-zelularen funtzioari dagokionez, proposamen ezberdinak plazaratu dira. Ikertzaile batzuen arabera, barne-medioaren ph-a orekatzeko indargetzaile gisa funtzionatuko luke kaltzioak (Krigjsman, 1928). Beste autore batzuen aburuz, kaltzio-zelulek metabolismo orokorrean eta muki-ekoizpenean ezinbestekoa den kaltzio kantitate handien biltegi gisa funtzionatuko lukete (Walker, 1971). Iraizte-zelulek erpinaldean mikrobiloxka ugari dituzte, eta hauen azpian hainbat pikor eta mitokondrio, erretikulu endoplasmatikoa eta diktiosomak. Hala ere, zelula hauen ezaugarririk deigarriena zelularen bolumen gehiena betetzera irits daitekeen bakuolo handia da (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Bakuoloaren edukina heterogeneoa da, eta batez ere lipofuszinez osatuta dago. Lehen aipatu den bezala, autore batzuen arabera, iraizte-zelulak liseri-zeluletatik eratorriak izan litezke (Walker, 1971), afera hori oraindik ere eztabaidan dagoen arren (Dimitriadis & Konstantinidou, 2002) Liseri-guruinaren plastikotasuna Epitelioaren aldaketa morfologikoak Liseri-guruinaren egitura ez da egonkor mantentzen; aitzitik, egoera desberdinen aurrean plastikotasun handia erakusten du. Hainbat ikerlanek deskribatutakoaren arabera, ingurugiroaren estres-iturrien pean, estrusio apokrino/holokrino eta aufogafia prozesuen emendioa behatu da liseri-epitelioan (Soto et al., 1996). Izan ere, kutsatzaile organiko zein ez-organikoen pean egondako moluskuetan eta baita bestelako estres orokorreko egoeratan (adb., baraualdiaren ondorioz), liseri-epitelioan aldaketa morfologiko esanguratsuak behatu dira, epitelioaren altueraren murrizpena eta zelula-moten proportzioaren aldaketak, bestek beste (Lowe et al., 1981; Couch, 1984; Marigómez et al., 1986; 1993; 1996; 1998b; 2005; Recio et al., 1988; Vega et al., 1989; Cajaraville et al., 1991). Liseri-epitelioaren batez besteko lodiera adierazteko MET (ingelesezko Mean Epithelial Thickness) parametroa erabili da. Dena den, MET parametroak ezin du bere osotasunean liseri-guruineko epitelioak pairatutako aldaketa estruktural guztiak azaldu. Liseri-dibertikuluaren tamaina adierazten duen MDR (ingelesezko Mean Diverticular 21

29 Zati Teorikoa Radius) eta lumenaren kalibrearen adierazlea den MLR (ingelesezko Mean Luminal Radius) parametroek ere informazio baliotsua eman dezakete, eta baita MLR/MET eta MET/MDR parametro erlatiboek ere (Vega et al., 1989). Orokorrean, estresatutako moluskuen MET eta MDR balioak baxuak eta MLR balioak altuak dira. Hala ere, aldaketa morfologikoak ez dira beti espero bezala. Zenbait ikerlanetan, MET jaistearekin batera, MDR mantendu edo igo daiteke (Cajaraville et al., 1991; Cajaraville et al., 1992). MDR, batez ere, estres-iturri iraunkorren aurrean jaisten da esangarriki. Bestalde, marearteko bibalbioen kasuan, liseriketa-jarduera fasikoek ere liseri-epitelioaren altueraren gain eragina dute. I eta II motetako tubuluen morfologia duen liseri-epitelioa IV motetakoena baino garaiagoa da (7. Ird.). Gainera, estres-egoeretan, MLR goratzearekin batera, IV motako tubuluen morfologia duen epitelioaren hedapena ere emenda daiteke (Cajaraville et al., 1991). Azkenik, zenbait egoera patologikotan, kasik epiteliorik gabeko tubulu atrofikoei legokioken V motako epitelio-morfologia aurkitu da (Couch, 1984). Halaber, muskuiluen liseri-guruinaren kasuan liseri-albeoloen morfologia eta tamaina ere ingurumen-baldintzen arabera alda daitezke. Alde batetik, hatz itxurako proiekzioen tamaina, itsasaldi-erregimenaren arabera desberdina izan daiteke. Bestalde, egoera normaletan hatz itxurako proiekzioak nabarmenagoak diren bitartean, estres peko egoeretan albeoloen proportziorik handiena ganbarari dagokio, 3D-berreraiketetan oinarrituta frogatu den moduan (3. Ird.; Quincoces, 1995; Lekube 1997). Oro har, ingurumen-baldintzen arabera suertatutako aldaketa morfologikoek, epitelioaren masa, hots zelulen masa edo kopurua, oso aldakorra dela agerian utzi dute. Gainera, aldaketak, itzulgarriak izanik, ordu gutxitan suertatzen dira gehienetan. Horri esker, epitelio-zelulen berriztapenaren garrantziaz jabetu gara, nahiz eta, gerora azalduko denez, epitelio honen berriztapenari buruz ezer gutxi dakigun Zelula-moten ordezkapena Morfologian ez ezik, liseri-guruineko epitelioa osatzen duten zelula-moten presentzia erlatiboan ere aldakortasun esanguratsua aurkitu da. Oro har, egoera fisiologiko eta patologiko jakin desberdinetan zelula basofilikoen presentzia erlatiboa areagotu daitekeela deskribatu da. Erantzun hori orokorra da molusku espezien artean, xenobiotiko organiko eta metal pean egondako magurio zein bibalbioetan (Rasmussen et al., 1983; Lowe, 1988; Cajaraville et al., 1990; 1991; Marigómez et al., 1990; Soto et al., 1997, 2002), eta metal pean egondako bareetan (Marigómez et al., 1986, 1996, 1998b) deskribatu den bezala. Gainera, bestelako estres-egoeretan (adb., baraualdia eta bizkarroein presentzia) 22

30 Moluskuen liseri-guruina ere erantzun-mota bera aurkitu da (Yoshino, 1976; Marigómez et al., 1992; 1993). Esaterako, Mytilus edulis muskuiluek baraualdi luzea jasan ostean, flagelodun eta flagelobako zelula basofilikoen kopuru erlatiboak gora egin zuela ondorioztatu zen (Thompson et al., 1974). Gainera, dirudienez, zelula-moten proportzioaren aldaketa behin behinekoa dirudi. Adibidez, Littorina littorea magurioaren kasuan, petrolio-eratorrien pean egotearen ondorioz zelula basofilikoen proportzioak gora egin arren, erantzuna itzulgarria dela ikusi da (Widdows et al., 1984). Testuinguru honetan, behatutako zelula-moten kopuru erlatiboen aldaketa liserizelulen kopuruaren jaitsiera edo zelula basofilikoen proliferazioaren bitartez burutzen ote den argitzeke dago. Litekeena da prozesu biak, liseri-zelulen narriadura eta zelula basofilikoen proliferazioa, aldi berean gertatzea. Izan ere, zelula basofilikoen kopuru eta desegite-faseko liseri-epitelioaren hedapenaren artean korrelazio positibo esangarria aurkitu da (Cajaraville et al., 1990). Beste autore batzuen arabera, ordea, zelula basofilikoen proliferazioa estresak induzitutako liseri-zelulen galeraren aurretik gertatuko litzateke (Thompson et al., 1974). Zentzu horretan, Widdows et al.-ek (1984) diotenez, xenobiotikoek zelula basofilikoen kopuruaren igoera eragingo lukete, estres-egoerei aurre egiteko zelula hauek ekoitzitako entzimen eskari handiagoa bailego. Estres kronikoa pairatu duten bareetan ere, kaltzio-zelulen kopuru erlatiboren balio altuak ikusi dira. Esaterako, kupre-meatzaldean bizi diren bareen liseri-guruineko epitelioan zelula-mota nagusia kaltzio-zelula dugu, liseriketa-jarduerei zein kaltzioaren metabolismoari dagokienez liseri-guruina berezia izanik (Marigómez et al., 1998b) Liseri-guruineko epitelioko zelulen plastizitatea Lehenago aipatu den bezala, liseri-zelulak oso sistema endo-lisosomikoa garatua dauka, lisosomek zelularen bolumen gehientsua betetzen dutelarik (Marigómez & Baybay- Villacorta, 2003). Lisosomen gainean estres-iturri desberdinek eragina izan dezakete, kutsadura kimikoak, gazitasun-estresak, muturreko tenperaturek altua, baraualdiak eta ugalketari asoziaturiko estres-egoerak, besteak beste (Lowe et al., 1981; Moore et al., 1987; Lowe, 1988; Cajaraville et al., 1991; 1995a; Marigómez et al., 1991, 1996; Regoli, 1992; Krishnakumar et al., 1995; Domouhtsidou & Dimitriadis, 2001). Oro har, liseri-zelulen lisosometan gerta daitezkeen aldaketak hiru taldetan sailka daitezke: tamainaz emendatzea, mintza desegonkortzea eta edukinen izaera aldatzea (Marigómez et al., 2005). Lisosomen erantzunak berehalakoak dira, eta zenbait kasutan tamainaz emendatzea eta mintza desegonkortzea kitzikadura jaso eta ordu gutxitara dagoeneko 23

31 Zati Teorikoa behatu dira (Lekube et al., 2000; Izagirre et al., 2005). Hori dela eta, lisosomen erantzunak estres-biomarkatzaile goiztiar gisa kontsideratu dira (Cajaraville et al., 2000; Marigómez & Baybay-Villacorta, 2003; Marigómez et al., 2005). Dena dela, lisosomen erantzunak bai kutsatzaile-motaren arabera, bai esposiziodenboraren arabera eta baita esposatutako kontzentrazioaren arabera desberdinak izan daitezke. Metalen pean egondako muskuilu eta magurioen liseri-zelulen lisosomen dentsitate bolumetrikoaren emendatzen den bitartean (Marigómez et al., 1990), kutsatzaile organikoen pean egondakoen kasuan, kutsatzailearen izaera, esposizio-denbora eta kontzentrazioaren arabera erantzun ezberdinak behatu dira. Esaterako, petrolioaren hidrokarburo eta azetonaren pean egondako muskuiluetan, hasiera batean lisosomak txikiagoak diren arren (Cajaraville et al., 1995b; Cancio et al., 1998, Marigómez & Baybay- Villacorta, 2003), esposizio luzeagoak tamainaz emendatzea dakarkie (Cajaraville et al., 1995b). Aitzitik, di(2-etilhexil)ftalato gisako zenbait kutsatzaile organiko pean egoteak, hasiera-hasieratik lisosomak tamainaz emendatzea eragin dezake (Marigómez & Baybay- Villacorta, 2003). Azkenik, zelula basofilikoei dagokienez, aipatutako kopuru erlatiboaren emendioa gertatzeaz gain, zelulen morfologia eta ultrastrukturan ere aldaketak aurkitu dira (Marigómez et al., 1998b; Triebskorn & Kohler, 1996). Kadmio kontzentrazio subletalen pean egondako magurioetan, zelula basofilikoen hipertrofia eta basofiliaren galera behatu dira, eraldatutako zelula basofiliko hauek liseri-zelula eta zelula basofilikoen arteko morfologia erakutsi dutelarik (Marigómez et al., 1990). Ingurumen kutsatuetan mantendutako Mizuhopecten yessoensis bibalbioaren liseri-epitelioan ere, tarteko itxurako zelula basofilikoak deskribatu dira (Syasina et al., 1997). 24

32 Epitelio-ehunen berriztapena 2.- EPITELIO-EHUNEN BERRIZTAPENA Zelula eukariotikoak, jatorriz aske bizi ziren banakako izakiak izan arren eboluzioan zehar izaki zelulanitzen partaide espezializatuak bilakatuz joan dira. Hori dela eta, modu independentean bizitzeko ezinbestekoak ziren ezaugarriak galduz joan ziren, izaki zelulanitzak beren osotasunean bizirik mantentzeko derrigorrezko ezaugarri berriak eskuratuz joan ziren bitartean. Izaki zelulanitza osatzen duten zelulak, nahiz eta genoma bera partekatu, elkarren artean arras desberdinak dira. Zelulek, aniztasun zabaleko zereginak buru ditzaketen organoetan antolatutako hamaika ehun desberdin itxuratzeko elkarlanari ekiten diote. Ehunak eta organoak behar bezala ulertzeko, zelulen lan egiteko modua eta habitat desberdinetan nola bizi eta hiltzen diren ezagutzea beharrezkoa da (Alberts et al., 2002). Epitelio-ehuna, animaliak osatzen dituzten lau oinarrizko ehun-motetako bat dugu. Oro har, bi era desberdinetan antolatuta dago, zelulen xafla jarrai moduan edo guruin moduan. Epitelio-ehunek, oso funtzio desberdinak burutzen dituzte, babespena, zelulen arteko garraioa, xurgapena, jariapena eta iragazkortasuna, besteen artean. Epitelioen sorrera eta mantentzearen inguruan oinarrizko hainbat galdera erantzuteke daude oraindik ere. Zenbait epiteliok, hestea edo larruazala kasu, zelulen ordezkatze-tasa handia erakutsi dute (Potten & Loeffler, 1990), beste zenbaitek, ordea, gibela edo area kasu, egoera normalean ordezkatze-tasa geldoagoa dute, berriztapen azkarrak behar izatekotan moldaera bereziak erakutsi dituzten arren (Finegood et al., 1995; Slack, 1995; Alison et al., 1997). Hurrengo orrialdeetan azalduko diren barne-faktore dibertsoen eraginaz gain, farmakoek, gaixotasunek, ebakuntza kirurgikoek eta ingurumen-faktoreek ere epitelioen berriztapen-tasa eraendu dezakete. Euren artean, argia/iluntasun zikloa faktore nagusitakoa omen da, askotan zelulen proliferazioaren dinamikaren erritmoak eta zikloak patroi zirkadiarren arabera gauzatzen baitira. Adibidez, hainbat zianobakterio eta protistotan, DNAren sintesia gauez baino ez da ematen. Hori, babes-mekanismo moduan interpretatu da, egunez erradiazio ultramoreak DNAren kopia akastunen ekoizpena bultza lezakeelako (Reddy et al., 2005). Animalien artean ere, antzeko portaerak behatu dira, bai arrainen epidermisean (Dekens et al., 2003) eta baita ugaztunen hezur-muinean (Abrahamsen et al., 1997) zein bestelako epitelio-ehunetan ere (Bjarnason & Jordan, 2002; Barbeito et al., 2003; Brandi et al., 2004). 25

33 Zati Teorikoa Atal honetan, epitelio desberdinetan zelulen berriztapena zein mekanismoren bitartez suertatzen den aurkeztuko dugu. Lehendabizi, sarrera gisa, zelula amen kontzeptuaren inguruan orokortasun batzuk eta zelulen proliferazioa aztertzeko teknika eskuragarriak azaldu dira laburki. Gerora, epitelioen berriztapenaren estrategia desberdinak aurkeztu dira, bi estrategia bereiziz: (a) egoera normaletan zelula amen bitartez berriztatzen diren epitelioak; eta (b) nahiz eta bertan ere zelula amak egon, normalean desberdintzatutako zelula helduen bitartez berriztatzen diren epitelioak Epitelioetako zelula amak Duela 40 urte inguru, ehun bereko bestelako zelula-motak emateko gai ziren zenbait zelula somatiko topatu ziren, zelula amak alegia. Zelula somatiko horiek, lehenengo aldiz saguen ehun hematopoietikoan deskribatu ziren (Till & McCullog, 1961). Azken urteotan, zelula amen presentzia bestelako ehun-mota desberdinetan ere demostratu da, epidermisean, muskuluan, gibelean eta burmuinean, besteak beste (Gage, 2000; Slack, 2000). Epitelio gehienek, zelula amak dituzte (Slack, 2000). Zelula amak definitu nahian, modu funtzionalean egitera behartuta gaude; kasu gehienetan epitelioko gainontzeko zelulekiko inolako desberdintasun morfologikorik ez baitute. Zelula amak deskribatzen dituzten ezaugarri funtzionalak honako hauek ditugu (Alberts et al., 2002): 1.- Guztiz desberdintzatu gabeko zelulak dira. 2.- Mugarik gabe zati daitezke edo, behintzat, organismoak bizirik dirauen bitartean zatitzeko gaitasuna manten dezakete. 3.- Zatiketa zelularra burutu ostean, zelula kume bakoitzak bi aukera ditu; zelula ama izaten jarraitu edo eta derberdintzapen-bidea bukaeraraino eraman. Epitelio bateko zelula-mota desberdin guztiak sortzeko gaitasuna (multipotentzialitatea) zelula amak identifikatzeko sarritan erabili den ezaugarria da. Tamalez, gehienetan, gaitasun hori ehuna kaltetu denean baino ez da azaltzen. Hau da, egoera normalean zelula ama gehienek desberdintzatutako zelula-mota bakarra produzitzen dute (unipotentzialitatea). Gibelaren kasuan, adibidez, hepatozitoen berriztapenaz hepatozitoak beraiek arduratzen dira (Michalopoulos & DeFrances, 1997), baina, edozein arrazoia dela medio, hepatozitoen zatiketa inhibituta baldin balego, hepatozitoen berriztapena konduktuetako zelulek burutuko lukete (Alison et al., 1997). Zatiketa zelularraren zinetika ikertu ondoren, zelula amek orokorrean bikoizpentasa baxua dutela ondorioztatu da, espero ez bezala. Izatez, epitelio-ehunetan gehien zatitzen diren zelulak zelula anplifikatzaile iragankorrak edo TAC (Transit Amplifying Cell) 26

34 Epitelio-ehunen berriztapena deitutakoak dira. TAC zelulak hainbat zatiketa-ziklo pairatu eta gero, desberdintzapenprozesuan sar daitezke. Euren kopurua altua denean, ehunak desberdintzapenerako gaitasun handia duela ikusi da, zelula ama urriak izan arren (Hall & Watt, 1989). Oro har, ehunetan zatitzen diren zelulak, zelula amak zein TAC zelulak, toki berezietan daude kokaturik. Esaterako, hestearen kasuan zelula amak Lieberkühn kripten zati distaletik gertu kokatuta dauden bitartean, TAC zelulak kriptaren altueraren bi heren distaletan paratuta daude, eta desberdintzatutako zelulak, aldiz, batez ere heren proximalean kokaturik agertu ohi dira (Potten & Loeffler, 1990) Zelulen proliferazioa aztertzeko teknikak Ziklo zelularraren kontzeptua, hamarkadaren inguruan plazaratu zen arratoien barrabiletan autorradiografiazko teknikak erabiliz 32 P-aren inkorporazioa DNAn behatu ondoren (Howard & Pelc, 1950). Ikerlan horren ondorioz, ziklo zelularra 4 fasetan banandu zen G 1 -, S-, G 2 - eta M-faseak, alegia. Lau fase horietatik deigarriena, eta ikuspuntu morfologiko batetik interesgarriena, M-fasea (mitosia) da. Bertan, nukleoa zatitu egiten da, eta zelula batetik bi zelula kume sortzen dira. Mitosia gertatu eta gero, zelula kumeak, G 1 -fasean edo lehenengo hazkuntza-fasean sartzen dira. Bertan, zelula sortu berriak bere ingurua aztertzen du, eta hazteari ekiten dio. Tamaina nahikoa lortu eta gero, eta seinale egokia jasoz gero, S-fasean (sintesia) sartzen da. Bertan nukleoko DNA bikoiztu egiten da, eta, DNA zeharo erreplikatuta egon ondoren, zelula G 2 -fasean sartzen da. Bertan, zelulak DNA guztiz erreplikatu dela egiaztatzen du, berriro ere hurrengo M- fasean sartu aurretik. G 1 -fasean dagoen zelulak bere ziklo normala geldiarazi dezake, eta espezializatutako atsedenaldian sar daiteke (G 0 -fasea). Bertan, asteak, hilabeteak edo urteak egon daiteke S-fasean berriro sartu arte, beharrezkoa den seinale espezifikoa jasotzearen zain. (Alberts et al.,2002). Ziklo zelularra eraentzen duen kontrol-sistema molekularra, eboluzioan zehar oso kontserbatua da. Esaterako, zelula eukariotiko guztietan zatiketaren kontrolean antzeko proteina eraentzaileek dihardute (Hall & Levinson, 1990). Zelulen proliferazioa ehunetan ikertzeko, proteina horien eta beren ekoizpenaren azterketaz baliatzen diren teknika desberdinak eskuragarri daude. Euren artean erabilienak, fluxu-zitometria, nukleotidoen analogoak erabileran oinarrituriko teknikak, immunohisto(zito)kimika eta geneen adierazpenaren azterketa molekularra (in situ hibridazioa, PCR...) dira. Moluskuetan zelula proliferatzaileak detektatzeko teknikak oso gutxitan erabili dira (1. Taula). Izatez, nahiz eta PCNA edo Ki67 moduko proteinak eboluzioan zehar kontserbatuak izan (Prelich et al., 27

35 Zati Teorikoa 1987; Endl & Gerdes, 2000), moluskuen ehunetan zelula proliferatzaileen identifikazioa nukleotidoen analogoen erabileran oinarritu da batik bat Fluxu-zitometria Teknika honetan, zelulak seinale batez markatzen dira. Seinaleak, itu-proteina bat espezifikoki ezagutzen duen antigorputzen bat zein azido nukleiko berezia ezagutzen duen zunda osagarriren bat izan daitezke. Zelulen esekidura batean zenbait zelula espezifikoki horrela markatu ondoren, laser-izpi batek zeharkatzen duen zulo batetik zelulen esekidura pasarazten da. Orduan, laser-izpiok zeluletan transmititu edo islatu egingo dira, zelulek seinalea daramatenentz arabera. Ondorioz, argia transmititu edo islatu den arabera zelulak karga elektrostatiko desberdinez hornituko dira, eta eremu elektromagnetiko batean zehar pasarazi ondoren banandu daitezke (Alberts et al., 2002). Teknika honen bitartez, zelulen kopurua eta zelula bakoitzak duen DNA kopurua ezagutu daitezke. Izan ere, aneuploidiarik ez egotekotan, G 0 - eta G 1 -fasean dauden zelulak diploideak izango dira, G 2 -fasean dauden zelulak tetraploideak eta S-fasean daudenek tarteko DNA-kopurua izango dute. Beraz, zelulen esekidurak erabiliz eta modelo matematiko egokiak aplikatuz, zatiketa-zinetika ere iker daiteke (Baisch et al., 1982). Zenbait kasutan, histologiarako fixatutako eta parafinan inkluditutako zeluletan ere DNA kopurua kalkula daiteke, laginak desparafinatu eta hidratatu ondoren (Hedley et al., 1983). Fluxu-zitometria, egoera patologiko desberdinak aztertzeko erabili da, eta bere bidez lortutako proliferazio-indizeek tumoreen garapenaren azterketarako ere balio prognostikoa dutela proposatu da (Joensuu et al., 1988). Fluxu-zitometriak, zelula proliferatzaileak detektatzeko bestelako tekniken aurrean daukan abantaila handienetakoa emaitzen objektibotasuna dugu. Gainera, zelulakopuru handiekin lan egin daiteke, eta interesatzen zaizkigun zelulak isolatzea ahalbidetzen du. Bestalde, beharrezkoa den ekipamendua oso garestia da, eta lagina sakabanatu eta desegituratu behar denez, zelula proliferatzaileen kokapena ehunean ez dago aztertzerik. Gainera, zelula proliferatzaileen azpipopulazioak ere galtzen dira Nukleotidoen analogoen erabileran oinarrituriko teknikak 3 H timidinaren ( 3 H-T) bitartezko markaketa Zelulen zinetika ehunetan zuzenean aztertzeko, hamarkadan 3 H timidina tritiatuaren ( 3 H-T) bitarteko markaketa, teknika estandarrena bilakatu zen. Zelula 28

36 Epitelio-ehunen berriztapena bideragarriek 3 H-T DNAn eransten dute S-fasean daudenean (17. Ird.), eta ondoren timidina hori autorradiografia bitartez ikuskor bihur daiteke. Timidina erradioaktiboa, animaliari edo zelulen kultiboari in vivo ematen zaie ( 3 H-T-ren pultsua), eta DNA sintetizatzen ari diren zelulek markatutako timidina beraien DNAn erantsiko dute. Halaber, biopsiaz lortutako materiala eta bestelako lagin-motak aztertzeko, fixapena burutu aurretik denbora-tarte luzez timidinaz inkubatu behar dira. In vivo pultsuak burutzeko zailtasuna, batetik, zein material erradiaktiboa erabili beharra, bestetik, ezaugarri mugatzaileak izanik, azkeneko urteotan 3 H-T gero eta gutxiago erabili da histopatologian. Edozein kasutan, zenbait ikerketa berezi egiteko edo eta ikerkuntz-zentro espezializatuetan teknika hau gaur egun oraindik ere erabilia da (Hale et al., 2003). Bromodeoxiuridinaren (BrdU) bitartezko markaketa BrdU, timidinaren analogoa den molekula da, eta horregatik DNA sintetizatzen den fasean (S-fasea) nukleoan inkorporatzen da 3 H-T moduan (17. Ird.). BrdU inkorporatu duten zelulak immunohisto(zito)kimika bitartez detekta daitezke, BrdUren aurkako 17. Irudia: Ziklo zelularraren fasearen arabera adierazten diren markatzaile molekular desberdinak 29

37 Zati Teorikoa antigorputzak erabiliz, eta mikroskopioan aztertu (18. Ird.; Gratzner 1982; Alison, 1995). BrdU immunohisto(zito)kimika S-fasean dauden zelulak identifikatzeko oso erabilgarria da. Kasu gehienetan antigorputzarekiko eskuragarritasuna emendatzeko DNA desnaturalizatu beharra dago, azido klorhidrikoaz tratatuz edo liseriketa entzimatikoaren bidez (Gratzner et al., 1982; Roberts et al., 1985; Kikuyama et al., 1988). BrdU, injekzio bitartez emandako pultsu moduan edo etengabe ponpa peristaltikoak erabiliz eman daiteke. Gaur egun, teknika hau metodo estandarra bilakatu da, eta horren ondorioz ikerlan desberdinetan 18. Irudia: Zelula proliferatzaileak detektatzeko erabil daitezkeen teknika desberdinek arratoien hestegorrian eman dituzten irudiak. (A) Ki67 immunohistokimika; (B) BrdU immunohistokimika (C) PCNA immunohistokimika; (D) H2b, H3 eta H4 histonen mrnaren in situ hibridazioa. (Muskhelishvili et al.-etik (2003) birmoldatua). 30

38 Epitelio-ehunen berriztapena lortutako emaitzak konparagarriak izatea lortu da. Hala ere, metodo honek bere desabantailak ere badauzka: (1) zenbait kasutan animalia injektatu beharra dago eta beraz baimen bereziak ezinbestekoak dira, (2) BrdU S-fasean eransteaz gain DNA konpontzerakoan ere DNAri eransten zaio, zelula proliferatzaileen gainestimazioa sor lezakeena; eta (3) BrdU mutagenoa denez, epe luzeko ikerketa toxikologikoetan ez da oso komenigarria Antigeno nuklearren immunohistokimikan oinarrituriko teknikak Ki67 antigenoaren immunohistokimika Ki67 proteina nuklearra zelula proliferatzaileak detektatzeko oso antigeno erabilia dugu. Ki67 zelula-mota guztietan G 1 -, S- eta G 2 -faseetan adierazten den bitartean, G 0 - fasean ez da adierazten (17. Irudia; Gerdes et al., 1984; Gerlach et al., 1997). Hori dela eta, ehunaren hazkuntza-mailaren neurketetarako erabil daiteke. Hala ere, momentuz bere funtzioa zein den argitzeke dago (Endl & Gerdes, 2000). Minbiziaren ikerkuntzan zein bestelako gaixotasunen diagnostikoan Ki67 antigenoaren immunohistokimika oso erabilia izan da (18. Ird.; Scholzen & Gerdes, 2000). Hala ere, proteina honen adierazpenaren eta ziklo zelularraren barruan duen kokapenaren inguruan eztabaida ugari dago, eta baita proteinaren biziraupenaz ere (Littleton et al., 1991; Bruno & Darzynkiewicz, 1992; Goldblum & Appelman, 1995; Oka & Arai, 1996; Scholzen & Gerdes, 2000). Antigeno horren desabantailarik garrantzitsuena, antigenoak fixatzaileekiko daukan sentikortasun handia da, kasu gehienetan izoztutako materiala erabiltzera bultzatzen duena, informazio morfologikoaren galera ekarriz (Endl & Gerdes, 2000). Gainera, giza-antigenoaren aurkako antigorputza erabili da gehienetan, hainbat espezieekiko erreakzionagarritasun gurutzatua baxu samarra edo nulua izanik. Zorionez, arazo horri irtenbidea emateko asmoz, bakteriotan adierazitako gizakiaren Ki67 antigenoaren aurkako antigorputz berezia garatu da, MIB-5 izenaz ezagutua dena (Schluter et al., 1993; Gerlach et al., 1997). Izan ere, MIB- 5 antigorputzak, karraskarien Ki67 antigenoarekiko erreakzionagarritasun gurutzatu oso altua du, fixatzaileekiko horren sentikorra ez izanik (Gerlach et al., 1997). 31

39 Zati Teorikoa PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) antigenoaren immunohistokimika PCNA, δ eta ε DNA-polimerasen zein DNAren sintesirako beharrezkoak diren hainbat entzimen proteina laguntzailea dugu (Kurki et al., 1986; Bravo et al., 1987; Wood & Shivji, 1997). PCNA, Miyachi-ren taldeak urtean lehenengo aldiz deskribatu zuen (Miyachi et al., 1978). PCNAren adierazpena G 1 -fasearen bukaera aldera emendatzen da, eta S-fasean zehar lortzen du bere adierazpen mailarik altuena. Ondoren, G 2 - eta M- faseetan adierazpena berriro ere jaisten da (17. Ird.). Berezitasun hauek direla eta, ziklo zelularraren fase desberdinak identifikatzea ahalbide dezake (Foley et al., 1993). PCNAren pisu molekularra 36 kda-koa da, eta immunofluoreszentzia erabiliz bi azpipopulazio bereiztu dira. Lehenengoa, soilik DNAren erreplikapen-guneetan dago, eta DNA ekoizten den bitartean bere kontzentrazioa igo egiten da. Bigarrena, berriz, nukleoplasman sakabanatuta dago, eta ziklo zelularrean zehar beti, gutxi gorabehera, maila beretsuan adierazten da (Bravo et al., 1987). Bi azpipopulazio horiek, fixatzaileekiko sentikortasun desberdina daukate. Fixatzaile aldehidikoz fixatutako ehunetan bi azpipopulazioak detektatzen diren bitartean, fixatzaile alkoholikoak erabiltzen direnean soilik DNAren erreplikapen-guneetan dagoen PCNA detektatzen da (PCNA osoaren %20-30-a). PCNAren biziraupena 20 ordukoa da (Bravo & MacDonald., 1987). Nahiz eta PCNAz markatutako zelula proliferatzaileen indizeak bestelako teknikekin lortutako indizeekin konparatzeko arazoak egon diren (Jain et al., 1991; Yu et al., 1991; Visakorpi, 1992; Sarli et al., 1995), PCNA immunohisto(zito)kimika oso erabilia izan da, bai oinarrizko ikerketa 19. Irudia: Mercenaria mercenaria bibalbioaren zelula proliferatzaileen markaketa PCNA immunohistokimika erabiliz. Geziek marka positiboa adierazten dute eta gezi-buruek nukleo negatiboak. (A) Liseri-guruineko epitelioko zelula proliferatzaileak. B) Zelula proliferatzaileen marka bortitza zakatzen oinaldeko epitelioan. (C) PCNA-markaketa positiboa giltzurruneko granulometan murgildutako hemozitoetan. Eskala marra: 13 μm. (Hanselman et al.-etik (2000) birmoldatua). 32

40 Epitelio-ehunen berriztapena egiteko eta baita pronostiko patologikoetan ere (18. Ird.; Faderl et al., 2002; Lillo et al., 2002). Hala ere, zelula proliferatzaileak detektatzeko PCNAk duen baliogarritasunak hainbat zalantza sortu ditu. Izan ere, PCNAren kopurua zelula-moten zein zelulen egoera fisiologiko edo patologikoen arabera esanguratsuki alda daiteke. Beraz, minbizi-zelulak eta zelula arruntak bereiztu nahi izan direnean, ez da erreza izan zelulen egoera bakoitzari zegozkion PCNA-markaketaren balioak finkatzea (Morris & Mathews, 1989; Hall et al., 1990; Scholzen & Gerdes, 2000). Gainera, PCNAk DNAren konponketan ere parte har dezake, bere adierazpena bikoizten ari ez diren zeluletan ere beha daitekeelarik (Toschi & Bravo, 1988; Wood & Shivji, 1997). PCNA, eboluzioan zehar nahiko kontserbatua den proteina dugu (Prelich et al., 1987). Garatutako antigorputz monoklonal komertzialek, batez ere PC10 izenaz ezagutzen denak, erreakzionagarritasun gurutzatu sendoa erakutsi dute (19. Ird.), ugaztun, intsektu, landare, molusku zein legamien PCNA antigenoekin (1 Taula; Waseem & Lane, 1990; González-Melendi et al., 1996; Marigómez et al., 1999; Hanselman et al., 2000). Ziklinen menpeko kinasen immunohistokimika Zelulen proliferazioa, ziklo zelularreko fase espezifikoetan proteina-kinasa konplexu desberdinek eraenduta dago. Konplexu horiek, azpiunitate katalitiko eta berari lotutako azpiunitate eraentzaileaz osaturik daude. Proteina-kinasa konplexuen azpiunitate katalitikoak ziklinen menpeko kinasak (zmk) dira, eta ziklo zelularrean aurrera egitearen eraentzaile nagusiak dira. Kinasa horien jarduera, ziklo zelularrean zehar igo eta jaitsi egiten da, eta gorabehera horiek ziklo zelularraren gertaera nagusietan (DNAren erreplikapena, mitosia, zitokinesia) gertatzen diren proteina ezberdinen fosforilazioan eragina daukate (Morgan, 1997). Adibidez, zmk jakin baten jarduera mitosiaren hasieran igoz gero, kromosomen kondentsazioan edo mintz nuklearraren apurketan parte hartzen duten proteinen fosforilazioen emendioa bultzatuko litzateke. Hainbat zmk desberdin daude, aipagarrienak zmk-1, zmk-2, zmk-4 eta zmk-6 izanik. Ikerlan aplikatu zein oinarrizko gehienek, lau zmk horiek izan dituzte aztergai (Palacios et al., 2005; Schmetsdorf et al., 2005). Zmk aurkako antigorputzei dagokienez, zmk-1 delakoaren PSTAIRE deitutako gunea ezagutzen duten antigorputzak garatu dira. Gune hori kontserbatua da, eta ugaztunetan gain beste espezie batzuetan antigorputz espezifikoetako elkargarritasun gurutzatua frogatu da (Weinstein et al., 1994). Beste zmk aurkako antigorputzei dagokienez, ugaztunetaz kanpo apenas informaziorik dago. 33

41 Zati Teorikoa 20. Irudia: Ziklina desberdinen adierazpen-mailak ziklo zelularraren fase desberdinetan. Eskuarki ziklina-mota bakoitzak bere adierazpen-piko maximoa ziklo zelularraren fase jakin batean lortzen du. Ziklinen immunohistokimika Proteina hauek, aurrenez aipatutako ziklinen menpeko kinasekin erlazio zuzena dute. Izan ere, ziklinak zmk-konplexuaren azpiunitate eraentzaileak dira. Ziklinak, ziklo zelular bakoitzean sintetizatu eta andeatu egiten dira. Kinasa jarduera, ziklinak zmkei estuki lotzen zaizkienean baino ez da adierazten. Hainbat ziklina-mota desberdin daude, garrantzitsuenak A-, B-, D- eta E-ziklinak izanik (20. Ird.). Ziklo zelularrak aurrera jarrai dezan, D-ziklina zmk4 eta zmk6-ri G 1 -fasean zehar lotu behar zaie (Sherr, 1996). E- ziklinak, zmk2 edo zmk4-ri lotuz, aktibatu egiten ditu, ziklo zelularra G 1 -fasetik S-fasera pasaraziz. A-ziklina, bere aldetik, zmk2-ri S-fasean lotzen zaio, DNAren sintesia ahalbidetuz; eta B ziklina, bestetik, zmk1-ri lotzen zaio, mitosiari bide emanez (Nigg, 1995; Edgar & Lehener, 1996). Ziklinen adierazpena, immunohistokimika bitartez azter daiteke, minbiziarekin erlazionatutako kasuetan (Zhu et al., 2003) zein oinarrizko ikerketetan (Golias et al., 2004) jadanik egin den bezalaxe. Hala eta guztiz ere, ugaztunetatik kanpo ziklinei buruzko ikerlan immunohistokimiko urriak burutu dira (1 Taula) Geneen adierazpenaren azterketan oinarrituriko teknikak Aldez aurretik ikusi dugunez, ziklo zelularra eraentzen duten zenbait proteina une edo fase jakinetan baino ez dira sintetizatzen zikloan zehar, bereziki histonen eta ziklinen kasuan alegia (17. Ird.). Proteina horien adierazpena, antigorputzak erabiliz iker daiteke. 34

42 Epitelio-ehunen berriztapena 1. Taula: Moluskuen ehunetan zelula proliferatzaileak detektatzeko erabili diren teknika desberdinen adibideak. Teknika Espeziea Organoa Erreferentzia 3 H timidina Achatina fulica Bihotz-muskulua Martynova & Bystrova, 2002 Crenomytilus grayanus Liseri-traktua Leibson & Frolova, 1994 Aplysia californica Nerbio-sistema Hickmott & Carew, 1991 Margaritifera Zakatza Tomasovic & Mix, 1974 margaritifera BrdU Planorbarius corneus Mikrogliako Peruzzi & Sonetti, 2004 zelulen kultiboa Sepia officinalis Enbrioia Grimaldi et al., 2004 Melampus bidentatus Garroen nerbiosistema Bale et al., 2001 Pinctada fucata marte nsii Mantu paliala Awaji & Suzuki, 1998 Helix lucorum Protozerebroa Zakharov et al., 1998 Incilaria fruhstorferi Hemozeleko Furuta et al., 1994 zelulak Mytilus galloprovincialis Zakatzak Martínez-Expósito et al., 1994 Ki67 Helix pomatia Listu-guruina Pirger et al., 2004 PCNA Mercenaria mercenaria Liseri-guruina, zakatzak, hemozitoak Hanselman et al., 2000 Mytilus galloprovincialis Liseri-guruina Marigómez et al., 1999 Zmk Aplysia californica Begia Sankrithi & Eskin, 1999 Bulla gouldiana Begia Krucher & Roberts, 1994 Ziklinak Pecten maximus Liseri-guruina Le Pennec & Le Pennec, 2002 Dreissena polymorpha Gonada arra Lamers et al., 1999 Patella vulgata Enbrioia Colas et al., 1993a Patella vulgata Oozitoak Colas et al., 1993b Spisula soldis sima Enbrioia Hunt et al., 1992 Patella vulgata Oozitoak Van Loon et al., 1991 Izan ere, beren funtzioa bete bezain pronto antigenoak andeatu egiten direnez, ziklinen kasu, oso informazio baliagarria ematen dute ziklo zelularraren fasea identifikatu ahal izateko. Esaterako, A-ziklina S-fasearen bukaera-aldera eta G 2 -fasean zehar soilik topa dezakegu, eta B-ziklina, bestalde, G 2 -fasearen bukaera-aldera eta M-fasean zehar baino ez (20. Ird.). Aldiz, kromatinaren proteina estrukturalak diren histonak oso proteina egonkorrak dira, sintetizatu eta gero zelularen ziklo osoan zehar aurki ditzakegularik. Adierazpen iragankorra duten ziklinen kasuan zein adierazpen iraunkorra duten histonen kasuan, proteina horiek ekoizten dituzten RNA mezularien presentzia, proteinak sintetizatzen diren une jakinetan emendatzen dira, gerora maila basaletara itzuliz (17. Ird.). Hau da, histonak egonkorrak diren arren, beren geneak S-fasean zehar soilik transkribatzen dira. Beraz, zelularen batean histonen RNA mezulariak topatzekotan, zalantzarik gabe zelula hori S-fasean dagoena badakigu. Halaber, ziklinen kasuan, ziklina desberdinen RNA mezularien sintesia ziklina bakoitza topatu dugun baino aurreneko fasean zehar areagotuz doa. Adibidez, B-ziklinaren genearen transkribapena G 2 -fasean 35

43 Zati Teorikoa zehar areagotuz doa, M-fasearen hasiera-hasieran genearen adierazpenik altuena ematen delarik. RNA mezulari horiek PCR kuantitatiboaren bidez kuantifika daitezke, DNA-hasle egokiak erabiliz. Era berean, ehunaren gainean molekula horiek lokalizatzeko in situ hibridazioa erabili ahal da, RNA- zein DNA-zunda osagarriak erabiliz. DNA-hasle egokiak diseinatzeko sekuentziaren ezagutza partziala ezinbestekoa da; DNA- eta RNA-zundak diseinatzeko, bestalde, sekuentzia nukleotidikoaren ahalik eta zatirik handiena ezagutu beharra dago. Proteina homologoek espezien artean nolabaiteko kontserbazio-maila duten eta eboluzioan zehar egonkorrak izan daitezkeena jakina da. Haatik, hau ez da egia RNAzunden edota DNA-hasleen kasuan, espezie desberdinen proteina beraren sekuentzia nukleotidikoak oso desberdinak izan baitaitezke. Sekuentzia nukleotidikoek sekuentzia aminoazidikoak baino aldakortasun handiagoa erakusten dute espezien artean, kode genetikoaren endekapenaren ondorioz (aminoazido askotarako 4 kodon ezberdin baitaude), hain zuzen ere. Hau da, antigorputzak erabiliz proteina bera espezie desberdinetan identifika daitekeen arren, RNA-zundek ez dute ezertarako baliogarriak izan behar espezie desberdinetan proteina jakin baten RNA mezulariak identifikatzeko. Beraz, edozein kasutan, ikertu nahi den espeziearen sekuentzia nukleotidikoaren ezagutza minimoa ezinbestekoa da. Moluskuen kasuan, histonen hainbat mrna sekuentzia geneen datu-baseetan argitaratu dira, 320 sekuentziatik gora daude eskuragarri ( hain zuzen ere. Taldez-talde, eta tesi honetan aztertuko diren espeziei erreparatuz, M. galloprovincialis-en histona guztien sekuentzia osoak argitaratu dira (Eirin-Lopez et al., 2002), eta beste mitilido askorenak ere (M. edulis, M. trossulus, M. californianus eta M. chilensis). A. ater eta L. littorea gastropodoen histonen sekuentziarik ez dugu ezagutzen, ordea, guztira pulmonatuen 35 sekuentzia desberdin eta orthogastropodoen 78 sekuentzia desberdin argitaratu diren arren. Oraintsu, muskuiluaren histonen sekuentziak 50 gene desberdineko microarray espezifiko batean erabili dira (Dondero & Viarengo, 2005). Moluskuen ziklinen 18 sekuentzia desberdin ere argitaratuak izan dira. Hala ere, ez da Mytilus, Arion edo Littorina generoen sekuentziarik argitaratu. Argitaratutako sekuentzien artean Dreissenia polymorpha bibalbioaren A-, B-, C- eta D-ziklinen RNA mezularien sekuentzia osoak (Lamers et al., 1999) topa ditzakegu. Halaber, beste bi bibalbioen sekuentziak identifikatu dira, hala nola Spissula solidissimaren A- eta B-ziklinak eta Crasssostrea virginicaren zenbait ziklinen antzekotasun handia duten sekuentzia nukleotidiko laburrak edo EST-ak (ingeleraz, Expression Sequence Tags; CD eta CD A-ziklina; CD eta B-ziklina, CD C-ziklina; CD D2-36

44 Epitelio-ehunen berriztapena ziklina eta CD G1-ziklina; ikus NCBI web orrialdea). Crassostrearen sekuentziak gainera merkurio pean mantendutako animalien eta animali kontrolen transkriptomak konparatuz aurkitu dira; proliferazio zelularra modulatuz ziklina horiek merkurio pean mantendutako ostretan gainadierazi edo azpiadierazi egin baitira (Peatman et al., argitaratu gabe, ikus NCBI web orrialdea). PCNA eta Ki67 sekuentziarik ez da klonatu orain arte. Hala ere, M. galloprovincialis-en 435 base paretako EST bat argitaratu da (AJ516167; Venier et al., 2003, ikus NCBI web orrialdea), zeinen sekuentzia aminoazidikoak Danio rerio eta Ictalurus punctatus arrainen PCNAren sekuentziekiko homologia (homologia: 1e- 29 ) altua baitu Zelula amen bitartez berriztaturiko epitelioak Ugaztunen epidermisa Epidermisa, jatorri ektodermikoa duen larruazalaren oinarrizko epitelio-osagaia da. Zuzenean eta jarraian kanpo-medioarekin kontaktuan egotearen eragina jasotzen duenez, epitelioaren berriztapenak, hots zelulen proliferazioak, ikaragarrizko garrantzia du. Hori dela eta, ugaztunen epidermisa organismo helduetan epitelio-ehunak nola berriztatzen diren ikertzeko ohiko eredu esperimentala izanez, bertako proliferazio zelularraren dinamika eta mekanismoak aski ezagunak dira. Ugaztunen epidermisa, keratinozitoz osatutako epitelio geruzatua da. Keratinozitoek, epidermisari sendotasuna damaion keratina deitutako proteina ekoizten dute. Keratinozitoak epitelioaren oinaldetik erpinalderantz desberdintzatuz doaz, eta gora egiten duten heinean osaketaz eta itxuraz aldatzen dira. Xafla basalaren gainean ezarrita dauden zelulak oinaldeko zelulak dira. Zelula hauek zatitzeko ahalmena dute, geruza germinatiboa konfiguratuz. Euren gainean desmosometan joriak izateari esker epidermisari trinkotasun mekanikoa eskaintzen dioten zelula handiagoak ditugu (Malpighi zelulak). Desmosomen inguruan sortutako arantza itxurako egitura nabarmenak edukitzegatik, zelula hauek osatzen duten epitelioaren zatiari geruza arantzatsu izena eman zaio, zenbait autorek Malpighi geruza ere deitu duten arren. Hurrengo mailan, geruza arantzatsuaren gainean paratuta, pikor zitoplasmatiko elektrodentsoz hornitutako zelulek, geruza pikortsu izenaz ezagututakoa osatzen dute. Geruza pikortsu horrek, metabolikoki aktiboa den epitelioaren barne-zati eta keratinaz betetako zelula hilez osatutako epitelioaren kanpo-zati arteko muga markatzen du. Geruza keratinotsua 37

45 Zati Teorikoa 21. Irudia: Epidermiseko zelula amen kokapena eta beraien banaketa ugaztunetako larruazalean zehar. Baban kokatzen diren zelula amek zatitu ondoren papila dermikora, gantz-guruinera zein epidermisaren oinaldera migratzen dute, ondoren desberdintzapen-bidean sartuz. (Spradling et al.-etik (2001) birmoldatua). izenekoa osatzen duten kanpo-zatiko zelulak etengabe askatzen dira. Gizakiaren kasuan, adibidez, geruza keratinotsua milaka aldiz berriztatu behar da bizitzan zehar. Geruza germinatiboan zelula amez osatutako keratinozitoen azpipopulazio berezia dago, epidermiseko zelula, ile-folikulu eta izerdi-guruinetako zelulen aitzindari izango dena (Lavker & Sun, 2000). Zelula amok bi tokitan kokaturik daude nagusiki, folikuluen arteko epidermisean eta ile-folikuluaren konkorraren aldean (21. Ird.), azken horiek zatiketan gogotsuago dihardutelarik (Ghazizadeh & Taichman, 2001). Larruazaleko zelula amak normalean nahiko mantso zatitzen diren bitartean, zelula ametatik eratorritako TAC zelulak askoz bizkorrago zatitzen dira (Cotsarelis et al., 1990), zelula ama batetik sortu berria den TAC zelula bakoitzak desberdintzatzeari ekin baino lehen hiruzpabost zatiketa-ziklo pairazten dituelarik (Jones et al., 1995). TAC zeluletatik sortutako zelula kumeek erpinalderantz migratzeari ekiten diote, xafla basaletik urrunduz eta bidean zehar integrinen adierazpen-mailen jaitsiera jasoz. Integrinen beherakada 38

46 Epitelio-ehunen berriztapena horrek ziklo zelularra geldiaraztea eragiten du, azkenean desberdintzapena oso-osorik ekarriz (Morasso & Tomic-Canic, 2005). Epidermisaren zati bat kalteturik edo eta zeharo suntsiturik suertatzekotan, kaltea inguruko zelula epidermikoek konpontzen dute, proliferazio-tasa areagotuz eta suntsitutako guneraino migratuz. Dena den, kalte-motaren arabera erreakzioa ezberdina izan daiteke. Adibidez, izpi ultramoreen erradiazioaren aurrean, keratinozitoen desberdintzapena bultzatzen da, geruza keratinotsua trinkoago bihurtuz (Sesto et al., 2002). Haatik, epidermisa mekanikoki larri kaltetzekotan, keratinozitoen proliferazioa eta migrazioa gauzatzen dira (Tomic-Canic et al., 2004). Sortu berria den migrazioaren helmuga-gunean, zelula ama berrien beharra dago. Horretarako, gune horren alboko ertzetako zelula amek zatiketa simetrikoa pairatzen dute, eta zelula ama bakoitzetik bi zelula ama kume ateratzen dira, zelula amen kopurua behar bezala emendatuz. Gainera, TAC zelulek eta guztiz desberdintzatu gabeko zelulek ere epitelioaren berreskurapenean parte har dezakete (Li et al., 2004). Izan ere, epidermiseko xafla basalarekin kontaktuan darraiten zelulek, zelula amak izateko gaitasuna gorde dezakete, kontaktua galdu arte desberdintzapen-bidean sartzen ez baitira. Desberdintzapenaren eraenketa, ß1-integrinak izeneko proteinen menpean dago. Dirudienez, ß1-integrinen adierazpen-maila baxua duten zelulek, altua dutenek baino zatitzeko ahalmen gehiago dute, zelulak isolatuz gero kolonia berriak sortzeko duten gaitasuna ikertzean ondorioztatu dena (Watt, 2000). Adibidez, TAC zelulek ß1-integrinen maila baxua dute, zatitzeko gaitasun handia edukiz. Izatez, TAC zelulak zatiketen kopuru mugatu batetik aurrera ezin dira berriro ere zatitu; eta, maiztasun handiz zatituz gero, xafla basaletik askatu eta desberdintzapen prozesuan murgiltzen dira (Jensen et al., 1999). Hala ere, zenbait kasutan, xafla basalarekin kontaktuan darraiten zelulak ere desberdintzatzen has daitezke, kontaktu horien iraunkortasuna keratinozitoen patua muga dezakeen faktore bakarra ez baita. Izan ere, keratinozitoen patua hainbat aldagaien eragin pean legoke, esaterako: zelula amen zatiketa-tasa, zelula amen kumeak zelula ama bilakatzeko probabilitatea, TAC zeluletan desberdintzatzen hasi aurretik zenbat zatiketa-ziklo eman behar diren, xafla basaletik askatzeko keratinozitoek behar duten denbora, eta desberdintzapen-prozesua bere osotasunean erdiesteko behar den denbora, besteak beste. Aldagai guzti horien atzetik, hainbat seinale eta informazio-molekulen sare desberdinetako partaideen mailan gertatutako aldaketak ditugu. Izatez, epitelioen hazkuntza-faktorea (EGF), fibroblastoen hazkuntza-faktorea (FGF), Wnt, Hedgehog, Notch, hezurren proteina morfogenetikoa/ß eraldatze-hazkuntza faktorea (BMP/TGF ß) eta 39

47 Zati Teorikoa integrinen gisako faktore proteikoek epidermisaren hazkuntza eta desberdintzapenean parte hartzen dutena badakigu (Oro & Scott, 1998; Dellambra et al., 2000; Watt, 2000) Ugaztunen hestea Ugaztunen heste-epitelioan lau zelula-mota nagusi aurkitu dira, hala nola: enterozitoak, muki-zelulak (ertz itxiko mukozitoak) edo zelula kaliziformeak (ertz irekiko mukozitoak), zelula endokrinoak eta Paneth zelulak. Epitelio horrek, endodermotik eratorritako epitelio pseudogeruzatu batean du bere jatorria. Hestearen garapenean zehar, jatorrizko epitelioa inbaginatu egiten da, eta inbaginazio eratu berrien zati distaleko zelulak zatiketan arituz, inbaginazioak hazi egiten dira. Azkenean, inbaginazio horiek, heste meharrean Lieberkühn kriptak eta heste lodian kolon-guruinak bilakatzen dira (Totafurno et al., 1987). Saguen kasuan, heste-epitelioaren berriztapena bizkor eta etengabe Lieberkühn kriptetan gertatzen da. Kripta horietako bakoitzean 250 zelula kokatzen dira batezbeste, 22. Irudia: Saguan timidina tritiatua injektatu ondoren, zelula amen kokapena eta geroko migrazio-bidea erakutsi dituzten hestearen ebakin histologikoak. A) 40 minutu injektatu ondoren, B) egun bat injektatu ondoren, C) 2 egun injektatu ondoren, D) 3 egun injektatu ondoren. Irudian segidan markatutako zelulak kriptaren erpinaldera migratuz doazela ikus daiteke, baita seinalea diluituz doala ere. (Potten-etik (1998) birmoldatua). 40

48 Epitelio-ehunen berriztapena horien artean zelula amak, zelula desberdintzatuak eta zelula migratzaile sortu berriak aurki ditzakegularik. Eskuarki, zelula amak kripten heren distalean banatuta daude (Potten et al., 2003). TAC zelulak, zelula ametatik eratorriak eta 4-6 aldiz zatitzera iris daitezkeenak, kripten bi heren distaletan lokalizatu dira. Heste-kriptak eta -guruinen artean hestearen argirantz proiektatutako heste-ebaginazio hazkarak heste-biloxka izenaz ezagutu dira. Heste meharrean, biloxka bakoitzaren inguruan, beraz, hainbat Lieberkühn kripta daude paratuta, eta kripta horietako zelula amek bai biloxketako eta bai kriptetako epitelioak osatzen dituzten lau zelula-motak sor ditzakete. Enterozitoak, muki-zelulak eta zelula endokrinoak, heste-biloxken mutur distaleranzko migrazio-bidean dauden bitartean desberdintzatu egiten dira. Migrazio hori, 2-5 egunez gauzatzen dena, oso era antolatuan burutzen da, zutabeka (22. Ird.; Potten, 1998), eta biloxken mutur distalera heltzerakoan zelulak hil egiten dira (Potten, 1998). Bestalde, kolonean zein urdailean, kriptetatik 23. Irudia: Heste epitelioko zelulen migrazio eta desberdintzapen-bide orokorrak adierazten dituen irudi eskematikoa. (Sancho et al.-etik (2004) birmoldatua). 41

49 Zati Teorikoa migratzen duten zelula gazteak hestearen argi-alderantz edo mukosa-alderantz abiatzen dira, zelula amak guruinen zati proximalean kokaturik egonik (Yamada et al., 1992). Heste meharreko Paneth zelulek, kripten mutur distalean paratuta daudenak, mikrobioen aurkako peptidoak eta hazkuntza-faktoreak jariatzen dituzte, eta hesteepitelioko beste zelula-motek ez bezala, kriptetako mutur distalerantz migratzen dute, bidean desberdintzatuz doazelarik (23. Ird.). Helmugara, hau da Lieberkühn kriptetara, iritsi ondoren biziraupen luze samarra dute (20 egun inguru), hil eta fagozitatuak izan baino lehen. Azkenik, bestelako zelula amekin alderatuz, hesteko zelula amak apoptosian sartzeko gaitasun handiagoa dutela aipatu beharra dago. Halaber, desberdintzapen prozesua nahiko itzulgarria dirudi, zelula kume desberdintzatuak, zelula amen berezitasunak berriro ere berreskuratzeko gai baitira (Marshman et al., 2002) Ugatz-guruina Ugaztun helduen ugatz-guruina, ehun konektibo adipotsuz inguratuta dagoen eta epitelio bakunez osatuta dagoen konduktu-sistema da, indibiduo helduen konduktuetan distalki albeoloak bereiz daitezkeelarik. Konduktuen artean, primarioak eta sekundarioak bereiztu dira, kalibre eta kokapenaren arabera. Konduktu zein aleboloetan, bi zelula-mota desberdin deskribatu dira, jariatzaileak eta mioepitelialak alegia (Kordon & Smith, 1998). Jatorriz epitelio-zelulak diren zelula mioepitelialek, muskulu-zelulen antzera uzkurkorrak izanik, esnea albeoloetatik konduktuetara eroatearen ardura dute, oxitozinaren presentzian uzkurtuz. Ugatz-guruinak, jatorri ektodermikoa du. Bere garapenaren abiapuntuari dagokionez, ektodermoaren loditze-gune bat aldameneko mesenkiman murgilduz zelula ametan joria den baba edo konkor moduko egitura sortzen da. Gerora, baba horretatik adarkamenduak desberdintzatuz doaz (Smalley & Ashworth, 2003). Ugatzguruinaren tamainaren behin-behineko emendioa eta adarkatutako egituren hedapena, hormona-kinada eraginda (Topper & Freeman, 1980), indibiduoaren bizitzan zehar garai jakin batzutan ematen da, pubertarora heldutakoan eta haurdunaldian, alegia, bukaerababetan zelula amen presentzia nabarmena izanik (Smalley & Ashworth, 2003). Konduktuen adarkatze eta murrizketan, zelula amen ekintza eta apoptosiaren bidezko heriotza zelularra berebiziko garrantzia duten prozesuak dira (24. Ird.). Hori dela eta, ugatz-gurina, desberdintzapen mekanismoak ikertzeko, zelulen proliferazioa eta heriotzaren arteko lankidetza barne, askotan erabili den eredu esperimentala dugu (Alberts et al., 2002). 42

50 Epitelio-ehunen berriztapena Epitelio-zelulen proliferazioari dagokionez, guztiz garatutako ugatz-guruineko zelula-mota guztiak zelula ama amankomun batetik (zelula ama multipotentziala) eratorriak direla behatu da saguen kasuan (Kordon & Smith, 1998). Alde batetik, zelula esnejariatzaileei dagokionez, haurdunaldian zelula ama zatitzen hastea hormonek eragiten dute, beren kopurua hamar-hogei biderrez igo araziz. Horrela, konduktuen bukaera-zatiak hazi egiten dira, adarkamendu berriak eta, azkenean, zelula jariatzaile desberdintzatuez osatutako albeolo dilatatuak eratzen dira (Smalley & Ashworth, 2003). Beste alde batetik, zelula mioepitelialak ere, konduktuetako epitelioan dauden zelula ama multipotentzialetik eratorriak dira (Liu et al., 2005); albeoloak tapizatzen paratu aurretik oso desberdintzapen 24. Irudia: (A) Ugatz-guruineko bukaera-konduktuaren alde distalean zelula amak simetrikoki (gezi estuak) zein asimetrikoki (gezi lodiak) zatitzen dira. Zatiketa asimetriko baten ostean, zelula kumeak zelula mioepitelialak edo konduktu-zelulak emateko desberdintzatzen dira. Argia sortzeko, epitelioko erpinaldean dauden guztiz desberdintzatu gabeko zelulak apoptosian sartzen dira. (B) Ugatz-guruineko zelula ama batzuk zatiketa simetrikoa (gezi estuak) eta asimetrikoak (gezi lodiak) pairatzen dituzte epitelioa berriztatzeko. Beste zelula amek, ordea, soilik zatiketa asimetrikoa pairatzen dute, beraien zelula kumeak albeoloen zelula mioepitelialak eta zelula jariatzaileak emateko desberdintzatuz (Smalley & Ashworth-etik (2003) birmoldatua). 43

51 Zati Teorikoa prozesu luzea pairatu behar duten arren. Zelula ama multipotentzialak, garapen eta desberdintzapen fase guztietan xafla basalari lotuta behatu dira (Chepko & Smith, 1997; Chepko & Dickson, 2003). Epitelioaren berriztapenean zelula amen partehartzeak xehetasun handiz deskribatu da (24. Ird.; Smalley & Ashworth, 2003). Zelula amek, oro har, ezaugarri ultrastruktural nabarmenik ez duten arren (arestian aipatu den bezala), ugatzguruineko zelula ama multipotentzialak berezko ezaugarri ultrastrukturalak baditu (Chepko & Dickson, 2003). Aitzitik, zenbait ikerlanek hiru zelula amen mota desberdin daudela iradoki dute. Ugatz-guruinaren transplantea jaso duten arratoiak ikertuz, zelula ama multipotentzialaz gain beste bi zelula ama desberdin, konduktu sekundariokoak eta albeolokoak alegia, egon daitezkeela ondorioztatu da (Kamiya et al., 1999; Kim et al., 2000). Azken biok zelula ama multipotentziala aitzindari amankomuna dute, eta bai zelula jariatzaileak zein zelula mioepitelialak emango lituzketelarik, norberak bere eskualdean (Kordon & Smith, 1998). Horrela orden hierarkikoa jarraituz, konduktu primarioetako zelula ama beste zelula ama bion aitzindaria litzateke. Esan bezala, zelulen heriotza ere ugatz-guruineko epitelioaren garapenean eta berriztapenean oso fenomeno garrantzitsua da. Izatez, esnea ekoizteko beharra amaitutakoan, zelula jariatzaileak apoptosi bitartez hiltzen dira, albeolo gehienak erregresioz desagertuz. Orduan, makrofagoek, hildako zelulen hondakinak fagozitatzen dituzte, ugatz-guruina berriro ere latentzia egoerara itzuliz. Apoptosia hainbat faktore direla medio aktibatzen da, esne-jariapena blokeatzen den tokietan TGFß3 (ß3 eraldaketa hazkuntza-faktorea; ingeleraz, Transforming Growth Factor ß3) metatuz, adibidez. 25. Irudia: Penaeus semisulcatus krustazeoaren hepatoarearen tubuluaren irudi eskematikoa. Bertan zelula-mota desberdinen kokapena ikus daiteke. (E), zelula amak; (R), zelula birxurgatzaileak; (F), zuntz-zelulak; (B), baba itxurako zelulak; (M), zelula txikiak. (Al-Mohanna & Nott-etik (1989) birmoldatua). 44

52 Epitelio-ehunen berriztapena Ugatz-guruinaren garapena, obarioko hormona, hormona adenokortikoide eta hormona pituitarioen arteko elkarrekintzek eraenduta dago (Topper & Freeman, 1980); hormona horiek hazkuntza-faktoreen gainean duten eragina dela medio (Roberts & Sporn 1992). Hazkuntza-faktore horien artean, hazkuntza-faktore epiteliala (EGF), fibroblastoen hazkuntza-faktorea (FGF), α eta ß eraldaketa hazkuntza-faktoreak (TGFα eta TGFß), intsulina antzeko hazkuntza-faktorea (ILGF) eta faktore kolonia-kitzikatzailea (CSF1) ditugu (Fischer & Lakshmanan, 1990; Derynck, 1992; Roberts & Sporn, 1992; Pollard & Hennighausen, 1994) Krustazeoen hepatoarea Hepatoarea, krustazeoen heste ertaineko egitura nagusia da, bolumenari zein konplexutasunari dagokionez. Bertan, liseriketa-prozesuaren azkeneko faseak betetzen 26. Irudia: Astacus astacus krustazeoaren hepatoarearen tubuluaren enbrioi-gunearen histologia.orokorra (a-c) eta irudi mitotikoen zehaztasunak (d-k).(hs), gune hemolinfatikoa, (A), anafasea, (E), E-zelula, (N), nukleoa, (Me), metafasea, (TL), tubuluen argia, (P), profasea, geziburuek PAS gune positiboak adierazten dute, geziek mikrobiloskak adierazten dute.(vogt-etik (1994)-tik hartua. 45

53 Zati Teorikoa dira, esaterako: 1) aurreko hestetik jasotako elikagaien azken liseriketa; 2) aurreko hestean beharrezkoak diren entzimen ekoizpena, 3) liseriketa produktuen xurgapena eta metaketa eta 4) hondakinen askapena. Hepatoarearen egitura-ardatz nagusia, konduktu primario batek osatzen du; konduktu hori konduktu sekundariotan eta horiek bukaeramutur itsuko tubuluetan adarkatuz bukatzen delarik (Gibson & Barker, 1979). Krustazeoen espezie desberdinetan, hepatoarearen sorrera eta desberdintzapena une desberdinetan gerta daiteke. Zenbaitetan, Penaeus setiferus espeziea kasu, hepatoarea larbaondoko fase berantiarrean itxuratzen hasten da; Homarus americanus espeziearen moduko beste kasuetan, berriz, enbrioi-fasean (Biesiot, 1986; Lovett & Felder, 1989). Dena den, oro har, hepatoarearen epitelioan lau zelula-mota nagusi bereizi dira, hala nola: E-, R-, F- eta B-zelulak (25. Ird.). Zenbait espezietan, bosgarren zelula-mota bat gehiago ere identifikatu da, M-zelula izena eman zaiona. E-zelulak (E, embrionary cell), tubuluen mutur distalean kokaturik, zelula ama gisa jokatzen du, eta beste zelula-mota guztien aitzindaria da. R-zelula (R, resorptive cell) birxurgatzailea da, ugariena izanik, eta bertan lipido eta glukogenoaren metaketa gauzatzen dira. F-zelulak (F, fiber cells), tubuluen eskualde distalean aurki ditzakegu batik bat. B-zelulak (B, blisterlike cells) hepatoareako epitelioan deskribatu diren zelula handienak dira, tubuluen bi heren proximaletan nagusiak izanik. Azkenik, M-zelulak (M, midget cells), liseri-epitelioaren oinaldean kokaturik lumeneraino iristen ez diren zelula gutxi batzuk baino ez dira (Icely & Nott, 1992). Aurrenez esan bezala, E-zelulek zelula ama gisa dihardute (26. Ird. Vogt, 1994). Izan ere, E-zelulek desberdintzapen-maila baxua erakusten dute. Haatik, zenbait autorek diotenaren arabera, zelula-mota guztiak ez datoz zuzenean E-zeluletatik. Zehazki, R- eta F- zelulak, E-zelulen aldamenean kokaturik daudenak, E-zeluletatik eratorritako bi leinu zelular ezberdintzat kontsideratu diren arren, B-zelulak antzerako ezaugarri ultrastrukturalak dituzten F-zeluletatik garatuko lirateke. (Loizzi, 1971; Hopkin & Nott, 1979). Beste autore batzuk, Penaeus monodon espeziean B-zelula gazteak F- eta R-zelula gazteetatik zalantzarik gabe bereizi daitezkeenaz jabetu ondoren, B-zelulek euren aldetik E-zeluletatik zuzenean sortzen den leinu zelularra osatuko luketeela proposatu dute (Icely & Nott, 1992). 46

54 Epitelio-ehunen berriztapena 2. Taula: Zelula amen bitartez berriztatzen diren epitelioen zelula-motak, euren funtzioa eta jatorria. ZELULA-MOTA FUNTZIOA JATORRIA Ugaztunen epidermisa Keratinozitoak Ugaztunen hestea Enterozitoak Muki-zelulak Zelula endokrinoak Paneth-zelulak Ugatz-guruina Zelula jariatzaileak Zelula mioepitelialak Krustazeoen hepatoarea E zelulak R zelulak F zelulak B zelulak M zelulak Keratinaren ekoizpena (babesa) Hidrolasen jariapena/elikagaien xurgapena Mukiaren ekoizpena Hormonen jariapena Hazkuntza-faktore eta mikrobioen aurkako peptidoen jariapena Esnearen jariapena Uzkurketa/mugimendua Zelula amak Lipido eta glukogenoaren metaketa Entzimen jariapena Elikagaien xurgapena/liseriketa Hondakinen metaketa Epidermiseko zelula amak Kriptetako zelula amak. Ugatz-epitelioko zelula amak E zelulak Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioak Area Arean, bi epitelio nagusi daude, entzimak liseri-traktura jariatzen dituzten zelula exokrinoz osatutakoa eta odolera hormonak jariatzen dituzten zelula endokrinoz osatutakoa. Area exokrinoa, epitelio bakunez osatutako azinoetan antolatuta dago, non zelula nagusiak (jariatzaileak), zelula zentroazinarrak eta konduktu-zelulak deskribatu baitira. Langerhans irletan mataza moduan korapilatutako epitelio endokrinoari dagokienez, 4 zelula-mota bereizi dira, α-zelulek glukagona, ß-zelulek intsulina, γ-zelulek 47

55 Zati Teorikoa area-polipeptidoa eta δ zelulek somatostatina ekoizten dutelarik (Orci & Unger, 1975; Wells, 2003; Jensen, 2004). Garapen embrionarioa ikertu duten autore batzuen aburuz, aurrealdeko gastrodermoan kokatutako zelulek, areako epitelio-zelula guztien zelula ama moduan dihardute (Le Douarin, 1988). Area helduaren epitelioen berriztapen normala 3 H- T eta BrdU pultsuen bidez edo PCNA immunohistokimikaz ikertuz, zelula proliferatzaileak azino, konduktu zein Langerhans irletan lokalizatu dira (Githens, 1988; Muller et al., 1990, Elsässer et al., 1994). Hala ere, zelula amen identifikazioa eta berriztapen-mekanismoak ez daude guztiz argi, eta horren inguruan ezbaika dabiltza ikertzaileen talde desberdinak. Alde batetik, epitelioen berriztapen-mekanismoak ezagutzeko, zenbait ikertzaile epitelioak esperimentalki kaltetzean induzituriko zelulen proliferazioaren azterketaz baliatu dira. Adibidez, kirurgiaren bitartez area osoaren %90-a erauzi ondoren, Langerhans irletako epitelioaren berriztapena, gelditu diren bertoko zelula endokrino desberdintzatuen zatiketari esker erdietsi daiteke; konduktu-epitelioaren berriztapenaren ardura zelula zentroazinar desberdintzatuek duten bitartean (Brockenbrough et al., 1988; Bonner-Weir et al., 1993). Berriztapen-prozesua berehalakoa da, erauzketa kirurgikoaren une beretsuan hasia hain zuzen ere. Ebakuntza eta gero gelditu diren zelulen kopurua jadanik 7 egunetan bikoiztera iristen da. Zatiketa-tasa bizkor hori, 21. egunerarte manten daiteke. Hala ere, zelula-mota guztien zatiketa-dinamika ez da berdina. α eta ß-zelulek, BrdU-markaketarik bortitzena kirurgi-erauzketa burutu eta 2 egunetara erakutsi dute, noiz α-zeluletan jorian den Langerhans irlen gune periferikoa bereziki handituta agertu baita. 2. egun horretan intsulina eta glukagona batera ekoizten dituzten zelulak ere behatu dira, α -zelulak ß- zelula bihur daitezkeenaren adierazgarritzat har litekeena. Lehenengo 5 egunetan, α- zelulen proliferazio-tasa, ß-zelulena baino altuagoa den bitartean, 7. egunetik aurrera tendentzia hori irauli egiten da, behintzat 14 egun igaro artean (Hayashi et al., 2003). Tankera beretsuko zatiketa-dinamika area exokrinoan behatu da. 27. Irudia: Arearen zati baten kirurgi erauzketa eman eta 3 egunetara BrdU markaketa arearen azino, konduktu eta Langerhans irletan (Hayashi et al., tik hartua). 48

56 Epitelio-ehunen berriztapena Bestalde, zelula exokrinoak, endokrinoak emateko ere desberdintza daitezkeela esperimentalki frogatu da, saguak espezifikoki ß-zelulak deuseztatzen dituen estreptozotozina izeneko farmakoaz tratatuz (Gu et al., 1997) zein area-konduktua kirurgikoki buxatuz (Bertelli & Bendayan, 1997). Esperimentu horietan amilasa eta intsulina batera ekoitz ditzaketen zelulak deskribatu dira, zelula exokrinoak endokrino bihur daitezkeenaren adierazgarritzat har litekeena. Zentzu berean, arratoi transgenikoen garapena aztertzean, zelula ametatik eratorritako zelula endokrino eta exokrinoen ezaugarriak batera dituen zelula-mota bat aurkitu da (Gu et al., 1994). Halaber, konduktuetako zelula amak ß-zelulak emateko desberdintza daitezke, induzituriko kalteei erantzunez zein ezohiko eskari metabolikoen aurrean areagotu daitekeena (Bonner-Weir & Sharma, 2002). Azkenik, arratoi transgenikoak eredu esperimental gisa erabiliz, areako zelula endokrinoak zatiketa autologoz baino ez direla zatitzen ere proposatu da, partikularki ß- zelulen kasuan, egoera normalean zein arearen zati handia erauztekoan ß-zelula desberdintzatuetatik soilik sor daitezkeenak (Dor et al., 2004). Beraz, α eta ß-zelulek jatorri berbera omen dutenez, eta zelula endokrino eta exokrinoen jatorria ere amankomuna omen denez, guztiok zelula ama beratik eratorriak izan daitezkeela pentsa genezake (Herrera 2000). Jatorrizko zelula ama horrek areako transkribapen-faktorea edukiko lukeen arren, ez luke hormonen adierazpen-gaitasunik izango. Gainera, zelula ama amankomunetik zelula ama endokrino eta exokrinoa bereiztu daitezkeenik ezin da baztertu (Seaberg et al., 2004); ezta norberak gerora zelula ama espezifikoagoak eman litzakeenik ere. Izan ere, aitzindari endokrinoak, konduktutik gertu egon arren, ez lirateke konduktu-epitelioaren osagaiak izango (Gu et al., 2002) Listu-guruinak Listu-guruinak, garatze-bidean dagoen mihi-epitelioaren loditze-gune batetik sortzen dira, zeinen ondoan, listu-guruinak izango diren baba itxurako formazio bat eratuz, kondentsazio mesenkimatikoa ematen baita (Melnick & Jaskoll, 2000). Listu-guruin helduek itxura albeolotubularra dute, eta ehun konektiboak enkapsulatzen dituzten hainbat lobuluz osaturik daude. Eskualde albeolotubularra, azino jariatzaileen multzoek eta konduktuen sistema konplexu batek osatzen dute. Azinoen epitelioan zelula jariatzaileak eta zelula mioepitelialak daude; konduktu-epitelioetan, berriz, ez dago zelula jariatzailerik eta osmoeraenketa moduko funtzioak bertan betetzen dira (Actis et al., 2002). 49

57 Zati Teorikoa Timidina tritiatuaz markatutako arratoi helduetan, konduktuen zelula pikortsuak konduktu ertaineko oinaldeko zeluletatik eratorriak direla behatu da. Hasiera batean, konduktuen zelula pikortsu ildaxkatu bihurtzen dira (tarteko egoera), azkenean zelula pikortsu helduak bilakatu arte (Chai et al., 1993; Denny et al., 1993). 3 H-T markaketaindizeek erakutsi dutenaren arabera, ez dirudi konduktu ertainetako zelula amek bizkor zatitzen direnik. Haatik, jarduera proliferatzaile altuena zelula pikortsu ildaxkatuek erakutsi dute. Hau da, zelula amak astiro zatitzen diren bitartean, zelula pikortsu ildaxkatuak, agian TAC zelulen analogotzat har genitzakeenak, bizkor zatitzen dira, gerora guztiz desberdintzatuak direnean zatiketa-tasa berriro ere motelduz doalarik (Chai et al., 1993). Listu-guruinetan esperimentalki kalteren bat induzituz, azinoen kopuruan eta tamainan murrizpena sortaraztekotan, (adb., apoptosia bultzatuz), konduktuen antzeko egitura tubularren agerpena suertatu da (Takahashi et al., 2002). Dirudienez, egitura tubular horiek konduktu ertainetatik eratorriak izango lirateke, eta azino-zelulen zelula aitzindarien ordezko sortuberriez osatuta egongo lirateke (Takahashi et al., 1998; 2002). Beste autore batzuen arabera, berriz, tubulu horiek zelula jariatzaileak galdu dituzten azinoak baino ez lirateke izango, zelulen kopuru egokia berreskuratuz gero berriro ere funtzionalak bilakatuko liratekeenak (Scott et al., 1999). Bistan denez, momentuz egitura tubular horien jatorria eta esangura biologikoa ez daude batere argi. Listu-guruinek, kirurgi-buxadura 5 egunez jasan ondoren, konduktuetako zelula pikortsu helduek proliferazio-jarduera handia erakutsi dute, 3 H-T zein PCNA markaketak erabiliz frogatu dena (Takahashi et al., 2000). Aitzitik, listu-guruinen kirurgi-erauzketa partziala egin ondoren, azinoen berreskurapena konduktu nagusietako zelulen proliferazio eta desberdintzapenaren bitartez gauzatzen dela behatu da, ebakuntza eta gero geratzen diren azinoek nolabait ere parte hartzen dutelarik (Hanks & Chaudhry, 1971). 28. Irudia: Listu-guruineko konduktu nagusia buxatuta duen arratoian burututako PCNA immunohistokimika. Azino zein konduktuetako zelulek marka positiboa (geziak) erakutsi dute (Takahashi et al.-etik (2001) hartua). 50

58 Epitelio-ehunen berriztapena Bestalde, arratoien listu-guruinetako epitelioan dimorfismo sexuala dagoela aipagarria da. Arratoi ar gazteetan, konduktuetan agertzen diren zelula berri gehienak konduktu-zelula helduen zatiketatik datoz; hau da, berezko zatiketa edo zatiketa autologoa izenekoa ematen da. Zelula berri desberdintzatuen %20 inguru baino ez dira konduktu ertainetako zelula ametatik eratorriak, azinoetan dauden gainerako zelula guztiak zelula helduen proliferazioz sortuak direlarik. Eme gazteetan, ordea, bai azinoetan zein konduktuetan dauden zelulen %60-a zelula ametatik eratorriak dira (Denny et al., 1997). Hala ere, emeak heltzen doazen heinean, azinoetako zelula berriak zelula desberdintzatuen zatiketa autologoz sortzen dira, zelula amen parte hartzea adinarekin batera gutxituz doalarik. Aitzitik, eme helduetan, konduktu-zelulak oraindik ere konduktu ertainetako zelula ametatik datoz. Desberdintasun honen gakoa, hazkuntza-abiaduran egon daiteke. Izan ere, eme gazteen listu-guruinek oraindik ere hazten jarrai dezakete, batez ere azino-eskualdean; nolabaiteko izaera enbrionarioa mantentzera behartuta daudela erakutsi lezakeena (Denny et al., 1990) Ugaztunen gibela Gibelak jatorri endodermikoa du, endodermoaren alde bentrala loditu egiten da gibelaren dibertikulua eratuz. Hepatoblastoek endodermotik migratzen dute baba moduko eskualde bereizia itxuratuz eta septum transversum izeneko gunean zehar proliferatzen dute (Tosh & Strain, 2005). Gibeleko epitelioen berriztapena, ez da egoera normaletan zelula ama gutxi batzuei esker ematen, zelula helduen zatiketa autologoz baizik. Esaterako, gibelaren erauzketa kirurgikoa partzialaren ondoren, berriztapena gainontzeko hepatozito zein behazun-epitelioko zelula helduen zatiketaz burutzen da (Fausto, 2001). Beraz, epitelio-zelula horiek oraindik ere guztiz desberdintzatu gabeak direla esan genezake. Are gehiago, hepatozitoak, esaterako, organismoaren biziraupen osoan zehar proliferatzeko gai dira. Kirurgi-erauzketa aplikatu eta hepatozitoetan DNAren sintesia hasi bitarteko denbora-tartea hainbat faktoreen pean dago, argiztapen-erregimena eta elikatzepatroia, besteak beste (Yanagi & Potter, 1977). Aitzitik, farmako kartzinogenikoz trataturiko arratoien gibelean, epitelio-zelulen proliferazioa, zelula amatzat har litezkeen eta portaguneko Hering kanaletan dauden itxura obaleko zelula txikien zatiketaz hasten da. Zelula horiek bipotentzialak lirateke, hepatozitoak zein behazun-epitelioko zelulak emango bailituzkete (Theise et al., 1999). Antzeko itxura obaleko zelula txikiak barneko portagunean ere deskribatu dira, hepatozito zein areako zelulen aitzindaritzat hartu direnak (Tosh & Strain, 2005). 51

59 Zati Teorikoa Hepatozitoen proliferazioa zerk pizten duen jakiteko hainbat ikerketa burutu dira. Esaterako, gibel-ehunaren zatiak edo eta hepatozito isolatuak gibela ez den ehun batera transplantatu ostean transplante-hartzailearen gibelaren zati bat ebakuntza bidez erauztean, transplantatutako zelulek, gibela ez den ehun horretan dauden arren, DNA sintetizatzen hasten dira. Horrek, gibela erregeneratzen den bitartean odolean nolabaiteko seinale mitogenikoa agertzen dela iradoki du (Overturf et al., 1999). Izan ere, hepatozitoen hazkuntza-faktoreak (HGF; ingeleraz hepatocyte growth factor), berebiziko garrantzia omen dauka prozesu horretan. Are gehiago, in vitro mantendutako hepatozitoak, HGFren presentzian, eta bestelako zitokinen seinalerik bitarteko izan gabe, zatitzen hasten dira. Hala ere, in vivo, HGFz gain, epitelio-hazkuntza faktore (EGF; ingeleraz, epithelial growth factor) moduko beste faktore batzuen plasma-kontzentrazioak ere igotzen dira kirurgierauzketaren ondorioz. Halaber, intsulina, interleukina 6 (IL6) eta norepinefrina molekulen bidezko seinalizazioa ere gibelaren erregenerazioa burutzeko ezinbestekoak dira, nahiz eta hepatozitoentzat oinarrizko mitogenoak ez izan. Antza denez, nondik norako orokorrak ezagutu diren arren, hepatozitoen proliferazioan diharduten seinale molekularrei buruz oraindik ere argilun dexente dago (Michalopoulos & DeFrances, 1997) Moluskuen liseri-guruina Krustazeo eta intsektu (Vogt 1994; Loeb et al., 2003; Illa, 2005) zein ornodunetan (ikus aurreneko atalak) ez bezala, moluskuen epitelio-ehunen berriztapenaz oso ikerlan gutxi burutu dira (Leibson & Frolova 1994). Konkretuki, moluskuen liseri-guruineko epitelioaren berriztapenaz egindakoak bereziki urriagoak dira (Hanselmann et al., 2000; Marigómez et al., 1999), ehun horren egitura histologikoaz ikerketa ugari egin diren arren (Ikus 1. atala). 29. Irudia: Ostren liseri-epitelioko balizko zelula basofiliko baten anafasea (Yongue-tik (1926) hartua) 52

60 Epitelio-ehunen berriztapena Urdaileko zelula amak identifikatu ez diren arren, zatiketa zelularren irudiak argitaratzeaz gain, proliferazio zelularra aztertzeko 3 H-T bidezko markaketaz baliatu diren ikerlanak burutu egin dira (Leibson & Frolova, 1994). Dirudienez, mitosia gertatutakoan, zatitzear dauden zelulek xafla basaletik urrundu behar dute, eta lumenaren aldera migratzen dute, ondoren zelula kumeek berriro ere epitelioaren oinalderaino itzuliz (Mix, 1972). Antzeko prozesua Crenomytilus grayanus muskuiluaren heste-epitelioan deskribatu da, zelulen proliferazio-tasan sasoi-aldaketa nabarmenak aurkitu direlarik (Leibson & Frolova, 1994). Hala ere, zunda espezifikoak erabiliz edo ultrastruktura sakonki aztertuz, zelula amak identifikatzera zuzendutako lanik ez dugu ezagutu. Bestalde, liseri-guruineko tubuluen epitelioari dagokionez, datu egokien gabezia bera dagoen arren, zelula amen presentzia proposatu da. Ostretan, liseri-epitelioko zelulen aitzindariak izan omen daitezkeenak, liseri-tubuluetako kriptetan aurkitu dira (29 Ird.; Yonge, 1926; Shaw & Battle, 1957; Mix & Sparks, 1971). Izatez, erradiazio ionizatzailez trataturiko liseri-tubuluen epitelioan, kriptetako zelula horiek epitelio berriaren sorreraren erantzule nagusiak dirudite (Mix & Sparks, 1971). Mytilus edulis muskuiluan eta Pecten maximus beiran ere, desberdintzatu gabeko zelula ama bat dagoela proposatu da 30. Irudia: PCNA immunohistokimika muskuiluaren liseri-guruinean eta krustazeoaren hepatoarean. Muskuiluen liseri-guruinean (a-b eta tarteko irudi txikia) positibotasun gehiena liseri-zelulei dagokie (geziak), nahiz eta zelula basofiliko batzuetan markaketa ere ageri den (gezi buruak). Urdaileko zelulek markaketa positiboa erakutsi dute (c), eta baita hemozitoek (H) ere (irudi txikia). Kontrolebakinetan (d) ez da inolako seinalerik atzeman. Krustazeoen hepatoarearen E- zeluletan (e) markaketa bortitza behatu da. Zelulak desberdintzatuz doazen heinean markaketa arinago bihurtuz. E-zelulen eskualdean irudi mitotikoak (m) ikus daitezke. Hepatoarearen kontrolebakinetan (f) ez da inolako markarik atzeman. Eskala-marra: 10 μm (a-c) eta 20 μm (d-f) (Marigómez et al.-etik (1999) hartua). 53

61 Zati Teorikoa 3. Taula: Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioen zelula-motak, beraien funtzioa eta jatorria. ZELULA-MOTA FUNTZIOA JATORRIA Ugaztunen area á-zelulak ß-Zelulak ã-zelulak ä-zelulak Ugaztunen listu -guruina Zelulak jariatzaileak (exokrinoak) Konduktuetako zelulak Zelula jariatzaileak Zelula mioepitelialak Zelula parenkimatikoak Ugaztunen gibela Glukagonaren ekoizpena Intsulinaren ekoizpena Are-polipeptidoaren ekoizpena Somatostatinaren ekoizpena Liseri-entzimen jariapena Oreka osmotikoaren eraenketa Entzimen jariapena Uzkurketa/mugimendua Egituraketa á-zelulak/zelula exokrinoak ß-Zelulak/Zelula exokrinoak ã-zelulak/zelula exokrinoak ä-zelulak/zelula exokrinoak Zelula exokrinoak Konduktuetako zelula amak Konduktuetako zelula amak/ Zelula jariatzaileak Konduktuetako zelula amak Zelula parenkimatikoak Hepatozitoak Funtzio anitzak Hepatozitoak/Hering kanaleko zelulak Moluskuen liseri -guruina Liseri-zelula Zelula basofilikoa Elikagaien liseriketa Entzimen jariapena Liseri-zelulak/Kriptetako zelula amak Zelula basofilikoak/kriptetako zelula amak (Thompson et al., 1974; Henry et al., 1991). Beste autore batzuen aburuz, epitelioaren berriztatzearen arduraduna ziliatua, hau da nahiko desberdintzatua, den zelula basofiliko berezia izango litzateke. Horrelakorik Cardium edule bibalbio eta Maricrypta monoxyla prosobrankio itsastarren kasuan iradoki zen (Owen, 1970; Nelson & Morton, 1979). Datu partzial eta eskas horietan oinarrituta, zelula amak zelula basofiloak direna zenbait hamarkadetan ontzat hartu da oro har, datu esperimental berrien sustapenik gabe. Aitzitik, azken urteotan, Mytilus galloprovincialis muskuiluan, liseri-albeoloetako epitelioko 2 zelula-motek, liseri-zelula eta zelula basofilikoa hain zuzen, PCNA immunohistokimikaren bitartez S-fasean sartzeko gai direla frogatu da (30. Ird.; Marigómez et al., 1999). Gainera, bi zelula-motok EGF hartzaileak erakusten dituzte (Canesi et al., 2000). Hori dela eta, behintzat espezie honetan, liseri-epitelioko bi zelula helduak zatitzeko gai direla dirudi, ugaztunen hepatozito moduan zatiketa autologoaz baliatuz. Ekarpen horrek, muskuiluen liseri-guruinean zelula amaren existentzia kolokan utzi du. Hala ere, erradiazio ionizatzailearen eraginaren ondorioz jasandako kalte bortitzen aurrean zelula 54

62 Epitelio-ehunen berriztapena amek liardukete. Azken finean, zelula basofiliko desberdintzatuak (jariatzaileak edo ziliatuak) zelula amak direla onartzeko zailtasunak aurkitu ditugun bitartean (Marigómez et al., 1999), Mix eta Sparks (1971) ikertzaileek deskribatutako zelula basofilikoak, txikiak eta biribilak izanik, zelula amak ez direla esateko ez dugu oinarri sendorik. 55

63 Zati Teorikoa BIBLIOGRAFIA Abrahamsen JF, Smaaland R, Sothern RB, Laerum OD (1997) Circadian cell cycle variations of erythro- and myelopoiesis in humans. Eur. J. Haematol. 58: Actis AB, Lampe PD, Eynard AR (2002) Cellular basis and clinical implications of biological markers in salivary tissues: Their topological distribution in murine submandibular gland. Oral Oncol. 38: Alberts B, Jonson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2002) Molecular biology of the cell. 4. edizioa. Taylor & Francis New York orr. Alison MR (1995) Assessing cellular proliferation: What's worth measuring? Human Exp. Technol. 14: Alison M, Golding M, Lalani EN, Nagy P, Thorgeirsson S, Sarraf C (1997) Wholesale hepatocytic differentiation in the rat from ductular oval cells, the progeny of biliary stem cells. J. Hepatol. 26: Al-Mohanna SY, Nott JA (1989) Functional cytology of the hepatopancreas of Penaeus semisulcatus (Crustacea: Decapoda) during the moult cycle. Mar. Biol. 101: Argaud A, Bounoure L (1910) Contribution a l etude anatomique et histologique du tube digestif d Arion rufus. S. Anat. Physiol. N. 46: Awaji M, Suzuki T (1998) Monolayer formation and DNA synthesis of the outer epithelial cells from pearl oyster mantle in coculture with amebocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34: Babula A, Wielinska L (1988) Ultrastructural studies of the digestive system of the slug, Deroceras reticulatum (Müller) (Pulmonata). Bull. Soc. Amis Sci. Lettres de Poznam. Ser. D. Sci. Biol. 26: Baisch H, Beck HP, Christiensen IJ, Hartmann NR, Fried J, Dean PN, Gray JW, Jett JH, Johnston DA, White RA, Nicolini C, Zeitz S, Watson JV (1982) A comparison of mathematical methods for the analysis of DNA histograms obtained by flow cytometry. Cell Tiss. Kin. 15: Bale SD, Howard TA, Moffett SB (2001) Neuronal and non-neuronal responses to nerve crush in a pulmonate snail, Melampus bidentatus. Invert. Neurosci. 4: Barbeito CG, González NV, Badrán AF (2003) Sex and Age-Related temporal variations in intestinal-epithelium proliferation in the suckling mouse. Chronobiol. Int. 20: Basalo C (1998) Organización morfofuncional de los alvéolos de la glándula digestiva del mejillón Mytilus galloprovincialis. Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 134 orr. Baumforth KR, Grewal N, Large AT, Jones CJ, Perry CJ, Connock MJ (1998) Zonal rotor purification and characterization of "mannosomes": a tubular membrane system in gastropod mollusc digestive gland. Anal. Biochem. 263: Beninger PG, Le Pennec M (1991) Functionall anatomy of the scallops orr. Non: Scallops: biology, ecology and aquaculture. Shunway SE (ed). Elsevier, Amsterdam. Bertelli E, Bendayan M (1997) Intermediate endocrine-acinar pancreatic cells in duct ligation conditions. Am. J. Physiol. C 273: Biesiot PM (1986) Changes in midgut gland morphology and digestive enzyme activities associated with development in early stages of the American lobster, Homarus americanus. Woods Hole Oceanographic Istitution, Publ. WHOI-86-20, PB : Doktoradutza- Tesia, 222 orr. Bjarnason GA, Jordan R (2002) Rhythms in human gastrointestinal mucosa and skin. Chronobiol. Int. 19: Boghen A, Farley J (1974) Phasic activity in the digestive gland cells of the intertidal prosobranch Littorina saxatilis (Olivi) and its relation to the tidal cycle. Proc. Malacol. Soc. London 41: Bonner-Weir S, Baxter LA, Schuppin GT, Smith FE (1993) A second pathway for regeneration of adult exocrine and endocrine pancreas. A possible recapitulation of embryonic development. Diabetes 42: Bonner-Weir S, Sharma A (2002) Pancreatic stem cells. J. Pathol. 197:

64 Bibliografia Bowen ID (1970) The fine structural localization of acis phosphatase in the gut epithelial cells of the slug, Arion ater (L.). Protoplasma 70: Bowen ID, Davies P (1971) The fine structural distribution of acid phosphatase in the digestive gland of Arion hortensis (Fre.). Protoplasma 73: Brandi GM Calabrese C, Pantaleo MA, Morselli Labate A, Di Febo G, Hakim R, De Vivo A, Di Marco MC & Biasco G (2004) Circadian variations of rectal cell proliferation in patients affected by advanced colorctal cancer. Can. Lett. 208: Bravo R, Frank R, Blundell PA, Mcdonald-Bravo H (1987) Cyclin/PCNA is the auxiliar protein of DNA polimerase-d. Nature 326: Bravo R, Macdonald-Bravo H (1987) Existence of two cyclin proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle: Association with DNA replication sites. J. Cell Biol. 105: Brockenbrough JS, Weir GC, Bonner-Weir S (1988) Discordance of exocrine and endocrine growth after 90% pancreatectomy in rats. Diabetes 37: Brouard M, Barrandon Y (2003) Controlling skin morphogenesis: hope and despair. Curr. Opin. Biotechnol. 14: Bruno S, Darzynkiewicz Z (1992) Cell cycle dependent expression and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells. Cell Prol. 25: Cajaraville MP (1989) Efectos histopatológicos y citotóxicos de los hidrocarburos derivados del petróleo, y su cuantificación en el mejillón Mytilus galloprovincialis (Lmk). Doktoradutza- Tesia. 577 orr. Cajaraville MP, Díez G, Marigómez JA, Angulo E (1990) Responses of basophilic cells of the digestive gland of mussels to petroleum hydrocarbon exposure. Dis. Aquat. Org. 9: Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E (1991) Consequences of keeping Mytilus in the laboratory as assessed by different cellular condition indices. Helgol. Meeresunter. 45: Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E (1992) Comparative effects of the water accommodated fraction of three oils on mussels 2.- Quantitative alterations in the structure of the digestive tubules. Comp. Biochem. Physiol. C 102: Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez I (1995a) Cellular biomarkers as useful tools in the biological monitoring of environmental pollution: molluscan digestive lysosomes orr. Non:. Cell biology in environmental toxicology. Cajaraville MP (ed.). University of the Basque Country Press Service. Bilbo. Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, Marigómez I (1995b) Lysosomes as cellular markers of environmental pollution: time- and dosedependent responses of the digestive lysosomal system of mussels after petroleum hydrocarbon exposure. Environ. Toxicol. Water. Qual. 10:1-8. Cajaraville MP, Bebianno MJ, Blasco J, Porte C, Sarasquete C, Viarengo A (2000) The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environments of the Iberian Peninsula: a practical approach. Sci. Tot. Environ. 247: Cancio I, Orbea A, Völkl A, Fahimi D, Cajaraville MP (1998) Induction of peroxisomal oxidases in mussels: comparison of effects of lubricant oil and benzo(a)pyrene with two typical peroxisome proliferators on peroxisome structure and function in Mytilus galloprovincialis. Toxicol. Appl. Pharmacol. 149: Canesi L, Malatesta M, Battistelli S, Ciacci C, Gallo G, Gazzanelli G (2000) Immunoelectron microscope analysis of epidermal growth factor receptor (EGFR) in isolated Mytilus galloprovincialis (Lam.) digestive gland cells: Evidence for ligand-induced changes in EGFR intracellular distribution. J. Exp. Zool. 286: Chai Y, Klauser DK, Denny PA, Denny PC (1993) Proliferative and structural differences between male and female mouse submandibular glands. Anat. Rec. 235:

65 Zati Teorikoa Chepko G, Dickson RB (2003) Ultrastructure of the putative stem cell niche in rat mammary epithelium. Tiss. Cell 35: Chepko G, Smith GH (1997) Three divisioncompetent, structurally-distinct cell populations contribute to murine mammary epithelial renewal. Tiss. Cell. 29: Colas P, Launay C, van Loon AE, Guerrier P (1993a) Protein synthesis control cyclin stability in metaphase I-arrested oocytes of Patella vulgata. Exp. Cell Res. 208: Colas P, Serras F, Van Loon AE (1993b) Microinjection of suc 1 transcripts delays the cell cycle clock in Patella vulgata embryos. Int. J. Dev. Biol. 37: Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM (1990) Labelretaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell 29: Couch J (1984) Atrophy of diverticular epithelium as an indicator of environmental irritants in the oyster Crassostrea virginica. Mar. Environ. Res. 14: Czarna Z, Krasowka E, Turska R (1985) The tubular structures in the cells of the digestive gland of Arion rufus (Mollusca Gastropoda). Zool. Poloniae 32: David H, Götze J (1963) Elektronenmikroskopische Befunde an der Mitteldarmdrüse von Schnecken. Z. Mikrosk.-Anat. Forsch. (Leipzig). 70: Daughaday WH, Rotwein P (1989) Insulin-like growth factors I and II. Peptide, messenger ribonucleic acid and gene structures, serum, and tissue concentrations. Endocr. Rev. 10: Dellambra E, Golisano O, Bondanza S, Siviero E, Lacal P, Molinari M, D'Atri S, De Luca M (2000) Downregulation of sigma prevents clonal evolution and leads to immortalization of primary human keratinocytes. J. Cell Biol. 29: 149: Dekens MPS, Santoriello C, Vallone D, Grassi G, Withmore D, Foulkes NS (2003). Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13: Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1990) Three-dimensional localization of DNA synthesis in secretory elements of adult female mouse submandibular gland. Adv. Dent. Res. 4: Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1993) Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. Anat. Rec. 235: Denny PC, Ball WD, Redman RS (1997) Salivary glands: a paradigm for diversity of gland development. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 8: Derynck R (1992) The physiology of transforming growth factor-α. Adv. Canc. Res. 58: Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin of excretory cells in the digestive gland of the land snail Helix lucorum. Malacologia 44: Domouhtsidou GP, Dimitriadis VK (2001) Lysosomal and lipid alterations in the digestive gland of mussels, Mytilus galloprovincialis (L.) as biomarkers of environmental stress. Environ. Pollut. 115: Dondero F, Viarengo A (2005) Development of novel sensitive molecular markers for marine environment biomonitoring employing mussels. 15th SETAC Europe Anual Meeting. Lille. Dor Y, Brown J, Martinez OI, Melton DA (2004) Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature 429: Edgar BA, Lehner CF (1996) Developmental control of cell cycle regulators: a fly s perpective. Science 274: Eirin-López JM, González-Tizón AM, Martínez A, Méndez J (2002) Molecular and evolutionary analysis of mussel histone genes (Mytilus spp.): possible evidence of an "orphon origin" for H1 histone genes. J. Mol. Evol. 55: Elsasser HP, Biederbick A, Kern HF (1994) Growth of rat pancreatic acinar cells quantitated with a monoclonal antibody against the proliferating cell nuclear antigen. Cell Tiss. Res. 276: Endl E, Gerdes J (2000) The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. Exp. Cell Res. 257:

66 Bibliografia Faderl S, Keating MJ, Do KA, Liang S.-Y, Kantarjian H.M, O'Brien S, Garcia-Manero G, Manshouri T, Albitar M (2002) Expression profile of 11 proteins and their prognostic significance in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL). Leukemia 16: Fausto N (2001) Liver regeneration: From laboratory to clinic. Liver Trasn. 7: Finegood DT, Scaglia L, Bonner-Weir S (1995) Dynamics of beta-cell mass in the growing rat pancreas. Estimation with a simple mathematical model. Diabetes 44: Fisher DA, Lakshmanan J (1990) Metabolism and effects of epidermal growth factor and related growth factors in mammals Endocr. Rev. 11: Foley J, Ton T, Maronpot R, Butterworth R, Goldworthy TL (1993) Comparison of proliferating cell nuclear antigen to tritiated thymidine as a marker of proliferating hepatocytes in rats. Environ. Health Prespec. 101: Fretter V, Graham A (1962) British prosobranch molluscs. Ray Society. 755 orr. Furuta E, Yamaguchi K, Shimozawa A (1994) Bloodcell producing site in the land slug Incilaria fruhstorferi. Kaibogaku. Zasshi. 69: Gage FH (2000) Mammalian neural stem cells. Science 287: Gerdes J, Lemke H, wacker H, Schwab HJ, Stein H (1984) Cell cycle analysis of a cell proliferation asociated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J. Immunol. 133: Gerlach C, Golding M, Larue L, Alison MR, Gerdes J (1997) Ki-67 immunoexpression is a robust marker of proliferative cells in the rat. Lab. Invest. 77: Ghazizadeh S, Taichman LB (2001) Multiple classes of stem cells in cuteneous epithelium; a lineage analysis of adult mouse skin. EMBO J. 20: Gibson R, Barker PL (1979) The decapod hepatopancreas. Oceangr. Mar. Biol. Ann. Rev. 17: Githens S (1988) The pancreatic duct cell: proliferative capabilities, specific characteristics, metaplasia, isolation, and culture. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 7: Goldblum JR, Appelman HD (1995) Stromal tumors of the duodenum: A histologic and immunohistochemical study of 20 cases. Am. J. Sur. Pathol. 19: Golias CH, Charalabopoulos K, Chralabopoulos K (2004) Cell proliferation and cell cycle control: a mini review. Int. J. Clin. Pract. 58: González-Melendi P, Testillano PS, Ahamadian P, Fadón B, Risueño MC (1996) New in situ approaches to study the induction of pollen embryogenesis in Capsicum anuum L. Eur. J. Cell Biol. 69: Gratzner HG (1982) Monoclonal antibody to 5- bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science 218: Grimaldi A, Tettamanti G, Rinaldi L, Brivio MF, Castellani D, de Eguileor M (2004) Muscle differentiation in tentacles of Sepia officinalis (Mollusca) is regulated by muscle regulatory factors (MRF) related proteins. Dev. Growth Differ. 46: Gu D, Lee MS, Krahl T, Sarvetnick N (1994) Transitional cells in the regenerating pancreas. Development 120: Gu D, Arnush M, Sarvetnick N (1997) Endocrine/exocrine intermediate cells in streptozotocin-treated Ins-IFN-γ transgenic mice. Pancreas 15: Gu G, Dubauskaite J, Melton DA (2002) Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development 129: Hale SA, Capuco AV, Erdman RA (2003) Milk yield and mammary growth effects due to increased milking frequency during early lactation. J. Dairy Sci. 86: Hall PA, Levinson DA (1990) Review: assessment of cell proliferation in histological material. J. Clin. Pathol. 43: Hall PA, Levison DA, Woods AL, Yu CCW, Kellock DB, Watkins JA, Barnes DM, Gillett CE, 59

67 Zati Teorikoa Camplejohn R, Dover R, Waseem NH, Lane DP (1990) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections: An index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms. J. Pathol. 162: Hall PA, Watt F (1989) Stem cells: the generation and maintenance of cellular diversity. Development 106: Hanks CT, Chaudhry AP (1971) Regeneration of rat submandibular gland following partial extirpation. A light and electron microscopic study. Am. J. Anat. 130: Hanselmann R, Smolowitz R, Gibson D (2000) Identification of proliferating cells in hard clams. Biol. Bull. 199: Hayashi KY, Tamaki H, Handa K, Takahashi T, Kakita A, Yamashina S (2003) Differentiation and proliferation of endocrine cells in the regenerating rat pancreas after 90% pancreatectomy. Arch. Histol. Cytol. 66: Hedley DW, Friedlander ML, Taylor IW, Rugg CA, Musgrove EA (1983) Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 31: Henry M (1987) Glande digestive de la palourde Ruditapes decussatus, en métabolisme de routine. I. La cellule digestive. II La cellule sécrétice. Vie Marine 6:7-24. Henry M, Bocaud-Camou E, Lefort Y (1991) Functional micro-anatomy of digestive gland of the marine bivalves. Mar. Environ. Res. 17:286. Herrera PL (2000) Adult insulin- and glucagonproducing cells differentiate from two independent cell lineages. Development 127: Hickmott PW, Carew TJ (1991) An autoradigraphic analysis of neurogenesis in juvenile Aplysia californica. J. Neurobiol. 22: Hopkin SP, Nott JA (1979) Some observations on concentrically structured, intracellular garnules in the hepatopancreas of the shore crab Carcinus maenas (L.). J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 59: Hotchin NA, Gandarillas A, Watt FM (1995) Regulation of cell surface beta 1 integrin levels during keratinocyte terminal differentiation J. Cell Biol. Mar. 128: Howard A, Pelc SR (1950) P32 autoradiographs of mouse testis; preliminary observations of the timing of spermatogenic stages. Br. J. Radiol. 23: Howard B, Mitchell PC, Ritchie A, Simkiss K, Taylor M (1981) The composition of intracellular granules from the metal-accumulating cells of the common garden snail (Helix aspersa). Biochem. J. 194: Hunt T, Luca FC, Ruderman JV (1992) The requirements for protein synthesis and degradation, and the control of destruction of cyclins A and B in the meiotic and mitotic cell cycles of the clam embryo. J. Cell Biol. 116: Icely JD, Nott JA (1992) Digestion and absortion: digestive system and associated organs orr. Non: Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison FW & Kohn AJ (ed). 10; Decapod Crustacea: FW. Wiley-Liss. Inc. New York. Illa I (2005) Un nuevo modelo para el estudio de la diferenciación de las células madre (stem cells): el nido de regeneracion de Locusta. Doktoradutza-Tesia. Universidad de Navarra. 164 orr. Izagirre U, Ruiz P, Marigómez M (2005) Early lysosomal membrane destabilisation on exposure to pollutants in mussel digestive cells. 13 rd Symposium PRIMO. Jain S, Filipe MI, Hall PA, Waseem N, Lane DP, Levison DA (1991) Prognostic value of proliferating cell nuclear antigen in gastric carcinoma. J. Clin. Pathol. 44: Janssen HH (1985) Some histological findings of the mid-gut gland of the common garden snail, Arion rufus (L.) (Syn. A. ater rufus (L.), A. emporicorum Férrusac), Gastropoda: Stylommatophora. Zool. Anz. 215: Jensen UB, Lowell S, Watt FM (1999) The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: 60

68 Bibliografia a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development 126: Jensen J (2004) Gene regulatory factors in pancreatic development. Dev. Dyn. 229: Joensuu H, Klemi PJ, Korkeila E (1988) Prognostic value of DNA ploidy and proliferative activity in Hodkin's disease. Am. J. Clin. Pathol. 90: Jones PH, Harper S, Watt FM (1995) Stem cell patterning and fate in human epidermis. Cell 80: Kamiya K, Higgins PD, Tanner MA, Gould MN, Clifton KH (1999) Kinetics of mammary clonogenic cells and rat mammary cancer induction by X-rays or fission neutrons. J. Radiat. Res. 40 Suppl: Kikuyama S, Kubora T, Watanabe M, Ishibiki K, Abe O (1988) Cell kinetic study of human carcinomas using bromodeoxyuridine. Cell Tiss. Kin. 20:1-6. Kim ND, Oberley TD, Yasukawa-Barnes J, Clifton KH (2000) Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Exp. Cell Res. 10: 260: Klauser DK, Denny PA, Denny PC (1993) Proliferative and structural differences between male and female mouse submandibular glands. Anat. Rec. 235: Kordon EC, Smith GH (1998) An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development 125: Krijgsman, B (1928) Arbeitsrhythmus der Verdauungsdüsen bei Helix pomatia. II. Sekretion, Resorption und Phagocytose. Z. Vergl. Physiol. 8: Krishnakumar PK, Casillas E, Vanarasi U (1995) Effect of environmental contaminants on the health of Mytilus edulis from Puget Sound, Washington, U.S.A. II. Cytochemical detection of subcellular changes in digestive cells. Mar. Biol. 124: Krucher NA, Roberts MH (1994) Identification of CDK- and cyclin-like proteins in the eye of Bulla gouldiana. J. Neurobiol. 25: Kurki P, Vanderlaan M, Dolbeare F (1986) Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)/cyclin during the cell cycle. Exp. Cell Res. 166: Lamers AE, Heiney JP, Ram JL (1999) Cloning and sequence analysis of two cdnas encoding cyclin A and cyclin B in the zebra mussel Dreissena polymorpha. Biochim. Biophys. Acta 1448: Langton RW (1975) Syncrony in the digestive diverticula of Mytilus edulis L. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 55: Lavker RM, Sun TT (2000) Epidermal stem cells: properties, markers, and location. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: Le Douarin NM (1988) On the origin of pancreatic endocrine cells. Cell 22: Leibson NL, Frolova LT (1994) Winter-spring essential reorganization of cell proliferation in the digestive tract epithelia in the mussel Crenomytilus grayanus. Mar. Biol. 118: Lekube X (1997) Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruinaren plastizitatea eta dinamika zelularra: 3D-berreraiketa eta PCNA bidezko azterketa. Lizentziatura-tesia. UPV/EHU. 130 orr. Lekube X, Cajaraville MP, Marigómez I (2000) Use of polyclonal antibodies for the detection of changes induced by cadmium in lysosomes of aquatic organisms. Sci. Tot. Environ. 247: Le Pennec G, Le Pennec M (2002) Molecular analysis of the seasonal expression of genes coding for different functional markers of the digestive gland of the bivalve mollusk Pecten maximus (L.). Comp. Biochem. Physiol. B 133: Li A, Normand P, Redvers R, Kaur P (2004) Extensive tissue-regenerative capacity of neonatal human keratinocytes stem cells and their progeny. J. Clin. Invest. 113: Lillo C, Velasco A, Jimeno D, Cid E, Lara JM, Aijón J (2002) The glial design of a teleost optic nerve head supporting continuous growth. J. Histochem. Cytochem. 50: Littleton RJ, Baker GM; Soombro IN, Adams RL, Whimster WF (1991) Kinetic aspects of Ki-67 61

69 Zati Teorikoa antigen expression in a normal cell line. Virchow Arch. B Path. Incl. Mol. Path. 60: Liu S, Dontu G, Wicha MS (2005) Mammary stem cells, self-renewal pathways, and carcinogenesis. Breast Canc. Res. 7: Loeb MJ, Clark EA, Blacburn M, Hakim RS, Elsen K, Smagghe G (2003) Stem cells from midguts of Lepidopteran larvae: clues to the regulation of stem cells fate. Arch. Insect. Biochem. Physiol. 53: Loizzi RF (1971) Interpretation of crayfish hepatopancreatic function based on fine structural analysis of epithelial cell lines and mussel networks. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 113: van Loon AE, Colas P, Goedemans CE, Neant I, Dalbon P, Guerrier P (1991) The role of cyclins in the maturation of Patella vulgata oocytes. EMBO J. 10: Lovett DL, Felder DL (1989) Ontogeny of gut morphology in the white shrimp Penaeus setiferus (Decapoda, Penaeidae). J. Morphol. 201: Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil in the digestive cells of mussels: quantitative alterations in cellular and lysosomal structures. Aquat. Toxicol. 1: Lowe DM (1988) Alterations in the cellular structure of Mytilus edulis resulting from exposure to environmental contaminants under field and experimental conditions. Mar. Ecol. Prog. Ser. 46: Luchtel DL, Martin AW, Deyrup-Olsen I, Boer HH (1997) Gastropoda: Pulmonata orr. Non: Microscopic Anatomy of Invertebrates. FW Harrison FW & Kohn AJ (ed). 6B; Mollusca II. Wiley-Liss. Inc. Lufty RG, Demian ES (1967) The histology of the alimentary system of Marisa cornuarietis (Mesogastropoda: Ampullariidae). Malacologia 5: Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986) Copper treatment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Morphometrics and histophysilogy. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 36: Marigómez I (1989). Aportacion citohistológicas a la evaluación de efectos subletales de cadmio en el medio marino: estudios con el prosobranquio Littorina littorea. Doktoradutza-Tesia. UPV/EHU. 430 orr. Marigómez I, Vega MM, Cajaraville MP, Angulo E (1989) Quantitative responses of the digestive lysosomal system of winkles to sublethal concentrations of cadmium. Cell Mol. Biol. 35: Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) Histopathology of the digestive gland-gonad complex of marine prosobranch Littorina littorea (L.) exposed to cadmium. Dis. Aquat. Organ. 9: Marigómez I, Soto M, Angulo E (1991) Responses of winkles digestive cell and their lysosomal system to environmental salinity changes. Cell Mol. Biol. 37: Marigómez I, Soto M, Angulo E (1992) Seasonal variability in the quantitative structure of the digestive tubules of Littorina littorea. Aquat. Living. Resour. 5: Marigómez I, Soto M, Etxenberria M, Angulo E (1993) Effects of size, sex, reproduction and trematode infestation on the quantitative structure of digestive tubules in stressed winkles. Zool. J. B. Anat. 123: Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury JR (1995a) Computer assisted 3-D reconstruction techniques may provide new insights into the pattern of histological organisation of the bivalvian digestive gland. 12th Inter. Malacol. Congr. Vigo. Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury JR (1995b) A novel model for the histological structure of the molluscan digestive gland based on computer aided 3D-reconstruction and scanning microscopy. VI Cong. SEBC. Congr. Lleida. Marigómez I, Orbea A, Olabarrieta I, Etxeberria M, Cajaraville MP (1996) Structural changes in the digestive lysosomal system of sentinel mussels as biomarkers of environmental stress in Mussel-Watch programmes. Comp. Biochem. Physiol. C 113:

70 Bibliografia Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998a) Cell-type replacement, a succesful strategy of molluscs to adapt to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 18: Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998b) Tissue-level biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to assess metal pollution in soils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 34: Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical localisation of proliferating cells in mussel digestive gland tissue. Histochem. J. 31: Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutantspecific and general lysosomal responses in digestive cells of mussels exposed to model organic chemicals. Aquat. Toxicol. 64: Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia L, Cajaraville MP (2005) Cell and tissue biomarkers in mussel, and histopathology in hake and anchovy from Bay of Biscay after the Prestige oil spill (Monitoring campaign 2003). Mar. Poll. Bull. (prentsan). Marshman E, Booth C, Potten CS (2002) The intestinal epithelial stem cell. BioEssays 24: Martínez-Expósito MJ, Pasantes JJ, Méndez J (1994) Proliferation kinetics of mussel (Mytilus galloprovincialis) gill cells. Mar. Biol. 120: Martynova MG, Bystrova OA (2002) Undifferentiated cells in the snail myocardium are capable of DNA synthesis and myodifferentiation. Biol. Bull. 203: Mason AZ (1983) The uptake, accumulation and excretion of metals by the marine prosobranch gastropod mollusc Littorina littorea (L). Doktoradutza-Tesia. University of Wales, Gwyneed (UK). 575 orr. Mason AZ, Simkiss K (1982) Sites of mineral deposition in mineral-accummulating cells. Exp. Cell Res. 139: McQuiston RW (1969) Cyclic activity in the digestive diverticula of Lasae rubra (Montagu) (Bivalvia: Eulamellibranchia). Proc. Malacol. Soc. London 38: Melnick M, Jaskoll T (2000) Mouse submandibular gland morphogenesis: a paradigm for embryonic signal processing. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11: Merdsoy B, Farley I (1973) Phasic activity in the digestive gland of the marine prosobranch gastropod, Littorina littorea (L.). Proc. Malacol. Soc. London 40: Michalopoulos GK, DeFrances MC (1997) Liver regeneration. Science 276: Mix MC (1972) Chronic tissue degeneration in the Pacific oyster, Crassostrea gigas, following acute irradiation. Radiat. Res. 49: Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestive tubule tissue of the pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing radiation. J. Invertebr. Pathol. 17: Miyachi K, Fritzler MJ, Tan EM (1978) Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells. J. Immunol. 121: Moore MN, Pipe RK, Farrar SV (1987) Induction of lysosomal lipid accumulation and fatty degeneration by polycyclic aromatic hydrocarbons in molluscan digestive cells. Mar. Environ. Res. 17: Morasso M, Tomic-Canic M (2005) Epidermal stem cells: the cradle of epidermal determination, differentiation and wound healing. Biol. Cell 97: Morgan DO (1997) Cyclin-dependent kinases: Engines, Clocks, and Microprocessors. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: Morris GF, Mathews MB (1989) Regulation of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle. J. Biol. Chem. 264: Morton JE (1956) The tidal rhythm and action of the digestive system of the lamellibranch Lasaea rubra. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 35: Morton BS (1969) Studies on the biology of Dreissenas polymorpha Pal. II. Correlation of the rhythms of adductor activity, feeding, digestion and excretion. Proc. Malacol. Soc. London 38: Morton BS (1970) The tidal rhythm and rhythm of feeding and digestion in Cardium edule. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 50:

71 Zati Teorikoa Morton BS (1971) The diurnal rhythm and tidal rhythm of feeding and digestion in Ostrea edulis. Biol.J. Linn. Soc. 3: Morton B (1979) The diurnal rhythm and the cycle of feeding and digestion in the slug Deroceras caruanae. J. Zool. 187: Morton B (1983) Feeding and digestion in bivalvia orr. Non: The Mollusca. 5. Academic Press. Saleuddin ASM & Wilburg M (ed.) New York. Moya J (1973) Estructura fina de algunos elementos glandulares y sus anejos en el aparato digestivo del limaco común Arion empiricorum, Ferussac (Gasterópodo pulmonado). Universidad de Bilbao. Doktoradutza-Tesia. Moya J, Rallo AM (1975) Intracisternal polycylinders: a cytoplasmic structure in cells of the terrestrial slug Arion empiricorum Férussac (Pulmonata, Stylommatophora). Cell Tiss. Res. 159: Muller R, Laucke R, Trimper B, Cossel L (1990) Pancreatic cell proliferation in normal rats studied by in vivo autoradiography with 3 H- thymidine. Virchows. Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 59: Muskhelishvili L, Latendresse JR, Kodell RL, Henderson EB (2003) Evaluation of cell proliferation in rat tissues with BrdU, PCNA, Ki- 67(MIB-5) Immunohistochemistry and in situ hybridization for histone mrna. J. Histochem. Cytochem. 51: Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial renewal in the digestive gland tubules of the marine prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 45: Nigg EA (1995) Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the eukaryotic cell cycle. BioEssays 17: Oka K, Arai T (1996) MIB1 growth fraction is not related to prognosis in cervical squamous cell carcinoma treated with radiotherapy. Int. J. Gyn. Pathol. 15: Orci L, Unger RH (1975) Functional subdivision of islets of Langerhans and possible role of D cells. Lancet 20: 2: Oro AE, Scott MP (1998) Splitting hairs: dissecting roles of signaling systems in epidermal development. Cell 25: 95: Overturf K, Al-Dhalimy M, Finegold M, Grompe M (1999). The repopulation potential of hepatocyte population differing in size and prior mitotic expansion. J. Am. Pathol. 155: Owen G (1956) Observations on the stomach and digestive diverticula of the Lamellibranchia II. The Nuculidae. Q. J. Microsc. Sci. 97: Owen G (1966) Digestion. Non: Physiology of the molluscan orr. Wilbur KM & Yonge CM (ed.). 2. Academic Press. New York. Owen G (1970) The fine structure of the digestive tubules of the marine bivalve Cardium edule. Phil. Trans. R. Soc. London Ser. 60: Owen G (1972) Lysosomes, peroxisomes and bivalves. Sci. Prog. 60: Owen G (1973) The fine structure and histochemistry of the digestive diverticula of the protobranchiate bivalve Nucula sulcata. Proc. R. Soc. London B. 183: Pal SG (1972) The fine structure of the digestiv e tubules of Mya Arenaria L. II. Digestive cell. Proc. Malacol. Soc. London. 40: Palacios J, Honrado E, Ososio A, Cazorla A, Sarrió D, Barroso A, Rodríguez S, Cigudosa JC, Diez O, Alonso C, Lerma E, Dopazo J, Rivas C, Benítez J (2005) Phenotypic characterization of BRCA1 and BRCA2 tumors based in a tissue microarray study with 37 immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 90:5-14. Palmer RW (1979) Histological and histochemical study of digestion in the bivalve Arctica islandica L. Biol. Bull. 156: Peatman E, Kucuktas H, Li P, He C, Feng J, Wei X, Liu Z Differentially expressed oyster (Crassostrea virginica) genes after exposure to mercury eko uztailan eskuratua. b=nucleotide&val= Peruzzi E, Sonetti D (2004) Microglia proliferation as a response to activation in the freshwater snail Planorbarius corneus: A BrdU incorporation study. Acta Biol. Hung. 55:

72 Bibliografia Platt AM (1971) Doktoradutza-Tesia. The Queen s University. Belfast. Pirger Z, Elekes K, Kiss T (2004) Functional morphology of the salivary gland of the snail, Helix pomatia: a histochemical and immunocytochemical study. Acta Biol. Hung. 55: Pollard JW, Hennighausen L (1994) Colony stimulating factor 1 is required for mammary gland development during pregnancy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: Potten CS (1998) Stem cells in gastrointestinal epithelium: Numbers, characteristics and death. Philo. Trans. R. Soc. London Ser. B Biol. Sci. 353: Potten CS & Loeffler M (1990) Stem cells: attributes, cycles, spirals, pitfalls and uncertainties. Lessons for and from the crypt. Development 110: Potten CS, Booth C, Tudor GL, Booth D, Brady G, Hurley P, Ashton G, Clarke R, Sakakibara S, Okano H (2003) Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation 71: Prelich G, Tan CK, Kostura M, Mathews MB, SØ AG, Downey KM, Stillman B (1987) Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase-δ auxiliar protein. Nature 326: Quincoces I (1995) Un nuevo modelo de la glándula digestiva de Mytilus galliprovincialis (Bivalvia, Eulamellibranchia): reconstrucción tridimensional asistida por ordenador y microscopía electrónica de barrido. Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 112 orr. Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light and electron microscopic studies of the acute and chronic toxic effects of N-nitroso compounds on the marine mussel Mytilus edulis (L.). II. N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine. Aquat. Toxicol. 3: Reddy AB, Wong GKY, O Neill J, Maywood ES, Hastings MH (2005) Circadian clocks: Neural and peripheral pacemakers that impact upon the cell division cycle. Mut. Res. 574: Recio A, Marigómez JA, Angulo E, Moya J (1988) Zinc tratment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Cellular distribution of zinc and cadmium. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 41: Regoli F (1992) Lysosomal responses as a sensitive stress index in biomonitoring heavy metal pollution. Mar. Ecol. Prog. Ser. 84: Roach DK (1968) Rhythmic muscular activity in the alimentary tract of Arion ater (L) (Gastropoda: Pulmonata). Comp. Biochem. Physiol. 24: Roberts CG, De Fazio A, Tattersal MH (1985) A simple rapid meted for the identification of cyclin cells in freshly excised tumors. Cytobios 43: Roberts AB, Sporn MB (1992) Differential expression of the TGF-β isoforms in embryogenesis suggests specific roles in developing and adult tissues. Mol. Reprod. Dev. 32: Robinson WE, Langton RW (1980) Digestion in a subtidal population of Mercenaria mercenaria (Bivalvia). Mar. Biol. 58: Robinson WE (1983) Assessment of bivalve intracellular digestion based on direct measurements. J. Moll. Stud. 49:1-8. Robledo Y, Cajaraville MP (1996) Ultrastructural and cytochemical study of the Golgi vomplex of mollusca (Mytilus galloprovincialis) digestive cells. Cell Tiss. Res. 284: Rudolph KL, Chang S, Millard M, Schreiber-Agus N, DePinho RA (2000) Inhibition of experimental liver cirrhosis in mice by telomerase gene delivery. Science 287: Runham NW, Hunter PJ (1970) Terrestrial Slugs. Hutchinson University Library, London. 184 orr. Sáez V, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1990) Histomorphology and histochemistry of the digestive gland of Littorina littorea (L.) in relation to experimental tidal conditions, food availability, and digestion. Zool. Jb. Anat. 120: Salvini-Plawen LV (1988) The structure and function of molluscan digestive systems orr. Non: The Molluscan. Form and function

73 Zati Teorikoa Trueman ER & Clarke MR (ed). Academic Press, Orlando, Florida. Sancho E, Batlle E, Clvers H (2004) Signaling pathways in intestinal development and cancer. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 20: Sanskrithi N, Eskin A (1999) Effects of cyclindependent kinase inhibitors on transcription and ocular circadian rhythm of Aplysia. J. Neurochem. 72: Sarli G, Benazzi C, Preziosi R, Marcato PS (1995) Assessment of proliferative activity by anti- PCNA monoclonal antibodies in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and correlation with mitotic index. Vet. Pathol. 32: Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, Enikolopov G, Asghar Z, Wheeler MB, Korbutt G, van der Kooy D (2004) Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat. Biotechnol. 22: Schluter C, Duchowr M, Wohlenberg C, Becker MHG, Key G, Flad HD, Gerdes J (1993) The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki- 67: A very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins. J. Cell Biol. 123: Schmetsdorf S, Gärtner U, Arendt T (2005) Expression of cell cycle-related proteins in developing and adult mouse hippocampus. Int. J. Dev. Neurosci. 23: Scholzen T, Gerdes J (2000) The Ki-67 protein: From the known and the unknown. J. Cell Physiol. 182: Scott J, Liu P, Smith PM (1999) Morphological and functional characteristics of acinar atrophy and recovery in the duct-ligated parotid gland of the rat. J. Dent. Res. 78: Sesto A, Navarro M, Burslem F, Jorcano JL (2002) analysis of the ultraviolet B response in primary human keratinocytes using oligonucleotide microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: Sherr CJ (1996) Cancer cell cycles. Science 274: Simkiss K (1981) Cellular discrimination processes in metal accumulating cells. J. Exp. Biol. 94: Slack JM (1995) Developmental biology of the pancreas. Development 121: Slack JM (2000) Stem cells in epithelial tissues. Science 287: Smalley M, Ashworth A (2003) Stem cells and breast cancer: a field in transit. Nat. Rev. Canc. 3: Sminia T (1981) Gastropods. Non: Invertebrate blood cells orr. Ratcliffe NA & Rowley AF (ed). New York: Academic Press. Smith GH, Gallahan D, Diella F, Jhappan C, Merlino G, Callahan R (1995) Constitutive expression of a truncated INT3 gene in mouse mammary epithelium impairs differentiation and functional development. Cell Growth. Differ. 6: Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I (1990) A planimetric study of morphological variability in the digestive diverticula of Littorina littorea (Linnaeus) and Mytilus edulis (Linnaeus). J. Moll. Stud. 56: Soto M, Cajaraville MP, Marigómez I (1996) Tissue and cell distribution of copper, zinc and cadmium in the mussel, Mytilus galloprovincialis, determined by autometallography. Tiss. Cell 28: Soto M, Marigómez I (1997) Metal bioavailability assessment in "Mussel-Watch" programmes by automated image analysis of BSD in digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156: Soto M, Zaldibar B, Cancio I, Taylor MG, Turner M, Morgan AJ, Marigómez I (2002) Subcellular distribution of cadmium and its cellular ligands in mussel digestive gland cells as revealed by combined autometallography and X-ray microprobe analysis. Histochem. J. 34: Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T (2001) Stem cells find their niche. Nature 414: Sumner AT (1965) The cytology and histochemistry of the digestive gland cells of Helix. Q. J. Microsc. Sci. 106:

74 Bibliografia Sumner AT (1966) The fine structure of the digestive gland of Helix, Succinea and Testacella. J. Roy. Microsc. Soc. 85: Sumner AT (1969) The distribution of some hydrlitic enzymes in cells of the digestive gland of certain lamellibranchs and gastropods. J. Zool. 158: Suzuki A, Nakauchi H, Taniguchi H (2004) Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes 53: Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) Morphological alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 44:85-98 Takahashi S, Nakamura S, Suzuki R, Islam N, Domon T, Yamamoto T, Wakita M (2000). Apoptosis and mitosis of parenchyal cells in the duct-ligated rat submandibular gland. Tiss. Cell 32: Takahashi S, Nakamura S, Suzuki R, Shinzato K, Domon T, Yamamoto T, Wakita M (2001) Apoptosis and mitosis of myoepithelial cells in atrophic rat submandibular glands. J. Histochem. Cytochem. 49: Takahashi S, Schoch E, Walker NI (1998) Origin of acinar cell regeneration after atrophy of the rat parotid induced by duct obstruction. Int. J. Exp. Pathol. 79: Takahashi S, Shinzato K, Nakamura S, Domon T, Yamamoto T, Wakita M (2002) The roles of apoptosis and mitosis in atrophy of the raltsublingual gland. Tiss. Cell 34: Theise ND, Saxena R, Portmann, BC, Thung SN, Yee H, Chiriboga L, Kumar A, Crawford JM (1999) The canals of Hering and hepatic stem cells in humans. Hepatology 30: Thompsom RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starvation on structure and function in the digestive gland of the mussel (Mytilus edulis). J. Mar. Biol. 54: Till JE, McCulloch EA (1961) A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res.14: Tosh D, Strain A (2005) Liver stem cells-prospects for clinical use. J. Hepatol. 42: Tomasovic SP, Mix MC (1974) Cell renewal in the gill of the freshwater mussel Margaritifera margaritifera: an autoradiographic study using high specific activity tritiated thymidine. J. Cell Sci. 14: Tomic-Canic M, Agren MS, Alvarez OM (2004) Epidermal repair and the chronic wound. Non: The epidermis in wound healing orr. Rovee D & Maibach H (ed). CRC Press, U.S.A. Topper YJ, Freeman CS (1980) Multiple hormone interactions in the developmental biology of the mammary gland. Physiol. Rev. 60: Toschi L, Bravo R (1988) Changes in cyclin/proliferating cell nuclear antigen distribution during DNA repair synthesis. J. Cell Biol. 107: Totafurno J, Bjerkes M, Cheng H (1987) The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophys. J. 52: Triebskorn R (1991) The impact of molluscicides on enzyme activities in the hepatropancreas of Deroceras reticulatum (Müller). Malacologia 33: Triebskorn R, Kohler HR (1996) The impact of heavy metals on the grey garden slug, Deroceras reticulatum (Muller): Metal storage, cellular effects and semi-quantitative evaluation of metal toxicity. Environ. Poll. 93: Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989) Quantitative alterations in digestive cell structure of the marine gastropod Littorina littorea on exposure to cadmium. Mar. Biol. 103: Venier P, Pallavicini A, De Nardi B, Lanfranchi G (2003) Towards a catalogue of genes transcribed in multiple tissues of Mytilus galloprovincialis. Gene 314: Visakorpi T (1992) Proliferative activity determined by DNA flow cytometry and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemistry as a prognostic factor in prostatic carcinoma. J. Pathol. 168:7-13. Vogt G (1994) Life-cycle and functional cytology of the hepatopancreatic cells of Astacus astacus. Crustacea, Decapoda. Zoomorphol. 114:

75 Zati Teorikoa Voltzow J (1994) Gastropoda: Prosobranchia. Non: Microscopic Anatomy of Invertebrates orr. Harrison FW & Kohn AJ (ed). Wiley- Liss. Inc. Walker G (1969) Studies on digestion of the slug Agriolimax reticulatus (Müller) (Mollusca, Pulmonata, Limacidae). Doktoradutza-Tesia, University of Wales. Walker G (1971) The cytology, histochemistry, and ultrastructure of the cell types found in the digestive gland of slug, Agriolimax reticulatus. Protoplasma 71: Walker G (1972) The digestive system of the slug, Agriolimax reticulatus (Müller): Experiments on phagocytosis and nutrient absortion. Proc. Malacol. Soc. 40: Waseem NH, Lane DP (1990) Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Structural conservation and the detection of a nuclear form. J. Cell Sci. 96: Watt FM (2000) Epidermal stem cells as targets for gene transfer. Hum. Gene Ther. 16: Weinstein J, Jacobsen FW, Hsu-Chen J, Wu T, Baum LG (1994) A novel mammalian protein, p55cdc, present in dividing cells is associated with protein kinase activity and has homology to the Saccharomyces cerevisiae cell division cycle proteins Cdc20 and Cdc4. Mol. Cell Biol. 14: Wells JM (2003) Genes expressed in the developing endocrine pancreas and their importance for stem cell and diabetes research. Diabetes Metab. Res. Rev. 19: Widdows J, Moore MN, Lowe DM Sublethal biological effects and short-term recovery of mussels (Mytilus edulis) and winkles (Littorina littorea) following chronic exposure to petroleum hydrocarbon. Non: Long term effects of oil on marine benthic communities in enclosures. Norwegian Institute for Water Research/NIVA Technical Report No Wood RD, Shivji MKK (1997) Which DNA polymerases are used for DNA-repair in eukaryotes? Carcinogenesis 18: Yamada K, Yoshitake K, Sato M, Ahnen DJ (1992) Proliferating cell nuclear antigen expression in normal, preneoplastic, and neoplastic colonic epithelium of the rat. Gastroenterology 103: Yanagi S, Potter VR (1977) Sequential changes in ornithine decarboxylase thymidine kinase, and other enzyme activities in regenerating liver in rats on controlled feeding schedules. Life Sci. 1: Yonge CM (1926) The digestive diverticula in Lamellibranchia. Trans. Roy. Soc. Edinbourgh 54: Yoshino TP (1976) Histopathological effects of larval digenea on the digestive epithelia of the marine prosobranch Cerithidea californica: fine structural changes in the digestive gland. J. Invert. Pathol. 28: Yu CCW, Hall PA, Fletcher CDM, Camplejohn RS, Waseem NH, Lane DP, Levison DA (1991) Haemangiopericytomas: The prognostic value of immunohistochemical staining with a monoclonal antibody to proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Histopathol. 19: Zakharov IS, Hayes NL, Ierusalimsky VN, Nowakowsky RS, Balaban PM (1998) Postembryonic neurogenesis in the protocerebrum of the terrestrial snail, Helix lucorum L. J. Neurobiol. 35: Zhu MH, Ni CR, Zhu Z, Li FM, Zhang SM (2003) Immunohistochemical demonstration of cyclins A, B, D1, D3 and E in hepatocellular carcinomas using tissue microarrays. Zhonghua. Bing. Li. Xue. Za. Zhi. 32:

76 Hipotesi eta helburuak AUZIAREN EGOERA Moluskuen liseri-guruina eraenketa metabolikoaren organo nagusia da. Horrela, sistema immunean eta barne medioaren (ph, Ca-kontzentrazioa ) eraenketa homeostatikoan parte hartzen du, eta elikagaien liseriketa intrazelular eta estrazelularraren zein hondakinen jariapenaren arduradun nagusia da. Dena den, eta zati teorikoan azaldu den moduan, moluskuen liseri-guruinaren epitelioa zelula-mota urriz osaturik dago, 2 edo 3 zelula-mota. Liseri-guruina, gainera, estres peko egoera desberdinetan modu neurgarrian erantzuteko gai da, liseri-epitelioaren lodieraren murrizpenarekin edota liserizelulen lisosomen tamaina eta osagaien aldaketarekin besteak beste. Hala ere, liseriguruineko epitelioan gertatutako aldaketen artean garrantzitsuena beharbada zelulamoten ordezkapena da. Horrela, zelula basofilikoen dentsitate erlatiboa liseri-guruinean liseri-zelularenaren gainetik emendatu egiten da. Dena den, prozesu hori liseri-zelulen galera, zelula basofilikoen proliferazioa edo bi prozesuen elkarrekintzak sortua den argitu beharra dago. Liseri-guruinaren antolakuntza-eredua desberdina da molusku espezie desberdinen artean eta osaketa zelularra ere desberdina da. Horretaz gain, modelo desberdinek erakusten duten plastikotasuna ere desberdina da, hori dela eta nagusiki muskuilu itsastarrean deskribatu diren aldaketak beste molusku-ereduetan orokortu daitezkeen ere ezagutzea komenigarria litzateke. Ugaztunen epitelio-ehun desberdinetan kalteren baten eraginez, epitelio-zelulen galera esanguratsua gertatzekotan, epitelioaren berreskurapena bi modu desberdinetan ematen da nagusiki; epitelio-ehunen zelula amen zatiketaren bidez, edo oraindik ere epitelioan darraiten zelula helduen zatiketen bidez. Moluskuen liseri-guruinean, hala ere, zelula amen presentzia oraindik ere argitzeko dago, eta beraz beharrezkoa zaigu epitelio honen berriztapena nola ematen den ulertzea, eta baita ere moluskuen bizi-zikloan zehar berriztapena nola eraentzen den ezagutzea. Bestalde, moluskuak ingurugiro kutsaduraren organismo zentinela gisa aspaldi erabiliak izan dira. Izan ere, beraien ehunetan kutsatzaileak metatzen dituzte, eta kutsatzaileen aurrean modu neurgarrian erantzuteko gai dira. Erantzun neurgarri hauen artean biomarkatzaileak ditugu. Biomarkatzaileak antolakuntza-maila xinpleetan ematen diren aldaketen neurketak dira, beranduago eta antolakuntza-maila konplexuagoetan gertatuko diren aldaketak aurresateko baliogarriak izango zaizkigunak. Hori dela eta, organismo hauen gainean, eta batez ere beraien liseri-guruinean, hainbat neurketa biologiko (biomarkatzaileak) zein kimiko (biometaketa) burutzen dira. Liseri-guruinean gertatzen diren zelula-moten aldaketek, beraz, eragin zuzena eduki dezakete ingurugiro- 71

77 Hipotesi eta helburuak kalitatearen jarraipen programetan egindako hainbat neurketetan. Hortaz, zelula-moten ordezkapenak neurketa hauetan hainbat alditan behatutako emaitza eztabaidatsuetan eragina izan ote dezaken argitu beharra dago. HIPOTESIA Moluskuen liseri-guruineko epitelioaren berriztapena zelula helduen zatiketa autologoz burutzen da eta aldagai naturalen pean alda daiteke. Esaterako, liseri-epitelioan ingurumen-estresak bultzatutako zelula-moten ordezkapena, zelula basofilikoen proliferazio areagotuak eragiten du. Bederen, zelula-moten osaketaren aldaketa horrek, kutsaduraren jarraipen-programetan erabilitako zenbait biomarkatzaileen gainean eragina du. HELBURUAK Aipatutako hipotesia frogatzeko asmoz, ikerlan honetarako hurrengo helburu orokor hauek proposatu ditugu: 1.- Moluskuen liseri-guruinaren epitelioaren berriztapena zelula amen edo zelula helduen zatiketaz ematen den argitzea. 2.- Epitelioaren berriztapenaren dinamika ezagutzea eta beren gain zeintzu faktorek eragiten duten zehaztea. 3.- Moluskuen liseri-guruinean gertatzen den zelula-moten ordezkapena, zelula basofilikoen proliferazioak eraginda dagoen antzematea. 4.- Aldaketa horiek kutsaduraren jarraipenerako erabiltzen diren ohiko hainbat biomarkatzaileen gainean nolako eragina duten zehaztea. Ikerlanaren helburu orokor horiek segidan azalduko diren eta Emaitzak eta Eztabaida atalean ekin diegun honako helburu espezifiko hauetan xehatu dira. 1.- Kutsatzaile metaliko zein organikoek, muskuiluen liseri-guruineko epitelioan zelula-moten ordezkapena noiz, nola eta zein puntutaraino eragin dezaketen jakitea. 2.- Muskuiluen liseri-guruineko epitelioko zelula-moten ordezkapenak autometalografiaz errebelatutako zilarrezko hauspeakin beltzen hedapena gisako biomarkatzaileen gainean nolako eragina duen zehaztea. 72

78 Hipotesi eta helburuak 3.- Muskuiluen liseri-guruineko epitelioaren berriztapenak patroi zirkadianoa edo zirkamareala jarraitzen ote duen zehaztea. 4.- Tamaina, sasoi eta itsasaldi-erregimena gisako faktore naturalek Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-albeolo eta urdaileko zelulen jarduera proliferatzailean nolako eragina duten zehaztea 5.- Kadmioz kutsatutako magurioetan zelula-moten ordezkapena liseri-zelulen kopuruaren murrizpen zuzenarekin edota zelula basofilikoen proliferazioarekin erlazionatuta ote dagoen zehaztea. 6.- Balizko zelula-moten ordezkapen horrek metalen esposizio eta efektu bilogikozko biomarkatzaileen gainean eraginik ote duen antzematea. 7.- Kutsatzaile organiko eta metalikoen nahasketa pean egondako bareen liseriguruinean zelula-moten ordezkapena liseri-zelulen galerarekin edo kaltzio-zelulen proliferazioarekin erlazionatuta dagoen eta prozesu hori itzulgarria ote den zehaztea. 8.- Prozesu horrek konposatu kimiko horien biometaketan eta efektu eta esposiziobiomarkatzaileetan nola eragiten duen finkatzea. 9.- Kronikoki kutsadura pean egondako bareen liseri-guruineko osaketa zelularra zein den zehaztea eta toki garbira lekuzaldatu ondoren liseri-guruinaren osaketa zelularrari zein biomarkatzaileen erantzunei dagokionez, kutsadura kroniko horrek sorterazitako aldaketak norainoko eragina izan dezaketen esagutzea. 73

79 Hipotesi eta helburuak 74

80 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Laburpena: Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-epitelioa bi zelula-motez osaturik dago, liseri-zelula eta zelula basofilikoa. Egoera normaletan liseri-zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak dira, baina kutsatzaileen eraginez zelula basofilikoen proportzio erlatiboaren emendioa deskribatu da. Alterazio horri, zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type replacement) deritzo. Autometalografia (AMG), metalak zeluletan lokalizatzearen bidez metal kutsatzaileen ingurun ak ebaluatzeko erabiltzen den teknika histokimiko sentikorra da, metalak zilarrezko hauspeakin beltz (BSD; ingeleraz, black silver deposits) gisa liseri-zelulen lisosometan agertzen direlarik. Ikerlan honen helburuak hiru dira. Lehenik, Cd moduko kutsatzaileek CTR eragin dezakeenentz jakitea. Bigarrenik, AMGz errebelatutako Cd-ren kokapena zelula-espezifikoa den ultrastruktura-mailan egiaztatzea eta, horrela balitz, AMGren bidez egindako estimazioen gain CTRk zer nolako eragina duen ezagutzea. Azkenik, CTR gerta dadin kutsatzaile desberdinen zein kontzentrazio beharrezkoak diren eta prozesua itzulgarria den finkatzea. Helburu horiek lortzeko, muskuiluak kutsatzaile organiko eta ez-organikoen kontzentrazio pean eta denbora-tarte desberdinetan mantendu dira laborategiko bost esperimentu osagarritan. CTR kuantifikatzeko, liseri-guruinaren parafinazko ebakietan zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa (Vv BAS ) estimatu da estereologiaren bidez. Era berean, BSDen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) irudianalisia erabiliz kalkulatu da. Horrela, Cd-k CTR eragiten duela demostratu dugu. Bestalde, BSD liserizelulen lisosomen barruan eta beren mintzaren inguruan lokalizatu dira espezifikoki, eta inoiz ez zelula basofilikoetan. BSD, metal espezifikoak ez diren arren, S-ri asoziatutako Cd ioien inguruan eratuak direla X izpien mikroanalisia eta mapaketen bidez erakutsi dugu. Lokalizazio zelula-espezifiko horren ondorioz, CTRk Vv BSD balioen gainean eragina duela frogatu dugu, ingurumen-metalen bioeskuragarritasunaren estimazioak egiterakoan arazoak ekar litzakeena. Bestetik, kutsatzaile organiko, ez-organiko zein beraien nahasketek CTR eragin dezaketela ikusi dugu, kutsatzaile desberdinen kontzentrazio eraginkorra desberdina den arren. Gako-hitzak: zelula-moten ordezkapena, autometalografia, kadmioa, benzo(a)pirenoa, X izpien mikroanalisia, muskuilua, liseri-guruina. 77

81 Emaitzak eta eztabaida Cell-type replacement in the digestive gland of mussels exposed to pollutants Abstract: The digestive gland epithelium of the mussel Mytilus galloprovincialis (Lmk) is comprised of two cell types, namely digestive and basophilic cells. Under normal circumstances digestive cells outnumber basophilic cells but under the influence of pollutants a relative increase in the proportion of basophilic cells has been described. This alteration has been termed cell-type replacement (CTR). Autometallography (AMG) is a sensitive histochemical technique to localize metals in cells as black silver deposits (BSD) and has been used in the assessment of environmental metal pollution. BSD are localized in the digestive cells lysosomes. The objectives of this work are three. First, to know whether pollutants such as Cd were able to induce CTR. Second, to check wether Cd localization revealed by AMG at the ultrastructural level were cell-specific and, if so, to determine wether CTR influenced the estimations made by AMG. Finally, to determine the effective concentration of various pollutants to provoke CTR and to check wether CTR is reversible. For these purposes mussels were exposed to different concentrations of organic and inorganic pollutants at various exposure-times in five complementary laboratory experiments. In order to quantify CTR, volume density of basophilic cells (Vv BAS ) was estimated on hematoxylin-eosin stained sections by means of stereology. Similarly, the volume density of BSD (Vv BSD ) was calculated with the aid of an image analysis. Results revealed that Cd provoked CTR. On the other hand, while BSD were specifically localized within digestive cells lysosomes, basophilic cells were devoid of BSD. X-ray microprobe analisys and X-ray mapping demonstrated that although BSD are not metal specific they were mainly formed around the Cd associated to S atoms. Due to this specific localization, CTR influences Vv BSD values, and therefore when environmental bioavailable metal levels are estimated this must be taken into account. On the other hand, organic and inorganic pollutants or their mixtures can provoke CTR although critical concentrations may change. Key Words cell-type replacement, autometallography, cadmium, benzo(a)pyrene, X-ray microanalysis, mussel, digestive gland. 78

82 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Sustitución de tipos celulares en la glándula digestiva de mejillones expuestos a contaminantes Resumen: El epitelio de la glándula digestiva del mejillón Mytilus galloprovincialis (Lmk) está constituido por dos tipos celulares, denominados célula digestiva y célula basófila, respectivamente. En circunstancias normales las células digestivas son más numerosas que las basófilas pero bajo la influencia de contaminantes se ha descrito un aumento en la proporción relativa de células basófílas. Ésta alteración ha sido denominada sustitución de tipos celulares (CTR; del inglés, cell-type replacement). La autometalografía (AMG) es una técnica histoquímica sensible que mediante la localización de metales en las células ha sido utilizada en la evaluación de la contaminación metálica del medio ambiente detectando los metales como depósitos negros de plata (BSD; del inglés, black silver deposits) en los lisosomas de las células digestivas. El presente estudio tiene tres objetivos. Primero, saber si contaminantes como el Cd son capaces de provocar CTR. Segundo, determinar si el Cd revelado mediante AMGa nivel ultrastructural se localiza específicamente en un tipo celular, y si así fuera, conocer si CTR tiene alguna influencia en las estimaciones hechas sobre los datos obtenidos mediante AMG. Finalmente, establecer las concentraciones necesarias por diferentes contaminantes para provocar CTR y determinar si CTR es un proceso reversible. Para cumplir estos objetivos se han diseñado cinco experimentos de laboratorio complementarios en los que se han expuesto mejillones a diferentes concentraciones durante diferentes periodos de tiempo a contaminantes orgánicos e inorgánicos. Para cuantificar CTR se ha estimado la densidad volumetrica de células basofílicas (Vv BAS ) en cortes de parafina mediante esterología. Del mismo modo, se ha calculado la densidad volumétrica de BSD (Vv BSD ) mediante análisis de imagen. Los resultados demuestran que el Cd provoca CTR. Por otro lado, mientras los BSD se localizan asociados a la membrana de los lisosomas de las células digestivas, las células basofílicas no muestran BSD. Mediante el empleo de microanálisis y mapeo de rayos X se ha demostrado que aunque los BSD no son específicos para cada tipo de metal, éstos se forman mayormente alrededor de los átomos de Cd asociados a S. Debido a esta localización específica, CTR influye sobre los valores de Vv BSD y por lo tanto puede crear problemas al estimar la biodisponibilidad metálica en el medio ambiente. Por otro lado, los contaminantes orgánicos, inorgánicos y la mezcla de éstos provocan CTR aunque las concentraciones efectivas son diferentes en cada caso. Palabras clave: sustitución de tipos celulares, autometalografía, cadmio, benzo(a)pireno, microanálisis de rayos X, mejillón, glándula digestiva. 79

83 Emaitzak eta eztabaida 80

84 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean SARRERA Muskuiluen liseri-guruinaren epitelioa bi zelulamotez osaturik dago: liseri-zelulak eta zelula basofilikoak (Morton, 1983). Liseri-zelulek oso sistema endo-lisosomiko garatua dute, eta batez ere barne-liseriketaz arduratzen diren arren, kutsatzaileen metaketan eta detoxifikazioan ere parte har dezakete (Viarengo, 1989; Cajaraville et al., 1995). Zelula basofilikoek duten funtzioa momentuz argitzeke dago, baina liseriketa estrazelularrean parte har dezakete, horretarako beharrezkoak diren entzimak sortu eta jariatzen dituztelarik. Izan ere, beraien erretikulu endoplasmatiko pikortsua oso garatua dago, eta horrek beren basofilia bereizgarria emango lieke (Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1998; Dimitriadis et al,. 2004). Egoera normaletan liserizelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak dira; baina inguruneko estres-iturri desberdinek, kutsatzaileek sortutako estresak barne, epitelioaren osaketan aldaketak sortarazi ditzakete, zelula basofilikoen proportzio erlatiboa emendatuz (Thompson et al.,1974; Rasmussen et al., 1983; Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990a; Syasina et al., 1997; Marigómez et al., 1998). Estresak induzitutako alterazio hori, zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type replacement) izenaz ezagutzen dena, liseri-zelulen galerak, zelula basofilikoen proliferazioak edo bi prozesu horien konbinaketak sortarazia izan daitekeela proposatu da (Marigómez et al., 1990a). Muskuiluen kasuan, N-nitroso konposatuek (Rasmussen et al., 1983), eta petrolioen eta olio lubrifikatzailearen uretan egokitutako frakzioak (WAF; ingeleraz, water accomodated fraction; Cajaraville et al., 1990a) CTR induzi dezakete. Halaber, zelai-ikerketen arabera, metal-kutsadura duten lekuetako moluskuen liseri-guruinean ere CTR behatu da (Soto & Marigómez,1997a; Syasina et al., 1997). Zenbait metalek (Cd, Cu, Zn) eta konposatu organikok (benzo(a)pirenoa -BaP-), zein beren nahasketek CTR eragin dezaketen zehaztea dugu ikerlan honen lehengo helburu. Gainera, kutsatzaile bakoitzaren kontzentrazio eraginkorra zein den ere finkatu nahi dugu. Bestalde, CTR prozesuaren mekanismoak ezagutzeko nahian, estres-iturria eten ondoren prozesua itzulgarria denentz jakitea ere planteatu dugu. Azkenik, CTR pairatu duten muskuiluek (adb., zelaian leku kutsatuan jasotakoak) laborategian berriro metalen pean jarriz gero, CTRri dagokion erantzunkortasuna ere aztertu nahi izan dugu. Ingurumen-toxikologian, metal kutsatzaileen maila bioeskuragarrien (esposizioa) zein beren efektu biologikoak neurtzeko biomarkatzaileak deritzen neurketak aplikatu ohi dira (Cajaraville et al., 2000). Esposizio-biomarkatzaileen artean, zeluletan metatutako metalak kuantifikatzeko oso sentikorra den autometalografia (AMG) izeneko teknika histokimikoa dugu. Teknika horren ezaugarri nagusia, duen izugarrizko sentikortasuna da, seinale ikuskorra emateko hamar atomo katalitikoren presentzia nahikoa izan daitekeelarik (Danscher, 1984). Beraz, moluskuen ehunetan metalak argi-mikroskopioan lokalizatzeko nahiko erabilia izan da. AMG aplikatu ondoren, Cu, Zn, Hg 81

85 Emaitzak eta eztabaida eta Cd moduko metalak zilarrezko hauspeakin beltz (BSD; ingeleraz, black silver deposits) moduan agertzen dira markaturik, batez ere liseri-zelulen lisosometan (Hemelraad & Herwig, 1988; Herwig et al., 1989; Soto et al., 1996a; 1996b; Soto & Marigómez, 1997a; 1997b; Domouhtsidou & Dimitriadis, 2000; Marigómez et al., 2002). Tamalez, teknika hau oso sentikorra den arren, ez da batere espezifikoa, metal ezberdinak bananbanan ezin baitira identifikatu. Beraz, BSDen presentzia ezin da metal jakin baten kokapenarekin erlazionatu. Testuinguru honetan, Cd pean mantendutako animalietan BSDak espezifikoki Cd ioien inguruan sortzen direla frogatu nahi izan dugu, elektroi-zunden mikroanalisi (EPMA; ingeleraz, electron probe microanalysis) moduko teknika mikroskopiko osagarriak AMGrekin batera erabiliz. AMG ez bezala, EPMA oso teknika espezifikoa da, zelulen osaketa elemental zehatza karakterizatzeko erabilia izan dena (Marigómez et al., 1990a; Morgan & Morgan, 1998; Dimitriadis & Papadaki, 2004). Aldi berean, EPMAren emaitzak, Ag eta Cd moduko metal-ioiak kolokalizatzeko oso teknika egokia den X izpien mapaketaren bidez (Morgan & Morgan, 1998) baieztatzea planteatu dugu. Bestalde, AMG argi-mikroskopioan aplikatzean metalak identifikatu ezin baditugu ere, errebelatutako BSD-hedapena metatutako metalen mailaren arabera emenda daiteke, bere kuantifikazioak metal bioeskuragarrien maila adieraz dezakeelarik (Soto & Marigómez, 1997b). Izan ere, liseri-lisosometako BSD-hedapena irudianalisi bitartez kuantifikatuz, BSDen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) deritzon parametroa kalkula daiteke. Vv BSD metal-esposizioaren biomarkatzaile egokia da, zenbait espezie desberdinetan ikusi denez (Soto & Marigómez, 1997a, 1997b; Da Ros et al., 2000; Porte et al., 2001). Hala ere, biomarkatzaile horren aplikazioari dagokionez, CTR fenomenoa aintzakotzat hartu beharrekoa da, metala metatzen duten liseri-zelulak zelula basofilikoz ordezkatuak baitira, metalak metatzeko liseri-guruinak duen gaitasuna aldarazita suertatu daitekeelarik (Soto & Marigómez, 1997b; Marigómez et al., 2002). Izan ere, metalak metatuz doazen heinean, Vv BSD balioek ez dute zertan gora egin behar; metala metatzen ez duten zelula basofilikoak, liseri-zelulak baino ugariak bilaka baitaitezke. Hots, atalase batetik aurrera metalen pean jarritako muskuiluetan liseri-epitelioan ematen den metaleen metaketa zelula-moten proportzioaren arabera alda liteke (Marigómez et al., 1990b; 1998). Hori dela eta, Vv BSD moduko biomarkatzaileen gainean CTRk zer nolako eragina izan dezaken jakitea dugu azken helburu. Sarrera honetan aipatutako helburuak erdiesteko, bost esperimentu desberdin diseinatu ditugu. Guztietan Mytilus galloprovincialis muskuiluak laborategiko baldintzen pean kutsatzaile desberdinez tratatu dira, denbora tarte eta kontzentrazio desberdinetan. Lehenengo esperimentuan, Plentziatik hartutako muskuiluak CTR induzi lezaken Cd kontzentrazio pean mantendu ziren 21 egunez, eta Vv BAS eta Vv BSD denbora tarte desberdinetan kalkulatu ziren. Halaber, Cd-aren lokalizazio ultrastrukturala eta 82

86 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean BSDen azterketa elementala burutu ziren, Cd-aren lokalizazioa zelula-espezifikoa dela ikertzeko asmoz. Bigarrenean, Plentziako muskuiluak, CTR induzitzen ez duten Cd kontzentrazioak aurkitu nahian, Cd kontzentrazio baxuago pean mantendu ziren, eta Vv BAS zein Vv BSD kalkulatu ziren. Hirugarren esperimentuan, Cu, Cd eta Zn bidezko tratamenduen arteko konparaketari ekin zitzaion, hiru metalen CTR induzitzeko gaitasuna eta Vv BSD balioen gaineko eragina alderatuz. Halaber esperimentu honetan, muskuiluak hiru metal horiekin 7 egunez tratatu ondoren, CTR itzulgarria den jakiteko asmoz, 14 eguneko arazketa-aldia aplikatu zen. Laugarren esperimentuan, Plentziako muskuiluak, Benzo(a)pireno (BaP) eta Cd + BaP pean mantendu ziren 21 egunez, kutsatzaile-mota desberdinen arteko elkarrekintzak CTRren gainean daukan eragina aztertzeko asmoz. Azkenik, bosgarren esperimentuan, aldez aurretik estresatutako muskuiluak (Zn-ez kutsatuak, Meñakozetik hartuak), laborategira ekarri eta Cd kontzentrazio desberdinen pean mantendu ziren 41 egunez, esposizio esperimentalak CTR areago dezakeenentz ikertzeko. MATERIAL ETA METODOAK Erreaktibo kimikoak Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkataletxekoak dira besterik agertu ezean. Prozedura esperimentala Bestelakorik esan ezean esperimentuetan erabilitako muskuilu (Mytilus galloprovincialis Lmk) mareartekoak, Plentzian (Bizkaia) (46º 26 I, 2º 55 M) hartu eta berehala laborategira garraiatu ziren. Bertan, muskuiluak, argi ultramore bidez esterilizatutako eta karbono aktiboz zein beirazko zuntzetan zehar iragazitako itsas-uretan mantendu ziren 7 egunez, tenperatura egonkorrean (15-16ºC). Muskuiluak baraurik mantendu ziren, laborategiko egoerara ohitu egin zitezen, eta urdailean zeuzkaten hondakinak hustu zitzaten, kutsatzaile peko tratamenduak hasi aurretik (moldarazte-tartea). Muskuiluak, esperimentuak iraun bitartean, fotoperiodo natural pean mantendu ziren, eta ornogabe itsastarrentzako jaki komertzialez (Marine Invertebrate Diet, Carolina, Burlington, North Carolina, Amerikako Estatu Batuak) elikatu ziren. Etengabeko aireztapena aplikatu zen, eta ura egunero aldatu zen. Lehenengo esperimentua 1998.eko apirilean hartutako muskuiluak, laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 80 µg Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan gehitua) zuen itsas-uretan mantendu ziren 21 egunez. Aldi berean, Cd gehitu gabeko kontrol serie bat ere burutu zen. Azterketa histologiko, autometalografia eta mikoanalisirako laginak 1., 7. eta 21. egunetan jaso ziren; absortzio atomikozko espektrofotometriarako laginak, ordea, bakarrik 18. egunean. 83

87 Emaitzak eta eztabaida Bigarren esperimentua 1999.eko martxoan hartutako muskuiluak, laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 10 µg Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan gehitua) zuen itsas-uretan mantendu ziren 7 egunez. Aldi berean, Cd gehitu gabeko kontrol serie bat ere burutu zen. Azterketa histologikoetarako laginak 1. eta 7. egunetan jaso ziren. Hirugarren esperimentua 1999.eko martxoan hartutako muskuiluak laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 10 µg Cd/l, 10 µg Cu/l zein 10 µg Zn/l-ko kontzentrazioa (Cd eta Zn kloruro, Cu sulfato moduan gehituak izanik) zuen itsas-uretan 7 egunez tratatu ziren (esposizio-taldeak), azkenik 14 egunez ur garbitan mantendu zirelarik (arazketa-taldeak). Aldi berean, metalik gehitu gabeko kontrol serieak ere burutu ziren. Azterketa histologikoak eta autometalografia egiteko laginak 1. orduan, eta 1. eta 7. egunetan hartu ziren, baita 14 eguneko arazketa-aldiaren ostean ere (21. eguna). Absortzio atomikozko espektrofotometriaren bidez metal-maila tisularrak neurtzeko laginak 1. orduan, eta 1., 7. eta 21. egunetan hartu ziren. Laugarren esperimentua 1998.eko apirilean hartutako muskuiluak, laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 21 egunez tratamendu desberdinak aplikatu zitzaien: (a) 500 µg Benzo(a)pireno/l-ko kontzentrazioa zuen itsasuretan (BaP talde esperimentala); (b) 80 µg Cd/l (kloruro moduan) eta 500 µg BaP/l batera zituen itsas-uretan (Cd + BaP talde esperimentala); eta (c) uretan disolbagarria izateko, BaP-a dimetil sulfoxidotan (DMSO) disolbatu zenez, 500 µg DMSO/l-ko kontzentrazioa zuen itsas-uretan mantendu ziren (DMSO kontrola). Aldi berean, Cdrik, BaP-rik zein DMSO-rik gehitu gabeko kontrol serie bat ere burutu zen (Itsas-ur kontrola). Azterketa histologikoak eta autometalografia egiteko laginak esperimentuaren 1., 7. eta 21. egunetan jaso ziren. Absortzio atomikozko espektrofotometriaren bidez metal-maila tisularrak neurtzeko laginak 18. egunean hartu ziren. Bosgarren esperimentua Meñakozen (43º 24 I, 2º 93 M) 1989.eko martxoan hartutako muskuiluak laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 10 µg Cd/l eta 80 µg Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan) zuen itsas-uretan 41 egunez mantendu ziren. Aldi berean, Cd-rik gehitu gabeko kontrol serie bat ere burutu zen. Azterketa histologikoak eta autometalografia egiteko laginak, 1., 7., 21., 27. eta 41, egunetan hartu ziren. Analisi kimikoak Disekzionatu eta gero, lehenengo, hirugarren eta laugarren esperimentuko liseri-guruinak ur distilatuan garbitu ziren, eta 120ºC-tara 48 orduz labean berotu ziren, guztiz lehortu arte. Lehortutako materiala almerizaren laguntzaz txikitu zen, eta azido nitriko kontzentratuan liseritu zen. Ondoren, azido nitriko kontzentratua plaka beroan lurrundu ostean, liseritutako materiala ur distilatuan diluitutako 0.1 M azido nitrikoan berresekitu zen. Laginak iragazi ondoren, absortzio atomikozko 84

88 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean espektrofotometroan (PerkinElmer 2280, Wellesley, Massachusetts, Amerikako Estatu Batuak) neurtu ziren. Lehenengo eta laugarren esperimentuetan Cd kontzentrazioak, µg Cd/g ehun pisu lehor modura kalkulatu ziren. Hirugarren esperimentuan, ordea, metal/maskor-pisua indizeak kalkulatu ziren (Soto et al., 1995). Erabilitako estandarrak Merck (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) merkatal-etxeak zertifikatutakoak izan ziren. Gertakuntza histologikoa Liseri-guruinaren zati txikiak (10 talde esperimentaleko) Carnoy fixatzailean fixatu ziren 4ºC-tan ordu batez (Martoja & Martoja-Pierson, 1970). Laginak goranzko graduazioko etanoletan deshidratatu ziren, metilo bentzoatoan aklaratu ziren eta bentzenozko bi bainutan murgildu eta gero, parafinan (60ºC) inkluditu ziren. Ebaki histologikoak (7 µm) Leitz 1512 eta American Optical mikrotomoetan lortu ziren. Liseri-guruinaren beste zati txiki batzuk, %2.5 glutaraldehidoa zuen kakodilato indargetzailean (0.1 M, ph = 7.2) fixatu ziren 4ºC-tan 2 orduz. Gerora, indargetzailean garbitu, goranzko graduazioko etanoletan deshidratatu eta, azkenik, Epon 812 erretxinan inkluditu ziren. Ebaki semifinak (1-3 µm) Leica Ultracut (UCT) ultramikrotomoan lortu ziren. Autometalografia (argi-mikroskopia) Parafinazko ebakiak xilolezko bainuetan desparafinatu ostean, beheranzko graduazioko etanoletan hidratatu ziren. Bai parafinazko zein erretxinazko ebaki semifinak labean (40ºC) mantendu ziren guztiz lehortu arte. Ondoren, laginak argazki-emultsio geruza fin eta uniformez estali ziren, gela ilunean (Ilford Nuclear Emulsion L4, Ilford, Mobberley, Ingalaterra). Gerora, laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean (30 minutu), eta errebelatzaile komertziala erabiliz errebelatu ziren. Parafinazko laginen kasuan, Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur distilatuan; (Tetenal AG & Co, Norderstedt, Alemania) errebelatzailea 15 minutuz aplikatu zen. Erretxinazko laginen kasuan, ordea, Kodak D-19 (Kodak, Paris, Frantzia) (%15 ur distilatuan) errebelatzailea, minutuz aplikatu zen. Ondoren, errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikozko disoluzioan minutu batez murgilduz geldiarazi zen. Azkenik, Agefix (Agfa Agefix, Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatzaileaz 10 minutuz fixatu ziren. Laginak Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) montatu ziren. Erretxinan inkluditutako ebakiak toluidina urdinez kontrastatu ziren. Metalioien presentzia, zilarrezko hauspeakin beltzen agerpenak adierazten du (Danscher, 1984; Soto et al., 1998b). Autometalografia (mikroskopio elektronikoa), EPMA eta X izpien mapaketa Beirazko portetan itsatsitako erretxinan inkluditutako 3 µm-ko ebaki semifinetan autometalografia aplikatu ondoren, Epon 812 erretxinan inkluditu ziren berriro ere ebaki ultrafinak egiteko. Mikroskopioan behaketa ultrastruktural 85

89 Emaitzak eta eztabaida morfologikoak egiteko, ebaki ultrafinak kuprezko euskarrietan bildu ziren, eta uranilo azetatoz eta berun zitratoz kontrastatu ziren. Bestalde, mikroanalisia egiteko, ebaki semifinak aldez aurretik karbono/formvar-ez estalitako aluminiozko euskarrietan (200 mesh) bildu ziren, eta berriro ere karbonoz estali ziren. Mikroanalisia, energia dispertsibozko espektrometroa lotuta zeukan JEOL 1210 STEM mikroskopioan burutu zen (kontaketa-denbora = 100 segundu). Espektruanalisia egiteko Link ISIS 1.04A softwarea erabili zen (Morgan & Morgan, 1998). X izpien mapaketa sistema berean burutu zen, Ag (Lα kev-, Lß kev-), Cd (Lß kev-) eta S (Kα kev-) elementuen seinaleak batera lokalizatzeko. BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan irudi-analisiaren bitartez Liseri-zelulen lisosometan zeuden BSDen hedapena irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto & Marigómez, 1997b), emaitzak BSDen dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (Vv BSD ). Argimikroskopiazko irudiak (x100 handipenean) B&W- CCD TV kamera, HR-TV kolorezko pantaila, Leitz mikroskopioa, PC ordenagailua, PIP 1024 (Matrox Electronic Systems Ltd., Dorval, Kanada) sistema eta Sevisan S.A. (Bilbo, Espainia) entrepresak 1. Irudia: Mytilus galloprovincialis muskuiluen liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa Cd pean 21 egunez mantendu eta gero. (A) Parafinan inkluditutako materiala. Eskala-marra: 10 µm. (B) Erretxinan inkluditutako liseri-guruinaren ebaki semifina, toluidina urdinez kontrastatua. Gezi-buruek liseri-zelulen lisosometan dauden BSDak erakutsi dituzte, zelula basofilikoek (izarrak), ordea, ez dute BSDrik erakusten. Eskala-marra: 10 µm. (C) Erretxinan inkluditutako eta kontrastatutako ebaki ultrafina. Zelula basofilikoen zitoplasman (BC) ez da BSDrik ikusten, bai ordea, heterolisosometan (gezi-buruak). (N = nukleoa; HL = heterolisosoma; L = lumena). Eskala-marra: 1 µm. 86

90 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean garatutako softwarea erabiliz eskuratu ziren. Ondoren, eskuz eta softwarearen laguntzarekin liseri-zelulen lisosometako BSD eta zitoplasma bereizteko segmentazio-prozedura aplikatu zen. Neurketak muskuilu bakoitzean 5 eremutan burutu ziren, eta talde esperimental bakoitzean 10 muskuilu erabili ziren; tratamendu bakoitzeko guztira 50 neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.- ek (1981) proposatutako formulak erabiliz egin ziren. Hau da, BSD partikulen tamaina ebakiaren lodiera baino txikiagoa zela kontuan hartuz, Holmes efektua zuzentzeko faktorea aplikatu zen. Zelula basofilikoen analisi estereologikoak Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm) Masson- Goldner trikromikoz (Martoja & Martoja-Pierson, 1970) tindatu ziren, zelula basofilikoak argiro bereiztu ahal izateko. Ondoren, zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa (Vv BAS ) estereologiaren bidez kalkulatu zen. Horretarako, Nikon Optiphot mikroskopioari erantsitako marrazketa-tutua erabili zen (bukaerako handipena = x670). Multipurpose test system M-168 Weibel gratikula erabiliz, zelula 2. Irudia: Muskuilu kontroletan (zutabe zuria) zein 80 µg Cd /l kontzentrazio pean mantendutako (zutabe grisa) muskuiluetan kalkulatutako BSDen eta zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazten dute. Goialdeko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazten dituzte (p<0.05). 3. Irudia: Zelula basofilikoen identifikazioa (asterisko zuriak) Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-albeoloetan.( A) Kontrola (B) 7 egunez 80 µgcd/l pean mantendutako muskuilua eta (C) 21 egunez 80µg/lCd pean mantendutako muskuilua. Eskala marra: 25 µm (A eta B); 10 µm (C). 87

91 Emaitzak eta eztabaida basofiliko eta liseri-zelulen gainean ezarritako puntuak zenbatu ziren, Vv BAS Delesse printzipioaren arabera kalkulatuz (Weibel, 1979). Neurketak elkarrengandik urruti (gutxienez 45 µm) zeuden 2 ebakietan egin ziren, ebaki bakoitzean sigi-saga eginez azarez aukeratutako 5 eremutan, hain zuzen. Guztira, talde bakoitzean 100 zenbaketa egin ziren. Estatistika Emaitzak estatistikoki aztertzeko SPSS/PC+ (SPSS Inc., Microsoft Co.) pakete estatistikoa erabili zen. Konfidantza-tarteak Student t testa erabiliz kalkulatu ziren, eta taldeen arteko desberdintasun estatistiko esangarriak p<0.05 mailan ezarri ziren (Sokal & Rohlf, 1979). Aldagai esperimentalen esangarritasuna bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz estimatu zen. 4. Irudia: Cd pean 21 egunez mantendutako muskuilu baten liseri-zelulen lisosometako autometalografiazko zilarrezko hauspeakin beltz baten EDS espektrua, EPMA egin eta gero. EMAITZAK Lehenengo esperimentua Analisi kimikoek muskuiluen liseri-guruinean Cd-a metatu zela erakutsi zuten. Muskuilu kontrolen Cd kontzentrazio-maila detekzio-atalasetik behera mantendu zen bitartean, Cd pean egondako muskuiluen kontzentrazio tisularra µg Cd/g ehun-pisu lehor mailara heldu zen. Mikroskopioan egindako behaketek erakutsi zutenez, Cd pean egondako muskuiluetan BSDen zelulabarneko banaketa ez zen uniformea izan. BSD espezifikoki liseri-zeluletako lisosometan lokalizatu ziren, zelula basofilikoak BSDrik gabe agertu ziren bitartean (1. Ird.). Emaitza horiek, 21 egunez Cd pean egondako muskuiluetan, erretxinan inkluditutako ebaki semifin zein ultrafinetan konfirmatu ziren. Bertan, BSD heterolisosometan eta, batez ere, lisosomen mintzari lotuta, eta inolaz ere zelula basofilikoetan lokalizatu ziren (1. Ird.). Horretaz gain, liserialbeoloen argirantz askatutako hondakinetan ere BSD behatu ziren maiz, hondakin horiek, seguruenik, jatorri lisosomikoa zutelarik. Bestalde, Vv BSD balioak Cd pean egondako muskuiluetan kontroletan baino esangarriki altuagoak suertatu ziren, batez ere 1. egunean. Gerora, 7. eta 21. egunen artean Vv BSD balioen beherakada behatu zen, oraindik ere, Cd-z tratatutako muskuiluen balioak kontrolenak baino esangarriki altuagoak izanik (2A Ird.). Halaber, Vv BAS balioei dagokienez, muskuilu kontroletan ez zen aldaketarik erregistratu esperimentuak iraun bitartean, Cd pean 88

92 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean egondakoetan, ordea, balioak nabarmenki igo ziren (2B eta 3. Ird.). Esperimentuko 1. egunean kontrol eta Cd-z trataturiko muskuiluen artean desberdintasun esangarririk behatu ez bazen ere, 7. eta 21. egunetan gorakada esangarria aurkitu genuen Cd pean egondako muskuiluen kasuan. Autometalografiatutako ebaki ultrafinen gainean egindako X izpien mikroanalisiak, BSDetan Cd-a eta S-a, Ag-arekin batera zeudela erakutsi zuen (4. Ird.). Halaber, emaitz horiek X izpien mapaketaren bidez konfirmatu ziren (5. Ird.). Aitzitik, X izpien mapaketaren emaitzek ziotenez, Cd-a eta S-a liserizelulen nukleo zein zitosolean ere lokalizatu ziren, seinalea heterolisosometan baino ahulagoa izan arren, eta bertan Ag-aren seinalerik ez zegoen arren (5. Ird.) Bigarren esperimentua Vv BSD delakoaren emaitzek, 10 µg Cd/l pean mantendutako muskuiluen liseri-lisosometan metalen presentzia esperimentuko lehenengo egunetik kontrolenetakoetan baino nabarmen altuagoa zela erakutsi zuten, joera hori esperimentuan zehar mantendu zelarik (6A Ird.). Vv BAS balioei dagokienez, esperimentu osoan zehar ez zen desberdintasun esangarririk behatu Cd pean egondako muskuilu eta muskuilu kontrolen artean (6B Ird.). Hirugarren esperimentua Cd/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cu zein Zn pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu batez Cd-z trataturiko muskuiluen indize hori 5. Irudia: Cd pean mantendutako muskuiluetan AMG aplikatu ondoren, kadmio (Cd), zilar (Ag) eta sufrerako (S) X izpien distribuzio-mapak. Lau mikrografiak eremu mikroskopiko berean hartuak daude. Gezi-buruek zitosolaren hauspeakinak markatzen dituzte liseri-zelula baten heterolisosomen (HL) barnean. 89

93 Emaitzak eta eztabaida kontrolen berdina izan arren, 1 eta 7 egun ondoren kontrolarena baino esangarriki altuagoa suertatu zen. Arazketa-aldiak, bere aldetik, ez zuen Cd/maskor-pisua indizearen inolako beherakadarik ekarri; haatik, balioak 7 eguneko tratamendu ostean lortutakoak baino are altuagoak suertatu ziren (1. Taula). Cu/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cd zein Zn pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu batez Cu-z trataturiko muskuiluen indize hori kontrolen berdina izan arren, 1 eta 7 egun ondoren 6. Irudia: Muskuilu kontrol (zutabe zuria) zein 10 µgcd/l pean mantendutako (zutabe grisa) muskuiluak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseriguruineko zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dute. Goialdeko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dute (p<0.05). kontrolarena baino esangarriki altuagoa suertatu zen. Cu pean egondako muskuiluen hilkortasuna handia gertatu zenez, 21. egunean ez genuen izan analisi kimikoak egiteko behar bezain beste laginik, eta, beraz, ezin dugu arazketa-aldiaren Cu/maskorpisua indizearekiko eraginari buruzko daturik eman (1. Taula). Zn/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cd zein Cu pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu batez Zn-az trataturiko muskuiluen indize hori kontrolen berdina izan arren, 1 eta 7 egun ondoren kontrolarena baino esangarriki altuagoa suertatu zen, aurreneko bi kasuen legez. Arazketa-aldiak, bere aldetik, ez zuen Zn/maskor-pisua indizearen inolako beherakadarik ekarri; haatik, balioak 7 eguneko tratamendu ostean lortutakoak baino are altuagoak suertatu ziren (1. Taula). Autometalografiaz errebelatutako BSD, aurreneko esperimentuen emaitzekin bat, hiru metal pean mantendutako muskuiluetan liserizelulen lisosometan lokalizatu ziren, batez ere. BSDen kuantifikazioa burutu ondoren, Cd, Cu eta Zn pean egondako muskuiluetan lortutako Vv BSD balioak kontroletan baino altuagoak izan ziren jadanik lehenengo ordutik, eta tendentzia hori 7 egunez mantendu zen (7A Ird.). Cd eta Cu pean egondako muskuiluen Vv BSD balio altuenak 7. egunean erregistratu ziren; Zn-aren kasuan, ordea, baliorik altuena 1. egunean gertatu zen. Izan ere, balio altu hori esperimentu osoan zehar erregistratutako baliorik altuena izan zen (7A Ird.). Arazketa-aldiaren ostean Vv BSD balioak 90

94 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean 1. Taula: AAS bidez neurtutako liseri-guruineko Cd, Cu eta Zn/maskor-pisua indizea, metal pean ordu batez eta 1, 7 eta 21 egunez mantendutako muskuiluetan eta muskuilu kontroletan. Asteriskoek kontrolekiko desberdintasun esangarriak adierazten dituzte p<0.05 mailan. ### muskuiluak hil zirenez ez zen gelditu animalia nahikorik arazketa esperimenturako. Lagina Cd indizea Cu indizea Zn indizea Kontrola Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia Cd-esposizioa Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia * * * Cu-esposizioa Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia ### * * ### ### Zn-esposizioa Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia * * * esangarriki jaitsi ziren hiru metalen kasuan, berriro ere kontrolen mailara helduz (7A Ird.). Liseri-epitelioan zelula basofilikoen proportzio erlatiboa kuantifikatzeko erabilitako Vv BAS balioak ez ziren esperimentuan zehar aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cd eta Cu pean mantendutako muskuiluetan ere (7B Ird.). Bestalde, 7 egunez Znaz trataturiko muskuiluen liseri-epitelioan Vv BAS balioetan gorakada esangarria behatu zen, gerora, arazketa-aldiaren ostean kontrolen mailara jaitsi zena (7B Ird.). Laugarren esperimentua Analisi kimikoek, kadmioa BaP-z nahastuta egon arren (Cd + BaP taldea), liseri-guruinean Cda metatu zela erakutsi zuten. Muskuilu kontroletan (DMSO-z tratatutakoak) Cd-aren kontzentrazio balioak detekzio-atalasetik behera agertu ziren bitartean, Cd + BaP pean mantendutakoen liseriguruinean µg Cd/g ehun-pisu lehor aurkitu ziren. Aurreneko esperimentuetan bezala, BSD espezifikoki liseri-zeluletako lisosometan lokalizatu ziren bitartean, zelula basofilikoetan ez zen seinale esangarririk detektatu. Esperimentuko 1. egunetik 21. egunera, BaP eta Cd + BaP tratamenduetako muskuiluetan neurtutako Vv BSD balioak DMSO kontroletan neurtutakoak baino esangarriki altuagoak izan ziren, bereziki 1. egunean, gorakada hori batik bat Cd + BaP tratamenduan nabarmena gertatu zelarik (8A Ird.). Vv BAS balioei dagokienez, DMSO-z trataturiko muskuilu kontroletan saiakuntza-denboran zehar nolabaiteko igoera behatu zen. Hala ere, Vv BAS 91

95 Emaitzak eta eztabaida balioen emendioa askoz nabarmenagoa izan zen BaP eta Cd + BaP tratamenduetako muskuiluetan (8B Ird.). Bosgarren esperimentua Esperimentuko 1. egunetik, Vv BSD balioak 80 µg Cd/l kontzentrazio pean egondako muskuiluetan kontroletan baino nabarmenki altuagoa izan ziren. 10 µg Cd/l kontzentrazio pean egondako muskuiluetan, berriz, astebete behar izan zen Vv BSD balioak kontrolenetatik esangarriki desberdinak izatera iristeko. Hala ere, Cd kontzentrazio handiaz lau astez trataturiko muskuiluetan, Vv BSD balioen behin behineko jaitsiera puntuala suertatu zen, 6 aste ostean berriro ere Vv BSD balio altuak neurtu zirelarik (9A Ird.). Vv BAS balioei dagokienez, muskuilu kontrolek balio baxuak erakutsi zituzten esperimentuak iraun bitartean. Bestalde, Cd kontzentrazioaren menpekoa ez zen igoera esangarria behatu zen Cd pean mantendutako muskuiluen Vv BAS balioetan, 1. astetik aurrera behintzat (9B Ird.). EZTABAIDA Kadmioak CTR eragin dezake Kutsatzaileek zein bestelako estres-iturriek muskuiluen liseri-guruinean aldaketak sortarazten dituztela ezaguna da; euren artean CTR izenekoa (Thompson et al., 1974; Rasmussen et al., 1983; Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b; Syasina et al., 1997; Marigómez et al., 1998). Ikerlan honetan, Cd-ak muskuiluen liseri-guruinean CTR prozesua bultza dezakeela baieztatu dugu. 7. Irudia: Muskuilu kontroletan zein 10 µg/l Cd, Cu eta Zn pean jarritakoetan kalkulatutako parametro estereologikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dute. Goialdeko matrizetako asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte (p<0.05). 92

96 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Laborategiko kontrol esperimentaletan Vv BAS balioak µm 3 /µm 3 tartekoak diren bitartean, Cd pean egondakoetan µm 3 /µm 3 -koak izatera irits daitezke. Hala ere, eraginkortasun horren atalase kritikoa, desberdina da, muskuiluen jatorri eta baldintza esperimentalen arabera. Esaterako, Plentziako muskuiluetan, 80 µg Cd/l kontzentrazio pean 7 egunez egotea Vv BAS -aren emendio esangarria sortzeko beharrezkoa den bitartean, aldez aurretik zelaian Zn-az kutsatutako Meñakozeko energetiko gehigarriari erantzuteko beharrezkoak diren entzimen jariapen areagotuarekin erlaziona litekeela iradoki zuten. Azkenik, zelula basofilikoen emendioa itxurazkoa baino ez dela, eta kutsatzaile pean egoteak liseri-zelulen galera ekarri izanaren ondorioz zelula basofilikoak nagusitzen direla ere proposatu egin da (Marigómez et al., 1990b). Izatez, hiru alternatiba horien artean Vv BAS -en emendioa zeinek azal dezaken argitzea tesi honen helburuetako bat da, geroko kapituluetan jorratuko den bezala. muskuiluetan laborategian 10 µg Cd/l kontzentrazio pean 7 egunez egotea nahikoa da Vv BAS emendatzeko. Aitzitik, 10 µg Cd/l kontzentrazio pean 7 egunez egoteak Vv BAS balioaren igoerarik ez zien ekarri Plentziako muskuiluei. Zelula-moten ordezkapen honen arrazoia momentuz ezagutzen ez bada ere, autore batzuen arabera, kutsaduraren aurkako babes-mekanismoa izango litzateke. Alde batetik, zelula basofilikoen emendioa, detoxifikazio-prozesuak eragindako liseri-zelulen andeakuntzari aurre egiteko erantzuna izango litzatekeela proposatu da, zelula basofilikoak liseri-epitelioaren berriztapenaz arduradunak direla suposatuz (Mix & Sparks, 1971; Thompson et al., 1974). Bestalde, kutsatzaile organikoen kasuan batik bat, zelula basofilikoek aktiboki detoxifikazioan parte hartzen dutenez, euren presentzia areagotzea, detoxifikazioprozesuaren ondorioa izan liteke (Widdows, 1984; Cajaraville et al., 1990a; Triebskorn & Künast, 1990). Halaber, Widdows et al.-ek (1984), kutsatzaileen aurrean zelula basofilikoen kopuruaren gorakada, arazketa-aldiko eskakizun Metalen metaketa zelula-espezifikoa CTR eragiteak, liseri-epitelioko metaketagaitasunean aldaketa garrantzitsuak sor ditzake. Izan ere, zelula-mota desberdinek, kutsatzaileak metatzeko gaitasun ezberdina eduki dezakete (Marigómez et al., 2002). Moluskuetan, BSD liserizelulen lisosometan agertu dira batez ere, eta beraz, zelula basofilikoen proportzio erlatiboaren igoerak, metalak metatzeko konpartimentua murrizten duenez, metatzeko gaitasuna txikitzea ekar lezake (Marigómez et al., 1998). Ikerlan honetan, ere Cd pean egondako muskuiluetan, BSD espezifikoki liseri-zeluletako lisosometan agertu dira, argi-mikroskopian oinarritutako beste moluskuen espezietan zenbait ikerketek diotenarekin bat datorrena (Hemelraad & Herwig, 1988; Holwerda, 1991; Giamberini et al., 1996; Marigómez et al., 1996; 2002; Soto et al., 1996a, 1996b, Soto & Marigómez, 1997b). Lisosomen barruan metalak bahitzeak, metal horien toxizitatea jaisten lagunduko luke, behin-behinekoz behintzat. Gerora, metaletan joriak diren lisosomak 93

97 Emaitzak eta eztabaida liseri-dibertikuluen argira askatu eta ondoren gorotzekin batera kanporatuko lirateke (Ireland & Marigómez, 1992; Viarengo & Nott, 1993; Cajaraville et al., 1995; Langston et al., 1998; Marigómez et al., 2002). Hala ere, argi-mikroskopioaren bidez lortutako emaitz horiek ez dira maiz mikroskopia elektronikoaren bidez baieztatu, dakigunez. Izatez, AMGren aplikazioak maila ultrastrukturalean urriak dira (Domouhtsidou & Dimitriadis, 2000; Dimitriadis & Papadaki, 2004). 8. Irudia: DMSO-kontrol taldeko (zutabe zuria) zein BaP (zutabe gris argia) eta Cd+BaP (zutabe gris iluna) pean mantendutako muskuiluetan kalkulatutako parametro estereologikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dute. Goialdeko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte (p<0.05). Ikerlan honetan, mikroskopio elektronikoan burututako AMGk, BSD espezifikoki liseri-zelulen lisosometan lokalizatzen direla egiaztatu du. Zehazki, BSD heterolisosometan, batez ere mintzari lotuta, eta inolaz ere zelula basofilikoetan lokalizatu dira. Emaitza horiekin ados, X izpien mikroanalisia aplikatuz, Littorina littorea magurioaren liseri-zeluletako lisosomek Cd-a metatzeko konpartimentu nagusia osatzen dutela frogatu zuten Marigómez et al.-ek (1991). Merkurio dosi oso altuz tratatutako muskuiluetan, ordea, liseri-zeluletako lisosometan egoteaz gain zelula basofilikoetan ere aurkitu dira BSD (Domouhtsidou & Dimitriadis, 2000). Beraz, banaketa intrazelularra dosiaren menpekoa (metalaren izaeraren menpekoa den bezala) izatea ezin da baztertu. Izatez, Recio et al.-ek (1988), Zn pean egondako bareetan, metala liseri- zein kaltzio- eta iraiztezeluletan esposizio-denbora eta dosiaren arabera ager daitekeela erakutsi zuten, metodo histokimiko konbentzionalak erabiliz, ditizona tindaketa, alegia. Bestalde, AMGk ez du zuzenean Cd-aren presentzia adierazi behar, teknika hau metalespezifikoa ez delako; eta gainera, BSDen eraketa metal-ioien Ag-arekiko duten irisgarritasunaren menpean dagoelako (Danscher, 1981). Alde batetik, Cd-rik gabeko tokitan BSDak eratzea posiblea da. Esaterako, Cd eta beste metal astunen pean egoteak, ehunetako metal esentzialen (Fe-a, Cu-a adibidez) berbanaketa sortarazi lezake (Mason & Simkiss, 1983; Mason et al., 1984; Mason & Jenkins, 1995), eta kasu horretan BSDek lekuzaldatutako metal horien agerpena eta ez Cdaren presentzia erakutsiko lukete. 94

98 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Arazo horri erantzuna emateko asmoz, AMGrekin batera metal-espezifikoak diren X izpien mikroanalisia eta X izpien mapaketa izeneko teknikak (Morgan et al., 1997) aplikatu egin dira ikerlan honetan. X izpien mikroanalisiek erakutsi dutenez, Cd eta S-a kolokalizatuta agertu dira BSDetako Ag-arekin batera, X izpien mapaketaren bidez konfirmatu dena. Horrela, Ag-a Cd-aren inguruan, BSDak eratuz, nukleatu dela ikusi dugu. Bertan S ere egoteak seguruenik Cd-metalotioneina (Cd-MT) konplexuen presentziaren frogatzat har liteke, aldez aurretik proposatu den bezala (Soto et al. 1996a). MT-k metalen presentzian induzigarri eta S-tan aberatsak diren proteinak dira, aminoazido guztien %33-a zisteinak direlarik (Pavicic et al., 1991; Isani et al., 2000; Roesijadi, 1994; 2000). MT nukleoan, zein zitosolean eta lisosometan ager daitezke (Langston et al., 1998). Cd-z trataruriko magurioetan, AMGk liseriepitelioan metatutako Cd-aren frakzio bat soilik erakutsi dezakeela proposatu da (Soto et al., 1996b). Gure ikerlanak hipotesi hori sustatu du. Izan ere, X izpien mapaketen emaitzen arabera, Cd-a eta S-a liseri-zelulen lisosometatik kanpo, zitosolean zein nukleoan, kolokalizaturik leudeke, bertan BSDrik ez badago ere. Emaitz horiek Cd-MT konplexuen presentziarekin erlaziona daitezke. AMGk, lisosometako entzimek Cd-MT konplexua liseritu ondoren soilik Cd-a detektatuko lukeen bitartean, ezingo luke zitosoleko Cd-MT konplexuetan estuki loturik dagoen Cd-a errebelatu, Cd ioiak Ag-arekiko behar bezain eskuragarriak ez direlako. Ondorioz, Cd pean egondako muskuiluen liserizeluletan AMG bitartez Cd-a lokalizatu dugula esan genezake, Cd-aren frakzio osoaren zati bat baino ez bada ere, lisosometan Cd-MT konplexu liserituetakoa hain zuzen. Beraz, AMG bitartez errebelatutako Cd-aren frakzioa liseri-zeluletako lisosometan lokalizatu da espezifikoki. Horrek ez du esan nahi Cd-aren beste frakziorik ez dagoenik liseri-zelulen beste konpartimentuetan edo, zelula basofilikoetan ere; baina, behintzat, frakzio horiek ezin dira AMG bitartez lokalizatu. 9. Irudia: Muskuilu kontroletan (puntu zuriak) eta Cd dosi bien pean (lerro grisa = 10 µg/l eta lerro beltza = 80 µg/l) mantendutako muskuiluetan kalkulatutako parametro estereologikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dute. 95

99 Emaitzak eta eztabaida CTRk BSDen kuantifikazioaren gain duen eragina AMG bitartez errebelatutako lisosomen barneko BSDak, irudi-analisiaren bitartez kuantifika daitezke, horrela estimatutako Vv BSD parametroak ingurumeneko metal bioeskuragarrien mailak adierazi litzakeelarik (Soto & Marigómez, 1997b). BSD espezifikoki liseri-zeluletan eratzen direla aintzat hartuz gero, metal kutsatzaileek beraiek eragindako CTR moduko efektuek AMG bitartez estimatutako metalen ingurumen-mailen gainean eragina izan dezakete. Izan ere, Soto & Marigómezek (1997b), arazo horretaz jabetuta, Vv BAS eta Vv BSD batera aintzat hartzen zituen protokolo bat 1. egunean Zn kontzentrazio tisularra eta Vv BSD altuak izan ziren bitartean, 7. egunean jaitsi egin ziren, Vv BAS gorakadarekin batera. Gainera, muskuiluak CTR induzitzen ez duten Cd eta Cu kontzentrazio baxuez tratatzerakoan Vv BSD balioen dinamikan ez da erregistratu aldaketarik esperimentuan zehar (2. eta 3. esperimentuak). Izan ere, 10 µg Cd/l kontzentrazioz trataturiko bigarren esperimentuko muskuiluetan, Vv BSD esangarriki igo zen bitartean, Vv BAS ez zen aldatu. Bestalde, Cd pean egon ostean 14 eguneko arazketa-aldiak, Cd kontzentrazio tisularraren igoera sortarazi zuen liseri-guruinean, aldi berean proposatu zuten metalen esposizio-mailak Vv BSD jaitsi zen arren. Itxuraz zentzu gutxiko muskuiluen liseri-guruinean AMG aplikatuz estimatzeko. Ikerlan honetan, balizko eragin hori laborategiko esperimentuetan oinarrituta aztertu dugu. Horrela, Cd pean mantendutako muskuiluen kasuan, Vv BAS nabarmenki igotzerakoan, Vv BSD balioek beherantz egin edo, behintzat, ez zuten tratamenduaren ondorioz gorantzago egin. Esaterako, muskuiluak 80 µg/l-ko Cd kontzentrazioaz tratatzean Vv BSD balio altuenak 1. egunean lortu ziren (1. esperimentua), eta denbora aurrera joan ahala Vv BSD balioak mantendu edo jaitsi egin ziren, Vv BAS balioen gorakadarekin batera. Halaber, BaP eta Cd + BaP tratamenduen ondorioz erantzun berbera ikusi dugu (4. esperimentua), eta baita 10 µg/l-ko Zn kontzentrazio pean 1 eta 7 egunez mantendutako muskuiluen kasuan ere. Zn-aren kasuan, ordea, aldaketa horiek, liseri-epitelioaren zein ondoko ehunen osaketa zelularraren aldaketekin erlaziona litezke. Alde batetik, liseri-epitelioaz gain inguruko ehun konektiboan eta hemozitoetan ere meta daiteke kadmioa (Soto et al., 1996a), eta Vv BSD balioek liseri-lisosometan dauden BSDei soilik dagozkie. Izan ere, Vv BSD balioak kalkulatzeko, beste zeluletan dauden BSD zein AMGk errebelatu ez dituen metalak ez dira kontuan hartu, AAS aplikatzean, berriz, metal frakzio guztiak batera barneratzen dira. Gainera, liseri-lisosometan metatutako Cd-a liseri-dibertikuluen argira kanporatzen da, ondoren gorotzekin batera eliminatua izateko (Marigómez et al., 2002). Hondakin horiek BSDetan joriak dira, eta irudianalisi bitartez ez dira kuantifikatu; analisi kimikoetan, ordea, hondakin horiek daramaten metala ere neurtu den bitartean. CTR esperimentuko 7. egunean ageri zen. Bertan, 96

100 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Ondorioz, metal-esposizioaren adierazleak diren analisi kimiko zein AMG bidez lortutako parametroen gain eragin esanguratsua du CTRk, laborategiko esperimentuko metal pean egondako muskuiluen kasuan behintzat, aldez aurretik zelaiikerketan oinarrituz proposatu zenarekin bat datorrena (Soto & Marigómez, 1997b). CTR eragin lezaketen kutsatzaileen maila kritikoak Vv BSD zein beste biomarkatzaileen gainean izan dezaken eragina kontuan hartuz, molusku espezie desberdinetan CTR fenomenoa gerta dadin beharrezkoak diren kutsatzaile desberdinen kontzentrazio kritikoak ezagutzea komeni da. Ikerlan honetan, 80 µg Cd/l, 10 µg Zn/l, 500 µg DMSO/l eta 500 µg BaP/l-ko dosiek CTR eragin dezaketela ondorioztatu dugu, beti ere denboratarte desberdinetan kutsatzailearen arabera. Halaber, 0.25 mg N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidinaz 15 egunez zein fuel olioaren %6 WAFez 35 egunez tratatutako muskuiluetan eta 1.25 mg Cd/l-z 17 egunez tratatutako magurioetan CTR fenomenoa ere gertatu da (Rasmussen et al., 1983; Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b). Behe-atalasearen bila, 3. esperimentuan muskuiluak Cd, Cu eta Zn dosi baxuz tratatu ziren. Bigarren esperimentua egin ondoren, 10 µg Cd/l-ko kontzentrazioak 7 egunetan CTRrik eragin ez zuena bagenekienez, kontzentrazio esperimental hori aukeratu zen 3. esperimenturako. Bertan, 2. esperimentuaren emaitzak konfirmatu ziren, eta baita ere 10 µg Cu/l-ko kontzentrazioak ez zuela CTRrik induzitzen. Zn-aren kasuan, ordea, 10 µg/lko dosiak CTR jadanik 7. egunean eragin dezake. Dosiaren menpeko erantzunak ere Cd pean egondako magurioetan behatu dira. Bertan, 20 egunez 1.25 mg Cd/l kontzentrazioak liseri-epitelioa nagusiki zelula basofilikoz osatuta egotea sortarazi zuen bitartean, 500 µg Cd/l-ko kontzentrazioa ez zen horren eraginkorra suertatu (Marigómez et al., 1990b). Hain Cd kontzentrazio handiak magurioen liseri-guruinean CTRrik ez eragiteak, espezien arteko sentikortasuna oso desberdina izan daitekeela utzi du agerian. CTRren itzulgarritasuna CTR fenomenoaren izaera eta beren biomarkatzaileen gaineko eragina behar bezala ulertzeko, prozesua itzulgarria denentz finkatzea ezinbestekoa iruditu zitzaigun. Arazketa-prozesuari dagokionez, Zn pean mantendutako muskuiluetan, CTR prozesua itzulgarria zela egiaztatu zen, behin estres-iturria desagertutakoan, liseri-epitelioaren zelulen proportzioa berriro ere bere hasierako balioetara itzuli baitzen. CTR fenomenoaren itzulgarritasuna ez da soilik muskuiluen kasuan ikusi; magurio eta bareen kasuetan ere estres-egoera jasan eta gero, zenbait egunez arazten utzitakoan, liseri-epitelioko zelulen proportzioa berriro ere hasierako egoerara itzul daitekeela frogatu da (4. eta 5. Kapituluak). CTRaren gainean eragina izan dezaketen faktoreak CTR fenomenoa noiz eta nola ematen den hobeto ulertzeko, bere gainean ingurumen-faktore 97

101 Emaitzak eta eztabaida desberdinek nolako eragina duten ezagutzea beharrezkoa zaigu. Faktore hauen artean, muskuiluen adina, itsasaldi-erregimena, urteko sasoia, kutsatzaileen arteko elkarrekintza eta aldez aurretik kutsatzaile pean egon izana ditugu, besteak beste. Urteko sasoiari dagokionez, udan Vv BAS neguan baino altuagoa da. Sasoiari lotutako aldaketa hori ziklo gonadalarekin erlazionatu da aldetik CTR eragin, bien nahasketak ez du erantzun gehigarririk ekarri. CTR fenomenoaren gainean eragina izan dezakeen beste faktoreetako bat, aldez aurretik estres-egoera batean egotea izan daiteke. Bosgarren esperimentuan, Zn-ez kutsatuta zegoen Meñakoz izeneko lekutik (Soto et al., 1995) hartu ziren muskuiluak. 7 egunez laborategian ur garbitan egon ondoren Plentziako muskuilu kontrolen (Méndez, 1993). Vv BSD eta Vv BAS balio antzekoak erakutsi Kutsatzaileen arteko elkarrekintza ikertzeko asmoz, laugarren esperimentuan Cd-arekin batera muskuiluak BaP kutsatzaile organikoaren pean jarri ziren. Analisi kimikoek diotenez, kutsatzaileen nahasketa horrek ez zuen eraginik izan liseriguruinak Cd-a metatzeko duen gaitasunean. Emaitza hori, beste ikerlan batzuekin bat dator. Izan ere, Cd eta alkilbentzeno sulfonatua kutsatzaile organikoaren artean ez da ere ez lehiaketamekanismorik aurkitu (Da Ros et al., 1995). Hala ere, BSDen emaitzek, BaP-k metalen mobilizazioa eragin dezakela erakutsi digute. Hau da, BaP taldeko muskuiluetan Vv BSD balioak esangarriki igo dira esperimentuko lehenengo egunetik. Beharbada, BaP-aren eraginez, metal esentzialak liseri-zelulen lisosometara mobilizatuak gerta litezke. Laugarren esperimentu honetan, Cd + BaP nahasketak CTR eragiten du, baita BaPk eta DMSOk (nahiz eta maila baxuagoan) ere. Cd + BaP nahasketak emandako Vv BAS balioak, Cd pean mantendutako muskuiluen antzekoak izan dira, beraz nahiz eta Cd-a eta BaP-a norberak bere zituzten. Izan ere, 3. esperimentuan CTR gutxienez 14 egunetan itzulgarria dela ikusi denez, 7 egunetan Vv BAS balioak berreskuratzea ez zaigu harrigarria gertatu. Gainera, kontrol gisa erabilitako muskuiluetan, balioak beste esperimentuen kontrolen maila baxuan mantendu ziren 5. esperimentuak iraun bitartean. Cd pean jarritako muskuiluetan, ordea, aurreneko esperimentuetan ez bezala, 10 µg Cd/l-ko kontzentrazioak CTR induzitu zuen. Muskuilu hauetan, aldez aurretik estres-egoera batean egon izanak, beraien liseriguruineko Vv BAS Plentziako muskuiluetan baino errezago goratzea eragin zezakeen. Bestalde, bi Cd kontzentrazioen desberdinen pean mantendutako muskuiluetan Vv BSD balioen jeitsiera behatu zen, Vv BAS balioen aldaketekin sinkronian agertu ez ba ziren ere. Gainera, Vv BSD balioak Plentziako muskuiluetan (2. esperimentuko datuak) baino denbora gehiago behar izan zuten modu esangarrian igotzeko. Beraz, aldez-aurretik estres-egoera batean egon izanak, dirudienez, CTR erantzunaren nondik norakoak, zein metalen detoxifikazio-mekanismoak eta -dinamika afekta ditzake. 98

102 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Ondorioak Ikerlan honetan lortutako emaitzek dioskutenez, muskuiluen liseri-guruinean CTR eragiteko gai da kadmioa. Bestalde, Cd-a ehunetan detektatzeko erabili den AMG bitartez errebelatutako BSDak, liseri-zelulen lisosometan espezifikoki lokalizatu dira. Hori dela eta, CTRk Vv BSD balioen gainean eragina dauka, metala metatzeko konpartimentuaren txikitzearen ondorioz. Bestalde, CTR gertatzeko beharrezkoa den kutsatzaile desberdinen kontzentrazio-atalaseak zehaztu dira, kutsatzaile eta espeziearen arabera desberdinak izanik. Halaber, estres-iturria etetean CTR itzulgarria izan daitekeela atzeman dugula azpimarratzekoa da. Azkenik, CTR prozesuaren gainean zenbait faktorek eragina eduki dezaketela ikusi dugu; kutsatzaileak nahasketetan agertzea eta muskuiluak aldez aurretik estres-egoeran egon izana, besteak beste. BIBLIOGRAFIA Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E (1990a) Responses of basophilic cells of the digestive gland of mussels to petroleum hydrocarbon exposure. Dis. Aquat. Org. 9: Cajaraville MP, Marigómez I, Angulo E (1990b) Short-term toxic effects of 1-naphthol on the digestive gland-gonad complex of the marine prosobranch Littorina littorea (L.): a light microscopic study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 19:17-24 Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez I (1995) Cellular biomarkers as useful tools in the biological monitoring of pollution: molluscan digestive lysosomes. :29-55 orr. Non: Cell Biology in Environmental Toxicology. Cajaraville MP (ed.). University of the Basque Country Press Service. Bilbo. Cajaraville MP, Bebianno MJ, Blasco J, Porte C, Sarasquete C, Viarengo A (2000) The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environments of the Iberian Peninsula: a practical approach. Sci. Total Environ. 247: Danscher G (1981) Histochemical demonstration of heavy metals. A revised version of the sulphide silver method suitable for both light and electronmicroscopy. Histochemistry 71:1-16. Danscher G (1984) Autometallography. A new technique for light and electron microscopic visualization of metals in biological tissues (gold, silver, metal sulphides and metal selenides). Histochemistry 81: Da Ros L., Nasci C, Campesan G, Sartorello P, Stocco G, Menetto A (1995) Effects of linear alkylbenzene sulphonate (LAS) and cadmium in the digestive gland of mussel, Mytilus sp. Mar. Environ. Res. 39: Da Ros L, Nasci C, Marigómez I, Soto M (2000) Biomarkers and trace metals in digestive gland of indigenous and transplanted mussels, Mytilus galloprovincialis, in Venice lagoon, Italy. Mar. Environ. Res. 50: Dimitriadis VK, Domouhtsidou GP, Cajaraville MP (2004) Cytochemical and histochemical aspects of the digestive gland cells of the mussel Mytilus galloprovincialis (L.) in relation to function. J. Mol. Histol. 35: Dimitriadis VK, Papadaki M (2004) Field application of autometallography and X-ray microanalysis using the digestive gland of the common mussel. Ecotoxicol. Environ. Saf. 59: Domouhtsidou GP, Dimitriadis VK (2000) Ultrastructural localization of heavy metals (Hg, Ag, Pb, and Cu) in gills and digestive gland of mussels, Mytilus galloprovincialis (L.). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 38: Giamberini L, Auffret M, Pihan JC (1996) Hemocytes of the freshwater mussel, Dreissena polymorpha Pallas: cytology, cytochemistry and X-ray microanalysis. J. Moll. Stud. 62: Hemelraad J, Herwig HJ (1988) Cadmium kinetics in freshwater clams. IV. Histochemical localization of cadmium in Anodonta cygnea and Anodonta anatina exposed to cadmium chloride. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 17: Herwig HJ, Brands F, Kruitwagen E, Zandee DI (1989) Bioaccumulation and histochemical localization of cadmium in Dreissena polymorpha exposed to cadmium chloride. Aquat. Toxicol. 15: Holwerda DA (1991) Cadmium kinetics in freshwater clams. V. Cadmium-copper interaction in metal accumulation by 99

103 Emaitzak eta eztabaida Anodonta cygnea and characterization of the metal-binding protein. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 21: Ireland MP, Marigómez I (1992). The influence of dietary calcium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mg & P and histological changes in the digestive gland cells of the snail Achatina Fulica Bodwich. J. Moll. Stud. 58: Isani G, Andreani G, Kindt M, Carpene E (2000) Metallothioneins (MTs) in marine molluscs. Cell Mol. Biol., 46: Langston WJ, Bebianno MJ, Burt GB (1998) Metal handling strategies in molluscs. orr: Non: Metal Metabolism in aquatic envionments. Langston WJ & Bebianno MJ (ed.).chapman & Hall. London. Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil on digestive cells in mussels: quantitative alterations in cellular and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 8: Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990a) Cellular distribution of cadmium in the common winkle Littorina littorea (L.) determined by X-ray microprobe analysis and histochemistry. Histochemistry 94: Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990b) Histopathology of the digestive gland-gonad complex of the marine prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. Aquat. Org. 9: Marigomez JA, Soto M, Angulo E (1991) Responses of winkles digestive cells and their lysosomal system to environmental salinity changes. Cell. Mol. Biol. 37: Marigómez I, Soto M, Kortabitarte M (1996) Tissue-level biomarkers of biological effect of mercury on sentinel slugs, Arion ater. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart GBJ (1997) Tissue-level biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to assess metal pollution in soils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 34: Marigómez I, Cajaraville, MP, Soto M, Lekube X (1998) Celltype replacement, a successful strategy of molluscs to adapt to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 20: Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Giamberini L (2002) Cellular and subcellular distribution of metals in molluscs. Microsc. Res. Tech. 56: Martoja R, Martoja-Pierson M (1970) Técnicas de Histología Animal. Toray Masson. Barcelona. 350 orr. Mason AZ, Jenkins KD (1995) Metal detoxification in aquatic organisms orr. Non: Metal speciation and bioavailability in aquatic systems Tessier A & Turner DR (ed.). John Wiley and Sons. New York. Mason AZ, Simkiss K (1983) Interactions between metals and their distribution in tissues of Littorina littorea (L) collected from clean and polluted sites. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 63: Mason AZ, Simkiss K, Ryan KP (1984) The ultrastructural localization of metals in specimens of Littorina littorea collected from clean and polluted sites. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 64: Méndez PA (1993) Composición celular y estructura tisular de la glándula digestiva de mejillones en un programa de seguimiento de la contaminación en el estuario de el Abra. Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 88 orr. Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestive tubule tissue of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing radiation. J. Invert. Pathol. 17: Morgan AJ, Winters C, Stürzebaum S (1997) X-ray microanalysis techniques orr. Non: Methods in molecular Medicine Biology. 117: Electron Microscopy Methods and Protocols Hajibagheri N (ed.). Humana Press Inc. Totowa New Jersey. Morgan JE, Morgan AJ (1998) The distribution and intracellular compartmentation of metals in the endogeic earthworm Aporrectodea caliginosa sampled from an unpolluted and a metal-contaminated site. Environ. Pollut. 99: Morton B (1983) Feeding and digestion in Bivalvia orr. Non: The Mollusca 5 Saleuddin ASM & Wilburg M (ed.). Academic Press. New York. Pavicic S, Balestreri E, Lenzi P, Raspor B, Branica MF(1991) Isolation and partial characterization of cadmium induced metallothionein-like proteins in Mytilus galloprovincialis. Mar. Chem. 36: Pearse AGE (1980) Histochemistry. Theoretical and applied. Vol 1. preparative and optical technology. 4. edizioa. Edinburgh: Churchill Livingstone orr. Porte C, Sole M, Borgi V, Martínez M, Chamorro J, Torreblanca A, Ortiz-Zarragoitia M, Orbea A, Soto M, Cajaraville MP (2001) Chemical, biochemical and cellular responses in digestive gland of mussels Mytilus galloprovincialis from the Spanish Mediterranean coast. Biomarkers 6: Rainbow PS, Dallinger R (1993) Metal uptake, regulation and excretion in freshwater invertebrates orr. Non: Ecotoxicology of metals in invertebrates Dallinger R & Rainbow PS (ed.). Lewis Publ. Boca Raton, Florida. 100

104 Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light and electron microscopic studies of the acute and chronic toxic effects of N-nitroso compounds on the marine mussel Mytilus edulis (L.). II. N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine. Aquat. Toxicol. 3: Recio A, Marigomez JA, Angulo E, Moya J (1988) Zinc treatment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Cellular distribution of zinc and calcium. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 41: Roesijadi G (1994) Metallothionein induction as a measure of response to metal exposure in aquatic animals. Environ. Health Persp. 102: Roesijadi G (2000) Metal transfer as a mechanism for metallothionein-mediated metal detoxification. Cell Mol. Biol. 46: Sokal RR, Rohlf FJ (1979). Biometría. Madrid: Blume. 832 orr. Soto M, Kortabitarte M, Marigómez I (1995) Bioavailable heavy metals in estuarine waters as assessed by metal/shellweight indices in sentinel mussels Mytilus galloprovincialis. Mar. Ecol. Prog. Ser. 125: Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Marigómez I (1996a) Autometallographic localization of protein-bound copper and zinc in the common winkle, Littorina littorea: a light microscopical study. Histochem. J. 28:1-13. Soto M, Cajaraville MP, Marigómez I (1996b) Tissue and cell distribution of copper, zinc and cadmium in the mussel Mytilus galloprovincialis determined by autometallography. Tiss. Cell 28: Soto M, Marigómez I (1997a) BSD extent, an index for metal pollution screening based on the metal content within digestive cell lysosomes of mussels as determined by autometallography. Ecotox. Environ. Saf. 37: Soto M, Marigómez I (1997b) Metal bioavailability assessment in "Mussel-Watch" programmes by automated image analysis of BSD in digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156: Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigómez I. (1998a) Autometallographed metal content in digestive cells of winkles: a cost-effective screening tool to monitor Cu and Zn pollution. Aquat. Toxicol. 40: Soto M, Quincoces I, Marigómez I (1998b) Autometallographical procedure for the localization of metal traces in molluscan tissues by light-microscopy. J. Histotechnol. 21: Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) Morphological alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 44: Taylor, MG (1995). Mechanisms of metal immobilization and transport in cells orr. Non: Cell Biology in Environmental Toxicology. Cajaraville MP (ed.).university of the Basque Country Press Service. Bilbo. Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starvation on structure and function in the digestive gland of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Ass. U. K. 54: Triebskorn R, Künast C (1990) Ultrastructural changes in the digestive system of Deroceras reticulatum (Mollusca: Gastropoda) induced by lethal and sublethal concentrations of the carbamate molluscicide cloethocarb. Malacologia 32: Viarengo A (1989) Heavy metals in marine invertebrates: mechanisms of regulation and toxicity at the cellular level. Rev. Aquat. Sci. 1: Viarengo A, Nott JA (1993) Mechanisms of heavy metal cation homeostasis in marine invertebrates. Comp. Biochem. Physiol. C 103: Viarengo A, Canesi L, Mazzucotelli A, Ponzano E (1993) Cu, Zn and Cd content in different tissues of the Antarctic scallop Adamussium colbecki, role of metallothionein in heavy metal homeostasis and detoxification. Mar. Ecol. Prog. Ser. 95: Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press. London 415 orr. Widdows J, Moore MN, Lowe DM Sublethal biological effects and short-term recovery of mussels (Mytilus edulis) and winkles (Littorina littorea) following chronic exposure to petroleum hydrocarbon. Non: Long term effects of oil on marine benthic communities in enclosures. Norwegian Institute for Water Research/NIVA Technical Report No

105 Emaitzak eta eztabaida 102

106 Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean eta urdailean Laburpena: Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-guruineko eta urdaileko epitelio-zelulen berriztapena bromodeoxiuridinaren (BrdU) immunohistokimika bitartez ikertu da. Muskuiluak 4 mg BrdU/l itsas-ur disoluzio pean etengabe mantendu ziren. Tratamenduari ekin eta 6 ordu ondoren, laginak 2 orduro hartu ziren 2 egunez. BrdU-markaketa argi-mikroskopioan zuzenean kontaketak eginez estimatu zen, balioak zelula BrdU-positiboen -tan emanez. BrdU erreakzio positiboa liseri-zelulen, zelula basofilikoen, eta konduktu zein urdaileko zelulen nukleoetan behatu zen, eta baita hemozitoetan ere. Liseridibertikuluetan, zelulen berriztapena eredu zirkamareala jarraituz sinkronizaturik agertu zen: BrdU markaketa, itsasbeheran igo eta itsasgoran jeisten zen. Liseri-zeluletan, irudi mitotikoa argiak behatu ziren. Lortutako emaitzek, zelula-mota desberdintzatuek proliferatzeari ekin diezaioketela egiaztatu ziguten, aldez aurretik egindako Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) immunohistokimikaren emaitzekin bat zetorrena. Urdailean ere epitelio-zelulen berriztapena sinkronizatuta zegoela atzeman genuen. Gako-hitzak: bromodeoxiuridina, berriztapen zelularra, mitosia, itsasaldia, fotoperiodoa, liseri-guruina, bibalbioak. 103

107 Emaitzak eta eztabaida Circatidal variation in epithelial cell proliferation in the mussel digestive gland and stomach Abstract: Epithelial cell renewal in mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk) digestive gland and stomach was investigated by bromodeoxyuridine (BrdU) immunohistochemistry. Mussels were exposed to 4 mg BrdU/l seawater continuously. Then, starting after 6 h treatment samples were collected every 2 h for 2 days and BrdU labelling was estimated by direct counting at the light microscope as BrdU positive cells. BrdU positive reaction was observed in the nuclei of digestive, basophilic, duct and stomach cells, as well as in hemocytes. Cell renewal in digestive diverticula is synchronised following a circatidal pattern: BrdU labelling increased during low tide and decreased during high tide. Clearcut mitotic figures were identified in digestive cells, which confirmed that mature cell types proliferate, in agreement with the results from immunohistochemistry for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemistry. Epithelial cell renewal in the stomach also appeared to be synchronised. Key Words: bromodeoxyuridine, cell renewal, mitosis, tide, photoperiod, digestive gland, bivalves. Variación circamareal en la proliferación de células epiteliales en glándula digestiva y estómago de mejillón Resumen Se investigó la renovación de células epiteliales en glándula digestiva y estómago del mejillón (Mytilus galloprovincialis, Lmk) mediante inmunohistoquímica de bromodeoxiuridina (BrdU). Se expusieron contínuamente mejillones a 4 mg BrdU/l agua de mar. Así,transcurridas 6 h de haberse iniciado el tratamiento se recogieron muestras cada dos h durante 2 días y se estimó el marcaje de BrdU mediante recuento directo al microscopio fotónico en términos de de células BrdU positivas. Se observó reacción BrdU positiva en los núcleos de las células digestivas, basófilas, de los conductos y del estómago, así como en hemocitos. La renovación celular en los divertículos digestivos estaba sincronizada de acuerdo con un patrón circamareal: el marcaje con BrdU aumentaba durante la marea baja y disminuía durante la marea alta. Se identificaron cortes limpios de figuras mitóticas en células digestivas, lo que confirmó que las células maduras son capaces de proliferar, de acuerdo con resultados anteriores de inmunohistoquímica de PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). También la renovación de células del epitelio del estómago parecía estar sincronizada. Palabras clave: bromodeoxiuridina, renovación celular, mitosis, marea, fotoperiodo, glándula digestiva, bivalvos. 104

108 Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean SARRERA Moluskuen liseri-guruin ehunaren oinarrizko zelulen berriztapenari dagokionez kasik ikerlanik ez dago, egitez. Muskuiluetan, liseri-guruina azkenean urdailean zabaltzen diren konduktu primarioei konduktu sekundarioen bitartez loturiko unitate albeolotubularren multzotan antolatuta dago. Unitate albeolotubular horien epitelioa bi zelula-mota helduz osaturik dago, liseri-zelulak eta zelula basofilikoak deitutakoak, hain zuzen (Morton, 1983). Liseri-zelulek elikagaien liseriketa intrazelularraren ardura dute, sistema endolisosomiko erabat garatua daukatelarik. Zelula basofilikoak, urriagoak, zelula jariatzaileak dira, basofiliaren ezaugarria ematen dien erretikulu endoplasmatiko pikortsu garatuaz hornituta daudelarik (Dimitriadis et al., 2004). Epitelioa arras dinamikoa da, eta elikagaien eskuragarritasunari zein bestelako ingurumen-faktoreei erantzunez, bi zelula-moten itxura, kopurua eta edukiak ordu gutxi batzuetan bortizki alda daitezke (Morton 1983). Izan ere, elikatze-ziklo bakoitzean, hots, ordu gutxi batzuen buruan, liseri-epitelioa guztiz berriztatzen dela proposatu da (Nelson & Morton 1979). Zelulen berriztapen bizkor hori gertatu ala ez, zelula basofilikoen proportzioa emendatzea dakarren epitelioaren berrantolaketa, ingurumen-estresaren iturri desberdinek bultzatzen dutena behin eta berriz egiaztatu da (Thompson et al. 1974; Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 1990; Marigómez et al. 1990; Syasina et al. 1997; Marigómez et al. 1998a; 1. Kapitulua). Zelulamoten ordezkapena (ingeleraz, Cell Type Replacement; CTR) izenaz ezagutzen den fenomeno hori, alde batetik, ingurumen-erasoa jaso eta ordu gutxietara jada nahiko aurreratua egon daiteke, eta, bestalde, zeharo itzulgarria da, estresa eten eta egun gutxietara jada zelula-moten proportzioa bere onera datorrelarik (Marigómez et al., 1998b). Hastapenetako ikerlanetan, CTR zelula basofilikoen proliferazioa areagotuak sor zezakeela kontsideratu zen (Thompson et al. 1974; Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 1990; Marigómez et al. 1990; 1998a). Haatik, zelula basofilikoen proliferazioaren ideia guztiz baztertu ezin bada ere, oraintsu eginiko esperimentuek CTRren gorakadak zelula basofilikoen proliferazioan baino gehiago liseri-zelulen galeran datzala iradoki dute (Marigómez et al., 1998b; Zaldibar et al., 2001). Bestalde, ingurumen-estresa sortarazten duten iturriak desagertzekotan liserizelulak proliferatzeko gai dira, laborategiko baldintza kontrolatu pean buruturiko sendabidetzeesperimentuetan erakutsi den moduan (Zaldibar et al., 2001; 4. & 5. Kapituluak). Zoritxarrez, liseriguruinean zalantzabako irudi mitotikoak bilatzeak ez du fruitu onik ekarri orain arte (Thompson et al. 1974; Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 1990; Marigómez et al. 1990; Syasina et al. 1997; Marigómez et al. 1998a; 1998b; Marigómez et al. 1999; Zaldibar et al. 2001). Izan ere, mitosiak nekez aurkitu dira bibalbioen liseri-guruinean. Ikerlan aurrendari batean, Yongek (1926) anafasean omen zegoen zelula baten marrazkia aurkeztu zuen. Autore horrek, zenbait zelula basofilikok zelula ama (sic., young cell) moduan joka dezaketela, eta, krustazeoen 105

109 Emaitzak eta eztabaida hepatoarean bezalaxe (Icely & Nott 1992; Vogt 1994), zelula gaztez osatutako kriptetatik (habietatik) zelulen berriztapena abia daitekeela iradoki zuen. Are gehiago, erradiazio ionizatzaile pean egondako ostretan liseri-guruineko epitelioa ea zeharo desagerrarazi ondoren, epitelio-zelulen birpopulatzea kripta-zelulen mitosien bidez eratutako zelula-habien eraiketaz hasten da (Mix & Sparks 1971). Hala ere, nahiz eta itxuraz basofilikoak izan, kripta-zelulak txikiak dira, eta ezin dira inolaz ere zelula basofiliko heldu (jariatzaile) gisa kontsideratu, nahiz eta geroagoko artikuluetan, bestelako argibide sustatzailerik gabe, zelula basofilikoak bibalbioen liseri-guruineko epitelioaren birsortzearen erantzuleak diren zelula gazteak direla proposatu den (Fankboner 1971; Palmer, 1979; Morton 1983). Aitzitik, Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) immunohistokimikak oraintsu erakutsi duenez (Marigómez et al., 1999), muskuiluetan bai liseri-zelulak eta baita zelula basofilikoak ere desberdintzatzeko, S-fasean sartzeko eta proliferatzeko gai dira, sagu helduaren listu-guruinetan zatiketa autologoa pairatzen duten zenbait zelula-mota helduek egiten duten bezalaxe (Denny et al., 1993). Halaber, Mya arenaria-ren liseri-tubuluetan ere, epitelio-zelula helduak PCNA - positiboak dira (Hanselmann et al., 2000). Ondorioz, zelula amek epitelioen berriztapenean parte hartuko lukete baina soilik epitelioan kalte masiboak ematekotan; bestela, baldintz normaletan, epitelio-zelulen berriztapena liserizelula eta zelula basofiliko helduen zatiketa autologoa dela medio burutuko litzateke. Ornodunen ehunetan, epitelio-zelulen berriztapendinamika eta prozesu horretan inplikatutako zelulamotek jasandako aldaketak, egoera fisiologiko eta patologikoen menpean daudela modu sinesgarrian erakutsi da (Karam & Leblond 1993; Santa Barbara et al., 2003). Muskuiluen liseri-guruineko epitelioaren berriztapena sinkronizatuta egonez mitosiak gauez burutuko balira, aurreneko ikerlanetan mitosirik aurkitu ez izana azalduko litzateke (Marigómez et al., 1998b; Zaldibar et al., 2001). Zelulen zatiketatasan aldamolde zirkadiarrak algetatik hasita ugaztunetaraino deskribatu izan dira (Makarov et al. 1995; Abrahamsen et al. 1998; Bjarnasson et al. 1999; García et al. 2001). Are gehiago, zenbait eredu esperimentaletan behintzat, zelulen proliferazioa eta ordezkatze-prozesuak batez ere gauez gertatzen direna jakin badakigu (Scheving et al., 1978; Abrahamsen et al., 1998; Bjarnasson et al., 1999; García et al., 2001). Muskuiluen liseri-guruineko zelulen proliferazioak patroi zirkadiarra jarraitzen duen antzemateko, zelula proliferatzaileen banaketa bromodeoxiuridina (BrdU) immunohistokimika aplikatuz ikertu da Mytilus galloprovincialis (Lmk.) muskuiluan. BrdU timidinaren analogoa da, eta ziklo zelularraren S-fasean zehar zelula proliferatzaileen DNAri eransten zaio. Muskuiluak, 4 mg BrdU/l-ko kontzentrazioa zuen itsas-uretan mantendu ziren 2 egunez. BrdUren agerpena immunohistokimika bitartez detektatu zen, eta zelula proliferatzaileen proportzio erlatiboa (BrdUmarkaketa) denbora-tarte desberdinetan erregistratu zen, BrdU-markaketan aldaketa zirkadiarrak identifikatu ahal izateko. 106

110 Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean MATERIAL ETA METODOAK Erreaktibo kimikoak Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkataletxekoak dira besterik agertu ezean. Laginak eta prozedura esperimentala Gutxi gorabehera mm-ko luzerako maskorra zuten mareazpiko M. galloprovincialis (Lmk) muskuiluak Plentzian (Bizkaiko Golkoa 43 24'I, 2 56'M) hartu ziren, uztailan eta goizerdiko itsasbeheran (10:12 a.m.). Laginketa mareazpiko muskuiluetara mugatu zen, itsasaldien zikloa eta fotoperiodoaren arteko elkarrekintza ekiditeko asmoz. Muskuiluak (n=80) laborategira garraiatu ziren eta 15 l-ko polietilenozko akuario batean mantendu ziren 15 C-tan eta etengabeko aireztapenaz. Itsas-ura argi ultramorea erabiliz esterilizatu zen, eta karbono aktiboz zein beirazko zuntzetan zehar iragazi egin zen; esperimentuak iraun bitartean itsas-ura ordezkatu ez zelarik. Muskuiluei, ornogabe itsastarrentzako jaki komertziala (Marine Invertebrate Diet, Carolina, Burlington, North Carolina, Amerikako Estatu Batuak) egunero eman zitzaien, goizeko 12:00-tan. Baldintza horietan, muskuiluak BrdU-tratamendu pean 2 egunez mantendu ziren. Hasieran, itsasuretan 4 mg BrdU/l-ko pultsua aplikatu zitzaien, eta gerora 2 mg/l-ko pultsuak 4 orduro aplikatu ziren, maila zitotoxikoetara heltzeke BrdUren eskuragarrita-suna etengabe ziurtatu ahal izateko. Horrela, saiakuntza-denboran zehar BrdUren galerarik gertatuko ez balitz ere, uretan metatutako gehiegizko BrdUren kontzentrazioa 20 mg/l baino baxuagoa izango litzateke. Ornogabe itsastarrekin egindako pultsu-esperimentuetan BrdUren kontzentrazioak 500 mg/l-ko bezain altuak erabili dituzte beste ikertzaileek (Candia Carnevali et al., 1997; Goergen et al., 2002). Hala ere, guk BrdU kontzentrazio askoz baxuagoa aplikatzea erabaki genuen honako arrazoi hauengatik: (1) muskuiluak laborategian egoera egokian mantentzeko ur bolumen handia ezinbestekoa zen, (2) mg BrdU/l baino kontzentrazio altuagoek, muskuiluen ehunen zelulen berriztapena inhibi dezakete (Martínez-Expósito et al., 1994); eta (3) aurreneko ikerketek, 4 mg BrdU/l-ko kontzentrazioa liseriguruineko epitelioan BrdU-markaketa konspikuoa erdiesteko nahikoa dela adierazi baitziguten. Muskuiluak denbora-tarte desberdinetan sakrifikatu ziren, BrdU-markaketaren fluktuazio-erritmoak identifikatu ahal izateko. Zelula BrdU-positiboen immunohistokimika Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean (%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10 azido azetikoa) fixatu ziren ordu batez 4 C-tan. Fixatu ondoren, laginak goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu ziren 60 C-tan. Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) American Optical mikrotomoan ebaki ziren eta aldez aurretik (3-amino propil trietoxisilanoz) silanizatutako portaobjektuetan jaso ziren. Ondoren, laginak xilenoz desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta fosfato indargetzaile salinoz 107

111 Emaitzak eta eztabaida (PBS; ingeleraz, Phosphate-Buffered Saline) garbitu ziren. Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko, ebakiak %3 zuen H 2 O 2 -an inkubatu ziren 5 minutuz, eta berriro PBSz garbitu ziren. DNA, 0.1 N HCl-ez desnaturalizatu zen ordu batez, 37 C-tan. Ebakiak, Vectastain Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories, Burlingame, California, Amerikako Estatu Batuak) hornitutako suero blokeatzailean ordu batez inkubatu ziren giro-tenperaturan eta berriro ere PBSz garbitu ziren. Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza; %0.1 bovine serum albumine zuen PBSan 1:10 diluitua) inkubatu ziren. Laginak PBSz garbitu ziren, eta ondoren, Vectastain Elite ABC Kitaren bitartez, abidina-biotina entzima-konplexua erabiliz antigorputza ikustarazi zen. Laburki, ebakiak, PBSn diluitutako saguaren aurkako zaldiaren IgG antigorputz sekundario biotinilatuan inkubatu ziren, 30 minutuz, eta ondoren PBSn garbitu ziren. Peroxidasa jarduera ikustarazteko kromogenoaren disoluzioa (3-amino-9- etilokarbazola, %0.015 H 2 O 2 zuen sodio azetato indargetzailean -ph 5.2- disolbatua) erabili zen. Azkenik, ebakiak hematoxilinaz kontrastatu ziren (10 s), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina glizerolatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50 (Olympus Tokio Japonia) mikroskopioari atxiki zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi ziren. Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa, argimikroskopioan kontateka zuzenaren bidez burutu zen. Liseri-epitelioan zelula BrdU-positiboen proportzioa antzemateko asmoz, 1000 zelula zenbatu ziren lagin bakoitzean, beste ikerketetan erabilitako lagin-tamainaren arabera (Okudela et al., 1999). Aldez aurretik egindako behaketa histologikoek, liseri-epitelioaren tubulu moduko ebakidura bakoitzean gutxienez zelula daudela erakutsi zuten. Hori dela eta, eguneroko lana errazteko asmoz, zelula BrdU-positiboen zenbaketa aleatorioki hautatutako 40 tubulu moduko ebakiduretan burutu zen ( zelula) liseri-guruin bakoitzean. Halaber, eskuarki konduktu sekundarioen ebakidura bakoitzean zelulak agertzen direnez gero, zelula BrdU-positiboen zenbaketa 10 konduktu sekundarioen ebakiduretan burutu zen ( zelula). Horrek, laginaren tamaina egoki lortzearen eta konduktu sekundarioen zeharkako ebakidurak lortzearen zailtasunaren arteko konpromisozko erabakia suposatu zuen. Datuak adierazteko momentuan --ra pasatu ziren. Urdailean, kontaketa trantsektu bat eginez burutu zen, eta guztira 200 zelula zenbatu ziren epitelioan barrena. Zelula-kopuru baxuago hori, urdailean jarduera proliferatzailea oso handia dela egiaztatu ondoren hautatu zen. Datuak kasu honetan ere -ko balioetan eman dira, aurrekoekin konparagarriak izan ahal izateko. Analisi estatistikoak, SPSS/PC+ programa erabiliz burutu ziren (SPSS, Microsoft). Denboraren eragina ikusi ahal izateko, faktore bateko ANOVA burutu zen, eta konparaketa anitzak eginez parekatutako batezbestekoen artean desberdintasun esangarriak (p<0.05) finkatzeko 108

112 Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean Duncan testa aplikatu zen. Azkenik, erregresio ez linealaren analisiak Sigma Plot programaren bitartez (SPSS, Microsoft) burutu ziren. Mitosien bilaketa Beste parafinazko ebaki batzuk (3 µm-koak) aldez aurretik deskribatu bezala prozesatu ziren, hematoxilina-eosinaz tindatu eta argimikroskopioan behatu ziren, liseri-guruinaren ehunean irudi mitotikoak identifikatzeko asmoz. Mikrografiak, Olympus BX50 mikroskopioari atxiki zegoen Olympus PM20 kameran lortu ziren. EMAITZAK Muskuiluen liseri-guruinan, zelula BrdUimmunorreaktiboak urdail, konduktu sekundario eta liseri-albeoloen epitelioetan lokalizatu egin ziren (1 Ird.). Liseri-epitelioan, liseri-zelulek zein zelula basofilikoek positiboki markatutako nukleoa erakutsi zuten, nahiz eta zelula erreakzionagarri gehienak liseri-zelulak izan (1A Ird.). Konduktu sekundarioetan, zelula BrdU-positiboak zati ziliatuetan kokaturik agertu ziren gehien bat (1B Ird.). Urdailean beste epitelioetan baino askoz zelula immunopositibo gehiago behatu ziren (1C Ird.). Azkenik, hemozitoen nukleoetan ere markaketa bortitza aurkitu genuen. Hemozitoak, sarritan epitelio-zelula BrdU-positiboen azpian kokaturik agertu ziren, xafla basalaren (zentzu histologikoan) azpian, hain zuzen ere (1B Ird.). Gainera, zelulen soberakinak, nukleo BrdUpositiboak barne, liseri-traktuaren argian askotan behatu ziren, hondakin zelularrekin batera (1D Ird.). BrdUren aurkako antigorputzarik gabe inkubatu ziren kontrol-ebakiek ez zuten inolako markaketarik erakutsi (1E Ird.). Faktore bateko ANOVA analisien (1. Taula) zein batezbestekoen arteko konparaketa anitza egiteko Duncan testaren arabera, BrdU-markaketa baloreak laginketa-denboren artean esangarriki desberdinak izan ziren. Duncan testaren arabera esangarriki desberdinak ziren zenbait azpitalde homogeneo bereiztu ziren, 2. Ird.-an erakutsi den bezalaxe. Liseri-epitelioan, zelulen bitartean BrdUz markatuta agertu zen; konduktu sekudarioetan, berriz, markaketa 8 aldiz baxuagoa izan zen gutxi gorabehera ( 3), eta urdailean 6 biderrez altuagoa ( 150) (2 Ird.). Liseri-guruineko zelulen BrdU-markaketak liseri-zelulen proliferaziotasaren aldaketak islatu zuen batik bat, zelula basofiliko BrdU-positiboak oso noizean behin baino behatu ez zirelako. Liseri-epitelioan, BrdUmarkaketaren jaitsiera nabarmenak 20:00-24:00 eta 08:00-10:00 tarteetan erregistratu ziren, bitartean igoerak behatu zirelarik (2A Ird.). Esperimentazio-egun bietan aldamolde erritmiko berdintsua aurkitu genuen. Erregresio ez-linealaren analisiaren ondoren, gutxi gorabehera 12 h-ko maiztasuna zuen funtzio sigmoideo bati doitu zitzaion, esangarriki. (3 Ird.). BrdU-markaketak konduktu sekundarioetan eta urdaileko epitelioan antzeko irudi erritmikoen patroia erakutsi zuen (2B, C Ird.), baina erregresio ez-lineala eta korrelaziokoefizientea ez ziren estatistikoki esangarriak izan. Muskuiluen liseri-guruina ohi bezala behatu ostean, irudi mitotikoak han-hemenka identifikatu ziren liseri-zeluletan (1F Ird.), eta hemozito zein urdaileko zeluletan ere. 109

113 Emaitzak eta eztabaida EZTABAIDA PCNA erabiliz aldez aurretik egindako lanek, liseri-epitelioa osatzen duten zelula-mota guztiek proliferatzeko gaitasuna dutela erakutsi dute (Marigómez et al., 1999). Liseri-zelulak zein zelula basofilikoak desberdintzatzeko eta mitosian sartzeko gai direla proposatu da. Dena den, bere biziraupen luzeari esker, PCNA-immunoerreakzionagarritasuna, zelula amen mitosien bidez sortarazitako zelula desberdintzatuen nukleoetan ere detekta daiteke (Casasco et al., 1995). Gure ikerlan honetan, liseri-zeluletan irudi mitotikoak agertu izanak eta BrdU-immunohistokimikaren emaitzek, zelulen berriztapena liseri-zelula eta zelula basofiliko helduen zatiketa autologoaren bitartez erdiesten dela egiaztatu dute. Hala ere, oro har, BrdU-markaketa PCNA-markaketa baino ahulagoa da. Markatutako zelulen proportzioan aurkitutako desberdintasunak, 3 H-Timidina, PCNA eta BrdU erabili direneko tasen araberakoak izan daitezke (Elsässer et al., 1994; Bromley et al., 1996; Moriki et al., 1996). Horrela, arratoiaren areako zelula azinarretan, zelula PCNA-positiboak 3 H-Timidina-positiboak baino 10 aldiz ugariagoak dira, bi teknika histokimikoen bidez lortutako emaitzen artean korrelazio esangarria dagoen arren (Elsässer et al., 1994). Azalpenik egokiena, seguru asko, PCNAren bizi-iraupena 20 ordukoa izatean datza; S-fasearen iraupena baino luzeagoa dena, hain zuzen. Hori dela eta, zelula PCNApositiboak ez dira soilik S-fasean daudenak baizik eta S-fasean daudenak edo eta oraintsu S-fasea gainditu berri dutenak ere. Ondorioz, PCNA immunohistokimikak zelula proliferatzaileak lokalizatzeko seinale bortitzagoa eskaini dezaken arren; proteinaren biziraupen luzeagoak epitelioen berriztapenaren dinamikak aztertzeko desabantaila suposa diezaguke. BrdU-immunohistokimika, bere aldetik, helburu hori betetzeko egokiagoa dela dirudi, BrdUren biziraupena laburragoa denez, pultsu-esperimentuetan aplikatzeko aukera eskaini baitiezaguke. Izatez, proliferazioaren markatzaile immunohistokimiko sendoena eta fidagarriena dugu BrdU, S-faseak baino ez dituelako identifikatzen (Bromley et al., 1996). BrdU-pultsu esperimentuak hainbat animali eredutan aplikatu diren arren, ornogabe itsastarren kasuan murritzak dira (Harzsch et al., 1999; Awaji & Suzuki, 1995; Candia Carnevali et al., 1997; Goergen et al., 2002). Muskuilu itsastarretan, BrdU-pulsua nola aplikatu arazo nagusietakoa izan genuen. Ikerlan honetan, BrdU uretan disolbatu zen, eta beraz, elikatzeiragazketa aurrera joan ahala BrdU zelulei iristen zitzaien. Prozedura horrek, liseri-guruineko ehunetan BrdU eranstea ahalbidetzen zuela baieztatu zen, aldez aurretik zakatz-ehunetan behatu izan zen bezalaxe (Martínez-Expósito et al., 1994). Immunohistokimika aplikatzekotan, pultsu batez emandako BrdU, mitosiondoko zeluletan beren bizitza osoan zehar detekta daiteke, nukleoan seinalea esponentzialki diluituko luketen proliferazio-prozesu suzesiboak ez gertatzekotan behinik behin (Ward et al., 1991). Ikerlan honetako baldintza esperimentalen arabera, BrdU-markaketa esperimentuak aurrera egin ahala igoz joango zela 110

114 Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean 1. Irudia: BrdU-positiboak diren nukleoen identifikazioa (geziak) unitate albeolotubularretako liseri-zeluletan (A), konduktuetan (B), urdailean (C) eta urdailaren argian askatutako materialean (D). Kontrol-ebakiean ez da inolako zelula BrdU-positiborik behatu (E). Hematoxilina-eosinaz tintatutako kromosomak (gezia) mitosian dagoen liserri-zelula batean (F). A) unitate albeolotubularra; D) konduktuko epitelio-zelula; H) hemozitoa; S) urdaileko epitelio-zelula.dc) liseri-zelula; BC) zelula basofilikoa. Eskala-marrak: 25 µm (A-E); 50 µm (F). espero genuen. Aitzitik, BrdU-markaketa oso bizkor jaitsi zen, 4 orduren buruan: 25-tik 2-ra unitate albeolotubularretan eta ra urdailean (2 Ird.). Nukleoetatik BrdU-markaketa desagertzea, zelulen zatiketa suzesiboen ondorioa ote dugu, edo markatutako zelulak jaio orduko hiltzearen ondorioa ote da?. Arratoiaren gibeleko epitelio-zeluletan egindako 111

115 Emaitzak eta eztabaida 1. Taula: Ikertutako hiru epitelioetan laginketa-denborak BrdUmarkaketan duen eragina finkatzeko egindako faktore bateko ANOVA-ren laburpena. P(F), Fisher ratioaren probabilitatea; a.g., askatasun-graduak. Estatistikoki esangarriak gertatu ziren desberdintasunak (p<0.05), asterisko batez adierazita daude. in vitro BrdU-pultsu esperimentuetan, BrdUimmunomarkaketa hiru zatiketa zelular eta gero desagertu dela demostratu da (Evarts et al., 1996). Mihiko keratinozito murinoetan, BrdU-markaketaren balio maximo eta minimoen artean gutxi gorabehera 12 orduko aldea dago (Garcia et al., 2001), baina indize mitotikoaren piko maximoa BrdU-markaketaren piko maximoa baino 8 ordu beranduago gertatzen da, BrdUren piko minimoaren momentuan, hain zuzen. Horrela, BrdU-markaketa zelulen zatiketaren ostean diluituko balitz, horrek muskuiluen liseri-epitelioan DNA bikoizketa eta zelulen zatiketa prozesu nahiko azkarrak izatea suposatuko luke. Muskuiluetan ziklo zelularraren iraupenari buruz ditugun datu urriek, ordea, kontrakoa erakutsi dute. Esaterako, zakatzetako epitelio-zeluletan ziklo zelularrak 30 ordu inguru irauten dituela frogatu da (Martínez Expósito et al., 1994). Hala ere, epitelio-zelulek behin eta berriro, zelula amen moduan, proliferatuko balute, BrdU-markaketa ez zen diluituta suertatuko; zatiketa berri bakoitzean gure baldintza esperimentaletan etengabe eskuragarria den BrdU gehiago behin eta berriro erantsiko bailukete. F ratio a.g.(1) a.g. (2) p(f) Unit. albeolotubularrak <0.001* Liseri-konduktuak <0.001* Urdaila * (1) taldeen artean; (2) talde barruan Bestalde, erabilitako BrdU kontzentrazioak zitotoxikoak ez direla pentsatu arren (Martínez Expósito et al., 1994), etengabeko BrdUesposizioak, zelula-mota bakoitzari dagokion modu espezifikoan ziklo zelularraren progresioa alda lezake (Diermeier et al., 2004). Batetik, BrdUk apoptosia eragin dezake. Bestetik, BrdU eransteak faboratutako DNA parekatze-akatsen ondorioz ziklo zelularra eten daiteke (Yao et al., 1998). Are gehiago, BrdUk, arearen kasuan esaterako, garapen-programa espezifikoki eragin dezake, proteinen sintesi- eta jariapen-patroietan aldaketa deigarriak sortaraziz (Van Nest et al., 1983). Beraz, gure baldintza esperimentaletan BrdU erantsi duten liseri-guruineko epitelioko-zelulak alteratuta egonez gero epiteliotik aska zitezkeen. Horrek, bertan aurkitutako BrdU-markaketaren berehalako beherakadak azalduko lituzke. Izan ere, gure ikerlanean liseri-traktuaren argian zelula BrdUpositiboak maiz behatu ditugu soberakinen artean (1D Ird.). Liseri-unitate albeolotubularreko epitelioan BrdU-markaketaren kuantifikazioari buruzko emaitzak liseri-zelulen proliferazio-tasaren aldaketei dagozkie batez ere, BrdU-markatutako zelula basofilikoak oso gutxitan behatu baitira. Gure emaitzen arabera, epitelio-zelulen berriztapena nabarmenagoa da urdailean unitate albeolotubularretan eta konduktuetan baino. Urdail-epitelioan, 150 zelula ere egon daitezke aldi berean S- fasean eta, dirudienez, epitelioa bere osotasunean 3 egunetan berrizta daiteke. Bestalde, liseri-zelulen 25-a eta bakarrik konduktuetako zelulen 3-a sartzen dira S-fasean une batean. Beraz, unitate 112

116 2. Irudia: 2 egunez fotoperiodo (argitasun/iluntasun) naturalean mantendutako muskuiluen liseri-guruineko BrdUmarkaketa ( ± desbidazio estandarra) denboraren arabera (eguzki-denbora). (A) unitate albeolotubularrak; (B) liserikonduktuak; eta (C) urdaileko epitelioa. Tratamendua eguerdiko 12:00-tan hasi zen, 4 mg BrdU/l itsas-ur pultsua aplikatuz, eta ondoren 2 mg BrdU/l itas-ur gehitu ziren 4 orduro (geziak). Muskuiluei janaria bi aldiz (asteriskoak) eman zitzaien egunero. Segmentu horizontalek, argiztapen-baldintzak (zuria, argitasun-tarteak; marraduna, ilunabar-tarteak; beltza, iluntasun-tarteak) adierazi dituzte. Erabilitako ikurren forma eta trama desberdinek esangarriki desberdinak diren azpitaldeak adierazi dituzte, Duncan testaren arabera (p<0.05). Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean Guruin-epitelioei dagokienez, BrdU-markaketa indizea gibel murinoaren 4-a (Cantz et al., 2003) eta hamsterraren guruin harderiarraren bitarteko balio-errangoan alda daiteke (Fernández- Suárez et al., 1996), balio hauek bibalbioen liserizeluletan erregistratutakoak baino txikiagoak izanik. Gure ikerlanean, 20 zelula BrdU-positiboko 2 batezbesteko piko maximoak topatu dira liseriunitate albeolotubularretan egunero eta, beraz, egun bakoitzean zelulen 40-a S-fasean sartzen direla estima genezake. Beraz, liseri-epitelio osoa hilabetero (25 egun) guztiz berriztatuta suertatuko litzateke. Unitate albeolotubularretako epitelioaren berriztatze osoa erdiesteko beharrezkoa den denbora-tarte hori ez dator bat inolaz ere liseri-ziklo bakoitzean, hau da, birritan egunero marearteko muskuiluetan, liseri-epitelioa osorik berriztatzen zela argudiatzen zuen autoreen iritziarekin (Nelson & Morton, 1979). Gizakiaren kolon-ondesteko mukosan albeolotubularreko epitelioa hilabete batean eta konduktuetako epitelioa 6 hilabetetan berriztatuko lirateke beren osotasunean. Oro har, urdaileko eta unitate albeolotubularretako epitelioetako zelulen berriztapen-tasa ertaina eta altua bitartean dagoela esan genezake. 3. Irudia: Unitate albeolotubularretako liseri-epitelioan behatutako BrdU-markaketa ( zelulak) eta denboraren (ordu esperimentalak) arteko erregresio ez-lineala. Doipenarik egokiena honako funtzio sigmoideo honi egokitu zitzaion: Y= [sin(2ΠX/10.988)+4.324]; r 2 =0.338; non erregresio- eta korrelazio-koefiziente guztiak estatistikoki esangarriak izan baitziren (p<0.05). Gailurren arteko zein bailaren arteko distanzia 12 ordu ingurukoa izan zen (goiko geziak, itsasgora; beheko geziak, itsasbehera). 113

117 Emaitzak eta eztabaida batezbesteko BrdU-markaketa indizea bitartekoa da (Potten et al., 1992), arratoiaren epitelio gastrikoan 150 ingurukoa den bitartean (Gama et al., 2000). BrdU-markaketa balio horiek guruinak ez diren epitelio normaletan balio-atalase maximoak direla dirudi (Bertalanffy 1962; Humme & Potten 1980; Potten et al. 1992; Pawlinoski et al., 1999; Gama et al. 2000), eta ikerlan honetan urdailean aurkitutakoen antzekoak dira. Liseriunitate albeolotubularren kasuan aplikatutakoen antzeko kalkuluetan oinarrituz, konduktuetako eta urdaileko berriztapen osoa 6 hilabetetan (175 egun) eta 3 egunetan, hurrenez hurren, burutuko litzatekeela ondorioztatu da. Liseri-konduktuetako epitelioaren BrdU-markaketa indizea baxua kontsidera daiteke, 2 eta 3 bitarteko indizea duen obarisektomizatutako arratoien endometrioaren moduko beste ehunen antzera (Pawlinoski et al., 1999). Gure emaitzen arabera, muskuiluen liseriunitate albeolotubularretako epitelio-zelulen berriztapenak patroi fluktuagarria jarraitzen du. Patroi horrek, gailur eta bailarak 6 ordutako txandatan agertzen direneko erritmo zirkamareal perfektoa irudikatzen du. Antzeko erritmo zirkamarealak hainbat ornogabe itsastarren mota askotako prozesu fisiologikoetan behatu dira (Naylor 1996, Abello et al., 1997). Bi proliferazioziklo gauzatzen dira egun batean zehar. Proliferazio-eredua errepikatu egiten da, zelulak itsasgorako orduetan S-fasean sartzen dira, geroko orduetan, zatiketa zelular bizkorrak pairatzeko. Izan ere, zelula BrdU-positiboak ia desagerturik daude 4 orduren buruan. Liseri-konduktuetako BrdUmarkaketa patroia ez da unitate albeolotubularretan deskribatutakoaren oso desberdina, baina seinalea hain baxua denez laginketa-denboren arteko desberdintasunak BrdU-markaketan esanguratasun biologiko eta esangarritasun estatistikorik gabekoak dira. Urdailean ere epitelioaren berriztapena sinkronizatuta dagoela dirudi. Bibalboen liseri-traktuan epitelio-zelulek zatitu baino lehen migratu egiten dutela deskribatu da mitosiak epitelioaren erpinaldean gertatuz (Mix 1970; Leibson & Frolova 1994). Aitzitik, nukleo BrdU-positiboak epìtelio-zelulen oinaldeko herenean kokaturik daudela aurkitu dugu. Gizakiaren aho-epitelioan (Bjarnasson et al., 1999) eta bizkar-muinean (Abrahamsen et al., 1998), zein arratoiaren liseri-traktuan ere (Scheving et al., 1978), bereziki zelula ugari aurkitu dira S- fasean ilunabarrean, gauan zehar beraien kopurua nabarmenki jaitsiz. Xaguaren keratinozitoetan S- fase gehienak gauez ematen dira (Garcia et al., 2001). Otarrainaren zerebroan neurogenesiaren mailarik altuena ilunabar aldean gertatzen da, gaua jarduera fisiologiko maximoaren garaia izanik (Goergen et al., 2002). Epitelio-zelulen proliferaziojardueraren aldaketa erritmikoen denbora-patroia ehun- eta espezie-espezifikoa izan liteke zalantzarik gabe, muskuiluen liseri-guruinean elikatze eta liseriketa moduko jarduera zikliko zein erritmo marealen menpekoa izanik (Nelson & Morton 1979; Morton 1983). Ikerlan honetan, marea-ziklo eta fotoperiodoaren arteko interferentziak ekiditeko asmoz, bakarrik mareazpiko muskuiluak aztertu dira. Hala ere, Mytilusen habitata itsasbeherako mailatik metro 114

118 Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean gutxi batzutara baino ez da iristen. Eskualde horretan animaliek kinada fotikoak eta gorantz zein beherantzko mareen pauta erritmikoak ere jasotzen dituzte. Ondorioz, marea-erritmoa liseri-sistemaren zelulen proliferazioaren prozesu erritmikoak gobernatzeko Zeitgeber perfektua izan daiteke, kasu honetan bezala muskuiluak mareazpikoak badira ere. Laburbilduz, liseri-zeluletan irudi mitotikoak behatu izanak eta BrdUren emaitzek, zelulen berriztapena liseri-guruineko zelula helduen zatiketa autologoaren bitartez gauzatzen dela egiaztatu dute. Urdaileko eta liseri-unitate albeolotubularreko epitelioek, zelulen berriztapentasa ertaina eta altua bitarteko dute. Epitelio-zelulen berriztapena sinkronizatuta dago, 24 ordutan 2 ziklo osoak betetzen dituen patroi zirkamareala jarraituz. BIBLIOGRAFIA Abello P, Warman CG, Naylor E (1997) Circatidal moulting rhythm in the shore crab Carcinus maenas. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 77: Abrahamsen JF, Smaaland R, Sothern RB, Laerum OD (1998) Circadian cell cycle variations of erythro- and myelopoiesis in humans. Eur. J. Haematol. 58: Awaji M, Suzuki T (1995) The pattern of cell proliferation during pearl sac formation in the Pearl oyster. Fisheries Sci. 61: Bertalanffy FD (1962) Cell renewal in the gastrointestinal tract of man. Gastroenterology 11: Bjarnasson GA, Jordan RCK, Sothern RB (1999) Circadian variation in the expression of cell-cycle proteins in human oral epithelium. Am. J. Pathol. 154: Bromley M, Rew D, Becciolini A, Balzi M, Chadwick C, Hewitt D, Li YQ, Potten CS (1996) A comparison of proliferation markers (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determined at each cell position in the crypts of normal human colonic mucosa. Eur. J. Histochem. 40: Cajaraville MP, Díez G, Marigómez JA, Angulo E (1990) Responses of basophilic cells of the digestive gland of mussels to petroleum hydrocarbon exposure. Dis. Aquat. Org. 9: Candia Carnevali MD, Bonasoro F, Biale A (1997) Pattern of bromodeoxyuridine incorporation in the advanced stages of arm regeneration in the feather star Antedon mediterranea. Cell Tiss. Res. 289: Cantz T, Zuckerman DM, Burda DR, Dandri M, Goricke B, Thalhammer S (2003) Quantitative gene expression analysis reveals transition of fetal liver to mature hepatocytes after transplantation in upa/rag-2 mice. Am. J. Pathol. 162: Casasco A, Casasco M, Icaro Cornaglia A, Mazzini G, De Renzis R, Tateo S (1995) Detection of Bromodeoxyuridine- and Proliferating Cell Nuclear Antigenimmunoreactivities in tooth germ. Connective Tiss. Res. 32: Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1993) Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. Anat. Rec. 235: Diermeier S, Schmidt-Bruecken E, Kubbies M, Kuntz-Schughar LA, Brockhoff G (2004) Exposure to continuous bromodeoxyuridine (BrdU) differentially affects cell cycle progression of human breast and bladder cancer cell lines. Cell Prolif. 37: Dimitriadis VK, Domouhtsidou GP, Cajaraville MP (2004) Cytochemical and histochemical aspects of the digestive gland cells of the mussel Mytilus galloprovincialis (L.) in relation to function. J. Mol. Histol. 35: Elsässer HP, Biederbick A, Kern HF (1994) Growth of rat pancreatic acinar cells quantitated with a monoclonal antibody against the proliferating cell nuclear antigen. Cell Tiss. Res. 276: Evarts RP, Hu Z, Omori N, Omori M, Marsden ER, Thorgeirsson SS (1996) Precursor-product relationship between oval cells and hepatocytes: comparison between tritiated thymidine and bromodeoxyuridine as tracers. Carcinogenesis 17: Fankboner PV (1971) Intracellular digestion of symbiotic zooxanthellae by host amoebocytes in giant clams (Bivalvia: Tridacnidae), with a note on the nutritional role of the hypertrophied siphonal epidermis. Biol. Bull. 141:

119 Emaitzak eta eztabaida Fernández-Suárez A, López JM, Carbajo S, Alvarez-Uria M, Carbajo-Pérez E (1996) New insights into cytodynamics of the hamster Harderian gland as provided by the bromodeoxyuridine-labelling method. Histol. Histopathol. 11: Gama P, Goldfeder EM, Bertacini de Moraes JC, Alvares EP (2000) Cell proliferation and death in the gastric epithelium of developing rats after glucocorticoid treatments. Anat. Rec. 260: García MN, Barbeito CG, Andrini LA, Badrán AF (2001) Circadian rhythm of DNA synthesis and mitotic activity in tongue keratinocytes. Cell Biol. Inter. 25: Goergen EM, Bagay LA, Rehm K, Benton JL, Beltz BS (2002) Circadian control of neurogenesis. J. Neurobiol. 53: Hanselmann R, Smolowitz R, Gibson D (2000) Identification of proliferating cells in hard clams. Biol. Bull. 199: Harzsch S, Miller J, Benton J, and Beltz B, (1999) From embryo to adult: Persistent neurogenesis and apoptotic cell death shape the lobster deutocerebrum. J. Neurosci. 19: Humme WJ, Potten CS (1980) Changes in proliferative activity as cells move along undulating basement membranes in stratified squamous epithelium. British J. Dermatol. 103: Icely JD, Nott JA (1992) Digestion absorption: digestive system and associated organs orr. Non: Harrison FW, & Humes AG (ed) Microscopic anatomy of invertebrates. 10: Decapod Crustacea. Wiley-Liss, New York. Karam SK, Leblond CP (1993) Dynamics of epithelial cells in the corpus of the mouse stomach. I. Identification of proliferative cell types and pinpointing of the stem cell. Anat. Rec. 236: Leibson NL, Frolova LT (1994) Winter-spring essential reorganization of cell proliferation in the digestive tract epithelia in the mussel Crenomytilus grayanus. Mar. Biol. 118: Makarov VN, Schoschina EV, Luning K (1995) Diurnal and circadian periodicity of mitosis and growth in marine microalgae. 1. Juvenile sporophytes of laminariales (phaeophyta). Eur. J. Phycol. 30: Marigómez I, Cajaraville M P, Angulo E (1990) Histopathology of the digestive gland-gonad complex of the marine prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. Aquat. Org. 9: Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart GBJ (1998a) Tissue-level biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to assess metal pollution in soils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 34: Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998b) Celltype replacement, a successful strategy of molluscs to adapt to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 18: Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical localisation of proliferating cells in mussel digestive gland tissue. Histochem. J. 31: Martínez-Expósito MJ, Pasantes JJ, Méndez J (1994) Proliferation kinetics of mussel (Mytilus galloprovincialis) gill cells. Mar. Biol. 120: Mix MC (1970) Cell renewal systems in the gut of the oyster, Crassostrea gigas. Veliger 14: Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestive tubule tissue of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing radiation. J. Invert. Pathol. 17: Moriki T, Takahashi T, Kataoka H, Hiroi M, Yamane T, Hara H (1996) Proliferation marker MIB-1 correlates well with proliferative activity evaluated by BrdU in breast cancer: an immunohistochemical study including correlation with PCNA, p53, c-erbb-2 and estrogen receptor status. Pathol. Internat. 46: Morton B (1983) Feeding and digestion in Bivalvia orr. Non: Saleuddin A S M. & Wilburg M (ed) The Mollusca. 5. Academic Press, New York. Naylor E (1996) Crab clockwork: the case for interactive circatidal and circadian oscillators controlling rhythmic locomotor activity of Carcinus maenas. Chronobiol. Internat. 13: Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial renewal in the digestive gland tubules of the marine prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 45: Okudela K, Ito T, Kameda Y, Nakamura N Kitamura H (1999) Immunohistochemical analysis for cell proliferation-related protein expression in small cell carcinoma of the esophagus; a comparative study with small cell carcinoma of the lung and squamous cell carcinoma of the esophagus. Histol. Histopathol. 14: Palmer RE (1979) A histological and histochemical study of digestion in the bivalve Arctica islandica L. Biol. Bull. 156:

120 Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean Pawlinoski M, Melén-Mucha G, Mucha S (1999) The involvement of the renin-angiotensin system in the regulation of cell proliferation in the rat endometrium. Cell.Mol. Life Sci. 55: Potten CS, Kellett M, Roberts SA, Rew DA, Wilson GD (1992) Measurement of in vivo proliferation in human colorectal mucosa using bromodeoxyuridine. Gut 33: Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light and electron microscopic studies on the acute and chronic toxic effects of N-nitroso compounds on the marine mussel Mytilus edulis (L.). II N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine. Aquat. Toxicol. 3: Santa Barbara P, van den Brink GR, Roberts DJ (2003) Development and differentiation of the intestinal epithelium. Cell Mol. Life Sci. 60: Scheving LE, Burns RE, Pauly JE, Tsai TH, (1978) Circadian variation in cell division of the mouse alimentary tract, bone marrow and corneal epithelium. Anat. Rec. 191: Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) Morphological alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 44: Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starvation on structure and function in the digestive gland of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Ass. U. K. 54: Van Nest G, Raman RK, Rutter WJ (1983) Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev. Biol. 98: Vogt G (1994) Life-cycle and functional cytology of the hepatopancreatic cells of Astacus astacus. Crustacea, Decapoda. Zoomorphology 144: Ward JM, Henneman JR, Osipova GY, Anisimov VN (1991) Persistence of 5-bromo-2'-deoxyuridine in tissues of rats after exposure in early life. Toxicology 70: Yao XH, Sugihara H, Hattori T, Katsura K, Takamatsu T (1998) Regulation of apoptotic cell death in the pyloric glands of the canine stomach. Virchows Arch. 433: Yonge CM (1926) The digestive diverticula in Lamellibranchia. Trans. Roy. Soc. Edin. 54: Zaldibar B, Iturralde J, Cancio I, Marigómez I (2001) Reversible cell-type replacement in marine mollusc Littorina littorea exposed to cadmium. SETAC Europe Ann. Conf., Vienna. 117

121 Emaitzak eta eztabaida 118

122 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseriguruin eta urdailean: sasoi, adin eta erregimen marealari lotutako aldamoldeak Laburpena: Tamaina, adin eta itsasaldi-erregimen desberdineko Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-albeolo eta urdaileko epitelioko zelulen jarduera proliferatzailearen aldamolde naturala ikertu da sasoi desberdinetan. Muskuiluak, timidinaren analogoa den bromodeoxiuridinarekin (BrdU) 6 orduz tratatu ondoren, 2 orduro hurrengo 36 ordutan BrdUren immunohistokimika burutu zen. Ondoren, zelula BrdU-positiboen proportzio erlatiboa BrdU-markaketa gisa ( ) kuantifikatu zen. Sasoiari dagokionez, desberdintasun esangarriak behatu ziren BrdU-markaketan. Udan, udazkenean eta neguan baino askoz jarduera proliferatzaile altuagoa neurtu zen. Adin (tamaina) desberdineko animalien artean ez zen zelulen jarduera proliferatzaile desberdinarik behatu. Bestalde, marearteko eta mareazpiko muskuiluen liseri-guruineko epitelioen artean desberdintasunak aurkitu ziren, bai BrdU-markaketa mailetan, eta baita aldamolde-patroian ere, non marearteko muskuiluetan BrdU-markaketa fotoperiodoak zein itsasaldierregimenak modulatua baitzegoen eta mareazpiko muskuiluetan, patroi zirkamareala jarraitu baitzuen. Gako-hitzak: bromodeoxiuridina, immunohistokimika, liseri-zelula, zelula basofilikoa, berriztapen zelularra, erritmo zirkamareala, tamaina, adina, sasoia, marea, bibalbioak. 119

123 Emaitzak eta eztabaida Epithelial cell renewal in the digestive gland and stomach of mussels: season, age and tidal regime related variations Abstract: The natural variability in cell proliferation activity in the epithelium of the digestive gland and stomach was investigated in mussels, Mytilus galloprovincialis (Lmk), of different age and tidal level at different seasons. After treating mussels with the thymidine analogue bromodeoxyuridine (BrdU) for 6 hours, BrdU immunohistochemistry was performed every 2 hours for the next 36. Then, the relative proportion of BrdU positive cells was quantified as BrdU labelling ( ). Marked seasonal differences were recorded in BrdU labelling, with much higher proliferating activity in summer than in autumn and winter. Cell proliferation seemed not to be significantly dissimilar between mussels of different age (size). In contrast, the digestive gland epithelium of mussels from intertidal and subtidal populations differed not only in the levels but also in the pattern of variation of BrdU labelling, which in intertidal mussels appeared to be modulated by photoperiod and tide, unlike in subtidal mussels, in which variations followed a circatidal pattern. Key words: bromodeoxyuridine immunohistochemistry, digestive cell, basophilic cell, cell epithelial renewal, circatidal rhythm, size, age, season, tide, bivalve. Renovación de células digestivas en glándula digestiva y estómago de mejillon: variación según la época, edad y régimen mareal Resumen: Se ha investigado la variabilidad natural en la actividad proliferativa de las células de la glándula digestiva y del estómago de mejillón, Mytilus galloprovincialis (Lmk), de diferente edad y régimen de marea en diferentes épocas del año. Los mejillones fueron tratados con bromodeoxiuridina (BrdU), un análogo de la timidina, durante 6 horas y en las siguientes 36 horas se realizó la immunohistoquímica de BrdU cada 2 horas. A continuación, se cuantificó la proporción relativa de células BrdU positivas ( ). Se observaron diferencias significativas en el marcaje de BrdU relacionadas con la época del año, siendo la proliferación celular mucho más marcada en verano que en otoño e invierno. La proliferación celular no resultó diferente entre animales de diferentes edades (tamaño). Por el contrario, en el epitelio de la glándula digestiva de mejillones intermareales y submareales no sólo resultó diferente el nivel, sino también el patrón de variación del marcaje de BrdU. En mejillones intermareales ese patrón parece modulado por el fotoperiodo y la marea, a diferencia de los submareales en los que las variaciones siguen un patrón circamareal. Palabras clave: inmunohistoquímica de bromodeoxiuridina, célula digestiva, célula basofílica, renovación celular, ritmo circamareal, tamaño, edad, época, marea, bibalvio. 120

124 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra SARRERA Muskuiluen liseri-guruineko epitelioa desberdintzatutako 2 zelula-motez osaturik dago, liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia. Liserizelulek, oso sistema endo-lisosomiko garatua dute eta elikagaien liseriketa intrazelularraz arduratzen dira. Zelula basofilikoek, izaera basofiloa damaien erretikulu endoplasmatiko pikortsu garatua dute, eta liseri-zelulak baino urriagoak dira. Marigómez et al.-ek, (1999), PCNA immunohistokimika erabiliz, bi zelula-mota horiek proliferatzeko gai direla frogatu zuten. Liseri-zeluletan irudi mitotikoak aurkitu izanak eta BrdU immunohistokimikak, zelulen berriztapena liseri-zelula eta zelula basofiliko helduen zatiketa autologoaz burutzen dela baieztatu dute (Zaldibar et al., 2004). Liseridibertikuluen epitelio-zelulen berriztapena sinkronizatuta dago patroi zirkamareala jarraituz, BrdU-markaketaren aldaketek adierazi zutenez (Zaldibar et al., 2004). Esperimentu horiek, mareazpiko muskuiluekin soilik burutu ziren arren, edonola ere itsasaldi-erregimena eraginkorra zela proposatu zen. Dirudienez, liseri-guruineko epitelioaren zelulen berriztapena, Izagirre-ren (2000) arabera liseri-zelulen jarduera fisiologikoa (adb, liseriketa intrazelularra) murrizten deneko une jakinetara mugatuta dago. Beraz, jarduera fisiologiko eta ziklo zelularraren arteko elkarrekintza ezagutzea, liseri-epitelioaren zelulen berriztapen ulertzeko oinarrizkoa izango litzateke. Testuinguru horretan, liseri-guruinaren gainean eragina duten aldagai naturalek (adina, sasoia, itsasaldi-erregimena), liseri-guruineko zeluletan aurkitutako jarduera proliferatzailearen eredu zirkamareala, aldarazi edo modula dezaketen finkatzea erronka erabakigarria da. Liseri guruinaren forma eta funtzioa, liseritze-iraupena eta intentsitatea eta beste prozesu fisiologikoak barne, aldagai horien arabera aldatu egiten da (Etxeberria et al., 1994; Cancio et al., 1999; Fernández-Reiriz et al., 2001; Wong & Cheung, 2001; Le Pennec & Le Pennec, 2002; Pazos et al., 2003). Are gehiago, tamaina (adin) desberdineko muskuiluek, liseri-guruineko zelulen proliferazioeredu ezberdina dute. Izatez, SDS-PAGE elektroforesiaren ondoko PCNAren immunotransferentziak, muskuilu txikien (gazte heldugabeak) liseri-guruineko zelulak muskuilu handienetakoak (helduak) baino proliferazio gaitasun handiagoa zutela erakutsi zuten (Marigómez et al., 1999). Hiru sasoi desberdinetan (negua, udara eta udazkena) itsasarteko bi eskualde desberdinetan (mareartekoa eta mareazpikoa) hartutako tamaina desberdineko (txikiak-gazteak eta handiakhelduak)mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-guruineko eta urdaileko zelula proliferatzaileen banaketa, BrdUimmunohistokimika bitartez ikertu zen. MATERIAL ETA METODOAK Erreaktibo kimikoak Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkataletxekoak dira besterik agertu ezean. 121

125 Emaitzak eta eztabaida Atariko esperimentua Mareazpiko eta marearteko Mytilus galloprovincialis muskuiluen liseri-guruineko eta urdaileko zelulen proliferazioa konparatu ahal izateko, BrdU-pultsua marearteko muskuiluak pairatzen duten urperatze-aldira mugatu behar izan zen (6 ordu). Aldez aurretik burututako esperimentuak uretango BrdU-esposizio jarraia aplikatu ondoren, BrdU-markaketa patroi zirkamareala erakutsi zutenez, oraingo honetan BrdU-pultsua egunaren unerik egokiena finkatzeko zenbait aurretiko esperimentu diseinatu ziren. Helburu hori betetzeko, 160 mareazpiko muskuilu gazte (maskorraren luzera <15 mm) eta 160 heldu (maskorraren luzera mm) uztailean itsasbeheran jaso ziren Plentzian (Bizkaiko Golkoa, 43º24 I 2º56 M). Muskuiluak laborategira garraiatu ziren, eta polietilenozko 4 akuariotan (80 muskuilu 15 l itsas uretan) etengabeko aireztapenaz eta 15ºC-tara mantendu ziren. Itsas-ura argi ultramorea erabiliz esterilizatu zen, eta karbono aktiboz zein beirazko zuntzetan zehar iragazi egin zen. 12 orduro itsas-ura aldatu zen eta muskuiluei, uraren aldaketarekin batera, janaria eman zitzaien (Marine Invertebrate Diet, Carolina, Carolina Supply Co, Burlington, North Carolina, Amerikako Estatu Batuak). Bi esperimentu osagarri burutu ziren. Lehenengo esperimentuan (Eguneko pultsuarenesperimentua), muskuilu gazte eta helduak, bakoitza bere aldetik 4 BrdU mg/l zuen itsas-uretan 6 orduz jarri ziren, 14:00-tan hasita. Ondoren, muskuiluak BrdUrik gabeko itsas-uretan murgildu ziren, eta hurrengo 36 ordutan 2 orduro 5 espezimen sakrifikatu ziren. Bigarren esperimentuan, (Gaueko pultsuaren esperimentua) BrdU-pultsu berdina gauean zehar (24:00-tatik 06:00-ak arte) aplikatu zen eta muskuiluak hurrengo 28 ordutan 2 orduro sakrifikatu ziren. Esperimentu nagusia Urteko hiru sasoi desberdinetan, negua (martxoa), uda (uztaila) eta udazkena (urria), muskuiluak (n = 320), Plentzian itsasbeheran hartu ziren, laborategira garraiatu eta lehen aipatutako baldintza berberetan mantendu ziren. Marearteko eta mareazpiko populazioetan, adin desberdineko (gazteak: <15 mm eta helduak: mm maskorraren luzera) muskuiluak hautatu ziren, eta beraz, sasoi bakoitzean lau joku esperimental (80 muskuilu bakoitzean) ezarri ziren: marerazpiko muskuilu helduak (LS), marearteko helduak (LI), mareazpiko gazteak (SS), eta mareazpiko gazteak (SI). Talde esperimental guztiak, 4 BrdU mg/l zuen itsas-uretan 6 orduz jarri ziren, 14:00-tan hasita, marearteko muskuiluen urperatze-denboran zehar, hain zuzen. Ondoren, muskuiluak BrdU gabeko uretan murgildu ziren, eta denbora-tarte desberdinetan talde bakoitzetik 5 espezimen sakrifikatu ziren, BrdU-markaketa kuantifikatzeko. LS eta SS taldeetan itsas-ura 12 orduro aldatzen zen. LI eta SI taldeko muskuiluak marearteko baldintzetan mantendu ziren, 6 orduz airean eta 6 orduz uretan murgildurik, euren jatorrizko lekuan zegoen itsasaldi-erregimena jarraituz. Janaria (Marine Invertebrate Diet) talde esperimental guztietako muskuiluei batera 12 orduro ematen zitzaien, marearteko muskuiluak uretan murgilduta 122

126 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra zeuden momentuan. BrdU immunohistokimika Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean (%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10 azido azetikoa) ordu batez fixatu ziren 4 C-tan, goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu ziren, 60 C-tan. Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) American Optical mikrotomo batean erdietsi ziren, eta aldez aurretik (3-amino propil trietoxisilano) silanizatutako portaobjektuetan jaso ziren. Ondoren, ebakiak xilenoz desparafinatu, etanolezko bainu-serie batean hidratatu, eta PBSaz (fosfato indargetzaile salinoa; ingelesez, Phosphate-Buffered saline) garbitu ziren. Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko, ebakiak %3 zuen H 2 O 2 -an 5 minutuz inkubatu ziren eta berriro PBSaz garbitu ziren. DNA, ordu batez 37 C-tan 0.1N HCl-z desnaturalizatu zen. Ebakiak, borato indargetzailean (ph=8.5) neutralizatu eta PBSaz garbitu ziren. Ondoren, ebakiak Vectastain Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, Amerikako Estatu Batuak) hornitutako serum blokeatzaile normalean (NBS, ingelesez; Normal Blocking Serum) ordu batez inkubatu ziren, giro-tenperaturan, eta berriro PBSaz garbitu ziren. Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza; 1:10 %0.1 behi-albumina seruma zuen PBSan) inkubatu ziren. Laginak PBSaz garbitu, eta ondoren, Vectastain Elite ABC Kit-a erabiliz abidina-biotinaentzima (ABC) metodoaren bidez immunokonplexuak ikustarazi ziren. Laburki, ebakiak, PBSan diluitutako sagu aurkako zaldiaren IgG antigorputz sekundario 30 minutuz biotinilatuan inkubatu ziren, eta ondoren PBSan biziki garbitu ziren. Peroxidasa jardueraren ikustaraztea, sodio azetato indargetzailean (ph = 5.2) 3-amino-9- ethylkarbazola eta %0.015 H 2 O 2 zituen kromogeno-disoluzioa erabiliz erdietsi zen. Azkenik, ebakiak hematoxilinaz kontrastatu (10 segundu), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50 (Olympus, Tokio, Japonia) mikroskopioari atxiki zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi ziren. Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa, argimikroskopioan konkateka zuzenaren bidez burutu zen. Liseri-epitelioan zelula BrdU-positiboen proportzioa antzemateko asmoz, lagin bakoitzean 1000 zelula zenbatu ziren, beste ikerketetan erabilitako lagin-tamainaren arabera (Okudela et al., 1999; Zaldibar et al., 2004). Aldez aurretik egindako behaketa histologikoek, liseri-epitelioaren tubulu moduko ebakidura bakoitzean gutxienez zelula daudela erakutsi zuten. Hori dela eta, eguneroko lana errazteko asmoz, zelula BrdUpositiboen zenbaketa aleatorioki hautatutako 40 tubulu moduko ebakiduretan burutu zen ( zelula) liseri-guruin bakoitzean. Halaber, eskuarki konduktu sekundarioen ebakidura bakoitzean zelulak agertzen direnez gero, zelula BrdUpositiboen zenbaketa 10 konduktu sekundarioen ebakiduretan burutu zen ( zelula). Horrek, 123

127 Emaitzak eta eztabaida laginaren tamaina egoki lortzearen eta konduktu sekundarioen zeharkako ebakidurak lortzearen zailtasunaren arteko konpromisozko erabakia suposatu zuen. Datuak adierazteko momentuan -ra pasatu ziren. Urdailean, kontaketa trantsektu bat eginez burutu zen, eta guztira 200 zelula zenbatu ziren epitelioan barrena. Zelula-kopuru baxuago hori, urdailean jarduera proliferatzailea oso handia dela egiaztatu ondoren hautatu zen. Datuak kasu honetan ere -ko balioetan eman dira, aurrekoekin konparagarriak izan ahal izateko. EMAITZAK Liseri epitelioko liseri-zelula zein zelula basofilikoek, BrdU-positibo ziren nukleoak erakutsi zituzten, nahiz eta zelula BrdU-positibo gehienak liseri-zelulak izan (1. Ird.). Urdaila, nukleo BrdUpositibo gehien erakutsi zituen organoa izan zen (1. Ird.). Tindaketaren kontrol-ebakietan ez zen inolako positibotasunik behatu (1. Ird.). Atariko esperimentuak BrdU-markaketari dagokionez, liseri-guruin eta urdaileko epitelioan patroi zirkamareal konparagarria ezagutu zen, seinale/zarata erlazioa urdailean txikiagoa izan arren. Beraz, liseriguruineko epitelioko BrdU-markaketa emaitzak soilik aurkeztuko dira hemendik aurrera. Eguneko pultsu-esperimentuan, muskuilu helduetan liseri-guruineko 33 zelulek BrdU markaketa aurkeztu zuten. Animali gazteetan, ordea, markaketa baxuagoa izan zen ( 21) (2A eta 2C Ird.). Liseri-epitelioaren BrdU-markaketaren kuantifikazioari dagozkion emaitzak, liseri-zelulen proliferazio-tasan gertatutako aldaketei egokitu zitzaizkien, zelula basofiliko BrdU-positiboak noizean behin soilik behatu baitziren. Termino kualitatiboetan, muskuilu gazte zein helduetan aldamolde bera aurkitu zen. Aldamoldea itsasaldierregimenak (IE) edo argia/iluntasuna zikloak (AIZ) gobernatua dagoen zehazteko asmoz, uretan murgiltzearen (itsasbeheratik itsasgoranzko bidea) eta aire-esposizioaren (itsasgoratik itsasbeherantz) uneetako batezbesteko BrdU-markaketa kalkulatu zen (1. Taula, 3. Ird). Helburu horretarako, eta esperimentua aurrera joan ahala behatutako BrdUmarkaketan beherakada kontuan hartuz, kalkuluak egiteko BrdU-pultsu osteko lehenengo 12 ordutako datuak baino ez ziren aintzat hartu. Batezbesteko BrdU-markaketaren balio altuena, gaueko murgiltze-aldian (marea altua) aurkitu zen muskuilu gazte zein helduetan; muskuilu gazteetan, gainera, eguneko murgilketa-aldian tarteko balioak erregistratu zirelarik (3. Ird.). Bi bidetako ANOVA analisiak muskuilu helduetan IE eta IE x AIZ faktoreek batezbesteko BrdU-markaketan eragin esangarria zutela adierazi zuten, muskuilu gazteetan, ordea, IE x AIZ elkarrekintza faktorerik esangarriena (p<0.05) suertatu zen (2. Taula). Gaueko pultsu-esperimentuan, muskuilu helduetan liseri-epitelioko zelulen 7-rarte BrdU-ko markaketa izatera iritsi zen, muskuilu gazteetan markaketa-pikoa altuagoa ( 12) izanik (2B eta 2D Ird.). Termino kualitatiboetan muskuilu gazte zein helduetan aldamolde bera aurkitu zen. Aldamoldea, itsasaldi-erregimenak (IE) edo argia/iluntasuna zikloak (AIZ) gobernatua den zehazteko asmoz, 124

128 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra 1. Irudia: BrdU positiboak diren nukleoen identifikazioa (geziak) unitate albeolotubularretako liseri-zeluletan, konduktuetan eta urdailean (A-D); D) konduktuko epitelio-zelula), A) unitate albeolotubularra, H) hemozitoa, BC) zelula basofilikoa, DC) liseri-zelula, S) urdaileko epitelio-zelula. Ebaki kontrolean ez da inolako zelula BrdU positiborik behatzen (E). Eskala-marra: 50 µm urera murgiltzearen eta aire-esposizioaren uneetako batezbesteko BrdU-markaketa kalkulatu zen, egunez zein gauez (1. Taula, 3. Ird.). Helburu horretarako, eta BrdU-pultsuaren ostean zein hurrengo egun argiko unean BrdU-markaketan piko nabarmenik behatu ez zelako kontuan hartuz, kalkuluak egiteko BrdU-pultsua eman eta 24 orduko osteko datuak baino ez ziren aintzat hartu. Batezbesteko BrdU-markaketa maximoa gauez behatu zen arren, bereziki muskulilu gazteetan, ez zen talde esperimentalen artean desberdintasun esangarririk topatu (3. Ird.). Honekin bat, bi bidetako ANOVA analisiak, muskuilu gazteetan BrdUmarkaketaren gainean efektu esangarria soilik AIZk zuela adierazi zuen. Muskuilu helduetan, bere aldetik, IE, AIZ eta beraien elkarrekintzek ez zuten efektu esangarririk eduki BrdU-markaketaren gainean (2. Taula). Esperimentu nagusiak Urte-sasoi, adin eta itsasaldi-erregimenaren efektua zelulen proliferazioaren gainean Urteko hiru sasoi, eta bi itsasaldi-erregimen desberdinetan hartutako bi adineko muskuiluen zelulen proliferazioa modu integratu batean konparatzeko hainbat parametro desberdin kalkulatu ziren (3. Taula). Orotariko BrdUmarkaketa/egun indizea pultsu osteko lehenengo 12 orduetan behatutako piko maximoan erregistratutako zelula BrdU-positiboen kopurua (A, 3. Taula), balio hau bikoiztuz 24 ordutako datuak islatzeko asmoz (B, 3. Taula) eta zuzenketa-faktore batez biderkatuz (C, 3. Taula) 3. Taulako balioak lortzeko estimatu ziren. Zuzenketa-faktorea, (ZF) aurreko esperimentuetan ez bezala (Zaldibar et al., 2004), BrdU-gehipena jarraia izan beharrean 6 125

129 Emaitzak eta eztabaida 2. Irudia: 2 egunez fotoperiodo (argitasun/iluntasun) naturalean mantendutako mareazpiko muskuiluen liseri-guruineko BrdU markaketa ( ± desbidazio estandarra) denboraren arabera (eguzki-denbora). (A) Eguneko pultsuko muskuilu gazteak. (B) Gaueko pultsuko muskuilu gazteak. (C) Eguneko pultsuko muskuilu helduak (D) Gaueko pultsuko muskuilu helduak. Geziek BrdU pultsua eman zitzaien ordua adierazten dute. Marra horizontalek, argiztapen-baldintzak (zuria, argitasun-tarteak; marraduna, ilunabar-tarteak; beltza, iluntasun-tarteak),eta esperimentua egin zeneko egunetako itsasaldi baldintzak (zuri, airean; marra ondulatuak, uretan adierazten dituzte).erabilitako ikurren forma eta trama desberdinek esangarriki desberdinak diren azpitaldeak adierazi dituzte, Duncan testaren arabera (p<0.05). orduko pultsua erabili zela kontuan hartuz aplikatu zen, konparazioak egiteko asmoz. ZF= 1.21 = GJ/PO. BrdU-markaketa/egun indizea = PO x 2 x ZF; non, ZF: Zuzenketa-faktorea; GJ: BrdU-gehipen jarraian lehenego 12 orduetan neurtutako zelula BrdU positiboak; eta PO: 6 orduko BrdU pultsu ostean llehenego 12 orduetan neurtutako zelula BrdU positiboak, baitiran. Azkenik, epitelioa bere osotasunean berriztatzeko beharrezkoa den denbora, egunetan (epitelio-berriztapen denbora; EBD) kalkulatu zen, aldez aurretik deskribatutako kalkuluetan oinarrituz (D, 3. Taulan). Liseri-guruineko jarduera proliferatzailea, nabarmenki aldatu zen sasoien artean, udan altuena izanik, eta itsasaldi-mailen artean (3. Taula). BrdU-markaketa/egun indizearen baliorik altuenak (C, 3. Taulan) udan erregistratu ziren; noiz liseri-guruineko epitelioaren EBD (D, 3. Taulan) adin eta itsasaldi-erregimenaren arabera 2 eta 6 aste bitartekoa izan baitzen. BrdU-markaketa/egun indizearen baliorik baxuenak, eta beraz EBD baliorik altuenak (6 hilabete inguru), udazkeneko mareazpiko muskuiluetan aurkitu ziren. Neguan, BrdU-markaketa/egun indizean ez zen desberdintasun esangarririk behatu itsasaldierregimenen artean, baina balioak apur bat 126

130 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra 1. Taula: Atariko esperimentuan ikertutako talde experimentaletako liseri-albeolotan egunez eta gabez zein airean edo uretan murgilduta egotean, muskuiluetan kuantifikatutako batezbesteko BrdU-markaketa + desbidazio estandarra. EGUNEKO PULTSUA HELDUAK GAZTEAK Airean Uretan Guztira AIREAN Uretan Guztira Eguna 1± ± ± ± Gaua 0.44± ± ± ± Guztira GAUEKO PULTSUA HELDUAK GAZTEAK Airean Uretan Guztira Airean Uretan Guztira Eguna 3.75± ± ±1.53 1± Gaua 2.42± ± ± ± Guztira handiagoak izan ziren muskuilu gazteetan helduetan baino (3. Taula). Udazkeneko marearteko eta mareazpiko muskuiluen artean desberdintasun harrigarriak behatu ziren, marearteko muskuiluetan zelulen proliferazioa garrantzitsua zen bitartean, mareazpiko muskuiluetan kasik ez baitzegoen. Udan bereziki, BrdU-markaketa/egun indizea, muskuilu helduetan gazteetan baino altuagoa izan zen (3. taula). Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamoldeak Neguko eta udazkeneko mareazpiko muskuiluetan, liseri-epitelioko zelulen proliferaziojarduera antzemanezina izan zen (3. Taula), beraz epitelio-zelulen berriztapenean ez zen inolako aldamolderik ageri. Aitzitik, desberdina izan arren, udako muskuiluetan zein udazkeneko mareazpiko muskuiluetan, zelulen proliferazioan aldamolde garbiak antzeman ziren (2A, 2C eta 4. Ird.). Marearteko eta mareazpiko muskuiluen artean proliferazioaren aldamolde desberdinak identifikatu zirela aipatzekoa da. Mareazpiko muskuiluek, bai heldu zein gazteek, BrdU-markaketaren aldamolde bera erakutsi zuten, atariko esperimentuetan (Eguneko pultsuesperimentua 2A eta 2C Ird.) deskribatu zen moduan. Hala ere, marearteko muskuiluen BrdUmarkaketaren aldamoldea arras desberdina izan zen, eguneko piko bakarra ageri baitzen eta BrdUmarkaketa balioak ez baitziren aldatu itsasgoran zehar, egunez ezta gauez ere (4. Ird.). Udan, liseriguruineko a BrdU-positiboak izan ziren. BrdU-markaketa, eguneko aire-esposizioan emendatzen zen (10:00 eta 12:00-ak bitartean), eta ia inolako aldaketarik gabe mantentzen zen aireesposizioko ilunabarreko ordua heldu arte (4A Ird.). 127

131 Emaitzak eta eztabaida Udazkenean, BrdU-markaketa maximoa ( 18.5), goizeko aire-esposizioari (gaua bukaera eta eguerdi bitartean zabaltzen zena) egokitu zitzaiona (08:00), eta berehala, berriz ere hurrengo murgiketa-aldia heldu aurretik, maila basaletara bueltatzen zen (4B Ird.). 3. Irudia: Atariko esperimentuan ikertutako talde experimentaletako liseri-albeolotan egunez eta gabez zein airean edo uretan murgilduta egotean, muskuiluetan kuantifikatutako batezbesteko BrdU-markaketa. (A) Eguneko pultsuko muskuilu helduak; (B) Gaueko pultsuko muskuilu helduak; (C) Eguneko pultsuko muskuilu gazteak; (D) Gaueko pultsuko muskuilu gazteak; (E) BrdU-gehipen jarraiko esperimentuan (Zaldibar et al., 2004) lortutako batezbesteko BrdU-markaketa. Segmentu bertikalek errore estandarra adierazten dute. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. EZTABAIDA Mareazpiko eta marearteko muskuiluak alderatzeko BrdU-pultsuaren aukeraketa Eguneko pultsu-esperimentuan, BrdUmarkaketa gaueko murgilketa-aldian behatu zen muskuilu gazte zein helduetan, eguneko murgilketa-aldian tarteko balioak behatuz. Muskuilu gazteetan itsasaldi erregimena efektu esangarria 128

132 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra 2. Taula: Atariko esperimentuan, esperimentu nagusian eta argitaratutako BrdU-pultsu jarraia (Zaldibar et al., 2004) izan duten muskuiluetan itsasaldi-erregimenak, argia/iluntasuna zikloak zein beraien arteko elkarrekintzak duten eragina finkatzeko egindako bi bideetako ANOVA-ren laburpena. p(f), Fisher ratioaren probabilitatea. Estatistikoki esangarriak gertatu ziren desberdintasunak (p<0.05) asterisko batez adierazita daude. EGUNEKO PULTSUA Helduak Gazteak Askatasun-graduak F p(f) Itsasaldierregimena * (IE) Argia/iluntasuna zikloa (AIZ) IE x AIZ * Barne-errorea Itsasaldierregimena (IE) Argia/iluntasuna zikloa (AIZ) IE x AIZ Barne-errorea GAUEKO PULTSUA Helduak Gazteak PULTSU JARRAIA Helduak Askatasun-graduak F p(f) Itsasaldierregimena (IE) Argia/iluntasuna zikloa (AIZ) IE x AIZ Barne-errorea Itsasaldierregimena (IE) Argia/iluntasuna * zikloa (AIZ) IE x AIZ Barne-errorea Askatasun-graduak F p(f) Itsasaldierregimena * (IE) Argia/iluntasuna zikloa (AIZ) IE x AIZ Barne-errorea 2159 MAREARTEKO MUSKUILUAK Uda Udazkena Askatasun-graduak F p(f) Itsasaldierregimena (IE) Argia/iluntasuna zikloa (AIZ) IE x AIZ Barne-errorea Itsasaldierregimena (IE) Argia/iluntasuna zikloa (AIZ) IE x AIZ Barne-errorea

133 Emaitzak eta eztabaida 4. Irudia: 2 egunez fotoperiodo (argitasun/iluntasun) eta erregimen mareal (airean/uretan) naturalean mantendutako muskuiluen liseri-guruineko BrdU markaketa ( ± desbidazio estandarra) denboraren arabera (eguzki-denbora). (A) udako marearteko muskuilu handiak, (B) udazkeneko marearteko muskuilu handiak. Geziek BrdU pultsua eman zitzaien ordua adierazten du. Marra horizontalek, argiztapen-baldintzak (zuria, argitasuntarteak; marraduna, ilunabar-tarteak; beltza, iluntasun-tarteak), eta erregimen mareala (uhinak, uretan murgilduta) adierazten dituzte. Erabilitako ikurren forma eta trama desberdinek esangarriki desberdinak diren azpitaldeak adierazi dituzte, Duncan testaren arabera (p<0.05). eragin zuen BrdU-markaketan; muskuilu helduetan, ordea, itsasaldi-erregimena eta argi/iluntasun zikloaren interakzioa esangarria izan zen. Aldamolde hori, BrdU-pultsu jarraia jaso zuten mareazpiko muskuilu handietan behatutakoaren antzekoa izan zen (Zaldibar et al., 2004). Seguru asko, 6 ordutako pultsuaren ostean suertatutako BrdUren eskuragarritasunaren beherakadak, etengabeko BrdUren gehipenaren kasuan (Zaldibar et al., 2004) ez bezala, BrdUren pultsua eman eta 12 ordutara proliferazio zelularrean aldamolde zirkamareala zergaitik desagertuz joan zen azalduko luke. Bereziki muskuilu helduen kasuan, zeintzuetan, BrdU-markaketa bortitzagoa izanik (piko maximo altuagoak), BrdU-ren hornidura mugatua gazteetan baino kritikoagoa suertatuko litzatekeen. Baldintza horietan, esperimentu honetan zeharreko BrdU-maila eskuragarriak muskuiluentzat baxuak izatea litekeena da (Potten et al., 1992, Candia Carnevali et al., 1997); hala ere, BrdU kontzentrazio ez kaltegarriak erabili beharrak alde batetik (ikusi Zaldibar et al., 2004), eta esperimentu nagusi hauetan ikertu nahi genituen marearteko muskuiluak uretan BrdU pean mantentzeko denbora mugatuak bestetik, diseinu esperimentalaren nondik norakoak agindu zizkiguten. 130

134 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra 3. Taula: Esperimentu nagusiaren talde esperimentaletako muskuiluen liseri-albeolotan kuantifikatutako batezbesteko BrdUmarkaketaren laburpena. (A) Lehendabiziko 12 ordutan eskuratutako BrdU-markaketaren piko maximoa. (B) 24 ordutan S-fasean sartuko liratekeen zelulak egunero 2 piko ematen direla kontutan hartuta. (C) BrdU-pultsu jarraiako esperimentuaren datuak (Zaldibar et al., 2004) kontutan hartuta eta zuzenketa-faktorea sartu eta gero, egunero S-fasean sartuko liratekeen zelula kopuru teorikoa. (D) Liseri-epitelioa osoa berriztatzeko beharrezkoa liratekeen egun kopurua.. N E G U A GAZTEAK HELDUAK A B C D A B C D MAREARTEKOA MAREAZPIKOA U MAREARTEKOA D A MAREAZPIKOA U D A Z K E N A MAREARTEKOA MAREAZPIKOA Gaueko pultsu-esperimentuan behatutako zelulen proliferazioaren aldamoldea desberdina izan zen. BrdU-markaketa, soilik gauez emendatu zen modu esangarrian, elkarren segidako bi piko maximo emanez. Egunez (argialdia) aldiz, soilik maila basalak neurtu ziren, baita BrdU-pultsua eman eta ondorengo laginketetan ere. Izan ere, BrdU-markaketa baliorik baxuenak pultsua eman osteko orduetan izatea deigarria da; zeren eta eguneko pultsu-esperimentuan BrdU-markaketa maximoak BrdU-pultsuaren osteko lehen momentuetan, erregistratu ziren. Ugaztunetan, liseri-traktuko epitelioaren proliferazio zelularra gauez gertatzearen berri eman dute zenbait ikerlanek (Scheving et al., 1978; Smaaland, 1996). Molusku itsastarretan, prozesu zelular batzuk nagusiki gabez eta beste batzuk nagusiki egunez gertatzen direla deskribatu den arren (Levy et al., 1994), muskuiluetan liseri-zelulen proliferazioak aldamolde zirkamareala jarraitzen duela demostratu da (Zaldibar et al., 2004). Ildo horretatik, emaitzok itsasaldia zelulen proliferazio-zikloa gobernatzen duen faktore nagusia dela adierazi duten arren, fotoperiodoak, neurri batean behintzat, zelulen proliferazio-prozesuak modula ditzakeela dirudi. Dena den, fotoperiodoaren eragina BrdU-hornidura mugatuak sortutako artefaktuaren ondorio soila ere izan liteke. Eguneko pultsu-esperimentuan, IE x AIZ elkarrekintza esangarria suertatu zeneko animalia helduetan, piko maximoak handiagoak izan ziren eta lehendabiziko argialdian zehar erregistratu ziren, BrdU-ren pultsuaren osteko lehen laginketetan. Ikerlan honetako eta baldintza esperimental berdinetan burututako BrdU-pultsu jarraian lortutako emaitzak alderatzeko, egunez zein gauez 131

135 Emaitzak eta eztabaida lortutako murgilketa- eta aire esposizio-aldietako, eta batezbesteko BrdU-markaketa balioak kalkulatu ziren Zaldibar et al., (2004) BrdU pultsu jarraiko esperimentuan lortutako datuetatik abiatuz eta ikerlan honetan aplikatutako kalkuluetan oinarrituz (1. eta 2. Taulak, 3E Ird.). Eguneko pultsuesperimentuko gazteetan gertatzen den moduan, batezbesteko BrdU-markaketan soilik itsasaldierregimenak eragiten du modu esangarrian. Ondorioz, atariko bi esperimentuen emaitzak kontuan hartuz, esperimentu nagusia burutzeko eguneko pultsu-esperimentuaren prozedura jarraitzea erabaki zen bi arrazoi nagusi hauek direla eta: (a) eguneko pultsu-esperimentuan BrdUmarkaketa handiagoa erregistratu zen, eta (b) eguneko pultsu-esperimentuan aurkitutako aldamoldeak, aldez aurretik BrdU-gehipen jarraia aplikatu zeneko esperimentuan aurkituriko aldamoldearen (Zaldibar et al., 2004) antz gehiago du. Sasoiaren eragina epitelioko zelulen berriztapenean Zelulen proliferazio-tasen baliorik altuenak udan gertatu ziren. Muskuiluen liseri-guruinean urteko sasoiaren arabera aldaketak behatu dira, entzimen jardueran (Cancio & Cajaraville, 1999; Le Pennec & Le Pennec, 2002), lipido-edukietan (Pazos et al., 2003), parametro peroxisomikoetan (Cancio et al., 1999) zein liseri-zelulen lisosomen egituran (Etxeberria et al., 1994). Tenperatura epelagoak eta eurei lotutako egokitze termikoak zein elikagaien presentzia areagotua, liseri-epitelioko dinamikan oso garrantzitsuak izan daitezke, liseri-epitelioaren aktibazioa emanez. Beraz, udako liseri-epitelioko zelulen proliferazio-tasa areagotua, alga- eta fitoplankton-bloom-ek sortarazitako elikagaien eskuragarritasun handiagoarekin erlazionatuta egon daiteke, muskuiluen hazkuntza somatikoaren emendioa ekar dezakeena. Are gehiago, udako jarduera metabolikoaren igoerak zelulak kaltetzea eta zelulen berriztapena handitzea sortu izana ere posible da, izan ere, neguko muskuiluekin alderatuz udakoen ehunetan DNA-harizpi matxuratu- eta proteinen desnaturalizazio-tasa altuagoak ikusi baitira (Hofmann & Somero, 1996; Shaw et al., 2000). Beraz, liseri-guruinean zelulen proliferazio areagotua, epitelioaren berriztapen eta egituren mantenuarekin zein hazkuntza somatikoarekin erlazionatuta egongo litzateke. Era berean, udazkenean eta neguko azken hilabeteetan, tenperaturaren eta elikagaien eskuragarritasunaren jaitsierek, eta honekin batera jarduera metaboliko, kalte zelular eta zelulen berriztapenaren jaitsierek ikerlan honetan behatutako proliferazio-tasa txikituak azalduko lituzkete. Halaber, Japoniako itsasoko Cremomytilus grayanus espeziearen liseritraktuan ere, Leibson & Frolova-k (1994) zelulen proliferazio-tasaren urteko sasoiarekin erlazionatutako aldaketa esangarriak topatu zituzten, zelulen proliferazioaren piko maximoak maiatza-ekaina aldean eta piko minimoak otsailamartxoan topatu zituztelarik. Autore hauek, zelulen proliferazioaren jaitsiera, neguko hilabeteetako tenperatura baxuek eragindako jarduera metaboliko eta elikadura-jarduera gutxituei egotzi zieten. 132

136 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra Adinarekin erlazionatutako aldaketak epiteliozelulen berriztapenean Aldez aurretik PCNA immunohistokimika erabiliz muskuilu gazteen liseri-guruinak helduena baino proliferazio-jarduera altuagoa zuela erakutsi arren (Marigómez et al., 1999), ikerlan honetan ez da halakorik behatu. Izatez, muskuilu gazte eta helduek antzeko proliferazio-tasak erakutsi zituzten. Are gehiago, udan, BrdU-markaketa/egun indizea muskuilu helduetan gazteetan baino altuagoa izan zen. PCNA eta BrdUren sentikortasunak desberdinak izatea (Sarli et al., 1995; Muskhelishvili et al., 2003), emaitza eztabaidatsu hauek azaldu lituzke. Are gehiago, PCNAren kasuan ez bezala, BrdU-markaketa, pultsu osteko BrdUren eskuragarritasunaren araberakoa izango litzateke, eta hori gazte eta helduen artean desberdina izan liteke, muskuiluetan adinarekin alda daitezkeen elikadurajarduera, asimilazio-eraginkortasun eta beste prozesu fisiologikoen menpean egonik (Thompson et al., 1974; Bayne et al., 1976). Beraz, uretango pultsu berak ez du ziurtatu behar muskuilu gazte eta helduek BrdUren kopuru bera eta momentu berean jaso behar dutenik. Haatik, termino kualitatiboetan behintzat, muskuilu gazte eta helduek aldamolde patroi bera erakutsi zuten, liseriepiteliora heldutako BrdUren kopurua faktore mugatzaile nagusietakoa ez zela izan iradoki zuena. Are gehiago, PCNAren bidez lortutako emaitzak immunoblotetan oinarritu ziren, ikerlan honetan lortutako BrdUren emaitzek immunohistokimika oinarri duten bitartean. Ezin daiteke baztertu, PCNA immunohistokimika aplikatu ondoren, Marigomez et al.-ek, (1999) aurkitu zituzten desberdintasunak, liseri-guruineko epiteliozelulen proliferazio-tasaren arteko desberdintasunei baino gehiago, homogeneizatuan zeuden beste zelula-mota batzuei egokitzea. BrdU bidez lortutako emaitza, berriz, liseri-zelulen jarduera proliferatzailearekin zuzenean erlazionatuta egongo litzateke. Itsasaldi-erregimenaren eragina epitelioko zelulen berriztapenean Marearteko muskuiluetan, aire-esposizio aldian S-fase gehiago erregistratu ziren, baina uretan murgildutakoan ez zen BrdU-markaketan jeitsierarik behatu. Horrek, murgilketa zein aireesposizio aldietan, DNA erreplikapenak, aurrera darraiela esan lezake, baina zatiketa zelularra nagusia da animaliak airera esposatuak dauden bitartean. Badirudi zelulen zatiketa ezingo zela inoiz marea altuan gertatu jatearekin batera, DNAren sintesia jatearekin batera eman litekeen bitartean. Jatearen eta bestelako zenbait jarduera fisiologiko garrantzitsuen arteko denboraren bereizketa molusku itsastarren kasuan aski deskribaturik dago (Susswein et al., 1983). Bestalde, marearteko organismoek euren bide metabolikoak egunero birritan aldatu beharrean topa daitezke, hipoxiaren aldi luze zein laburrak jasateren ondorioz. Hori, beherakada metabolikoen bitartez lortzen da, bai energia lortzeko bide anaerobikoak aktibatuz zein transkripzioaren eraenketa edota proteinen fosforilazio itzulgarrien bidezko entzima-jardueraren aldaketaz erdietsi daitekeena (Greenway & Storey, 2000; Ton et al., 133

137 Emaitzak eta eztabaida 2003; David et al., 2005; Papandreou et al., 2005). Oxigenoaren eskaera modu egokian ez hornitzekotan, zelulen kopurua ere txikitu beharra dago, beraz, hipoxiarekiko erantzuna, ziklo zelularraren gelditze edo eta apoptosiaren indukzio gisa deskriba daiteke (Ton et al., 2003; Papandreou et al., 2005), ornodunetan hipoxiak induzitutako faktorea (HIF-1) izeneko transkripzioaren suspertzaile baten kontrolpean suertatzen dena (Gracey et al., 2001, Ton et al., 2003; Papandreou et al., 2005). Airean egoteak eta ondorengo hipoxiak, edo uretan murgiltzearen ondorengo beroxigenatzeak, DNAren erreplikapen eta prozesu mitotikoen geldiaraztea sor izana aintzat har genezake, baina, dirudienez hori ez da ikerlan honetan behatu dena. Bi prozesuok, zelulei BrdU berriaren eskuratzearen gutxitzea lekarkieke eta baita uretan murgilduta egon bitartean S-faseari ekin zioten zeluletako BrdU-markaketa metatzea ekarri, eta hori ikerlan honetan ez da behatu. Ildo beretik, eta HIF-1 tankerako proteina bat Crassostrea virginica marearteko moluskuan identifikatu den arren (NCBI, CD648099), hipoxia larriaren ondorioz azpi eta gainadierazitako zenbait gene Crassostrea gigas-en aztertu dituen ikerlan berriago batek (David et al., 2005), ez du zelulen proliferazio-prozesuan inolako eraenketaren berririk eman, ezta areagotutako apoptosi-erantzunarena ere. Edozein kasutan, ornodunetan gertatzen den modu berean, moluskuen neuronetan ere, hipoxiabaldintzek apoptosia piz dezaketela proposatu da (Jonas et al., 2005; Papandreou et al., 2005). Itsasbehera izan bitartean (6 ordu bakarrik) airean egotea areagotutako apoptosi-erantzuna eragitea ez da litekeena; baina, hori gertatzekotan, zelulen berriztatze altuago hori, ikerlan honetan behatutako marearteko indibiduoen liseri-guruineko zelulen proliferazio gaitasun areagotuarekin orokorrean erlaziona liteke. Edonola ere, marearteko muskuiluak mareazpikoekin konparatu direnean ehunetan areagotutako kalte-zelularra eta proteinen desnaturaltzea behatu dira (Hofmann & Somero, 1995). Aerobiosi/anaerobiosi baldintzez gain, elikatzejarduera ere, muskuilu itsastarren fisiologia eragiten duen faktore nagusienetarikoa da. Itsasaldierregimenak, muskuiluen liseri-epitelioaren forma eta funtzioan berebiziko eragina du, jarraiki (mareazpiko muskuiluak) edo txandaka (mareartekoak) jaten duten arabera liseri-epitelioak modu desberdinean funtzionatzen baitu (Owen, 1972, Robinson et al. 1981; Izagirre, 2002). Hala ere, itsasaldia eta fotoperiodoa estuki erlazionaturik daude, bibalbioen elikatze-jarduerari dagokionez behintzat. Animaliak, batez ere egunez elikatzen dira, fotosintesia dela eta, algak ur-zutabean nagusiki egunez agertzen baitira. Beraz, gaua endekatutako epitelioa berrizta daitekeen unea dugu. Mareateko muskuiluen kasuan, DNAren bikoizpena edozein momentutan gerta daiteke, baina mitosiak muskuiluak airera esposaturik daudenean soilik suertatzen dira, jaten ez dauden bitartean, hain zuzen. Are gehiago, liseri-guruineko epitelioa dinamikoa da oso, eta berau osatzen duten bi zelulen profila, kopurua zein edukia, elikagai eta ingurumen baldintzen arabera ordu gutxiren buruan bortizki alda daitezke (Thompson et al., 1974; Soto & Marigómez, 1997; Syasina et al., 134

138 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra 1997). Ildo beretik, itsasbeheran elikatze-tasa eta xurgapen-efizientzia emendatzen dira (Wong & Cheung, 2001), eta liseri-entzima ugarien jarduerak ur-azpian suspertzen dira (Fernandez-Reiriz et al., 2001). Honela, elikatze-tasak eta entzima-jarduerak doituz, xurgapena egonkor manten daiteke (Wong & Cheung, 2001). Liseri-epitelioaren berriztapena elikatze-ziklo bakoitzarekin batera burutzen dela iradoki da, hau da, marearteko muskuiluetan birritan egunero (Nelson & Morton, 1979). Horrela, mareazpiko muskuiluetan liseri-zelulen proliferazioak aldamolde zirkamareala darraien bitartean (Zaldibar et al. 2004; ikerlan honetako emaitzak), marearteko muskuiluetan, pairatu beharreko baldintza mugatuagoak direla eta, itsasaldiak eta fotoperiodoak liseri-zelulen proliferazioa agindu lezakete, eta, ondorioz, BrdUmarkaketen emendioa egunean behin eta bortizki gertatuko da. Ondorioak Talde esperimentalen arteko desberdintasun nabarmenenak itsasaldi-erregimen eta urteko sasoiaren aldaketekin antzeman dira. Azken finean, ez dirudi adinak proliferazio-aldamoldean eragin handiegirik duenik. Areagotutako jarduera metabolikoa dela eta, uda hazkuntza somatiko gehien edo zelulen berriztapen-tasa altuagoa duen sasoia dela ondorioztatu dugu, muskuilu gazte zein helduek antzeko proliferazio-aldamoldea erakutsiz. Bestalde, itsasaldi-erregimen desberdina duten muskuiluen artean desberdintasun handiak daude, baina, oro har, liseri-epitelioan zelulen proliferazioa liseriketa bukatutakoan gertatu behar da. BIBLIOGRAFIA Bayne BL, Widdows J, Thompson RJ (1976) Physiology I orr. Non: Marine mussels, their ecology and physiology. Bayne BL (ed). Cambridge University Press. Cambridge. Cancio I, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of xanthine oxidoreductase activity in the digestive gland cells of the mussel Mytilus galloprovincialis: A biochemical, histochemical and immunochemical study. Biol. Cell 91: Cancio I, Ibabe A, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of peroxisomal enzyme activities and peroxisomal structure in mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C 123: Candia Carnevali MD, Bonasoro F, Biale A (1997) Pattern of bromodeoxyuridine incorporation in the advanced stages of arm regeneration in the feather star Antedon mediterranea. Cell Tiss. Res. 289: David E, Tanguy A, Pichavant K, Moraga D (2005) Response of the Pacific oyster Crassostrea gigas to hypoxia exposure under experimental conditions. FEBS J. 272: Etxeberria M, Sastre I, Cajaraville MP, Marigómez I (1994) Digestive lysosome enlargement induced by experimental exposure to metals (Cu, Cd and Zn) in mussels collected from a zinc polluted site. Arch. Environ. Toxicol. 27: Fernandez-Reiriz MJ, Labarta U, Navarro JM, Velasco A (2001) Enzymatic digestive activity in Mytilus chilensis (Hupe 1854) in response to food regimes and past feeding history. J. Comp. Physiol. 171: Gracey AY, Troll JV, Somero GN (2001) Hypoxia-induced gene expression profiling in the euryoxic fish Gillichthys mirabilis. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 98: Greenway SC, Storey KB (2000) Seasonal change and prolonged anoxia affect the kinetic properties of phosphofructokinase and pyruvate kinase in oysters. Comp. Biochem. Physiol. B 170: Hofmann GE, Somero GN (1996) Interspecific variation in thermal denaturation of proteins in the congeneric mussels Mytilus trossulus and M. galloprovincialis: Evidence from the heat-shock response and protein ubiquitination. Mar. Biol. 126:

139 Emaitzak eta eztabaida Izagirre U (2002) Itsasaldien, sasoien, elikadura-erregimenen eragina liseri-zelulen lisosometan eta euren kutsatzaileekiko erantzunetan. Lizentziatura-Tesia. 78 orr. Jonas EA, Hickman JA, Hardwick JM, Kaczmarek LK (2005) Exposure to hypoxia rapidly induces mitochondrial channel activity within a living synapse. J. Biol. Chem. 280: Leibson, N.L & Frolova, L.T Winter-spring essential reorganization of cell proliferation in the digestive tract epithelia in the mussel Crenomytilus grayanus. Mar. Biol. 118: Le Pennec, G & Le Pennec, M Molecular analysis of the seasonal expression of genes coding for different functional markers of digestive gland of the bibalve mollusk Pecten maximus (L). Comp. Biochem. Physiol B 133: Levy M, Weller A, Susswein AJ (1994)Learned changes in the rate of respiratory pumping in Aplysia fasciata in response to increases and decreases in seawater concentration. Behav. Neurosci. 108: Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical localisation of proliferating cells in mussel digestive gland tissue. Histochem. J. 31: Muskhelishvili L, Latendresse JR, Kodell RL, Henderson EB (2003) Evaluation of cell proliferation in rat tissues with BrdU, PCNA, Ki-67(MIB-5) immunohistochemistry and in situ hybridization for histone mrna. J. Histochem. Cytochem. 51: Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial renewal in the digestive gland tubules of the marine prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 45: Okudela K, Ito T, Kameda Y, Nakamura N Kitamura H (1999) Immunohistochemical analysis for cell proliferation-related protein expression in small cell carcinoma of the esophagus; a comparative study with small cell carcinoma of the lung and squamous cell carcinoma of the esophagus. Histol. Histopathol. 14: Owen G (1972) Lysosomes, peroxisomes and bivalves. Sci. Prog. Ser. Oxf. 60: Papandreou I, Powel A, Lim AL, Denko N (2005) Cellular reaction to hypoxia: sensing and responding to an adverse environment. Mut. Res. 569: Pazos AJ, Sánchez JL, Román G, Pérez-Parallé ML, Abad M (2003) Seasonal change in lipid classes and fatty acid composition in the digestive gland of Pecten maximus. Comp. Biochem. Physiol. B 134: Potten CS, Kellet M, Rew DA Roberts SA. (1992) Proliferation in human gastrointestinal epithelium using bromodeoxyuridine in vivo: data for different sites, proximity to a tumour, and polyposis coli. Gut 33: Robinson WE, Pennington MR, Langton RW (1981) Variability of tubule type within the digestive glands of Mercenaria mercenaria L., Ostrea edulis L., Mytilus edulis L. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 54: Sarli G, Benazzi C, Preziosi R, Marcato PS (1995) Assessment of proliferative activity by anti-pcna monoclonal antibodies in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and correlation with mitotic index. Vet. Pathol. 32: Scheving LE, Burns ER, Pauly JE, Tsai T (1978) Circadian variation in cell division of the mouse alimentary tract, bone marrow and corneal epithelium. Anat. Rec. 191: Smaaland R Circadian rhythm of cell division. Prog. Cell Cycle Res. 2: Shaw JP, Large AT, Livingstone DR, Doyotte A, Renger J, Chipman JK, Peters LD (2000) Elevation of cytochrome P450-immunopositive protein and DNA damage in mussels (Mytilus edulis) transplanted to a contaminated site. Mar. Environ. Res. 54: Soto M, Marigómez I (1997) Metal bioavailability assessment in mussel-watch programmes by automated image analysis of autometallographical black silver deposits (BSD) in digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156: Susswein AJ, Gev S, Feldman E, Markovich S (1983) Activity patterns and time budgeting of Aplysia fasciata under field and laboratory conditions. Behav. Neural Biol. 39: Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) Morphological alterations in the digestive diverticula of Mizuhipecten yessoensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 44: Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starvation on structure and function in the digestive gland of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Assess. U. K. 54: Ton C, Stamatiou D, Liew CC (2003) Gene expression profile of zebrafish exposed to hypoxia during development. Physiol. Genom. 13:

140 Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra Wong WH, Cheung SG (2001) Feeding rhythms of the greenlipped mussel, Perna viridis (Linnaeus, 1758) (Bivalvia: Mytilidae) during spring and neap tidal cycles. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 257: Zaldibar B, Cancio I, Marigómez I (2004) Circatidal variation in epithelial cell proliferation in the mussel digestive gland and stomach. Cell Tiss. Res. 318:

141 Emaitzak eta eztabaida 138

142 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean Laburpena: Littorina littorea magurio itsastarren zelula basofilikoen proliferazioa eragiteko 1.25 mg Cd/l pean jarri ziren 21 egunez. Ondoren, magurioak itsas-ur garbitan 10 egunez arazten utzi ziren, zelulamoten ordezkapena itzulgarria zen antzemateko. Liseri-guruinak, Carnoy fixatzailean fixatu eta analisi histologikoak egiteko parafinan inkluditu ziren. Zelula basofilikoen (Vv BAS ) eta liseri-zelulen (Vv DIG ) dentsitate bolumetrikoa kuantifikatzeko hematoxilina eosinaz tindatutako ebakien gainean analisi estereologikoak burutu ziren. Zelulen tamaina eta kopuru absolutua estimatu ondoren, behatutako aldaketek liseri-zelulen galerari eta aldi bereko zelula basofilikoen hipertrofiari egotzi zitzaien, eta ez zelula basofilikoen kopuruaren emendioari. Hamar egunetako arazketa-aldiaren ondoren zelula-moten osaketa eta tamaina kasik balio normaletara itzuli ziren. PCNA immunohistokimikak, Cd pean egondako eta arazketa taldeko magurioen liseri-epitelioan kontrolean baino liseri-zelula proliferatzaile gehiago zeudela erakutsi zuen. Hau da, liseri-zelulen galera netoak liseri-zelulen proliferazioaren areagotzearekin bat zetorrela iradoki du, zelula basofilikoen ekarpenak zerikusirik ez zuen bitartean. Beraz, Cd pean egoteak, Cd-aren detoxifikazioa burutzeko liseri-zelulen berriztapena areagotuko zuela dirudi. Autometalografia (AMG) bitartez errebelatzen diren zilarrezko hauspeakin beltzak (BSD; ingeleraz, black silver deposits), nagusiki Cd ioien inguruan eratuak, liseri-zelulen lisosometan agertu ziren, zelula basofilikoetan BSDen presentziarik behatu ez zen bitartean. Arazketa-aldia burutu eta gero BSD ez ziren horren nabarmenak izan. Liseri-zelulen lisosometan gertatutako aldaketak kuantifikatzeko, kriostatoko ebakien gainean ß- glukuronidasa jardueraren erakusketa histokimikoa gauzatu zen. Gerora, eta irudi-analisi automatizatuaren laguntzaz liseri-lisosometan gertatutako aldaketak neurtu ziren. Cd pean mantendutako magurioetan handiagotutako lisosomak behatu ziren, arazketa-aldiaren hamar egunak eta gero berriro ere kontrolen balioetara itzuliz. Liseri-zelulen proliferazioan ikusitako aldaketek, liseri-zelulen galerak eta zelula basofilikoen hipertrofiak, ez zuten ikerlan honetan erabilitako esposiziozko (BSD) eta efektuzko (erantzun lisosomikoak) biomarkatzaileen gainean eragin nabarmenik eduki. Gako-hitzak: zelula-moten ordezkapena, magurioa, kadmioa, PCNA, liseri-guruina, efektu- eta esposizio-biomarkatzaileak. 139

143 Emaitzak eta eztabaida Reversible cell-type replacement in the digestive gland epithelium of the marine mollusc Littorina littorea exposed to cadmium Abstract: Marine winkles Littorina littorea were exposed to 1.25 mg/l Cd for 21 days to provoke the proliferation of basophilic cells. Then, animals were depurated in clean seawater for 10 days to determine whether CTR was reversible. Digestive glands were fixed in Carnoy and paraffin embedded for histological analysis. The volume densities of basophilic cells (Vv BAS ) and digestive cells (Vv DIG ) were calculated by stereology on haematoxylin-eosin stained sections. Vv BAS raised and Vv DIG decreased in Cd exposed animals. After estimation of cell size and absolute cell numbers, these changes were attributed to digestive cell loss and concomitant basophilic cell hypertrophy but not to increased numbers of basophilic cells. The cell type composition and cell size almost fully returned to normal values after 10 days depuration. Accordingly, PCNA immunohistochemistry demonstrated that proliferating digestive cells were more abundant in winkles exposed to Cd and after 10 day depuration than in control specimens, suggesting that net digestive cell loss was accompanied by increased digestive cell proliferation and that CTR was not related to any contribution by basophilic cells. Thus, Cd-exposure seems to provoke an enhanced digestive cell turnover in order to cope with Cd detoxification. Autometallography revealed the presence of black silver deposits (BSD), most likely formed around Cd ions, in digestive cell lysosomes whereas basophilic cells appeared devoid of them. After depuration, BSD were less conspicuous. Changes occurring in digestive cell lysosomes were quantified by automatized image analysis on cryostat sections stained to demonstrate ß- glucuronidase activity. Enlarged lysosomes were observed in Cd-exposed winkles while return to control levels ocurred after 10 days depuration. Changes in digestive cell proliferation, digestive cell loss and basophilic cell hypertrophy did not apparantly affect the exposure (BSD) and effect (lysosomal responses) biomarkers investigated herein. Key Words cell-type replacement, winkle, cadmium, PCNA, digestive gland, effect and exposure biomarkers. 140

144 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. Sustitución reversible de tipos celulares en el epitelio de la glándula digestiva del molusco marino Littorina littorea expuesto a cadmio Resumen Bígaros marinos Littorina littorea fueron expuestos a 1.25 mg/l de Cd durante 21 días con el fín provocar la proliferación de células basofílicas. Posteriormente, los animales se depuraron por un período de 10 días en agua de mar limpia con el fin de observar si el recambio de tipos celulares era reversible. Las glándulas digestivas se fijaron en Carnoy fueron incluídas en parafina. La densidad volumétrica de células basofílicas (Vv BAS ) y células digestivas (Vv DIG ) se calculó mediante estereología en muestras teñidas con hematoxilina-eosina. En los bígaros expuestos a Cd se observó un aumento en los valores Vv BAS y un descenso en los valores Vv DIG. Después de estimar el tamaño y el número absoluto de células, éstos cambios se atribuyeron a la pérdida de células digestivas y a la hipertrofia concomitante de las células basofílicas, y no al aumento de éstas. Después del período de 10 días de depuración, la composición de tipos celulares y el tamaño de las células volvieron a valores cercanos a los normales. La inmunohistoquímica de PCNA demostró que la proliferación de células digestivas era mayor en los bígaros expuestos a Cd y después de 10 días de depuración que en los bígaros control, sugiriendo que la pérdida neta de células digestivas viene acompañada por el aumento en la proliferación de células digestivas y no tiene relación alguna con la contribución de las células basofílicas. Por lo tanto, la exposición a Cd parece provocar una renovación aumentada de células digestivas. Los depósitos negros de plata (BSD; del inglés, black silver deposits) mayormente formados alrededor de los iones de Cd y revelados mediante autometalografía se localizaron en los lisosomas de las células digestivas, mientras que no se detectaron en las células basofílicas. En el grupo de los bígaros depurados los depósitos fueron menos llamativos. Se midieron los cambios ocurridos en los lisosomas de las células digestivas mediante análisis de imagen sobre muestras de criostato, previamente teñidas para la demostración de la enzima ß- glucuronidasa. Se observó un mayor tamaño de lisosomas en los bígaros expuesto a Cd, que volvieron a los valores controles después de los 10 días de depuración. Los cambios en la proliferación de células digestivas, la pérdida de células digestivas y la hipertrofia de células basofílicas no tuvieron efecto sobre los biomarcadores de exposición (BSD) y efecto (respuestas lisosómicas) empleados en este trabajo. Palabras clave: sustitución de tipos celulares, bígaro, cadmio, PCNA, glándula digestiva, biomarcadores de efecto y exposición. 141

145 Emaitzak eta eztabaida 142

146 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. SARRERA Moluskuen liseri-guruina ingurumen-toxikologia ikerketetarako itu-organoa da; izan ere,kutsatzaileen metaketa eta detoxifikazioan parte hartzen du (Marigómez et al., 2002). Orokorrean, molusku gehienen liseri-guruina antzeko antolaketa-eredua aurkezten du; hots, liseridibertikulua epitelio bakun batez osaturik dago eta bertan bi zelula-mota agertzen dira, liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia (Morton, 1983). Liserizelulek, elikagaien liseriketa intrazelularrean parte hartzen dute, eta oso sistema endo-lisosomiko garatua dute; zelula basofilikoak, bestalde, zelula jariatzaileak dira, eta gastropodotan pikor mineralizatu zitoplasmatikoak izan ditzakete (Mason, 1983). Baldintza fisiologiko normaletan, liseri-zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak dira, baina estres-egoera desbedinetan, zelula basofilikoen proportzio erlatiboa emendatzen da, fenomeno hau zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell type replacement) izenarekin ezaguna delarik (Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990). Zelula-moten ordezkapena, kutsatzaileen eragin pean egondako taxon desberdineko eta habitat desberdineko moluskuetan ematen den fenomeno orokorra da (Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; 1996). Kutsatzaile organiko (Cajaraville et al., 1990a) zein metaliko (Soto & Marigómez, 1997a; 1997b) desberdinen kontzentrazio subletalen pean jarritako bibalbioek, nagusiki zelula basofilikoz osatutako liseri-guruina aurkezten dute. Modu berean, laborategian Cd pean jarritako gastropodo itsastarrek, zelula basofiliko hipertrofiatuz osatutako liseri-tubuluak aurkezten dituzte (Marigómez et al., 1990). Zelula basofilikoen kopuru erlatiboaren igoera esangarria hidrokarburo aromatikoen pean jarritako gastropodo itsastarretan ere behatu da (Cajaraville et al., 1990b). Zelula-moten ordezkapena, liseri-zelulen kopuruaren murrizpenarekin zuzenean edo, zelula basofilikoen proliferazioarekin erlazionatuta dagoen erantzun beharra dago. Oraintsu, gure taldeak muskuiluen liseri-guruineko liseri-zelulak zein zelula jariatzaileak PCNA eta BrdUren immunohistokimikarekiko erreaktiboak direla erakutsi du (Marigómez et al., 1999, Zaldibar et al., 2004). Beraz, zelula-mota bakoitzak ziklo zelularra bere aldetik burutzen du. Bestalde, 1.25 mg Cd/l itsas-ur kotzentrazioak, magurioen liseri-guruineko zelula basofilikoen proportzio erlatiboen igoera esangarria sorterazten duela deskribatu da (Marigómez et al., 1990). Ekarpen horiek kontuan hartuta, ikerlan honen helburua, zelula-moten ordezkapena prozesu itzulgarria ote den, eta zelula basofilikoen proliferazioa edo liseri-zelulen galera dela medio ematen ote den argitzea da. Gainera, prozesua itzulgarria izatekotan zelulamoten ratio normalera itzultzea liseri-zelulen proliferazioaren areagotze batek eragin ote duen finkatu behar da. Helburu horiek betetzeko, magurioak 1.25 mg Cd/l itsas-ur kontzentrazio pean jarri ziren 3 astez, baldintza esperimental horietan zelula-moten ordezkapena sortaraz zitekeela bagenekielako (Marigómez et al., 1990), 143

147 Emaitzak eta eztabaida eta, ondoren, 10 egunez itsas-ur garbitan eduki ziren; izan ere, aldez aurretik arazketak zelula basofilikoen kopuruan jaitsiera eragin dezakeela ikusi da. Zelula-moten ordezkapen-prozesuak hainbat emaitza biokimiko eta bioenergetiko eztabaidatsu azal ditzake, uretan eta muskuilu itsastarren ehun bigunetan neurtutako metal-kontzentrazioak erlazionatzerakoan behatutako emaitza eztabaidakorrak, besteak beste. Marigómez et al. (1996, 1998), Soto et al. (1998a) eta Soto & Marigómez-ek (1997b) esposizio luze edo kronikoen ondorioz liseri-epitelioetan metalen metaketarik ematen ez zela aurkitu zuten; izan ere, epitelio horietan ez da apenas liseri-zelularik ikusten, eta euren lisosomak metaleen metaketatoki nagusia dira. Zelula-espezifiko diren hainbat biomarkatzaile (parametro lisosomikoak, peroxisomen proliferazioa...) erabiltzen direnean lortutako emaitzak interpretatzerakoan, antzeko ondorioak lortu daitezke. Kutsatzaileen eragin pean jartzeak liseri-zeluletako lisosomen tamainaren handipena eragiten du normalean (Cajaraville et al., 1995a; Etxeberria et al., 1995; Marigómez et al., 2005a), baina zelai ikerketetan denbora tarte laburrez kutsatzaile organikoen pean jarritako animalietan lisosomen tamainaren txikipena deskribatu da baita (Marigómez & Baybay- Villacorta, 2003). Metaketa-gaitasuna eta biomarkatzaileen erantzun batzuk zelula-mota espezifikoak direnez, zelula-moten osaketan ematen diren aldaketak, biometatze eta biomarkatzaileen ikerketetan, ustekabeko emaitza gisa ager daitezkeela susma daiteke. Testuinguru honetan, ikerketa honen bigarren helburua, zelulamoten ordezkapenak, metal-esposizio eta efektu biologikozko biomarkatzaile ezagunak diren AMGz lortutako zilarrezko hauspeakin beltzen (BSD; ingeleraz, black silver deposits) hedapenean eta lisosomen tamaina aldaketan eraginik ote duen ikustea da (Cajaraville et al., 1995a; Marigómez et al., 2002). MATERIAL ETA METODOAK Erreaktibo kimikoak Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkataletxekoak dira besterik agertu ezean. Prozedura esperimentala zm altuera kolumelarreko Littorina littorea magurioak merkatu batean eskuratu ziren eko urtarrilean eta litro bateko akuarioetan mantendu ziren moldatzen 17ºC-tan 7 egunez. Girora moldatzeko denbora igaro ondoren, magurioak 1.25 mg Cd/l-pean jarri ziren 21 egunez. Kontzentrazio subletal horrek liseri-guruineko epitelioko zelula basofilikoen proportzio erlatiboaren igoera esangarria sortarazten duela aldez aurretik egindako esperimentuetan deskribatu da (Marigómez et al., 1990). Esposiziodenbora bitartean, magurioak aldez aurretik izoztutako Fucus vesiculosus algaz ad libitum elikatu ziren. Janaria eta ura 2 egunero aldatu ziren. Kadmio peko 21 egunak igaro ondoren, talde esperimental bakoitzeko 10 magurio hartu ziren, eta 144

148 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. liseri-guruina/gonada konplexua disekzionatu zen gero deskribatuko den bezala. Gainontzeko ziren, eta toluidina urdinez tindatu ziren, argi mikroskopioan behaketak egiteko. magurioak, itsas-ur garbitan mantendu ziren 10 egunez, arazteko asmoz, eta ondoren aurreko magurioen modu berean prozesatu ziren. Zelula basofilikoen tamainaren estimazio morfometrikoa Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm) hematoxilina-eosinaz tindatu ziren liseri-zelulak (eosinofiloak) eta zelula basofilikoak (ilunak) bereizteko. Zelula basofilikoen tamainaren estimazio zakar bat lortzeko Olympus BX50 mikroskopio (Olympus, Tokio, Japonia) (amaierako handipena x540) bati atxiki zegoen irudi-analisi baten bitartez (Visilog 5.4 softwarea, Noesis, Crolles, Frantzia) tratamendu bakoitzeko aleatorioki aukeratutako 20 zelula basofilikoen soslaia eskuratu zen. Neurketak egiteko soilik epitelioaren xafla basaletik (zentzu histologikoan) lumenera argiro zabaltzen ziren soslai triangeluarreko zelula basofilikoak aukeratu ziren. Soslai bakoitzerako ebakiduraren azalera (As) eta luzeera maximoa (Lm) neurtu zen eta ondoren zelula basofilikoak konikoak zirela onartuz (Mason, 1983) beraien tamaina (S BAS ) hurrengo oinarrizko formula geometrikoen arabera kalkulatu zen. S BAS = (π x As 2 )/(3 x Lm), µm 3 -tan. Horrela As = (B x Lm)/2; r = B/2; Vkonoa =(π/ 3) x r 2 x Lm = (π/3) x (As/Lm) 2 x Lm, non B soslai triangeluarraren basearen luzera den, eta r luzera maximoaren ardatzarekiko elkartzuta den konoaren erradio maximoa den. Laginen prozesaketa Liseri-guruina/gonada konplexuaren zati txikiak Carnoy fixatzailean (%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10 azido azetikoa) fixatu ziren ordu batez 4 C-tan. Fixatu ondoren, laginak goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu ziren 60 C-tan. Ebakiak (7 µm-ko lodiera) mikrotomoan ebaki ziren. Ehunaren beste zati txiki bat, %10 sakarosa zuen 0.1 M fosfato indargetzailean (ph 7.4) murgildu zen 10 minutuz 4ºC-tan. Ondoren, gehiegizko indargetzailea iragazi-papera erabiliz lehortu, eta Cryo-M-Bed (TAAB Laboratories Equipments Ltd., Aldermaston, Ingalaterra) konposatuan inkluditu zen, amaieran laginak nitrogeno likidotan izoztu ziren. Ehunaren hirugarren zati bat, zati txikitan xehetu zen (<1 mm 3 ) eta %2.5 glutaraldehido zuen kakodilato indargetzailean (CB; 0.1 M; ph 7.2) fixatu zen 2 orduz 4ºC-tan. Ondoren, laginak %2 osmio tetroxidoa eta %3 potasio ferrozianuroa zuen CBan, 1:1 diluzioan, postfixatu ziren ordu batez 4ºC-tan. Laginak ur distilatuan garbitu ziren (3x10 minutu), goranzko graduazioko etanolezko bainuserie batean deshidratatu ziren, eta EPON 812 erretxinan inkluditu ziren. Ebaki semifinak Leica Utracut ultramikrotomo baten bitartez eskuratu Epitelioaren konposizio zelularraren analisi estereologikoak Hematoxilina-eosinaz tindatutako lagin 145

149 Emaitzak eta eztabaida berberak erabiliz (7 µm), liseri-zelulen (Vv DIG ) eta zelula basofilikoen (Vv BAS ) dentsitate bolumetrikoak kuantifikatzeko prozedura estereologikoa aplikatu zen. Horretarako kontaketak lagin bakoitzean azarez aukeratutako zelai batetan egin ziren kontaketak guztira talde desberdinetan egindako behaketa mikroskopikoek liseri-zelulen altueran aldaketa txikiak erakusten dituzte, µm, kalibrea konstante mantendu zelarik, 6-8 µm), eta zelula basofilikoen tamainen estimazio errealak aldez aurretik azaldu bezala egin ziren. esperimental bakoitzeko 10 kontaketak burutuz. Analisi estereologikoak burutzeko Nikon Optiphot mikroskopio bati atxiki zegoen irudi-hodi bat erabili zen (amaierako handipena x670). Vv DIG eta Vv BAS kalkulatzeko Weibel gratikula (multipurpouse test system M-168; Weibel, 1979) erabili zen eta liseri-zelula zein zelula basofilikotan eroritako puntuak kuantifikatu ziren eta kalkuluak Delesse-ren printzipioen arabera gauzatu ziren (Weibel, 1979). Liseri-zelula eta zelula basofilikoen bolumenaren estimazio absolutuak dentsitate bolumetrikoen datuetan oinarrituz burutu ziren. Liseri-zelulek eta zelula basofilikoek betetzen zuten bolumena (V DIG = Vv DIG x 17.8 x 10 6 µm 3 ; V BAS = Vv BAS x 17.8 x 10 6 µm 3 ) arbitrarioki aukeratutako liseri-guruinaren bolumen batekiko kalkulatu zen (17.8 x 10 6 µm 3 gutxi gorabehera). Bolumen hori kalkulu estereologikoak egiteko erabilitako Weibel gratikularen ( µm 2 ) arbitrarioki aukeratutako 50 µm-ko lodierako ebakidura bati dagokio. Lodiera hori zelula basofilikorik handiena guztiz barneratua egotea ahalbidetzen du. Ondoren, liseri-guruineko zati arbitrario horretan liseri-zelula eta zelula basofilikoen kopurua kalkulatzeko, liseri-zelulek tamaina konstantea zutela onartu zen (talde esperimental PCNA immunohistokimika Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) mikrotomo batean lortu eta aldez aurretik (3-amino propil trietoxisilanoz) silanizatutako portaobjektuetan jazo ziren. Ondoren, laginak xilenoz desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta fosfato indargetzaile salinoz (PBS; ingeleraz, phosphate-buffered saline) garbitu ziren. Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko, ebakiak %3 zuen H 2 O 2 an inkubatu ziren 5 minutuz, eta berriro PBS-az garbitu ziren. Ebakiak, Vectastain Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, Amerikako Estatu Batuak) hornitutako suero blokeatzailean 30 minutuz inkubatu ziren giro-tenperaturan, eta berriro ere PBS-an garbitu ziren. Gero, ebakiak PCNAren aurkako antigorputz espezifikoan (PC10, 1:1500 PBSan) inkubatu ziren. Laginak PBS-az garbitu ondoren, Vectastain Elite ABC Kit-aren bitartez eta abidina-biotina entzima-konplexua erabiliz antigorputza ikustarazi zen. Laburki, ebakiak, PBSan diluitutako saguaren aurkako zaldiaren IgG antigorputz sekundario biotinilatuan inkubatu ziren, 30 minutuz, eta PBS-an garbitu. Peroxidasa jarduera 3,3 -diaminobenzidina tetrahidrokloridoa (DAB) eta %0.03 H 2 O 2 zuen PBS indargetzailea erabiliz ikustarazi zen. Azkenik, ebakiak 146

150 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. hematoxilinaz kontrastatu ziren (10 s), dabilen uretan garbitu eta Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) montatu ziren. BSDen bolumena den eta V EH bolumena. Lisosomen estereologia ehunaren Mikrografiak, Olympus BX50 mikroskopio batetara atxiki zegoen Olympus PM20 argazki-kamera batez erdietsi ziren. ß-glukuronidasa entzimaren erreakzio histokimikoa fixatu gabeko kriotomo ebakietan burutu zen Moore-k (1976) deskribatu eta Cajaraville et al.-ek, (1989) modifikatu legez. Autometalografia Metalak, Danscher-ek (1984) deskribatutako eta Soto et al.-ek (1998b) modifikatutako prozedura jarraituz determinatu ziren parafinan inkluditutako laginetan. Ebakiak (7 µm), laburki xilenoz desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta labean (37ºC) utzi ziren guztiz lehortu arte. Laginak ondoren, argazki-emultsio geruza fin eta uniforme batez estali ziren gela ilunean (Ilford Nuclear Emulsion L4, Ilford, Mobberley, Ingalaterra). Laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean (30 minutu) eta laginak Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur destilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt, Alemania) errebelatzaile komertziala erabiliz errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren, errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikoa zuen diluzio batean geldiarazi zen minutu batez, eta azkenik erreakzioa fixatzailean (Agfa Agefix, Agfa- Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatu zen 10 minutuz. Hauspeakin beltz (BSD) moduan agertutako metalak irudi-analisi baten bitartez (Biological Measurement System software BMS- Sevisan, Bilbo, Espainia.) kuantifikatu ziren. Horrela, BSDen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) kalkulatu zen: Vv BSD = V BSD /V EH non V BSD Ebakiak (8 µm) -21ºC-ko kabinako tenperatura zuen CM3000 kriotomoan (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Alemania) lortu ziren, ebakiak giro-tenperaturan zeuden portaobjektuetan jazo ziren eta -40ºC-tan mantendu ziren tindatu aurretik. Ebakiak, 28 mg naphtol AS-BI glucuronide 1.2 ml sodio bikarbonatoan (50 mm) disolbatutako eta 100 ml-arte %2.5 NaCl zuen 0.1 M sodio azetato indargetzailean (ph 4.5) murgildu ziren. Disoluzio honetan, %20 (W/V) polibinilo alkoholezko g disolbatu ziren egonkortzaile koloidal gisa. Ebakiak 40 minutuz 37ºC-tan inkubatu ziren etengabeko irabiatzea zuen bainu batean. Ondoren, laginak %2.5 NaCl-tan garbitu ziren 2 minutuz eta 37ºCtan,eta %2.5 NaCl eta 1 mg/ml Fast Garnet GBC 0.1 M fosfato indargetzailean (ph 7.4) tindatu ziren 10 minutuz giro tenperaturan. Ebakiak, Baker formol kaltzikoan (%4 formaldehido, %1 CaCl 2 eta %2.5 NaCl) fixatu ziren 10 minutuz 4ºC-tan. Laburki, uretan garbitu eta gero %0.1 zuen Fast Green FCF disoluzioan kontrastatu zen 2 minutuz. Azkenik, ebakiak Kaiser gelatina glizerinatuan muntatu ziren. Prozedura estereologikoa aplikatuz eta irudianalisia erabiliz liseri-zelulen lisosomen egitura kuantifikatu zen (Cajaraville et al., 1995b; 147

151 Emaitzak eta eztabaida Etxebarria et al., 1994). Sistema, aldez aurretik Cajaraville et al.-ek, (1991) deskribatu dutenez B&W-CDD bideo-kamera batez, Leitz Laborlux mikroskopio batez eta Pentium ordenagailu batez osaturik dago, softwarea BMS sistema izanik (Sevisan, Bilbo, Espainia). x100 handipeneko objektiboa erabili zen eta lisosomak eta liserizelulen zitoplasma bereiziz irudi binarizatuak erabili ziren. Lehenengo neurketak eskuz doitu ziren, lagin desberdinen arteko tindaketa-intentsitate desberdintasun txikiak ekiditeko asmoz. Irudianalisi sistemak hurrengo parametroak sortzen ditu: lisosomen dentsitate bolumetrikoa (Vv LYS = V L /V C ), dentsitate superfiziala (Sv LYS = S L /V C ), azalera/bolumena ratioa (S/V LYS = S L /V L ) eta dentsitate numerikoa (Nv LYS = N L /V C ) non V = bolumena, S = azalera, L = lisosomak eta C = liserizelulen zitoplasma baitira. Formula estereologikoak, batezbesteko diametroa ebakiduraren lodiera baino txikiagoak duten partikulentzako zuzenketa-faktorea dauka sartuta (Lowe et al., 1981). Cajaraville et al.-en, (1995a) arabera, 5 neurketa burutu ziren liseri-guruin bakoitzeko. 1. Irudia: Magurio kontrol (A eta B) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako magurioen (C eta D) irudi histologikoak, bai hematoxilinaeosinaz (A eta C) zein toluidina urdinez (B eta D) tindatutako ebakietan. Geziek zelula basofilikoak adierazten dituzte. L) liseritubuluen argia. Eskala-marrak: 50 µm (A, B eta D) eta 25 µm (C). 148

152 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. Estatistika Emaitzak estatistikoki analizatzeko SPSS/PC+ (SPSS Inc., Microsoft Co.) pakete estatistikoa erabili zen. Lisosomen Vv eta Nv logaritmikoki transformatu ziren analisi estatistikoa aplikatu aurretik, indibiduoen arteko bariantza batezbestekoaren menpekoa zelako. Aldagai esperimentalen esangarritasuna, bide bateko bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz estimatu zen, eta parekatutako batezbestekoak, Duncan testa erabiliz konparatu ziren. EMAITZAK Liseri-epitelioaren analisi morfometriko eta estereologikoa Esperimentuak iraun zuen denbora guztian magurio kontrolen liseri-guruinean behatutako zelula-mota nagusia pikor zitoplasmatiko heterogeneoak zituen liseri-zelula izan zen. Zelula basofilikoak, beraien soslai piramidal karakteristikoarekin taldekatuak agertu ziren (1A eta 1B Ird.). Bestalde, zelula basofilikoen maiztasun erlatiboa askoz nabarmenagoa izan zen 21 egunez Cd pean jarritako magurioetan (1C eta 1D Ird.). Liseri-dibertikuluen lumena dilatatu samarra zegoela zirudien (1C Ird.), baina analisi estererologikoak egin ondoren animalia kontrol eta kutsatuen artean Vv LUMEN balioan desberdintasun esangarririk ez zegoela ondorioztatu zen (2. Ird.). Are gehiago, Cd pean jarritako magurioen liseri-zelulek iraizpenean gogoz jarduten ari ziren (1C eta 1D Ird.), baina epitelioaren lodierak ez zuen funtsezko murrizketarik pairatu (epitelioaren ebakiduraren azalera: kontrolak, 36633±2894 µm 2 ; Cd pean jarritakoak, 35640±2761 µm 2 ; araztutakoak, 39514±4028 µm 2 ). Azkenik, Cd pean jarritako magurioetan, zelula basofilikoek, handiagoak izanik, basofilia gutxiago zutela (1C eta 1D Ird.) eta pikor zitoplasmatikoen populazio heterogeneoagoa zutela ematen zuen (1D Ird.). Behaketa hauek sendotzeko asmoz irudi-analisiaren laguntzarekin zelula basofilikoen tamaina estimatu zen ebakiduraren azaleren neurketa zuzenak burutuz. 3. irudian ikusten denez, Cd pean jarritako magurioetan zelula basofilikoen tamaina (bolumena µm 3 -tan adierazita) kontrolena baino bi aldiz handiagoa izan zen, azken hauek esperimentuak iraun bitartean aldakatarik jaso ez zutelarik. Ur garbitan 10 egunez arazten egon ondoren, liseriguruinaren epitelioa ezin zen animali kontrolen epiteliotik bereizi. Zelula basofilikoen tamaina normala berreskuratu zen, euren bolumenaren neurketek adierazi zutenez (3. Ird.). 2. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen liseri-tubuluen lumenaren dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. 149

153 Emaitzak eta eztabaida Liseri-guruinaren epitelioko zelula-moten osaketan gertatu ziren aldaketak kuantifikatzeko, Vv BAS eta Vv DIG kalkulatu ziren (4. Ird.). Bi parametroak, osagarriak izanik, Cd pean jarritako magurioetan eta magurio kontrol eta 10 egunez arazten mantendutako magurioen artean esangarriki desberdinak izan ziren (4A eta 4B Ird.). Vv BAS -en igoera, edota aldibereko Vv DIG -en jaitsiera, liseri-zelulen galerak edota zelula basofilikoen ugaritzeak sortua den zehazteko asmoz, liseri-zelula eta zelula basofilikoen bolumen eta kopuru absolutuen estimazioa burutu zen, planimetria eta estereologia batera aplikatuz. Termino absolututan, Cd pean jarritako magurioetan liseri-zelulen bolumena, berriro ere 10 egunetako arazketa-aldiaren ondoren jaitsi zen kontrolen balioetara bueltatuz (4D Ird.). Bitartean, zelula basofilikoen bolumena 10 egunez Cd pean jarritako magurioetan igo zen, eta arazketaren egin ondoren, berriro ere kontrolen balioetara bueltatu zen (4D Ird.). Horrela, 17.8 x 10 6 µm 3 -ko liseriguruinaren zati bati dagokionez, kontroletan liserizelulen bolumena 11.8 x 10 6 µm 3 koa izan zen, gutxi gorabehera. Cd pean jarri ondoren, liserizelulen 1.6 x 10 6 µm 3 -ko bolumena galdu zen, eta 10 eguneko arazketa-aldia igaro ondoren, liserizelulen bolumena berriro ere 12.7 x 10 6 µm 3 -ko baliora bueltatu zen. Liseri-zelulen kopuruari dagokionez, Cd pean jarritako magurioetan liseriguruinaren zati horretan 1850 liseri-zelula galdu zitrela erakutsi zuten, magurio kontroletan liserizelulen kopurua zeluletakoa izanik, gutxi gorabehera. 10 egunez arazten utzi ondoren, liserizelulen kopurua kontroletan baino apur bat altuagoa izan zen, inguru. Zelula basofilikoen bolumen absolutuari dagokionez, 17.8 x 10 6 µm 3 -ko zati arbitrarioan, magurio kontrolen 1.1 x 10 6 µm 3 -ko bolumena Cd pean jarritako magurioetan 2.3 x 10 6 µm 3 -ra emendatu zen, eta arazketaren ondoren berriro 1.2 x 10 6 µm 3 -ra itzuli zen. Zelula basofilikoen kopurua, bere aldetik, tartean mantendu zen, eta talde esperimental desberdinen artean esangarriki aldatu ez zelarik (4E eta 4F Ird.). PCNA immunohistokimika 3. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mgcd/l pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen zelula basofilikoen batezbesteko bolumena. Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. Aurretik aipatutako zelula-kopuruen aldaketak azaltzeko asmoz, zelulen proliferazio tasetan balizko aldaketak aurkitzeko PCNA immunohistokimika aplikatu zen. Behar bezalako irudiak lortzeko, zailtasun handiak topatu ziren; izan ere, lipofuszinak eta pikor zitoplasmatikoetan seinale ez-espezifiko bortitza topatu zen; batez ere, Cd pean jarritako magurioetan. Tindaketaprozedura desberdinekin, DAB, fosfatasa alkalinoa eta tindagai fluoreszenteak barne, hainbat 150

154 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. saiakuntza egin ondoren, nukleo PCNA-positiboak bestelako egituretatik errez bereiztea lortu zen, baina aldez aurretik pentsatutako PCNAren analisi kuantitatiboak egitea ezinezkoa suertatu zen. Dena den, behaketa kualitatiboak, nahiz eta mugatuak izan, interesgarriak suertatu ziren oso. Erabilitako 4. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen neurketa estereologiko desberdinak. (A) Zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa; (B) Liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa; (C) Zelula basofilikoek betetzen duten bolumena 17.8 x 10 6 µm 3 bolumenarekiko; (D) Liseri-zelulek betetzen duten bolumena 17.8 x 10 6 µm 3 bolumenarekiko; (E) Zelula basofilikoen kopurua 17.8 x 10 6 µm 3 -tako bolumen batean: (F) Liseri-zelulen kopurua 17.8 x 10 6 µm 3 -tako bolumen batean. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrka adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. 151

155 Emaitzak eta eztabaida arratoien PCNA aurkako PC10 antigorputz komertziala, magurioen zelula proliferatzaileak detektatzeko gai izan zen; izan ere, gonadan oso erreakzio bortitza behatu zen (5A Ird.). Gonada arran, espermatozito primarioetan, sekundarioetan baino erreakzio bortitzagoa behatu zen, eta espermatida helduek ez zuten PCNA-markaketarik erakutsi (5A Ird.). PCNArik gabe inkubatutako tindaketa kontroletan ez zen inolako seinalerik ikusi (5B Ird.). Gonada emean, erreakzio positiboa obozitoen nukleoan soilik behatu zen, nukleoloan inolako seinalerik behatu ez zelarik (5C eta 5D Ird.). Bestalde, magurio kontroletan liseri-zelulen nukleo PCNA-positibo gutxi behatu ziren, eta lipofuszinen erreaktibotasunagak sortutako zarata gutxi aurkitu genuen (6A-C Ird.). Hala ere, Cd pean jarritako magurioetan, lifofuszina eta lisosomen materialak PCNA-markaketa bortitza eman zuten (6D-F Ird.), magurio kontroletan eta araztuetan behatu ez zena (6F-H Ird.). Autometalografia Autometalografiak, liseri-zelulen lisosometan zilarrezko hauspeakin beltzen (BSD) presentzia erakutsi zuen, zelula basofilikoetan BSDrik behatu ez zen bitartean (7. Ird.). Magurio kontroletan BSDen maila basalak behatu ziren, eta Cd pean mantendutako magurioetan askoz erreakzio bortitzagoak aurkitu ziren (7A-C Ird.). 10 eguneko arazketa-aldia bukatu ondoren, tindaketa-patroia, magurio kontroletan ikusitakoaren antzekoa izan zen (7D Ird.). Behaketa horiek, Vv BSD gisa neurtutako BSDen hedapena neurtzerakoan lortutako emaitza kuantitatiboekin bat egin zuten. Vv BSD balioak, Cd pean jarritako magurioetan magurio kontroletan baino hiru aldiz handiagoak izan ziren, eta are gehiago, araztutako magurioen artean eta magurio kontrolen artean ez zen desberdintasun esangarririk aurkitu (8. Ird). Lisosomen egitura-aldaketak Lisosomak, ß-glukuronidasa entzimaren histokimika erabiliz ikustarazi ziren. Honela, arre- 5. Irudia: PCNA immunohistokimika burutu ondoren magurioen gonada ar eta emean behatutako immunomarkaketa. (A) PCNAmarkaketa positiboa ikusten da espermatogonietan g), espermatozito primario p) eta sekundarioetan s) eta baita espermatidetan ere t). Eskala-marra: 25 µm. (B) Antigorputz primariorik gabe inkubatutako lagin kontroletan (folikulu espermatikoa) ez da inolako markaketa positiborik behatzen. Eskala-marra: 25 µm. (C) eta (D) PCNAren lokalizazioa gonada emeetan, bai obozito helduetan o), zein obozito goiztiarretan e). Nukleoek markaketa positibo bortitza erakusten duten bitartean (geziak), nukleoloetan ez da markaketarik behatzen (gezi-buruak). Eskala marra: 50 µm. 152

156 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. purpura koloreko egitura esferiko gisa agertu ziren liseri-zelulen zitoplasman. Lisosomak, Cd pean ugariagoak ziren (9. Ird.). Lisosomen egituraren analisi estereologikoak erakutsi zutenaren arabera, jarritako magurioetan kontrol eta araztutako nahiz eta S/V LYS eta Nv LYS parametroetan taldeenetan baino apur bat handiagoak eta desberdintasun esangarririk ez aurkitu Cd-ak, 6. Irudia: PCNA immunohistokimika magurio kontrol eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako magurioetan. (A eta C) Magurio kontrolak, T) liseri-tubuloa, D) liseri-zelula, B) zelula basofilikoa, H) hemozitoa. Geziek liseri-zelula positiboak adierazten dituzte, eta gezi-buruek zelula basofiliko positiboak adierazten dituzte. Ikusi lipofuszinen erreaktibogarritasun urria magurio kontroletan (A). Eskala-marra: 50 µm (A) eta10 µm (C). (B) Antigorputz primariorik gabe inkubatutako laginetan ez da inolako markaketa positiborik behatzen. Eskala-marra: 50 µm. (D-F) Cd pean 21 egunez mantendutako magurioetan lipofuszinak erreakzio bortitza erakusten dute. T) liseri-tubuloa, D) liseri-zelula, B) zelula basofilikoa. Geziek liseri-zelula positiboak adierazten dituzte, eta gezi- buruek zelula basofiliko positiboak adierazten dituzte. Eskala-marra: 50 µm (D) eta 10 µm (E eta F). (G-H) 10 egunez arazten utzitako magurioetan lipofuszinen erreakzionagarritasuna ahulagoa da eta zelula PCNA positibo ugari (geziak) ikus daitezke. T) liseritubuloa. Eskala-marra: 50 µm (G) eta 10 µm (H). 153

157 Emaitzak eta eztabaida Vv LYS balioaren igoera (lisosomen handipena) esangarria eragin zuen, arazketa burutu ondoren balioak berriro ere kontrolen mailara itzuliz (10. Ird.). EZTABAIDA Moluskuen liseri-guruinean kutsatzaileen eragin pean behatutako bestelako erantzunen artean, epitelioko zelula-moten ordezkapena (CTR) bibalbio eta gastropodoetan fenomeno orokor gisa deskribatu da (Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; 1996; 2005a; 2005b). Zenbait kasutan, bai zelula basofiliko normalek zein hipertrofiatutako liseri-guruineko epitelioko parterik nagusiena osatuz aurkitu dira, eta horregatik, CTR prozesua zelula basofilikoen proliferazioa dela medio burutzen dela proposatu da (Rasmussen et al., 1983; Lowe & Clarke, 1989: Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; Syasina et al., 1997). Are gehiago, Yonge (1926) eta Mix & Sparks-en (1971) lanetan oinarriturik, orokorrean, liseri-guruinaren epitelioaren berriztapen-gaitasuna zelula basofilikoei esleitu zaie (Thompson et al., 1974; Nelson & Morton, 1979). Izatez, zelula basofilikoen proliferazioa, babes-mekanismoa izan daitekeela iradoki da, non zelula basofilikoak behar bezalako baldintzak ematekotan liseri-zelula helduetan desberdintzatu baitaitezken (Thompson et al., 1974). Zelula basofilikoei eta liseri-zelulei funtzio arras desberdinak egokitu zaizkiela kontuan 7. Irudia: Littorina littorea magurioaren liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa, bai 1.25 mg Cd/l pean 21 egunez mantendu eta gero, (A eta B); maguio kontroletan (C); zein 10 egunez arazten mantendutako magurioetan (D). Geziek liseri-zelulen lisosometan dauden zilarrezko hauspeakin beltzak adierazten dituzte, gezi-buruek liseri-epitelioko xafla basalean dagoen metala adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm. 154

158 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. hartuz gero (Mersoy & Farley, 1973; Mason, 1983), Marigómez et al.-ek (1990), aipatutako hipotesia betetzeko aukera gutxi daudela iradoki zuten. Ikerlan horren arabera, zelula basofilikoz osatutako tubuluen agerpenaren erantzulea, liseri-zelulen kopuruaren jaitsiera soilik izango litzateke. Are gehiago, ikerlan horretan epitelioan neurtutako aldaketa morfologikoek eta honako ikerlan honetan zelula proliferatzaileak identifikatu izanak, bigarren hipotesia baieztatzen dute, geroago ikusiko denez. Kutsatzaileen pean jarritako moluskuetan, liseri-guruineko epitelioaren masaren galera netoa gertatu izana hainbat ikerlanetan frogatu da (Lowe et al., 1981; Couch, 1984; Tripp et al., 1984; Marigómez et al., 1986; 1993; Minnitti, 1987; Axiak et al., 1988; Recio et al., 1988; Lowe & Clarke, 1989; Vega et al., 1989; Cajaraville et al., 1992; Ireland & Marigómez, 1992; Syasina et al., 1997; Snyman, et al., 2005). Halaber, zenbait zeharkako ebidentziek liseri-dibertikuluen luzeraren murrizpena gertatzen dela adierazi dute, esaterako kutsatzaileen pean egondako muskuiluen liseriguruinaren 3-D-ko berreraikuntzak egin ondoren ikusi zenez, (Quincoces, 1995). Muskuiluetan, liseri-guruinaren unitate morfofuntzionala ganbara baten bitartez liseri-konduktuetara lotzen diren hatz itxurako egiturez osaturik dago (Marigómez et al., 1995). Metal eta kutsatzaile organikoen pean mantendutako muskuiluetan, hatzen luzera esangarriki txikitzen da (Quincoces, 1995). Masa epitelialaren murrizpen hori, liseri-zelulen galerarekin lotuta egon daiteke, eta ondorioz, zelula basofilikoen kopuru erlatiboaren itxurazko igoera gauzatuko litzateke. Magurioen liseri-dibertikuluak ez dira muskuiluenak bezain plastikoak. Muskuiluetan, liseri-guruinaren morfologia prozesu fisiologiko normaletan ere aldaketa bortitzak jasotzen dituen bitartean, (liseriketa-ziklo bakoitzean adibidez; Robinson, 1983), magurioenaren itxura eta morfologia orokorra askoz egonkorragoa da, adibidez liseriketan zehar (Sáez et al., 1990). Hala ere, 1.25 mg Cd/l-ko kontzentrazio pean egondako magurioetan, liseriepitelioaren lodieraren jaitsiera esangarria gertatu zen (Vega et al., 1989), eta beraz, Cd kontzentrazio horrek, magurioetan ere masa epitelialaren galera garbia eragiten duela ondoriozta daiteke. Ikerlan honetan, aipatutako efektuaren ebidentziarik ez da behatu; izan ere, Cd pean egondako magurioetan Vv LUMEN balioa ez da modu esangarrian aldatu. Hala ere, Vega et al.-ek (1989) aplikatutako metodologia, lan honetan aplikatutako hurbilketa estereologikoa baino sentikorragoa izan zen. Izan ere, lan honetan lumenaren tamaina, tubuluen tamaina eta epitelioaren lodiera aldi berean kalkulatu dira. Gainera, bi esperimentuak urteko 8. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. 155

159 Emaitzak eta eztabaida sasoi desberdinetan burutu ziren (errute-garaian, abendua-urtarrila versus errute-ostean, otsailamartxoa). Erantzuna termino kualitatibotan antzekoa izatea espero bada ere, erantzunaren hedadura desberdina izan daiteke, abenduaurtarrila garaian (Vega et al., 1989) otsaila-martxoa garaian (ikerlan hau) baino erantzun sentikorragoak behatuz. Modu berean, CTR erantzuna, nahiz eta Cd kontzentrazio berdinak erabili, leunagoa suertatu da ikerlan honetan, abendua-urtarrila garaian burutu ziren esperimentuekin (Marigómez et al., 1990) alderatuz. Are gehiago, Marigómez et al.-en (1990) arabera, espero baino zelula basofilikoen hipertrofia gutxiago behatu da oraingo honetan. Zelulen galeraren ebidentziarekin batera, orain epitelioko zelulen berriztapen-mekanismoen inguruan datu berriak daude eskuragarri. Muskuiluen liseri-guruinean, bai liseri-zelulak zein zelula basofilikoak PCNA zein BrdU immunohistokimikak eginez erreakzionagarriak direla frogatu da, eta beraz, bi zelula-motek bere ziklo zelularra norberak bere aldetik betetzen dute (Marigómez et al., 1999; Zaldibar et al., 2004). Hori dela eta, kutsatzaileen eraginez desagertu diren liseri-zelulak ordezkatzeko ez dirudi zelula basofilikoak proliferatzen eta desberdintzatzen direnik, liseri-zelulek bere aldetik bikoizteko gaitasuna baitute. PCNA immunohistokimikaren bitartez behatu denez, nahiz eta Cd pean mantendutako magurioetan eta araztutako magurioetan lipofuszinen erreakzionagarritasun handiak emaitza kuantitatiboak lortzerik baimendu ez, badirudi Cd-ak liseri-zelulen proliferazioaren 9. Irudia: Littorina littorea magurioaren liseri-epitelioan ß-glukuronidasa entzimaren jardueraren lokalizazioa histokimika bitartez, bai 1.25 mg Cd/l pean 21 egunez mantendu eta gero, (A eta B ); magurio kontroletan (C); zein 10 egunez arazten mantendutako magurioetan (D). Geziek lisosomen barneko ß-glukuronidasa jarduera adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm. 156

160 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. areagotzea eragiten duela. Areagotutako proliferazio hori, 10 egunez arazten utzitako magurioetan oraindik ere mantentzen da. Proliferazio-tasak kalkulatzeko gai izan ez garenez, arazketa ondoren liseri-guruinean gertatzen den zelula-moten berreskurapena, liseri-zelulak gehiago proliferatzen dutelako edo liseri-zelula gutxiago galtzen direlako ondorioztatzea ezinezkoa zaigu. Kadmio pean egondako magurioetan, liserizelulen bolumen absolutua jaitsi zen 10 egunetako arazketa-aldia eta gero, kontrolen balioetara itzuli bazen ere. Zelula basofilikoen bolumen absolutua, Cd peko tratamenduaren ondoren igo zen eta arazketa-aldia eta gero berriro ere kontrolen balioetara jaitsi zen. Liseri-zelulen bolumen absolutuaren jaitsiera, liseri-zelulen galera netoa dela medio eman zen bitartean (1850 liseri-zelula galdu ziren liseri-guruinaren 17.8 x 10 6 µm 3 -ko zati batean), zelula basofilikoen bolumenaren igoera zelulen hipertrofiak sortua da, eta ez zelula kopuruaren igoerak, sortua izan zen. Ikerlan honetan lortutako emaitza guztiak batera kontuan hartuta, CTR, zelula basofilikoen proliferazioak sortua baino, gehiago, liseri-zelulen 10. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta Cd pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen ß-glukuronidasa jardueraren parametro estereologikoak (A) Dentsitate bolumetrikoa; (B) Dentsitate superfiziala; (C) Azalera/Bolumena ratioa; (D) Dentsitate numerikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. 157

161 Emaitzak eta eztabaida galera netoak sortua zela dirudi. Hala ere, liserizelulen galera neto hori, liseri-zelulen proliferazio areagotuarekin batera gertatu zen. Ornodunen zeluletan, programatutako heriotza zelularra zein zelulen proliferazioa Cd-ak eragiten duena jakina da (Beyersmann & Hechtenberg, 1997; Habeebu et al., 1998; Piechotta et al., 1999). Cd pean egondako Helix pomatia barraskiloetan kontroletan baino lau aldiz programatutako heriotza zelular gehiago erregistratu da liseri-zeluletan (Chavikovsky et al., 2004). Programatutako heriotza zelular hori, elkar baztertzaileak ez diren autofagia eta apoptosioren konbinaketak eraginda dagoela dirudi (Bursch et al., 2000; Chavikovsky et al., 2004). Izan ere, oraingo honetan Cd-ak liserizelulen proliferazioa eragin dezakeela behatu da; beraz, liseri-zelulen galera netoa zelulen heriotza eta proliferazioaren arteko balantze gisa azal daiteke. Beraz, magurioetan, Cd pean egoteak, arazketari aurre egiteko liseri-zelulen berriztapena areagotzen du. Kadmio pean egondako magurioen zelula basofilikoen hiperplasia, esposizio-denbora eta kontzentrazioaren araberakoa da (Marigómez et al., 1990). Zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) hiperplasia zenbait metalen pean egondako lehorreko gastropodoetan ere deskribatu da (Marigómez et al. 1996; 1998; Chabicovsky et al. 2004). Hiperplasia hori fenomeno desberdinekin erlazionatu da: (1) liseri-zelulen funtzioak (liseriketa intrazelularra barne) kaltetuta egonez gero, liseriketa estrazelularrerako entzimen areagotutako ekoizpenarekin (Cajaraville et al., 1990b; Marigómez et al., 1990); (2) zelula basofilikoetan areagotutako detoxifikazio-jarduerekin (Cajaraville et al., 1990a; Livingstone & Pipe, 1992; Triebskorn & Köhler, 1996); eta (3) apoptosi bidez hildako liseri-zelulen fagozitosiarekin (Chabicovsky et al., 2004), hain zuzen ere. Bestalde, aipatutako hiperplasia, liseri-zelulen galerak epitelioan toki libre gehiago uzten duenez, zelula basofilikoen tamaina eta soslai aldaketekin erlazionatuta egon daiteke, ugaztunen urdaileko epitelioan deskribatu den bezala (Clarke, 1970). Liseri-guruinaren histofisiologiari dagokionez, duela gutxi egindako behaketen arabera (argitaratu gabe), ez dirudi areagotutako entzimen jariapena azalpen sinesgarria denik. Halaber, kutsatzaile organikoen pean, baina ez metalen pean, zelula basofilikoen erretikulu endoplasmatiko pikortsuan areagotutako jarduera detoxifikatzaileen berri eman da (Livingstone & Pipe, 1992; Triebskorn & Köhler, 1996). Edonola ere, metalen detoxifikazioaren kasuan partaide nagusiak liseri-zelulak direnez (Vega et al., 1989), ikerlan honetako behaketak azaltzeko pisu gutxiko aukera dirudi. Azkenik, zelula basofilikoek hiltzen ari diren liseri-zelulen hondarren fagozitosian parte hartzen dutela hiperplasia azaltzeko aukera egokiena izan daiteke. Intsektuen epidermisean (Locke, 1985), ugaztunen hepatozito (Dini et al., 2002), Sertoli zelula (Nakanishi & Shiratsuchi, 2004) eta bestelako epitelio-zeluletan (Monks et al., 2005), eta gastropodoen liseriguruineko epitelio-zeluletan (Chavikovsky et al., 2004), hiltzen diren epitelio-zelulak, alboko epiteliozelulek fagozitatzen dituztela deskribatu da. Oraintsu, Cd-z elikatutako bareetan gorputz apoptotikoak izan daitezkenak deskribatu dira (5. 158

162 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. Kapitulua). Edonola ere, azken hipotesi hori baieztatzeko, teknika immunohistokimikoak erabiliz zelula apoptotikoen identifikazio espezifikoak eta mikroskopio elektroniko mailan egindako ikerketak burutzea beharrezkoa da. Ikerlan honen ekarpen garrantzitsuena, CTR itzulgarria dela frogatzea izan da: 10 eguneko arazketa-aldia eta gero, liseri-zelulak berriz ere zelula basofilikoak baino ugariagoak suertatu dira. Liseri-zelulen PCNA-markaketa Cd pean mantendutako zein araztutako magurioetan antzekoa izanik, CTRren itzulgarritasunak liserizelulen galera moteltzearekin zerikusia behar du izan, Cd-aren gabezian liseri-zelulen jarduera metabolikoa berriz ere bere egoera normalera itzultzea espero baita (Marigómez et al., 1986). Beraz, liseri-zelulen berriztapena kutsatzaileen gisako ingurumen-faktoreek modulatua dagoela dirudienez, zelula-moten osaketa bereizgarria ingurumen-baldintza berezi bati egotzi ahal zaio. Ingurumen-erasoaren maila eta luzeraren araberakoa izan daitekeen moldaera hori, liseriguruinaren fisiologiaren ulermenean eta biomarkatzaileen aplikazioan eragina izan dezake, itu-zeluletan ezartzen ez diren eta matrize analitikoan (liseri-guruina) suertatzen diren aldaketak aintzakotzat hartzen ez dituzten prozedurak erabiltzen badira. Metal-esposizioak sortarazitako CTRk, BSDhedapena bezalako esposizio-biomarkatzaile eta lisosomen erantzunak bezalako efektubiomarkatzaileen gainean eragina izan dezakeela frogatu da muskuiluetan (Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Modu berean, metal-esposizioak muskuilu eta magurioen liseri-guruinean eragindako masa netoaren aldaketek, AAS bidez estimatutako ehunetako metal-zaman eragina izan dezakete (Soto et al., 1997a; 1997b). Dirudienez, liseri-zelulen galerak eta berreskurapenak, ikerlan honetan aplikatutako biomarkatzaileen (BSDhedapena, lisosomen parametro estereologikoak) gainean eraginik ez dute. Magurioen liseriguruineko Vv BAS balioak 0,2 µm 3 /µm 3 baino handiagoak izan arren, zelula basofilikoak saihestuz; lisosomen barneko metal-kopuru eta lisosomen handipenaren neurketak zuzenean liserizelulen gainean egin daitezke. Laburbilduz, ikerlan honen ondorioak honako hauek dira: (1) "itxurazko" zelula-moten ordezkapena liseri-zelulen galerak eta aldibereko zelula basofilikoen hipertrofiak sortua dela; (2) prozesua itzulgarria dela; (3) liseri-zelulen proliferazioa Cd pean mantendutako magurioetan areagotzen dela, eta tendentzia hori arazketaaldiaren ondoren mantentzen dela; eta (4) liserizelulen galera eta berreskurapena ikerlan honetan erabilitako maila zelular eta tisularreko biomarkatzaileen gainean eraginik ez dirudi duenik. BIBLIOGRAFIA Axiak V, George JJ, Moore MN (1988) Petroleum hydrocarbons in the marine bivalve Venus verrucosa: accumulation and cellular responses. Mar. Biol. 97: Beyersmann D, Hechtenberg S (1997) Cadmium, gene regulation, and cellular signalling in mammalian cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: Bursch W, Ellinger A, Gerner CH, Fröhwein U, Schulte- Hermann R (2000) Programmed cell death (PCD) apoptosis, autophagic PCD, or others?. Ann. N.Y. Acad. Sci. 926:

163 Emaitzak eta eztabaida Cajaraville MP, Marigómez JA, Angulo E (1989) A stereological survey of lysosomal structure alterations in Littorina littorea exposed to 1-naphtol. Comp. Biochem. Physiol. C 93: Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E (1990a) Responses of basophilic cells of the digestive gland of mussels to petroleum hydrocarbon exposure. Dis. Aquat. Org. 9: Cajaraville MP, Marigómez I, Angulo E (1990b) Short-term toxic effects of 1-naphthol on the digestive gland-gonad complex of the marine prosobranch Littorina littorea (L.): a light microscopic study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 19: Cajaraville MP, Marifómez JA, Angulo E (1991) Automated measurement of lysosomal structure alterations in oocytes of mussels exposed to petroleum hydrocarbons. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 21: Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E (1992) Comparative effects of the water accommodated fractions (WAF) of three oils on mussels. 2.- Quantitative alterations in the structure of the digestive tubules. Comp. Biochem. Physiol. C 102: Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, Marigómez I (1995a) Lysosomes as cellular markers of environmental pollution: time- and dose-dependent responses of the digestive lysosomal system of mussels after petroleum hydrocarbon exposure. Environ. Toxicol. Water Qual. 10:1-8. Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez I (1995b) Cellular biomarkers as useful tools in the biological monitoring of environmental pollution: molluscan digestive lysosomes orr. Non: Cell Biology in Environmental Toxicology. Cajaraville MP (ed) University of the Basque Country Press Service. Bilbo. Chabicovsky M, Klepal W, Dallinger R (2004) Mechanisms of cadmium toxicity in terrestrial pulmonates: Programmed cell death and metallothionein overload. Environ. Toxicol. Chem. 23: Clarke RM (1970) A new method of measuring the rate of shedding of epithelial cells from the intestinal villus of the rat. Gut 11: Couch JA (1984) Atrophy of diverticular epithelium as an indicator of environmental irritants in the oyster, Crassostrea virginica. Mar. Environ. Res. 14: Danscher G (1984) Autometallography. A new technique for light and electron microscopic visualization of metals in biological tissues (gold, silver, metal sulphides and metal selenides). Histochemistry 81: Dini L, Pagliara P, Carlà EC (2002) Phagocytosis of apoptotic cells by liver: A morphological study. Microsc. Res. Tech. 57: Etxeberria M, Sastre I, Cajaraville MP, Marigómez I (1994) Digestive lysosome enlargement induced by experimental exposure to metals (Cu, Cd and Zn) in mussels collected from a zinc polluted site. Arch. Environ. Toxicol. 27: Etxeberria M, Cajaraville MP, Marigómez I (1995) Changes in digestive cell lysosomal structure as biomarkers of environmental stress in the Urdaibai estuary (Biscay Coast, Iberian Peninsula). Mar. Poll. Bull. 30: Habeebu SSM, Liu J, Klaassen CD (1998) Cadmium-induced apoptosis in mouse liver. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153: Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary calcium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and histological changes in the digestive cells in the snail Achatina fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58: Livingstone DR, Pipe RK (1992) Mussels and environmental contaminants: molecular and cellular aspects orr. Non: The Mussel Mytilus: ecology, Physiology, Genetics and Culture. EM Gosling (ed). Elsevier Science Publs B.V. Amsterdam. Locke M (1985) A structural analysis of post embryonic development orr. Non: Parasites-Their world and ours. Mattrick CF & Desser SS (ed). Elsevier Biomedical Press. New York. Lowe DM, Clarke KR (1989) Contaminant-induced changes in the structure of the digestive epithelium of Mytilus edulis. Aquat. Toxicol. 15: Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil in the digestive cells in mussels: quantitative alterations in cellular and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1: Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986) Copper treatment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Morphometrics and histophysiology. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 36: Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) Histopathology of the digestive gland-gonad complex of the marine prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. Aquat. Org. 9:

164 Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. Marigómez I, Soto M, Etxeberria M, Angulo E (1993) Effects of size, sex, reproduction, and trematode infestation on the quantitative structure of digestive tubules in stressed winkles. Zool. Jb. Anat. 123: Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury JR (1995) Computer assisted 3-d reconstruction techniques may provide new insides into the pattern of histological organisation of the bivalvian digestive gland. 12th Int. Malacol. Congr. Vigo. Marigómez I, Soto M, Kortabitarte M (1996) Tissue-level biomarkers of biological effect of mercury on sentinel slugs, Arion ater. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998) Celltype replacement, a successful strategy of mollusks to adapt to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 20: Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical localisation of proliferating cells in mussel digestive gland tissue. Histochem. J. 31: Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Giamberini L (2002) Cellular and subcellular distribution of metals in molluscs. Microsc. Res. Tech. 56: Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutant-specific and general lysosomal responses in digestive cells of mussels exposed to model organic chemicals. Aquat. Toxicol. 64: Marigómez I, Izagirre U, Lekube X (2005a) Lysosomal enlargement in the digestive cells of mussels exposed to cadmium, bezo[a]pyrene and their combination. Comp. Biochem. Physiol. C 141: Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia L, Cajaraville MP (2005b) Cell and tissue biomarkers in mussel, anh histopathology in hake and anchovy from Bay of Biscay after the Prestige oil spill (Monitoring Campaign 2003). Mar. Poll. Bull. (prentsan). Mason AZ (1983) The uptake, accumulation and excretion of metals by the marine prosobranch gastropod mollusc Littorina littorea (L). Doktoradutza-Tesia. University of Wales, Gwyneed (UK). 575 orr. Merdsoy B, Farley I (1973) Phasic activity in the digestive gland of the marine prosobranch gastropod, Littorina littorea (L.). Proc. Malacol. Soc. London 40: Minnitti F (1987) Effects of copper pollution on the hepatopancreas of Cyclope neritea L. (Mollusca:Gastropoda). Zool. Anz. 219: Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestive tubule tissue of the pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing radiation. J. Invert. Pathol. 17: Monks, J., Rosner, D., Geske, F.J., Lehman, L., Hanson, L., Neville, M.C., Fadok, V.A. (2005) Epithelial cells as phagocytes: Apoptotic epithelial cells are engulfed by mammary alveolar epithelial cells and repress inflammatory mediator release. Cell Death Diff. 12: Moore MN (1976) Cytochemical demonstration of latency of lysosomal hydrolases in digestive cells of the common mussel Mytilus edulis, and changes induced by thermal stress. Cell Tiss. Res. 175: Morton B (1983) Feeding and digestion in bivalvia orr. Non: The Mollusca. ASM & Wilburg M. (ed). Academic Press. Saleuddin. New York. Nakanishi Y, Shiratsuchi A (2004) Phagocytic removal of apoptotic spermatogenic cells by sertoli cells: Mechanisms and consequences. Biol. Pharma. Bull. 27: Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial renewal in the digestive gland tubules of the marine prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 45: Piechotta G, Lacorn M, Lang T, Kammann U, Simat T, Jenke HS, Steinhart H (1999) Apoptosis in dab (Limanda limanda) as possible new biomarker for anthropogenic stress. Ecotox. Environ. Saf. 42: Quincoces I (1995) Un nuevo modelo de la glándula digestiva de Mytilus galliprovincialis (Bivalvia, Eulamellibranchia): reconstrucción tridimensional asistida por ordenador y microscopía electrónica de barrido. Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 112 orr. Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light and electron microscopic studies of the acute and chronic toxic effects of N-nitroso compounds on the marine mussel, Mytilus edulis (L) II. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine Aquat. Toxicol. 3: Recio A, Marigómez JA, Angulo E, Moya J (1988) Zinc tratment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Cellular distribution of zind and cadmium. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 41: Robinson WE (1983) Assessment of bivalve intracellular digestion based on direct measuremets. J. Moll. Stud. 49:

165 Emaitzak eta eztabaida Sáez V, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1990) Histomorphology and histochemistry of the digestive gland of Littorina littorea (L.) in relation to experimental tidal conditions, food availability, and digestion. Zool. Jb. Anat. 120: Snyman RG, Reinecke AJ, Reinecke SA (2005) Quantitative changes in the digestive gland cells of the snail Helix aspersa after exposure to fungicide copper oxychloride. Ecotox. Environ. Saf. 60: Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I (1990) A planimetric study of morphological variability in the digestive diverticula of Littorina littorea (Linnaeus) and Mytilus edulis Linnaeus. J. Moll. Stud. 56: Soto M, Marigomez I (1997a) BSD extent, an index for metal pollution screening based on the metal content within digestive cell lysosomes of mussels as determined by autometallography. Ecotox. Environ. Saf. 37: Soto M, Marigómez I (1997b) Metal bioavailability assessment in mussel-watch programmes by automated image analysis of autometallographical black silver deposits (BSD) in digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156: Soto M, Ireland MP, Marigómez I (1997a) The contribution of metal/shell weight index in target-tissues to metal body burdens in sentinel marine mollusks. 1 Littorina littorea. Sci. Tot. Environ. 198: Soto M, Ireland MP, Marigómez I (1997b) The contribution of metal/shell weight index in target-tissues to metal body burdens in sentinel marine mollusks. 2 Mytilus galloprovincialis. Sci. Tot. Environ. 198: Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigomez I (1998a) Autometallographed metal content in digestive cells of winkles: a cost-effective screening tool for monitoring Cu and Zn pollution. Aquat. Toxicol. 40: Soto M, Quincoces I, Marigómez I (1998b) Autometallographical procedure for the localization of metal traces in molluscan tissues by light microscopy. J. Histotechnol. 21: Soto M, Zaldibar B, Cancio I, Taylor MG, Turner M, Morgan AJ, Marigómez I (2002) Subcellular distribution of cadmium and its cellular ligands in mussel digestive gland cells as revealed by combined autometallography and X-ray microprobe analysis. Histochem. J. 34: Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) Morphological alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 44: Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starvation on structure and function of the digestive gland of the mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 54: Triebskorn R, Köhler HR (1996) The impact of heavy metals on the grey garden slug, Deroceras reticulatum (Muller): Metal storage, cellular effects and semi-quantitative evaluation of metal toxicity. Environ. Poll. 93: Tripp MR, Fries CR, Craven MA, Grier CE (1984) Histopathology of Mercenaria mercenaria as an indicator of pollutant stress. Mar. Environ. Res. 14: Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989) Quantitative alterations in the structure of the digestive cell of Littorina littorea on exposure to cadmium. Mar. Biol. 103: Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press. London 415 orr. Widdows J, Bakke T, Bayne BL, Donkin P, Livingstone DR, Lowe DM, Moore MN, Evans SV, Moore SL (1984) Responses of Mytilus edulis on exposure to the WAF of North Sea oil. Mar. Biol. 67: Yonge CM (1926) The digestive diverticula in Lamellibranchia. Trans. Roy. Soc. Edin. 54: Zaldibar B, Cancio I, Marigómez I (2004) Circatidal variation in epithelial cell proliferation in the mussel digestive gland and stomach. Cell Tiss. Res. 318:

166 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lanborategi-ikerketa Liseri-zelulen berriztapena kadmio eta kerosenozko nahasketa baten pean esperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko epitelioan Laburpena: Arion ater (L) bareak lurzoruen osasun-maila ebaluatzeko organismo-behale gisa proposatu dira. Kutsatzaile pean egondako bareen liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketak behatu dira, aldaketa horien artean esanguratsuena liseri-zelulen galera eta horrekin batera iraizte- eta kaltzio-zelulen emendioa izanik. Lan honen helburua, liseri-zelulen galerak efektu- eta esposiziobiomarkatzaileen gainean eragina duen, eta zelulen galera hori laborategiko baldintzetan metal eta konposatu organikozko nahasketa baten pean jarritako bareetan itzulgarria ote den antzematea da. Horretarako, bareak kutsatu gabeko toki batetik (Delika, Euskal Herria) hartu ziren eta 10 µg Cd + %30 kerosenotik lortutako urari egokitutako frakzioa zuen janariaz 27 egunez elikatu ziren. Gorputzeko metalzama eta kerosenoaren mailak kalkulatu ziren erabilitako esposizioa eraginkorra zela baieztatzeko asmoz. Esposizio-biomarkatzaile gisa, autometalografia bitartez lortutako zilarrezko hauspeakin beltzen (ingeleraz, Black Silver Deposits; BSD) dentsitate bolumetrikoa eta azil-koa oxidasa (AOX) entzimaren jarduera erabili ziren. Efektu-biomarkatzaile gisa, liseri-epitelioa osatzen duten 3 zelula-moten (liseri-, iraizte- eta kaltziozelulak) dentsitate bolumetrikoan neurtutako aldaketak erabili ziren. Zelula proliferatzaileak bromodeoxiuridinaren (BrdU) immunodetektapenaren bitartez identifikatu ziren. Ikerlan honen emaitzek, kutsatzaile pean jarritako bareetan AOX jarduera eta BSD-en denstitate bolumetrikoaren igoera eta liserizelulen kopuruaren jaitsiera gertatzen dela islatu zuten, dena den aldaketa horiek liseri-guruineko kutsatzaileen metaketa-gaitasunean eta erabilitako efektu- eta esposizio-biomarkatzaileen gainean eraginik ez zuten izan. Gainera, liseri-epitelioko zelula-moten osaketan behatutako aldaketa eraldatu hori arazte-aldiko 7 egunen buruan itzulgarria zela behatu zen. BrdU-markaketak kutsatzaile pean egoteak liseri-zelulen proliferazio areagotua eragiten duela erakutsi zuen, proliferazio-jarduera areagotu hori araztealdian zehar ere mantentzen zelarik. Gako-hitzak: liseri-guruina, bareak, zelula-moten ordezkapena, kadmioa, kerosenoa, efektu- eta esposizio-biomarkatzaileak.. 163

167 Emaitzak eta eztabaida Digestive cell turnover in the digestive gland epithelium of slugs experimentally exposed to a mixture of cadmium and kerosene Abstract: Slugs, Arion ater (L), have been proposed as sentinel organisms to assess soil environmental health. In slugs under the influence of pollutants changes in the cell-type composition of the digestive-gland have been observed, among these changes, the most remarkable one is the loss of digestive cells and the related increase of excretory and calcium cells.the aim of the present work was to determine whether digestive cell loss affects biomarkers of exposure and effect and whether is reversible in the digestive gland of slugs exposed to a mixture or metal and organic pollutants under laboratory conditions. For these purposes, slugs collected from a non-polluted site (Delika, Basque Country) were dosed with 10 µg Cd/gr + 30% of the water accommodated fraction of kerosene in the food for 27 days. Metal body burdens and kerosene tissue levels were measured. The volume density of black silver deposits (Vv BSD ) revealed by autometallography, and the activity of the enzyme acyl-coa oxidase (AOX) were used as exposure biomarkers. As effect biomarkes, changes in the volume density of the three cell types that constitute the digestive gland epithelium in slugs (digestive, excretory and calcium cells) were calculated. Proliferating cells were identified by means of bromodeoxyuridine (BrdU) immunohistochemistry. The results of the present work revealed that the mixture of pollutants provoked an increase in Vv BSD and AOX activity as well as a decrease in the number of digestive cells. Anyway, these changes had no effect in the capacity of the digestive gland to accumulate or in the effect and exposure biomarkers employed. Moreover, the change in cell-type composition measured in the digestive epithelium was reversible after 7 days of detoxification. BrdU-labelling showed that exposure to pollutants provoked an enhanced digestive cell proliferation, that perdured during detoxification Key words: digestive gland, slugs, cell-type replacement, cadmium, kerosene, effect and exposure biomarkers. 164

168 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa Renovación de células digestivas en el epitelio de la glándula digestiva de limacos experimentalmente expuestos a una mezcla de cadmio y keroseno Resumen: Los limacos, Arion ater (L) han sido propuestos como organismos centinela en la evaluación de la salud del suelo. Se han observado cambios en la composición de tipos celulares de la glándula digestiva de limacos bajo la influencia de contaminantes. De entre todos estos cambios el más reseñable es la pérdida de células digestivas y el aumento de células excretores y de calcio que le acompaña. El objetivo del presente trabajo es determinar si la pérdida de células digestivas afecta a los biomarcadores de exposición y efecto, y si dicha pérdida es reversible en limacos expuestos a una mezcla de contaminantes metálicos y orgánicos en condiciones de laboratorio. Con ese fín, se recogieron limacos de un lugar no contaminado (Delika, País Vasco) y se trataron con 10 µg Cd/gr + 30% de la fracción acomodada al agua de keroseno en la dieta durante 27 días. Se midió la concentración de Cd y de keroseno en la glándula digestiva. La densidad volumétrica de BSD (Vv BSD ), (BSD, del inglés; Black Silver Deposit) revelados mediante autometalografía y la actividad del enzima acil-coa oxidasa fueron los biomarcadores de exposición estudiados. Como biomarcadores de efecto se calcularon los cambios en la densidad volumétrica de los tres tipos celulares que contituyen el epitelio de la glándula digestiva de limacos (células digestivas, excretoras y de calcio). Las células proliferativas se identificaron mediante immunohistoquímica de bromodeoxiuridina (BrdU). Los resultados obtenidos demostraron que la mezcla de contaminantes provocan un aumento en Vv BSD y en la actividad AOX así como la pérdida de células digestivas en limacos, aunque los cambios observados en el epitelio digestivo no afectaron a la capacidad de acumulación de contaminantes ni a los biomarcadores de efecto y exposición empleados en el presente trabajo. Además, el cambio en la composición de tipos celulares del epitelio digestivo fué reversible después de 7 días de depuración. Por otro lado, el marcaje de BrdU demostró que la exposición a contaminantes induce la proliferación de las células digestivas y que dicho aumento en la tasa de proliferación se mantiene durante el período de detoxificación. Palabras clave: glándula digestiva, limacos, recambio de tipo celular, cadmio, keroseno, biomarcadores de efecto y exposición. 165

169 Emaitzak eta eztabaida 166

170 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa SARRERA Moluskuetan, liseri-guruinaren epitelioko zelulamoten osaketa larriki aldatuta suerta daiteke kutsatzaile-esposizio subletalen ondorioz (Rasmussen et al., 1983, Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; 1996; 1998a; 1998b; Soto et al., 2002). Efektu hori, zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type replacement) izenaz ezagutu da, eta orokorki zelula basofilikoen dentsitate bolumetriko edo kopuru erlatibo gisa neurtu da (Rasmussen et al., 1983, Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; 1996; 1998a; 1998b; 1. Kapitulua). CTR, kutsadura oean gerta daitekeen zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) proliferazioaren ondorioa dela iradoki da (Thompson et al., 1974; Rasmussen et al., 1983, Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; 1996). Haatik, Cd pean mantendutako magurioetan behatutako zelula basofilikoen itxurazko areagotzea nagusiki liseri-zelulen galera (DCL; ingeleraz, Digestive Cell Loss) eta aldi bereko zelula basofilikoen hipertrofiaren (BDH; ingeleraz, Basophilic Cell Hypertrophy) ondorioa dela frogatu da berriki (4. Kapitulua). DCL, liserizelulen proliferazio eta heriotzaren arteko desorekaren ondorioa dela dirudi, nahiz eta liserizelulen kopuruaren galera netoa suertatu, Cd peko esposizioak liseri-zelulen proliferazioaren emendioa eragiten baitu (4. Kapitulua). Muskuilu zein magurioetan, liseri-guruinaren epitelioa bi zelula-mota nagusiz osaturik dago, liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia; hortaz, "itxurazko" CTR, epitelioko zelula-kopuruaren galera netoa ematen denez, DCLren ondorio zuzena dela onar genezake (1. eta 4. Kapituluak). Lehorreko gastropodoen liseri-guruineko epitelioa, ordea, morfologikoki desberdintzatutako hiru zelula-motez osaturik dago: liseri-zelulak (ugarienak), iraizte-zelulak eta kaltzio-zelulak (basofilikoak) (Sumner, 1965). Hala ere, iraiztezelulak, bizi-zikloaren azken urratsetan dauden liseri-zelulak, eta ez hirugarren zelula-mota desberdintzatua, izango liratekeela proposatu da, (Porcel et al., 1996; Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Molusku itsastarretan bezala, kaltzio-zelulen (zelula basofilikoen) hipertrofia eta kopuru erlatibo emendatuaren berri eman da metalen pean mantendutako lehorreko bareetan (Marigómez et al. 1996; 1998a). Hala ere, iraizte-zelulen proportzio erlatiboa ere emenda daiteke (Marigómez et al., 1998a) eta, beraz, bareen liseriguruinean hiru zelula-motetan gertatzen diren aldaketak "itxurazko" CTR gainean nola eragiten duten argitu beharra dago. Are gehiago, Cd eta Zn pean mantendutako magurio eta muskuiluetan behintzat, "itxurazko" CTR egun gutxiren buruan itzulgarria denez (1. eta 4. kapituluak), moluskuen liseri-guruineko epitelio-zelulen berriztatzearen ikuspegi orokorra eskuratzeko asmoz, erantzun hori zelula-moten osaketa konplexuagoa duten 167

171 Emaitzak eta eztabaida bareen liseri-guruinean ere itzulgarria ote den argitzea komenigarria iruditu zitzaigun. Beste alde batetik, muskuiluen kasuan metalesposizioak eragindako CTRk autometalografia (AMG) bidez errebelatutako zilarreezko haupeakin beltzen (BSD; ingeleraz, Black Silver Deposits) BSD-hedapenaren moduko esposiziobiomarkatzaileen gainean eragina duena badakigu (Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Hala ere, Cd pean jarritako magurioetan ez dirudi DCLk BSDhedapenaren gainean eragina duenik, lisosomen barneko BSDen neurketa mikroskopikoak liserizeluletan modu errazean egin baitaitezke, zelula basofilikoak taldekaturik agertu ohi direlako. Bareetan, metal desberdinen arabera emaitza desberdinak erdietsi dira. Dietan 1000 µg Hg/g dosi pean 3 aste baino gehiagoz tratatutako bareetan, liseri-guruineko epitelioan suertatutako zelulamoten osaketaren aldaketak Vv BSD (BSDen dentsitate bolumetrikoa) esangarriki eragin zuen, liseri-epitelioa nagusiki BSDrik gabeko iraiztezelulez osaturik baitzegoen (Marigómez et al., 1996). Merkurio pean mantendutako bareetan, BSD liseri-zeluletan bereziki ugariak, iraizte-zeluletan esangarriki urriagoak eta kaltzio-zeluletan bakanak zirela aipatu beharra dago. Aitzitik, Zn pean mantendutako bareetan, zelula-moten osaketak ez zuen BSD-hedapenean eraginik izan, AMG bidez errebelatutako BSDak hiru zelula-motetan lokalizatu baitziren (Marigómez et al., 1998a). Cd pean jarritako bareetan, aurretiko behaketek BSDak iraizte-zeluletan ere bazeudela erakutsi zuten, eta, beraz, lotugai-multzo eskuragarrien arabera metal desberdinak zelula-mota desberdinetan bahitu daitezkeela kontuan hartuz (Marigómez et al., 2002), Cd-aren presentzian zelula-moten ordezkapenean behatutako aldaketek BSD-hedapenaren moduko metal-esposizioaren biomarkatzaileen gainean eragina duten ikertzea planifikatu genuen. Azkenik, metal indibidualen, metalen nahasketen, zein kutsatzaile organikoen pean jarritako bareen liseri-gurineko epitelioan ere "itxurazko" CTR deskribatu da (Müller, 1994; Marigómez et al., 1996; 1998a; 6. Kapitulua), baina metal eta konposatu organikoen nahasketek eragindako efektuei buruz ez dago datu eskuragarririk, guk dakigunez. Moluskuen liseriguruinean, zelula-moten osaketari dagokionez metal eta hidrokarburoen nahasketen eta kutsatzaile indibidualen eragina desberdina denez (1. Kapitulua), ikerlan honetan Cd eta kerosenozko (beren urari egokitutako frakzioa, hain zuzen; WAF: ingeleraz, Water Accommodated Fraction) nahasketa kutsatzaile eredu gisa aukeratu zen. Horrela, ikerlan honetako helburuak hurrengoak dira: (1) metal (Cd) eta kutsatzaile organikozko (keroseno-waf) nahasketa pean mantendutako bareen liseri-guruinean DCL dagoen den finkatzea; (2) magurioetan bezala, kutsatzaileen pean jarritako bareen liseri-guruinean, DCL prozesu itzulgarria den frogatzea; eta (3) zelula-moten osaketan gertatutako aldaketek BSD-hedapena moduko esposizio-biomarkatzaileen gainean eragina duten argitzea. Helburu horiekin, Delika (Euskal Herria) inguruko toki garbi batetik Arion ater bareak hartu ziren. Kadmio eta keroseno-waf nahasketaren dosi subletal pean 27 egunez jarri 168

172 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa ziren, eta ondoren laborategiko egoera garbitan mantendu ziren 7 egunez. Neurketa osagarri gisa, elikatze-jarduera eta hazkuntza, egunero neurtu ziren. Bareen liseri-guruineko Cd eta kerosenoaren kontzentrazioak, absortzio atomikozko espektrofotometria (AAS) eta gaskromatografia/masa-espektrometria (GC/MS) bidez neurtu ziren, hurrenez hurren. Halaber, AMG bidez errebelatutako BSDen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) eta azil-koa oxidasa (AOX) entzimaren jarduera bareen liseri-guruinean, metalen eta konposatu organikoen esposiziobiomarkatzaile gisa aplikatu ziren, hurrenez hurren. Bareen liseri-guruinaren epitelioa osatzen duten hiru zelula-moten dentsitate bolumetrikoa (Vv DIG, Vv EXC, Vv CAL ) hematoxilina-eosinaz tindatutako parafinazko ebakien gainean estereologia erabiliz kalkulatu zen. Gainera, liseri-guruinen bolumenunitate arbitrario bateko zelula-kopuru absolutua ere estimatu zen. Azkenik, bromodeoxiuridina (BrdU) immunohistoki-mika erabiliz zelula proliferatzaileak identifikatu ziren. MATERIAL ETA METODOAK Erreaktibo kimikoak Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkataletxekoak dira besterik agertu ezean. Diseinu esperimentala eta laginen prozesaketa Arion ater (Linnaeus) lehorreko bareak Iberiar penintsularen iparraldeko Delikako (42º 58 I, 3º 1 M) gune landatar garbian ekainaren bukaeran (ar-fasea) hartu ziren. Animaliak laborategira garraiatu ziren, eta 15 aleko taldeetan mantendu ziren, aireztapen egokia baimentzeko saretxo batez estalitako 3 l-ko kutxetan. Kutxak, egunero dabilur ugariz garbitu ziren, esperimentuak iraun bitartean. Elikagairik gabeko moldatze-denbora (7 egun) igaro ondoren, bareak egunero azenario, sagar, uraza eta kalabaza zati proportzionalak zituen eta %1.5 agar uretan zuen "dieta naturalez" elikatu ziren. Hogei bare, Cd (10 Cd µg/g) eta %30 keroseno-waf nahasketaz tratatu ziren. WAFa, 900 ml ur distilatu eta 100 ml keroseno gau osoan 20ºC-tan etengabe irabiatzen nahastuz ekoiztu zen. Kadmioa, agar-disoluzioa prestatzeko erabili zen uretan kloruro gatz moduan disolbatu zen, agar-disoluzioa %30 WAF eta %70 ur distilatuan prestatu zelarik. Horrela janariaren Cd eta kerosenoaren kontzentrazioak µg/g ehunpisu lehor eta µg/g ehun-pisu lehor izan ziren, hurrenez hurren. Aldi berean, esposatu gabeko kontrol seriea ere mantendu zen. 27 egun ondoren, Cd + keroseno nahasketaz tratatutako bareak 7 egunez "dieta naturalez" elikatu ziren, arazte-prozesua ikertzeko asmoz. Tratamenduaren erreplika-serie bat gehitu genuen, bestearen baldintza berberetan mantendu zena. Janaria egunero aldatu zen. Elikatze-jarduera determinatzeko, emandako janaria eta utzitako janaria egunero pisatu ziren. Bareak ere egunero eta taldeka pisatu ziren. Esperimentuan zehar analisi kimiko eta biologikoak egiteko hainbat animalia beharrezkoak 169

173 Emaitzak eta eztabaida zirenez, erabilitakoak erreplika-serieko barez ordezkatzen ziren animalien dentsitatea konstantea mantentzeko asmoz. Izan ere, lehorreko gastropodoen fisiologia populazio-dentsitatearen arabera esangarriki aldatzen dela deskribatu da (Runham & Hunter, 1970). Analisi kimikoak Disekzionatutako liseri-guruinak (tratamenduko 18. egunean, eta 7 egunetako arazte-aldia eta gero), ur distilatuan garbitu ziren, eta 120ºC-tara 48 orduz labean berotu ziren, guztiz lehortu arte. Lehortutako materiala almerizaren laguntzaz txikitu zen, eta azido nitriko kontzentratuan liseritu zen. Ondoren, plaka beroan azido nitriko kontzentratua lurrundu ostean, liseritutako materiala ur distilatuan diluitutako (0.1 M) azido nitrikoan berresekitu zen. Laginak absortzio atomikozko espektrofotometroan (PerkinElmer 2280, Wellesley, Massachusetts, Amerikako Estatu Batuak) neurtu ziren. Kadmioaren kontzentrazioak, µg Cd/g ehun pisu lehor modura kalkulatu ziren. Erabilitako estandarrak Merck merkatal-etxeak (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) zertifikatutakoak izan ziren. Kerosenoa neurtzeko, disekzionatutako liseriguruinak (tratamenduko 18. egunean, eta 7 eguneko arazte-aldia eta gero), ur distilatuan garbitu ostean izoztu egin ziren. Izoztutako materiala, liofilizatu, txikitu eta pisatu zen. Ondoren, azetonan murgilduta ultrasoinuen bidezko erauzketari ekin zitzaion. Iragazi ondoren laginak FID detektagailua zuen HP 6890 gaskromatografo/masa-espektrometroan (Hewlett- Packard, Palo Alto, California, Amerikako Estatu Batuak) neurtu ziren. Analisi biologikoetarako esperimentuko 0., 3., 18., eta 27. egunetan eta arazte-aldiko 7. egunean 5 bare disekzionatu ziren taldeko. Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean (%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10 azido azetikoa) fixatu ziren ordu batez 4 C-tan. Fixatu ondoren, laginak goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean deshidratatu ziren, eta parafinan inkluditu ziren 60 C-tan. 7 µm-ko lodiera zuten ebakiak mikrotomoan lortu ziren, eta hematoxilinaeosinaz tindatu ziren behaketa morfologikoak eta zelula-moten osaketaren neurketak burutu ahal izateko. Autometalografia Parafinazko ebakiak xilolezko bainuetan desparafinatu ostean, beheranzko graduazioko etanoletan hidratatu ziren. Parafinazko ebakiak labean (40ºC) mantendu ziren guztiz lehortu arte. Laginak argazki-emultsio geruza mehe eta uniformez estali ziren, gela ilunean (Ilford Nuclear Emulsion L4, Ilford, Mobberley, Ingalaterra). Gerora, laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean (30 minutu), eta errebelatzaile komertziala erabiliz Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur distilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt, Alemania) errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren, errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikozko disoluzioan minutu batez murgilduz geldiarazi zen. Azkenik, fixatzaileaz (Agfa Agefix, Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) 10 minutuz fixatu ziren. Laginak, Kaiser gelatina glizerinatuan 170

174 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa muntatu ziren. Metal-ioien presentzia, zilarrezko hauspeakin beltzen agerpenak adierazten du (Danscher, 1984; Soto et al., 1998). BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan irudianalisiaren bitartez Liseri-zelulen lisosometan zeuden BSDen azalera irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto & Marigómez, 1997), emaitzak BSDen dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (Vv BSD ). Argimikroskopiazko irudiak (x100 handipenean) B&W- CCD TV kamera, HR-TV kolorezko pantaila, Leitz mikroskopioa, PC ordenagailua, PIP 1024 (Matrox Electronic Systems Ltd., Dorval, Kanada) sistema eta Sevisan (Bilbo, Espainia) entrepresak garatutako softwarea erabiliz eskuratu ziren. Ondoren, eskuz eta softwarearen laguntzarekin liseri-zelulen lisosometako BSD eta zitoplasma bereizteko segmentazio-prozedura aplikatu zen. Neurketak bare bakoitzean 5 eremutan burutu ziren, eta talde esperimental bakoitzean 5 bare erabili ziren; tratamendu bakoitzeko guztira 25 neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.-ek (1981) proposatutako formulak erabiliz egin ziren. Hau da, BSD partikulen tamaina ebakiaren lodiera baino txikiagoa zela kontuan hartuz, Holmes efektua zuzentzeko faktorea aplikatu zen. Epitelioaren konposizio zelularraren analisi estereologikoak Hematoxilina-eosinaz tindatutako lagin berberak erabiliz (7 µm), liseri-zelulen (Vv DIG ), kaltzio-zelulen (Vv CAL ) eta iraizte-zelulen (Vv EXC ) dentsitate bolumetrikoak kuantifikatzeko prozedura estereologikoa aplikatu zen. Horretarako lagin bakoitzean azarez aukeratutako zelai batean egin ziren kontaketak, guztira talde esperimental bakoitzeko 5 kontaketa burutuz. Analisi estereologikoak burutzeko Nikon Optiphot mikroskopioari atxiki zegoen irudi-hodia erabili zen (orotariko handipena: x670). Vv DIG, Vv CAL eta Vv EXC kalkulatzeko Weibel gratikula (multipurpouse test system M-168; Weibel, 1979) erabili zen, eta liseri-zelula, iraizte-zelula zein zelula basofilikotan eroritako puntuak zenbatu ziren, dentsitate bolumetrikoak Delesse printzipioaren arabera kalkulatzeko (Weibel, 1979). Liseri-zelula, kaltzio-zelula eta iraizte-zelulen estimazio absolutuak dentsitate bolumetrikoen datuetan oinarrituz burutu ziren. Liseri-, kaltzio- eta iraizte-zelulek betetzen zuten bolumenak (V DIG =Vv DIG x 17.8 x 10 6 µm 3 ; V CAL =Vv CAL x 17.8 x 10 6 µm 3 ; V EXC =Vv EXC x 17.8 x 10 6 µm 3 ) arbitrarioki aukeratutako liseri-guruinaren bolumen batekiko kalkulatu ziren (17.8 x 10 6 µm 3 gutxi gorabehera): bolumen hori kalkulu estereologikoak egiteko erabilitako Weibel gratikularen ( µm 2 ) arbitrarioki aukeratutako 50 µm-tako lodierako ebakidurari dagokio. Lodiera horrek, kaltzio-zelula handiena guztiz barneratua egotea ahalbidetzen du. Ondoren, liseri-guruineko zati arbitrario horretan liseri-, kaltzio- eta iraizte-zelulen kopurua kalkulatzeko, zelula-mota guztiek tamaina konstantea zutela onartu zen. Horrek iraizte- eta kaltzio-zelulen tamainaren azpiestimazioa ekarriko zuen, kutsatzaile pean egondako bareetan behintzat. 171

175 Emaitzak eta eztabaida AOX peroxisomikoaren jarduera AOX jarduera espektrofotometrikoki determinatu zen, 502 nm-ko uhin-luzeera erabiliz, Small et al.-ek (1985) ezarritako metodologia jarraituz. Bareen liseri-guruinak 4 ml/g ehun ph 7.6 zuen TVBE indargetzailean (1 mm sodio bikarbonatoa, 1 mm EDTA, %0.1 etanola eta %0.01 Triton X-100) teflonezko homegenizatzailea erabiliz izotzezko bainuan homogenizatu ziren. Lagin homogenizatuak 500 g-tara zentrifugatu ziren 15 minutuz 4ºC-tan eta, ondoren, AOX jarduera neurtzeko, gainjalkina TVBE indargetzailean 10 aldiz diluitu zen. Saiakerak, 30 µm palmitoil-coa oxidasa substratu gisa erabiliz, peroxidasa endogenoak katalizatutako diklorofluoreszeina diazetatoaren (Molecular probes, Eugene, Oregon, Amerikako Estatu Batuak) H 2 O 2 menpeko oxidazioa du oinarri. Orotariko proteinakontzentrazioa Lowry et al.-ek (1951) garatutako metodoan oinarritutako DC protein assay (BioRad, Hercules, California, Amerikako Estatu Batuak) erabiliz kalkulatu zen, estandar gisa γ-globulina erabiliz. BrdU immunohistokimika Liseri-guruineko zelula proliferatzaileak BrdU immunohistokimika bidez lokalizatzeko, 27. esposizio-eguneko eta arazte-aldi osteko bareei 3.5 mg BrdU injektatu zitzaien oinean zehar. Carnoy-z fixatutako eta parafinan inkluditutako ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) American Optical mikrotomoan lortu ziren, eta aldez aurretik (3-amino propil trietoxisilanoz) silanizatutako portaobjektuetan jaso ziren. Ondoren, laginak xilenoz desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko etanolezko bainu-seriean hidratatu eta fosfato indargetzaile salinoz (PBS; ingeleraz, Phosphate-Buffered Saline) garbitu ziren. DNA, 0.1 N HCl-ez desnaturalizatu zen ordu batez, 37 C-tan. Ebakiak, %5 bovine serum albumine (BSA) zuen suero blokeatzailean ordu batez inkubatu ziren girotenperaturan eta berriro ere PBS-z garbitu ziren. Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza); %0.1 BSA zuen PBSan 1:10 diluitua) inkubatu ziren. Laginak PBS-z garbitu ziren, eta ondoren, abidina-biotina entzima-konplexua erabiliz antigorputza ikustarazi zen. Laburki, ebakiak, PBS-an diluitutako saguaren aurkako ahuntzaren IgG antigorputz sekundario biotinilatuan inkubatu ziren, 30 minutuz, eta ondoren PBSn garbitu ziren. Fosfatasa alkalinoa jarduera ikustarazteko kromogenoaren disoluzioa (naftol fast-red zuen PBS indargetzailean disolbatua) erabili zen. Azkenik, ebakiak Mayer hematoxilinaz kontrastatu (1 minutu), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50 (Olympus, Tokio, Japonia) mikroskopioari atxiki zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi ziren. EMAITZAK Bare kontrolek elikatze-jarduera konstantea erakutsi zuten esperimentuak iraun bitartean (1B Ird.). Maneiu esperimentalak eta laborategiko baldintzek jaitsiera txikia eragin zuten bareen 172

176 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa pisuan (1A Ird.). Esperimentuko lehengo sei egunetan bare kontrolek zein kutsatzaileen pean jarritako bareek antzeko elikatze-jarduera eta hazkuntza erakutsi zuten (1. Ird.). 10. egunetik aurrera, berriz, kutsatzaile pean jarritako bareetan elikatze-jardueran jaitsiera nabarmena behatu zen, eta momentu horretatik aurrera beraien pisua kontrolena baino txikiago gertatu zen. Arazte-aldia igaro eta gero, elikatze-jardueran nolabaiteko susperraldia antzeman zen arren, ez zen bareen pisuaren igoeran islatu. Hala ere, momentu horretaraino neurtutako etengabeko pisu-galerak ez zuen luzaroago jarraitu (1. Ird.). Bare kontroletan neurtutako Cd kontzentrazioak baxuak izan ziren, zelaitik hartutako bareetan neurtutakoen antzekoak, eta aldaketarik gabe mantendu ziren esperimentuak iraun bitartean. Bestalde, kutsatzaileen pean jarritako bareetan Cd kontzentrazioa kontroletan neurtutakoak baino 10 aldiz handiagoak izan ziren esperimentuaren 18. egunean, eta arazte-aldia bukatu ondoren balioak kontroletan neurtutako mailetara itzuli ziren (1. Taula). Keroseno kontzentrazio tisularrei dagokienez, kutsatzaileen pean 18 egunez jarritako bareetan neurtutako kontzentrazioa kontroletan baino 3 aldiz handiagoa izan zen esperimentuaren. Arazte-aldia bukatu ondoren, bere aldetik, liseri-guruinaren keroseno kontzentrazioak kontroletan neurtutako mailetara itzuli ziren (1. Taula). Kutsatzaile pean jarritako bareetan, BSDak liseri-zelulen lisosometan eta iraizte-zelulen bakuoloetan lokalizatu ziren (2B Ird.). Gainera, liseri-azinoen lumenera iraizitako eta jatorri lisosomiko zuten liseri-zelulen hondakinek BSD nabarmenak erakutsi zituzten (2C Ird.). Horretaz gain, zenbait laginetan liseri-epitelioaren xafla basalean BSDen presentzia detektatu zen. Kontrol eta araztutako bareen liseri-guruinetan ez zen apenas BSDen presentziarik aurkitu (2A eta 2D Ird.). Horrekin lotuta, bare kontrolek Vv BSD maila basalak erakutsi zituzten. Tratamendu pean jarritako bareetan, Vv BSD maila denbora aurrera 1. Irudia: Bare kontrol eta Cd + keroseno pean mantendutako bareen pisuaren aldaketa (A) eta elikatze-jarduera metatua (B). Puntu zuriak bare kontrolei dagozkie eta puntu beltzak kutsatzaileen nahasketaz tratatutako bareei. Beheko geziak esposizio- eta arazte-aldiaren nondik norakoak adierazi ditu. 173

177 Emaitzak eta eztabaida 1. Taula: Bare kontrol eta Cd + keroseno pean jarritako bareen liseri-guruinetan neurtutako Cd eta kerosenoaren adierazgarriak diren hidrokarburoen gehiketaren kontzentrazioak (µg/g ehun-pisu lehor) esperimentuko 18. egunean eta arazte-aldia bukatu ondoren. Cd Kontzentrazioa 18. Eguna Arazte-aldia Kontrola ± ±36.6 Cd + keroseno ± ±25.6 Keroseno Kontzentrazioa 18. Eguna Arazte-aldia Kontrola ± ±41.25 Cd + keroseno ± ±52.13 joan heinean handitu zen (3. Ird.), 18 eta 27. egunetan bereziki agerian gelditu zena. Araztearen 7 egunak igaro eta gero, Vv BSD balioak kontrolen mailetara itzuli ziren (3. Ird.). 2. Irudia: Metalen lokalizazio autometalografikoa Arion ater barearen liseri-epitelioan: bare kontroletan (A), Cd + keroseno pean 18 egun egondako bareetan (B), Cd + keroseno pean 27 egun egondako bareetan (C eta irudi txikia), eta 7 eguneko arazte-aldia jaso zuten bareetan (D). L, liseri-epitelioaren lumena; gezi-buruak, liseri-zelulen lisosometan dauden zilarrezko hauspeakin beltzak, geziak, liseri-epitelioko lumenean dagoen metala. Eskala-marra: 25 µm. 174

178 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa Peroxisomen proliferazioaren adierazle gisa neurtutako azil-koa oxidasa (AOX) jarduera Cd + keroseno nahasketa pean induzitu zen 3. egunean (4. Ird.). Gerora, AOX jarduera esangarriki jaitsi zen, kontrol zein esposatutako bareetan, eta ez zen aurkitu taldeen arteko desberdintasun esangarririk (4. Ird.). Bare kontrolen liseri-guruina nagusiki liserizelulez osaturik agertu zen, eta iraizte- zein kaltziozelula urriak taldekaturik agertu ziren (5A Ird.). 18 (5B Ird.) eta 27 (5C Ird.) egunez Cd + keroseno nahasketaz tratatu ondoren, iraizte-zelulen kopurua esposizio-denborarekin emendatu zela bistakoa zen. Modu berean, kaltzio-zelulak ere nabarmenagoak suertatu ziren, eta gainera itxuraz hipetrofiaturik ageri ziren,(5b Ird. eta 5C irudi txikia). Kutsatzaileen peko esposizioaren ondorio gisa, odol-hodiak erlatiboki ugaritu ziren, eta euren paretetako Leydig zelulak puztuta agertu ziren. Zazpi eguneko arazte-aldiaren ondorioz, liseriguruinaren epitelioak kontrolen itxura berreskuratu zuen (5D Ird.), liseri-zelula ugari eta iraizte-zelula esangarria aurkitu zen esperimentuko 3. egunetik aurrera, hortik aurrera antzeko balioak (inoiz ez 0.7 baliotik behera) lortu zirelarik. Araztearen ondorioz, Vv DC balioen igoera esangarria behatu zen, bare kontrolen antzeko balioak eskuratuz (6A Ird.). Liseri-zelulen batezbesteko tamaina (8 µm-ko diametro eta 50 µm altuera) kontuan hartuz, gutxi gorabehera liseri-guruineko 17.8 x 10 6 µm 3 zati batean (kalkulu estereologikoak burutzeko erabili den Weibel gratikularen kaltzio-zelula handiena barneratzea ahalbidetzen duen 50 µm-ko lodiera arbitrarioaren ebakidurari dagokiona), liseri-zelulen kopurua 4275±487 (3. eguna) eta 4797±111 (27. eguna) bitartekoa izan zen bare kontroletan; eta kutsatzaile pean jarritako bareetan, ordea, 3736±647 baliora jaitsi zen (21. eguna). Zazpi eguneko arazte-aldiaren ondoren, liseri-zelulen kopurua 5344 baliora igo zen (6B Ird.). Vv EXC eta iraizte-zelulen kopuruan aldaketa deigarriagoak antzeman ziren (6C eta 6D Ird.). Vv EXC 3. egunetik aurrera hiru aldiz handiagoa izan zen kutsatzaile pean jarritako bareetan kontroletan baino, arazte- urriez eratuta egonik; kaltzio-zelulek oraindik ere nolabaiteko hipertrofia erakusten jarraitu zuten arren. Aurrekoarekin bat, Vv CAL, Vv EXC eta Vv DIG parametroek, Cd + keroseno nahasketa pean jartzeak eta ondorengo arazte-aldiak bareen liseriguruinaren zelula-moten osaketan aldaketa esangarriak eragin zituztela adierazi zuten (6. Ird.). Bare kontroletan Vv DC balioek ez zuten aldaketarik erakutsi, eta modu iraunkorrean 0.8 baliotik gora mantendu ziren. Kutsatzaileen pean jarritako bareetan, berriz, parametro horretan jaitsiera 3. Irudia:.Bare kontrol (zutabe zuria) eta Cd + keroseno pean mantendutako (zutabe grisa) bareen lisosometan neurtutako zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ). Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte (p<0.05). Kutsatzaile pean mantendutako bareen arazte-aldian animalia bakarra zegoenez, ez dago desbidazio estandarrik. 175

179 Emaitzak eta eztabaida aldiaren ondoren balioak berriro ere bare kontrolen mailetara itzuli zirelarik (6C Ird.). Horrela, iraiztezelulen kopurua 243-tik 748-ra emendatu zen, arazte-aldiaren ondoren 224-ra bueltatu zen bitartean. Bestalde, Vv CAL balioei dagokienez, ez zen desberdintasun esangarririk behatu (6E eta 6F Ird.). Orotara, epitelio-zelulen kopurua ez zen desberdina izan ez esposizio ezta arazte-aldiaren ondorioz ere (6G Ird.). BrdU immunohistokimika BrdU-positiboak ziren bareen liseri-guruineko zelulen nukleoek kolore gorria erakutsi zuten (7. Ird.). Liseri-epitelioan batez ere liseri-zelulak positiboki markaturik aurkitu ziren, eta nahiz eta iraizte-zelulen lipofuszinen materialak erreakzionagarritasuna erakutsi, errez bereiz zitekeen nukleo positibo eta sasipositibotasunaren artean (7G Ird.). Urdailaren epitelioan ere nukleo BrdU-positiboak behatu ziren (7E Ird.). Cd + keroseno nahasketa pean jarritako bareetan, eta baita arazte-prozesua pairatu zutenetan ere, talde kontroletan baino nukleo BrdU-positibo gehiago 4. Irudia: Bare kontrol (zutabe zuria) eta Cd +keroseno pean mantendutako (zutabe grisa) bareen liseri-guruinean neurtutako AOX jarduera. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoak taldeen arteko desberdintasun esangarria adierazi ditu (p<0.05). Kutsatzaile pean mantendutako bareen arazte-aldian animalia bakarra zegoenez, ez dago desbidazio estandarrik. aurkitu ziren. (7B-D eta F Ird.). BrdU aurkako antigorputzik gabe inkubatutako tindaketaren ebaki kontroletan ez zen inolako positibotasunik topatu. EZTABAIDA Ikerlan honetako emaitzek, Cd + keroseno nahasketaz tratatzeak bareen liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketak sortarazten dituela erakutsi dute, aldaketa horiek liseri-zelulen proportzioa gutxiagotzea eta iraizte-zelulena handiagotzearekin zerikusia izanik. Gainera, erantzuna 7 egunetan guztiz itzulgarria dela frogatu egin da, ikerlan honetako baldintza esperimentaletan behintzat. Cd + keroseno pean jarritako bareek, metala eta kerosenoa metatu zituzten euren ehunetan, liseriguruinaren AAS eta GC/MS bitaeteko analisiek erakutsi zutenez. Lehorreko gastropodoen liseriguruineko kutsatzaileen kontzentrazioa ingurumeneko esposizio-mailekin esangarriki erlazionatuta dagoena jakina da (Popham & D'Auria, 1980; Ireland, 1981; Marigómez et al., 1998a; Beeby & Richmond, 2002; Hamers et al., 2004). Beraz, esperimentalki trataturiko bareen liseri-guruinean aurkitutako Cd eta keroseno kontzentrazioen gorakada esangarriek, aplikatutako kutsatzailearen esposizio-modua eraginkorra izan zela egiaztatu zuten. Antzeko esposizio-modua beste metal toxikoen kasuan aplikatu da aldez aurretik (Marigómez et al., 1986a; Recio et al., 1988a; 1988b; Marigómez et al., 1996), baina kerosenoaren kasuan (WAFa lortzea eta dieta 176

180 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa naturalean gehitzea) zeharo hurbilketa berria izan zen. Esposizio-biomarkatzaileek ere, kimika analitikoaren datuak baieztatu zituzten. Cd + keroseno nahasketaz tratatutako bareen liserizeluletako lisosometan Vv BSD esangarriki igo izana, metal-esposizioaren adierazle moduan har dezakegu. Era berean, Hg pean egoteak, liserizeluletako lisosometan BSDen presentzia areagotua dakar (Marigómez et al., 1996). Metalen metaketa, moluskuen liseri-guruinean oso erantzun azkarra dena jakina da; izan ere, Cd pean mantendutako muskuiluetan egun bakar batean Vv BSD balioak esangarriki goratu ziren (Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Ikerlan honetan, Vv BSD parametroan behatutako aldaketak, denbora eta dosiaren menpekoak dira. Hortaz, kerosenoaren presentziak bareen liseri-guruinean Cd-aren metaketa oztopatu ez zuela ondoriozta daiteke. Halaber, Cd + bezo(a)pireno (BaP) pean jarritako muskuiluetan, kutsatzaile organikoaren presentziak ez zuen Cd-aren metaketa oztopatu liseriguruinean (Marigómez et al., 2005; 1. Kapitulua). Bestalde, keroseno eta Cd nahasketa pean jarritako bareetan, azil-koa oxidasa (AOX) jarduera bare kontroletan baino altuagoa izan zen esperimentuko 3. egunean, bareak kutsatzaile organikoen pean (kasu honetan kerosenoa) egon izanaren seinale (Cancio & Cajaraville, 2000). AOX jarduera estabulazio denborarekin jaitsi zen, 5. Irudia: Arion ater barearen liseri-guruinaren ebakiak, hematoxilina-eosinaz tindatuak: bare kontrolak (A); Cd + keroseno pean 18 egunez mantendutako bareak (B); Cd + keroseno pean 27 egunez mantendutako bareak (C eta irudi txikia); eta 7 eguneko arazte-aldia jaso duten bareak (D). Asteriskoak, iraizte-zelulak; geziak, kaltzio-zelulak; gezi-buruak, askatzen ari diren kaltziozelulak; L, liseri-azinoen lumena. Eskala-marra: 50 µm (A,-D); 25 µm (irudi txikia). 177

181 Emaitzak eta eztabaida kutsatzaile pean egondako bare zein bare kontroletan antzeko jarduerak neurtu zirelarik esperimentuko 3. egunetik aurrera. Optimoak ez diren elikatze- eta mantenu-egoera esperimental luze hauetank, AOX jarduera induzitu ez izana ez da harrigarria. Dakigunaren arabera, peroxisomen proliferazioaren adierazlea den AOX jarduera (Cajaraville et al., 2003) honako honetan erabili da lehenendo aldiz lehorreko gastropodoetan kutsatzaile organikoen esposizio-biomarkatzaile gisa. Bibalbioen AOX jardueran, indibiduoen elikadura-egoerak, maneiu-esperimentalak eta 6. Irudia: Bare kontrol (zutabe zuria) eta kutsatzaile pean mantendutako (zutabe grisa) bareen zelula-moten osaketaren aldaketak. (A) Liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liserizelulen kopurua. (C) Iraizte-zelulen dentsitate bolumetrikoa. (D) Iraizte-zelulen kopurua. (E) Kaltzio-zelulen dentsitate bolumetrikoa. (F) Kaltzio-zelulen kopurua. (G) Zelulen kopuru totala. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte (p<0.05). Kutsatzaile pean mantendutako bareen arazte-aldian animalia bakarra zegoenez, ez dago desbidazio estandarrik. 178

182 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa ugalketa-zikloak eragina izan dezakete (Cancio et al., 1999; Cancio & Cajaraville, 2000; Orbea et al., 2002). Bareetan, ugal-garapenaren aldaketak aste gutxiren buruan gerta daitezke (Marigómez et al., 1986; Zubiaga, 1986) eta beraz, uztailan zehar, feminizazioaren aurretik, non gameto arrak ia guztiz garatuak dauden, AOX jardueran aldaketak gertatzea ezin daiteke baztertu. Ikerlan honetan gertatu den bezala, Cd eta BaP nahasketaren pean mantendutako muskuiluetan, AOX jarduera soilik esposizio-egun baten ondoren erantzuteko gai izan zen, momentu horretatik aurrera, AOX jarduerak baxuak izan ziren, muskuilu tratatui eta muskuilu kontrolen artean berdintsuak izan zirelarik (Orbea et 7. Irudia: Arion ater barearen liseri-azinoen epitelioan eta urdaileko-epitelioan egindako BrdU immunohistokimika: Bare kontrola (A); Cd + keroseno pean 27 egunez egondako barea (B); 7 eguneko arazte-aldia jaso duten bareak (C-G). Gezi-buruak, nukleo BrdU-positiboak; zirkuluak, lipofuszinek sortutako marka sasipositiboak. Eskala-marra: 50 µm (A-E); 25 µm (F & G). 179

183 Emaitzak eta eztabaida al., 2002). Era berean, BaP pean jarritako bareetan, kutsatzaile kimikoen esposizio-biomarkatzaile gisa erabilitako benzo(a)pireno hidroxilasa (BPH) jarduera, soilik esperimentuko 3. egunean induzitu zen, baina ez esposizio-denbora luzeagoetan (Hamers et al., 2004). Halaber, BaP pean jarritako muskuiluetan, esposizio osteko egun gutxitara bakarrik induzitzen da BHP jarduera (Okay et al., 2000). Beraz, nahiz eta esposizioaren 3. egunetik aurrera erregistratutako AOX jarduera baxua izan, AOXren indukzio azkarrak, ikerlan honetan erabilitako kerosenoaren esposizio-modua eraginkorra izan zela argiro erakutsi du. Elikatze-jarduera eta hazkuntza, neurri osagarri gisa erregistratu ziren esperimentuan zehar. Bare zein barraskiloetan, kutsatzaile pean egoteak elikatze-jardueran eta hazkuntzan beherakada esangarriak sor ditzake (Russell et al., 1981; Marigómez et al., 1986b; Laskowski & Hopkin, 1996; Swaileh & Ezzughayyar, 2000; 5. Kapitulua). Hortaz, metalez (Cu, Zn eta Cd) kutsatutako tokietatik hartutako bareek, kutsatugabeko tokietan hartutako bareekin alderatuz, gorputz osoaren eta liseri-guruinaren pisu lehorrean %50-eko murrizketa erakutsi zuten (Marigómez et al., 1998a). Efektu horri dagokionez, eragit a metalez-metal alda daitekeela esan baharra dago. Helix aspersa barraskiloan behatutakoaren arabera, Cd-a, Zn-a eta Pb-a baino toxikoagoa da elikatze-jarduera, hazkuntza eta heriotza-tasari dagokienez (Laskowski & Hopkin, 1996). Kutsatzaile organikoek ere, elikatze-jarduera zein hazkuntzaren gainean eragina dute, laborategian BaP pean jarritako bareek erakutsi zutenez (Hamers et al., 2004). BaP pean jarritako bareetan, elikatze-jarduera modu azkarrean txikiagotu zen, baina gorputzaren pisuan aldaketak soilik hirugarren egunetik aurrera gertatu ziren (Hamers et al., 2004). Modu berean, ikerlan honetan Cd + keroseno pean jarritako bareetan, elikatze-jarduera aste batetik aurrera txikiagotu zen, hazkuntzaren murrizpena bakarrik 3. astetik aurrera ikusgarria izan zen bitartean. Metal pean jarritako lehorreko gastropodoen liseri-guruinaren xafla basalak loditu egiten dira, liseri-zelulak lehendabizi bakuolizatuak ageri eta beranduago urriagoak bilakatzen dira, kaltziozelulak hipertrofiatu egiten dira, kaltzio-zelulak eta iraizte-zelulak erlatiboki ugariagoak bilakatzen dira, eta odol-zelulak eta ehun konektiboko zelula migratzaileak liseri-azinoen inguruan metatzen dira (Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; 1998a; Recio et al., 1988a; 1988b; Ireland & Marigómez; 1992, Chabikovsky et al., 2004; Snyman et al., 2005; 6. Kapitulua). Oro har, Cd + keroseno pean jarritako bareetan irudi beretsua ikusi da, erantzuna, beraz, orokorra dela dirudi, eta ez metalkutsaduraren espezifikoa. Horrela, emaitza horiek, behatutako aldaketak kutsatzaile espezifiko batek sorterazitako erantzunak baino gehiago, estresegoera orokorraren aurrean gauzatutako erantzunak direla konfirmatu dute, aldez aurretik Marigómez et al.-ek, (1996) proposatu bezala. Hala ere, kutsatzaile organikoek beraien kabuz efektu berdinak, modu kualitatiboan behintzat, sortarazten ote dituzten zehazteko ikerlan gehiagoren beharra dago. 180

184 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa Efektu horien artean, deigarrienak liseriguruinaren epitelioan behatutako zelula-moten osaketari dagozkionak dira. Aldez aurretik laborategian egindako ikerlanek agerian utzi dutenez, moluskuen liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketa esangarriak 3 eta 21 egun bitartean, espeziearen, kutsatzaile, dosi eta esposizio-moduaren arabera eta baita ingurumenegoeraren arabera, gerta daitezke (Marigómez et al., 1996; 1 eta 4. Kapituluak). Ikerlan honetan erabilitako esposizio-modu bera erabiliz, Cu eta Hgz tratatutako bareetan, liseri-epitelioa osatzen duten zelula-moten proportzio erlatiboan aldaketak behatu dira, iraizpen-jarduera eta estrusio apokrino areagotuen ondorioz (Marigómez et al., 1986b; 1996) µg Hg/g janari dosiaz egunez elikatutako bareetan, liseri-zelulen kopurua izugarri jaitsi zen, liseri-epitelioa funtsean kaltzio-zelulez eta iraizte-zelulez osaturik geratuz (Marigómez et al., 1996). Cd kontzentrazio subletalen pean mantendutako magurioetan antzeko prozesua deskribatu da (Marigómez et al., 1990). Ikerlan honetan, Vv DIG eta Vv EXC modu esangarrian aldatu ziren, Cd + keroseno esposizio zein 7 eguneko arazte-aldiaren eraginez. Vv CAL balioak, ordea, ez ziren esangarriki aldatu. Horrela, Cd + kerosenoz tratatutako bareetan, Vv DIG esperimentuko hirugarren egunetik aurrera jaitsi zen, eta 7 eguneko arazte-aldiaren ondoren berriro ere bare kontroletan neurtutako balioetara itzuli zen. Vv EXC balioen aldaketak nabarmenagoak izan ziren, 3. tratamendu-egunetik aurrera tratatutako bareetan, kontroletan baino hiru aldiz handiagoak izatera iritsiz baina, Vv DIG -ren kasuan bezalaxe, arazte-aldiaren ondoren kontrol-mailetara itzuli ziren. Vv CAL balioei dagokienez, ez dirudi tratamenduak kaltzio-zelulen proportzioaren gain eragin esangarria izan zuenik. Aitzitik, Cu, Hg eta metaleen nahasketan (Cu, Cd, Zn) peko esposizioek kaltzio-zelulen dentsitate erlatiboaren emendioa eragiten dutela deskribatu da (Marigómez et al., 1986b; 1996; 1998). Ikerlan honetan, Vv CAL modu esangarrian aldatu ez zen arren, itxurazko kaltzio-zelulen presentzia erlatiboaren igoera susma zitekeen, mikroskopioan egindako behaketa zuzenak kontuan hartuz, behintzat. Horrekin bat, Cd + kerosenoz tratatutako Vv CAL balioen igoerako joera ageri zen, estatistikoki esangarria izan ez arren. Edozein kasutan, kaltzio-zelulen proportzioan behatutako igoerak iraizte-zeluletan behatutakoen aurrean garrantzi gutxikoak izango ziren, beste moluskuetan ez bezala (Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990; 1998b; 2005; Soto et al., 2002; 1 eta 4. Kapituluak). Liseri-zelulen batezbesteko tamaina kontuan hartuta, beraien kopurua (DCN) 17.8 x 10 6 µm 3 -ko liseri-guruineko ehun-zati arbitrario batetarako (bolumen unitate arbitrarioa) kalkulatu zen. Bare kontroletan, DCN ez zen esangarriki aldatu esperimentuak iraun bitartean, batezbesteko balioa unitate arbitrario horretan 4500 zelula baino apur bat altuagoa izanik. Cd + keroseno tratamenduaren eraginez, 750 (%17) liseri-zelula inguru galdu ziren, 7 eguneko arazte-aldiaren ondorioz unitate arbitrario bakoitzeko 1500 liseri-zelula berri agertuz. Era berean, Cd pean jarritako magurioetan 1850 (%13) liseri-zelula galdu ziren, 7 eguneko arazte- 181

185 Emaitzak eta eztabaida aldiaren ondorioz 2600 liseri-zelula berri sortu zirelarik 17.8 x 10 6 µm 3 -ko liseri-guruineko unitate arbitrarioko (4. Kapitulua). Cd pean jarritako Orokorki, lehorreko gastropodoen liseriguruinean ematen diren iraizte-jarduera eta estrusio apokrino areagotuek, alterazio lisosomikoek eta lipofuszinen metaketek, kutsatzaileen eragin magurioetan, Vv BAS eta zelula basofilikoen orokorren adierazgarritzat har ditzakegu bolumen absolutua handitu zen, baina ez zen aldaketarik behatu zelula basofilikoen kopuruan (4. Kapitulua), ikerlan honetan Cd + keroseno pean jarritako bareetan behatutako emaitzekin bat datorrena. Bestalde, Cd + keroseno pean 27 egunez mantendutako bareetan 500 (%300) iraiztezelula berri agertu ziren bolumen unitate arbitrarioko, 7 eguneko arazte-aldiaren ondorioz galdu zirenak, hain zuzen. Aipagarria da, muskuilu eta magurioetan gertatu ez bezala, epitelio-zelulen kopuru totala kutsatzaileen zein arazte-aldiaren eraginez ez zela aldatu. Iraizte-zelula, zelula-mota desberdina baino bizi-zikloaren amaieran dagoen liseri-zelula dela proposatu da (Porcel et al., 1996; Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Liseri- eta iraizte-zelulen proportzio erlatiboek kontrako zentzuan mugitzen dira baraualdian eta kutsatzaileen esposizio pean (Porcel et al. 1996; Marigómez et al. 1998; Dimitriadis & Konstantinidou 2002; 6. Kapitulua). Testuinguru horretan, ikerlan honen emaitzek, iraizte-zelulak liseri-zelula zahar edo erabiliak direnaren hipotesia sendotzen dute, liseri-zelulen eta iraizte-zelulen kopuru absolutuek, tratamendu eta arazte-aldiaren eraginez kontrako zentzua jarraitzen baitute. Metalek, bareen liseriguruineko zelulen zahartzapen goiztiarra eragin dezaketela aurretik ere proposatu da (Marigómez et al., 1986b), Cu pean (dietan zein uretango esposizioa) jarritako bareak aztertuz, hain zuzen (Marigómez et al., 1996; 1998; Chandran et al., 2005). Kuprez trataturiko bareetan, jarduera fisiologikoaren fase desberdinak histokimikoki determinatu ondoren, xurgapena, liseriketa eta jariapena tratamenduko lehenengo egunetan bizkortu ziren, fase bakoitzak gutxiago irauten zuelarik; 300 eta 1000 µg Hg/g janari tratatutako bareetan 15. egunetik aurrera, berriz, epitelioa atrofiko edo, behintzat, ez horren aktibo bilakatu zen (Marigómez et al., 1986b). Hiperaktibitate horrek, zergaitik Cd + keroseno tratamenduaren 3. egunetik aurrera liseri-zelula gehiago iraizte-zelula bilakatzen joatea azalduko luke. Ondorioz, nahiz eta magurioetan kutsatzaileek liseri-zelulen galera netoa sortarazi, konplexuagoa den bareen liseriguruinean badirudi liseri-zelulak, galdu beharrean, iraizte-zelulak bilakatzen direla. Hortaz, bareen liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketak nabarmenago irudikatzeko, iraizte-zelula/liserizelula ratioa (ECR; ingeleraz, Excretory to Digestive Cell Ratio) parametro sentikorrago gisa proposatu dugu, soilik liseri-zelula eta zelula basofilikoz osatutako magurioen liseri-guruinean proposatutako DCL parametroaren baliokidetzat har genezakeena (4. Kapitulua). Azkenik, zelula proliferatzaileak BrdU immunohistokimika bitartez identifikatu ziren liseriguruineko epitelioan. Hainbat saiakera burutu ondoren, fosfatasa alkalinoa (AlP; Chabicovsky et ere. al., 2003) aukeratu zen BrdU/anti-BrdU konplexuak 182

186 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa ikustarazteko, aldez aurretik magurio eta muskuiluetan erabilitako diamino benzidinak bareen liseri-guruinean pikor zitoplasmatiko eta lipofuszina ugariekin erreakzionatzen baitzuen (Zaldibar et al., 2004; 3 eta 4. Kapituluak). Hala ere, iraizte-zelulen bakuoloen lipofuszinen zenbait substantzia AlPrekin erreakzionagarriak badira. Edonola ere, lipofuszina sasipositibook, liseriguruin eta urdaileko epitelioan behatutako nukleo BrdU-positiboetatik zailtasun handirik gabe bereiztu genituen. Muskuilu eta magurioetan gertatu zen moduan, bareen kasuan ere, urdaileko epitelioan liseri-guruineko epitelioan baino BrdU-markaketa nabariagoa topatu dugu (Zaldibar et al., 2004; 4. Kapitulua). Liseri-guruineko epitelioan, BrdUmarkaketa batez ere liseri-zeluletan behatu zen, kaltzio-zelula urrietan markaketa ahula behatu zen bitartean. Iraizte-zelulen nukleoan ez zen BrdUmarkaketa positiborik aurkitu. Hala ere, bakuoloetako lipofuszinen markaketek nukleo BrdU-positiboak itzal zitzaketeenez, iraizte-zelulak proliferatzeko gai direnentz egiaztatzeko, behaketa zehatzagoak egitea ezinbestekoa izango litzateke. Edonola ere, Cd + keroseno tratamenduak eta ondorengo arazte-aldiak, bareen liseri-zelulen proliferazio-intentsitatearen areagotzea eragin dute, ikusi dugunez. Izan ere, tratatutako zein araztutatko bareetan nukleo BrdU-positibo gehiago daude talde kontroleko bareetan baino. Era berean, magurioetan, Cd-ak liseri-zelulen proliferazioa areagotu zuen, eta proliferazio-tasa altu hori 7 eguneko arazte-aldiaren ondoren ere antzeko mailan mantendu zen (4. Kapitulua). Kutsatzaileek zelulen proliferazioa eragin dezaketena jakina da (Beyersmann & Hechtenberg, 1997; Habeebu et al., 1998; Piechotta et al., 1999; Chabicovsky et al., 2004). Magurioetan, Cd pean egoteak, arazte-prozesuei aurre egin ahal izateko, areagotutako liseri-zelulen berriztapena dakar, zelulen heriotza eta proliferazioaren arteko balantze gisa interpreta daitekeena (4. Kapitulua). Bareetan, areagotutako liseri-zelulen proliferazioa iraiztezelula faseranzko progresio areagotuarekin batera gertatu zela dirudi. Zentzu horretan, Cu-meatze abandonatu batean hainbat belaunaldiz (kutsadura kronikoa) bizi izan diren bareen liseri-guruinean, iraizte-zelulen kopuru erlatibo altuaren berri eman da; non liseri-zelulek pikor zitoplasmatikoen iraizpenean bortizki baitziharduten eta oso bakuolizaturik ageri baitziren (Marigómez et al., 1998a). Aldez aurretik metal pean jarritako magurio eta muskuiluetan deskribatu den moduan (1 eta 4. Kapituluak), Cd + keroseno nahasturaz trataturiko bareetan suertatutako zelula-moten osaketaren aldaketak ere, 7 eguneko arazte-aldiaren ostean itzulgarriak izan ziren. Liseri-zelulen proliferazioa tratatu eta araztutako bareen artean desberdina ez dela dirudienez, behatutako leheneratzea liserizeluletatik iraizte-zeluletaranzko progresioa moteltzean datzala pentsa genezake, eta hori epitelio-jarduera kutzatsailea ez egotean moteldu izanarekin bat letorke (Marigómez et al., 1986b; 1998a; Chandran et al., 2005; 4. Kapitulua). Beraz, ingurumen-baldintz jakin bakoitzari zelula-moten osaketa bereizgarri bat eslei lekioke. 183

187 Emaitzak eta eztabaida Liseri-zelulen kopuru erlatiboaren murrizpen eta kaltzio-zelulen, eta batez ere, iraizte-zelulen kopuru erlatiboaren emendioaren berri, metalez kutsatutako ingurunetan bizitako lehorreko bareen liseri-guruinean ere eman da (Marigómez et al. 1998a). Ikerlan honek, zelula-moten osaketaren aldaketok itzulgarriak direla erakutsi du, laborategiko baldintzetan behintzat. Dena den, ingurumen naturaletan animaliak beren bizitza osoan zehar metal pean kronikoki egon daitezke, eta beren erantzunak deskribatutakoen antzekoak liratekeenentz argitu beharrean gaude oraindik ere (Wang & Rainbow, 2005), hurrengo kapituluan jorratuko denez. Azkenik, zelula-moten osaketan metalesposizioak eragindako aldaketek, BSD-hedapena gisako esposizio-biomarkatzaileen gainean eragina izan ditzaketeenaren berri eman da muskuiluen kasuan (Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Aitzitik, ez dirudi Cd + keroseno esposizio eta ondoko araztealdian zehar bareetan suertatutako aldaketek, BSDhedapena parametroaren gainean eragina izan zutenik, Vv BSD aldaketak dosi eta denboraren menpekoak baitziren. Arrazoia, magurioetan gertatzen den moduan, bareen liseri-guruinaren epitelioko ezaugarri berezietan datza, non lisosomen barneko metalen neurketa mikroskopikoak liseri-zelulen gainean zuzenean egin baitaitezken (4. Kapitulua), liseri-zelula kopurua basala izanik ere. BIBLIOGRAFIA Beeby A, Richmond L (2002) Evaluation of Helix aspersa as a sentinel for mapping metal pollution. Ecol. Indt. 1: Beyersmann D, Hechtenberg S (1997) Cadmium, gene regulation, and cellular signalling in mammalian cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E (1990a) Responses of basophilic cells of the digestive gland of mussels to petroleum hydrocarbon exposure. Dis. Aquat. Org. 9: Cajaraville MP, Marigómez I, Angulo E (1990b) Short-term toxic effects of 1-naphthol on the digestive gland-gonad complex of the marine prosobranch Littorina littorea (L.): a light microscopic study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 19: Cajaraville MP, Cancio I, Ibabe I, Orbea A (2003) Peroxisome proliferation as a biomarker in environmental pollution assessment. Micr. Res. Tech. 61: Cancio I, Ibabe A, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of peroxisomal enzyme activities and peroxisomal structure in mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with the lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C 123: Cancio I, Cajaraville MP (2000) Cell biology of peroxisomes and their characteristics in aquatic organisms. Int. Rev. Cytol. 199: Chabicovsky M, Niederstätter H, Thaler R, Hödl E, Parson W, Rossmanith W, Dallinger R (2003) Localization and quantification of Cd- and Cu-specific metallothionein isoform mrna in cells and organs of the terrestrial gastropod Helix aspersa. Toxicol. Appl. Pharmacol. 190: Chabicovsky M, Klepal W, Dallinger R (2004) Mechanisms of cadmium toxicity in terrestrial pulmonates: Programmed cell death and metallothionein overload. Environ. Toxicol. Chem. 23: Chandran A, Sivakumar AA, Mohandass S, Aruchami M (2005) Effect of cadmium and zinc on antioxidant enzyme activity in the gastropod, Achatina fulica. Comp. Biochem. Physiol. C 140: Danscher G (1984) Autometallography. A new technique for light and electron microscopic visualization of metals in biological tissues (gold, silver, metal sulphides and metal selenides). Histochemistry 81: Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin of excretory cells in the digestive gland of the land snail Helix lucorum. Malacologia 44: Habeebu SSM, Liu J, Klaassen CD (1998) Cadmium-induced apoptosis in mouse liver. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153:

188 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa Hamers T, Kalis EJJ, Van den Berg JHJ, Maas LM, Schooten FJV, Murk AJ (2004) Applicability of the black slug Arion ater for monitoring exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons and their subsequent bioactivation into DNA binding metabolites. Mut. Res. 552: Ireland MP (1981) Uptake and distribution of cadmium in the terrestrial slug Arion ater (L). Comp. Biochem. Physiol. A 73: Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary calcium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and histological changes in the digestive cells in the snail Achatina fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58: Laskowski R, Hopkin SP (1996) Effect of Zn, Cu, Pb, and Cd on fitness in snails (Helix aspersa). Ecotoxicol. Environ. Saf. 34: Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil in the digestive cells in mussels: quantitative alterations in cellular and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1: Lowe DM, Clarke KR (1989) Contaminant-induced changes in the structure of the digestive epithelium of Mytilus edulis. Aquat. Toxicol. 15: Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biochem. Chem. 193: Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986a) Copper treatment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Bioassay conduction and histochemical analysis. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 36: Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986b) Copper treatment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Morphometrics and histophysiology. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 36: Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) Histopathology of the digestive gland-gonad complex of the marine prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. Aquat. Org. 9: Marigómez I, Soto M, Kortabitarte M (1996) Tissue-level biomarkers of biological effect of mercury on sentinel slugs, Arion ater. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998a) Tissuelevel biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to assess metal pollution in soils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 34: Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998b) Celltype replacement, a succesful strategy of molluscs to adapt to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 18: Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Giamberini L (2002) Cellular and subcellular distribution of metals in molluscs. Micr. Res. Tech. 56: Marigómez I, Izagirre U, Lekube X (2005) Lysosomal enlargement in digestive cells of mussels exposed to cadmium, benzo[a]pyrene and their combination. Comp. Biochem. Physiol. C 141: Müller S (1984) Lindanuntersuchungen im Aquatischen und Terrestrischen Bereich in Bilbao (Nordostspanien). Lizentziatura-Tesia. Universität Karlsruhe. 93 orr. Orbea A, Ortiz-Zarragoitia M, Cajaraville MP (2002) Interactive effects of benzo(a)pyrene and cadmium and effects od di(2-ethylexyl) phtalate on antioxydant and peroxisomal enzymes and peroxisomal volume density in digestive gland of mussel Mytilus galloprovincialis Lmk. Biomarkers 7: Okay OS, Donkin P, Peters LD, Livingstone DR (2000) The role of algae (Isochrysis galbana) enrichment on the bioaccumulation of benzo[a]pyrene and its effects on the blue mussel Mytilus edulis. Environ. Poll. 110: Piechotta G, Lacorn M, Lang T, Kammann U, Simat T, Jenke HS, Steinhart H (1999) Apoptosis in dab (Limanda limanda) as possible new biomarker for anthropogenic stress. Ecotox. Environ. Saf. 42: Popham JD, D'Auria M (1980) Arion ater (Mollusca: Pulmonata) as an indicator of terrestrial environmental pollution. Water Air Soil Poll. 14: Porcel D, Bueno JD, Almendros A (1996) Alterations in the digestive gland and shell of the snail Helix aspersa Muller (Gastropoda, Pulmonata) after prolonged starvation. Comp. Biochem. Physiol. A 115: Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light and electron microscopic studies of the acute and chronic toxic effects of N-nitroso compounds on the marine mussel, Mytilus edulis (L) II. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine Aquat. Toxicol. 3: Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988a) Zinc treatment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Cellular distribution of zinc and calcium. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 41: Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988b) Zinc treatment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Sublethal effects at the histological level. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 41:

189 Emaitzak eta eztabaida Runham NW, Hunter PJ (1970) Terrestrial Slugs. Hutchinson University Library, London 184 orr. Russell LK, DeHaven JI, Botts RP (1981) Toxic effects of cadmium on the garden snail (Helix aspersa). Bull. Environ. Contam. Toxicol. 30: Small GM, Burdett K, Connock MJ (1985) A sensitive spectrophotometric assay for peroxisomal Acyl-CoA oxidase. Biochem. J. 227: Snyman RG, Reinecke AJ, Reinecke SA (2005) Quantitative changes in the digestive gland cells of the snail Helix aspersa after exposure to fungicide copper oxychloride. Ecotox. Environ. Saf. 60: Soto M, Marigómez I (1997b) Metal bioavailability assessment in mussel-watch programmes by automated image analysis of autometallographical black silver deposits (BSD) in digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156: Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigómez I (1998) Autometallographical procedure for the localization of trace metals in molluscan tissue by lighht microscopy. J. Histotech. 21: Soto M, Zaldibar B, Cancio I, Taylor MG, Turner M, Morgan AJ, Marigómez I (2002) Subcellular distribution of cadmium and its cellular ligands in mussel digestive gland cells as revealed by combined autometallography and X-ray microprobe analysis. Histochem. J. 34: Sumner AT (1965) The cytology and histochemistry of the digestive gland cells of Helix. Q. J. Microsc. Sci. 106: Swaileh KM, Ezzughayyar A (2000) Effects of dietary Cd and Cu on feecing and growth rates of the landsnail Helix engaddensis. Ecotox. Environ. Saf. 47: Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starvation on structure and function of the digestive gland of the mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 54: Wang WX, Rainbow PS (2005) Influence of metal exposure history on trace metal uptake and accumulation by marine invertebrates. Sci. China C. Life Sci. 48: Weibel ER (1979) Stereological Methods. Vol. 1. Academic Press. London 415 orr. Widdows J, Bakke T, Bayne BL, Donkin P, Livingstone DR, Lowe DM, Moore MN, Evans SV, Moore SL (1984) Responses of Mytilus edulis on exposure to the WAF of North Sea oil. Mar. Biol. 67: Zaldibar B, Cancio I, Marigómez I (2004) Circatidal variation in epithelial cell proliferation in the mussel digestive gland and stomach. Cell Tiss. Res. 318: Zubiaga AM (1986) Histofisiología dcel aparato reproductor de Arion subfuscus (Draparnaud, 1805) (Gastropoda, Stylomatophora). Doktoradutza-Tesia. UPV/EHU. 316 orr. 186

190 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa Zelula-moten ordezkapena bareen liseriguruinean eta bere eragina biomarkatzaileen gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien artean lekuzaldatze-esperimentuak Laburpena: Zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell type replacement) estresatutako moluskuen liseri-guruineko epitelioan ematen den fenomeno orokorra da. Aldez aurretik laborategian egindako ikerlanek, CTRk biometatze-prozesu eta biomarkatzaileen neurketen gainean eragina duela erakutsi dute. Lan honen helburua CTR prozesua kutsadura metaliko pean kronikoki egondako bareetan itzulgarria ote den eta biometaketa-parametro eta esposizio- zein efektu- biomarkatzaileen gainean CTRk zer nolako eragina duen aztertzea da. Horretarako, Arion ater bareak, abandonatutako zink meatze batetik (Karrantza) eta kutsatugabeko toki batetik (Bakio) jaso ziren eta leku batetik bestera 3, 10 eta 28 egunez lekuzaldatu ziren. Metal-zama, absortzio atomikozko espektrofotometria (AAS) erabiliz kalkulatu zen. Lisosomen egitura-aldaketa, zelula-moten dentsitate bolumetrikoa, autometalografiko hauspeakinak eta metalotioneinen mailak esposizio- eta efektu-biomarkatzaile gisa neurtu ziren. Ikerlan honen emaitzek, metal-kutsadura kroniko pean egondako bareen liseri-guruinak, laborategian hainbat astez metalen pean jarritako bareen liseri-guruinen antzekoak direla erakutsi dute. Hala ere, kronikoki kutsatutako liseriguruinak, laborategian epe laburrean kutsatutakoen bareenak ez bezala, kutsadura-iturria etenez gero ez dira erantzunkorrak, edo behintzat, erantzuteko gaitasun murritzagoa dute. Bestalde, kutsatugabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareek, 3 eguneko lekuzaldatze ostean jada laborategian metal pean jarritako bareek bezala erantzun zuten; beraz, lan honek, erabilitako prozedura analitikoak eta biomarkatzaileak lurzorutan noizbehinkako metal-esposizioak detektatzeko egokiak direla demostratu du. Gako-hitzak: lekuzaldatzea, zelula-moten ordezkapena, metalak, kutsadura kronikoa, liseri-guruina, bareak. 187

191 Emaitzak eta eztabaida Cell-type replacement in the digestive gland of slugs and its influence in biomarkers after transplantation between clean and metal-polluted sites Abstract: Cell-type raplacement (CTR) is a general phenomenon that takes place in the digestive gland epithelium of stressed molluscs. Previous laboratory studies have demontrated that CTR influences bioaccumulation processes and biomarker measurements. The aim of this work is to determine wether CTR is a reversible process is slugs exposed to chronic metal pollution and to investigate the influence of CTR in metal accumulation parametres and in effect and exposure biomarkers. For this purpouse slugs, Arion ater, were transplanted from an abandoned Zn mine (Karrantza) to a non-polluted site (Bakio) and the other way round for 3, 10 and 28 days. Metal burdens were measured by atomic absorption spectrophotomtry (AAS). Lysosomal structural changes, volume density of cell-types, autometallographical deposits and metallothionein levels were calculated as exposure and effect biomarkers. The results of this study, showed that the digestive gland of slugs chronically exposed to metal pollution is similar to the digestive gland of slugs exposed to metals for some weeks under laboratory conditions. However, chronically polluted digestive glands, are not responsible, or at least, are less responsible than short-term exposed ones when the pollution source disappears. On the other hand, slugs tranplanted from the reference site to the mine respond simmilarly to slugs exposed to metals in the laboratory after 3 days of transplantation, which indicates that the analitical procedure and biomarkers employed in this work are able to detect eventual metal exposures in soils. Key Words transplant, cell-type replacement, metals, chronic pollution, digestive gland, slugs. Sustitución de tipos celulares en la glándula digestiva de limacos y su influencia sobre biomarcadores después de un transplante entre un lugar limpio y uno con contaminación metálica Resumen El recambio de tipos celulares (CTR; del inglés, cell-type replacement) es un fenómeno general que se da en la glándula digestiva de moluscos en situaciones de estrés. Experimentos previos realizados en el laboratorio, demostraron que CTR influye sobre las medidas de los procesos de bioacumulación y biomarcadores. El objetivo del presente estudio es investigar si CTR es un proceso reversible en limacos crónicamente expuestos a contaminación metálica y determinar su influencia sobre los parámetros de acumulación y biomarcadores de exposición y efecto. Para ello, se recogieron limacos Arion ater en una mina de zinc abandonada (Karrantza) y en un lugar sin contaminar (Bakio) y se transplantaron de un lugar a otro durante 3, 10 y 28 días. La carga de metal se calculó mediante espectrofotometría de absorción atómica (AAS). Como biomarcadores de exposición y efecto se estudiaron los cambios estructurales de lisosomas, la densidad volumétrica de tipos celulares, los depósitos autometalográficos y los niveles de metalotioneinas. Los resultados demuestran que los limacos crónicamente expuestos a metales presentan una glándula digestiva similar a la de los limacos expuestos en el laboratorio durante semanas a metales. Sin embargo, al contrario de lo que ocurre en la glándula digestiva de limacos expuestos a metales por un corto período de tiempo, cuando termina la exposición la glándula digestiva de limacos crónicamente expuestos a metales no responden o presentan una capacidad de respuesta limitada. Por otro lado, en los limacos tranplantados del lugar sin contaminar a la mina 3 días son suficientes para observar respuestas similares a las obtenidas tras la exposición a metales en el laboratorio, indicando que el procedimiento analítico y los biomarcadores empleados en el presente trabajo son válidos para detectar exposiciones puntuales a metales en suelos. Palabras clave: transplante, sustitución de tipos celulares, metales, contaminación cronica, glándula digestiva, limacos. 188

192 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa SARRERA Lehorreko gastropodoak metalen metatzaile eraginkorrak direnez eta kutsaduraren aurrean modu sentikor eta neurgarrian erantzuten dutenez, lurzoruen kutsaduraren begirale moduan erabiliak izan dira oso (Coughtrey & Martin, 1977; Popham & D'Auria, 1980; Marigómez et al., 1998a; Pihan & de Vaufleury, 2000; Viard et al., 2004; Snyman et al., 2005). Liseri-guruina, metaleen metatze-toki garrantzitsuena da bare eta barraskiloetan (Ireland, 1979; 1984a; 1994; Beeby & Richmond, 1987; Berger & Dallinger, 1993; Marigómez et al., 1998a; 2002), metalen prozesatze eta detoxifikazioan gako-funtzioak betetzen dituelarik (Kammenga et al., 2000). Metalak, iraizte-zelulen lipofuszina pikorretan (Marigómez et al., 1986a; 1996; 1998a; Recio et al., 1988a) eta maiztasun gutxiagoz kaltzio zeluletan (Schoettli & Seiler, 1977; Marigómez et al., 1986a) lokaliza daitezke, baina metatzekonpartimentu nagusia liseri-zelulen sistema endolisosomikoa dugu, non metalak metalotioneinei lotuta bahitzen baitira (Schoettli & Seiler, 1977; Ireland, 1981; 1982; 1984a; Dallinger & Wieser, 1984; Marigómez et al., 1986a; 2002; Recio et al., 1988a; Janssen & Dallinger, 1991;1995). Metal pean egoteak, iraizte-jardueraren emendioa sortarazi dezake liseri-zeluletan (Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; Recio et al., 1988a; 1988b), zeintzuetatik lisosoma eta hondakin-gorputzen barruan dauden proteinei lotutako metalak jariapen apokrino edo holokrino prozesuen bidez gorotzetara aska baitaitezke (Marigómez et al., 1986a; 1990a; Recio et al., 1988a; Ireland & Marigómez, 1992). Iraiztejarduera emendatu horren ondorioz, liseriguruinaren epitelioaren zelula-osaketan aldaketa latzak sor daitezke kutsatzailepeko esposizio subletala pairatu ondoren (Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996; 1998a; 1998b; Soto et al., 2002). Efektu horri zelula-moten ordezkapena (ingeleraz, Cell Type Replacement; CTR) deritzo, eta toxiko zein bestelako estres-iturri pean mantendutako molusku itsastarretan egindako lan aurrendarietan zelula basofilikoen dentsitate bolumetriko edo kopuru erlatiboaren igoera gisa neurtu da (Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996; 1998a; 1998b). Liseri-guruineko epitelioaren zelula-moten ordezkapena, habitat eta kokapen taxonomiko desberdinetako molusku estresatuetan gertatzen den fenomeno orokorra dela dirudi. (Marigómez et al., 1998a). Kutsatzaile organokimiko edo metalikoen kontzentrazio subletal pean mantendutako muskuilu itsastarrek, batez ere zelula basofilikoz osatutako liseri-tepitelioa agertu dute (Rasmussen et al., 1983; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; Soto & Marigómez, 1997a; 1997b; Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Modu berean, gastropodo itsastarrek zelula basofiliko hipertrofiatuz osatutako liseri-tubuluen epitelioa erakutsi dute, laborategian Cd zein hidrokarburo aromatikoen pean mantenduz gero (Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b). 189

193 Emaitzak eta eztabaida Lehorreko bareetan, liseri-guruinaren epitelioa desberdintzatutako hiru zelula-motez osaturik dago, esaterako: liseri-zelula (ugariena), iraizte-zelula eta kaltzio-zelula (zelula basofilikoa; Sumner, 1965). Gainerako molusku taldeetan bezala, metalez kutsatutako eskualdeetan bizi diren bare en liseriguruinean ere, zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) kopuru erlatibo altuak eta hipertrofia aurkitu dira (Marigómez et al., 1998a), eta baita laborategian metalen pean mantendutakoetan ere (Marigómez et al., 1996; 4. Kapitulua). Halaber, metalezko kutsadura kronikoaren baldintzetan, iraizte-zelulen kopuru erlatiboa ere emenda daiteke (Marigómez et al., 1998a). CTR, kutsatzaile peko esposizioari erantzunez zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) proliferazioaren ondorioa dela proposatu da (Thompson et al., 1974; Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996). Widdows et al.-ek (1984), aldaketa horrek liseriketa-prozesuan zein bioenergetikan berebiziko eragina izan dezakeen moldarazpen-erantzuna dela kontsideratu zuten. Izan ere, liseri-zelulen berriztapena, zelula ama moduan jokatuko luketen zelula basofilikoen zatiketaren bidez suertatuko litzatekeela orokorki onartuta zegoen (Yonge, 1926; Mix & Sparks, 1971; Thompson et al., 1974) eta, zentzu horretan, zelula basofilikoen proliferazioak, liseri-zelulen galerak ekarritako zelulen berriztapen areagotua bermatuko luke (Cajaraville et al., 1990a). Haatik, oraintsuko ikerketek, muskuiluen liseri-guruinean liseri-zelulek zein zelula basofilikoek, ziklo zelularra norberak bere aldetik jarraitzen duela frogatu dute (Marigómez et al. 1999; Zaldibar et al., 2004), eta beraz, liseri-zelulak zatitzeko gai direnez, beraiek ordezkatzeko zelula basofilikoek proliferatzea gertagaitza litzateke. Are gehiago, metal eta konposatu organikoen kutsadura peko baldintzetan epitelioaren masamurrizpen netoa gertatzen da, liseri-zelulen galeraren ondorioz seguru asko, murrizpen horrek zelula basofilikoen kopuru erlatiboaren itxurazko gorakada ekarriz (Vega et al., 1989; Marigómez et al., 1990b; 1995; 1996; 1998b; Zaldibar et al., 2002). Aitzitik, kutsadura peko baldintzetan zein ingurumen-kaltea eteterakoan liseri-zelulek proliferatzen dute, BrdU immunohistokimika bidez magurio eta bareen kasuan laborategiko esperimentuetan frogatu den moduan (Zaldibar et al., 2002, 4. eta 5. kapituluak). Beraz, zelula basofilikoen kopuru erlatiboaren emendioa, batez ere liseri-zelulen galeraren ondorioa dela onar genezake. Modu berean, iraizte- eta kaltzio-zelulen kopuru erlatibo altuak, abandonatutako Cu meatzean hainbat belaunaldiz (kutsadura kronikoa) bizi izan diren bareetan aurkitu ziren, liseri-zelulak pikor zitoplasmikoen iraizpenean oso aktiboak eta oso bakuolizatuak agertu zirelarik (Marigómez et al., 1998a). Egoera horrek liseri-zelulen etengabeko askatzeak azalduko luke. Ildo beretik, iraiztezelulak, bizi-zikloaren azken urratsetan dauden liseri-zelulak izango liratekeela proposatu da, eta ez beste zelula-mota ezberdina (Porcel et al., 1996; Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Horrek, baraualdian eta kutsadurapean liseri- eta iraiztezelulen proportzio erlatiboek jarraitzen dituzten jokabideak kontrajarriak izatea azalduko luke 190

194 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa (Porcel et al., 1996; Marigómez et al., 1998a; Dimitriadis & Konstantinidou, 2002; 5. Kapitulua). Are gehiago, zelula basofilikoen presentzia erlatiboaren gorakada, euren hiperplasia eta ez euren kopuruaren emendioaren ondorioa izango litzateke batik bat (Marigómez et al., 1990b; 1996; Chabicovsky et al., 2004; 4. Kapitulua). Liseri-zelula, ingurumen-kutsaduraren ebaluaketarako itu-konpartimentua nagusietarikoa denez, kutsatzaileen pean egoteak bultzatutako liserizelulen galerak, biometaketa-parametro eta biomarkatzaileak neurtu direneko zelai- eta epe luzeko ikerketen emaitza polemikoak azalduko lituzke. Epe luzeko esposizio (kroniko) ostean, metalak ez dira liseri-epitelioan metatzen, epitelio horrek metatze-toki nagusia diren lisosomak dituzten liseri-zelula urriak baititu (Marigómez et al., batera lekuzaldatu ziren 3, 10 eta 28 egunez, eta vice versa, Bakiotik Karrantzara. Gorputzeko metal-zamak absortzio atomikozko espektrofotometria (AAS) bitartez neurtu ziren. Bareen liseri-guruinaren epitelioa osatzen duten 3 zelula-moten dentsitate bolumetrikoa estereologia erabiliz kalkulatu zen (Vv DIG, Vv EXC, Vv CAL ) hematoxilina-eosinaz tindatutako parafinazko ebakien gainean. Autometalografiaz (AMG) errebelatutako zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) eta espektrofotometria bitartez neurtutako metalotioneinen (MT) maila esposiziobiomarkatzaile gisa erabili ziren. Efektubiomarkatzaile gisa lisosomen handiagotzea aukeratu zen, kriostato-ebakien gainean, liserilisosomen bolumenezko, azalerazko eta 1996; 1998a; Soto et al., 1998; 2002; Soto & zenbakizko dentsitateak (Vv LYS, Sv LYS eta Marigómez, 1997b). Aldez aurretik burututako ikerlanek, laborategian metal pean mantendutako Nv LYS ) eta azalera/bolumena ratioa (S/V LYS ) irudi-analisi bidez neurtuz gero estimatu zelarik. muskuilu eta magurioetan neurtutako biomarkatzaileen gainean CTRk zer nolako eragina MATERIAL ETA METODOAK duen finkatu dute (Soto & Marigómez, 1997b; Soto et al., 2002; 1. eta 4. Kapituluak), bareen inguruan dagoen informazioa, berriz, bakana da (Marigómez et al., 1996; 1998a; 5. Kapitulua). Metalen pean kronikoki egondako bareen liseriguruinean CTR prozesu itzulgarria den finkatzea, Erreaktibo kimikoak Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkataletxekoak dira besterik agertu ezean. alde batetik, eta CTRk metaleen biometaketa eta efektu- zein esposizio-biomarkatzaileen gainean nolako eragina duen ezagutzea, bestetik, ikerlan honen helburuak dira. Asmo horrekin, Karrantzako Zn-meatze abandonatu baten inguruko bareak (Arion ater) hartu eta Bakioko toki kutsatu gabe Diseinu esperimentala eta laginen prozesatzea 50 Arion ater bare ar, Euskal Herriko 2 herri desberdinetan jaso ziren 2002.ko ekainaren 1ean (1. Ird.): (a) Karrantzako bailaran abandonatutako Zn-meatze zahar baten inguruan; eta (b) 191

195 Emaitzak eta eztabaida 1. Irudia: Erreferentzia tokia (Bakio) eta antzinako meatzetokiaren (Karrantza) kokapenaren irudi eskematikoa. Geziek bareen lekuzaldatzearen nondik norakoak islatzen dituzte kutxen barruan agertutako egun kopuruen zehar kutsatugabeko toki batean Bakion, meatzetik aski urruti dagoen landa-herria dena. Bareak toki batetik bestera 3, 10 eta 28 egunez lekuzaldatu ziren, eta baldintza naturaletan mantendu ziren lurzoruari atxikitako saredun kutxen bitartez. Horretaz gain, bai Bakion zein Karrantzan lurzorua eta bareak lagindu ziren, transplantea egin zeneko egun berean (0. eguna). Bareak (10 talde esperimentaleko), laginketa-egunetan sakrifikatu ziren, eta segidan azalduko den moduan prozesatu ziren. Liseri-guruinaren zati bat, Carnoy likidoan fixatu, parafinan inkluditu eta 7 µm-ko lodierako ebakietan moztu zen, azterketa histologikoak eta analisi histokimikoak egiteko. Bigarren zati bat, glutaraldehidoan fixatu eta EPON erretxinan inkluditu zen, ebaki semifinen behaketa egiteko. Hirugarren zati bat, nitrogeno likidotan izoztu zen. 8 µm-ko lodierako ebakiak, kriostatoan moztu, eta ondoren ß-glukuronidasa entzimaren jardueraren demostrazio histokimikoa egiteko prozesatu ziren. Liseri-guruinaren beste zati bat nitrogeno likidotan izoztu zen, metalotioneinen neurketa espektrofotometrikoa burutzeko. Azkenik, geratzen zen liseri-guruinaren zatia, metalen analisi kimikoak egiteko liseriketa azidoaren bitartez prozesatu zen. Prozedura bakoitzaren nondik norakoak, zehaztasun gehiagoz jarraian azalduko dira. Analisi kimikoak Liseri-guruinak ur distilatuan garbitu, eta labean 120ºC-tara lehortu ziren 48 orduz, pisua egonkortu zen arte (Ireland, 1979). Lehortutako ehunak azido nitriko kontzentratuan liseritu ziren. Gerora, ur distilatuan disolbatutako azido nitrikotan (0.1 M) diluitu ondoren, laginak absortzio atomikozko espektrofotometroan (PerkinElmer 2280, Wellesley, Massachusetts, Amerikako Estatu Batuak) neurtu ziren, aldi bereko atzealdeko zuzenketaz eta 0.3 mg/l-ko sentikortasunaz. Merck merkatal-etxeko (Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) disoluzio estandarrak (zertifikatutakoak) 0.1 M azido nitrikotan diluitu ziren kalibrazioa burutzeko. 7 metal analizatu ziren: kadmioa (Cd), kromoa (Cr), kuprea (Cu), burdina 192

196 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa (Fe), beruna (Pb), nikela (Ni) eta zinka (Zn). Lurzoruaren laginak modu berean prozesatu ziren. Metalotioneina-mailen determinazio espektrofotometrikoa MT-mailak sulfidrilo taldeen (-SH) determinazio espektrofotometrikoaren bitartez estimatu ziren (UNEP/RAMOGE, 1999). MTen kontzentrazioa, laginaren -SH edukina espertrofotometro bitartez kuantifikatu da, Ellman erreaktiboa (5,5 ditiobis 2 azido nitrobenzoikoa; DTNB) erabiliz. Laburki, liseri-guruinaren zatiak 1 g ehun emateko taldekatu ziren, eta motoreak gidatutako teflonezko homogeneizagailuan ß-merkaptoetanola, fenilmetanosulfonilfluorido (PMSF) eta leupeptinadun indargetzaile homogeneizatzailearen 3 bolumenetan homogeneizatu ziren. Homogeneizatuak 30000x g-tan 20 min 0-4ºC-tan zentrifugatu ziren. Gainjalkinean zeuden pisu molekular baxuko proteinak etanol absolutu hotzean (-20ºC), eta ondoz ondoko 6000x g-ko zentrifugazioaren bitartez prezipitatu ziren. MTtan joria zen pisu molekular baxuko frakzioa 0.25 M NaCl, 1 N HCl eta 4 nm EDTA zuen indargetzailean berresekitu zen. Erreferentziazko kurba estandarrak, 1 mg glutation/ml 0.25 M NaCl stock disoluzioa erabiliz sortu ziren. MTen ebaluazio espektrofotometrikoa 0.43 mm DTNB 0.2 M fosfato indargetzailean erreaktibo gisa erabiliz egin zen, absorbantzia 412 nm-tan neurtuz. Autometalografia Parafinazko ebakien talde bat autometalografiaz tindatu zen. Autometalografia metalak zilarrezko hauspeakin beltz gisa ikustarazteko argazkilaritzan oinarritutako teknika da (Danscher, 1984). Ebakiak (7 µm), xilenoz desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta labean (40ºC) utzi ziren guztiz lehortu arte. Laginak ondoren, eta gela ilunean, argazki-emultsio geruza fin eta uniforme batez estali ziren (Ilford Nuclear Emulsion L4, Ilford, Mobberley, Ingalaterra). Laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean (30 minutu) eta Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur distilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt, Alemania) errebelatzaile komertziala erabiliz errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren, errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikoa zuen diluzio batean geldiarazi zen minutu batez eta, azkenik, erreakzioa fixatzailean (Agfa Agefix, Agfa- Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatu zen 10 minutuz. Laginak, Kaiser gelatina glizerinatuan muntatu ziren. BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan irudi-analisi bitartez Liseri-zelulen lisosometan zeuden BSDen azalera irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto & Marigómez, 1997a; 1997b), emaitzak BSDen dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (Vv BSD ). Argimikroskopiazko irudiak (x100 handipenean) B&W- CCD TV kamera, HR-TV kolorezko pantaila, Leitz mikroskopioa, PC ordenagailua, PIP 1024 (Matrox Electronic Systems Ltd., Dorval, Kanada) sistema eta Sevisan (Bilbo, Espainia) entrepresak garatutako softwarea erabiliz eskuratu ziren. Ondoren, eskuz eta softwarearen laguntzarekin 193

197 Emaitzak eta eztabaida liseri-zelulen lisosometako BSD eta zitoplasma bereizteko segmentazio-prozedura aplikatu zen. Neurketak bare bakoitzean 5 eremutan burutu ziren, eta talde esperimental bakoitzean 10 bare erabili ziren; tratamendu bakoitzeko guztira 50 neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.-ek (1981) proposatutako formulak erabiliz egin ziren. Hau da, BSD partikulen tamaina ebakiaren lodiera baino txikiagoa zela kontutan hartuz, Holmes efektua zuzentzeko faktorea kontuan hartu zen. Azterketa histologikoa eta analisi histologiko kuantitatiboak Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm) Hematoxilina-eosinaz tindatu ziren eta EPON erretxinan inkluditutako ebaki semifinak (3-4 µm) toluidina urdinez tindatu ziren, talde desberdinetako bareen liseri-guruineko epitelioaren eta bertoko zelula-moten deskribapen morfologikoa argimikroskopioaren bitartez egiteko. Liseri-zelulen, iraizte-zelulen eta kaltzio-zelulen dentsitate bolumetrikoa kalkulatzeko (Vv DIG, Vv EXC, Vv CAL ) prozedura estereologikoa aplikatu zen. Horretarako, lagin bakoitzean azarez aukeratutako zelai batetan egin ziren kontaketak guztira talde esperimental bakoitzeko 10 kontaketa burutuz. Analisi estereologikoak burutzeko, Nikon Optiphot mikroskopioari atxikitako irudi-hodia erabili zen (amaierako handipena 670x). Zelulen Vv DIG, Vv EXC eta Vv CAL Delesse printzipioan oinarrituz (Weibel, 1979) kalkulatu zen. Lortutako datu horietan oinarrituta, zelula-mota bakoitzaren proportzio erlatiboa portzentaietan kalkulatu zen. Lisosomen egitura-aldaketak Liseri-zelulen lisosomen ikustaraztea ß- glukuronidasa (ß-GUS) entzimaren jardueraren agerketa histokimikoa burutuz egin zen, Cajaraville et al.-en (1991) prozedura jarraituz. Ebakiak, egin berria zen ß-GUS inkubazio-medioan (28 mg naphtol AS-BI-ß-D-glucuronide 1.2 ml 50 mm sodio bikarbonatoan disolbatuta eta 100 ml-arte %2.5 NaCl eta %15 polibinilo alkohola zuen azetato indargetzailean, ph 4.5) murgildu ziren 10 minutuz 37ºC-tan, etengabe irabiatuz. Inkubazioaren ondoren, laginak %2.5 NaCl gatz-disoluzioan garbitu ziren 2 minutuz 37ºC-tan, etengabe irabiatuz. Laburki, ebakiak disoluzio ikustarazlean sartu ziren (0.1 g Fast Garnet GBC % 2.5 NaCl zuen 0.1 M fosfato indargetzaileko (ph 7.4) 100 mltan disolbatuak) 10 minutuz eta ilunpean. Ondoren, laginak %2.5 NaCl zuen Baker formol kaltzikoan fixatu ziren 10 minutuz 4ºC-tan, eta uretan labur garbitu ziren. Azkenik, laginak % 0.1 Fast Green disoluzio batean kontrastatu ziren bi minutuz, ur distilatuan hainbat aldiz garbitu, Kaiser gelatina glizerinatuan montatu eta azazkalen esmalteaz zigilatu ziren. Lisosomen egitura, automatizatutako irudianalisi (Biological Measurement System software- BMS- Sevisan; Cajaraville et al., 1991) bitartez neurtu zen. Ebakiak, x100 handipeneko objektiboa erabiliz aztertu ziren Leitz argi-mikroskopioan. 5 neurketa burutu ziren ebaki bakoitzean, hurrengo parametro estereologikoak kalkulatuz: lisosomen dentsitate bolumetrikoa (Vv LYS = V(L)/V(C)), dentsitate superfiziala (Sv LYS = S(L)/V(C)), azalera/bolumena ratioa (S/V LYS = S(L)/V(L)) eta 194

198 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa dentsitate numerikoa (Nv LYS = N(L)/V(L)); non V = bolumena, S = azalera, N = kopurua, L = lisosomak eta C = liseri-zelulen zitoplasma baitira. Estatistika Emaitzak estatistikoki aztertzeko SPSS/PC+ (SPSS Inc., Microsoft Co.) pakete estatistikoa erabili zen. Vv LYS eta Nv LYS datuak logaritmikoki transformatu ziren azterketa estatistikoa egin aurretik, indibiduoen barne-bariantza batezbestekoaren menpekoa zelako. Aldagai esperimentalen esangarritasuna bide bateko bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz estimatu zen, eta parekatutako batezbestekoak Duncan testa erabiliz konparatu ziren. Oro har, lurzoruan neurtutako metal desberdinen kontzentrazioa, Karrantzan Bakion baino altuagoa izan zen, Cu eta Fe salbu (1. Taula). Haatik, desberdintasun esangarrienak, Zn eta Pb kontzentrazioetan aurkitu ziren, metal horiek metal kontzentrazio osoaren partaide nagusiak izanik. Karrantzako bareen liseri-guruinean, Pb eta Zn kontzentrazioak Bakiokoak baino hamar eta bost aldiz handiagoak izan ziren, hurrenez hurren (1. Taula). Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareetan, Karrantzako zelaiko bareen liseri-guruinean neurtutakoen Pb eta Zn EMAITZAK Talde esperimental desberdinen metalen kontzentrazio totala (Cd + Cu + Cr + Fe + Ni + Pb + Zn), lurzoruan eta liseri-guruinean µm gisa neurtu zen, AAS bitartez. Metalen mailak, meatzeko lurzoruan kutsatugabeko tokikoan baino hiru aldiz handiagoak izan ziren (2. Ird.). Liseri-guruinean neurtutako metalen mailak emaitza horrekin bat etorri ziren, Karrantzako bareen liseri-guruinean Bakioko bareetan baino hiru aldiz metal gehiago zegoen (2. Ird.). Karrantzatik Bakiora lekuzaldatutako bareen liseri-guruinean, ordea, neurtutako metal kontzentrazioak Zn-meatzean neurtutakoak baino altuagoak izan ziren, gainera metal kontzentrazio hauek erreferentzi-tokian denbora gehiago egon heinean igoz joan zirelarik (2B Ird.). 2. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruineko lurzoruetako metaleen kontzentrazioa (µm metaletan). (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. M) Mehatzeko lurzoruko metaleen kontzentrazioa; E) Erreferentzia tokiko lurzoruko metaleen kontzentrazioa. 195

199 Emaitzak eta eztabaida 1. Taula: Erreferentzizko tokian (Bakio) eta antzinako meatzearen inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruineko eta lurzoruetako metalen kontzentrazioa (mg/kg). BBZ, Bakioko bareak; BB3, Bakioko bareak 3 egunez Bakion kutxetan sartuak; BB10, Bakioko bareak 10 egunez Bakion kutxetan sartuak; BB28, Bakioko bareak 28 egunez Bakion kutxetan sartuak; BUR, Bakioko bareak urrian hartuak; BL3, Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareak; LB3, Karrantzatik Bakiora 3 egunez lekuzaldatutako bareak, LB10, Karrantzatik Bakiora 10 egunez lekuzaldatutako bareak; LB28, Karrantzatik Bakiora 28 egunez lekuzaldatutako bareak; LLZ, Karrantzako bareak; LL3, Karrantzako bareak 3 egunez Karrantzan kutxetan sartuak; LUR, Karrantzako bareak urrian hartuak Lurra Bakio Lurra Mehatza Cu Pb Fe Cd Ni Cr Zn (±38.93) (±12.78) (±6.47) (±142.18) (±263.21) (±189.72) 6.59 (±2.96) (±6.42) 2.58 (±3.58) 1.47 (±1.13) 9.66 (±3.76) (±7.76) (±320.60) (± ) BBZ BB (±87.3) (±108.16) (±25.61) (±15.13) (±726.92) (±260.83) 5.6 (±1.68) (±11.56) 5.99 (±9.28) 2.23 (±4.2) 9.37 (±10.06) 9.47 (±11.87) (± ) (±323.52) BB10* BB28* BUR BL3 LB3 LB10 LB28 LLZ LL3 LUR (±208.89) (±191.7) (±51.01) (±79.44) (±59.27) (±36.42) (±9.13) (±5.87) * Ez dago erreplikarik (±6.81) (±317.58) (±360.46) (±214.53) (±72.95) (±301.29) (±250.82) (±78.03) (±656.99) (±230.72) (±285.46) (± ) (±846.29) (±211.81) (±182.77) (±38.92) kontzentrazioen balioetara heldu ziren (3A eta 3C Ird.). Karrantzatik Bakiora lekuzaldatutako bareek, neurtutako Pb eta Zn kontzentrazio-balioak iturriko bareetan neurtutako balioen antzekoak erakutsi zituzten (3B eta 3D Ird.). Are gehiago, Bakion 3 egun igaro ondoren, Pb kontzentrazioak Karrantzan baino 3 aldiz altuagoak izan ziren (3B Ird.), eta 3.53 (±2.53) (±41.93) (±4.2) (±16.6) (±10.94) (±9.73) (±16.94) 9.44 (±8.92) 3.39 (±4.03) 2.82 (±6.69) 5.84 (±8.29) 4.82 (±7.07) Bakion 28 egun igaro ondoren, Zn kontzentrazioa Karrantzako bareetan neurtutako baino altuagoa izan zen (3D Ird.) (±4.58) (±15.66) 5.12 (±7.37) 4.01 (±7.65) (±464.65) (± ) (± ) (± ) 2.51 (±4.34) 5.82 (±9.3) (±3.23) 1.45 (±2.15) 1.27 (±1.53) 2.28 (±3.46) 3.98 (±2.72) 4.84 (±3.67) (± ) (± ) (±761.97) (±578.12) Autometalografiak, metalen presentzia zilarrezko hauspeakin beltz (BSD) moduan erakutsi zuen, liseri-zelulen lisosometan, iraizte-zelulen lipofuszina-pikorretan eta, maila baxuagoan, 196

200 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa kaltzio-zelulen kaltzio-esferuletan (4. Ird.). Behaketa mikroskopikoa burutu ondoren, BSD, Karrantzako bareetan kutsatu gabeko tokian baino ugariagoak zirela argi agertu zen (4A eta 4B Ird.). Bakioko bareetan, BSD, liseri-epitelioko xafla basalean (zentzu histologikoan) eta liseri-zelulen erpinaldeko lisosoma (pikor berdeak) gutxi batzutan behatu ziren (4A Ird.). Kutsatutako tokiko bareetan, eta kutsatu gabeko tokira 3 egunez lekuzaldatutakoetan BSD xafla basalean urriagoak izan ziren arren, sistema endo-lisosomikoaren bolumen gehiena betetzen agertu ziren (pikor berde eta horiak), eta iraizte-zelulen lipofuszinetan ere konspikuoak gertatu ziren (4B eta 4D Ird.). BSDen hedapen-balioak, irudi-analisi bitartez Vv BSD gisa kuantifikatuak, Karrantzako bareetan Bakioko bareetan baino 10 aldiz handiagoak izan ziren. Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareetan tarteko balioak kuantifikatu ziren (5A Ird.). Kutsatutako tokitik kutsatugabekora lekuzaldatutako bareen liseriguruinean, Vv BSD balioa ez zen jaitsi. Aitzitik, 3 eta 10 egunez lekuzaldatu ondoren balio handiagoak suertatu ziren (5B Ird.). 3. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruineko ehunetako eta lurzoruetako Pb (A eta B) eta Zn (C eta D) kontzentrazioak (µg/g ehun-pisu lehor).( A) eta (C) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) eta (D) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. M) Mehatzeko lurzoruko Pb eta Zn kontzentrazioa; E) Erreferentzia tokiko lurzoruko Pb eta Zn kontzentrazioa. 197

201 Emaitzak eta eztabaida Bi tokietan determinazio espektrofotometrikoz kuantifikatutako metalotioneinen (MT) kontzentrazioa ez zen esangarriki desberdina izan (6A Ird.). Era berean, Bakiotik Karrantzara lekuzaldatutako bareetan MT kontzentrazioa ez zen esangarriki aldatu. Bestalde, kutsatu gabeko tokian 3 egunez mantendutako bareetan MT kontzentrazioa esangarriki jaitsi zen (6B Ird.). ß-glukuronidasaren histokimika burutu ondoren, liseri-zelulen lisosomak arre-purpura koloreko hauspeakin modura behatu ziren (4E eta F Ird.). Karrantzako bareetan (4F Ird.), lisosomak 4. Irudia: Arion ater barearen liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa (A-D) eta ß-glukuronidasa entzimajardueraren detekzio histokimikoa (E-F). (A) Kutsatu gabeko tokian hartutako barea; (B) Zn-meatzetik hartutako barea; (C) Kutsatu gabeko tokitik meatzera 10 egunez lekuzaldatutako barea; (D) Zn-meatzetik kutsatu gabeko tokira 3 egunez lekuzaldatutako barea. Geziek liseri-zelula, iraizte-zelula eta kaltzio-zelulen barruan dauden metalak adierazten dituzte. Gezi-buruek liseri-azinoetako xafla-basalean metatutako metalak adierazten dituzte. Eskala-marra: 50 µm. (E) Kutsatu gabeko bareen liseri-guruinean topatutako ß-glukuronidasa entzimaren jarduera; (F) Zn-meatzeko bareen ß-glukuronidasa entzimaren jarduera. Geziek ß- glukuronidasa jarduera adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm. 198

202 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa nabarmenki handiagoak izan ziren Bakiokoetan baino (4E Ird.). Estereologia bidez egindako analisi kuantitatiboek emaitza hauek baieztatu zituzten: Vv LYS eta Sv LYS altuagoak eta S/V LYS baxuagoak neurtu ziren Karrantzako laginetan Bakioko laginetan baino (7. Ird.). Bakiotik liseri-zelulak, ordea, askoz urriagoak (%30 vs %80; 9. Ird) Gainera, kutsatu gabeko tokitik toki kutsatura 3 egunez lekuzaldatutako bareetan zelula-mota desberdinen proportzioek tarteko balioak erakutsi zituzten; hau da, batez ere iraiztezelulen emendioa gertatu zen (9A Ird.). Toki kutsatutik kutsatugabekora lekuzaldatutako bareen liseri-guruinean pareko erantzuna behatu zen, non kaltzio-zelulen proportzioan aldaketarik behatu ez zen bitartean iraizte-zelulen gutxiagotze graduala aurkitu baitzen (9B Ird.). Aldaketa horiek parametro Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareetan, adierazgarrietan islatzeko asmoz, Vv DIG eta Vv LYS eta Sv LYS parametroak aldatu ez ziren Vv EXC /Vv DIG ratioa hautatu egin dugu (10. Ird.). arren, lisosomen tamainaren handiagotzea Bakion, Vv DIG Karrantzan baino bi aldiz altuagoa (S/V LYS baxua) kopuruaren txikipen hain zuzen, eta 3 egunez Bakiotik Karrantzara esangarriarekin batera (Nv LYS baxua) gertatu zen. Kontrako lekuzaldatzea egiterakoan, lisosomek ez zuten inolako erantzunik eman 28 egunez (7B Ird.). Karrantzako liseri-guruineko azinoek, Bakiokoek baino epitelio meheagoa erakutsi zuten; gainera, argia handiagoa eta azinoen kalibrea ere txikiagoa izan ziren (8. Irudia). Are gehiago, loditutako xafla basala eta odol hodiak eratzen duten Leydig zelula puztuak aurkitu ziren (8. Ird.). Liseri-zelulak, kaltzio-zelulak eta iraizte-zelulak errez identifikatu ziren bi tokietako bareen liseriguruineko epitelioan; hala ere, zelula-mota bakoitzaren maiztasun erlatiboa desberdina izan zen bi tokietan (8. eta 9. Ird.). Eskuarki, kaltziozelulen proportzio erlatiboa konstante mantendu zen lagin desberdinetan, liseri-zelula eta iraiztezelulena esangarriki aldatu ziren bitartean. Iraiztezelulak, toki kutsatuan kutsatu gabeko tokian baino bost aldiz ugariagoak izan ziren (%60 vs %12), eta 5. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruinean neurtutako zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate bolumetrikoa. (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. 199

203 Emaitzak eta eztabaida EZTABAIDA 6. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruinean neurtutako metalotioneinen (MT) kontzentrazioa. (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. lekuzaldatu ondoren tarteko balioak agertu ziren (10A Ird.). Vv EXC /Vv DIG ratioari dagokionez, Karrantzako balioak Bakiokoak baino 8 aldiz handiagoak dira (10B Ird.). Halaber, Karrantzatik Bakiora 28 egunez lekuzaldatutako bareetan Vv DIG Bakioko jatorrizko balioetaraino igo ez bazen ere, igoera gradualaren ebidentzia argiak topatu ziren (10C Ird.). Vv EXC /Vv DIG ratioak ere joera horren aztarnak islatzen ditu (10D Ird.). Metal-kutsadura kronikoaren aurreko moldarazpena Metal-kutsadura kronikoa eta bere efektua lehorreko organismoen gainean, utzitako meatzeak zelai-laborategi merke eta eraginkor gisa erabiliz iker daiteke (Ireland & Wootton, 1975; Dallinger et al., 1989; Marigómez et al., 1998a). Ikerlan honetan, Zn-meatze batean (Karrantzan) hainbat hamarkadaz bizitako bareen populazioek Pb eta Zn kontzentrazio esangarriki altuagoak erakutsi zituzten, erreferentziazko tokikoekin alderatzekotan (Bakio). Ehunetako metalen kontzentrazioak lurzoruan neurtutakoekin bat datoz. Behaketa horiek, lehorreko gastropodoen liseri-guruinean neurtutako metalen kontzentrazioak ingurumeneko metalen mailekin erlazionaturik daudela baieztatu dute (Ireland, 1981; 1982; Marigómez et al., 1998a; Beeby & Richmond, 2002). Karrantzako bareek, Pb eta Zn kutsadura kronikoaren pean egonik, hainbat belaunalditan zehar bizirik irautea lortu dute. Hala ere, Zn-meatzean bareek bizirik jarraitu arren, nolabaiteko estres kronikoa pairatu dutela espero daiteke, biomarkatzaile lisosomikoek agerian utzi dutenez (ikus aurrerago). Bizirauteko gaitasun hori ez zaigu horren deigarria iruditu, euren ehunetan oso metal kantitate altuak metatu dituzten metal kutsatzailen pean egondako barraskilo eta bareetan garrantzi gutxiko hilkortasuna aurkitu baita (Russell et al., 1981; Marigómez et al., 1986c; 1998a; Greville & Morgan, 1991; Berger & Dallinger, 1993; Dallinger, 1994). Gainera, metal batetik bestera 200

204 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa sentikortasuna eta tolerantzia alda daitezke (Laskowski & Hopkin, 1996). Pb/Zn-z kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien arteko lekuzaldatzeesperimentuetan oinarrituz, bareen metalekiko tolerantziaren berri aurretikoz argitaratu da. Tolerantzia hori, metalen metaketaren murrizpenaz fenotipikoki adierazten da; Cd moduko beste metal astunekiko tolerantzia, ordea, metatze-gaitasun areagotuaz karakterizatzen den bitartean (Greville & Morgan, 1991). Eskuarki, metal-kutsadura 7. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruinean neurtutako ß- glukuronidasa jardueraren parametro estereologikoak. (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareen dentsitate bolumetrikoa; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareen dentsitate bolumetrikoa; (C) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareen dentsitate superfiziala; (D) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareen dentsitate superfiziala; (E) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareen Azalera/Bolumena ratioa; (F) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareen Azalera/Bolumena ratioa; (G) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareen dentsitate numerikoa; (H) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareen dentsitate numerikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. 201

205 Emaitzak eta eztabaida zelaian pairatzekotan, hautespen-presioak animalien gainean eragin esanguratsua izan dezake; kutsatzaileen harrera murrizteak eta iraizte edo eta metatze bidezko detoxifikazio-tasak areagotzeak, hautespenerako abantaila ekar lezaketelarik (Wang & Rainbow, 2005). Bare eta barraskiloek toki kutsatuetan bizirauteko duten ahalmena, metalak detoxifikatu edo gehiegizko esposizioa ekiditeko duten gaitasunean oinarritzen dela dirudi. Oro har, metalekiko erresistentzia, metal-ioiak (Cd, Cu, Zn) estuki bahitzen dituzten metalotioneinen ekoizpenarekin zein liseriguruineko lisosometan eta pikor mineralizatuetan metal toxikoen bahiketarekin erlazionatuta dago (Hopkin et al., 1989; Dallinger, 1993; Marigómez et al., 2002; Dallinger et al., 2004). Hirigunetako barraskilo eta meatzetako bareen kasuan proposatu denez, Pb- eta Zn-esposizio kronikoak hautespen naturalerantz darama, mekanismo genetiko edo eta anbientalen bitartez (Beeby & Richmond, 1987; Greville & Morgan, 1991). Fenotipo tolerante hautatuak, beste bereizgarrien artean, liseri-guruineko epitelioko zelula-moten banaketa eta presentzia erlatiboan islatutako desberdintasunez karakterizatuta daude (Marigómez et al., 1998a). Lehorreko gastropodoetan, metalen metaketa eta detoxifikaziorako toki nagusia liseri-guruina dugu, eta bere epitelioa 3 zelula-motez osaturik dago: liseri-zelula, iraizte-zelula eta kaltzio-zelula (Sumner, 1965). Egoera normaletan, liseri-zelulak ugarienak dira, baina Cd-z kutsatutako tokietan bizi 8. Irudia: Kutsatu gabeko tokiko (A eta C irudiak) eta Zn-meatzeko bareen (B eta D irudiak) irudi histologikoak, bai Hematoxilinaeosinaz (A eta B) zein toluidina urdinez (C eta D) tindatutako ebakietan. DC) liseri-zelula, EC) iraizte-zelula, eta CC) kaltzio-zelula adierazten dute. Eskala-marra: 50 µm (A eta B irudiak); 20 µm (C eta D irudiak). 202

206 Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa 9. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruinean neurtutako osaketa zelularra. (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. diren bareetan kaltzio-zelulak eta iraizte-zelulak zelula-mota nagusiak bilaka daitezke (Marigómez et al., 1998a). Epe luzeko/kronikoak diren kutsatzaile-esposizioen ondorioz, zelula-moten osaketaren halako aldaketak, moluskuen erantzun orokortzat har daitezkeela dirudi (Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996; 1998a), azken finean kutsatzaileen aurreko erantzuna zein erantzun horren zenbait parametro adierazle ere eragin ditzaketelarik (Marigómez et al., 1998b). Laborategiko baldintzetan metal-kutsadura pean jarritako lehorreko gastropodoen liseriguruinean, xafla basalak loditu, liseri-zelulak lehendabizi bakuolizatu eta ondoren gutxiagotu, kaltzio-zelulak hipertrofiatu, kaltzio- eta iraiztezelulak erlatiboki ugaritu, epitelioa mehetu, eta odol-zelulak zein ehun konektiboko zelula migratzaileak liseri-azinoen inguruan metatu egiten dira (Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; 1998a; Recio et al., 1988a; 1988b; Ireland & Marigómez, 1992). Metal-kutsadurarekiko moldarazpenaren steady state hori, metal toxikoen maila subletalen pean kronikoki egondako zelaiko bareen populazioetan ere gerta daiteke (Marigómez et al., 1998a). Ikerlan honetan, Karrantzako bareetan (utzitako zink-meatzea) aldez aurretik 203

207 Emaitzak eta eztabaida deskribatutako liseri-guruinaren antolakuntz histologikoaren patroi berbera aurkitu dugu. Bakioko bareen liseri-azinoak liseri-zelula ugariz, erlatiboki urriagoak ziren iraizte-zelulez eta oso urriak ziren kaltzio-zelulez osaturik agertu zitzaizkigun. Karrantzan iraizte-zelulen dentsitate bolumetrikoa Bakion baino altuagoa izan zen, eta horretaz gain, liseri-zelulek pikor zitoplasmatikoen iraiztean biziki ziharduten, eta bakuolizazio nabarmena erakutsi zuten. Antzeko emaitzak laborategian Cu eta Hg pean jarritako bareetan ere lortu ziren (Marigómez et al., 1986b; 1996), eta baita Cd pean eta baraurik mantendutako barraskiloetan ere (Porcel et al., 1996; Dimitriadis & Konstatinidou, 2002; Chabicovsky et al., 2004). Metal-esposizio zein baraualdi ostean deskribatu diren alterazioak antzerakoak izanik, CTR eta asoziaturiko aldaketa histologikoak, metalen ekintza toxiko zuzenaren ondorioa baino gehiago metal-esposizioak eragindako liseri-prozesuen narriaduraren ondorioa izan daitezkeela ezin da baztertu. Izatez, bare eta barraskiloak kutsatzaileen 10. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruinean neurtutako liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa eta iraizte-zelula/liseri-zelula ratioa. (A eta B) Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (C eta D) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. 204

MUGIMENT TXORIERRI PROGRAMAREN DATUAK

MUGIMENT TXORIERRI PROGRAMAREN DATUAK MUGIMENT TXORIERRI PROGRAMAREN DATUAK 1. Partaidetza-datuak 2. Arrisku kardiobaskularraren faktoreak 3. Partaideen ezaugarriak 4. Esku-hartzearen ondorengo hobekuntzak 5. Gogobetetasun-inkesta 6. Ondorioak

More information

Nola eragiten du 2-Interleukinak T-zelulen nukleoko proteinen fosforilazio mailan?

Nola eragiten du 2-Interleukinak T-zelulen nukleoko proteinen fosforilazio mailan? Nola eragiten du 2-Interleukinak T-zelulen nukleoko proteinen fosforilazio mailan? (How does interleukin-2 affect the phosphorylation state of nuclear proteins in T-cells?) Nerea Osinalde Biokimika eta

More information

Gizonezkoentzako pilula antikontzeptiboa: errealitatea ala fikzioa?

Gizonezkoentzako pilula antikontzeptiboa: errealitatea ala fikzioa? Gizonezkoentzako pilula antikontzeptiboa: errealitatea ala fikzioa? Amaia Maite Erdozain Fernández Farmakologia Saila, Medikuntza eta Ondontologia Fakultatea, UPV/EHU Leioa Laburpena: Gaur egun gizonezkoengan

More information

Analisi farmakozinetiko/farmakodinamikoa antimikrobianoen erabilera hobetzeko gaixo larrietan

Analisi farmakozinetiko/farmakodinamikoa antimikrobianoen erabilera hobetzeko gaixo larrietan Analisi farmakozinetiko/farmakodinamikoa antimikrobianoen erabilera hobetzeko gaixo larrietan (Pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling to optimize antimicrobial agents dosage in critically ill patients)

More information

LGMD2A gaixotasunaren diagnostiko molekularra

LGMD2A gaixotasunaren diagnostiko molekularra LGMD2A gaixotasunaren diagnostiko molekularra Oihane Jaka Biodonostia Institutua eta King s College London oihane.jaka@kcl.ac.uk DOI: 10.1387/ekaia.14528 Jasoa: 2015-05-22 Onartua: 2015-06-16 Laburpena:

More information

LABURDURAK. Eskuineko blokeo osoa. Eskuin-bentrikuluaren hipertrofia. Ezkerreko blokeo osoa. Ezker-bentrikuluaren hipertrofia

LABURDURAK. Eskuineko blokeo osoa. Eskuin-bentrikuluaren hipertrofia. Ezkerreko blokeo osoa. Ezker-bentrikuluaren hipertrofia 1 LABURDURAK AEA AEE AKZ AMP AP ATHB AUHB BAAAK BAB BBB BGBK BTE EAK EB EKG ESBEO ESBH ESBO EZBEO EZBH EZBO FA KASN Aldi errefraktario absolutua Aldi errefraktario erlatiboa Arteria koronario zirkunflexua

More information

PROTEINA MOTORRAK ETA MUGIMENDU ZELULARRAK

PROTEINA MOTORRAK ETA MUGIMENDU ZELULARRAK 17 PROTEINA MOTORRAK ETA MUGIMENDU ZELULARRAK Zelularen mugimendu gehienak, eta egitura mugikorrak ere bai, zitoeskeletoan eta proteina motorren jardueran oinarritzen dira (iturria: JCB). Argi dago zitoeskeletoaren

More information

Leptina: funtzio fisiologiko garrantzitsuak dituen molekula

Leptina: funtzio fisiologiko garrantzitsuak dituen molekula Leptina: funtzio fisiologiko garrantzitsuak dituen molekula (Leptin: a molecule with important physiological functions) Gómez Zorita, Saioa Univ. del País Vasco/Euskal Herriko Unib. Farmazia Fak. Farmazia

More information

Populazio-baheketaren garrantzia: giza papilomabirusaren aurkako borroka

Populazio-baheketaren garrantzia: giza papilomabirusaren aurkako borroka Populazio-baheketaren garrantzia: giza papilomabirusaren aurkako borroka Nerea Fontecha 1, Miren Basaras* 1, Jose C. Quilez 2, Silvia Hernáez 3, Daniel Andía 2, Ramon Cisterna 1,3 1 Immunologia, Mikrobiologia

More information

GIBaren EGITURA- PROTEINA-KOLESTEROL ELKARREKINTZAREN AZTERKETA

GIBaren EGITURA- PROTEINA-KOLESTEROL ELKARREKINTZAREN AZTERKETA GIBaren EGITURA- PROTEINA-KOLESTEROL ELKARREKINTZAREN AZTERKETA Biokimika eta Biologia Molekularreko Gradua Gradu Amaierako Lana Egilea: Ariane Araujo Lombraña Leioan, 2016ko ekainaren 28a Zuzendaria:

More information

Ingurune aberastuaren eragina eskizofrenian

Ingurune aberastuaren eragina eskizofrenian Ingurune aberastuaren eragina eskizofrenian Harkaitz Bengoetxea* 1, Irantzu Rico-Barrio 1, Naiara Ortuzar 1, Enrike G. Argandoña 2, Jose Vicente Lafuente 1 1 Neurozientziak Saila, Medikuntza eta Odontologia

More information

Droga berriak merkatu berritzailean New drugs in an innovative market

Droga berriak merkatu berritzailean New drugs in an innovative market Errebisio-artikulua Droga berriak merkatu berritzailean New drugs in an innovative market Igor Horrillo 1, 2, 3 1, 2, 3 eta Luis F. Callado 1 Farmakologia Saila, Euskal Herriko Unibertsitatea, UPV/EHU

More information

Zaintzaren alde goxoa, zentzua eta alde positiboaren bilaketa menpekotasuna duen adinekoaren zainketan

Zaintzaren alde goxoa, zentzua eta alde positiboaren bilaketa menpekotasuna duen adinekoaren zainketan Zaintzaren alde goxoa, zentzua eta alde positiboaren bilaketa menpekotasuna duen adinekoaren zainketan J. López Martínez* I. Lizaso Elgarresta** M. Sánchez de Miguel** *San Pablo-CEU Unibertsitatea **Psikologia

More information

1. Sarrera eta motibazioa. 2. Arloko egoera eta ikerketaren helburuak. Jatorrizko artikulua

1. Sarrera eta motibazioa. 2. Arloko egoera eta ikerketaren helburuak. Jatorrizko artikulua Tumoreek, estres sozialak eta estresari aurre egiteko estrategiek jokabide depresiboan eta garunaren aktibitatean duten eragina Effect of tumor, social stress and stress-coping strategies on depressive-like

More information

Listeria monocytogenes. Agiriaren data: 2006ko martxoa

Listeria monocytogenes. Agiriaren data: 2006ko martxoa Listeria monocytogenes Agiriaren data: 2006ko martxoa 1.- SARRERA Listería monocytogenes (LM) sortu ahal den patogenoa da. Bakteria horiek sortzeko prozesu batzuk oso larriak izan ahal dira, eta umeki,

More information

ERRESBERATROLAREN HAINBAT EFEKTU ETA ERABILERA

ERRESBERATROLAREN HAINBAT EFEKTU ETA ERABILERA ERRESBERATROLAREN HAINBAT EFEKTU ETA ERABILERA Giza nutrizioa eta dietetikako gradua 2012/2013 ikasturtea Gradu amaierako lana Tutorea: Encarnación Goikoetxea Egilea: Iñaki Milton Laskibar AURKIBIDEA

More information

Kanabinoideoak: onuragarriak ala kaltegarriak?

Kanabinoideoak: onuragarriak ala kaltegarriak? Kanabinoideoak: onuragarriak ala kaltegarriak? Jon Zarate Sesma* Itziar Txurruka Ortega* Enrique Etxebarria Orella** * Farmazian lizentziatuak ** Medikuntzan doktorea Fisiologia Saila, Farmazia Fakultatea

More information

Peroxisomen proliferazioaren markatzaileak diren geneen klonazioa eta espresio ikerketak

Peroxisomen proliferazioaren markatzaileak diren geneen klonazioa eta espresio ikerketak Jakintza-arloa: Biologia Peroxisomen proliferazioaren markatzaileak diren geneen klonazioa eta espresio ikerketak Xenobiotiko organikoen eragina Egilea: EIDER BILBAO CASTELLANOS Urtea: 2007 Zuzendaria:

More information

From the bench to the bed: Sendagai berri baten garapena

From the bench to the bed: Sendagai berri baten garapena From the bench to the bed: Sendagai berri baten garapena Amaia M. Erdozain Fernández Farmakologia Saila, Medikuntza eta Odontologia Fakultatea, UPV/EHU, Leioa Laburpena: Luzea eta konplexua da botika baten

More information

ELIKAGAIAK, ELIKADURA ETA DIETETIKA. Edurne Simón Bittor Rodríguez Idoia Labayen

ELIKAGAIAK, ELIKADURA ETA DIETETIKA. Edurne Simón Bittor Rodríguez Idoia Labayen ELIKAGAIAK, ELIKADURA ETA DIETETIKA Edurne Simón Bittor Rodríguez Idoia Labayen Udako Euskal Unibertsitatea Bilbo, 2007 Udako Euskal Unibertsitatea Edurne Simón, Bittor Rodríguez, Idoia Labayen ISBN: 978-84-8438-092-4

More information

EREMU ELEKTROMAGNETIKOAK ETA OSASUNEAN DUTEN ERAGINA FROGA ZIENTIFIKOAK

EREMU ELEKTROMAGNETIKOAK ETA OSASUNEAN DUTEN ERAGINA FROGA ZIENTIFIKOAK OSASUN SAILA Osasun Sailburuordetza Osasun Publikoaren eta Adikzioen Zuzendaritza DEPARTAMENTO DE SALUD Viceconsejería de Salud Dirección de Salud Pública y Adicciones EREMU ELEKTROMAGNETIKOAK ETA OSASUNEAN

More information

Gaitasun kognitiboen aplikazioa 5G sareen kontrol- eta kudeaketa-mailetan

Gaitasun kognitiboen aplikazioa 5G sareen kontrol- eta kudeaketa-mailetan Gaitasun kognitiboen aplikazioa 5G sareen kontrol- eta kudeaketa-mailetan (Application of cognitive capabilities in control and management planes of 5G networks) Bego Blanco*, Jose Oscar Fajardo, Fidel

More information

HPV infection, a described cause for human cancer: HPV detection and molecular mechanisms of HPV carcinogenesis (Review).

HPV infection, a described cause for human cancer: HPV detection and molecular mechanisms of HPV carcinogenesis (Review). Bachelor s Thesis Degree in Biology HPV infection, a described cause for human cancer: HPV detection and molecular mechanisms of HPV carcinogenesis (Review). Author: Josu Aguirre Gomez Director: Ainhoa

More information

B12 BITAMINAREN ETA FOLATOREN ESKASIAREN DIAGNOSTIKOA BERRIKUSKETA BIBLIOGRAFIKOA ETA GOMENDIOAK. 2015eko abendua

B12 BITAMINAREN ETA FOLATOREN ESKASIAREN DIAGNOSTIKOA BERRIKUSKETA BIBLIOGRAFIKOA ETA GOMENDIOAK. 2015eko abendua B12 BITAMINAREN ETA FOLATOREN ESKASIAREN DIAGNOSTIKOA BERRIKUSKETA BIBLIOGRAFIKOA ETA GOMENDIOAK. 2015eko abendua LANTALDEA: Carmen Mar Medina, koordinatzailea, Laborategia, Galdakao- Usansoloko Ospitalea

More information

Azido Linoleiko Konjokatua: obesitatearen aurkako irtenbidea ala mehatxua?

Azido Linoleiko Konjokatua: obesitatearen aurkako irtenbidea ala mehatxua? Azido Linoleiko Konjokatua: obesitatearen aurkako irtenbidea ala mehatxua? Jonatan Miranda, Arrate Lasa, Edurne Simón, Itziar Txurruka Farmazia eta Elikagaien Zientziak Departamentua, Farmazia Fakultatea.

More information

Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute

Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute Jakintza-arloa: Medikuntza Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute Egilea: EKAITZ AGIRREGOITIA

More information

MUSIKOTERAPIA ZAINKETA

MUSIKOTERAPIA ZAINKETA MUSIKOTERAPIA ZAINKETA ARINGARRIETAN GRADU AMAIERAKO LANA MUSIKOTERAPIA ZAINKETA ARINGARRIETAN GRADU AMAIERAKO LANA Vitoria-Gasteizko Erizaintza Eskola EGILEA: Maider Gorritxategi ZUZENDARIA: Yolanda López

More information

Arrain gelatinan oinarrituriko film biodegradagarriak

Arrain gelatinan oinarrituriko film biodegradagarriak Arrain gelatinan oinarrituriko film biodegradagarriak Alaitz Etxabide, Itsaso Leceta, Pedro Guerrero, Koro de la Caba* BIOMAT Ikerketa Taldea. Ingeniaritza Kimikoa eta Ingurumenaren Ingeniaritza Saila.

More information

Kalamua: maria-ren sekretua

Kalamua: maria-ren sekretua Kalamua: maria-ren sekretua Aitziber Mendiguren Ordorika Jose Angel Ruiz Ortega Joseba Gotzon Pineda Ortiz Farmakologia Saila Medikuntza Fakultatea. EHU Azken urteotan kalamuaren gaitasun terapeutikoa

More information

LINFOMA FOLIKULARRA:LINFOMA FOLIKULARRA 11/6/07 11:02 Página 1 LINFOMA FOLIKULARRA 2006ko berrikuspena

LINFOMA FOLIKULARRA:LINFOMA FOLIKULARRA 11/6/07 11:02 Página 1 LINFOMA FOLIKULARRA 2006ko berrikuspena LINFOMA FOLIKULARRA 2006ko berrikuspena AURKIBIDEA 1. Sarrera............................................... 5 2. PETen erabilgarritasuna linfoma folikularraren azterketan............. 5 3. Faktore pronostikoak.....................................

More information

Zahartzaroa eta lekukoen oroimena

Zahartzaroa eta lekukoen oroimena PSIKOLOGIA Zahartzaroa eta lekukoen oroimena Alaitz Aizpurua, Elvira Garcia-Bajos eta Malen Migueles Euskal Herriko Unibertsitatea Ikerketa honen helburua da gertaera baten oroimenean pertsona gazteen

More information

AURKIBIDEA. Sarrera Azterketen diseinua Emaitzak Ondorioak. Iruzkinak Proposamen terapeutikoa Bibliografia...

AURKIBIDEA. Sarrera Azterketen diseinua Emaitzak Ondorioak. Iruzkinak Proposamen terapeutikoa Bibliografia... SUKAR-NEUTROPENIA LUZEA ANTIFUNGIKO BERRIEN EGINKIZUNA AURKIBIDEA Sarrera................................................. 4 Azterketen diseinua......................................... 5 Emaitzak.................................................

More information

GRADU AMAIERAKO LANA

GRADU AMAIERAKO LANA GRADU AMAIERAKO LANA ARIKETA FISIKOAREN ETA DIETA OSASUNTSUAREN PROGRAMA BATEN EPE LUZEKO EFEKTUAK LEHENENGO MAILAKO HIPERTENTSIOA ETA OBESITATE MORBIDOA ZUEN PERTSONA BATENGAN: IKASKETA KASUA EGILEA:

More information

3. GAIA DIAGNOSTIKO PERIODONTALAREN SARRERA

3. GAIA DIAGNOSTIKO PERIODONTALAREN SARRERA 3. GAIA DIAGNOSTIKO PERIODONTALAREN SARRERA Egileak: García-De La Fuente AM, Estefanía-Fresco R, Aguirre-Zorzano L A OCW-2016 DESKRIBAPENA Bakterio-plaka (B-P) ez-espezifikoa pilatzen denean hortzen inguruan,

More information

MPERen ezagumendua GIB birusaren mintzean 4E10 eta 10E8 antigorputzen aldetik

MPERen ezagumendua GIB birusaren mintzean 4E10 eta 10E8 antigorputzen aldetik Gradu Amaierako Lana Biokimika eta Biologia Molekularra Gradua MPERen ezagumendua GIB birusaren mintzean 4E10 eta 10E8 antigorputzen aldetik CDR-H3 eta mintzaren garrantziaren azterketa mikroskopia bidez

More information

1. Ikasgaia. Garezur oinaldeko hobiak

1. Ikasgaia. Garezur oinaldeko hobiak 1. Ikasgaia Garezur oinaldeko hobiak Garezurra buruaren hezurrezko euskarria da. Bere barruan entzefaloa eta zentzumen bereziak babesten ditu, hau da, entzumena, usaimena, ikusmena eta dastamena. Arnasbideen

More information

GIB-1 birusaren env fusio proteinaren ingurune lipidikoaren azterketa

GIB-1 birusaren env fusio proteinaren ingurune lipidikoaren azterketa Gradu Amaierako Lana Biokimikako eta Biologia Mokularreko Gradua GIB-1 birusaren env fusio proteinaren ingurune lipidikoaren azterketa Egilea: Irati Odriozola Lerchundi Zuzendaria: Maier Lorizate Nogales

More information

GRADU AMAIERAKO LANA

GRADU AMAIERAKO LANA GRADU AMAIERAKO LANA BERRIKUSPEN BIBLIOGRAFIKOA Distrofia miotonikoa duten pazienteen eta euren senideen bizi-kalitatearen azterketa MAITE BILBAO CORTINA 2015eko maiatzaren 14a Eskerrak eman nahi dizkiet

More information

GRADU AMAIERAKO LANA

GRADU AMAIERAKO LANA GRADU AMAIERAKO LANA Berrikuspen bibliografikoa Antsietate Asaldura Orokorraren tratamenduaren hausnarketa eta Erizaintzaren esku hartzea. ARANTZA AGIRRE VALLE 2015eko Maiatzak 15 1 LABURPENA: Antsietate

More information

Urte bat baino gutxiagoko umeengan agertutako nerbio-sistema zentraleko tumoreak: berrikuspena Gurutzetako Unibertsitate Ospitalean eta literaturan

Urte bat baino gutxiagoko umeengan agertutako nerbio-sistema zentraleko tumoreak: berrikuspena Gurutzetako Unibertsitate Ospitalean eta literaturan Urte bat baino gutxiagoko umeengan agertutako nerbio-sistema zentraleko tumoreak: berrikuspena Gurutzetako Unibertsitate Ospitalean eta literaturan Central Nervous System (CNS) tumors in an under 1 year-old

More information

GAIXOTASUN INFEKZIOSOEN AURKAKO JARDUERA-PROTOKOLOAK (III) PROTOCOLOS DE ACTUACIÓN FRENTE A ENFERMEDADES INFECCIOSAS (III)

GAIXOTASUN INFEKZIOSOEN AURKAKO JARDUERA-PROTOKOLOAK (III) PROTOCOLOS DE ACTUACIÓN FRENTE A ENFERMEDADES INFECCIOSAS (III) GAIXOTASUN INFEKZIOSOEN AURKAKO JARDUERA-PROTOKOLOAK (III) PROTOCOLOS DE ACTUACIÓN FRENTE A ENFERMEDADES INFECCIOSAS (III) OSASUN SAILA DEPARTAMENTO DE SANIDAD ISBN 84-457-2148-8 Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen

More information

LANDARE-OSASUNERAKO PRODUKTUEN HONDAKINAK: LETXUGA, TOMATEA, ZERBAK ETA PIPERRA. 2005eko azaroa

LANDARE-OSASUNERAKO PRODUKTUEN HONDAKINAK: LETXUGA, TOMATEA, ZERBAK ETA PIPERRA. 2005eko azaroa LANDARE-OSASUNERAKO PRODUKTUEN HONDAKINAK: LETXUGA, TOMATEA, ZERBAK ETA PIPERRA 2005eko azaroa 1.- SARRERA Osasunaren Munduko Erakundeak (OME) horrela definitzen du plagizida hitza (pestizida edo landare-osasunerako

More information

Urdaibai estuarioko plankton mikrobianoaren dinamika trofikoa

Urdaibai estuarioko plankton mikrobianoaren dinamika trofikoa Jakintza-arloa: Biologia Urdaibai estuarioko plankton mikrobianoaren dinamika trofikoa Egilea: AITZIBER SAROBE EGIGUREN Urtea: 2009 Zuzendariak: Unibertsitatea: ARANTZA IRIARTE GABIKAGOGEASKOA, EMMA ORIBE

More information

Protokoloa. MIELOMA ANIZKOITZA eko berrikuspenaren eguneratzea

Protokoloa. MIELOMA ANIZKOITZA eko berrikuspenaren eguneratzea Protokoloa MIELOMA ANIZKOITZA 2008 2005eko berrikuspenaren eguneratzea 37 MIELOMA ANIZKOITZA 2008 2005eko berrikuspenaren eguneratzea DONOSTIA OSPITALEA Osakidetza Begiristain pasealekua, z.g. 20014 Donostia-San

More information

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE BIOENERGETIKA. metabolikoak.

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE BIOENERGETIKA. metabolikoak. BIOENERGETIKA 1. GAIA. Bide metabolikoak Jarduera Fisikoan 1.2.1.- Substratuen erabilpena eta moldaketa metabolikoak Substratuen erabilpena zehazten duten faktoreak ariketan zehar Ariketaren intentsitatea.

More information

Mutazioak progranulina genean: eragiten duten klinika, patologia eta RNA mailako adierazpena

Mutazioak progranulina genean: eragiten duten klinika, patologia eta RNA mailako adierazpena Mutazioak progranulina genean: eragiten duten klinika, patologia eta RNA mailako adierazpena (Progranulin gene mutations: manifestations of clinical, pathological and RNA level) López de Munain Arregui,

More information

Helduen altuera iragarpena: belaunerainoko altuera neurriak*

Helduen altuera iragarpena: belaunerainoko altuera neurriak* Helduen altuera iragarpena: belaunerainoko altuera neurriak* (Prediction of stature in adults: knee height measurements) Arroyo Izaga, Marta 1 ; Martínez de la Pera, Concha 2 ; Ansotegui Alday, Laura 3

More information

MEDIKAZIO KRONIKOAREN MANEIUA EBAKUNTZA INGURUKO ALDIAN

MEDIKAZIO KRONIKOAREN MANEIUA EBAKUNTZA INGURUKO ALDIAN 25 LIBURUKIA 09 Zk 2017 FARMAKOTERAPIA INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA MEDIKAZIO KRONIKOAREN MANEIUA EBAKUNTZA INGURUKO ALDIAN AURKIBIDEA SARRERA FARMAKO ANTIDIABETIKOAK FARMAKO ANTITRONBOTIKOAK

More information

GABAPENTINA ETA PREGABALINA: ERABILERAREN ETA ABUSUAREN ARTEAN

GABAPENTINA ETA PREGABALINA: ERABILERAREN ETA ABUSUAREN ARTEAN Infac ESKUALDEKO 22 LIBURUKIA 4 Zk 2014 FARMAKOTERAPI INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA DE LA COMARCA http://www.osakidetza.euskadi.net/cevime Intranet Osakidetza http:/www.osakidetza.net GABAPENTINA

More information

Umearen sobera. Esku-hartzea Lehen Mailako Arretako Pediatrian. Doktoretza-tesia. Xabier Txakartegi Etxebarria. Gernika-Lumon, 2015ko maiatzaren 12an

Umearen sobera. Esku-hartzea Lehen Mailako Arretako Pediatrian. Doktoretza-tesia. Xabier Txakartegi Etxebarria. Gernika-Lumon, 2015ko maiatzaren 12an Umearen pisu sobera Esku-hartzea Lehen Mailako Arretako Pediatrian Doktoretza-tesia Xabier Txakartegi Etxebarria Gernika-Lumon, 2015ko maiatzaren 12an Ondoko Doktoretza-Tesi hau Lourdes, Jokin, Maddalen,

More information

Pregabalinaren eraginkortasuna min neuropatikoa tratatzeko: Berrikustapen sistematikoa

Pregabalinaren eraginkortasuna min neuropatikoa tratatzeko: Berrikustapen sistematikoa Revisión Gac Med Bilbao. 2016;113(3):113-128 Pregabalinaren eraginkortasuna min neuropatikoa tratatzeko: Berrikustapen sistematikoa Iratxe Ruiz, Aitziber Mendiguren Farmakologia Saila. Medikuntza eta Erizaintza

More information

ALZHEIMER MOTAKO DEMENTZIA. Aurkibidea

ALZHEIMER MOTAKO DEMENTZIA. Aurkibidea ALZHEIMER MOTAKO DEMENTZIA Aurkibidea 1.1. Funtzio kognitiboak balioesteko galde-sortak 1.1.1. MMSE, Mini-Mental State Exam 1.1.2. SPMSQ, Short Portable Mental Status 1.1.3. ADAS-COG, Alzheimer s Disease

More information

3.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK

3.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK 3.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK Streptococcus pneumoniae bakterioa da herritarren artean pneumonia komunitarioaren eragile nabarmenena eta haurrei erdiko otitisa eragitearen arrazoi nagusia.

More information

ZEFALEAREN KUDEAKETA LARRIALDIETAN

ZEFALEAREN KUDEAKETA LARRIALDIETAN ZEFALEAREN KUDEAKETA LARRIALDIETAN Kasu baten harira Ane Mateos Aurrekoetxea, Maialen Alday Munilla, Joseba Fdz de Retana Corres eta Garazi Agirre Beitia KASU KLINIKOA Kontsulta arrazoia: zefaleagatik

More information

LC teknika desberdinen erabilera sindrome metabolikoaren aurkako terapian erabiltzen diren farmakoen determinaziorako

LC teknika desberdinen erabilera sindrome metabolikoaren aurkako terapian erabiltzen diren farmakoen determinaziorako Jakintza-arloa: Kimika LC teknika desberdinen erabilera sindrome metabolikoaren aurkako terapian erabiltzen diren farmakoen determinaziorako Egilea: GORKA IRIARTE SAENZ DE OJER Urtea: 2011 Zuzendariak:

More information

Epilepsia eta genetika*

Epilepsia eta genetika* Epilepsia eta genetika* (Epilepsy and genetics) Urtasun, Miguel; Poza, Juan José; Cobo, Ana Mª; Azpitarte, Margarita; Martí Massó, José Félix; Martínez-Gil, Ángel; Bautista Espinal, Juan; Carrera, Edurne;

More information

4.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK

4.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK 4.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK Streptococcus pneumoniae bakterioa da herritarren artean pneumonia komunitarioaren eragile nabarmenena eta haurrei erdiko otitisa eragitearen arrazoi nagusia.

More information

4. GAIA: Farmakoen banaketa organismoan

4. GAIA: Farmakoen banaketa organismoan 4. GAIA: Farmakoen banaketa organismoan Lan hau Creative Commons-en Nazioarteko 3.0 lizentziaren mendeko Azterketa-Ez komertzial- Partekatu lizentziaren mende dago. Lizentzia horren kopia ikusteko, sartu

More information

Arreta gabezia hiperaktibitatearekin. nahastea 15. monografikoa

Arreta gabezia hiperaktibitatearekin. nahastea 15. monografikoa hik hasi 5 euro 2005eko NEGUA 15. Arreta gabezia hiperaktibitatearekin monografikoa nahastea Arreta gabezia hiperaktibitatearekin nahastea Mikel HARANBURU EHUko irakaslea Jesus GUERRA EHUko irakaslea Esther

More information

RPAQ. Jarduera fisiko egin berriari buruzko galdesorta

RPAQ. Jarduera fisiko egin berriari buruzko galdesorta RPAQ Basque_RPAQ Version Number 1.1 updated 11/September/27 RPAQ Jarduera fisiko egin berriari buruzko galdesorta Azkeneko 4 asteetan egunero zer jarduera fisiko egin duzun neurtu nahi da galdesorta honen

More information

Haur-depresioa Lehen Hezkuntzako etapan: zertan datzan eta irakasleek zer egin dezaketen

Haur-depresioa Lehen Hezkuntzako etapan: zertan datzan eta irakasleek zer egin dezaketen PSIKOLOGIA Haur-depresioa Lehen Hezkuntzako etapan: zertan datzan eta irakasleek zer egin dezaketen Marian Soroa, Elena Bernaras eta Joana Jauregizar* EHUko Donostiako Irakasleen Unibertsitate Eskola,

More information

EAEko jardun-prozedura, Zika birusaren gaixotasunaren susmoa dagoen kasuetan

EAEko jardun-prozedura, Zika birusaren gaixotasunaren susmoa dagoen kasuetan EAEko jardun-prozedura, Zika birusaren gaixotasunaren susmoa dagoen kasuetan (Eguneratzea: 2016ko urriaren 17a) Osasunaren Mundu Erakundeak (OME), Zika birusaren gaixotasuna dela-eta, ezarri duen alerta

More information

Aurkezpena Operazio kirurgikoa egiteko denbora Infekzioaren profilaxia Profilaxi antibiotikoa... 6

Aurkezpena Operazio kirurgikoa egiteko denbora Infekzioaren profilaxia Profilaxi antibiotikoa... 6 ALDAKAKO HAUSTUREN PROTOKOLOA AURKIBIDEA Aurkezpena.............................................. 5 1. Operazio kirurgikoa egiteko denbora............................ 6 2. Infekzioaren profilaxia.....................................

More information

ERIZAINTZAKO GRADUA GIPUZKOA GRADO EN ENFERMERIA

ERIZAINTZAKO GRADUA GIPUZKOA GRADO EN ENFERMERIA ERIZAINTZAKO GRADUA GIPUZKOA GRADO EN ENFERMERIA 2015 / 2016 ikasturtea ALZHEIMER GAIXOTASUNA DUEN PERTSONARI ESKAINI BEHARREKO ZAINKETA INTEGRALAK GRADU AMAIERAKO LANA Silvia Tellechea Iraola Zuzendaria:

More information

AURKIBIDEA. 01. BIZTANLERIAREN ZAHARTZEA Zahartzea, sistema neuromuskularra eta gaitasun funtzionala

AURKIBIDEA. 01. BIZTANLERIAREN ZAHARTZEA Zahartzea, sistema neuromuskularra eta gaitasun funtzionala AURKIBIDEA 01. BIZTANLERIAREN ZAHARTZEA Zahartzea, sistema neuromuskularra eta gaitasun funtzionala 02. AHULTASUNA: OSO ZAHARREN ZAHARTZE ZAURGARRIA ETA EZGAITASUNA Indarraren entrenamendua zahar ahularengan.

More information

GRADU AMAIERAKO LANA. EGILEA: Amaia Ganboa Aldaba ZUZENDARIA: Sara Maldonado Martin KURTSOA: 2016/2017 DEIALDIA: Ohikoa

GRADU AMAIERAKO LANA. EGILEA: Amaia Ganboa Aldaba ZUZENDARIA: Sara Maldonado Martin KURTSOA: 2016/2017 DEIALDIA: Ohikoa GRADU AMAIERAKO LANA ARIKETA FISIKOAREN ETA DIETA OSASUNTSUAREN PROGRAMA BATEN EFEKTUAK GORPUTZEKO MASAN ETA GAITASUN FISIKOAN LEHENENGO MAILAKO HIPERTENTSIOAN ETA GAINPISUA DUTEN PERTSONENGAN EGILEA:

More information

Arreta medikoei murrizketarik?

Arreta medikoei murrizketarik? Arreta medikoei murrizketarik? (Health care rationing?) Martínez Urionabarrenetxea, Koldo Arreta Trinkoak. Nafarroako Ospitalea. Irunlarrea, z/g. 31008 Pamplona/Iruñea BIBLID [1577-8533 (2004), 6; 131-139]

More information

Gaceta Médica de Bilbao

Gaceta Médica de Bilbao Gac Med Bilbao. 2011;8(4):1 7 Gaceta Médica de Bilbao www.elsevier.es/gmb ORIGINAL ARTICLE Sociodemographic characteristics by primary cancer diagnosis of patients dying in a palliative care unit: A retrospective

More information

I ATALA: Farmakologia Aplikatuaren Orokortasunak

I ATALA: Farmakologia Aplikatuaren Orokortasunak I ATALA: Farmakologia Aplikatuaren Orokortasunak 1. Elkarrekintza farmakologikoak (4. Gaia) Ariketa honetan bi farmako mota agertzen dira: 1 Farmakoa (F1): Pazienteak odontologoaren kontsultara joan baino

More information

SEXOLOGIAKO HIZTEGIA

SEXOLOGIAKO HIZTEGIA SEXOLOGIAKO HIZTEGIA Iñaki Ugartebururen omenez Zuzendaria: Nerea Sancho Esnaola Aholkulari teknikoa: Itziar Alonso-Arbiol Hizkuntza-arduraduna: Juan Kruz Igerabide Sarasola Hizkuntza-begiralea: Iñigo

More information

Gaixotasun infekziosoen aurkako jarduera-protokoloak (V) Protocolos de actuación frente a enfermedades infecciosas (V) LEGIONELOSIA

Gaixotasun infekziosoen aurkako jarduera-protokoloak (V) Protocolos de actuación frente a enfermedades infecciosas (V) LEGIONELOSIA Gaixotasun infekziosoen aurkako jarduera-protokoloak (V) Protocolos de actuación frente a enfermedades infecciosas (V) LEGIONELOSIA OSASUN SAILA Osasun Sailburuordetza Osasun Publikoko Zuzendaritza DEPARTAMENTO

More information

Salud Pública. Osasun Publikoa seihilekoa. Editoriala. Aurkibidea. a u r k i b i d e a

Salud Pública. Osasun Publikoa seihilekoa. Editoriala. Aurkibidea. a u r k i b i d e a Salud Pública 202006 1. seihilekoa zenbakia Osasun Publikoa EHAEko Epidemiologi Aldizkaria http: //www.osanet.euskadi.net/ OSASUN SAILA DEPARTAMENTO DE SANIDAD a u r k i b i d e a Aurkibidea Epidemiologi

More information

BIOTEKNOLOGIA ETA PHARMA UNITATEA

BIOTEKNOLOGIA ETA PHARMA UNITATEA BIOTEKNOLOGIA ETA PHARMA UNITATEA Gure jarduerak hiru eremu barne hartzen ditu: TECNALIAko Bioteknologia eta Pharmaren Unitateak ikerketak egin eta zerbitzu teknologiko aurreratuak ematen ditu bioprozesuen

More information

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE EDUKIAK

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE EDUKIAK EDUKIAK 4.. Hormona-sistema: oroimena. 4.1. Hipotalamoko eta hipofisiko hormonak. 4.2. GH eta sexu-hormonak. 4.3. Guruin suprarrenalak: 4.3.1. Kortex suprarrenala (kortisol eta aldosterona). 4.3.2. Muin

More information

Osakidetzako praktika klinikoko gidaliburuak. Lipidoen erabilerari buruzko praktika klinikoko gidaliburua arrisku kardiobaskularreko faktore bezala

Osakidetzako praktika klinikoko gidaliburuak. Lipidoen erabilerari buruzko praktika klinikoko gidaliburua arrisku kardiobaskularreko faktore bezala Osakidetzako praktika klinikoko gidaliburuak Lipidoen erabilerari buruzko praktika klinikoko gidaliburua arrisku kardiobaskularreko faktore bezala FINANTZAKETA: PKG hau Osakidetzak eta Eusko Jaurlaritzako

More information

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA urtea

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA urtea EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA 2012. urtea EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA 2012. urtea Vitoria-Gasteiz 2014 Lan honen bibliografia-erregistroa Eusko Jaurlaritzaren

More information

HERPES GENITALAREN IKERKETA EPIDEMIOLOGIKO, KLINIKO ETA MIKROBIOLOGIKOA BILBO HIRIAN

HERPES GENITALAREN IKERKETA EPIDEMIOLOGIKO, KLINIKO ETA MIKROBIOLOGIKOA BILBO HIRIAN Medikuntza eta Erizaintza Fakultatea Immunologia, Mikrobiologia eta Parasitologia Saila HERPES GENITALAREN IKERKETA EPIDEMIOLOGIKO, KLINIKO ETA MIKROBIOLOGIKOA BILBO HIRIAN Doktorego Tesia Mikele Macho

More information

BIGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA EGITARAU TEORIKOA

BIGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA EGITARAU TEORIKOA BIGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA IRAUNALDIA: Lauhilabetekoa KREDITUAK: 5,5 teorikoak eta 1,5 praktikoak IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA Farmakologia interes kliniko handia duen oinarrizko

More information

Lan-asma BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK PROTOCOLOS DE VIGILANCIA SANITARIA ESPECIFICA

Lan-asma BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK PROTOCOLOS DE VIGILANCIA SANITARIA ESPECIFICA OSALAN Laneko Segurtasun eta Osasunerako Euskal Erakundea Instituto Vasco de Seguridad y Salud Laborales BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK Lan-asma LAN-OSASUNA LAN-OSASUNA BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO

More information

Parametro desberdinen konparaketa saskibaloi jokalari gizonen eta emakumeen artean

Parametro desberdinen konparaketa saskibaloi jokalari gizonen eta emakumeen artean Gradu Amaierako Lana Fisioterapia Gradua Parametro desberdinen konparaketa saskibaloi jokalari gizonen eta emakumeen artean Egilea: Mikel Urretabizkaia Astigarraga Zuzendaria: Iratxe Duñabeitia Usategui

More information

IKASLEAREN GIDA. Aholkularitza Psikologikoa

IKASLEAREN GIDA. Aholkularitza Psikologikoa IKASLEAREN GIDA Aholkularitza Psikologikoa Ikasturtea: 2016-2017 TITULAZIOA: GRADUA PSIKOLOGIAN ZENTRO: PSIKOLOGIA FAKULTATEA IKASTURTEA: 2016-2017 IKASLEAREN GIDA 1. IRAKASGAIAREN OINARRIZKO EZAUGARRIAK

More information

Euskadiko energiapobretasunari. buruzko gizarteeztabaidarako

Euskadiko energiapobretasunari. buruzko gizarteeztabaidarako Euskadiko energiapobretasunari buruzko gizarteeztabaidarako oinarriak Arartekoaren 1/2016 Gomendio orokorra, urtarrilaren 26koa. w w w. a r a r t e k o. e u s 2 Euskadiko energiapobretasunari buruzko gizarte-eztabaidarako

More information

4. Kapitulua TXERTOAK

4. Kapitulua TXERTOAK 4. Kapitulua TXERTOAK 4.1. DIFTERIA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK Gaixotasun bakteriano akutua da, eta arnaseko traktuaren goiko aldeari sudurreko mukosa, amigdalak, laringea edo faringea erasaten dio sarritan

More information

ASMA HELDUETAN ETA NERABEETAN

ASMA HELDUETAN ETA NERABEETAN 25 LIBURUKIA 08 Zk 2017 FARMAKOTERAPIA INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA ASMA HELDUETAN ETA NERABEETAN AURKIBIDEA SARRERA DIAGNOSTIKOA TRATAMENDUA TRATAMENDUAREN HELBURUAK ETA OSAGAIAK JARRAIPEN

More information

JARDUERA FISIKO EGOKITUA ETA ELIKADURA: OSASUNAREN BIDEAN

JARDUERA FISIKO EGOKITUA ETA ELIKADURA: OSASUNAREN BIDEAN 12 13 Iratxe Ibarra, markinarra, afizionatu mailako paletaria eta bertso - laria Koikili Lertxundi, otxandiotarra, Athletic-eko futbolaria izana, gaur egun futbol entrenatzailea; kirol mundua euskaraz

More information

6. GAIA: FARMAKOEN IRAIZKETA

6. GAIA: FARMAKOEN IRAIZKETA 6. GAIA: FARMAKOEN IRAIZKETA Lan hau Creative Commons-en Nazioarteko 3.0 lizentziaren mendeko Azterketa-Ez komertzial- Partekatu lizentziaren mende dago. Lizentzia horren kopia ikusteko, sartu http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/es/

More information

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA Vitoria-Gasteiz, 2012 Lan honen bibliografia-erregistroa Eusko Jaurlaritzako Liburutegi

More information

Hipertentsio arterialari buruzko Praktika klinikoaren gida

Hipertentsio arterialari buruzko Praktika klinikoaren gida Osakidetzako praktika klinikoko gidak Hipertentsio arterialari buruzko Praktika klinikoaren gida Laburpena 2007ko eguneratzea FINANTZAKETA: PKG hau Osakidetzak eta Eusko Jaurlaritzaren Osasun Sailak finantzatu

More information

Pazientearen motibazioa eta. Aho-higiene argibideak. Kontrol mekanikoa.

Pazientearen motibazioa eta. Aho-higiene argibideak. Kontrol mekanikoa. Pazientearen motibazioa eta Aho-higiene argibideak. Kontrol mekanikoa. Egileak: Aguirre-Zorzano L A,Estefanía-Fresco R, Fernández-Jiménez A,, OCW-2017 Egileak: Aguirre LA, Estefanía R, Fernández A, García

More information

Activos O.I.T. afijación. afijación igual. afijación óptima. agregación. agrupamiento de datos. ajuste. aleatorio. algoritmo

Activos O.I.T. afijación. afijación igual. afijación óptima. agregación. agrupamiento de datos. ajuste. aleatorio. algoritmo Activos O.I.T. Son todas las personas que aportan un trabajo para producir bienes y servicios, y las que carecen de empleo en ese momento, lo buscan y están disponibles para corporarse a él. Se compone

More information

GIZA ELIKADURA (06086)

GIZA ELIKADURA (06086) GIZA ELIKADURA (06086) HELBURU OROKORRAK Ikasgai honen helburua, ikaslei elikadura orekatuaren oinarriak irakustea izango da, baita hazten hari diren gizakietan eta baita gizaki helduetan eta zaharretan.

More information

Osasun Zientzien Arloan Oinarrezkoa Derrigorrezkoa ) Ikasle-taldea Euskara (32)

Osasun Zientzien Arloan Oinarrezkoa Derrigorrezkoa ) Ikasle-taldea Euskara (32) Ikasleentzako irakasgai-gidak egiteko EREDUA talde bakoitzean 1 1.- IRAKASGAIAREN INFORMAZIO OROKORRA Irakasgaiaren izena Saila Ikasturtea (Lauhilekoa) Farmakologia Medikoaren Oinarriak Farmakologia 1.

More information

A Structural Study of Functional Cells in Hepatopancreas of Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819

A Structural Study of Functional Cells in Hepatopancreas of Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 Pakistan J. Zool., vol. 40(2), pp. 109-114, 2008. A Structural Study of Functional Cells in Hepatopancreas of Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 YASEMIN TUNALI AND MELIKE ERKAN* Department of Biology,

More information

BOSTGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA KLINIKOA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA

BOSTGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA KLINIKOA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA BOSTGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA KLINIKOA IRAUNALDIA: Lauhilabetekoa KREDITUAK: 2 teorikoak eta 2,5 praktikoak IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA Farmakologia klinikoko kurtso honen helburu

More information

ZAHARREN MEDIKAZIOA BERRIKUSTEN: Zer jakin beharko nuke?

ZAHARREN MEDIKAZIOA BERRIKUSTEN: Zer jakin beharko nuke? Infac ESKUALDEKO 23 LIBURUKIA 2 Zk 2015 FARMAKOTERAPI INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA DE LA COMARCA http://www.osakidetza.euskadi.eus/cevime Intranet Osakidetza http:/www.osakidetza.eus ZAHARREN

More information

Ungueal Morphology and Pathology of the human mummy found in the Val Senales (Eastern Alps, Tyrol, Bronze Age)

Ungueal Morphology and Pathology of the human mummy found in the Val Senales (Eastern Alps, Tyrol, Bronze Age) MUNIBE (Antropologia-Arkeologia) Nº 46 123-132 SAN SEBASTIAN 1994 ISSN1132-2217 Aceptado: 1994-01-28 Ungueal Morphology and Pathology of the human mummy found in the Val Senales (Eastern Alps, Tyrol, Bronze

More information

Dementziaren aurkako medikamentuen jarraipena eta ezabapena. 2016ko ekaina

Dementziaren aurkako medikamentuen jarraipena eta ezabapena. 2016ko ekaina Dementziaren aurkako medikamentuen jarraipena eta ezabapena 2016ko ekaina Vitoria-Gasteiz, 2016 Lan honen Lan honen bibliografia-erregistroa Eusko Jaularitzaren Bibliotekak sarearen katalogoan aurki daiteke:

More information

Axularren liburutegia irudikatzen. Erlijiozko aipuak Geron

Axularren liburutegia irudikatzen. Erlijiozko aipuak Geron Axularren liburutegia irudikatzen. Erlijiozko aipuak Geron PATXI SALABERRI MUÑOA patxi.salaberri@ehu.eus Modo, ecce modo; sine paululum Agustin Hiponakoa 0.- Literaturan literatura orotan garrantzizko

More information

EBAZPENA (1/2007 Espedientea, IMQ)

EBAZPENA (1/2007 Espedientea, IMQ) EBAZPENA (1/2007 Espedientea, IMQ) Osoko biltzarra Juan Luis Crucelegui Garate J. Javier Berasategi Torices J. Vitoria-Gasteizen, 2008ko otsailaren 20 Lehiaren Defentsarako Euskal Auzitegiak, azaldu berri

More information

UNIBERTSITATERA SARTZEKO PROBAK 2015eko EKAINA. Choose between option A and option B. Specify the option you have chosen.

UNIBERTSITATERA SARTZEKO PROBAK 2015eko EKAINA. Choose between option A and option B. Specify the option you have chosen. UNIBERTSITATERA SARTZEKO PROBAK eko EKAINA INGELESA PRUEBAS DE ACCESO A LA UNIVERSIDAD JUNIO INGLÉS Choose between option A and option B. Specify the option you have chosen. Please, don t forget to write

More information