Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute

Size: px
Start display at page:

Download "Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute"

Transcription

1 Jakintza-arloa: Medikuntza Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute Egilea: EKAITZ AGIRREGOITIA MARCOS Urtea: 2008 Zuzendaria: Unibertsitatea: JON IRAZUSTA ASTIAZARAN UPV-EHU ISBN:

2 Hitzaurrea Opioide-hartzaileak (δ, κ, μ) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute izenburua duen tesia 2003ko udaberrian hasi zen eta 2008ko apirilaren 25ean defendatu zen. Euskal Herriko Unibertsitateko, Medikuntza fakultateko, Fisiologia saileko Jon Irazustaren zuzendaritzapean egin zen. Tesia aurrera eramateko, Carmen Ochoa doktorearekin eta Madrilgo Unibertsitate Konplutenseko Manolo Guzmán doktorearen taldearen laguntzarekin egina izan zen. Ordura arte ezezaguna zen helburu bat ebatzeari ekin zioten: sistema opioidea eta sistema kannabinoidea espermatozoideen gaineko eragina, alegia. Emaitza oso interesgarriak lortu ziren, izan ere, giza espermatozoideetan osagai opioideentzako eta kannabinoideentzako hartzaileak deskribatu zituzten lehenetarikoak izan ziren. Eta horren ondorioz, tesiak eman dituen artikulu zientifikoak zientzia-aldizkari prestigiotsuetan publikatu dira eta oso aipatuak izan dira beste ikertzaileengatik. Emaitza haiek, gaur egun, egilearen ikerketalerroaren oinarria dira, hala ere, tesiaren egilearen gaur egungo helburua emakumeen ugalkortasuna ikertzean datza. Ekaitz Agirregoitia Marcos, 2012

3 Opioide-hartzaileak (δ, κ, µ) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute Ekaitz Agirregoitia Marcos Leioa, 2008

4 Opioide-hartzaileak (δ, κ, µ) eta kannabinoide-hartzaileak (CB 1, CB 2 ) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute Ekaitz Agirregoitia Marcos Leioa, 2008ko apirila Doktore-tesi honen zuzendaria Jon Irazusta Astiazaran Fisiologia Saila Medikuntza eta Odontologia Fakultatea Euskal Herriko Unibertsitatea

5

6 Doktore-tesi hau 2003ko udaberrian hasi zen eta 2008ko urtaro berdinean bukatu da. Eskerrik asko bost urte hauetan doktore-tesi hau, zuzenean edo zeharka, aurrera eramatea ahalbidetu duzuen norbanako, talde eta erakunde guztiei. Eta barkatu doktoretesi hau aurrera eramatean kale egin dizuedanoi. Nire hitzek ezin dute zuen bost urteko lana eta pazientzia saritu, izan ere zuek gabe ez nintzateke ezer izango... Gora zuek! Nire familia guztientzat... aurrera bolie! Aita, Ama, Naia, maite zaituztet!!!

7

8 Bertze jendek uste zuten ezin eskriba zaiteien orai dute phorogatu enganatu zirela. Heuskara ialgi adi mundura. (Bernard Etxepare, 1545) Edozein ekintzak indar berdineko eta kontrako noranzko erreakzioa eragiten du (Isaac Newton, 1687)

9

10 LABURDUREN ZERRENDA 2-AG: 2-arakidonoilglizerola AC: adenilato ziklasa ACEA: arakidonoil-2 -kloroetilamida ACTH: hormona adrenikortikotropikoa ADH: hormona antidiuretikoa ADP: adenosina 5 -difosfatoa AEA: N-arakidonoiletanolamina (anandamida) ALH: buruaren albodesplazamenduaren anplitudea AM251: 1-(2,4-diklorofenil)-5-(4- iodofenil]])-4-metil-n-(1- piperidil)pirazol-3-karboxamida AM630: [(6-iodo-2-metil-1-[2-(4- morfolinil)etil]-1h-indol-3-yl)(4- metoxifenil)metanona], AMP: adenosina 5 -monofosfatoa ANOVA: bariantzaren analisia; APN: N aminopeptidasa ATP: adenosina 5 -trifosfatoa BCF: zeharkatze-maiztasuna BOP: barne-peptido opioideak BSA: behi-serum albumina CB 1 : 1 motako kannabinoide-hartzailea CB 2 : 2 motako kannabinoide-hartzailea CaM: kalmodulina CaMK: kalmodulina kinasa camp: AMP ziklikoa CASA: ordenagailu bidezko haziaren analisia CBD: kannabidiola CBN: kannabinola cdna: DNA osagarria DAMME: D-ala 2 -Mephe 4 -Met-(O)-OIentzefalina DEPC: dietilpirokarbonatoa DMSO: dimetil sulfoxidoa DNA: azido desoxirribonukleikoa dntp: deoxirribonukleotido trifosfato DPDPE: [D-Pen 2,5 ]-Entzefalina ECL: kimioluminiszentzia-areagotzailea EDTA: azido diaminoetanotetraazetikoa FAAH: gantz-azidoen amida hidrolasa FSH: hormona folikulu-estimulatzailea GAPDH: glizeraldehido 3-fosfato deshidrogenasa GDP: guanosina 5'-difosfatoa GH: hazkuntza-hormona GnRH: hormona gonadotropinaaskatzailea GTP: guanosina 5'-trifosfatoa IZK: immunozitokimika JNK: Jun N-bukaera kinasa JWH-015: (2-Metil-1-propil-1H-indol-3- il)-1-naftalenil-metanona LH: hormona luteinizatzailea LIN: linealtasuna LPH: lipotropina LSD: desberdintasun minimo adierazgarria MAP: mitogenoz aktibaturiko proteina MAPK: MAP kinasa MGL: monoazilglizerollipasa mrna: RNA mezularia MSH: melanotropina

11 NAPE: N- arakidonoilfosfatidiletanolamina NAT: N-aziltransferasa NEP: endopeptidasa neutroa OME: Osasunerako Munduko Erakundea PAGE: poliakrilamidazko gel elektroforesia PBS: fosfato/gatz-indargetzailea PE: proentzefalina PD: prodinorfina PI3K: fosfatidilinositol-3 kinasa PCR: polimerasaren kate-erreakzioa PKA: camparen menpeko proteina kinasa PLD: D fosfolipasa POMC: proopiomelanokortina PRL: prolaktina PVDF: polibinilideno difluoroa RNA: azido erribonukleikoa RT: alderantzizko transkripzioa SDS: Sodio dodezil sulfatoa SR141716a:N-piperidino-5-(4- klorofenil)-1-(2,4-diklorofenil)-4-metil- 3-pirazol-karboxamida SR144528: N-[(1S)-endo-1,3,3-trimetil biziklo[2.2.1] heptan-2-il]-5-(4-kloro-3- metilfenil)-1-(4-metilbenzil)-pirazol-3- karboxamida] STR: zuzentasuna TAE: Tris/azetato indargetazailea TBEK: Tyrode-BSA eraldatu ezkapazitantea TBS: tris/gatz-indargetzailea TEK: Tyrode eraldatu ez-kapazitantea TEMED: N,N,N,N'- tetrametiletilenodiamina THC: Δ9-tetrahidrokannabinola TRPV1: 1 motako baniloide-hartzailea U-50488: 3,4-Dikloro-N-metil-N-[2-(1- pirrolidinil)ziklohexil]benzeneazetamida VAP: batez besteko ibilbidearen abiadura VCL: abiadura lerromakurra VSL: abiadura lerrozuzena WB: western blot WOB: oszilazioa ZP: mintz peluzidoa

12 AURKIBIDEA Orrialdea SARRERA 1 1. GIZONEZKOEN UGALTZE-APARATUA Ugaltze-aparatu arraren anatomia fisiologikoa Gameto arra (espermatozoidea) 6 2. ERNALKETA Espermatozoide eta obozitoen garraioa Espermatozoideen kapazitazioa Espermatozoideen akrosomaren erreakzioa Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko lotura ESPERMATOZOIDEEN MUGIKORTASUNA Espermatozoideen mugikortasunaren azterketa molekularra Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa SEINALEEN TRANSDUKZIO-BIDEAK GIZA ESPERMATOZOIDEETAN SISTEMA OPIOIDEA ETA KANNABINOIDEA Sistema opioidea Sistema kannabinoidea 36 HELBURUAK 45 MATERIALAK ETA METODOAK MATERIALAK Gailuak Erreaktiboak Soluzioak METODOAK Laginak lortzea Espermatozoideak prestatzea 57

13 2.3. Hartzaileen espresio genikoa Hartzaileen proteinen presentzia Hartzaileen proteinak kokatzea Espermatozoideen behaketa fisiologikoa Analisi estatistikoa 76 EMAITZAK ETA EZTABAIDA helburua: δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan Opioide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan Opioide-hartzaileen kokapena giza-espermatozoideetan Opioide-hartzaileen mrnaren espresioa giza espermatozoideetan helburua: CB 1 eta CB 2 kannabinoide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan Kannabinoide-hartzaileen mrnaren espresioa giza espermatozoideetan Kannabinoide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan Kannabinoide-hartzaileen kokapena giza espermatozoidetan helburua: Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen aktibazioaren eragina espermatozoideen mugikortasunean Agonista eta antagonista opioideen eragina espermatozoideen Mugikortasunean 89 δ opioide-hartzailearen agonista (DPDPE) eta antagonista (naltrindol) opioideen eragina mugikortasunean 89 κ opioide-hartzailearen agonista (U-50488) eta antagonista (norbinaltorfimina) opioideen eragina mugikortasunean 94 µ opioide-hartzailearen agonista (morfina) eta antagonista (naloxona) opioideen eragina mugikortasunean 94

14 3.2. Agonista eta antagonista kannabinoideen eragina espermatozoideen Mugikortasunean 98 CB 1 kannabinoide-hartzailearen agonista (ACEA) eta antagonista (SR A) kannabinoideen eragina mugikortasunean 98 CB 2 kannabinoide-hartzailearen agonista (JWH-015) eta antagonista (SR144528) kannabinoideen eragina mugikortasunean 101 EZTABAIDA OROKORRA ETA HIPOTESIAK Garrantzitsua al da opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mrna mantentzea espermatozoide helduetan? Opioide eta kannabinoide-hartzaileen kokalekua: beren funtzioaren adierazle? Opioide eta kannabinoideek espermatozoideen ugaltze-traktuetan zeharreko bidaia erregulatzen dute? 110 ONDORIOAK 115 BIBLIOGRAFIA 119 ERANSKINAK Eranskina: Denbora errealean egindako PCR kuantitatiboa (qrt-pcr) Eranskina: PCRan anplifikatutako anplikoien sekuentziazioa Eranskina: Mugikortasun parametroak 147 DOKTORE-TESI HONETATIK ERATORRITAKO ARTIKULUA 151

15

16 Sarrera

17

18 Sarrera 3 1. GIZONEZKOEN UGALTZE-APARATUA 1.1 Ugaltze-aparatu arraren anatomia fisiologikoa 1. irudiak gizonezkoen ugaltze-aparatua osatzen duten atalak erakusten ditu. Jarraian, atal bakoitzaren kokalekua eta funtzioa aztertuko dugu banan-banan: Testikuluak Testikuluak (A) espermatozoideak sortu eta metatzeko eta androgenoak jariatzeko organo espezializatuak dira. Eskrotoan biltzen dira, bertako tenperatura gorputzaren ohikoa baino 2-3 ºC baxuago mantentzeko. Izan ere, testikuluen tenperatura altuagoa denean, espermatogenesia kaltetua gertatzen da (Munkelwitz and Gilbert, 1998; Zorgniotti, 1980). Barrabilak zenbait atalez osatuta daude: a) Tubulu seminiferoak Tubulu seminiferoak (B), testikuluen barneko ehunka hodixka bihurri eta era oso trinkoan paketatuak dauden egiturak dira. Tubuluak zenbait lobulutan banatzen dira, baina guztiek sare testikularrean bukatzen dute. Tubuluetan, espermatogenesia gertatzen da; aurrerago azalduko dugu (Rhoades eta Tanner, 1995). b) Sare testikularra Tubulu seminiferoek sare testikularra (D) izeneko gune biltzailera igortzen dute beren edukia, eta barrabiletako hoditxo eferenteetatik (E1) epididimora eramaten dute (Guyton eta Hall, 1997) Epididimoa Epididimoa (E), testikuluen atzealdean kokatzen den hodia da; haren funtzioa hodi deferentea eta testikuluak lotzea da. Epididimo bi dauzkate gizonek; bat testikuluko.

19 4 Sarrera Epididimoa, klasikoki, hiru zatitan banatu izan da: epididimoaren burua (E1), gorputza (E2) eta isatsa (E3) (Rhoades eta Tanner, 1995). Gizakian, epididimoa 4-5 metro luze da, eta espermatozoideek, bide hori egiteko, 3 egunetik gora ematen dute (Wen eta Yang, 2000). Geroxeago ikusiko dugun bezala, organo hau oso garrantzitsua da espermatozoideen heltze-prozesuan eta mugikortasunean (Cosentino eta Cockett, 1986). Testikuluen eta epididimoaren jariakina hazi-likidoaren % 5 da, baina gametoen ugaltze-prozesurako ezinbestekoak diren zenbait propietate bereganatzen laguntzen dute (Jequier eta Crich, 1986) Hodi Deferenteak Hodi deferentea (F) epididimoaren edukia jaso eta hodi isurlera (H) eramaten duen hodia da. Bide horretan dauden anpuluak (G) haziaren biltegi gisa jokatzen du. Hori da, hain zuzen, basektomietan mozten den hodia. GERNU-MASKURIA (K) (O) gorputz leizetsu (N) gorputz arola (P) glandea (J) prostata (L) uretra (B) tubulu seminiferoak (A) TESTIKULUA (H) Hodi isurlea (M) guruin bulbo-uretrala (I) guruin besikularra (G) hodi deferentearen anpulua (F) hodi deferentea (E1) hoditxo eferenteak + epid. burua (caput) (E) epididimoa (E2) epid. gorputza (corpus) (D) sare testikularra (E3) epid. isatsa (cauda) 1. irudia. gizonezkoen ugaltze-aparatuaren atalak. Azalpena testuan. (Debuse, 1998-tik moldatua) Guruin Osagarriak Espermatozoideak epididimotik uretraraino garraiatzeko ekintzari emisio deritzo, eta bide horretan nahasten dira espermatozoideak eta guruin osagarrien jariakin guztiak. Ekintza hori epididimo, hodi deferente eta hodi isurleen muskuluen uzkurketek eragiten

20 Sarrera 5 dute (Rhoades eta Tanner, 1995). Beraz, guruin osagarriak uretrarekin konektatuta daude, eta haien jariakinek espermatozoideen iraupena eta ugalkortasuna mantentzen dute (Jequier eta Crich, 1986). a) Guruin besikularra Guruin besikularraren (I) jariakin gelatinakara horixka hazi-likidoaren % izaten da. Jariatzen dituzten gaien artean fruktosa (espermatozoideen elikagai energetiko nagusia), azido askorbikoa, fibrinogenoa, bikarbonatoa eta prostagladinak daude, besteak beste, eta ahalmen indargetzaile handia du (Jequier eta Crich, 1986). b) Prostata Prostata (J) gernu-maskuriaren (K) azpialdean dagoen guruina da, eta uretrarekin (L) konektatuta dago (Rhoades eta Tanner, 1995). Prostataren jariakin urtsu eta koloregabekoa hazi-likidoaren % izaten da, eta zinkez eta hainbat entzimaz (proteasa, fosfatasa azidoak...) osatua dago. Prostataren jariakin horrek ph azidoa du, eta ugalkortasunaren zenbait prozesu garrantzitsu erregulatzen duten prostasoma izeneko mintzezko besikulak ditu (Jequier eta Chrich, 1986). Prostasometan, osagai lipidiko (kolesterola, esfingomielina...), ioi eta molekula txiki (Ca ++, Zn ++, GDP, ADP, ATP...) eta proteina ugari (% 33,8 entzimak, % 19 proteina garraiatzaileak, % 17,3 seinaleen transdukziorako proteinak, % 14,4 GTP proteinak eta % 5,8 proteina txaperonak) identifikatu dira (Utleg eta lank., 2003). d) Guruin bulbo-uretrala Guruin bulbo-uretralak (M) hazi-likidoari azken bi jariakinak gehitzen dizkio. Bi jariakinek gelatinakara, alde batetik, eta urtsua, bestetik hazi-likidoaren % 2-5 osatzen dute, eta glukoproteinatan aberatsak dira (Jequier eta Crich, 1986) Uretra Testikuluaren eta kanpo-ingurunearen arteko azken egitura da. Zati prostatikoa, zati menbranosoa eta zati arola ditu (L). Uretraren zati arola zakilaren barnean dago, eta

21 6 Sarrera gorputz arolak (N) inguratzen du. Haren gainean zakilaren trenkadak bitan banatzen dituen gorputz leizetsua (O) dago, eta zakilaren gorputz arol distal zabaldua zakilaren glandea (P) da. Egitura muskular horiek guztiek parte hartzen dute zakilaren tentetzean. Hazi-isurtzea hazia uretratik kanporatzea da (Guyton eta Hall, 1997). 1.2 Gameto arra (espermatozoidea) Espermatogenesia Zelula ama germinaletatik espermatozoideetara doan desberdintze-prozesua da espermatogenesia (2. irudia). Prozesu hori testikuluetan gertatzen da, tubulu seminiferoetan hain zuzen ere. Haurtzaroan, gametoen sorrera atsedenean mantentzen da, baina pubertaroan, hormona gonadotropikoen (FSH eta LH) kontzentrazioaren igoerarekin batera, testikuluetako Leydig zelulek testosterona hormona jariatuko dute eta, horrekin batera, espermatogenesia hasiko da. Prozesua bizitza osoan mantenduko da, baina zahartzaroan urritze txiki bat nabaritzen da (Sadler, 2004). Espermatogenesia, edo zelula germinal arren sorrera-prozesua, 3 zatitan banatu ohi da (Dudek eta Fix, 2004): a) Espermatozitogenesia Zelula germinatibo primordialak (46, 2N), bitelo-zakuaren paretetan agertzen dira garapen enbrionarioaren hirugarren astean eta, zatiketa mitotikoak jasaten dituzten bitartean, mugimendu ameboideen bidez, 4. eta 5. asteen artean gonadetara heltzen dira. Pubertaroan, zelula germinatibo primordialak A motako espermatogoniara (46, 2N) desberdintzen dira. A motako espermatogoniek etengabe mitosiak pairatzen dituzte, arra zelula amez hornitzeko. Baina horietako hainbat zelula B motako espermatogonietara diferentziatzen dira (46, 2N).

22 Sarrera 7 b) Meiosia B motako espermatogoniak lehenengo meiosian sartzen dira eta, DNA erreplikatzen dutenean, espermatozito primario bihurtzen dira (46, 4N). Espermatozito primario horiek lehenengo meiosia bukatzen dute, eta bakoitzak 2 espermatozito sekundario sortzen ditu (23, 2N). Espermatozito sekundario horiek, bigarren meiosia eginda, bakoitzak 2 espermatida sortzen ditu (23, 1N). Espermiogenesia Meiosia Espermatozitogenesia espermatogonia A espermatogonia B espermatozito I espermatozito II espermatidak Mitosia (16 egun) I. meiosia (24 egun) II. meiosia (orduak) hondakingorputzak espermatozoideak Desberdintzapena 2. irudia. Espermatogenesiaren eskema. Zelula ama germinaletatik eratorritako A motako espermatogoniak, espermatogenesia prozesuaren lehenengo zelulak dira. Zelulen zatiketaren bidez zelula-klonak eratzen dira eta zelula berri horiek guztiak, zubi zitoplasmatikoen bidez, lotuak geratzen dira espermatozoideak hondakin-gorputzetatik banatzen diren arte. Zelula elkarlotuen kopurua, eskeman irudikatzen direnak baino askoz gehiago dira (Miller eta Ostermeier, 2006-tik moldatua). d) Espermiogenesia A motako espermatogoniek espermatogenesia egiten hasten direnetik espermatidak sortu arte, zitozinesia osatugabea da. Hori dela eta, zelula batetik eratorritako zelula-

23 8 Sarrera klon luzeak zubi zitoplasmatikoen bidez lotuak agertzen dira. Zelula germinatibo heldu (espermatozoideak) independiente bilakatzeko, espermatidek zenbait aldaketa morfologiko pairatzen dituzte. Aldaketa horiek, besteak beste, hauek dira: akrosoma garatzea, nukleoa kondentsatzea, zitoplasmaren zati nagusia desagertzea eta burua, erdiko zatia eta isatsa eratzea. Dena den, espermatozoide horiek ez dute ernaltzeko gaitasunik emearen ugaltze-traktuan kapazitazioa eta erreakzio akrosomikoa pairatu arte. Gizakietan, ziklo espermatogeniko bakoitzak 64 egun irauten ditu. Hala ere, ziklo bakoitza bukatu baino lehen, 2-3 asteko erregulartasunez, beste ziklo batzuk hasten dira. Ondorioz, tubulu seminifero bakoitzean garapen-egoera desberdinetan dauden zelulak izango ditugu, eta garatuenak tubulu horien argiune edo lumen aldera kokatuko dira (3. irudia). Tubulu horien alde basalean espermatogenesia erregulatzen duten Sertoli zelulak ere kokatzen dira, eta odolaren eta tubuluaren arteko hesia edo muga dira (Browder eta lank., 2000). Espermatozoidea Tubulu seminiferoen lumena GARAPENAREN SEKUENTZIA Espermatida II. Espermatozitoa I. Espermatozitoa Espermatogonia Tubulu seminiferoen pareta 3. irudia. Espermatozitoen garapena tubulu seminifero baten zehar-ebakian. Xafla basalean, zelula ama germinalen populazioa dago (espermatogoniak). Zelula horiek zatitzean sortzen diren zelula alabak lumen aldera migratuko dute eta 64 egun eta gero, espermatozoideetara desberdintzen dira (irudia The McGraw-Hill Companies egindakotik moldatua dago).

24 Sarrera Espermatozoideen egitura Espermatozoideen funtzioa ugaltze-zelula emeraino (obozitoa) iritsi eta hura ernaltzea da. Helburu hori lortzeko, oso morfologia zehatza dute. Ugaztunen espermatozoidea bi zati nagusitan banatu ohi da: burua eta isatsa (4. irudia). A Nukleoa Lepoa Akrosoma Zitoplasma B MBE EMB MG Tarteko zatia KZD DB MP D KZD Zatiki nagusia ZMZ MP Bukaerako zatikia E MP 4. irudia. Espermatozoidearen eta isatsaren ultraegituraren irudi eskematikoa. A) Ugaztunen espermatozoidea buruaz (akrosoma, nukleoa eta zitoplasma) eta isatsaz (lepoa, tarteko zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia) osaturik dago. B) Tarteko zatiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, kanpotik barrura, mintz plasmatikoa (MP), mitokondrien geruza (MG), 9 kanpo-zuntz dentso (KZD) eta axonema eratzen duten egiturak [mikortubulu-bikoteen eraztuna (MBE), dineinazko besoak (DB) eta erdiko mikrotubulu-bikotea (EMB)] daude. D) Zatiki nagusiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, mintz plamatikoa (MP), 7 kanpo-zuntz dentso (KZD) eta 2 zuntzezko mintz zutabe (ZMZ) daude. Axonemako osagaiak ez dira aldatzen. E) Bukaerako zatiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, mintz plamatikoa (MP) eta axonema agertzen dira. Azalpena testuan. (Turner, 2006-tik moldatua). Burua Buru barruko egitura aipagarrienak akrosoma, nukleoa eta zitoplasma oso murritza dira (Browder eta lank., 2000):

25 10 Sarrera a) Akrosoma: Buruaren alde apikalean kokatzen den besikula handi bat da. Egitura horren barruan, obozitoaren matrize estrazelularra (mintz peluzidoa) zeharkatzeko beharrezkoak diren entzima hidrolitikoak daude. Entzima horiek, akrosomaren exozitosiagatik (erreakzio akrosomikoa) askatzen dira. b) Nukleoa: Akrosomaren atzetik geratzen den buruaren zatian kokatzen da, eskualde post-akrosomalean hain zuzen. Espermatozoidearen nukleoan, DNA oso kondentsatua dago espermatogenesian zehar protaminek histonak ordezkatzen dituztelako. Nukleoan ere, oraindik guztiz ezagunak ez diren zenbait funtzio bete ditzakeen RNA dago. Nukleoa obozitora sartu behar den zatia da. d) Zitoplasma: Espermatozoide helduek oso zitoplasma murritza dute. Zitoplasmaren galera nagusia, espermatozoideak tubulu seminiferoen epiteliotik askatzera doazenean gertatzen da. Askatzen duten zitoplasma zatiari hondakingorputz deritzo; gorputz horietan, RNA paketatua, Golgi aparatua, erretikulu endoplasmikoa, lisosomak eta peroxisomak daude. Sertoli zelulek fagozitatzen dituzte hondakin gorputzak. Nukleoko kromatinaren kondentsazio handiagatik, ez da mrnarik de novo sortuko, eta zitoplasmaren presentzia murritza eta organuluen galera direla eta, mrna hori ez da itzultzen proteinetara, eta besikulen garraiorik ez da gertatzen. Espermatozoide helduek, beraz, proteinen espresioa eta besikulen garraioa galdua dute (Miller eta Ostermeier, 2006). Horrek esan nahi du espermatozoideek ez dituztela konposatu berriak sintetizatuko eta, beraz, espermatogenesian sortutakoarekin heldu beharko dutela obozitora. Dena den, epididimoan zeharreko garraioan, likido seminalarekin kontaktuan dauden bitartean edota emearen ugaltze-bidean zehar, espermatozoideen mintz plasmatikoko proteina eta lipidoen trukea gertatzen da (Schuel eta Burkman, 2005). Modu horretan, gerta daiteke espermatozoideek, ingurunearen arabera, jarduera aldatzea. Bestalde, duela gutxi, proposatu da proteina jakin batzuen mrnaren itzulpen mitokondriala gerta daitekeela (Miller eta Ostermeier, 2006). Beraz, gai horrek eztabaida sortzen du oraindik.

26 Sarrera 11 Isatsa Espermatozoidearen isatsak egitura konplexua eta espezializatua osatzen du gametoaren mugimendua ahalbidetzeko. Morfologikoki, lau zatitan banatzen da: lepoa, tarteko zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia (Mortimer, 1997): Zelula eukariotikoen flageloetan, mugimendua sortzeko motorra axonema da. Axonemaren egitura espermatozoideen isatsaren zatiki guztietan mantentzen den egitura komuna da, eta mikrotubuluz eta haiei lotutako proteinez osatua dago. Zehazki, tubulinaz eraturiko 9 mikrotubulu bikotek eraztun bat osatzen dute eta, erdian, beste bi mkrotubulu paratzen dira. Mikrotubulu bikoteei lotutako egitura proteiko garrantzitsuenak dineinazko besoak dira. Izan ere, proteina horrek ATPasa jarduera duenez, energia kimikoa energia mekaniko bihurtzen du eta, ondorioz, konformazioaldaketa jasaten du. Beraz, mugimendua mikrotubuluen arteko irristadura bidez gertatzen da, tubulina/dineina motorren funtzionamenduari esker (Marigomez eta Cajaraville, 1999). a) Lepoa: Buruaren eta isatsaren arteko giltzadura da. b) Tarteko zatikia: Axonemaren inguruan, 9 kanpo-zuntz dentso daude; haien inguruan, mitokondriaz osaturiko geruza; eta, azkenik, dena inguratzen mintz plasmatikoa. Zatiki honetan sortzen da gametoaren mugimendurako beharrezkoa den ATPa. d) Zatiki nagusia: Hemen ere, axonema inguratzen duten kanpo-zuntz dentsoak daude, baina 3.a eta 8.a luzetara kokatutako bi zuntzezko mintz-zutabek ordezkatzen dituzte. Bi zutabeak elkarri lotuak agertzen dira. Azkenik, dena inguratzen duen mintz plasmatikoa dago. Zatiki honetan ere ATPa sortzen da. e) Bukaerako zatikia: Axonema eta haren inguruan, mintz plasmatikoa dago.

27 12 Sarrera 1.2.3) Espermatozoideen heltzea Espermatogenesia bukatu ostean, espermatozoideak tubulu seminiferoko argiunera askatzen dira (espermiazioa). Espermatozoide askeak, obozitoa ernaltzeko gai izateko, lehen aipatutako aldaketa morfologikoaz gain, aldaketa fisiologiko eta biokimiko sakonak ere jasan behar izango ditu. Aldaketa horiei guztiei espermatozoidearen heltzeprozesu deritze (Yanagimachi, 1994). Beraz, mugimendu peristaltikoen bidez, espermatozoideak sare testikularra igaro ostean, hoditxo eferenteetatik epididimora igarotzen dira; han, heltze-prozesuak jarraitzen du. Alde batetik, epididimoaren burutik isatserainoko bidean, espermatozoideek mugikortasuna bereganatzen dute (zitosoleko camp eta ATParen igoerarekin loturiko prozesua) eta epididimoaren isats horretan metatzen dira. Bestalde, bide osoan zehar, espermatozoideek zenbait molekula trukatzen dituzte ingurunearekin (gluzido, proteina eta lipido ugari mintzetik erauzi, eraldatu edota bereganatu egiten dira) (Yanagimachi, 1994). Heltze-prozesuaren helburu nagusiak, beraz, mugikortasuna lortzea eta obozitoa ezagutu eta berarekin fusionatzeko beharrezkoak diren konposatuak lortzea dira (Gatti eta lank., 2004). Hala ere, lehen aipatu dugunez, ernalketarako gaitasun osoa emakumezkoen ugaltze-aparatuan bukatzen da, kapazitazioarekin eta erreakzio akrosomikoarekin (Sadler, 2004) ) Espermatozoideen isurtzea Espermatozoideak, kanporatuak izan arte, hodi deferentean eta haren anpuluan denbora luzean metatu daitezke. Gizonezkoaren kitzikatze eta erekzioarekin batera, emisio deituriko prozesua hasten da. Prozesu horretan, espermatozoideak likido seminala osatzen duten zenbait jariakinekin elkartzen dira. Uretra, haziarekin betetzean, zentzumen-seinaleak sortzen dira eta hazia isurtzen da. Isurtzen den hazia osagai zelularrek (espermatozoideek) eta osagai jariatuek (likido seminalak) osatzen dute. Likido seminala espermatozoideak emearen ugaltze-aparatuan barrena garraiatzeaz arduratzen da, baina, gainera haren osagaiek badituzte beste zeregin asko ere: ATPa ekoizteko substratu energetikoak (fruktosa...) gehitzen ditu. Isuritako haziaren koagulazioa gertatzen da (fibrinogeno eta semenogelinaren bidez), hasiera batean haziak

28 Sarrera 13 baginatik alde egin ez dezan eta baginaren alde sakonetan (umetoki-lepoaren aldean) manten dadin. Koagulua minutuan disolbatzen da (fibrinolisinari esker), eta, horregatik, espermatozoideen mugikortasuna areagotzen da. Likido seminalean dauden faktore inhibitzaileei esker, geldotu egiten da espermatozoideen jarduera (kapazitazioa eta erreakzio akrosomikoa saihestuz), eta, modu horretan, beren bideragarritasuna mantentzen da. Haziaren ph-a 7,2 eta 7,8 artean egon ohi da, eta horrek espermatozoideen mugikortasunean laguntzen du. Gizon emankor batek 2-6 ml hazi isurtzen ditu, eta hazi horrek milioi espermatozoide ditu mililitroko (Guyton eta Hall, 1997).

29

30 Sarrera ERNALKETA Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko loturari ernalketa deritzo. Prozesu hori umetoki-tronparen anpuluan gertatzen da. Beraz, ernalketa gertatzeko, espermatozoideek emearen umetoki-tronpara heldu behar dute eta obuluak obariotik askatu eta umetoki-tronpara iritsi behar du (Mortimer, 1997). 2.1 Espermatozoide eta obozitoen garraioa Espermatozoideei dagokienez, lehenik eta behin, isuritako hazia baginara heltzen da. Likido seminalaren babesagatik, espermatozoideek baginako ph azidoa jasan dezakete. Espermatozoideak likido seminaletik askatzen dira, eta umetoki-lepoaren hodira garraiatuak dira. Lepoko mukosak lagunduta, espermatozoideak umetokira igarotzen dira, eta, handik, umetokiko tronpara (Fallopioren tronpa) heltzen dira. Baginan, umetokian eta umetokiaren eta tronparen arteko loturako bidean, espermatozoideen galera handia gertatzen da, eta baginara askatutako espermatozoideen % 1 soilik heltzen da tronpara. Umetoki-tronparen istmora ailegatzean, espermatozoideek mugikortasuna murrizten dute; leku horretan amaitzen da espermatozoideen migrazioa obulazioa gertatu arte (Sadler, 2004) (5. irudia). Obozitoari dagokionez, oso ondo erregulatuta dagoen obulazioa gertatu eta gero, obozitoa, kumulu ooforoko zelulez inguratua, obulutegitik askatzen da eta, zerrenda obarikoen mugimenduak lagunduta, umetoki-tronparen anpulura heltzen da. Aipatutako obulazio-prozesua gertatzen denean, agian kumulu ooforoko zelulek askatutako substantzia kimioerakarleek eraginda, istmoan zeuden espermatozoideen mugikortasuna berriro aktibatzen da eta umetoki-tronparen istmotik anpulura igeri egiten dute (Sadler, 2004). Mugimenduaren hiperaktibazio hori, espermatozoideek ernaltzeko gaitasuna bereganatzeko jasaten duten kapazitazioa eta ondoriozko erreakzio akrosomikoaren hasiera da (Bedford, 1983) (5. irudia).

31 16 Sarrera Anpulua Istmoa Ernalketa Obozitoa Umetoki-tronpa Obarioa 5. irudia. Espermatozoide eta obozitoen garraioaren eskema umetoki-tronpan. Espermatozoideak umetoki-tronparen istmora ailegatzean, mugikortasuna txikitzen dute. Obulazioa gertatzean, obozitoa umetoki-tronpara kanporatzen da eta espermatozoideak hiperaktibatzen dira. Ernalketa, anpuluan gertatzen da. Azalpen zabaldua testuan (Schuel, tik moldatua). 2.2 Espermatozoideen kapazitazioa Espermatozoideek ernalketaren azkeneko pausoak aurrera eramateko emearen ugaltzeaparatuan jasaten duten aldaketa multzoari kapazitazio deritzo (Sadler, 2004). Aldaketa horiek espermatozoideak likido seminaletik askatzen direnean eta emearen ugaltzeaparatuko likidoekin harremanetan jartzen direnean hasten dira. Zehazki, umetokitronpako likidoek espermatozoideen jardueraren inhibizioa eragiten zuten faktoreak (proteina, glukoproteina, lipido...) kentzen dituztenean (Mortimer, 1997). Esate baterako, espermatozoidearen mintzetik kolesterola erauzten da, eta, horren ondorioz, espermatozoidearen buruaren mintz plasmatikoa desegonkortu egiten da (Cross, 1996). Mintzaren jariakortasun-aldaketa horrek bikarbonatoa eta kaltzioaren sarrera eta beste ioien irteera eragiten du, besteak beste, eta espermatozoideen metabolismoaren aldaketa dakar (Flesch eta Gadella, 2000). Kapazitazioa prozesu itzulezina da.

32 Sarrera Espermatozoideen akrosomaren erreakzioa Espermatozoideen kapazitazioa gertatzen denean, akrosomaren kanpo-mintza eta espermatozoidearen buruko mintz plasmatikoa fusionatzen dira (Flesch eta Gadella, 2000). Horrek (1) akrosomako entzimen askapen txikia ekarriko du eta koroa erradiatuko zelularteko bidea irekiko dio espermatozoideei. Espermatozoideak mintz peluzidora lotzean (ZP3 proteinari esker), (2) akrosomaren kanpo-mintza erabat disolbatzen da; akrosoma barruko entzima guztien exozitosia gertatzen da, eta mintz peluzidoa digeritzen da (Guyton eta Hall, 1997) (6. irudia). Umetoki-tronparen inguruneko substantziek bideratutako kapazitazioa eta erreakzio akrosomikoa leku eta une zehatzean gertatzen ez badira, espermatozoideek ez dute ernaltzeko gaitasunik izango (Harrison, 1996). 6. irudia. Erreakzio akrosomikoa eta ernalketa (espermatozoide eta obuluaren loturaren xehetasuna). Espermatozoideen kapazitazioa gertatzen denean akrosoma barruko entzimek (1) granulosako zelulak eta (2) mintz peluzidoa digerituko dute eta (3) espermatozoidea eta obozitoaren arteko mintzen fusioa gertatzen da. (irudia The McGraw-Hill Companies egindakotik moldatua dago). 2.4 Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko lotura Koroa erradiatuko zelulak eta mintz peluzidoa zeharkatzea lortzen duen espermatozoidea obozitoaren mintz plasmatikoarekin (oolema) kontaktuan jartzen da, eta (3) bi zelulen arteko mintzen fusioa gertatzen da (6. irudia). Espermatozoide horren material genetikoa obozitoaren barnean sartuta, ernalketa gauzatzen da. Sortutako

33 18 Sarrera zigotoa aktibatu egiten da (agian, espermatozoideak eramandako faktoreek eraginda) eta haren segmentazioa hasten da. 3 egunetan blastomeraz osatutako morula umetokitronpatik umetokira garraiatuko da, eta, blastozisto-egoeran dagoenean, umetokian ezarriko da. Hortik aurrera, enbrioia garatuko da (Sadler, 2004). (7. irudia). Anpulua Istmoa Umetoki-tronpa Obarioa irudia. Giza garapenaren lehenengo asteko gertaerak. 1) Obulazio osteko obozitoa. 2) Ernalketa, obulaziotik ordu beranduago. 3) Zigotoa, DNAren bikoizketa unea. 4) 2 zelulaaldia (30 orduko adina). 5) 4 zelula-aldia (40 orduko adina). 6) 8 zelula-aldia. 7) Morula, zelula-aldia (3 eguneko adina). 8) Morula berantiarra, umetokira heltzean (4 eguneko adina). 9) Blastozisto goiztiarra (4 egun eta erdiko adina), mintz peluzidoa desagertu da. 10) Ezarpen fase goiztiarra (6 eguneko adina). (Salder, 2004; Schuel, 2006-tik moldatua).

34 Sarrera ESPERMATOZOIDEEN MUGIKORTASUNA Orain arte, gizonezkoen gametoetatik abiatuz, ugaltze-fisiologia aztertu dugu. Zehazki, gameto arren sorrera (gametogenesia), egitura, heltzea, isurtzea, emearen ugaltzetraktuan zeharreko garraioa eta ernalketa-prozesuak azaldu ditugu. Jakin behar da ezen, gizonezkoak, ugalkorra izateko, aurrean aipatutako prozesu horiek guztiak era egokian egiteko gai izan behar duela; zeren eta gizonezkoari ernalketa gertatu arteko prozesuren batek huts egiten badio, ugalkortasun-gaitasuna murriztua edukiko du. Beraz, ugalkortasunik ezaren ikerketa egitean, ernalketa gauzatzeko beharrezkoa den edozein prozesu fisiologiko edota biokimikoren erregulazioa aztertzen da, eta, behin erregulazioa ulertuta, gai izango gara ugalkortasunik ezaren zergatiak errazago ulertzeko. Gizonezkoen ugalkortasuna aztertzeko, arruntki onartzen da prozesu fisiologiko garrantzitsuenetariko bat espermatozoideen mugikortasuna dela. Hori horrela da, batez ere, espermatozoideen mugikortasun urriak edo mugikortasunik ezak, ia beti, ugalkortasunik eza dakarrelako (Turner 2006). Baina espermatozoideen mugikortasun urriari loturiko ugalkortasunik ezaren erantzulea emea zein arra izan daiteke, hau da, arazoa espermatozoidean (osagai maskulinoa), espermatozoideak zeharkatu behar duen emearen ugaltze-traktuan (osagai femeninoa) edo bietan egon daiteke. 3.1 Espermatozoideen mugikortasunaren azterketa molekularra Espermatozoideak, mugitzeko, flageloaren mugimenduez baliatzen dira. Flageloaren mugimenduaren oinarrian dauden erreakzio kimikoak ugariak izan arren, laburki baino ez ditugu azalduko. Espermatozoidearen isatsaren egitura aztertu dugunean, aipatu dugu flageloen mugimendua axonemak sorturiko astinduran datzala; axonemaren mikrotubuluen

35 20 Sarrera arteko irristaduran, hain zuzen ere (Marigomez eta Cajaraville, 1999). Axoneman, 250 bat proteina daude, hala nola proteina zitoeskeletikoak (tubulina...), proteina motorrak (dineina...), proteina txaperonak, kaltzioa lotzen duten proteinak eta proteina kinasak zein fosfatasak... (Inaba, 2003). Axonemaren dineina-besoei ATPa lotzean, dineinaren ATPasa aktibatzen da, eta, ATParen hidrolisiagatik, dineiak konformazio-aldaketa jasaten du eta ondoz ondoko mikrotubuluen gainean mugitzen da. Baina axonemaren dineina molekula guztiak ez dira batera aktibatzen; oinaldeko molekulak aktibatzen dira lehenik, eta aktibazio hori hedatu egiten da pixkanaka axonemaren puntarantz, proteinaz proteina motako elkarrekintzen bitartez. (Marigomez eta Cajaraville, 1999; Turner, 2006). Espermatozoideek, tarteko zatikiaren mitokondrietan gertatzen den fosforilazio oxidatiboak eraginda, ATPa eskuratzen dute. Baina, isatsean zehar, mitokondriarik ez dagoen tarteetan, ATPa lortzeko, oso garrantzitsua da batez ere zatiki nagusiaren zuntzezko mintzetan gertatzen den glikolisia (Turner, 2006). Espermatozoideen mugikortasuna erregulatzeko seinaleztatze-biderik garrantzitsuenak camp/pka eta kaltzioari loturikoak dira (Yanagimachi 1994, Ho 2002, Turner 2006). Kaltzio ioia kanpotik zelulara barneratzean edota espermatozoideak barneko kaltziobiltegia hustutzean: (1) kaltzioak, kalmodulinara (CaM) lotzean, kalmodulina kinasa (CaMK) aktibatzen du eta, ondorioz, mugikortasuna aktibatzen da (Ignotz Suarez 2005; Turner, 2006); (2) bestalde, kaltzioak ezohiko adenilato ziklasa disolbagarria (sac) aktibatzen du (bikarbonatoak ere eragin berdina du) eta sac-k AMP ziklikoa (camp) sortzen du. (3) ATPtik sortzen den campk, camparen menpeko proteina kinasa (PKA) aktibatuko du eta, ondorioz, PKAk eta berak aktibatutako tirosina kinasak flageloaren proteinak (dineinak,...) fosforilatuko dituzte, eta mugimendua sorraraziko dute (Tash 1989; Turner, 2006) (8. irudia). Kaltzioa edota bikarbonatoak sorturiko seinaleztatze-bide horretaz gain, espermatozoideen ph-an gertatutako aldaketek, GTPa lotzen duen proteina eraentzaile (G proteina; ingelesezko GTP binding regulatory protein) txikiek edota heterotrimerikoez gidaturiko seinaleztatzeak ere zerikusia dute mugikortasunaren erregulazioan (Yanagimachi 1994, Wang 2003, Turner, 2006). Hala ere, mekanismo horiek ez dira oraindik oso ondo ezagutzen.

36 Sarrera 21 Mintzean zeharreko kanala (1) (2) (2) (3) Barne erreserbak Ser/Thr fosfatasak Tyrosina kinasa Tyrosina fosfatasak Mugikortasuna Mugikortasuna 8. irudia. Ugaztunen espermatozoideen mugikortasunaren erregulazioan parte hartzen duten hainbat seinaleztatze-bideen eskema. 1) CaM menpeko bidea. 2) sac menpeko bidea. 3) camp/pka bidezko seinaleztatzea. Azalpena testuan. (Turner, 2006-tik moldatua). 3.2 Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa Espermatozoideek, zeharkatzen duten ingurunearen arabera eta behar funtzionalen arabera, mugikortasun-patroi desberdinak dituzte. Hala, plasma seminalean dauden espermatozoide isuri berrien ibilbide lerrozuzenak, emearen lepoko mukosara heltzean, fisiologikoki aurkeztuko lituzketen ibilbide lerrozuzen berdinak dira. Espermatozoideek, plasma seminaletik askatzean eta emearen ugaltze-traktutik gora abiatzean, mugikortasun-ezaugarriak aldatzen dituzte. Lehen aipatu dugun bezala, umetoki-tronparen istmoan, espermatozoideen mugikortasuna motelduz doa eta, kapazitazioa gertatzearekin batera, flageloaren uhin-luzera berriz handitzen da; ondorioz, buruaren albo-desplazamendu handiko ibilbideak sortzen hasten dira (Álvarez C, 2003; Mack eta lank., 1988; Roberson eta lank., 1988). Azkenean, uhinaren anplitudea asimetriko bihurtzen da, eta mugimendu ez-progresibo eta indartsua sumatzen da; horri espermatozoidearen hiperaktibazio deritzo (Álvarez C, 2003; Burkman, 1984). Espermatozoideen ernaltzeko gaitasuna lortzea eta mugikortasuna garatzea modu paraleloan gertatzen direnez, mugikortasuna erabili izan da espermatozoide-populazio batek ernaltzeko duen gaitasuna zeharka neurtzeko (Álvarez C, 2003; Holland-Moritz eta Krause 1992).

37 22 Sarrera Mugikortasuna kontuan harturik, Osasunerako Munduko Erakundeak lau taldetan sailkatu zituen espermatozoideak (WHO, 1999): - a motako mugikortasuna: higidura progresiboa (lerrozuzena) eta azkarra duten espermatozoideak. - b motako mugikortasuna: higidura ez-progresiboa (sigi-sagakoa) edota motelegia duten espermatozoideak. - c motako mugikortasuna: tokitik mugitzen ez diren edota ibilbide zirkular hertsia duten espermatozoide mugikorrak. - d motako mugikortasuna: mugimendurik ez duten espermatozoideak (geldiak). Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa egitean, mugikortasun hitzak bi kontzeptu adierazten ditu: alde batetik, espermatozoidearen mugikortasun lerrozuzen aktiboa [adibidez, gizonezkoen espermatozoideen batez besteko abiadura-lerro zuzena segundoko 25 µm-koa da 37 ºC-an, eta tenperaturaren arabera aldatzen da (Kraemer eta lank., 1998)]; bestetik, espermatozoide mugikorren portzentaje totala [adibidez, Osasunerako Munduko Erakundearen arabera, hazi-lagina normaltzat hartzeko, espermatozoideen % 25ek baino gehiagok a motako mugikortasuna izan behar dute edo, gutxienez, espermatozoideen % 50ek a+b mugikortasuna izan behar dute (WHO, 1999)]. Diagnostikoa egiteko, mugikortasun-parametroaren erabilera handituz joan den heinean, espermatozoideen abiadura eta espermatozoide mugikorren portzentajeaz gainera, espermatozoideen ibilbideak edo mugimendu motak aztertzeko tresnak sortu dira (Álvarez C, 2003). Hala, gaur egun, mikroskopioei loturiko neurketa-sistema automatikoen bidez (CASA; ingelesezko computer assisted sperm analysis), espermatozoidearen buruak bi planoetan egiten duen denboran zeharreko higidura azter dezakegu. Aztertzen diren parametro nagusiak abiadura eta ibilbidea adierazten dutenak dira (Mortimer, 2000): a) Abiadura-parametroak: VCL = abiadura lerromakurra (µm/s) VSL = abiadura lerrozuzena (µm/s) VAP = batez besteko ibilbidearen abiadura (µm/s)

38 Sarrera 23 b) Ibilbide-parametroak (abiaduren konparaketaz lortuak): LIN = linealtasuna (VSL/VCL) X 100 (%) STR = zuzentasuna (VSL/VAP) X 100 (%) WOB = oszilazioa (VAP/VCL) X 100 (%) d) Bestelako parametroak: ALH = buruaren albo-desplazamenduaren anplitudea (µm) BCF = zeharkatze-maiztasuna (Hz) Bukatzeko, aipatu behar da Osasunerako Munduko Erakundeak espermatozoideen mugikortasuna, kontzentrazioa eta morfologia irizpidetzat hartuta eratu zuela haziaren patologien terminologia (WHO, 1999): - Normozoospermia: eiakulatu normala, lehen aipatutako erreferentzia-balioa betetzean. - Oligozoospermia: Espermatozoideen kontzentrazioa erreferentzia-balioa baino txikiagoa denean. - Astenozoospermia: Espermatozoideen mugikortasuna erreferentzia-balioak baino txikiagoak direnean. - Teratozoospermia: Espermatozoide (morfologikoki) normalen kopurua erreferentziabalioa baino urriagoa denean. - Nekrozoospermia: Espermatozoide bizien kopurua % 50 baino baxuagoa denean. - Azoospermia: Espermatozoiderik ez eiakulatuan. - Aspermia: Eiakulaturik ez.

39

40 Sarrera SEINALEEN TRANSDUKZIO-BIDEAK GIZA ESPERMATOZOIDEETAN Gure gorputzeko organo eta ehunen integrazio funtzionalean, ezinbestekoa da zelulazelularen eta zelula-ingurunearen arteko komunikazio-sistema egokia izatea. Zenbait zelula (zelula miokardikoak) komunikazio elektriko zuzenaz komunikatzen dira euren artean. Hala ere, komunikabiderik hedatuenek oinarri kimikoa dute; adibidez, nerbiosistemaren sinapsietako neurotransmisoreak, sistema endokrinoaren hormonak edota sistema immunearean bitartekari kimikoak. Komunikazio kimikoan parte hartzen duten substantzia motak asko dira eta izaera kimiko desberdina dute (lipidoak, aminoazido eraldatuak,...). Substantzia kimikoek seinale zehatzak eragiten dituzte zelulan eta, modulaturiko transdukzio-bidearen arabera, zelula-barneko eraldaketa zehatza gertatzen da. Gorputzean gertatzen den seinaleztatze modu hori ugaltze-sisteman ere gertatzen da (Guyton eta Hall, 1997). Lehenago aztertu dugun bezala, espermatozoideen sorrera-prozesutik obozitoa ernaldu arte, espermatozoideek zenbait ingurune zeharkatu behar dituzte. Zehazki, espermatozoideentzat duten garrantzi fisiologikoagatik, ingurune horietako aipagarrienak dira tubulu seminiferoak (espermatogenesia han gertatzen delako), epididimoa (heltze-prozesua han gertatzen delako), likido seminala (jardueraren inhibitzailea eta bideragarritasunaren erantzulea delako) eta umetoki-tronpa (kapazitazioa, hiperaktibazioa, erreakzio akrosomikoa eta gametoen mintzen fusioa han gertatzen direlako). Espermatogenesia burutu ahal izateko, gameto arraren eta ingurunearen arteko elkarrekintzak gertatzen dira; era berean, espermatozoideen heltzeprozesua aurrera joateko, espermatozoideen eta gizonezkoaren ugaltze-traktuko ingurunearen arteko elkarrekintzak gertatzen dira. Hazi-isurtzearekin, espermatozoideak emearen ugaltze-traktura heltzen dira, eta likido seminaletik askatzen dira. Hortik aurrera, espermatozoide horien funtzioak, emearen ugaltze-traktuko ingurunearekin dituzten elkarrekintzek erregulatzen dituzte. Emearen ugaltze-traktuan, konposizio biokimiko desberdineko inguruneak zeharkatzean, lehen aipatu ditugun elkarrekintzei esker, espermatozoideen mintz eta zelula barruko transformazioa gertatzen da. Eraldaketa horiek ahalbidetuko dute, hain zuzen, ingurune bakoitzean dauden eragile fisiologikoei erantzuteko gaitasuna bereganatzea. Modu horretan, ernalketarako

41 26 Sarrera beharrezkoak diren prozesuak (kapazitazioa, hiperaktibazioa, erreakzio akrosomikoa,...), bata bestearen ondorio gisa (modu sekuentzialean) gertatzen dira. Hala ere, elkarrekintza eta aldaketa horiek oso ondo erregulatuak egon behar dute, zeren eta, aipatutako gertaerak leku desegokian eta une desegokian gertatzen badira, murriztu egingo baita ugaltzeko gaitasuna. Laburtuz, ernalketa gauzatzeko, espermatozoideetan gertatu behar duten aldaketa eta prozesu horiek guztiak (mugikortasuna barne), zelulen arteko eta zelularen eta ingurunearen arteko seinaleen transdukzio-sistemek erregulatuko dituzte (Baldi eta lank., 2002). Badakigu zelula somatikoetan dauden seinaleztatze-bide asko, nukleoaren jarduera eragiten duten bideak izan ezik, espermatozoideetan ere agertzen direla. Izan ere, azken urteetan asko ikertu dira espermatozoideen mintz plasmatikoari loturiko hartzaileek gidaturiko transdukzio-bideak. Eta, zehatzago adierazita, deskribatu da nerbio-sisteman oso sakon ikertutako komunikazio zelularreko sistema askok espermatozoidearen kapazitazioan, erreakzio akrosomikoan, mugikortasunean, arnasketan edota kimiotaxian eragiten dutela (Meizel, 2004; Schuel eta Burkman; 2005). Alde horretatik, hainbat ornogabe eta ugaztunen espermatozoideek hormona, neurotransmisore eta neuromoduladoreak lotzen dituzten hartzaileak espresatzen dituzte; substantzia horien artean, serotonina eta katekolaminak (Meizel eta Turner, 1983; Nelson eta Cariello, 1989; Bandivdekar eta lank., 1991), adenosina eta ATPa (Minelli eta lank., 1995; Fraser eta Adeoya-Osiguwa, 1999; Meizel, 2004), azetilkolina (Baccetti eta lank., 1995), prostaglandina eta leukotrienoak (Basuray eta lank., 1990; Schaefer eta lak., 1998), gonadotropinak, progesterona, estrogenoak eta androgenoak (Luconi eta lank., 1998; Lee eta lank., 2000; Solakidi eta lank., 2005), glizina (Meizel eta Son, 2005), tazikininak (Ravina eta lank., 2007) eta beste substantzia batzuk daude (berrikuspenerako, Meizel, 2004; Naz eta Sellamuthu, 2006).

42 Sarrera SISTEMA OPIOIDEA ETA KANNABINOIDEA Opioideak eta kannabinoideak bi droga-talde psikoaktiboak dira. Opioideak peptidoak dira, eta kannabinoideak lipidoak dira, baina profil farmakologiko antzekoa dute. Fisiologikoki, biek eragiten dute analgesia, katalepsia, hipotermia, depresio motorra, hipotentsioa, immunosupresioa, sedazioa eta beste hainbat efektu. Zelulan, substantzia bakoitzak hartzaile desberdinak aktibatzen ditu, baina opioide-hartzaileak zein kannabinoide-hartzaileak G proteinei lotuta daude, zehazki Gi/Go motako G proteinei lotuak daude. Hartzaile horien aktibazioak, oro har, adenilato ziklasaren (AC) jarduera eta tentsioaren mendeko kaltzio-kanalak inhibitu, potasio-kanalak aktibatu eta MAP kinasen transdukzio-bidea estimulatzen du (Viganó eta lank., 2004). Azkenaldian, opioide eta kannabinoideen arteko modulazio gurutzatua gertatzen dela proposatu da. Orain arte lortu diren emaitzetan oinarrituta, modulazio gurutzatu hori azaltzeko, hipotesi bat baino gehiago proposatu da; kannabinoideek peptido opioideak askatzea edo alderantziz (Corchero eta lank., 1999), kannabinoideek opioide-hartzaileak espresatzea edo alderantziz (Börner eta lank., 2006), hartzail ako edota transdukzio-bideen elkarrekintzak (Shapira eta lank., 2000) eta abar (berrikuspenerako, Viganó eta lank., 2004; Fattore eta lank., 2005), baina oraindik ikerketa gehiago behar dira hipotesietatik teorietara pasatzeko. 5.1 Sistema opioidea Opioa lo-belarraren (Papaver Somniferum L.) fruituetatik ateratako erretxina da, eta haren ondorioen arduradun nagusia morfina da (Lorenzo eta lank., 1999). Opioaren eragin psikoaktiboak direla eta, beste edozein narkotiko baino gehiago erabili izan da, alkohola alde batera utzita. Izan ere, opioak beti izan du toki gailena medikuntzan, eta, gutxienez azken 4000 urteotan, terapeutikan ugari erabili da (Snyder, 1993). Opioaren osagai aktiboak isolatzerakoan hasi ziren opiazeoen eragin kimikoak zientifikoki ulertzen. 1805ean, Friedrich Sertürner izeneko kimikari alemaniar batek lo-belarretik morfina hutsa lortu zuen, eta substantzia hori morphium izenaz bataiatu zuen, Morfeo edo loaren jainko grekoaren oroimenez. Oro har, lo-belar landare batek eman dezakeen opio gordin kantitatea 5-10 gramokoa da. Opioaren % substantzia inaktiboak dira, eta beste % substantzia aktiboek osatzen dute. Garrantzitsuenak morfina (% 10),

43 28 Sarrera narkotina (% 6), papaverina (% 1) eta kodeina (% 0,5) dira. Heroina morfinari talde azetilo bi gehituz lorturiko eratorri erdisintetikoa da, eta talde azetilo horiei esker, lipodisolbagarritasun handia du. Horren ondorioz, ehunetara errazago heltzen da, eta sortutako efektuak morfinak sortutakoak baino biziagoak dira. Opioideak peptidoak dira, eta peptido horien hartzaileak, estekatzaileekiko duten itxurazko afinitatearen arabera, hiru mota farmakologikoki desberdinetan sailkatu dira: δ opioide-hartzailea (δ = delta, deferens hitzagatik, saguaren hodi deferentean identifikatu zelako; DOP-R), κ opioide-hartzailea (κ = kappa, ketoziklazozinagatik; KOP-R) eta μ opioide-hartzailea (μ = mu, morfinagatik; MOP-R) (Lord eta lank., 1977). Hartzaile metabotropiko horiek, izatez, monomerikoak dira, mintz plasmatikoa zeharkatzen duten 7 α-helizez eratuta daude, eta gai dira Gi/o proteinetara lotzeko (Picatoste eta lank., 1996). Hartzaile horien artean, aminoazido-sekuentzien antzekotasuna oso handia da [% 60 orotara eta % mintzean zeharreko aldeetan (Minami eta Satoh, 1995)]. Azken hamarkadan, opioide-hartzaileekin antzekotasun handia duen nozizeptina lotzen duen opioide-hartzailea (nozizptina dinorfinaren antzeko peptidoa da; NOP-R) deskribatu izan da (Wick eta lank., 1994; Mollereau eta lank., 1994). Opioide-hartzaileak izaki bizidun ornogabeetan zein ornodunetan espresatzen dira (Waldhoer eta lank., 2004) δ opioide-hartzailea Gizakiaren nerbio-sistema zentralari dagokionez, δ-hartzaileen dentsitate handia ikus daiteke kortexean eta kaudatu-putamenean (Pilapil eta lank., 1987). δ-hartzailearen mrna, kortexean, kaudatu-putamenean, hipokanpoan eta amigdalan banatzen da (Simonin eta lank., 1994). δ-hartzaileak, batez ere, axoietan kokatzen dira; beraz, ziur aski gune presinaptikoan funtzionatzen dute gehienetan (Elde eta lank., 1995). Ehun periferikoetan, δ-hartzailea, besteak beste, linfozitoetan (Sharp eta lank., 1998), hestean eta guruin adrenalean (Wittert eta lank., 1996) espresatzen da κ opioide-hartzailea Nerbio-sistema zentralean, κ opioide-hartzaileak kortexean, amigdalan eta klaustroan ikus daitezke (Pilapil eta lank., 1987). κ-mrna, besteak beste, kortexean, talamoan,

44 Sarrera 29 hipotalamoan, gorputz ildaskatuan eta accumbens nukleoan agertzen da (Peckys eta Landwehrmeyer, 1999). κ-hartzaileak dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira gehienbat, eta, ziur aski, postsinaptikoki funtzionatzen dute (Elde eta lank., 1995). Ehun periferikoei dagokienez, κ-hartzailea hestean (Wittert eta lank., 1995) eta, batez ere, zelula immuneetan agertzen da (Rivière, 2004) μ opioide-hartzailea Nerbio-sistema zentralari dagokionez, δ-hartzaile eta μ-hartzaileen mrnaren banaketa nahiko antzekoa den arren, badira ezberdintasunak. Kortexean, δ-mrnaren maila handia da; μ-mrnaren maila, ostera, nahiko eskasa da (klase bietako hartzaileak ugariak izan arren). Talamoan eta hipotalamoan, berriz, δ-mrna gutxi (baita δ- hartzaileak ere) eta μ-mrna ugari agertzen da. Gorputz ildaskatuan (kaudatuputamenean) eta accumbens nukleoan, mrna eta hartzaile mota biak azaltzen diren arren, δ-mrna lausotuago banatzen da (Mansour eta lank., 1994). μ-hartzaileak dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira gehienbat, eta, ziur aski, postsinaptikoki funtzionatzen dute (Elde eta lank., 1995). μ-hartzailea ehun periferikoetan ere deskribatu da, besteak beste, arratoiaren hodi deferentean (Lemaire eta lank., 1978), barean, guruin adrenalean eta giltzurrunean (Wittert eta lank., 1995) eta saguaren hestean (Pol eta lank., 2001) Barne-sistema opioidea Opioide-hartzaileek, haien barne-estekatzaileek (barne-peptido opioideak; BPO) eta sintesi- eta andeakuntza-prozesuetan parte hartzen duten molekulek barne-sistema opioidea eratzen dute. Nerbio-sistema zentralean ezagutzen diren peptido guztiak (karnosina dipeptidoa eta glutation tripeptidoa izan ezik) gorputz neuronaleko erribosometan (erretikulu endoplasmiko bikortsuan), molekula aitzindari peptidiko handi edo pre-pro-proteina moduan sintetizatzen dira (Siegel eta lank., 1993). Metalo-endopeptidasa batek hidrolizatu ondoren, pro-proteina moduan garraiatzen dira Golgi aparatura; handik, pikor batzuetan, axoian zehar amaiera presinaptikoraino heltzen dira. Bide horretan

45 30 Sarrera zehar, hidrolisi eta aldaketa berri batzuk jasaten dituzte, peptido aktibo bihurtu arte. Neurona peptidergikoa kitzikatzean, mintz presinaptikoaren despolarizazioa gertatzen da, eta, ondorioz, tentsioaren menpeko kaltzio-kanalak zabalduko dira eta ioi horren kontzentrazio zelularra igoko da (Thorn eta lank., 1978). Modu horretan, neuropeptidoz beterik dauden besikulak, exozitosi bidez, gune sinaptikora askatzen dira. Barne-sistema opioidearen kasuan, opioide-hartzaileak aurkitu ondoren, haien barneko estekatzaileak eta horien aitzindariak sortzen dituzten hiru geneak identifikatu ziren: a) Proentzefalina (PE) (Comb eta lank., 1982); nerbio-sistema zentralean eta muin adrenalean sintetizatzen da. Tripsina, endopeptidasa eta N-karboxipeptidasa motako entzimen eraginez, 243 aminoazidoko proteina horretatik, zazpi peptido opioide sor daitezke. Garrantzitsuenak bost aminoazidoz eratutako entzefalinak (met- edo leuentzefalina) dira. Pentapeptido horien sintesiaren arduraduna garunean isolatutako entzefalina konbertasa izeneko karboxipeptidasa bat da (Hughes, 1983). b) Prodinorfinak (PD) (Kakidani eta lank., 1982); besteak beste, dinorfina A (1-17), dinorfina B (1-13) eta β-neo-endorfina sortzen ditu. d) Proopiomelanokortina (POMC) (Nakanishi eta lank., 1979); aitzindari honek barne-opioideak ez diren peptidoak ere gordetzen ditu. Izan ere, β-endorfina peptido opioideaz gainera, hormona adrenikortikotropikoa (ACTH), α eta β-lipotropina (LPH), α eta β-melanotropina (MSH), eta beste zenbait peptidoren aitzindaria da. Molekula horiek sintetizatzen dituen entzima POMC entzima bihurtzailea da (Turner eta lank., 1987). Gaur egun, 20 barne-peptido opioide ezagutzen dira eta 5-32 aminoazido arteko luzera izan dezakete. Guztien ezaugarri komuna amino muturretik karboxi muturrera errepikatutako aminoazido-sekuentzia da ( Tyr-Gly-Gly-Phe-Met edo Tyr-Gly-Gly- Phe-Leu ), Met eta Leu-entzefalina alegia. Salbuespenak nozizeptina eta endomorfina dira; azkenak 4 aminoazido baino ez ditu. Ugaztunen peptido opioide naturalak Metentzefalina, Leu-entzefalina, β-endorfina, Dinorfina A, Dinorfina B, α-neoendorfina, Nozizeptina eta Endomorfina dira (Florez, 1998).

46 Sarrera 31 Oro har, entzefalinak δ-hartzailearen lotugai natural gisa ezagutzen dira, baina μ- hartzaileei ere lotzen zaizkie. Dinorfinak κ-hartzaileari lotzen zaizkio, eta β-endorfinak μ-hartzailea eta baita δ-hartzailea ere ia afinitate berez ezagut ditzake (Roques, 1999). 1. taulan, peptido opioideek hartzaile bakoitzekiko dituzten afinitateak azaltzen dira. 1. taula. Estekatzaile opioideen afinitate-profilak, binding esperimentu bidez lortuak. Estekatzailea Barne-opioideak Ki (nm) δ κ µ Erreferentzia [Met 5 ]-entzefalina 0, ,5 Leslie, 1987 [Leu 5 ]-entzefalina Chang eta lank., 1981 Dinorfina A (1-17) 3,2 0,12 0,7 Leslie, 1987 Dinorfina B (1-8) 4,4 9 3,4 Leslie, 1987 β-endorfina 2, Leslie, 1987 α-neoendorfina 0,57 0,20 1,3 Leslie, 1987 Endomorfina >500 >500 0,67 Goldberg eta lank., 1998 Opioide sintetikoak DPDPE 1,4 19 (Kd) >10000 >3000 (Kd) Hunter eta lank., 1990 Fukuda eta lank., 1995 Naltrindol 0,13 >5000 >10000 Fang eta lank., 1994 U50, , Leslie, 1987 Nor-binaltorfimina 10,2 0,038 16,7 Metcalf eta Coop, 2005 Morfina* > (Kd) 163-1,4 23 (Kd) Satoh eta Minami, 1995 Fukuda eta lank., 1995 Naloxona 27 17,2 1,78 Leslie, 1987 *Morfina ez da gizakion barne-opioidea ezta opioide sintetikoa ere, izan ere, lo-belarraren erretxinatik eratorritako alkaloide opioidea da. Peptido opioideen inaktibazioa, batez ere, peptidasa izeneko entzimek buruturiko andeakuntza metabolikoaren bitartez gertatzen da. Biologikoki aktiboak diren peptidoak apurtzean, zatiki inaktiboak sortzen dira (Iversen, 1987). Entzefalinaren (BPO ia guztien sekuentzia errepikakorra) andeakuntza, bi entzimak katalizatzen dute batez ere: alanina aminopeptidasa N (APN), entzefalinaren Tyr-Gly lotura apurtzen duena (Waksman eta lank., 1985), eta endopeptidasa neutroa (NEP), entzefalinaren Gly-Phe lotura apurtzen duena (Relton eta lank., 1983). Andeakuntza horien bidez, entzefalinaren jarduera erregula daiteke.

47 32 Sarrera Opioide-hartzaileen aktibazioa Opioide-hartzaileen moten artean, mintzean zeharreko domeinu eta zelula barnean geratzen diren bukleen homologia handia izan arren (% eta % , hurrenez hurren), N- zein C- muturren eta zelulaz kanpoko 2. eta 3. bukleen homologia txikia da (% 9-10, % eta % 14-20, hurrenez hurren) (Chen eta lank., 1993). Beraz, erraz uler daiteke hartzaile moten arteko homologia txikiko leku horiek peptido desberdinen ezagupenean inplikaturik egongo direla (Jordan eta Devi, 1998) (10.A irudia). Bideratutako aminoazidoen mutagenesiaren bidez jakin izan da ezen, δ-hartzaileetan hondar baten (Lys108) ordezkapena egiten bada, µ-agonista espezifikoak, δ-hartzaile mutatu horietara lot daitezkeela (Minami eta lank., 1996). Era berean, hiru opioidehartzaileetan serina-hondar bat ordezkatzean (Ser177 δ-n, Ser187 κ-n eta Ser196 µ-n), naloxona antagonista ez-espezifikoak agonista gisa jokatzen du (Claude eta lank., 1996). Mintzean zeharreko hirugarren domeinu zitoplasmatikoa, 2. eta 3. barne-bukleak eta C- muturreko zatiren bat G proteina heterotrimerikora lotzen dira Seinaleztatzea opioide-hartzaileen bidez Opioide-hartzaileak nagusiki G proteina inhibitzaileetara elkartzen dira. Agonistek G proteina horiek aktibatzean, oro har, AC entzimaren inhibizioa gertatzen da eta, horren ondorioz, camparen kontzentrazio-mailak txikitzen dira eta PKAren aktibazioa murrizten da. Horrek, neuronetan, zelula barneko eta nukleoko proteina askoren fosforilazio-egoeran eragingo du; ondorioz, badirudi transkripzio-prozesu askoren aldaketak gerta daitezkeela, eta, epe batean, opiazeoekiko tolerantziaren edota abstinentzia-sindromearen prozesuen errudun bihurtzen dira (Lorenzo eta lank., 1999). Nerbio-ehunari dagokionez, opioideek sorturiko erantzuna, maiz, (1) aktibitate bioelektrikoaren inhibizioa eta (2) neurotransmisoreen askapenaren inhibizioa da. Erantzun molekularrari dagokionez, μ- eta δ-hartzaileen aktibazioak mintzaren hiperpolarizazioa eta jarduera bioelektriko neuronalaren inhibizioa dakar, era zuzenean

48 Sarrera 33 potasio-kanalen irekiera gertatzen delako (ioi horren konduktantzia igoz) edota agonistak, zelula barneko kaltzioa askatzen duelako eta ioi horrek, zeharka, potasio kanalen irekiera eragiten duelako (Williams eta lank., 1982). Bestalde, κ-hartzailearen aktibazioak tentsioaren menpeko kaltzio-kanalen inaktibazioa ekar dezake; horren ondorioz, kaltzioa neurona barnera sartzea ekiditen da eta neurotransmisoreen askapenaren inhibizioa gertatzen da (Surprenant eta lank., 1990; Lorenzo eta lank., 1999). Dena den, deskribatu da opioide-hartzaileak AC aktibatzen duten G proteinetara (Gs) ere elkartu daitezkeela (Crain eta Shen, 1990, Ammer eta Schulz, 1997). Azpimarratzekoa da δ- eta µ-agonisten kontzentrazio txikiek (nm) bide estimulatzailea indartzen dutela eta kontzentrazio handiagoetan (µm) bide inhibitzailea aktibatzen dela (Fields eta Sarne, 1997) Opioide-hartzaileen ekintza fisiologikoak Opioide-hartzaileak aktibitate fisiologiko askoren modulazioarekin erlazionatu dira. Oro har, peptido opioideak edo alkaloide opiazeoak morfina, adibidez nerbio-sistema zentralean edo nerbio-sistema periferikoan sartzean sortzen den ekintza-espektroa antzekoa da. Hala ere, eragin horien intentsitatea ezberdina da eratorri opioide motaren eta aktibatutako hartzailearen arabera (2. taula). 2. Taula. Opiazeoen ekintzak eta hartzaileak. (Flórez, 1998). Ekintza Hartzaileak Ekintza Hartzaileak Minaren inhibizioa μ, δ, κ Diuresia Arnas depresioa μ, δ Inhibizioa μ Menpekotasun psikikoa μ > κ Aktibazioa κ Menpekotasun fisikoa μ > κ; δ? Bradikardia μ > δ = κ Tolerantzia μ, δ, κ Hipotentsioa δ = κ > μ Euforia eta sedazioa μ Akzio endokrinologikoak Disforia κ PRL askatzea μ Miosia μ, κ GHa askatzea δ > μ Gihar-zurruntasuna μ ACTHa askatzea μ, κ Mugikortasun gastrointestinala μ, δ? ADHa inhibitzea κ Puxikaren mugikortasuna μ LHa inhibitzea μ, δ

49 34 Sarrera Sistema opioidearen inplikazioa ugalkortasunean Peptido opioideek, zenbait lekutan arituz, ugaltze-sisteman eragiten dute (Fabri eta lank., 1989). Peptido opioideek, nerbio-sistema zentralaren bidez, jokabide sexuala inhibitzeaz gainera, ugaltze-funtzioa ere inhibitzen dute, alde batetik, hipotalamoko GnRHaren jariapena ekidinez, hipofisiko hormona gonadotropikoen jariapena inhibitzen dutelako (Kalra eta lank., 1988), eta, bestetik, guruin pituitarioa bera zuzenean inhibitzen dutelako. Ehun periferikoetan, lyeding zelulek sortutako β- endorfinek tubulu seminiferoen funtzioa inhibitzen dute (Fabri eta lank., 1989). Horretaz gainera, substantzia opioide exogenoen kontsumoak (heroina, metadona) emakumezkoetan amenorrea eragiteaz gainera (Santen eta lank., 1975), kalteak sortzen ditu hazi-parametroetan eta, bereziki, espermatozoideen mugikortasunean (Cicero eta lank., 1975; Ragni eta lank., 1985). Beraz, ikertzen hasi ziren ea opioideek espermatzoideetan nerbio-sistema zentralaren bidez edota ehun periferikoen bidez zeharka eragiteaz gainera zuzeneko efektua ere ba ote zuten. Alde horretatik, badakigu peptido opioideak ugaltze-egituretan daudela hala nola lyeding zeluletan, epididimoan eta prostatan (Gerendai, 1991). Bestalde, likido seminalean ere, hainbat peptido opioideren kontzentrazio handiak deskribatu dira: esate baterako, β-endorfina (Fraioli eta lank., 1984; Davidson eta lank., 1989), metentzefalina (Sastry eta lank., 1982; Fujisawa eta lank., 1996) eta leu-entzefalina (Sastry eta lank., 1982). Izan ere, peptido horien kontzentrazioa handiagoa da plasma seminalean, plasma periferikoan baino. Azkenik, espermatozoideetan ere, askotariko peptido opioideak topatu dira, hala nola β-endorfina, met-entzefalina, leu-entzefalina (Sastry eta lank., 1982; Foresta eta lank., 1986) eta proentzefalinatik eratorritako produktuak (Kew eta lank., 1990). Ugaltze-sisteman, δ-, κ- eta µ-hartzaileen mrnak arratoien testikuluetako Sertoli eta Leydig zeluletan eta espermatogenesiko zenbait zelula motatan deskribatu dira (Fabbri eta lank., 1985; Wittert eta lank., 1996; Jenab eta Morris, 2000). Horretaz gainera, bi arrain motaren espermatozoidetan ere, hiru opioide-hartzaileen lokalizazioa deskribatu da (Aiudi eta lank., 2004), eta zaldien espermatozoideetan µ-hartzailearen presentzia ikusi da (Albrizio eta lank., 2005). Datu horiekin guztiekin, pentsatzekoa da espermatozoideen gaineko opioideen efektu zuzena gerta zitekeela.

50 Sarrera 35 Hala, opioideen kontzentrazio desberdineko inguruneak erabilita, frogatu da opioide horiek espermatozoideen mugikortasunean eragiten dutela; opiazeo-drogazaleetan gertatzen zen bezala, alegia. Dena den, peptido motaren, kontzentrazioaren eta inkubazio-denboraren arabera, efektu bat baino gehiago deskribatu dira: Alde batetik, leu-entzefalina, edo met-entzefalinaren D-ala 2 -Mephe 4 -Met-(O)-OIenkephalin (DAMME) analogoa erabiltzean, mugikortasunaren inhibizioa ikusi da (Sastry eta lank., 1991; Foresta eta lank., 1985); met-entzefalina erabiltzean, berriz, ez da efekturik ikusi edo mugimendua mantentzen duela deskribatu da (Fraioli eta lank., 1984; Fujisawa eta lank., 1996). Bestetik, lan batzuetan β-endorfina erabiltzean dosiaren menpeko mugikortasunaren inhibizioa ikusi arren, peptido hori naloxonarekin batera inkubatzean, bi efektu kontrajarri deskribatu dira; mugikortasunaren inhibizioa ez ekiditea eta ekiditea (Fraioli eta lank. 1984; Mari eta lank., 2005). Dena den, badirudi β-endorfinaren kontzentrazioa ez dela adierazle ona gizonezko ez-ugalkor eta ugalkorren artean desberdintzeko (El- Haggar eta lank., 2006). Azkenik, deskribatu da naloxona antagonistaren kontzentrazio baxuak mugikortasuna mantentzen laguntzen duela (Albrizio eta lank., 2005; Mari eta lank., 2005) baina kontzentrazio handiagoak mugikortasuna murriztu (Albrizio eta lank., 2005) edo areagotu egin dezakeela denboran zehar (Sastry eta lank., 1991). Gauza azpimarragarria da hazi astenozoospermikoan topatutako met-entzefalina eta β- endorfinaren kantitatea normozoospermikoan topatutakoa baino txikiagoa dela (Fujisawa eta lank., 1996; El-Haggar eta lank., 2006). Barne-sistema opioidea osatzeko, entzima degradatzaileen eginkizunari buruz hitz egitea falta zaigu. Entzimen-jarduerari dagokionez, APNa espermatozoideetan, likido seminalean eta prostasometan agertzen da; NEPa, berriz, soilik prostasometan. Gainera, bestelako ehunetan baino jarduera handiagoa ikusi da (Fernandez eta lank., 2002). Datu horiek entzimen kokalekuaren deskribapenarekin bat datoz, nahiz eta NEPa, modu ahulean, espermatozoideetan ere ikusi den (Subiran eta lank., 2008). APNa eta NEPa inhibitzean, espermatozoideen mugikortasuna mantentzen da denboran zehar, eta efektu

51 36 Sarrera hori naloxonak ekiditen du (Subiran eta lank., 2008). Bestalde, astenozoospermikoek, normozoospermikoekin alderatuta, APN-jarduera txikiagoa dute (Irazusta eta lank., 2004). Mugikortasunaz aparteko faktoreak aztertuz, proentzefalinatik eratorritako peptidoak akrosoman mantentzen dira eta, erreakzio akrosmikoa gertatzean, ingurunera askatzen dira; horren ondorioz, ernaltze-prozesuan nolabaiteko garrantzia izan dezakeela proposatu da (Kew eta lank., 1990). Bukatzeko, naloxona antagonistaren kontzentrazio baxuak kapazitazioa areagotzen du (Albrizio eta lank., 2005). Argi geratzen da, beraz, peptido opioideen efektu oso kontrajarriak deskribatu direla eta asko geratzen dela argitzeko. Gainera, oso ikerketa gutxi egin dira giza hazia erabilita, eta orain arte ez da deskribatu opioide-hartzaileen presentzia giza espermatozoideetan. 5.2 Sistema kannabinoidea Kannabinoideak kalamu landareak (Cannabis sativa L.) sintetizatutako metabolito sekundarioen multzo gisa definitzen dira. Efektu bioaktiboen arduradun nagusia Δ9- tetrahydrokannabinola (THC) da. Kalamua, azken milurtekoetan medikuntzan, helburu espiritualekin edota dibertimendurako erabili izan da. Marihuanaren osagai aktiboak isolatutakoan hasi zen zientifikoki ulertzen kannabinoideen eragin kimikoa. Dena den, bestelako sendabelarrekin alderatuta, kannabinoideen purifikazioa berandu gertatu zen, konposatu horien izaera lipofilikoa dela eta. 1940ko hamarkadan lortu zen lehenengo kannabinoide purua (Todd, 1946); geroago, 1960ko hamarkadan, THCa purifikatu eta egitura deskribatu zen (Gaoni eta Mechoulan, 1964). THCa kannabinoide indartsuena eta ugariena da, baina marihuanak dibenzopiranetik eratorritako 70 konposatu inguru ditu. Garrantzitsuenak Δ9-tetrahydrokannabibarina (THCaren efektua antagonizatzen duena), kannabidiola (CBD) eta kannabinola (CBN) dira (Elsohly eta Slade, 2005). Esan bezala, marihuanatik eratorritako kannabinoideek izaera oso lipofilikoa dute. Ezaugarri horregatik, hasiera batean, bestelako konposatu ez-hidrodisolbagarrien (anestesikoak, disolbatzaileak...) moduan jokatzen zutela pentsatu zen, hau da, efektua mintz zelularren jariakortasunean eragindako aldaketengatik sortzen zela (Lawrence eta Gill, 1975).

52 Sarrera 37 Hipotesi hori bertan behera geratu zen 1990eko hamarkadan, estekatzaile kannabinoideekiko afinitatea zuten mintz-hartzaileak deskribatu zirenean (Matsuda eta lank. 1990, Munro eta lank, 1993). Gaur egun arte, egitura heptahelikoidala eta Gi/o proteinei lotutako bi kannabinoide-hartzaile mota klonatu dira. Hartzaile mota biek sekuentzien antzekotasun handia erakusten dute [% 44 orotara eta % 68 mintzean zeharreko aldeetan (Munro eta lank, 1993)]. Dena den, aurrerago ikusiko dugun bezala, adierazpen-eredu oso desberdina dute. Bestalde, aipatzekoa da kannabinoide-hartzaileak izaki bizidun ornogabeetan zein ornodunetan espresatzen direla (McPartland, 2004, Begg eta lank., 2005) CB 1 kannabinoide-hartzailea CB 1 -a oso kontserbatua agertzen da espezie batzuetan. Esate baterako, arratoiaren eta gizakiaren CB 1 hartzailearen aminoazidoen % 98an antzekotasuna dago. Banaketari dagokionez, animalia helduan, batez ere, nerbio-sistema zentralean aurkitzen da eta dentsitate handia du hipokanpoan, zerebeloan, amigdalan edo garun-enborrean. Garuneko zelula mota guztiek [neuronak (Herkenham eta lank., 1990), astrozitoak (Sanchez eta lank., 1998), oligodendrozitoak (Molina-Holgado eta lank., 2002) eta mikrogliak (Cabral eta lank., 2001)], CB 1 hartzailea espresatzen dute. Bestalde, CB 1 -a ehun periferikoetan ere espresatzen da, hala nola bare, birika, hezur-muin, amigdala, bihotz, prostata, umetoki, obario (Galiegue eta lank., 1995), heste (Di Carlo eta Izzo, 2003), ehun adiposo (Cota eta lank., 2003), erretina (Buckley eta lank., 1998), gibel (Osei-Hyiaman eta lank., 2005) eta endotelio baskularrean (Liu eta lank., 2000). Arratoi-enbrioiaren garapenean, CB 1 hartzaile funtzionala ernaldiaren 11. eta 14. egunaren artean agertzen da, gainerako neurotransmisoreen espresioarekin batera (Pertwee, 2005a). Badirudi fase goiztiarretan aktibatzearen arrazoiak gene garrantzitsuen indukzioa, metabolismo energetikoaren aktibazioa, azido arakidonikoaren mobilizazioa eta nerbio-garapena direla (Ramos eta lank, 2002). Kannabinoide-hartzaileen espresioari buruzko informazioa giza enbrioiaren garapenean oso mugatua da, eta soilik dakigu hartzaile funtzionalak haurdunaldiaren 19. astean agertzen direla (Mato eta lank 2003).

53 38 Sarrera CB 2 kannabinoide-hartzailea Gaur egun, informazio gutxiago dugu CB 2 -ari buruz CB 1 -ari buruz baino. Espezie batetik bestera, CB 2 -a ez da CB 1 -a bezain ondo kontserbatu [arratoiaren eta gizakiaren arteko antzekotasuna % 81 da (Munro eta lank., 1993, Shire eta lank., 1996)] eta banaketa oso desberdina dauka. Nerbio-sistema zentralari dagokionez, CB 2 -a, zelula mikroglialetan (Nunez eta lank., 2004), garunaren hainbat neurona-azpipopulaziotan (Skaper eta lank., 1996, Ashton eta lank., 2006) eta garun-enborrean espresatzen da (Van Sickle eta lank., 2005, Ashton eta lank., 2006). Ehun periferikoetan, CB 2 -a batez ere barean, amigdaletan, B eta T zeluletan, monozitoetan, zelula dendritikoetan (Galiegue eta lank., 1995, Schatz eta lank., 1997), erretinan (Croxford eta Yamamura, 2005) eta endotelio baskularrean (Blazquez eta lank., 2003, Golech eta lank., 2004) kokatzen da. Zelula immuneen aktibazioak, mikroglialak barne, CB 2 -aren espresiomaila areagotzen du (Kaminski eta lank., 1992, Croxford eta Yamamura, 2005) Barne-sistema kannabinoidea Kannabinoide-hartzaileek, haien barne-estekatzaileek (endokannabinoideak) eta sintesi-, andeakuntza- eta rekaptazio-prozesuetan parte hartzen duten molekulek barne-sistema kannabinoidea eratzen dute. Endokannabinoideak kate luzeko gantz-azido poliasegabeen eratorriak dira (nagusiki, azido arakidonikoa) eta talde polar batekin amida edo ester lotura sortzen dute. Endokannabinoideen artean, N- arakidonoiletanolamina [anandamida, AEA (Devane eta lank., 1992)] eta 2- arakidonoilglizerola [2-AG (Mechoulam eta lank., 1995)] azpimarratzekoak dira. Bi konposatu horiek, CB 1 zein CB 2 hartzaileetara lotzeko gaitasuna dute. 3. taulan, konposatu kannabinoideek hartzaile bakoitzarekiko dituzten afinitateak azaltzen dira. Kaltzioaren menpeko bi entzimaren ekintzagatik sintetizatzen da AEA. Hasiera batean, N-aziltransferasa (NAT) batek hondar arakidonilo bat transferitzen dio fosfatidiletanolaminaren NH 2 taldeari (Sugiura eta lank., 1996), eta N- arakidonoilfosfatidiletanolamina (NAPE) sortzen da. Gero, fosfolipasa D (PLD) batek, AEA eta azido fosfatidikoa askatuko ditu (Di Marzo eta lank., 1994), nahiz eta azken erreakzio hori eztabaidagarria den (Leung eta lank., 2006). Estimulu baten erantzun gisa, zitoplasman kaltzioa metatzen denean, endokannabinoideak sintetizatzeko makineria aktibatzen da eta konposatu horien sorkuntza areagotzen da. Behin lipido

54 Sarrera 39 horiek sortuta, zelulatik kanpora garraiatuak izaten dira, agian proteina garraiatzaile baten bidez (Wang eta lank., 2006), eta bi bide har ditzakete: (1) hartzaile espezifikoetara lotu edo (2) birkaptatuak eta andeatuak izan. Endokannabinoideen andeakuntza, bi entzimak katalizatzen dute, batez ere: gantz-azidoen amida hidrolasa (FAAH), AEArentzat (Giang eta Cravatt, 1997, Cravatt eta lank., 2001) eta monoazilglizerollipasa (MGL), 2-AGarentzat (Dinh eta lank., 2002). Kannabinoideen kanporatzea eta birkaptazioari buruzko gaia eztabaidagarria da, zeren eta, oraindik, molekula horientzako proteina garraiatzailerik ez baita klonatu, eta balizko proteina horren existentzia nola gabezia babesten duten datuak argitaratu dira (Beltramo eta lank., 1997, Hillard eta lank., 1997, Glaser eta lank., 2003, Hillard y Jarrahian, 2003). 3. taula. Estekatzaile kannabinoideen afinitate-profilak binding esperimentu bidez lortuak. Estekatzailea Ki (nm) CB 1 CB 2 Erreferentzia Barne-kannabinoideak AEA 78 >500 Pertwee, 2005a 2-AG Pertwee, 2005a Kannabinoide sintetikoak ACEA 1,4 >2.000 Howlett eta lank., 2002 SR141716a 11, Howlett eta lank., 2002 JWH ,8 Howlett eta lank., 2002 SR > ,6 Howlett eta lank., 2002 Kannabinoide klasikoak Δ 9 -THC 80,3 32,2 Howlett eta lank., Kannabinoide-hartzaileen aktibazioa Estekatzaile kannabinoideak hartzaileetara lotzeko modua oso gai interesgarria da, agonista eta antagonista berrien diseinuan lagundu dezakeelako. Gaur arte ditugun datuen arabera, kannabinoideak mintz lipidikoan sartu eta, albo-difusioari esker, hartzaileetara lotuko lirateke (Makriyannis eta lank., 2005) (10.B irudia). Badirudi prozesu horrentzako faktore garrantzitsuenetariko bat estekatzaile kannabinergikoen talde polarren kokalekua dela. Izan ere, talde horietan gertatutako leku-aldaketek aldatu egin ditzakete estekatzaileek mintz lipidikoan duten konformazioa, kokapena eta orientazioa, eta, modu horretan, aktibitate biologikoa modula daiteke (berrikuspenerako,

55 40 Sarrera Makriyannis eta lank., 2005). Kannabinoide-hartzaileen jarduerari dagokionez, badirudi hartzaileak ez daudela egoera basal ez-aktiboan. Izan ere, CB 1 antagonistak, SR141716ak (Pertwee, 2005b) eta AM251-ak, eta CB 2 antagonistak, SR ak eta AM630-ak gai dira agonista kannabinoideek sortutakoen alderantzizko efektu kannabinomimetikoak sortzeko (berrikuspenerako, Pertwee, 2005a). Eta antagonista horien efektu batzuk, tonu endokannabinoidearen blokeoagatik sor daitezkeen arren, badirudi beste efektu batzuek ez dutela zerikusirik blokeo horrekin. Hipotesirik onartuenak dio kannabinoide-hartzaileak konformazio (aktibazio-egoera) desberdinetan A Glikozilazioak Zelula kanpoaldea NH 2 B Talde polarra CB OP Talde polarrak CB CB Difusio laterala Zelula barnealdea COOH 10. irudia: Opioideak eta kannabinoideak hartzaileetara lotzeko proposatutako ereduak. A) Peptido opioideen lotunea opioide-hartzailearen mintzaren zeharreko domeinuek, N-muturrak eta bestelako kanpo-bukleek eratzen dute. B) Estekatzaile kannabinoidea mintz plasmatikoan barneratzen da eta albo-difusioaz proteina heptahelikoidalera lotzen da. Irudian agertu ez arren, kannabinoide-hartzaileak ere glikosila daitezke N- muturrean. OP: Opioide; CB: Kannabinoide. (Carracedo, 2006b-tik moldatua). egon daitezkeela: (1) hartzaileak aktibatuak egongo liratekeen ON egoera bat (efektoreei akoplatuak), eta (2) hartzaileak ez-akoplatuak egongo liratekeen OFF egoera bat edo gehiago. Hala, agonistek ON egoerako hartzaileen kopurua handituko lukete, alderantzizko agonistek OFF egoerakoak areagotuko lituzkete eta antagonista neutroek konformazio bakoitzaren proportzioa mantenduko lukete (berrikuspenerako, Pertwee, 2005b). Azkenik, kannabinoideen hainbat efektu ez dira CB 1 edo CB 2 -aren aktibazioari lotu eta, horregatik, kannabinoideetarako afinitatea duten bestelako hartzaile batzuen existentzia proposatu da: (1) Vanilloide-hartzaileak; kapsaizina (agonista) eta kapsazepina (antagonista) estekatzaile vanilloideak lotzen dituzte, baina AEA bezalako kannabinoideen bidez ere aktiba daitezke (Di Marzo, 1998, Zygmunt eta

56 Sarrera 41 lank., 1999, Begg eta lank., 2005). (2) CB 3 -a; balizko kannabinoide-hartzaile berri bat klonatu da, GPR55 hartzaile umezurtza (Baker eta lank., 2006) Seinaleztatzea kannabinoide-hartzaileen bidez Kannabinoide-hartzaileak, nagusiki, G proteina inhibitzaileetara elkartzen dira. G proteina horien aktibazioak αi eta βγ azpiunitateen banaketa dakar. αi azpiunitateak AC inhibitzen du, eta campren ekoizpena txikitzen. Horren ondorioz, PKAren aktibazioa ere murrizten da. Bestalde, βγ dimeroak seinaleztatze-bide desberdinak aktiba ditzake, hala nola fosfatidilinositol-3 kinasa (PI3K)-Akt eta mitogenoek aktibaturiko kinasak (MAPK) p38 MAPK eta Jun N-bukaera kinasa (JNK) (Liu eta lank., 2000, Rueda eta lank., 2000, Herrera eta lank., 2005). Dena den, deskribatu da kannabinoide-hartzaileak AC aktibatzen duten G proteinetara (Gs) ere elkartu daitezkeela (adibidez, Gq eta G13) (Bonhaus eta lank., 1998, Lauckner eta lank., 2005). Bukatzeko, kannabinoidehartzaileek G proteinetatik independente diren efektuak sor ditzakete, hala nola esfingomielinaren FAN bidezko hidrolisia (Sanchez eta lank., 2001) edo zenbait kanal ionikoren erregulazioa (berrikuspenerako, Pertwee 2005a) Kannabinoide-hartzaileen ekintza fisiologikoak Sistema kannabinoidearen funtzioak, animalia-ereduetan, in vitro sistemetan eta kannabisaren erabilera ludikoak sortutako efektuetan ikertu dira. Sistema horren paper garrantzitsuenetariko bat neuromodulatzailearena da; izan ere, CB 1 hartzailea G proteinei loturiko hartzailerik ugariena da nerbio-sistema zentralean (Herkenham eta lank., 1990). Sistema kannabinoidearen ekintza, nerbio sistema zentralean eta ehun periferkoan deskribatu da (4. taula) Sistema kannabinoidearen inplikazioa ugalkortasunean Kannabinoideek, leku desberdinetan arituz, ugaltze-sisteman eragiten dute. Kannabinoideek ugaltze-funtzioa inhibitzen dute hipotalamoko GnRHa (Gammon eta lank., 2005) eta hipofisiko prolaktina (PRL) eta hormona luteinizatzaileen (LH) mailak jaitsiz (Vescovi eta lank., 1992; de Miguel eta lank., 1998) eta, ondorioz, Leyding zeluletan sortutako testosterona-maila ere jaisten da (Harclerode, 1984). Baina, badirudi

57 42 Sarrera Leyding zeluletan dauden CB 1 hartzaileen bidez testosteronaren jaitsiera zuzenean gertatzen dela (Wenger eta lank., 2001). Horretaz gainera, substantzia kannabinoide exogenoen kontsumoak (THC), emakumezkoen hilekoan eta haurdunaldian ezegonkortasunak sortzeaz gainera (Smith and Asch, 1987), kalteak sortzen ditu haziparametroetan eta, bereziki, espermatogenesian eta espermatozoideen mugikortasunean (Hembree eta lank., 1976; Hong eta lank., 1982). Beraz, ikertzen hasi ziren ea kannabinoideek espermatozoideetan nerbio-sistema zentralaren bidez edota ehun periferikoen bidez zeharka eragiteaz gainera zuzeneko efektua ere ba ote zuten. 4. taula. Barne-sistema kannabinoidearen ekintza garrantzitsuenak (Carracedo, 2006b). Ehuna Ekintza Nerbio-sistema zentralean Babes neuronala Kontrol motorra Termorregulazioa Oroimenaren modulazioa Nozizepzioa Gosearen kontrola Oka egitearen kontrola Erregulazio neuroendokrinoa Begian Begi-barneko presioaren murrizpena Digestio-sisteman Gosearen kontrola Obesitatearen tratamendua Heste-mugimenduen kontrola Ugaltze-sisteman Ugalkortasunaren kontrola Hezurrean Hezurren berrosatzearen kontrola Sistema immunean Immunomodulazioa Sistema baskularrean Hipotentsioa Alde horretatik, badakigu AEA saguen umetokian eta emakumezkoen umetoki-tronpan (Schmid eta lank., 1997) eta arratoien testikuluetan (Sugiura eta lank., 1996) agertzen dela. Bestalde, giza espermatozoideek zeharkatu behar dituzten likido batzuetan ere AEA deskribatu da, hala nola likido seminalean, umetoki-tronpako likidoan eta likido folikularrean (Schuel eta lank., 2002).

58 Sarrera 43 Ugaltze-sisteman, CB 1 hartzailea prostata (Ruiz-Llorente eta lank., 2003), testikulu (Galiegue eta lank., 1995) eta Lyeding zeluletan (Gye eta lank., 2005) deskribatu da eta CB 2 hartzailea prostata (Sarfaraz eta lank., 2005), testikulu (Brown eta lank., 2002) eta Sertoli zeluletan (Macarrone eta lank., 2003). Espermatozoideetan, CB 1 kannabinoidehartzailearen lehenengo ebidentziak itsas trikuan deskribatu ziren (Chang eta lank., 1993) eta, geroago, giza (Schuel eta lank., 2002; Rossato eta lank., 2005) txerri- (Maccarrone eta lank., 2005), sagu-, arratoi- eta igel-espermatozoideetan (Gye eta lank., 2005; Cobellis eta lank., 2006) deskribatu dira. Datu horiekin guztiekin, pentsatzekoa da gerta daitekeela kannabinoideek zuzeneko efektua eragitea espermatozoideetan. Ildo horretan, kannabinoideek (THC, AM 356), erreakzio akrosomikoaren blokeoaren bidez (Schuel eta lank., 1994), itsas trikuen espermatozoideen ugaltzeko gaitasuna inhibi dezakete (Schuel eta lank., 1991; Berdyshev, 1999). Era berean, AEA barnekannabinoideak espermatozoideen mugikortasuna eta erreakzio akrosomikoa inhibitzen du CB 1 hartzailearen aktibazioaren bidez (Schuel eta lank., 1994; Rossato eta lank., 2005; Macarrone eta lank., 2005; Cobellis eta lank., 2006). Eta deskribatua dago txerriespermatozoideek AEA sintetizatu (NAPE-PLD), lotu (CB 1, TRPV1) eta andeatzeko (FAAH) beharrezkoa den makinaria biokimiko guztia dutela (Maccarrone eta lank., 2005). Bukatzeko, interesgarria da aipatzea ezen saguen enbrioian eta umetoki-tronpan, AEAren sintesi eta andeakuntzagatik, ugaltze-traktuaren zati horretan AEA-tonu desberdinak ezarriko direla. Eta badirudi AEA-tonu hori oso garrantzitsua izan daitekeela espermatozoideek ernaltzeko gaitasuna eskuratzeko eta geroko enbrioia garatzeko (berrikuspenerako, Schuel, 2006; Wang eta lank., 2006). Gaur egun arte, kannabinoideek espermatozoideetan duten eraginaren azterketa, batez ere, CB 1 hartzailean egin da. Aitzitik, nahiz eta autore batzuek ez duten baztertzen CB 2 hartzailea espermatozoideetan egotea (Schuel eta Burkman, 2005; Maccarrone, 2007), hartzaile mota horrek espermatozoideetan duen eraginari buruzko lanik ez da egin oraindik.

59

60 Helburuak

61

62 Helburuak 47 Azkeneko hamarkadetan, zelula-zelula edota zelula-ingurune seinaleen transdukziosistemak ikertzen dituzten laborategi askotan ohartu dira ustez neuronetako espezifikoak ziren mintz-hartzaileak bestelako zelula somatikoetan ere badaudela. Horren ondorioz, hartzaile horientzako estekatzaileak eta ehun bakoitzean dituzten funtzioak deskribatuz joan dira. Ildo horretatik, azkeneko urteetan, ar zein emeen ugaltze-sistemako osagaietan konposatu neuroaktiboak (neurotransmisoreak eta neuromoduladoreak) lotzen dituzten hartzaileen presentzia zabala aurkitzeaz gainera, ikusi da ugalkortasunerako garrantzitsuak diren gertaeretan parte hartzen dutela. Izan ere, ugaltze-aparatuetan, sistema neuronal klasiko batzuk osorik deskribatu dira. Opiazeoak eta kannabinoideak (alkohola alde batera utzita), droga psikoaktibo erabilienetakoak izan dira aspalditik. Barne-sistema opioide eta kannabinoidea deskribatu zirenean eta, beraz, barnetik zein kanpotik eratorritako substantzia horien ekintza modua ulertuz joan zen heinean, aukera asko zabaldu ziren medikuntzaren garapenerako. Hasiera batean, sistema opioide eta kannabinoidearen eragina nerbiosistema zentralean ikertu zen eta, nahiz eta substantzia oso desberdinak izan, duten ekintza-moduagatik eta sortzen duten efektuengatik, bi sistemak erlazionatzeko joera izan da beti. Lehenengo ikerketen arabera sistema neuronaltzat hartuak izan baziren ere, bi sistema horien osagaiak ehun periferikoetan deskribatuz joan dira eta, gaur egun, emakumezko eta gizonezkoen ugaltze-aparatuetan partzialki deskribatuak izan dira. Hala ere, substantzia opioide eta kannabinoideen efektu batzuk deskribatu diren arren, oso informazio gutxi dago opioide-hartzaileek eta kannabinoide-hartzaileek giza espermatozoideetan duten eraginari buruz. Aurrekariak kontuan hartuta eta giza ugalkortasuna hobeto ulertzeko asmoarekin, tesi honetarako, 3 helburu nagusi proposatu ditugu: 1. δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan. 2. CB 1 eta CB 2 kannabinoide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan. 3. Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen aktibazioaren eragina espermatozoideen mugikortasunean.

63

64 Materialak eta Metodoak

65

66 Materialak eta metodoak MATERIALAK Ikerketa honetan, honelako gailuak, erreaktiboak eta soluzioak erabili genituen: 1.1 Gailuak - Abiadura handiko zentrifuga hozgarria. Sorvall RC 28S. - Angelu finkoko Sorvall SM-24 errotorea. - Ultrazentrifuga. Kontron Centrikon T Angelu finkoko Kontron TFT 45.6 errotorea. - Bolumen aldakorreko pipeta automatikoak. Nychiryo. - Espektrofotometroa. Shimadzu UV-2401 PC. - Homogeneizagailua, teflonezko enboloduna. Heidolph. - Inkubagailu lehorra. Hotcold S, 0º-60ºC bero-tartea. Selecta. - Inkubagailu hezea. Unitronic 320 OR. Selecta. - ph-metroak, Micro-pH 2001 eta Micro-pH Crison. - Zehaztasunezko balantza. R180D. Sartorius. - Termoegonkortutako irabiagailu magnetikoa. Agimatic. - Mikroskopio fase-kontrasteduna. Nikon H550S. - Laser-mikroskopio fokukidea. Olympus Fluoview FV Bideokamera. Basler. - Elektroforesi- eta transferentzia-euskarriak. Mini Trans-Blot III. Bio-Rad. - Termozikladorea. Mastercycler. Eppendorf. - RT-PCR sistema Applied Biosystems. - Densitometroa. Molecular Imager GS-800. Bio-Rad. 1.2 Erreaktiboak Opioideak Morfina hidroklorida (Alcaliber S.A.) DPDPE: [D-Pen 2,5 ]-Entzefalina (Sigma-Aldrich) U-50488: 3,4-Dikloro-N-metil-N-[2-(1-pirrolidinil)ziklohexil]benzeneazetamida (Sigma-Aldrich) Naloxona (Sigma-Aldrich) Naltrindola (Sigma-Aldrich) Nor-binaltorfimina (Sigma-Aldrich) Kannabinoideak ACEA: arakidonil-2-kloroetilamida (Tocris Bioscience) JWH-015: (2-Metil-1-propil-1H-indol-3-il)-1-naftalenil-metanona (Sigma-Aldrich) SR141716a: N-piperidino-5-(4-klorofenil)-1-(2,4-diklorofenil)-4-metil-3-pirazolkarboxamida (Manolo Guzman doktoreak utzia, Madrilgo Unibertsitate Konplutentsea, UCM) SR144528: N-[(1S)-endo-1,3,3-trimetil biziklo[2.2.1] heptan-2-il]-5-(4-kloro-3- metilfenil)-1-(4-metilbenzil)-pirazol-3-karboxamida] (Manolo Guzman doktoreak utzia, UCM)

67 52 Materialak eta metodoak Beste erreaktibo batzuk Pisu molekular ezaguneko proteinak (Invitrogen) TRIZOL (Invitrogen) RNasa inhibitzailea (Promega) Transcriptor RT + erreakzio-indargetzailea (Roche) Azarezko hexameroak (Amersham) GoTaq polimerasa + erreakzio-indargetzailea (Promega) Pisu molekular ezaguneko nukleotidoak (Bioline) Nukleotidoentzako karga-indargetzailea (Biolina) Fluoromount G (EMS) Gainerako erreaktiboak (Sigma-Aldrich) 1.3 Soluzioak Tyrode-BSA 100 mm NaCl 21,7 mm sodio-laktato 20 mm Hepes 15 mm NaHCO 3 5 mm glukosa 3 mm KCl 2 mm CaCl 2 1 mm sodio-pirubato 0,4 mm MgSO 4 0,3 mm KH 2 PO µg/ml kanamizina 7 mg/ml BSA (Behi-serum albumina) H 2 O-a bolumena bete arte Prestakin hori 0,22 µm-ko iragazkitik iragazi behar da, eta 7,4 ph-an eta mosm-ean mantendu behar da Tyrode-BSA eraldatu ez-kapazitantea (TBEK) Tyrode-BSA inguruneari, bikarbonatoaren (15 mm NaHCO 3 ) ordez, NaCl hein berean gehitzen zaio osmolaritatea mantentzeko Tyrode eraldatu ez-kapazitantea (TEK) Tyrode inguruneari, bikarbonatoaren (15 mm NaHCO 3 ) eta BSA-ren (7 mg/ml) ordez, NaCl hein berean gehitzen zaio osmolaritatea mantentzeko Fosfato/gatz-indargetzailea (Phosphate buffered saline; PBS) 137 mm NaCl 2,7 mm KCl 1,5 mm KH 2 PO 4 8,1 mm Na 2 HPO 4 H 2 O-a bolumena bete arte

68 Materialak eta metodoak Lisi-indargetzailea PBS % 1 (b/b) Triton X-100 % 1 (b/b) Proteasen inhibitzaileen koktela Tris-HCl 10 mm ph-a:7, ml H 2 O 12,11 g Tris-Base HCl-aren ph-a 7,4-ra heldu arte Tris-HCl / 1M / ph 8,8 Tris 1000 ml H 2 O 121,14 g Tris-Base HCl-aren ph-a 8,8-ra heldu arte Tris-HCl 0,5M ph:6, ml H 2 O 62,07 g Tris-Base HCl-aren ph-a 6,8-ra heldu arte Homogeneizazio-soluzio indargetzailea 10 mm Tris-HCl, ph 7,4 % 1 (b/b) Proteasen inhibitzaileen koktela H 2 O-a bolumena bete arte Bradford erreaktiboa 0,117 mm Coomasie urdin distiratsua % 5 (b/b) Etanola % 15 (p/b) Azido ortofosforikoa H 2 O bolumena bete arte Prestakina nahastu egiten da bi orduz, irabiatuz. Disolbatu ez den koloratzailea erauzteko, disoluzioa birritan iragazten da iragazpaperez Sodio dodezil sulfatoa (SDS) - % ml H 2 O 10 g SDS Persulfato amonikoa - % ml H 2 O 1 g persulfato amoniko

69 54 Materialak eta metodoak Proteinentzako karga-indargetzailea (Laemmli sample buffer) - 5X % 10 (p/b) SDS % 25 (b/b) Tris-HCl 250 mm ph 6,8 % 0,025 (p/b) bromofenol urdin % 50 (b/b) glizerol % 5 β-merkaptoetanol H 2 O-a bolumena bete arte Karga-indargetzaileak 5 aldiz diluitua geratu behar du laginean Gel banatzailea % 30 akrilamida / % 1 bisakrilamida: akrilamida, % 30etik nahi den %-ra eramateko, diluitu egin behar da (adibidez, % 12rako, 2,5 aldiz diluitu). Tris-HCl 1 M ph 8,8: % 25 (bol) % 10 SDS: % 1 (bol) H 2 O-a bolumena bete arte % 10 (p/b) Persulfato amonikoa: 50 µl TEMED: 10 µl Gel kontzentratzailea % 30 akrilamida / % 1 bisakrilamida: akrilamida % 4ra (7,5 aldiz diluitu) Tris-HCl 0.5 M ph 6.8: % 25 (bol) % 10 SDS: % 1 (bol) H 2 O: bolumena bete arte % 10 (p/b) persulfato amonikoa: 25 µl TEMED: 5 µl Elektroforesi-indargetzailea - 10X 250 mm Trizma-Base % 1 (p/b) SDS 2 M Glizina H 2 O-a bolumena bete arte ph 8,3 doitua atera behar da, ez ukitu Erabiltzeko, H 2 O-arekin10 aldiz diluitu behar da Transferentzia-indargetzailea - 10X 250 mm Trizma-Base % 0,25 (p/b) SDS 1,92 M Glizina H 2 O-a bolumena bete arte ph 8,3 doitua atera behar da, ez ukitu Erabiltzeko, H 2 O-arekin 10 aldiz diluitu behar da. Diluitzean, % 20 (b/b) metanol gehitu behar zaio Ponceau gorria % 1 (p/b) Ponceau gorria % 5 (b/b) Azido azetiko glazial H 2 O-a bolumena bete arte

70 Materialak eta metodoak Tris/gatz-indargetzailea (Tris buffered saline; TBS) 50 mm Tris-HCl ph 7,5 150 mm NaCl H 2 O-a bolumena bete arte Blotto soluzioa TBS % 0,1 Triton X Blokeo soluzioa Blotto % 5 esne gaingabetua Luminola (250 mm) 10 ml DMSO 0,44 g luminol Azido p-kumarikoa (90 mm) 10 ml DMSO 0,15 g azido p-kumariko Kimioluminiszentzia-areagotzailea (Enhanced chemiluminesence; ECL) 1,25 mm luminol 0,2 mm azido p-kumariko 0,1 M Tris-HCl ph: 8.5 H 2 O-a bolumena bete arte Nahastura hori 4 ºC-an eta iluntasunean gordetzen da erabilia izan arte. Erabiltzeegunean, iluntasunean gordeta dugun nahasturara % 0,3 (b/b) H 2 O 2 (%30) gehitu behar zaio Tris/azetato indargetazailea + EDTA (TAE) 0,4 M Tris-Base % 5,7 (b/b) Azido azetiko glazial 10 mm EDTA ph Agarosa-gela % 2 agarosa 100 ml TAE (DEPC) Irakiten jarri (1-2 min) % 1 etidio bromuro Gel-euskarrira bota, eta orraziak jarri polimerizatu arte (20 min)

71

72 Materialak eta metodoak METODOAK 2.1 Laginak lortzea Giza haziaren laginak Euskalduna-Bilbao Klinikan jasotzen ziren, Euskalduna-Bilbao Klinikaren Hazi-bankuko Laborategiak eta Lagunduriko Ugalketa Unitateak eta Euskal Herriko Unibertsitateak (UPV/EHU) xedatu zuten hitzarmenari esker. e guztiak (25-40 urte bitartekoak) osasuntsuak eta, Osasunerako Munduko Erakundearen (OME) irizpideen arabera (OMS, 1999), normozoospermikoak ziren. eak ez ziren opio edota kannabinoideen ohiko erabiltzaileak. Ikerketa, lagin biologikoen eta giza laginen erabilera dela eta, UPV/EHUren eta Osakidetzaren Ikerkuntza Klinikoaren Batzorde Etikoaren oniritziaz egin zen. Hazi-laginak masturbazio bidez lortzen ziren 2 edo 3 eguneko abstinentzia eta gero. Ontzi esteriletan isurtzen ziren eta gutxienez 30 minutuan 37 ºC-an mantentzen ziren hazia likidotu arte. Lagin bakoitza prozesatzen hasi baino lehen, hazi-bolumena zein espermatozoideen kontzentrazioa eta mugikortasuna neurtzen ziren. 2.2 Espermatozoideak prestatzea Swim-up Espermatozoide ez-mugikorrak eta hazian egon zitezkeen bestelako zelulak kentzeko, swim-up deritzon teknika aplikatu zitzaien hazi-lagin guztiei (1.A irudia). Klinikatik jasotako hazi berria Eppendorf saio-hodi batzuetan banatzen zen (250 µl eppendorfeko). Haren gainean, Tyrode-BSA eraldatu ez-kapazitantearen (TBEK) (Flesch, 1999) µl emeki gehitu eta 2 fase eratzen ziren. Espermatozoide mugikorrenak hazitik TBEKra mugi zitezen, eppendorf saio-hodiak 60 minutuz 37 ºC-an mantentzen ziren, eta, denbora horren ostean, eppendorf saio-hodi bakoitzaren goiko geruzako (TBEK + espermatozoide mugikorrenak) zati gehiena berreskuratzen zen, eta espermatozoidekontzentrazioa neurtzen zen fase-kontraste bidezko mikroskopioan. Eppendorf saiohodi guztietatik berreskuratutako goiko geruzak 15 ml-ko zentrifuga-saio-hodietan batzen ziren eta 800 g-an zentrifugatzen ziren 10 minutuz. Hauspeakinean agertutako espermatozoide mugikorrak ondoren azalduko diren prozeduretan erabiltzen ziren.

73 58 Materialak eta metodoak Azkenik, espermatozoide ez zen bestelako zelularik ez zegoela baieztatzeko, lagin guztiak fase-kontraste bidezko mikroskopioan aztertzen ziren (1.B irudia). A B Hazi berria (250 µl) TBEK gehitu ( µl) Swim-up 60 min 37 ºC Goiko geruza kendu (espermatozoide mugikorrak) WB Goiko geruza(k) zentrifugatu (800 g / 10 min) TBEK kendu IZK RT-PCR Mugikortasuna 1. irudia: Espermatozoideen prestaketa. A) Espermatozoide mugikorrenak berrezkuratzeko Swim-up teknikaren pausuak. TBEK: Tyrode eraldatu ez-kapazitantea WB: western-blot, IZK: immunozitokimika, RT-PCR: Real-Time Polymerase Chain Reaction. B) Espermatozoidelaginaren purutasunaren azterketa fase-kontraste bidezko mikroskopiopean. Argazkian, espermatozoide ez den bestelako zelularik ez da ikusten. 2.3 Hartzaileen espresio genikoa RNA: erauztea, kalitatea behatzea eta kontzentrazioa neurtzea a) RNA erauztea Swim-up teknikaren bidez isolatutako giza espermatozoide, garun-kortex eta Jurkat zelulak TRIZOL erreaktiboarekin lisatzen ziren. Ehunak mililitro bat TRIZOL -ean eta enbolo txiki batekin homogeneizatzen ziren, eta espermatozoide-zelulak zuzenean pipetarekin homogeneizatzen ziren. Homogeneizatu horren gainean, kloroformoa gehitzen zitzaion (0,2 ml kloroformo : 1 ml TRIZOL ) eta 2-3 minutuan girotenperaturan nahasten zen. Zentrifugazioaz ( g / 10 min / 4 ºC) faseak eratzen ziren; goiko fase gardena RNA zen; interfasea zuria DNA zen; beheko fase arrosa TRIZOL -a zen. Fase gardena berreskuratzen zen (guztia ez, ziurtatzeko hurrengo faseko DNA hartzen ez zela) eta isopropanola (1:1) gehitu eta nahasten zen. 10 minutuan giro tenperaturan mantendu eta gero, zentrifugatu egiten zen ( g / 10 min / 4 ºC). Gainjalkineko

74 Materialak eta metodoak 59 isopropanola kentzen zitzaion hauspeakina hartu gabe eta hauspeakin horren gainean 500 µl etanol (% 70) gehitu eta nahasten ziren. Hurrengo zentrifugazio baten ondoren ( g / 5 min / 4 ºC), etanol guztia kentzen zen hauspeakin gardena kendu gabe (etanol guztia ondo kentzeko, 2-3 minutuan berogailu batean lehortzen zen). Azkenik, lortutako hauspeakina urarekin (10-50 µl-rekin, lagin kantitatearen arabera) homogeneizatzen zen. DNA genomikoaren kutsadura ekidin nahi zenean, DNasa digestio-pausoa zeukan RNeasy Protect Kit (Quiagen) erabili zen fabrikatzailearen argibideak jarraituz. Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 5 espermatozoide-laginen mrna erabili zen. b) RNAren kalitatea behatzea Erauzitako RNAren kalitatea neurtzeko, RNA % 1,5-2 agarosa-gel batean korriarazten zen. Lagineko RNA kalitatekoa izateko, gelean korriaraztean, 28S eta 18S RNA erribosomikoen banda diskretuak eta 2:1 proportzioan agertzea gomendatzen zen. Hala ere, garun-kortex eta Jurkat zelulek baldintza hori bete arren, espermatozoideek 28S eta 18S RNA erribosomikoak galtzen dituzte (2.A irudia) eta, beraz, DNA genomikoaren interferentziarik egongo ez zela ziurtatzeko, RNA-ren erauzketan DNAsa digestiopauso bat egin edota PCRan, exoi desberdinetan kokaturiko primer-ak erabili ziren. c) RNA-ren kontzentrazioa espektrofotometro bidez neurtzea Ur puruarekin, lortutako RNAren 1/20 diluzioa egin eta, nm artean, espektroekorketa egiten zen. Espektrofotometroak ohiko kurba sortu behar zuen (2.B irudia). Kurba horretan, 280 nm-an (proteina) eta 260 nm-an (RNA) absorbantzia-puntu maximoak agertzen ziren. Teorikoki, laginaren purifikazioa ontzat emateko, RNApuntuaren absorbantziak proteina-puntaren bikoitza izan behar zuen. RNArentzat, absorbantzia unitate bat 40 µg/ml direla jakinda, RNA kantitatea (µg/ml) kalkulatzeko, [absorbantzia x diluzio-faktorea x konbertsioa] aplikatzen zen.

75 60 Materialak eta metodoak A B PM Kx / Jr PM Sp 2. irudia: A) Erauzitako RNAren kalitatearen behaketa. PM: nukleotidoen pisu molekularreko standarra; Kx: garun-kortexa; Jr: Jurkat; Sp: espermatozoideak. B) Erauzitako RNA-ren absorbantzia-kurba espektrofotometroaren bidez neurtua. 260 nm-an absorbantzia-puntu maximoa agertzen da; RNAri dagokiona alegia RT-PCR a) Oinarria DNA zati zehatz baten kopia kopuru handia lortzeko, polimerasaren kate-erreakzioa (Polymerase Chain Reaction; PCR) erabiltzen da, oligonukleotido espezifikoak (primerak) erabiliz. Baina RNA mezularien (mrna) azterketa egin nahi bada, lehenik eta behin, DNA osagarria (cdna) eratu behar da alderantzizko transkriptasa baten bidez. Prozesu horri alderantzizko transkripzioa (Retro-Transcription; RT) deritzo. Beraz, lagin bateko mrna guztien cdna eratu eta gero, anplifikatu nahi den genearen sekuentzia-tartea mugatuko duten 2 primer-ak erabiliz, PCRa egingo da. Hori dela eta, teknika osoari RT-PCR deritzo. b) Protokoloa b.1 Alderantzizko transkripzioa (RT) 0,2 ml-ko Eppendorf saio-hodi batean nahasten ziren 1 µg RNA total, 2 µl azarezko hexamero eta ur purua (RNasa-rik gabe) 13 µl arte. Azarezko hexameroak RNAra lotzeko, nahasketa 10 minutuan 65 ºC-an berotzen zen, eta, horren ostean, izotzean

76 Materialak eta metodoak 61 uzten zen minutu batean (RNAren egitura sekundarioak desegiteko). Zentrifuga-pultsu batekin lagina berreskuratzen zen, eta 4 µl Transcriptor RT erreakzio-indargetzaile (8 mm MgCl 2 ), 0,5 µl RNasa inhibitzaile (20 U), 1 µl dntp (deoxirribonukleotido trifosfato) (0,5 mm bakoitzeko) eta 0,35-0,5 µl (7-10 U) alderantzizko transkriptasa (Transcriptor RT) gehitzen zitzaizkion. Bortex-az ondo nahastu eta gero, zentrifugapultsu batekin lagina berreskuratzen zen. Alderantzizko transkripzioa egiteko, lagina 10 minutuan 25 ºC-an, 60 minutuan 55 ºC-an (cdna eratzeko), 5 minutuan 85 ºC-an (RT inhibitzeko) eta, azkenean, izotzean mantentzen zen. Lortutako cdna -20 ºC-an gorde zen erabilia izan arte. (3.A irudia). A B hexameroak cdna 1 + primers + dntp + GoTaq (r) (f) 5 3 mrna cdna + dntp + RT mrna Ziklo 1 = 2 kopia Ziklo 2 = 4 kopia cdna ziklo = kopiak irudia: RT-PCR. A) Alderantzizko transkripzioaren eskema. Azarezko hexameroak mrnara lotzen dira eta RT-ak dntp-ak gehitzen joango da cdna eratuz. B) Polimerasaren kate erreakzioaren eskema. Desnaturalizazioa, hibridazioa (anneling), primer espezifikoak, cdna-ren tarte konkretuetan lotuko dira, katearen hedapena GoTaq DNA polimerasaren bidez. Inkubazio denborak eta tenperaturak testuan azaltzen dira. RT: Retrotranskriptasa, dntp: deoxirribonukleotido trifosfato, cdna: DNA osagarria. b.2 Polimerasaren kate-erreakzioa (PCR ) PCRa egiteko 0,2 ml-ko Eppendorf saio-hodiak erabiltzen ziren. Lagin bakoitzeko, erreakzio-nahastura berdina sortzen zen aurrera (forward; f) eta atzerako (reverse; r) primer-ak (1.taula) izan ezik:

77 62 Materialak eta metodoak 1 µl cdna (< 0,5 µg) 10 µl GoTaq polimerasa erreakzio-indargetzailea (1,5 mm MgCl 2 ) 1 µl dntp (0,2 mm bakoitzeko) 2,5 µl aurrerako primer-a (1 µm) (X. Taula) 2,5 µl atzerako primer-a (1 µm) (X. Taula) 0,25 µl GoTaq polimerasa (1,25 U) 50 µl arte, ura 1. taula. RT-PCR bidez egindako mrnaren analisian erabilitako primer-ak. hdor: giza δ opioide-hartzailea; hkor: giza κ opioide-hartzailea; hmor: giza µ opioide-hartzailea; hcb 1 : giza CB 1 kannabinoide-hartzailea; hcb 2 : giza CB 2 kannabinoide-hartzailea; GAPDH: Glizeraldeido 3-fosfato deshidrogenasa. Genea Sekuentzia (5-3 ) Anplikoia (bp) Erreferentzia hdor (f) ACGTGCTTGTCATGTTCGGCATCGT (r) ATGGTGAGCGTGAAGATGCTGGTGA 222 Börner eta lank., 2004 hkor (f) AGATACACAAAGATGAAGACAGCAACCAAC (r) TCCCTGACTTTGGTGCCTCCAAGGACTATT 352 Neudeck eta lank., 2003 hmor (f) GCAGATGCCTTAGCCACCAGTA (r) GAGGCGCAAGATCATCAGTCCATA 440 Kraus eta lank., 2003 hcb 1 (f) CGTGGGCAGCCTGTTCCTCA (r) CATGCGGGCTTGGTCTGG 408 Carracedo eta lank., 2006a hcb 2 (f) CGCCGGAAGCCCTCATACC (r) CCTCATTCGGGCCATTCCTG 522 Carracedo eta lank., 2006a GAPDH (f) GGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC (r) CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 322 Carracedo eta lank., 2006a Nahastura prest zegoenean, lagin bakoitza termozikladorean sartzen zen, eta, PCRa gauzatzeko, denbora-tarte, tenperatura eta ziklo egokiak ezartzen ziren (2.taula). Hasiera batean, lagina (cdna) desnaturalizatu behar zen. Gero, primer-ak eta DNA polimerasa cdnara lotzeko, tenperatura jaisten zen (tenperatura hori enpirikoki topatu behar zen) eta, behin hibridazioa emanda, tenperatuta igotzen zen DNA polimerasak lan egin ahal izateko. Prozesu hori behin eta berriz errepikatuz, cdnaren tarte espezifikoaren anplifikazio esponentziala gertatzen zen (3.B irudia). Anplifikatutako laginak nukleotidoentzako karga-indargetzailearekin nahasten ziren, eta etidio bromurodun agarosa-geleko kaleetan kargatzen ziren. Geleko kale batean, nukleotidoen pisu molekularreko estandarra kargatzen zen. Gela, 15 V-eko korrontearekin korriarazten zen, eta argi ultramorearen pean argazkia ateratzen zen. Bukatzeko, argazkiaz baliatuz, lagin bakoitzean lortutako anplikoiak (anplifikatutako zatia) sortzen zuen banda pisu molekularreko estandarrarekin alderatzen zen. Espero

78 Materialak eta metodoak 63 ziren base pareak lortzen baziren, lagin horretan hartzailearen mrnaren presentzia ondorioztatzen zen. 2. taula. PCRaren ezaugarriak. Prozesua Denbora Tenperatuta Ziklo zk. Hasierako desnaturalizazioa 2 95 ºC 1 Desnaturalizazioa ºC Hibridazioa (anneling) ºC 40 Katearen hedapena 1 72 ºC Azken hedapena 5 72 ºC 1 Mantenua - 4 ºC Hartzaileen proteinen presentzia Espermatozoideen mintzak prestatzea Swim-up teknikatik eratorritako espermatozoideei lisi-indargetzailea gehitzen zitzaien, eta, ordu batean kulunkatu ondoren, izotzean lisatzen ziren. Denbora hori igarota, % 40ko anplitudera sonikatzen ziren (0,5 segundoko 10 ziklo) eta lortutako homogeneizatuak 600 g-ra zentrifugatzen ziren, 10 minutuan eta 4 ºC-an. Lortutako hauspeakina (apurtu ez ziren zelulak eta nukleoak) kendu eta gainjalkina g-an ultrazentrifugatzen zen, 45 minutuan eta 4 ºC-an. Azkeneko zentrifugaziotik eratorritako hauspeakina (mintz zelularrak), immunoblota egiteko, -80 ºC-ra gordetzen zen (4. irudia). Zentrifugatu 600 g / 10 min / 4 ºC Ultrazentrifugatu g / 45 min / 4 ºC Lisi-bufferra gehitu Kulunka 60 min / 4 ºC Sonikatu Gainjalkina Mintz zelularrak 4. irudia: Espermatozoideen mintzen prestaketaren eskema pausoz pauso. Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 5 espermatozoide-laginen proteinak erabili ziren Garun-kortexeko zelulen eta Jurkat zelulen mintzak prestatzea Giza garunaren kortex prefrontalaren materia grisa homogeneizazio-soluzio indargetzailean homogeneizatu zen tefloizko enboloa zuen homogeneizagailu mekaniko

79 64 Materialak eta metodoak baten bidez, minutuko 800 birako abiaduran, gutxienez minutu batean eta 4 ºC-an. Jurkat zelulek prozesamendu berdina jasan zuten. Homogeneizatuak g-an zentrifugatu ziren, 5 minutuan eta 4 ºC-an. Lortutako hauspeakina (apurtu ez ziren zelulak eta nukleoak) kendu eta gainjalkina g-ra ultrazentrifugatu zen, 35 minutuan eta 4ºC-an (5. irudia). Azkeneko zentrifugaziotik eratorritako hauspeakinaren (mintz zelularrak) proteina-kontzentrazioa neurtzeko, homogeneizazio-soluzio indargetzailean berreseki zen. Homogeneizatu 800 rpm / 1 min / 4 ºC Zentrifugatu 1500 g / 10 min / 4 ºC Ultrazentrifugatu g / 35 min / 4 ºC Homogeneizaziobufferra gehitu Gainjalkina Mintz zelularrak 5. irudia: Garunaren kortexaren eta Jurkat zelulen mintzen prestaketaren eskema pausoz pauso. Jurkat hilezkor bilakatu diren T linfozitoen lerro zelularra da. 1976an odol periferikoaren T leuzemia pairatzen zuen 14 urteko mutiko baten odoletik eratortzen dira (Schneider, 1977). Giza garunaren kortex prefrontalaren materia grisa zein Jurkat zelulak, Guillermo Velasco doktorearen (UCM) eta Leyre Urigüen doktorearen (UPV/EHU) adeitasunez lortu ziren Proteinen kontzentrazioa neurtzea (Bradford metodoa) a) Oinarria Laginetan dagoen proteina-kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa Coomasie urdin distiratsuak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da (Bradford, 1976). Teknika kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia xurgatzeko duten gaitasunean oinarritzen da. Koloratzailea proteinetara lotzean, gai kimiko horren xurgapenaren uhin-luzeran aldaketa sortzen da: 465 nm-tik 595 nm-ra pasatzen da. Koloratzailea asetzailea denez, xurgapenaren gehikuntza proteina-kontzentrazioarekiko zuzenki proportzionala da. Hala, xurgapenaren gehikuntza espektrofotometroan neurtuz, proteina kantitate ezagunekin egindako xurgapen patroi-zuzen batean interpola daiteke.

80 Materialak eta metodoak 65 b) Protokoloa Patroi-zuzena egiteko, 10 mm Tris-HCl + BSA (1 mg/ml) soluzioaren bolumen batzuk (0 µl-tik, 25 µl-ra) eta 2,5 ml Bradford erreaktiboa nahastu eta 10 minutuan inkubatzen genituen. Xurgapenaren uhin-luzera kontrolatzen duen monokromadorea 595 nm-an finkatuz, hodi bakoitzaren edukiaren absorbantzia neurtzen zen. Ikusi behar genuen lortutako absorbantzia-emaitzak kontzentrazioarekiko proportzionaltasun zuzena azaltzen duen Y = ax + b funtzio zuzenera doitzen zirela. Beraz, behin eskala eginda, esperimentuetarako erabiliko ziren lagin bakoitzaren 10 µl, 2,5 ml Bradford erreaktiborekin inkubatzen ziren 10 minutuan (3 erreplika) eta espektrofotometroan neurtzen ziren 595 nm-an. Lagin bakoitzaren proteina-kontzentrazioa jakiteko, absorbantziaren balioak patroi-zuzenean interpolatzen genituen Western Blot (WB): Elektroforesia (SDS-PAGE), transferentzia eta immunodetekzioa a) Oinarria Elektroforesia proteinen nahasketa konplexuak banatzeko erabili ohi da, gero proteinak identifikatzeko edo purifikatzeko helburuarekin. SDSren presentzian egindako dimentsio bateko poliakrilamidazko gel elektroforesian (SDS-PAGE), proteinak, eremu elektriko bati esker, geleko poroetan zehar barreiatzen dira. Akrilamida-kontzentrazioa handitzean, poroen tamaina txikituko da. Beraz, gelaren poroen tamainak eta proteinaren karga, neurri eta itxurek proteinen migrazio-abiadura mugatuko dute. Gelean korriarazitako proteinak nitrozelulosa, nylon edo PVDF (Polyvinylidene difluoride) mintz baten azalari itsasteari deritzo transferentzia. Prozesu hori elektroforesiz egiten da, eta, behin prozesua bukatua, proteinen tindaketa itzulgarria egiteko aukera dago. Immunodetekzioa antigorputz monoklonal edo poliklonal bidez antigeno espezifikoa ezagutzeko erabiltzen da. Kasu honetan, bilatzen dugun proteina espezifikoa bilatzeko erabiliko da.

81 66 Materialak eta metodoak b) Protokoloa b.1 Elektroforesia Gela prestatzea Bi kristal-laukirekin 0,75 mm-ko tarteko sandwicha sortu eta beheko aldea ixten zen. Kristalek sortutako tartean, gelaren zati banatzailea (beheko partean) eta kontzentratzailea (goiko partean) sortzen ziren: Gel banatzailea: proteinak negatiboki kargatu (SDSagatik) eta desnaturalizatzen zirenez (SDS, β-merkaptoetanol eta beroagatik), pisu molekularraren arabera soilik banatuko ziren. Akrilamidaren portzentajea aztertu nahi genuen proteinaren pisu molekularraren arabera erabaki zen. Gure proteinak, teorikoki, 40 kda-etik 100 kda-era agertzeko aukera zegoenez, taula teoriko batez baliatuz (6.A irudia), % 12-ko bereizmena zuten gelak egitea erabaki zen. Beste portzentajeko gelak egin nahi izanez gero, erabakitako portzentajearen arabera aldatzen ziren akrilamida eta ur kantitatea (materialak eta metodoak atala). Erlenmeyer batean, gel banatzailea eratzeko konposatu guztiak gehitzen ziren (amonio persulfatoa eta TEMED azkenean) eta lasai nahasten ziren. Pipeta batez, nahasketa kristalen artean sartzen zen (~7 cm) eta, gela zuzen geratzeko, nahasketaren gainean isopropanola gehitzen zen (~0,5 cm). Gela polimerizatzen zenean (10-20 min), goiko partetik isopropanola ondo kentzen zitzaion. Gel kontzentratzailea: proteinak gel banatzailera igaro baino lehen lerrokatu/kontzentratu behar ziren gel kontzentratzailean. Gel hori eratzeko, akrilamidaportzentajea beti % 4 izan zen (materialak eta metodoak atala). Gel banatzailea bezala eratzen zen (osagai desberdin bakarra Tris-HCl ph 6,8 zen). Pipeta batekin, eratutako nahasketa gel banatzaile polimerizatuaren gainean botatzen zen kristalen tartea goraino bete arte eta orrazia jartzen zitzaion kaleak era zitezen. Gela polimerizatzen zenean (10-20 min), orrazia kendu eta elektroforesi-indargetzaileaz beteriko elektroforesi-euskarrian jartzen zen.

82 Materialak eta metodoak 67 Laginak prestatzea, kargatzea eta gel-korriaraztea Zentrifugazio bidez lortutako mintz zelularren hauspeakina (espermatozoideetan) edo homogeneizatua (garun-kortexeko zeluletan eta Jurkat zeluletan), proteinentzako kargaindargetzailearekin berreseki edo diluitzen zen eta 3-5 minutuan irakiten jartzen zen (100 ºC). Gelaren kale bakoitzeko ~500x10 6 zelula/ml espermatozoide eta, garunkortexeko zelulen edo Jurkat zelulen 30 µg proteina kargatzen ziren % 12ko bereizmenarekin eratutako gelean. Kale batean pisu molekular ezaguneko proteinak kargatzen ziren. Proteinak 100 V-ean korriarazten ziren kontzentrazio-gela zeharkatu arte eta, hortik aurrera, korrontea 200 V-ean eramaten zen bromofenol urdina gelaren bukaeraraino heldu arte. A B + Kuxinak PVDF Gel Whatman paperak - 6. irudia: A) Poliakrilamidazko Tris-HCl/Glizina/SDS buffer gelen bereizmen portzentajeen hautaketarako taula teorikoa. Proteinen bandak, pisu molekularraren (KDa) arabera kokatzen dira. B) Transferentzia sandwich-eko muntaiaren ordena, polo negatibotik polo positibora. b.2 Transferentzia-metodo hezea Sandwicharen muntaia Transferentzia-sandwich-aren muntaiaren ordena, polo negatibotik polo positibora, hau izan zen: kuxina, Whatman paperak (x3), gela (zati kontzentratzailerik gabe), transferentzia-mintza (PVDF), Whatman paperak (x3) eta kuxina (6.B irudia). Burbuilak kentzeko, azkeneko Whatman paperen gainetik zilindro bat pasatzen zen.

83 68 Materialak eta metodoak Gela, Whatman paperak, PVDFa eta kuxinak, transferentzia-indargetzailean egonkortzen ziren (5-10 min). Geletik mintzerainoko transferentzia Transferentzia-sandwich-a itxi eta transferentzia-cassette-an orientazio egokian jarri ostean (gela anodoari eta PVDFa katodoari begira), cassette-a transferentziaindargetzailez beteriko transferentzia-euskarrian sartzen zen eta proteinak 100 V-ean transferitzen ziren 1,5 orduan. Mintza tindatzea (itzulgarria) Transferentzia ondo gertatu zela baieztatzeko, PVDFa Ponceau gorrian murgiltzen zen 5 minutuan eta, gero, urarekin hainbat garbiketa egiten zen. Horren ostean, PVDFa Blotto soluzioan egonkortzen zen. b.3 Immunodetekzioa Lotura ez-espezifikoak ekiditeko, PVDFa blokeo-soluzioan ordu batean murgiltzen zen giro-tenperaturan. Garbiketa arin baten ostean, gizakientzako untxi-antigorputz poliklonal primario espezifikoekin inkubatzen zen gau osoan 4 ºC-an (3. taula). 3. taula. Western blot eta immunozitokimikan erabilitako antigorputzak. hdor: giza δ opioidehartzailea; hkor: giza κ opioide-hartzailea; hmor: giza µ opioide-hartzailea; hcb 1 : giza CB 1 kannabinoide-hartzailea; hcb 2 : giza CB 2 kannabinoide-hartzailea. ANTIGENOA OSTALARIA DILUZIOA DILUZIOA ETXE (WB) (IZK) KOMERTZIALA hdor Untxia 1/2500 1/800 Chemicon hkor Untxia 1/300 1/50 Santa Cruz hmor Untxia 1/2500 1/800 Chemicon hcb 1 Untxia 1/250 1/400 Affinity BioReagents hcb 2 Untxia 1/200 1/400 Cayman Anti-Rabbit IgG : HRP Astoa 1/ Affinity BioReagents Anti-Rabbit IgG : Alexa Fluor 488 Ahuntza - 1/500 Molecular Probes

84 Materialak eta metodoak 69 Horren ostean, garbiketak egiten ziren Blotto soluzioarekin (3x5 min) eta peroxidasarekin konjugatutako untxiaren IgG-aren kontrako asto-antigorputz sekundarioarekin inkubatzen zen ordu batean giro-tenperaturan. Blotto soluzioarekin PVDFaren azkeneko garbiketak egin ondoren (3x5 min), PVDFa ECLan murgiltzen zen minutu batean. PVDFa azetato-paperen tartean sartu eta argazki-filma gainean jartzen zen (1-5 min). Azkenik, bandak ikusarazteko, filma errebelatzen zen. Bukatzeko, argazkiaz baliatuz, kale bakoitzean lortutako banda pisu molekularreko estandarrarekin alderatzen zen. Hartzaile bakoitzerako espero ziren kda-ak lortzen baziren, lagin horretarako hartzailearen presentzia ondorioztatzen zen. b.4 Stripping-a PVDFtik antigorputzak erauzteko eta mintza berrerabiltzeko, stripping deituriko teknika erabili zen. PVDFa, guanidina-tiozianatoan (6 M) 5-10 segundoan murgiltzen zen (PVDFa gardendu arte) eta, Blotto soluzioarekin garbiketak egin eta gero (3x5 min), PVDFa berrerabili egiten zen beste immunodetekzio baterako. 2.5 Hartzaileen proteinak kokatzea Immunozitokimika (IZK) a) Oinarria Immunozitokimika zeluletan dauden antigeno jakinak lokalizatzeko erabiltzen da. Immunodetekzio ez-zuzena antigorputz primario espezifikoa gehi antigorputz sekundario markatua erabiliz egiten da. Antigorputzen marka fluorogenikoa bada, antigeno espezifikoak fluoreszentzia-mikroskopio bidez detektatu eta lokalizatuko dira. b) Protokoloa Immunofluoreszentzia bidez hartzaile bakoitzaren kokalekua zehazteko, swim-up teknikarekin isolatutako espermatozoideak PBSan esekitzen ziren. Mikroskopio-estalki baten gainean, Poly-L-lisina jartzen zen, espermatozoideak euskarri horretan itsas

85 70 Materialak eta metodoak zitezen. Zelulak finkatzeko, paraformaldehido % 3-rekin (10 min) eta metanol hotzarekin (10 min) erabili zen. Estalkiak PBSarekin garbitzen ziren (3x5 min) pauso bakoitzaren bukaeran. Finkatze-prozesua amaituta, espermatozoideak PBS + % 10 (bol/bol) behi-umekiaren serumarekin blokeatzen ziren 20 minutuan. Tindaketa immunofluoreszente ez-zuzena egiteko, espermatozoideak untxi-antigorputz poliklonal primario espezifiko bakoitzarekin inkubatzen ziren gau osoan 4 ºC-an (3.taula). Horren ostean, PBSarekin garbitzen zen (3x5 min) eta konposatu fluorogenikoz konjugatutako untxiaren IgG-en kontrako ahuntz-antigorputz sekundarioarekin inkubatzen zen (3. taula) iluntasunean, bi orduan eta girotenperaturan. Estalkien azkeneko garbiketa egin ondoren (3x5 min), Fluoromont G- rekin muntatu ziren porta baten gainean. Espermatozoideak mikroskopio fokukidearen bidez aztertu ziren argon ioi bidezko laserrarekin 488 nm-an (urdina) kitzikatuz eta nm-an (berde) jasoz (7. irudia). 7. irudia: Immunozitokimikako esperimentuaren eskema pausoz pauso. Estalkiek 12 mm-ko diametroa dute eta inkubaketak egiteko, hazkuntza zelularrerako erabiltzen diren 24 putzuko plakak erabiltzen dira; irudian 24 putzutik bat irudikatzen da. Azalpen zabaldua testuan.

86 Materialak eta metodoak 71 Espermatozoideen nukleoak markatu nahi zirenean, azkenaurreko garbiketan Hoestch koloratzailea (3 µm) erabiltzen zen. Argon ioi bidezko laserrarekin 405 nm-an (UV) kitzikatuz, 440 nm-an (urdina) jasotzen zen, baina, kasu honetan, modu sekuentzialean, Alexa-488 eta Hoestch ren seinaleak nahas ez zitezen. Antigorputz primarioarekin egindako inkubaketa kenduta, kontrol negatiboak modu berdinean egin ziren. Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 3 espermatozoide-lagin erabili ziren. 2.6 Espermatozoideen behaketa fisiologikoa Espermatozoideen inkubaketa-ingurunea a) Opioideekin egindako inkubaketak Swim-up bidez berreskuratutako espermatozoideak TEK ingurunearekin berreseki ziren ~30x10 6 zelula/ml kontzentraziora. Inkubaketa-ingurunea TEKa izan zen, eta bertara konposatu opioideak gehitzen ziren: µ-agonista morfina eta antagonista naloxona; δ- agonista DPDPE eta antagonista naltrindola; κ-agonista U eta antagonista norbinaltorfimina. Konposatu horien stock-a TEKean egin zen. Eppendorf saio-hodi batzuetan 180 µl TEK + espermatozoide jartzen ziren eta, amaierako bolumena 200 µl izateko, TEKa + opioide konposatua 10 aldiz kontzentratuagoa zeukan stock-etik 20 µl gehitzen ziren. Kontrol orokorra egiteko, eppendorf saio-hodi batean opioiderik gabeko 20 µl TEK gehitzen ziren. Opioidehartzaile bakoitzaren aktibazioa agonista espezifikoaren kontzentrazio desberdinak erabilita aztertzen zen; 10-5, 10-6 eta 10-7 M. Antagonismoa aztertzeko, laginak antagonista espezifikoarekin preinkubatzen ziren 30 minutuan eta, gero, agonista gehitzen zitzaien. Antagonistaren kontzentrazioa agonistarena baino hamar aldiz handiagoa izan zen kasu bakoitzean (kasu honetan, eppendorf saio-hodi batera 160 µl TEK + 20 µl antagonista + 20 µl agonista botatzen ziren). Azkenik, antagonista

87 72 Materialak eta metodoak espezifikoaren dosi altuenak (10-4 M) espermatozoideetan efekturen bat sorrarazten ote zuen ikusteko, kontrol bat egin zen antagonista bakoitzerako (8. irudia). TEKan berreseki 30x10 6 sp / ml Agonista (10X) 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 180 µl 160 µl 180 µl 180 µl 20 µl Antagonista (10X) TEK Agonista (1X) Antagonista (1X) + 30 min + agonista (1X) Antagonista (1X) Kontrola 8. irudia: Espermatozoideak agonista eta antagonista opioideekin inkubatzeko diseinu esperimentala. b) Kannabinoideekin egindako inkubaketak Swim-up bidez berreskuratutako espermatozoideak TEK ingurunearekin berreseki ziren ~60x10 6 zelula/ml kontzentraziora. Inkubaketa-ingurunea TEKa izan zen, eta bertara konposatu kannabinoideak gehitu ziren: CB 1 -agonista ACEA eta antagonista SR a; CB 2 -agonista JWH-015 eta antagonista SR Konposatu horien stock-a etanol eta DMSOan egin zen. Eppendorf saio-hodi batzuetan TEK 80 µl + kannabinoide konposatua 10 aldiz kontzentratuagoa zeukan stock-etik 20 µl gehitzen ziren eta vortex-arekin ondo irabiatzen ziren. Kasu honetan, 2 kontrol orokor egiten ziren; alde batetik, eppendorf saio-hodi batean kannabinoiderik gabeko 20 µl TEK gehitzen ziren; bestetik, 20 µl kannabinoide disolbatzaile huts (etanol edo DMSO) gehitzen ziren. Bolumen finala 200 µl izateko, aurretik lortutako 100 µl-etara, TEKean berresekitutako 100 µl espermatozoide gehitzen ziren. Kannabinoide-hartzaile bakoitzaren aktibazioa agonista espezifikoaren kontzentrazio desberdinak erabilita aztertzen zen; 10-5, 10-6 eta 10-7 M.

88 Materialak eta metodoak 73 Kasu honetan, laginak ez ziren antagonista espezifikoarekin pre-inkubatu, zeren eta, kannabinoideak lipidoak izanik, irabiaketa bortitza behar baitute ingurunean homogeneoki zabaltzeko. Beraz, behin espermatozoideak ingurunean zeudela, ezin zen irabiaketa bortitz hori egin. Beraz, antagonismoa aztertzeko, antagonistaren eta agonistaren kontzentrazio ekimolekularrak batera nahastu ziren kasu bakoitzerako (kasu honetan, eppendorf saio-hodi batera 60 µl TEK + 20 µl agonista + 20 µl antagonista botatzen ziren eta, kontrol espezifikorako, 60 µl TEK + 40 µl kannabinoide disolbatzaile huts jartzen ziren). Azkenik, antagonista espezifikoaren dosiek, bakarrik, espermatozoideetan efekturen bat sorrarazten zuten ikusteko, kontrol bat egin zen antagonista bakoitzerako eta dosi bakoitzerako (10-5, 10-6 eta 10-7 M) (9. irudia). TEKan berreseki 60x10 6 sp / ml Agonista (10X) 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl BORTEX 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl BORTEX 20 µl Antagonista (10X) TEK 80 µl TEK 80 µl Etanol / DMSO Agonista (1X) Antagonista (1X) + agonista (1X) Antagonista (1X) Kontrola 9. irudia: Espermatozoideak, agonista eta antagonista kannabinoideekin inkubatzeko diseinu esperimentala Espermatozoideen mugikortasunaren analisia Mugikortasunaren analisia fase-kontrastedun mikroskopioarekin eta ordenagailu bidezko Sperm Class Analyzer 2005 softwarearekin (10.a irudia) neurtu zen, 4. taulako konfigurazioa erabiliz. Aztertu beharreko konposatua espermatozoideekin kontaktuan jarri ondoren, espermatozoideen mugikortasuna zenbait denboratan neurtzen zen; opioideentzat, 0, 0,5, 1 eta 3,5 orduak eta kannabinoideentzat, 0, 0,5, 1 eta 2 orduak erabili ziren.

89 74 Materialak eta metodoak 4. taula: erabilitako CASA sistemaren konfigurazioa. Parametroak Frame/segundoko: eskuratutako irudiak segundoko 25 Frame zenbatekoa: grabatutako irudiak 25 LVV muga (µm/s): espermatozoide geldo baten abiadura maximoa 10 MVV muga (µm/s): espermatozoide ertain baten abiadura maximoa; hortik 35 gora, azkartzat hartuko da STR minimoa (%): azkarrak ez ezik, progresibotzat hartzen diren 80 espermatozoideen kopurua adierazteko balioa Fase-kontrastea: mikroskopioak erabilitakoa irudiak grabatzean PH+ Handiagotzea x20 Espermatozoideen kontzentrazioa eta mugikortasuna neurtzeko, lagin bakoitzetik, 37 ºC-an zegoen Makler zenbaketa-kameran (10.B irudia) 7,5 µl jartzen ziren. Lagin bakoitzetik, 2 tanta desberdinetatik eratorritako 100 espermatozoide neurtzen ziren gutxienez. Espermatozoideen mugikortasuna adierazteko, Osasunerako Munduko Erakundearen irizpideen araberako nomenklatura erabili zen (10.D irudia): A motako A B D 10. irudia: Sperm Class Analyzer A) Fase kontrastedun mikroskopioa eta ordenagailua. B) Makler zenbaketa-kamera. D) Espermatozoideen mugikortasunaren argazkia Sperm Class Analyzer 2005 softwarearekin neurtua (a mota: gorri, b mota: berde, c mota: urdin eta d mota: hori).

90 Materialak eta metodoak 75 mugikortasuna (abiadura 25 µm/s): higidura progresiboa (lerro zuzena) eta azkarra erakusten duten espermatozoideen proportzioa; B motako mugikortasuna (abiadura 10 µm/s, baina 25 µm/s): higidura motel/makala (sigi-sagakoa) erakusten duten espermatozoideen proportzioa; C motako mugikortasuna (abiadura < 10 µm/s): mugikortasun ez-progresiboa duten espermatozoide mugikorren proportzioa. D motako mugikortasuna (geldirik): mugimendurik ez duten espermatozoideen proportzioa. Bestalde, espermatozoideek egindako ibilbideen arabera, mugikortasun-parametro hauek neurtu ziren: VCL: abiadura lerromakurra (kurbolineala) (µm/s): frame bakoitzean, buruaren zentroa agertzen den lekuak elkarri lotuz lortzen da. Irudia eskuratzen den denbora osoa hartu behar da kontuan. VSL: abiadura lerrozuzena (µm/s): irudia eskuratzen den denboran, lehenengo eta bukaerako puntuak elkarri lotuz lortzen da. VAP: batez besteko ibilbidearen abiadura (µm/s): VCLa sortzen duten puntuen estrapolazioz lortzen da. Ibilbide erreala Ibilbide erreala 11. irudia. Espermatozoideen hainbat mugikortasun-parametroen irudikapena (Ibilbide erreala, VCL, VSL, VAP eta ALH). Espermatozoideek egindako ibilbide errealetik kalkulatzen dira. (Tablado eta lank., 1996-tik moldatua). LIN: linealtasuna (VSL/VCL) X 100: ibilbide lerromakurraren zuzentasuna adierazten du. STR: zuzentasuna (VSL/VAP) X 100: batez besteko ibilbidearen zuzentasuna adierazten du. WOB: oszilazioa (VAP/VCL) X 100: ibilbide lerromakurraren oszilazioa batez besteko ibilbidearen gainean adierazten du. ALH: buruaren albo-desplazamenduaren anplitudea (µm): buruaren desplazamenduaren anplitudea batez besteko ibilbidearen gainean adierazten du.

91 76 Materialak eta metodoak BCF: zeharkatze-maiztasuna (Hz): buruak batezbesteko ibilbidea zenbat alditan zeharkatzen duen adierazten du. 2.7 Analisi estatistikoa Emaitzen analisi estatistikoa bariantzaren analisia (Analysis of variance; ANOVA) eginez aztertu zen. Adierazgarritasunaren muga minimoa p<0,05-ean ezarri zen. Hala konparatu zen espermatozoideen mugikortasunaren batez bestekoaren aldaketa tratamenduen artean eta denboran zehar. Post-hoc analisirako, Student t testean oinarritutako desberdintasun minimo adierazgarriaren testa erabili zen (Least Significant Difference t test; LSD). Analisi estatistikorako, SPSS 14.0 (Statistical Package for the Social Sciences) softwarea erabili zen.

92 Emaitzak eta eztabaida

93

94 Emaitzak eta eztabaida helburua: δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan 1.1 Opioide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan 1.irudia (A, B eta D) espermatozoide eta giza garun-kortexeko mintz plasmatikoak erabilita egindako western bloten erakusgarria da. A B D KDa Sp Kx KDa Sp Kx KDa Sp Kx irudia: δ opioide-hartzailea (A), κ opioide-hartzailea (B) eta µ opioide-hartzailea (D) western bloten analisia giza espermatozoideetan (Sp) eta garun-kortexean (Kx). Pisu molekularreko markatzaileak (kda) bloten ezkerrean agertzen dira. n = 5. Anti-δ antigorputz poliklonalak ~50 kda-eko banda agerrarazi zuen espermatozoideen proteina-erauzkinean. Garun-kortexean, ~50 kda-eko banda ez ezik, 70 eta 36 kda-eko bandak ere aurkitu ziren (1.A irudia). Datu horiek bibliografian topatutako hainbat lanekin bat datoz. Adibidez, argitaratutako lan batean, δ opioide-hartzailearentzat, 46 kda-eko masa molekular teorikoa ondorioztatu izan da, nahiz eta SDS-PAGE eta gero, δ opioide-hartzailearekiko immunorreaktibotasuna masa molekular batzuetan (50-tik 70 kda-era) agertu (Christoffers, 2005). Bestalde, Persson-ek eta lankideek arratoiaren garunean hiru banda desberdin immunokokatu zituzten 72, 48 eta 36 kda-ean (Persson, 2005). Azken lan horretan, 48 kda-eko banda proteina osoa izango zela ondorioztatu zuten. Era berean, proposatu zuten 36 kda-eko banda itzulpen ondoko prozesamenduan C-muturra moztuta edukiko lukeen zatia izango zela eta dimeroak (72 kda) sortzeko ahalmena edukiko zuela. Beraz, ondoriozta genezake espermatozoideetan, kontrol positiboarekin (kortexa) alderatuz, proteinaren forma bakarra agertzen dela.

95 80 Emaitzak eta eztabaida Anti-κ antigorputz poliklonala erabiliz, espermatozoideetan ~100, 65, 56 eta 36,5 kdaeko 4 banda detektatu ziren. Garun-kortexean, ~65 eta 56 kda arteko immunorreaktibotasuna detektatu zen (1.B irudia). Hau da, kontrol positibo moduan erabilitako kortexean antzemandako bandak espermatozoideetan ere agertu ziren. Banda horiek, lehenago egindako lanetan, arratoiaren eta igelaren garunetan eta giza plazentan ere deskribatuak izan dira (Simon 1987, Ahmed 1989, Mejean 1992). κ opioidehartzailearentzat ondorioztatutako masa molekular teorikoa 43 kda izan arren, lan guztietan kda arteko immunorreaktibotasuna topatu izan da, agian, itzulpen ondoko aldaketak direla eta (Arvdisson 1995). 100 kda-eko banda dimero bat izan daitekeela deskribatu da (Arvidsson 1995, Jordan 2001) eta 36,5 kda-eko banda ez da deskribatua izan. Azkenik, anti-µ antigorputz poliklonalak ~70 eta 50 kda-eko bandak agerrarazi zituen espermatozoideen proteina-erauzkinean, baina, garun-kortexean, gehienbat ~50 kdaeko banda detektatu zen (1.D irudia). Albriziok eta lankideek antzeko banda ezglikosilatuak (65 eta 50 kda) aurkitu zituzten zaldi- eta giza espermatozoideetan (Albrizio 2005, Albrizio 2006). µ opioide-hartzailearen 49,8 kda-eko masa molekular teorikoa (Christoffers 2003) bat dator espermatozoideetan eta garun-kortexean lortu genituen bandekin. Dena den, hainbat lanetan, gure laginean bezala, pisu molekular altuagoko bandak ere aurkitu izan dira, ziurrenik, itzulpen ondoko aldaketak direla eta (Christoffers 2003). Western blot-eko PVDF mintzak δ-, κ- zein µ-antigorputz poliklonal primarioekin inkubatzen ez zirenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik eman (aurkeztu gabeko datuak). 1.2 Opioide-hartzaileen kokapena giza-espermatozoideetan Azterketa immunozitokimikoen bidez, hiru opioide-hartzaileen presentzia baieztatu zen. Gainera, hartzaile bakoitzaren kokapena zehaztu eta elkarren artean konparatu ahal izan ziren. δ opioide-hartzailea espermatozoideen mintz plasmatikoan detektatu zen buruaren aurrealdean (akrosoma aldearen gainean), lepoan, tarteko zatian eta isatsean (2.A

96 Emaitzak eta eztabaida 81 irudia). Kew-ek eta lankideek, nagusiki, µ zein δ opioide-hartzailera lotzen den [Met 5 ]entzefalina-arg 6 -Phe 7 peptidoaren kontrako antigorputza erabiliz, akrosoma aldearen gainean aurkitu genuen immunokokapen berdina aurkitu zuten (Kew 1990). Gure kasuan, behatutako zelulen % 20an, buruko seinalea akrosoma osteko hasierako zatira arte hedatzen zen (2.B irudia). κ opioide hartzailearen immunotindaketa espermatozoideen mintz plasmatikoan aurkitu zen buruaren aurrealdean, lepoan, tarteko zatian nabarmena eta isatsean (2.D irudia). Aztertutako zelula guztien % 17ren seinalea, buruaren aurrealdean aurkitu beharrean, ekuatorean edo akrosoma osteko zatian aurkitu zen (2.E irudia). Azkenik, µ opioide-hartzailearen seinalea espermatozoideen mintz plasmatikoaren buruan (ekuatore/akrosoma osteko zatian), tarteko zatian eta isatsean zehar agertu zen (2.F irudia). Tindaketa patroi hori zaldien espermatozoideetan topatutakoarekin bat dator, gutxi gorabehera (Albrizio 2005). Espermatozoideak oso zelula zatikatuak dira; horregatik uste da proteina bakoitza beharrezkoa den egituran bakarrik aurkitzen dela. Hala baldin bada, erreakzio akrosomikoan parte hartzen duten proteinek akrosoman kokatu behar dute; obozitoen mintz plasmatikora lotzen diren proteinek ekuatorean egon behar dute; eta mugikortasunerako beharrezkoak diren proteinek, espezifikoki, espermatozoide helduen isatsean kokatu behar dute (Turner 2006). Beraz, teoria hori aintzat hartuz eta goian azaldu dugun opioide-hartzaile bakoitzaren banaketa kontuan hartuz, hiru opioidehartzaileek kokalekua partekatzen dutenean, funtzio berean parte har dezaketela ondoriozta genezake. Aitzitik, hiruak kokaleku desberdinetan topatuz gero, funtzio espezifiko desberdinetan ere parte har dezaketela ondoriozta genezake. Bestalde, immunotindaketa-prozedura berdina jasan duten zeluletan aurkitutako seinale patroi desberdinaren arrazoia mintz plasmatikoa egoera funtzional desberdinean aurkitzearen ondorioa izan daiteke. Izan ere, espermatozoideek, obozitoa ernaltzeko gaitasuna eskuratzeko jasaten duten aktibazio-prozesuan zehar, zeina batzuetan berez gerta baitaiteke (Maccarrone 2005), mintz plasmatikoaren berrantolaketa pairatzen dute (Flesch eta Gadella 2000).

97 82 Emaitzak eta eztabaida δ-, κ- zein µ-antigorputz poliklonal primarioekin egin beharreko inkubaketa egiten ez zenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen (2.G irudia). 2. irudia: Opioide-hartzaileen azterketa immunozitokimikoa giza espermatozoideetan. A eta B) δ opioide-hartzailearen kokapena. D eta E) κ opioide-hartzailearen kokapena. F) µ opioidehartzailearen kokapena. G) kontrol negatiboa (Hoechst ak nukleoa markatzen du urdinez). n = 3. Gezitxoek hartzaile bakoitzaren tindaketa patroiaren aldakortasuna (B eta E) edo kontrol negatiboaren nukleoa (G) seinalatzen dute. Eskala-barra, 10 µm. 1.3 Opioide-hartzaileen mrnaren espresioa giza espermatozoideetan Giza espermatozoideetatik erauzitako RNArekin egindako RT-PCR bidez µ eta κ opioide-hartzaileen mrnak detektatu ziren arren, ez zen δ opioide-hartzailearena aurkitu. µ eta κ opioide-hartzaileentzat, espermatozoideetan zein kontrol positibo moduan erabilitako giza garunaren kortexean, espero genuen bezala, 352 bp eta 440 bpko zatiak topatu genituen, hurrenez hurren. δ opioide-hartzailearentzat, espero genuen 222 bp-ko zati anplifikatua giza garunaren kortexean aurkitu genuen baina ez espermatozoideetan. Barne-kontrol moduan erabilitako GAPDH genea ondo anplifikatu zen (3. irudia). [RT-PCRaren bidez lortutako espermatozoideen µ eta κ opioidehartzaileen anplikoien sekuentziak bat datoz NCBI-BLAST (National Center for Biotechnology Information - Basic Local Alignment Search Tool) datu-baseko mrna sekuentziekin (1. eranskina)]

98 Emaitzak eta eztabaida 83 Sp Kx DELTA KAPPA MU GAPDH 3. irudia: RT-PCRaren produktuen etidio bromurodun % 2 agarosa-gelaren elektroforesia giza espermatozoideentzat (Sp) eta garun-kortexarentzat (Kx). DELTA, δ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (222 bp) soilik garunaren kortexean topatu zen. KAPPA, κ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (352 bp). MU, µ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (440 bp). GAPDH, barne-kontrol moduan erabili zen (322 bp). n = 5. Emaitza horiek bat datoz µ- eta κ-hartzaileen proteina-datuekin. Baina espermatozoide helduetan, δ opioide-hartzailearen immunorreaktibotasuna detektatu genuen arren, opioide-hartzaile horren mrnaren presentziarik ez zen ikusi, ez RT-PCR erabilita (3. irudia) ezta RT-PCR kuantitatiboa erabilita ere (2. eranskina). Alde batetik, badakigu espermatozoide helduek ez dutela transkripzioa eta itzulpenprozesua egiteko gaitasunik (Flesh eta Gadella, 2000). Espermatogenesiaren azkeneko urratsetan espermatozoideek beren zitoplasmaren zati handi bat (organulu gehienak eta mrnaren gehiengoa barne) galtzen dutelako gertatzen da (Miller, 2005). Hori dela eta, RNAren presentzia nukleo/perinukleora edota mitokondrietara mugatzen da, in situ hibridazio bidez frogatu den bezala (Pessot1989, Kumar 1993, Wykes 1997). Beste alde batetik, RNAren andeakuntza selektiboa gertatzen denez, giza espermatozoideen RNA-populazio jakinak babestuak egongo liratekeela deskribatu da. Azken horrek adieraziko luke espermatozoide helduetan RNA-populazio egonkorrak egon daitezkeela (Ostermeier, 2005). Ondorioz hipotetiza dezakegu espermatozoideek, espermatogenesia bukatu eta hurrengo faseetan δ opioide-hartzailearen mrna behar izango ez luketenez, ez luketela gordeko mrna hori. Horrek azalduko luke zergatik agertzen den espermatogenesian zehar espresatu den hartzailearen proteina espermatozoide helduetan δ-hartzailearen mrna

99 84 Emaitzak eta eztabaida azaltzen ez den arren. Ildo beretik, Ravinak eta lankideek, tazikininen hartzaileak aztertzean, ondorio berdina proposatu zuten (Ravina, 2007). Proposatutako ondorio hori egia bada, µ- eta κ-hartzaileen mrnak, mezulari hautatu moduan, funtzio bat eduki lezake zigoto goiztiarraren garapenean, bestelako espermatozoide-transkriptoreentzat proposatu den bezala (Ostermeier, 2002; Ostermeier, 2004). Dena den, espermatozoidearen mrnaren funtzioen inguruan sortutako eztabaidak oraindik pizturik dirau (Miller, 2005).

100 Emaitzak eta eztabaida helburua: CB 1 eta CB 2 kannabinoide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan. 2.1 Kannabinoide-hartzaileen mrnaren espresioa giza espermatozoideetan Giza espermatozoideetatik erauzitako RNArekin egindako RT-PCR bidez, CB 1 zein CB 2 kannabinoide-hartzaileen mrnak detektatu ziren. CB 1 kannabinoide-hartzailearen 408 bp-ko anplikoia espermatozoideetan eta kontrol positibo moduan erabilitako giza garuneko kortexean aurkitu zen, baina ez, ordea, kontrol negatibo moduan erabilitako Jurkat zeluletan. Bestalde, CB 2 kannabinoide-hartzailearen kasuan espero genuen 522 bp-ko zatia, espermatozoideetan eta kontrol positibo moduan erabilitako Jurkat zeluletan topatu genuen, baina ez kontrol negatibo moduan erabilitako giza garuneko kortexean (4. irudia). Sp Kx Jr CB 1 CB 2 GAPDH 4. irudia: RT-PCRaren produktuen etidio bromurodun % 2 agarosa-gelaren elektroforesia giza espermatozoideentzat (Sp), garun-kortexarentzat (Kx) eta Jurkat zelulentzat (Jr). CB 1, CB 1 kannabinoide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (408 bp) ez zen Jurkat zeluletan topatu. CB 2, CB 2 kannabinoide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (522 bp) ez zen giza garuneko kortexean topatu. GAPDH, barne-kontrol moduan erabili zen (322 bp). n = 5. Hartzaileen mrna espermatozoide helduetan agertzeak adieraziko luke CB 1 eta CB 2 hartzaileak, opioide-hartzaileak bezala, testikuluetako zelula espermatikoetan sortuko liratekeela. Hau da, ez lirateke epididimoan zeharreko bidaian eskuratuko, ernalkuntzarako beharrezkoak diren beste mintz-proteinekin gertatzen den bezala (Focarelli, 1998; Scuell eta Burkman, 2005), eta ez lirateke prostasometatik bereganatuko (Arienti 1997a, Arienti 1997b) ere, zeren eta, ez opioide-hartzaileak, ez kannabinoideak, ez baitira prostasometan deskribatuak izan (Utleg 2003).

101 86 Emaitzak eta eztabaida µ eta κ opioide-hartzaileen kasuan adierazi dugun bezala, kasu honetan ere, CB 1 eta CB 2 hartzaileen mrna espermatozoide helduetan selektiboki mantendu badira, uste izatekoa da ernalkuntzaren ondoren zenbait funtzio beteko dituztela. 2.2 Kannabinoide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan 5. irudia espermatozoideen, giza garuneko kortex prefrontalaren materia grisaren eta Jurkat zelulen mintz plasmatikoak erabilita egindako western blot-en erakusgarria da. Anti-CB 1 antigorputz poliklonalak ~58 kda-eko banda agerrarazi zuen espermatozoideetan eta garun-kortexean (5.A irudia). Pisu molekular hori bat dator espermatozoideetan (Rossato, 2005) eta beste zeluletan (de Jesus, 2006; Xu, 2005) lehenago egindako hainbat lanekin. Bestalde, mrnarekin gertatu zen bezala, kontrol negatibo moduan erabilitako Jurkat zelulen proteina-erauzkinean ez zen seinalerik aurkitu (5.A irudia); izan ere, zelula mota horien CB 1 genearen transkripzioa oso txikia da, eta, beraz, proteina ez da ia detektatzen (Herrera 2006, Börner 2007). A B kda Sp Kx Jr kda Sp Kx Jr irudia: CB 1 kannabinoide-hartzailea (A) eta CB 2 kannabinoide-hartzaileentzako (B) western blot-en analisia giza espermatozoideetan (Sp), garun-kortexean (Kx) eta Jurkat zeluletan (Jr). Pisu molekularreko markatzaileak (kda) blot-en ezkerrean agertzen dira. n = 5. Anti-CB 2 antigorputz poliklonala erabiliz, espermatozoideetan eta kontrol positibo moduan erabilitako Jurkat zeluletan, 44 kda-eko banda detektatu zen (5.B irudia) eta, gutxi gorabehera, lehenago deskribatutako pisu molekular teorikoarekin bat dator (Filppula, 2004). Espermatozoideekin egindako lanetan, CB 2 proteinaren existentzia kolokan jarri da (Rossato, 2005; Maccarrone, 2005). Dena den, Schuel eta Burkman-ek idatzitako berikuspenean (Schuel eta Burkman, 2005) ondo adierazi zuten bezala, Maccarrone-k eta lankideek basurde-espermatozoideekin egindako lanean (Maccarrone, 2005), alde batetik, western blot bidez CB 2 hartzailearen seinale ahula ikus daiteke, eta,

102 Emaitzak eta eztabaida 87 bestetik, SR CB 2 antagonista espezifikoak [ 3 H]CP55.940aren lotura espezifikoa ~% 15 blokeatzen duela ere ikus daiteke. Aipagarria da Maccarrone bera, CB 2 hartzaileari buruzko 2007ko berrikuspen batean (Maccarrone, 2007), CB 2 -aren presentziaz mintzatzen dela 2005ean egin zuen lanean oinarrituta. Laburbilduz, gure emaitzek aurreko datuak indartu eta CB 2 -aren presentzia baieztatzen dute. Bestalde, mrnarekin gertatzen zen bezala, giza garunaren kortexean ez zen CB 2 proteinaren seinalerik detektatu (5.B irudia), bestelako lanetan dagoeneko ikusita dagoen bezala (Herrera, 2006; Blazquez, 2006). Western blot-eko PVDF mintzak CB 1 zein CB 2 antigorputz poliklonal primarioekin inkubatzen ez zirenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen (aurkeztu gabeko datuak). 2.3 Kannabinoide-hartzaileen kokapena giza espermatozoidetan Azterketa immunozitokimikoen bidez, CB 1 eta CB 2 kannabinoide-hartzaileen presentzia baieztatu zen. Horretaz gain, kokalekua zehaztu eta elkarren artean aldaratu ahal izan zen. CB 1 kannabinoide-hartzailea espermatozoideen buruaren aurrealdean (akrosoma aldearen gainean) eta tarteko zatian aurkitu zen (6.A irudia). Emaitza horiek lehenago egindako beste lanen aurkikuntzak baieztatu zituzten (Rossato, 2005). Hala ere, gure kasuan, isatsean ere seinalea topatu zen (6.A irudia). Behatutako zelula guztien % 15ean, buruko seinalea akrosoma osteko zatiraino hedatzen zen (6.B irudia). Basurdeespermatozoideetan egindako ikerketetan, CB 1 hartzailearen presentzia akrosoma osteko zatira eta isatsera mugatzen zen (Maccarrone, 2005). CB 2 kannabinoide-hartzailearen immunotindaketa, ostera, buruaren akrosoma osteko zatian, tarteko zatian eta, intentsitate txikiagoarekin, isatsean aurkitu zen (6.D irudia). Aztertutako zelula guztien % 20ren seinalea buruaren aurreko zatiraino hedatzen zela ikusi zen (6.E irudia).

103 88 Emaitzak eta eztabaida Opioide-hartzaileen kokalekua eztabaidatu dugunean ondorioztatukoaren harira, proteina bakoitza espermatozoidean erabilgarria den egituran bakarrik aurkitzen bada (Turner, 2006), CB 1 eta CB 2 hartzaileen arteko kokalekuen desberdintasunak iradoki lezake prozesu fisiologiko desberdinetan parte hartzen dutela. 6. irudia: Kannabinoide-hartzaileen azterketa immunozitokimikoa giza espermatozoideetan. A eta B) CB 1 kannabinoide-hartzailearen kokapena. D eta E) CB 2 kannabinoide-hartzailearen kokapena. F) kontrol negatiboa. G) F irudia, fase-kontraste bidezko mikroskopiarekin. n = 3. Gezitxoek (B eta E) hartzaile bakoitzaren tindaketa patroiaren aldakortasuna seinalatzen dute. Eskala-barra, 10 µm. Azkenik, immunotindaketa-prozedura berdina jasan duten zeluletan aurkitu dugun seinale patroi desberdina opioide-hartzaileetan eta beste hainbat hartzaile eta proteina immunokokatzean behatu izan da (Meizel, 2004; Subiran, 2007). Berretsi egiten dugu gertaera hori zelulen mintza egoera-funtzional desberdinean egoteagatik gerta daitekeela (Maccarrone, 2005; Flesch eta Gadella, 2000). CB 1 zein CB 2 antigorputz poliklonal primarioekin egin beharreko inkubaketa egiten ez zenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen (6.F irudia).

104 Emaitzak eta eztabaida helburua: Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen aktibazioaren eragina espermatozoideen mugikortasunean. 3.1 Agonista eta antagonista opioideen eragina espermatozoideen mugikortasunean Sarreran ikusi dugun bezala, farmakologikoki, gutxienez hiru opioide-hartzaile mota desberdintzen dira estekatzaileekiko duten itxurazko afinitatearen arabera. Baina badakigu, halaber, konposatu opioide bakoitzak hartzaile mota bakoitzarekiko selektibotasun-maila desberdina daukan arren, edozein opioide-hartzailetara lot daitekeela kontzentrazioa handitzen bada. Hala, aztertu dugun hartzaile bakoitzaren aktibazioaren emaitzak banatuak emango ditugun arren, hartzaileen arteko elkarrekintzak azaldu ahal izateko, emaitzen eztabaida orokorra egingo dugu. δ opioide-hartzailearen agonista (DPDPE) eta antagonista (naltrindol) opioideen eragina mugikortasunean OMEk zehaztutako espermatozoideen mugikortasun motak aztertuz, ikus daiteke DPDPEaren kontzentrazio altuenak (10-5 M) ez zuela aldaketa adierazgarririk sortu denboran zehar (7.A irudia). Era berean, inkubaketa-denborarik luzeenean (3,5 ordu), DPDPE agonistaren kontzentrazio desberdinek ez zuten elkarren arteko ezberdintasun adierazgarririk erakutsi OMEk zehaztutako mugimendu motetan (7.A' irudia). Aipagarria da naltrindol 10-4 M-a gehitu eta berehala (0 ordu) a eta b motako espermatozoideen ehunekoak modu adierazgarrian jaitsi eta, horren ondorioz, d motakoa igo zela naltrindol gabeko inkubaketekin alderatuz (8.A, B eta D irudiak). Gainera, naltrindola bakarrik egonda edo naltrindola zeukan laginari DPDPEa (10-5 M) gehituz, mugikortasun patroi antzekoak ikusi ziren denboran zehar mugimendu mota guztietan (8.A, B, C eta D irudiak). Beraz, ematen du antagonista 10-4 M denean mugikortasun patroia antagonistaren presentziak gidatzen duela denboran zehar. Dena den, 3,5 ordu igaro ostean, naltrindol 10-4 M-aren presentziak soilik A motako mugikortasunaren ehunekoa mantendu zuen era adierazgarrian aldatua, naltrindol gabeko inkubaketekin alderatuz (8.A eta A' irudia). Naltrindolak ere VCL, VSL, VAP,

105 90 Emaitzak eta eztabaida A A Mugikortasuna (%) Mugikortasuna (%) Kontrola DPDPE 10-7 M DPDPE 10-6 M DPDPE 10-5 M DPDPE 10-5 M a c b d Denbora (orduak) 0 a b c d Mugikortasun mota (OME) B Mugikortasuna (%) B Mugikortasuna (%) Kontrola U M U M U M U M a c 0 b d a b c d Denbora (orduak) Mugikortasun mota (OME) D Mugikortasuna (%) $ * $ D Mugikortasuna (%) Kontrola Morfina 10-7 M Morfina 10-6 M Morfina 10-5 M # # Morfina 10-7 M a c a+b b d Denbora (orduak) * 0 a b c d a+b Mugikortasun mota (OME) 7. irudia: Opioide-hartzaileen agonista eta antagonista opioideen eragina giza espermatozoideen mugikortasunean. A) DPDPE 10-5 M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar. B) U M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar. D) Morfina 10-5 M gehitzean a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus gainontzeko orduak; $ P<0,05 versus 0 eta 0,5 orduak). A ) DPDPEren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero. B ) U-50488ren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero. D ) Morfinaren hainbat dosik a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero ( # P<0,05 versus kontrola).

106 Emaitzak eta eztabaida 91 A A a mota (%) a mota (%) * Denbora (orduak) * 5 0 # # Kontzentrazioa (M) B B b mota (%) 30 * b mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) C 30 C 30 c mota (%) c mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) D D * d mota (%) 30 d mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) 8. irudia: δ opioide-hartzailearen agonistaren (DPDPE) eta antagonistaren (naltrindol) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; naltrindol 10-4 M DPDPE 10-5 M + naltrindol 10-4 M; DPDPE 10-5 M (*P<0,05 versus ordu bereko naltrindol gabeko tratamenduak). A, B, C eta D ) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna DPDPEren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioa eta gero (naltrindolaren kontzentrazioa DPDPErena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti). Kontrola; naltrindol 10-4 M; DPDPE + naltrindol; DPDPE ( # P<0,05 versus kontzentrazio bereko naltrindol gabeko tratamenduak).

107 92 Emaitzak eta eztabaida A A a mota (%) a mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) B B b mota (%) 30 b mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) C 30 C 30 c mota (%) c mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) D D d mota (%) 30 d mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) 9. irudia: κ opioide-hartzailearen agonistaren (U-50488) eta antagonistaren (nor-binaltorfimina) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; norbinaltorfimina 10-4 M; U M + nor-binaltorfimina 10-4 M; U M. A, B, C eta D ) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna U ren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioa eta gero (nor-binaltorfiminaren kontzentrazioa U-50488rena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti). Kontrola; norbinaltorfimina 10-4 M; U nor-binaltorfimina; U

108 Emaitzak eta eztabaida 93 A A a mota (%) Denbora (orduak) * * * a mota (%) # Kontzentrazioa (M) B B b mota (%) 30 * b mota (%) $ Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) C C 30 * 30 c mota (%) c mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) D D $ d mota (%) * d mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) E 75 E a+b mota (%) Denbora (orduak) * a+b mota (%) $ Kontzentrazioa (M) 10. irudia: µ opioide-hartzailearen agonistaren (morfina) eta antagonistaren (naloxona) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C, D eta E) hurrenez hurren a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; naloxona 10-4 M morfina 10-7 M + naloxona 10-6 M; morfina 10-7 M (*P<0,05 versus 0 ordu). A, B, C, D eta E ) hurrenez hurren a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna morfinaren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioa eta gero (naloxonaren kontzentrazioa morfinarena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti). Kontrola; naloxona 10-4 M; morfina + naloxona; morfina ( # P<0,05 versus morfina 10-7 M + naloxona 10-6 M; $ P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak ).

109 94 Emaitzak eta eztabaida LIN, STR, ALH eta BCF parametroak jaitsi zituen modu adierazgarrian (3. eranskinna). κ opioide-hartzailearen agonista (U-50488) eta antagonista (norbinaltorfimina) opioideen eragina mugikortasunean Mugikortasun motak aztertuz, ikus daiteke U-50488ren kontzentrazio altuenak (10-5 M) ez zuela aldaketa adierazgarririk sortu denboran zehar (7.B irudia). Era berean, inkubaketa-denborarik luzeenean (3,5 ordu), U agonistaren kontzentrazio desberdinek ez zuten elkarren arteko ezberdintasun adierazgarririk erakutsi OMEk zehaztutako mugimendu motetan (7.B' irudia). κ opioide-hartzailearen antagonista nor-binaltorfimina 10-4 M-ak ere ez zuen inolako aldaketa adierazgarririk sortu aztertutako kontzentrazio, denbora eta mugimendu motetan (9. irudia). Bestelako parametroetan ere ez zen aldaketarik ikusi (3. eranskina). µ opioide-hartzailearen agonista (morfina) eta antagonista (naloxona) opioideen eragina mugikortasunean Morfina 10-7 M-aren presentziak OMEk zehaztutako mugimendu mota guztietan aldaketa adierazgarriak sortu zituen inkubazioaren hirugarren orduan (inkubazio totalaren 3,5 orduan). Zehazki, a eta b motako espermatozoideen ehunekoa jaitsi eta c eta d motako espermatozoideena handitu zen (7.D irudia). Erabilitako morfinakontzentrazioen ekintza 3,5 orduko inkubazio-denboran aztertuz, dosiaren menpeko alderantzizko joera ikusi zen. Hau da, kontrolarekin alderatuz, a eta b motako espermatozoideen ehunekoen jaitsiera agerikoena morfina-kontzentrazio txikienean (10-7 M) gertatu zen; era berean, c eta d motako espermatozoideen ehunekoen handipen nabariena morfina-kontzentrazio berdinean (10-7 M) gertatu zen (7.D' irudia). Hala ere, dosiaren menpeko alderantzizko joerak nabariak izan arren, soilik d motako espermatozoideen ehunekoaren handipena izan zen kontrolarekiko ezberdina modu adierazgarrian (44,9 ± 10,7 vs 25,9 ± 4,6; P < 0,05; 7.D' irudia). Dena den, aipagarria da a eta b mugikortasunak batuz gero (mugikor progresiboak) morfina 10-7 M-ak sortutako a+b motako espermatozoideen ehunekoen jaitsiera era adierazgarrian desberdina izan zela, kontrolarekin alderatuta, (27,1 ± 9,3 vs 45,8 ± 6,7; P < 0,05; 7.D' irudia).

110 Emaitzak eta eztabaida 95 Morfina 10-7 M-ak mugimenduan sortutako aldaketa horiek, µ opioide-hartzailearen antagonista den naloxonak (10-4 M) saihestu zituen, inkubaketa-denborarik luzeenean (3,5 ordu) (10. A, B, D eta E irudiak). Alde batetik, d motako espermatozoideen ehunekoaren handipena ekidin zuen (44,9 ± 10,7 vs 25,7 ± 3,4; P < 0,05; 10. D eta D irudiak); bestetik, a zein b motako espermatozoideen ehunekoaren jaitsiera ere saihestu zuen (a motarako: 4,6 ± 1,9 vs 13,8 ± 2,9; P < 0,05; 10.A eta A irudiak. b motarako: 22,5 ± 7,9 vs 36,4 ± 7,1; P = 0,07; 10.B eta B irudiak). Kasu horretan ere, naloxonak (10-4 M) era nabariagoan saihestu zuen espermatozoide progresiboen baturaren (a+b) ehunekoaren jaitsiera (27,1 ± 9,6 vs 50,3 ± 6,5; P < 0,05; 10.E eta E irudiak). Morfinak (10-7 M) VCL, VSL eta VAP parametroak jaitsi zituen, eta naloxonak (10-4 M) efektu hori lehengoratu zuen. Bestalde, ibilbidearekin zerikusia duten parametroak ez ziren aldatu morfinarekin (3. eranskina). Emaitzen eztabaida hasteko, gogoratuko dugu argitaratu diren hainbat ikerketatan efektu kontraesankorrak deskribatu izan direla entzefalina edo haren analogoek [oro har, µ-hartzailearekin alderaturik δ-hartzailearekiko afinitate handiagoa duten peptido opioideak (Leslie, 1987)] espermatozoideen funtzioan duten eragina aztertzean. Lan horien arabera, entzefalina-dosi altuak espermatozoideen mugikortasuna jaisten bazuen ere (Sastry eta lank., 1991; Foresta eta lank., 1985), mugikortasuna mantentzeko, peptido horren dosi txikia behar zen (Fujisawa eta lank., 1996). Gure emaitzek, hein batean, paradoxa hori azaldu dezakete. Alde batetik, egia izan daiteke entzefalina-kontzentrazio minimo bat beharrezkoa izatea mugimendua mantentzeko (Fujisawa eta lank., 1996), zeren eta, gure esperimentuetan, naltrindolak (10-4 M) espermatozoideen mugikortasunaren jaitsiera eragin zuen eta, agian, naltrindolak δ-hartzaileari lotuta zeuden barne-entzefalinak desplazatu zituelako gertatu zen jaitsiera hori. Bestalde, litekeena da, halaber, entzefalina-kontzentrazio altua erabiltzean mugikortasunaren inhibizioa gertatzea (Sastry eta lank., 1991; Foresta eta lank., 1985) baina, beharbada, inhibizio hori ez dago δ-hartzaileei lotua, zeren eta, nahiz eta entzefalinen selektibotasuna δ > µ izan, barne-peptido horiek δ- zein µ-hartzaileei lot baitaitezke (Jordan eta lank., 2000). Beraz, entzefalina-kontzentrazio batetik aurrera, µ opioide-hartzailera lotzen hasiko ziren eta, gure emaitzen arabera, badakigu µ opioide-hartzailearen aktibazioak mugikortasunaren jaitsiera dakarrela. Bukatzeko, gure

111 96 Emaitzak eta eztabaida emaitzetan ikusi dugu guk erabilitako δ-antagonistak (DPDPE) ez zituela sortu beste lanetan deskribatutako entzefalinaren efektuak. Horren zergatia izan daiteke, DPDPEa, δ-hartzailearekiko oso espezifikoa denez (Ki = 1,4 nm / Kd = 19 nm), kontzentrazio altuagoak behar izatea (Ki > nm / Kd > 3000 nm) µ-hartzailearen bidez efektua sortzeko (Hunter eta lank., 1990; Fukuda eta lank., 1995). µ opioide-hartzailearekin jarraituz, ikusi dugu µ opioide-hartzailearen agonistak (morfina, 10-7 M) espermatozoide geldien kopurua igo zuela eta antagonistak (naloxona), berriz, ekintza hori saihestu zuela. Emaitza hori bat dator giza eta zaldiespermatozoideekin egindako inkubazioekin. Bi lan horietan, espermatozoideak µ- opioide-hartzailearen beste agonista batekin (β-endorfina) eta guk erabilitako antagonista berdinarekin (naloxona) inkubatu ziren. Horietako lan batean, agonistarekin 5 minutuko inkubazioa egin eta gero, mugikortasunaren dosiaren menpeko jaitsiera ikusi zuten, baina naloxonak ez zuen efektua ekidin (Fraioli eta lank., 1984). Beste lanean, β-endorfinarekin 24 orduko inkubazioa egin eta gero, mugikortasunaren dosiaren menpeko inhibizioa ikusi zuten eta naloxonak (10-8 M) ekintza hori ekidin zuen. Gainera, azken lan horretan, naloxonarekin bakarrik inkubatzean, ikusi zuten espermatozoideek mugikortasunari eusten ziotela (Mari eta lank., 2005). Zaldi-espermatozoideekin egindako beste lan batean, bost orduz inkubatu eta gero, naloxona 10-8 M-ak mugikortasun progresiboan eragin positiboa zuen; naloxona 10-3 M- ak, berriz, ekintza negatiboa sortu zuen (Albrizio, 2005). Naloxonak µ opioidehartzaileekiko afinitate handiagoa dauka δ-hartzaileekiko baino (Leslie, 1987; Chacrabarti, 1997). Beraz, naloxona-kontzentrazio txikiak, µ opioide-hartzailearen antagonizazioaren bidez, mugikortasunean lagunduko du; naloxona-kontzentrazio altua, aldiz, δ-hartzaileen estekatzaileak ere desplazatzen has daiteke eta mugikortasuna inhibi dezake (naltrindolaren efektu berdina). Hala eta guztiz ere, gure taldean egindako lanetan eta tesi honetan, naloxona 10-4 M-arekin ez dugu efektu kaltegarririk ikusi mugikortasunean (Subiran, 2007). Bestalde, naloxona-kontzentrazio altuaren (10-4 M) efektu positiboak ere deskribatu dira (Sastry eta lank., 1991). Beraz, argi dago gai eztabaidagarria dela oraindik. Jakingarria da nola daitekeen µ opioide-hartzailearen agonistek, β-endorfinak [10-9 M eta 10-8 M (Mari eta lank., 2005)] eta morfinak (10-7 M) espermatozoideen

112 Emaitzak eta eztabaida 97 mugikortasunean efektu negatiboa sortzea eta kontzentrazio handiagoetan (morfina 10-6 M eta 10-5 M) efektu adierazgarririk ez sortzea. Alde horretatik, litekeena da 10-7 M baino kontzentrazio altuagoetan morfina µ opioide-hartzaileari (Ki = 1,4 nm / Kd ~ 23 nm) zein δ opioide-hartzaileari (Ki > 1000 / Kd ~ 390 nm) lotzea (Satoh eta lank., 1995; Fukuda eta lank., 1995) eta, horren ondorioz, δ-efektua sorraraztea, zeinak, ikusi dugunaren arabera, espermatozoideen mugikortasuna manten baitzezakeen. Dena den, heroinazaleen (µ-agonista) patologia espermatiko nagusia mugikortasunaren jaitsiera izatea bat dator guk aurkitutako morfinaren efektu negatiboarekin. Beraz, opiazeozale gizonezkoen artean atzemandako hazi-kalitate eskasa eta ugalkortasunik eza ez zen izango soilik hipotalamoan (Stansfield eta Cunningam, 1987; Fabbri eta lank., 1989; Giri eta Kaufman, 1994) eta guruin pituitarioan (Kalra eta lank., 1988) sortutako efektuengatik; aitzitik, espermatozoideen opioide-hartzaileen bidez zuzenean eragindako ekintza ere izango zen. κ opioide-hartzailearen agonistak zein antagonistak espermatozoideen mugikortasunean efektu adierazgarririk sortu ez zuten arren, hartzaile hori espermatozoideen hainbat aldetan agertu izanak iradokitzen du mugikortasuna ez den beste eginkizunen bat eduki lezakeela. Beraz, laburbilduz: hiru hartzaileek erakutsi duten elkarren arteko banaketa desberdina izateak, batetik, eta agonista- zein antagonista-dosi bakoitzak espermatozoideen mugikortasunean ekintza bat baino gehiago sortu izanak, bestetik, aditzera ematen digute ezen, benetan, hartzaile bakoitzak funtzio espezifiko desberdinak bete ditzaketela. Izan ere, espermatozoideek hain egitura eta funtzio polarizatua dutenez, seinaleztapen-sistema bakoitza beharrezkoa den zelularen alde espezifikoan kokatuko da (Aquila eta lank., 2004; Turner, 2006). CASAk neurtutako bestelako parametroei begiratuta, esan dezakegu µ-hartzailearen aktibazioak espermatozoideen abiaduran eragiten duela baina ibilbideak edo higidura motak ez dituela aldatzen eta δ-hartzailearen inaktibazioak (antagonistarekin), aldiz, espermatozoideen abiaduraren eta ibilbideen aldaketa sortzen duela.

113 98 Emaitzak eta eztabaida 3.2 Agonista eta antagonista kannabinoideen eragina espermatozoideen mugikortasunean CB 1 kannabinoide-hartzailearen agonista (ACEA) eta antagonista (SR A) kannabinoideen eragina mugikortasunean ACEAk, CB 1 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, denboraren eta dosiaren menpeko eran jaitsi zuen a motako espermatozoideen ehunekoa (11.A eta B irudiak), eta, ondorioz, d motakoen ehunekoa igo zuen. (11.A eta B irudiak). A eta D motako mugikortasunetan aurkitutako diferentziak inkubazioaren 2. orduan (11.A irudia) eta 10-5 M-eko kontzentrazioan (11.B irudia) adierazgarriak izan ziren. b eta c motako mugikortasunen ehunekoek ez zuten aldaketa adierazgarririk jasan inkubazio denboran zehar, ezta erabilitako ACEA-dosiekin ere (11.A eta B irudiak). Gure esperimentuetan ACEAk sortutako espermatozoide ez-mugikorren ehunekoaren igoerak hainbat lanetan CB 1 hartzaileari egotzitako zeregin inhibitzailea baieztatuko luke (Schuell and Burkman, 2005) zeren eta, ACEA oso selektiboa baita CB 1 hartzailearekiko (Howlett, 2002). Bestalde, nahiz eta denboran zehar SR a CB 1 antagonistaren kontzentrazio altuenak (10-5 M) b, c eta d mugikortasunetan aldaketa adierazgarririk ez zuen eragin (12.B', C' eta D' irudiak), a motako mugimenduan eragin negatiboa sortu zuen (12.A' irudia). Eta SR a, ACEArekin batera inkubatzean, ACEAren efektu negatiboa saihestu beharrean, a, b eta d motako mugikortasunetan dosiaren menpeko eran indartu zuen efektu hori (12.A, B eta E irudiak). Aurretik publikatutako beste lan batzuetan, anandamida (AEA) eta SR141716arekin egindako inkubaketetan, AEAk efektu inhibitzailea sortu zuen eta SR ak ez zuen eraginik sortu espermatozoideen mugikortasunean. Gainera, biak batera inkubatzean, SR ak AEAren efektua saihestu zuen (Rossato, 2005; Cobellis, 2005). Lehen komentatu dugun bezala, gure lanean SR ak ez du ACEAren eragina ekidin, eta horrek azalpen bat izan behar du. Zenbait ehunetan egindako CB 1 hartzailearekiko afinitate-azterketetan, hauxe ondorioztatu da: (1) ACEA CB 1 - selektiboa da eta, CB 1 hartzailearekiko, SR a antagonista baino afinitate

114 Emaitzak eta eztabaida 99 A B Mugikortasuna (%) ACEA 10-5 M a c b d * * $ * Mugikortasuna (%) # Kontrola ACEA 10-7 M ACEA 10-6 M ACEA 10-5 M $ a b c d Denbora (orduak) Mugikortasun mota (OME) D Mugikortasuna (%) JWH M a c b d * * * * E Mugikortasuna (%) $ # # Kontrola JWH M JWH M JWH M # Denbora (orduak) 0 a b c d Mugikortasun mota (OME) 11. irudia: Kannabinoide-hartzaileen agonista eta antagonista kannabinoideen eragina giza espermatozoideen mugikortasunean. A) ACEA 10-5 M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus 0 ordu; $ P<0,05 versus 0 eta 0,5 orduak). B) ACEAren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 2 orduko inkubazioa eta gero ( # P<0,05 versus kontrola eta ACEA 10-7 M; $ P<0,05 versus mugikortasun mota horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak). D) JWH M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus 0 ordu). E) JWH-015aren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 2 orduko inkubazioa eta gero ( # P<0,05 versus kontrola; $ P<0,05 versus mugikortasun mota horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak). handiagoa du (Howlett, 2002). (2) AEA CB 1 /CB 2 -selektiboa da, eta, CB 1 hartzailearekiko, SR a baino afinitate txikiagoa du (Howlett, 2002).

115 100 Emaitzak eta eztabaida A 50 A 40 # a mota (%) Denbora (orduak) * * a mota (%) # Kontzentrazioa (M) $ # B B b mota (%) * * b mota (%) & Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) C 25 C c mota (%) c mota (%) 10 5 D Denbora (orduak) D Kontzentrazioa (M) # * $ d mota (%) * d mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) 12. irudia: CB 1 kannabinoide-hartzailearen agonistaren (ACEA) eta antagonistaren (SR141716a) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola SR M; ACEA 10-5 M + SR141716a 10-5 M; ACEA 10-5 M (*P<0,05 versus 0 ordu). A, B, C eta D ) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna kontzentrazio aldakorrekin eta 2 orduko inkubazioa eta gero (SR141716aren eta ACEAren kontzentrazio ekimolekularrak erabili ziren). Kontrola; SR141716a; ACEA + SR141716a; ACEA ( # P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak; $ P<0,05 versus kontrola eta ACEA 10-5 M + SR141716a 10-5 M; & P<0,05 versus kontrola eta SR141716a 10-5 M).

116 Emaitzak eta eztabaida 101 Beraz, afinitate horiek kontuan hartuz, erraz uler dezakegu AEA eta SR a erabili duten lanetan (Rossato, 2005; Cobellis, 2005) antagonismoa gertatzea, are gehiago espermatozoideak antagonistarekin preinkubatu ahal izan zituztela kontuan hartzen badugu. Aitzitik, gure lanean, ACEA eta SR a (ekimolekularki) batera inkubatu genituen. Modu horretan, ACEAk CB 1 hartzaileei lotu eta aktibatu ahal izan zituen, baina SR ak CB 1 hartzaileari lotzeko zailtasunak izango zituen eta, hortaz, antagonismoa ez zen gertatu. Dena den, alde batetik, SR aren kontzentrazio altuenak (10-5 M) A mugikortasunean eragindako efektu negatiboak adieraziko lituzke; bestetik, ACEArekin batera inkubatzean sortutako efektu negatibo horren indarpenak SR aren efektua adieraziko luke. Horren alde, deskribatua izan da SR ak, berak bakarrik, itsas trikuaren ugalkortasunean efektu negatiboa sortzeko ahalmena duela, eta, are gehiago, THCaren efektu negatiboa indartzeko gaitasuna duela (Berdyshev, 1998). CASAk neurtutako bestelako parametroak aztertuz, ikus dezakegu ACEAk (10-5 M) aldaketa sortzen zuela parametro guztietan, ibilbidearekin zerikusia zutenekin izan ezik (LIN, STR eta WOB). Dena den, SR a ACEArekin batera inkubatzean, aurrean ikusi dugun eragin indartzaile berdina eduki zuen parametro horietan guztietan, (3.eranskina). Beraz, badirudi CB 1 hartzailearen aktibazioak, batez ere, espermatozoideen abiaduran eragiten duela. CB 2 kannabinoide-hartzailearen agonista (JWH-015) eta antagonista (SR144528) kannabinoideen eragina mugikortasunean JWH-015, CB 2 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, denboraren eta dosiaren menpeko eran jaitsi zuen a motako espermatozoideen ehunekoa (11.D eta E irudiak), eta b motakoen ehunekoa igo zuen. (11.D eta E irudiak). a eta b motako mugikortasunetan aurkitutako alde horiek adierazgarriak izan ziren inkubazioaren 2. orduan (11.D irudia) eta 10-5 M-eko kontzentrazioan (11.E irudia). c eta d motako mugikortasunen ehunekoek ez zuten aldaketarik jasan inkubazio-denboran zehar, ezta JWH-015 dosiekin ere (11.D eta E irudiak).

117 102 Emaitzak eta eztabaida A 60 A a mota (%) B Denbora (orduak) * * * # * * a mota (%) B Kontzentrazioa (M) # b mota (%) b mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) C 20 C c mota (%) 10 5 c mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) D 40 D d mota (%) d mota (%) Denbora (orduak) Kontzentrazioa (M) 13. irudia: CB 2 kannabinoide-hartzailearen agonistaren (JWH-015) eta antagonistaren (SR144528) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola SR M; JWH M + SR M; JWH M (*P<0,05 versus 0 ordu). A, B, C eta D ) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna kontzentrazio aldakorrekin eta 2 orduko inkubazioa eta gero (SR144528ren eta JWH- 015aren kontzentrazio ekimolekularrak erabili ziren). Kontrola; SR144528; JWH SR144528; JWH-015 ( # P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak; $ P<0,05 versus kontrola eta JWH M + SR M; & P<0,05 versus kontrola eta SR M).

118 Emaitzak eta eztabaida 103 Baina, JWH-015 CB 2 agonista espezifikoa SR antagonista espezifikoarekin batera inkubatzean, agonistak sorturiko a eta b mugikortasunen ehunekoen aldaketarik ez genuen topatu (13.A' eta B' irudiak), hau da, SR M-ak, agonistak sorturiko eragina ekidin zuen. Gainera, SR antagonistak, bakarrik inkubatuta, ez zuen eraginik sortu denboran zehar (13.A, B, C eta D irudiak), ezta edozein dosi erabilita ere (13. A', B', C' eta D' irudiak). Kasu horretan ere, azpimarratu behar da JWH-015a CB 2 -selektiboa dela eta, CB 2 hartzailearekiko, SR antagonista baino afinitate txikiagoa duela (Howlett, 2002). Beraz, CB 1 zein CB 2 kannabinoide-hartzailearen aktibazioak A motako espermatozoideen galera ekarri zuen. Hala ere, CB 1 agonistak igo egin zuen espermatozoide geldien kopurua, eta CB 2 agonistak, berriz, B motako mugikortasuna handitu zuen. Beraz, laburbilduz: bi hartzaileek erakutsi duten elkarren arteko banaketa desberdinak, batetik, eta agonista bakoitzak espermatozoideen mugikortasunean ekintza desberdina sortu izanak, bestetik, aditzera ematen digute ezen, benetan, hartzaile bakoitzak funtzio espezifiko desberdinak bete ditzaketela. Izan ere, opioide-hartzaileentzat esaten genuen bezala, espermatozoideek hain egitura eta funtzio polarizatua dutenez, seinaleztapensistema bakoitza beharrezkoa den zelularen alde espezifikoan kokatuko da (Aquila eta lank., 2004; Turner, 2006). CASAk neurtutako bestelako parametroei begiratuta, ikus dezakegu JWH-015ak (10-5 M) eragin negatiboa sortu zuela VCL eta BCFn eta ibilbidearekin lotutako LIN, STR eta WOB parametroetan, baina SR ak (10-5 M), modu adierazgarrian, soilik VCL-ko eragina lehengoratu zuen, nahiz eta LIN, STR eta WOB parametroetan, lehengoratzeko joera oso markatua egon (3. eranskina). Hau da, CB 2 hartzaileen aktibazioak, espermatozoideen abiadura lerromakurra jaisteaz gainera, zelula horien ibilbideak erregula ditzake.

119

120 Eztabaida orokorra eta hipotesiak

121

122 Eztabaida orokorra eta hipotesiak 107 Tesi honen helburu orokorra izan da sistema opioide eta kannaboinoideak ugaltzeprozesuko faseetan eduki lezaketen eraginaren inguruko ezagupena handitzea: (1) espermatozoideetan, konposatu horientzako hartzaileen presentzia ba ote dagoen aztertzea eta (2) espermatozoideen mugikortasunean, hartzaile horien eginkizuna zein den jakitea. Jarraian, gaiari buruz dauden eztabaidak berrikusiz, tesian lortutako ondorio nagusiak eztabaidatuko ditugu, eta etorkizunean zabaldu litezkeen lan-lerroak aztertuko ditugu. 1. Garrantzitsua al da opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mrna mantentzea espermatozoide helduetan? Espermatogenesian zehar, espermatozoideek RNA espresatzen dute eta proteinatara itzultzen dute (Boerke eta lank., 2007). Baina, behin espematogenesia bukatua, transkripzioa isildua dute, alde batetik, nukleoko DNA oso paketatua dutelako eta, bestetik, proteinatara itzultzeko makineria galdu dutelako (Miller eta Ostermeier, 2006). Hala ere, ikusi dugu espermatozoide helduetan opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mrna agertzen dela. Eta badirudi espermatozoide helduetan agertzen den RNA espermatogenesian eratutako RNA izan daitekeela baina espermatozoideetan gordeta mantendu dela (Miller eta lank., 2005). Espermatozoide helduetan, δ opioide-hartzailearen mrna ez da agertzen, baina κ-, µ-, CB 1 eta CB 2 hartzaileen mrnak, berriz, agertzen dira. Aldiz, proteinaren azterketa egitean, argi frogatzen da espermatozoide helduetan aztertutako hartzaile guztiak daudela. Horrek adieraziko luke opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mrnak eta proteinak espermatogenesian zehar sortzen direla eta espermatogenesiaren azken faseetan κ-, µ-, CB 1 eta CB 2 hartzaileen mrnak gordeak izan direla baina δ- hartzailearen mrna, ostera, andeatu edo zitoplasmarekin batera desagertu dela. Gainera, ez dirudi zoriz gertatzen den prozesu bat denik, zeren eta erabilitako gizabanako guztietan agertu baita patroi berdina. Wykes-ek eta lankideek (1997) eta Ostermeier-ek eta lankideek (2005), besteak beste, hainbat generekin egindako lanetan, guk aipatutako RNAren andeakuntza edo galera selektiboa deskribatu zuten giza espermatozoideetan. Lan horietan, andeakuntzatik babestuak dauden RNA-populazio egonkorrak existitzen direla ondorioztatu zuten. Beraz, δ opioide-hartzailearen mrna ondorengo faseetan behar ez delako desagertuko litzateke; aldiz, κ-, µ-, CB 1 eta CB 2

123 108 Eztabaida orokorra eta hipotesiak hartzaileen mrnak, betebeharren baterako beharrezkoak izan daitekeenez, espermatozoideetan mantenduko lirateke (Miller eta lank., 2005). Iradoki da espermatozoide helduetan gordeta geratzen den RNA horrek funtzio bat baino gehiago izan ditzakeela: (1) kromatinaren paketatzean lagundu; (2) impronta genomikoan parte hartu (antisense-rna bezala); (3) proteinatara itzuli mitokondrietako polisomen bidez; (4) obozitoaren RNA-erreserbekin batera, zigotoaren aktibazioan lagundu ernalkuntzaren ondoren; eta (5) enbrioiaren patroi espaziala markatu (Miller eta Ostermeier, 2006). Ikuspegi aplikatua: Aurrean aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mrnari dagokionez, interesgarria izan daiteke zenbait gauza ikertzea: - Obozitoetan, opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mrna eta proteinen presentzia azter liteke. Izan ere, deskribatu da obozitoek espresatzen ez dituzten mrna batzuk espermatozoideek pasatzen dizkietela eta, agian, horrek aktibatu dezakeela enbrioiaren garapena (Ostermeier eta lank., 2004). Beraz, garrantzitsuak al dira guk aztertutako hartzaileen mrnak enbrioien garapena aktibatzeko? - Halaber, aztertzekoa litzateke gizonezko batzuen espermatozoide helduetan opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mrna eta proteinen presentzia. Zeren eta, espermatozoideetan gertatzen den mrnaren galera benetan zoriz gertatzen ez bada, hainbat mrna-giltza aztertuz, gizon ugalkor eta ez-ugalkorren mrna profilak sortu ahal izango lirateke (Ostermeier eta lank., 2005). Hortaz, garrantzitsuak al dira guk aztertutako hartzaileen mrnak enbrioia bideragarria izateko? Eta, beraz, garrantzitsuak al dira mrna horiek ugalkortasun-profilak sortzeko? - Aurrean aipatutako mrnaren ideia hori egia bada, agian, horrek jatorri ezezaguneko abortuei buruz zerbait argitu liezaguke.

124 Eztabaida orokorra eta hipotesiak Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen kokalekua: beren funtzioaren adierazle? δ-, κ-, µ-, CB 1 eta CB 2 hartzaileak espermatozoideen isatsean agertzeak mugikortasunean parte hartu behar zutela pentsatzera eraman gintuen. Eta, ikusi dugun bezala, κ opioide-hartzailearentzat susmo hori bete ez den arren, δ-, µ-, CB 1 eta CB 2 hartzaileek parte hartzen dute mugikortasunaren erregulazioan. Horrek baieztatu egingo luke Turner-en berrikuspenean (2006) azaldutakoa; hau da, espermatozoideak oso zelula zatikatuak izanda, proteina bakoitza, funtzio zehatza betetzeko, beharrezkoa den egituran aurkitzen dela. Bestalde, hartzaile bakoitzak kokapen-patroi nagusi bat eduki arren, beti agertzen da espermatozoideen portzentaje bat kokapen-patroi desberdinarekin, agian, espermatozoideen mintz plasmatikoa egoera-funtzional desberdinean aurkitzen delako, baina, oraingoz, baieztapen hori ez dugu frogatu. Ikuspegi aplikatua: Aurrean aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, opioide- eta kannabinoide-hartzaileen kokapenari dagokionez, interesgarria izan daiteke zenbait gauza ikertzea: - Erreakzio akrosomikoan parte hartzen duten proteinek akrosomaren aldean kokatu behar badute (Turner, 2006), δ-, κ-, eta CB 1 hartzaileek, erreakzio akrosomikoan duten parte-hartzea azter liteke. Horrela bada, garrantzitsuak al dira aipatutako hartzaileak erreakzio akrosomikoan? - Obozitoen mintz plasmatikora lotzen diren proteinek espermatozoideen ekuatorean egon behar badute (Solakidi eta lank., 2005; Turner, 2006), µ- eta CB 2 hartzaileek obozitoaren ezagupenean duten parte-hartzea azter liteke. Beraz, garrantzitsuak al dira aipatutako hartzaileak obozitoaren ezagupenean? - Azkenik, interesgarria suerta daiteke hartzaile baten kokapen-patroi desberdinaren arrazoia zehaztea; izan ere, arrazoi fisiologikoa (espermatozoidea aktibazio-egoera desberdinean egoteagatik) edo arrazoi patologikoa (hartzailea

125 110 Eztabaida orokorra eta hipotesiak leku desegokian kokatu delako) izan daiteke. Beraz, garrantzitsua al da hartzaileen kokapena aztertzea, ugalkortasunik eza detektatzeko? 3. Opioide eta kannabinoideek espermatozoideen ugaltze-traktuetan zeharreko bidaia erregulatzen dute? Espermatozoideak testikuluetan sortzen dira, epididimoan heldu egiten dira eta, plasma seminalarekin elkartzean, isuri egiten dira. Isuritako hazi hori baginara heltzen da, eta espermatozoideek igeri egiten dute umetokiaren lepoko mukian gora. Umetokia zeharkatu ostean, umetoki-tronpara sartzen dira, eta anpulura ailegatzen dira. Ibilbide horretan espermatozoideak kapazitatu badira, anpuluan ernalketa gertatuko da (Yanagimachi, 1994). Zeharkatzen duten ingurune bakoitzean, espermatozoideen aktibazio- eta mugikortasun-patroia aldatuz doa espermatozoideek topatzen duten mikroingurune bakoitzaren ezaugarri fisiko-kimikoen arabera (Mortimer, 1997). Oro har, hau onartzen da: plasma seminalean eta umetokian (mikroinguruneak), espermatozoideak egonkortu eta kapazitazio goiztiarra saihestuko duten molekulak egongo dira. Gero, espermatozoideak, modu sekuentzialean, umetoki-tronpako likidoekin, likido folikularrarekin eta granulosako zelulen jariakinekin (mikroinguruneak) kontaktuan jarriko dira (Schuel eta lank., 2002). Leku horietan, kapazitazioaren aurkako molekulen kontzentrazioa jaitsiz joango da (Cross, 1996) eta espermatozoideak erdikapazitazio egoeran geratuko dira. Obulazioa gertatzean, espermatzoideak, pixkanaka-pixkanaka, kapazitatuz joango dira ernalketa gertatu ahal izateko (Mortimer, 1997). Prozesu horretan guztian molekula askok parte hartzen duten arren, opioide eta kannabinoideek ere zerikusia dutela espekula daiteke (Jin eta lank., 1988; Wang eta lank., 2006). Hala, ugaltze-traktuko likidoetan dauden opioide eta kannabinoideen kontzentrazio-gradienteak ikusita, iradoki dezakegu zer eginkizun bete lezaketen. 1. taulan ikus dezakegunez, espermatozoideak, likido seminalean daudenetik emearen ugaltze-traktura heldu arte, gero eta AEA-kontzentrazio baxuagoak aurkitzen ditu, eta horrek ahalbidetuko luke CB 1 hartzailearen bidez inhibituak zeuden kapazitazioa eta mugikortasuna aktibatzea (Maccarrone eta lank., 2005). Gainera, gure datuen arabera,

126 Eztabaida orokorra eta hipotesiak 111 CB 2 hartzailearen bidez inhibitua zegoen mugikortasuna ere aktiba daiteke AEAren kontzentrazio-jaitsiera progresibo horregatik. 1. taula: Kannabinoide eta opioideen kontzentrazioak animalien gorputz-likidoetan; a) Habayeb eta lank., 2004: gizakian; b) Schuel eta lank., 2002: gizakian; d) Fraioli eta lank., 1984: gizakian; e) Sharp eta Pekary, 1980: gizakian; f) Zalata eta lank., 1995: gizakian; g) Petraglia eta lank., 1986: behian. Plasma periferikoa Likido seminala Umetokia (endometrio) Umetokitronpa Likido folikularra AEA (nm) 1,68 ± 0,16 a 0,87 ± 0,09 a - 12,1 ± 2,1 b - 10,7 ± 2,5 b 2,9 ± 0,9 b Met-entzefalina (pm) - 41,3 ± 0,6 d 139,2 ± 8 d 197,5 ± 43,5 g 29,5 ± 10,1 g 471,5 ± 58,1 g β-endorfina (pm) - 2,8 ± 0,4 d 82,5 ± 37 e 12,9 ± 1,2 d 44,4 f 151 ± 37,7 g 39,7 ± 15,5 g 308,5 ± 44,5 g Opioideei dagokienez, alde batetik, gizakien likido seminalean eta umetokiko endometrioan dauden Met-entzefalina eta β-endorfinaren kontzentrazioak odol plasman daudenak baino handiagoak dira eta, bestetik, Met-entzefalinaren kontzentrazioa, β- endorfinarena baino handiagoa da (1. taula). Behietan egindako neurketekin ikus dezakegu, ez dagoela opioideen beheranzko kontzentrazio-gradienterik (kannabinoideetan bezala); izan ere, umetokiko endometrioan eta likido folikularrean baino opioide-kontzentrazio txikiagoa dago umetoki-tronpan (1. taula). Beraz, espermatozoideek, umetoki-tronpara heltzean, opioide-kontzentrazio baxuagoa topatuko dute, eta horrek hainbat eragin sor dezake espermatozoideetan; adibidez, deskribatu da opioideek muskulu leunaren uzkurketa inhibitzen dutela (Kilpatrick eta Rosenthal, 1986); beraz, opioide-kontzentrazioa txikiagoa denez, umetoki-tronpako muskuluaren uzkurketa ez da inhibituko, eta espermatozoideak errazago garraia daitezke. Gainera, µ- hartzailearen aktibazioa jaitsiko da, eta, dauzkagun datuen arabera, mugikortasunaren inhibizioa geldituko da. Baina harrigarria da ikustea likido folikularrean opioidekontzentrazioa berriro igotzen dela (1. taula) eta, gainera, handitu egiten da β- endorfinaren kontzentrazioa, batez ere, obulazioa gertatzen denean (Petraglia eta lank., 1985; Petraglia eta lank., 1987; Facchinetti eta lank., 1988). Beraz, badirudi β-endorfina garrantzitsua dela obozitoaren garapenerako eta obulaziorako (Petraglia eta lank., 1985), baina, obulazioa hastean, likido folikularra askatzen da eta umetoki-tronpara doa (Schuel eta lank., 2002). Beraz, jakin beharko genuke nola eragiten duten opioideek kapazitazioan eta erreakzio akrosomikoan, zeren eta, hala, ugaltze-traktuko opioideen kontzentrazio-aldaketen zergatia ulertuko genuke.

127 112 Eztabaida orokorra eta hipotesiak Ernalketa gertatu eta gero, enbrioia umetokira garraiatu behar da, eta endometrioan ezarriko da (Sadler, 2004). Hilekoaren faseetan eta ernaldian zehar umetokiko endometrioan opioide eta kannabinoideek duten presentzia aztertu dutenean, kontzentrazio-gradientearen patroi aldakorrak topatu dituzte. Alde batetik, fase folikularretik fase luteora bitartean, AEAk odolean duen kontzentrazioa jaisten doa eta FAAHrena handitzen doa (Habayeb eta lank., 2004; Lazzarin eta lank., 2004). Dena den, ez dago argi kontzentrazio periferiko horiek eragina duten ugaltze-traktuko kontzentrazioetan (Schuel eta Burkman., 2005). Baina badirudi umetokiko AEA-tonuak zerikusia eduki lezakeela enbrioiaren ezarpenarekin. Izan ere, ernalduta ez dauden saguen umetokian eta ezargunearen inguruan, AEA-maila altuenak ikusi dira, eta AEA-maila baxuenak, berriz, enbrioiaren ezargunean eta sagu ernalduen umetokian (Schmid eta lank., 1997). Gainera, badirudi enbrioiaren FAAH entzima bidezko mekanismo bat dela (Habayeb eta lank., 2002). Beraz, oro har, AEAkontzentrazio baxuak ezarpenean laguntzen du, baina kontzentrazio altua, ordea, kaltegarria da (Wang eta lank., 2006). Endometrioan opioideen kontzentrazioa fase folikularretik fase luteoa arte igotzen doa (1. taula). Gainera, proentzefalinaren mrnaren espresioa asko igotzen da umetokiko ezargunearen inguruko zeluletan ernalketa aurrera joan ahala, baina, era berean, txikiagoa da proentzefalinaren mrna ezargunearen inguruko aldean ezargunearen aldean baino (Jin eta lank., 1988; Rosen eta lank., 1990). Dena den, β-endorfinaren mrna ez da igotzen, eta ez dakigu mrnaren balioak peptido opioidekin bat datozen. Beraz, oraindik ez dago guztiz argi ezarpenean opioideek duten eginkizuna. Azaldutako guztiarekin, argi geratzen da sistema opioideak eta kannabinoideak parte hartzen dutela ugalkortasunaren hainbat faseren erregulazioan. Ikuspegi aplikatua: Aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, ugaltze-traktuetako hartzaile eta substantzia opioide eta kannabinoideei dagokienez, interesgarria izan daiteke zenbait gauza ikertzea:

128 Eztabaida orokorra eta hipotesiak Emakumezkoen eta gizonezkoen (batez ere, likido seminala) ugaltze-traktuko tonu-opioidea eta tonu-kannabinoidea ugalkortasunik ezarekin erlazionatzen saiatzea. Opioideen kasuan, gutxien ikertutako peptidoak dinorfinatik eratorriak dira, eta, kannabinoideen kasuan, 2AG barne-kannabinoideari buruz ia ez da lanik egin. - Jarraitzeko, opiazeo eta kannabinoideak aisialdi-droga moduan kontsumitzen dutenen ugalkortasun-egoera azter liteke, zeren eta, odolean ez ezik agian ugaltze-traktuan ere, opioide eta kannabinoideen tonu-aldaketak gerta baitaitezke. - Ildo beretik jarraituz, aztertzekoa litzateke opiazeo edo kannabinoideen erabilera klinikoak ugalkortasunean ekar ditzakeen aldaketak. - Azkenik, substantzia opioide eta kannabinoideek hartzaileen bidez eragiten dutenez, ugaltze-traktuetako ehun eta zeluletako opioide- eta kannabinoidehartzaile mota bakoitzaren presentzia eta kopurua azter liteke eta ugalkortasunik ezarekin erlazionatu liteke. Azkenaldian, asko ikertzen ari da kannabinoideek ugaltze-prozesuan duten eginkizuna eta hainbat ikerlari berrikuspen asko egiten ari dira. Aldiz, opioideek ugaltze-prozesuan duten eginkizunaren ikerketa alboratua geratu da, eta ona litzateke 1980ko hamarkadako lanak berreskuratu eta berrikuspen zabala egitea. Hala ere, eta bukatzeko, oso zaila da sistema bakar batek edo bik ugalkortasunik ezaren edo ugalkortasunaren arrakastaren zergatia azaltzea. Nolanahi ere, pauso bat izan liteke sistema horien eginkizunak aztertzea eta konparatzea, ugaltze-prozesuaren orokortasuna ulertzeko.

129

130 Ondorioak

131

132 Ondorioak Espermatozoide helduetan, κ eta µ opioide-hartzaileen mrna agertzen da. Aldiz, δ opioide-hartzailearen mrna ez da agertzen zelula horietan. 2. Espermatozoide helduetan, δ, κ eta µ opioide-hartzaileen proteina dago, eta, isatsean eta tarteko zatian kokatzeaz gainera, espermatozoideen buruan era bereizgarrian kokatzen dira: buruaren aurrealdean, aurrean eta atzealdean eta atzealdean, hurrenez hurren. 3. µ opioide-hartzailearen agonista morfina 10-7 M-ak, 3,5 orduan, modu adierazgarrian jaisten du a+b motako mugikortasuna duten espermatozoideen ehunekoa. Horren ondorioz, handitu egiten da espermatozoide geldien kopurua. Aldiz, µ opioidehartzailearen antagonista naloxona 10-4 M-ak saihestu egiten du efektu hori. 4. δ opioide-hartzailearen agonista DPDPEk ez du eraginik sortzen espermatozoideen denboran zeharreko mugikortasunean. Aitzitik, naltrindol antagonista 10-4 M-ak, ingurunera gehitu eta berehala, a eta b motako espermatozoideen ehunekoak modu adierazgarrian jaisten ditu eta, horren ondorioz, igo egiten da espermatozoide geldien ehunekoa. 5. κ opioide-hartzailearen agonista U-50488ak eta antagonista nor-binaltorfiminak ez dute eraginik sortzen espermatozoideen denboran zeharreko mugikortasunean. 6. Espermatozoide helduetan, CB 1 eta CB 2 kannabinoide-hartzaileen mrna agertzen da. 7. Espermatozoide helduetan, CB 1 eta CB 2 kannabinoide-hartzaileen proteina dago eta, isatsean eta tarteko zatian kokatzeaz gainera, espermatozoideen buruan era bereizgarrian kokatzen dira: CB 1, batez ere, buruaren aurrealdean eta CB 2, batik bat, buruaren atzealdean. 8. ACEAk, CB 1 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, a motako espermatozoideen ehunekoa denboraren eta dosiaren menpe jaisten du, eta, horren ondorioz, espermatozoide geldien ehunekoa igotzen du. Bestalde, CB 1 antagonista SR

133 118 Ondorioak M-ak, ACEArekin batera inkubatzean, agonista horren efektu negatiboa indartzen du. 9. JWH-015ak, CB 2 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, a motako espermatozoideen ehunekoa denboraren eta dosiaren menpe jaisten du, eta, horren ondorioz, b motako espermatozoideen ehunekoa igotzen du. Aldiz, CB 2 antagonista SR ak, JWH-015-arekin batera inkubatzean, saihestu egiten du agonista horren efektua.

134 Bibliografia

135

136 Bibliografia 121 Ahmed M. S., Zhou D. H., Cavinato A. G., Maulik D.: Opioid Binding-Properties of the Purified Kappa-Receptor from Human-Placenta. Life Sciences 1989, 44(13): Aiudi G., Albrizio M., Guaricci A. C., Centoducati G., Minoia P.: Localization of mu, delta, and kappa opioid receptors on Sparus aurata and Dicentrarchus labrax sperm cells. Book of abstracts of the Aquaculture Europe 2004, Barcelona, Spain, 2004, p 102 Albrizio M., Guaricci A. C., Maritato F., Sciorsci R. L., Mari G., Calamita G., Lacalandra G. M., Aiudi G. G., Minoia R., Dell'Aquila M. E., Minoia P.: Expression and subcellular localization of the mu-opioid receptor in equine spermatozoa: evidence for its functional role. Reproduction 2005, 129(1): Albrizio M., Guaricci A. C., Calamita G., Zarrilli A., Minoia P.: Expression and immunolocalization of the mu-opioid receptor in human sperm cells. Fertil Steril 2006, 86(6): Álvarez C.: Análisis integrado de morfología y movilidad espermática humana con el uso del Sperm Class Analyzer. Tesis Doctoral. Servei de publicacions. Universitat de València, València; Ammer H., Schulz R.: Chronic morphine treatment increases stimulatory beta-2 adrenoceptor signaling in A431 cells stably expressing the mu opioid receptor. J Pharmacol Exp Ther 1997, 280(1): Aquila S., Sisci D., Gentile M., Middea E., Catalano S., Carpino A., Rago V., Ando S.: Estrogen receptor (ER)alpha and ER beta are both expressed in human ejaculated spermatozoa: evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-oh kinase/akt pathway. J Clin Endocrinol Metab 2004, 89(3): Arienti G., Carlini E., Verdacchi R., Cosmi E. V., Palmerini C. A.: Prostasome to sperm transfer of CD13/aminopeptidase N (EC ). Biochim Biophys Acta 1997a, 1336(3): Arienti G., Polci A., Carlini E., Palmerini C. A.: Transfer of CD26/dipeptidyl peptidase IV (E.C ) from prostasomes to sperm. FEBS Lett 1997b, 410(2-3): Arvidsson U., Riedl M., Chakrabarti S., Vulchanova L., Lee J. H., Nakano A. H., Lin X. Q., Loh H. H., Law P. Y., Wessendorf M. W., Elde R.: The Kappa-Opioid Receptor Is Primarily Postsynaptic - Combined Immunohistochemical Localization of the Receptor and Endogenous Opioids. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92(11): Ashton J. C., Friberg D., Darlington C. L., Smith P. F.: Expression of the cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum: An immunohistochemical study. Neurosci Lett 2006, 396(2):

137 122 Bibliografia Baccetti B., Burrini A. G., Collodel G., Falugi C., Moretti E., Piomboni P.: Localization of 2 Classes of Acetylcholine Receptor-Like Molecules in Sperms of Different Animal Species. Zygote 1995, 3(3): Baker D., Pryce G., Davies W. L., Hiley C. R.: In silico patent searching reveals a new cannabinoid receptor. Trends Pharmacol Sci 2006, 27(1):1-4. Baldi E., Luconi M., Bonaccorsi L., Forti G.: Signal transduction pathways in human spermatozoa. J Reprod Immunol 2002, 53(1-2): Bandivdekar A. H., Segal S. J., Koide S. S.: Demonstration of Serotonin Receptors in Isolated Spisula Oocyte Membrane. Invertebr Reprod Dev 1991, 19(2): Basuray R., Dejonge C., Zaneveld L. J. D.: Evidence for a Role of Cysteinyl Leukotrienes in Mouse and Human Sperm Function. J Androl 1990, 11(1): Bedford J. M.: Significance of the Need for Sperm Capacitation before Fertilization in Eutherian Mammals. Biol Reprod 1983, 28(1): Begg M., Pacher P., Batkai S., Osei-Hyiaman D., Offertaler L., Mo F. M., Liu H., Kunos G.: Evidence for novel cannabinoid receptors. Pharmacol Therapeut 2005, 106(2): Beltramo M., Stella N., Calignano A., Lin S. Y., Makriyannis A., Piomelli D.: Functional role of high-affinity anandamide transport, as revealed by selective inhibition. Science 1997, 277(5329): Berdyshev E. V.: Inhibition of sea urchin fertilization by fatty acid ethanolamides and cannabinoids. Comp Biochem Phys C 1999, 122(3): Blazquez C., Casanova M. L., Planas A., del Pulgar T. G., Villanueva C., Fernandez-Acenero M. J., Aragones J., Huffman J. W., Jorcano J. L., Guzman M.: Inhibition of tumor angiogenesis by cannabinoids. FASEB J 2003, 17(1): Blazquez C., Carracedo A., Barrado L., Real P. J., Fernandez-Luna J. L., Velasco G., Malumbres M., Guzman M.: Cannabinoid receptors as novel targets for the treatment of melanoma. FASEB J 2006, 20(14): Boerke A., Dieleman S. J., Gadella B. M.: A possible role for sperm RNA in early embryo development. Theriogenology 2007, 68:S147-S155. Bonhaus D. W., Chang L. K., Kwan J., Martin G. R.: Dual activation and inhibition of adenylyl cyclase by cannabinoid receptor agonists: Evidence for agonistspecific trafficking of intracellular responses. J Pharmacol Exp Ther 1998, 287(3): Borner C., Kraus J., Schroder H., Ammer H., Hollt V.: Transcriptional regulation of the human mu-opioid receptor gene by interleukin-6. Mol Pharmacol 2004, 66(6):

138 Bibliografia 123 Borner C., Hollt V., Kraus J.: Cannabinoid receptor type 2 Agonists induce transcription of the mu-opioid receptor gene in Jurkat T cells. Mol Pharmacol 2006, 69(4): Borner C., Hollt V., Sebald W., Kraus J.: Transcriptional regulation of the cannabinoid receptor type 1 gene in T cells by cannabinoids. J Leukocyte Biol 2007, 81(1): Bradford M. M.: Rapid and Sensitive Method for Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 1976, 72(1-2): Browder L. W., Erickson, C. A., Jeffery, W. R.: Developmental Biology, 3. argitalpena. Saunders College Publishing argitaletxea, New York; Brown S. M., Wager-Miller J., Mackie K.: Cloning and molecular characterization of the rat CB2 cannabinoid receptor. Biochim Biophys Acta 2002, 1576(3): Buckley N. E., Hansson S., Harta G., Mezey E.: Expression of the CB1 and CB2 receptor messenger RNAs during embryonic development in the rat. Neuroscience 1998, 82(4): Burkman L. J.: Characterization of Hyperactivated Motility by Human- Spermatozoa During Capacitation - Comparison of Fertile and Oligozoospermic Sperm Populations. Arch Andrology 1984, 13(2-3): Cabral G. A., Harmon K. N., Carlisle S. J.: Cannabinoid-mediated inhibition of inducible nitric oxide production by rat microglial cells: Evidence for CB1 receptor participation. Adv Exp Med Biol 2001, 493: Carracedo A., Gironella M., Lorente M., Garcia S., Guzman M., Velasco G., Iovanna J. L.: Cannabinoids induce apoptosis of pancreatic tumor cells via endoplasmic reticulum stress-related genes. Cancer Research 2006a, 66(13): Carracedo A.: Acción antitumoral de los cannabinoides: implicación de p8 y la vía de estrés de retículo endoplásmico. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid, Madrid; 2006b. Chakrabarti S., Yang W. L., Law P. Y., Loh H. H.: The mu-opioid receptor downregulates differently from the delta-opioid receptor: Requirement of a high affinity receptor G protein complex formation. Mol Pharmacol 1997, 52(1): Chang M. C., Berkery D., Schuel R., Laychock S. G., Zimmerman A. M., Zimmerman S., Schuel H.: Evidence for a cannabinoid receptor in sea urchin sperm and its role in blockade of the acrosome reaction. Mol Reprod Dev 1993, 36(4): Chang K. J., Hazum E., Cuatrecasas P.: Novel Opiate Binding-Sites Selective for Benzomorphan Drugs. P Natl Acad Sci-Biol 1981, 78(7):

139 124 Bibliografia Chen Y., Mestek A., Liu J., Yu L.: Molecular-Cloning of a Rat Kappa-Opioid Receptor Reveals Sequence Similarities to the Mu-Opioid and Delta-Opioid Receptors. Biochem J 1993, 295: Christoffers K. H., Li H., Keenan S. A., Howells R. D.: Purification and mass spectrometric analysis of the mu opioid receptor. Mol Brain Res 2003, 118(1-2): Christoffers K. H., Li H., Howells R. D.: Purification and mass spectrometric analysis of the delta opioid receptor. Mol Brain Res 2005, 136(1-2): Cicero T. J., Meyer E. R., Wiest W. G., Olney J. W., Bell R. D.: Effects of Chronic Morphine Administration on Reproductive-System of Male Rat. J Pharmacol Exp Ther 1975, 192(3): Claude P. A., Wotta D. R., Zhang X. H., Prather P. L., McGinn T. M., Erickson L. J., Loh H. H., Law P. Y.: Mutation of a conserved serine in TM4 of opioid receptors confers full agonistic properties to classical antagonists. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(12): Cobellis G., Cacciola G., Scarpa D., Meccariello R., Chianese R., Franzoni M. F., Mackie K., Pierantoni R., Fasano S.: Endocannabinoid system in frog and rodent testis: type-1 cannabinoid receptor and fatty acid amide hydrolase activity in male germ cells. Biol Reprod 2006, 75(1): Comb M., Seeburg P. H., Adelman J., Eiden L., Herbert E.: Primary Structure of the Human Met-Enkephalin and Leu-Enkephalin Precursor and Its Messenger-Rna. Nature 1982, 295(5851): Corchero J., Romero J., Berrendero F., Fernandez-Ruiz J., Ramos J. A., Fuentes J. A., Manzanares J.: Time-dependent differences of repeated administration with Delta(9)-tetrahydrocannabinol in proenkephalin and cannabinoid receptor gene expression and G-protein activation by mu-opioid and CB1-cannabinoid receptors in the caudate-putamen. Mol Brain Res 1999, 67(1): Cosentino M. J., Cockett A. T.: Structure and function of the epididymis. Urol Res 1986, 14(5): Cota D., Marsicano G., Lutz B., Vicennati V., Stalla G. K., Pasquali R., Pagotto U.: Endogenous cannabinoid system as a modulator of food intake. Int J Obesity 2003, 27(3): Crain S. M., Shen K. F.: Opioids Can Evoke Direct Receptor-Mediated Excitatory Effects on Sensory Neurons. Trends Pharmacol Sci 1990, 11(2): Cravatt B. F., Demarest K., Patricelli M. P., Bracey M. H., Giang D. K., Martin B. R., Lichtman A. H.: Supersensitivity to anandamide and enhanced endogenous cannabinoid signaling in mice lacking fatty acid amide hydrolase. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(16):

140 Bibliografia 125 Cross N. L.: Human seminal plasma prevents sperm from becoming acrosomally responsive to the agonist, progesterone: cholesterol is the major inhibitor. Biol Reprod 1996, 54(1): Croxford J. L., Yamamura T.: Cannabinoids and the immune system: Potential for the treatment of inflammatory diseases? J Neuroimmunol 2005, 166(1-2):3-18. Davidson A., Vermesh M., Paulson R. J., Graczykowski J. W., Lobo R. A.: Presence of immunoreactive beta-endorphin and calcitonin in human seminal plasma, and their relation to sperm physiology. Fertil Steril 1989, 51(5): De Jesus M. L., Salles J., Meana J. J., Callado L. F.: Characterization of CB1 cannabinoid receptor immunoreactivity in postmortem human brain homogenates. Neuroscience 2006, 140(2): de Miguel R., Romero J., Munoz R. M., Garcia-Gil L., Gonzalez S., Villanua M. A., Makriyannis A., Ramos J. A., Fernandez-Ruiz J. J.: Effects of cannabinoids on prolactin and gonadotrophin secretion: involvement of changes in hypothalamic gamma-aminobutyric acid (GABA) inputs. Biochem Pharmacol 1998, 56(10): Devane W. A., Hanus L., Breuer A., Pertwee R. G., Stevenson L. A., Griffin G., Gibson D., Mandelbaum A., Etinger A., Mechoulam R.: Isolation and Structure of a Brain Constituent That Binds to the Cannabinoid Receptor. Science 1992, 258(5090): Di Carlo G., Izzo A. A.: Cannabinoids for gastrointestinal diseases: potential therapeutic applications. Expert Opin Inv Drug 2003, 12(1): Di Marzo V.: 'Endocannabinoids' and other fatty acid derivatives with cannabimimetic properties: biochemistry and possible physiopathological relevance. Bba-Lipid Lipid Met 1998, 1392(2-3): Dimarzo V., Fontana A., Cadas H., Schinelli S., Cimino G., Schwartz J. C., Piomelli D.: Formation and Inactivation of Endogenous Cannabinoid Anandamide in Central Neurons. Nature 1994, 372(6507): Dinh T. P., Carpenter D., Leslie F. M., Freund T. F., Katona I., Sensi S. L., Kathuria S., Piomelli D.: Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99(16): Dudeck W. R., Fix J. D.: High-Yield (Embryology) 3. argitalpena. Lippincott Williams & Wilkins argitaletxea, Philadelphia; El-Haggar S., El-Ashmawy S., Attia A., Mostafa T., Roaiah M. M. F., Fayez A., Ghazi S., Zohdy W., Roshdy N.: Beta-endorphin in serum and seminal plasma in infertile men. Asian J Androl 2006, 8(6): Elde R., Arvidsson U., Riedl M., Vulchanova L., Lee J. H., Dado R., Nakano A., Chakrabarti S., Zhang X., Loh H. H., Law P. Y., Hokfelt T., Wessendorf M.:

141 126 Bibliografia Distribution of Neuropeptide Receptors - New Views of Peptidergic Neurotransmission Made Possible by Antibodies to Opioid Receptors. Ann Ny Acad Sci 1995, 757: ElSohly M. A., Slade D.: Chemical constituents of marijuana: The complex mixture of natural cannabinoids. Life Sciences 2005, 78(5): Fabbri A., Tsaimorris C. H., Luna S., Fraioli F., Dufau M. L.: Opiate Receptors Are Present in the Rat Testis - Identification and Localization in Sertoli Cells. Endocrinology 1985, 117(6): Fabbri A., Jannini E. A., Gnessi L., Ulisse S., Moretti C., Isidori A.: Neuroendocrine control of male reproductive function. The opioid system as a model of control at multiple sites. J Steroid Biochem 1989, 32(1B): Facchinetti F., Storchi A. R., Petraglia F., Volpe A., Genazzani A. R.: Expression of Proopiomelanocortin-Related Peptides in Human Follicular-Fluid. Peptides 1988, 9(5): Fang L., Knapp R. J., Horvath R., Matsunaga T. O., Haaseth R. C., Hruby V. J., Porreca F., Yamamura H. I.: Characterization of [H-3] Naltrindole Binding to Delta- Opioid Receptors in Mouse-Brain and Mouse Vas-Deferens - Evidence for Delta- Opioid Receptor Heterogeneity. J Pharmacol Exp Ther 1994, 268(2): Fattore L., Deiana S., Spano S. M., Cossu G., Fadda P., Scherma M., Fratta W.: Endocannabinoid system and opioid addiction: Behavioural aspects. Pharmacol Biochem Be 2005, 81(2): Fernandez D., Valdivia A., Irazusta J., Ochoa C., Casis L.: Peptidase activities in human semen. Peptides 2002, 23(3): Fields A., Same Y.: The stimulatory effect of opioids on cyclic amp production in SK-N-SH cells is mediated by calcium ions. Life Sciences 1997, 61(6): Filppula S., Yaddanapudi S., Mercier R., Xu W., Pavlopoulos S., Makriyannis A.: Purification and mass spectroscopic analysis of human CB2 cannabinoid receptor expressed in the baculovirus system. J Pept Res 2004, 64(6): Flesch F. M., Colenbrander B., van Golde L. M., Gadella B. M.: Capacitation induces tyrosine phosphorylation of proteins in the boar sperm plasma membrane. Biochem Biophys Res Commun 1999, 262(3): Flesch F. M., Gadella B. M.: Dynamics of the mammalian sperm plasma membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta 2000, 1469(3): Florez J.: Farmacología humana, 3. argitalpena, Masson argitaletxea. Barcelona; 1998.

142 Bibliografia 127 Focarelli R., Giuffrida A., Capparelli S., Scibona M., Fabris F. M., Francavilla F., Francavilla S., Giovampaola C. D., Rosati F.: Specific localization in the equatorial region of gp20, a 20 kda sialylglycoprotein of the capacitated human spermatozoon acquired during epididymal transit which is necessary to penetrate zona-free hamster eggs. Mol Hum Reprod 1998, 4(2): Foresta C., Tramarin A., Scandellari C., Arslan P.: Effects of a met-enkephalin analogue on motility, O2 consumption, and ATP content of human spermatozoa. Arch Androl 1985, 14(2-3): Foresta C., Caretto A., Indino M., Betterle C., Scandellari C.: Localization of metenkephalin on human spermatozoa and evidence for its physiological role. Arch Androl 1986, 17(1): Fraioli F., Fabbri A., Gnessi L., Silvestroni L., Moretti C., Redi F., Isidori A.: Betaendorphin, Met-enkephalin, and calcitonin in human semen: evidence for a possible role in human sperm motility. Ann N Y Acad Sci 1984, 438: Fraser L. R., Adeoya-Osiguwa S.: Modulation of adenylyl cyclase by FPP and adenosine involves stimulatory and inhibitory adenosine receptors and G proteins. Mol Reprod Dev 1999, 53(4): Fujisawa M., Kanzaki M., Okada H., Arakawa S., Kamidono S.: Metenkephalin in seminal plasma of infertile men. Int J Urol 1996, 3(4): Fukuda K., Kato S., Mori K.: Location of Regions of the Opioid Receptor Involved in Selective Agonist Binding. J Biol Chem 1995, 270(12): Galiegue S., Mary S., Marchand J., Dussossoy D., Carriere D., Carayon P., Bouaboula M., Shire D., Le Fur G., Casellas P.: Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations. Eur J Biochem 1995, 232(1): Gammon C. M., Freeman G. M., Xie W. H., Petersen S. L., Wetsel W. C.: Regulation of gonadotropin-releasing hormone secretion by cannabinoids. Endocrinology 2005, 146(10): Gaoni Y., Mechoulam R.: Isolation Structure + Partial Synthesis of Active Constituent of Hashish. J Am Chem Soc 1964, 86(8): Gatti J. L., Castella S., Dacheux F., Ecroyd H., Metayer S., Thimon V., Dacheux J. L.: Post-testicular sperm environment and fertility. Anim Reprod Sci 2004, 82-83: Gerendai I.: Modulation of testicular functions by testicular opioid peptides. J Physiol Pharmacol 1991, 42(4): Giang D. K., Cravatt B. F.: Molecular characterization of human and mouse fatty acid amide hydrolases. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(6):

143 128 Bibliografia Giri M., Kaufman J. M.: Opioidergic Modulation of in-vitro Pulsatile Gonadotropin-Releasing-Hormone Release from the Isolated Medial Basal Hypothalamus of the Male Guinea-Pig. Endocrinology 1994, 135(5): Glaser S. T., Abumrad N. A., Fatade F., Kaczocha M., Studholme K. M., Deutsch D. G.: Evidence against the presence of an anandamide transporter. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(7): Goldberg I. E., Rossi G. C., Letchworth S. R., Mathis J. P., Ryan-Moro J., Leventhal L., Su W., Emmel D., Bolan E. A., Pasternak G. W.: Pharmacological characterization of endomorphin-1 and endomorphin-2 in mouse brain. J Pharmacol Exp Ther 1998, 286(2): Golech S. A., McCarron R. M., Chen Y., Bembry J., Lenz F., Mechoulam R., Shohami E., Spatz M.: Human brain endothelium: coexpression and function of vanilloid and endocannabinoid receptors. Mol Brain Res 2004, 132(1): Guyton A.C., Hall J. E.: Tratado de fisiología médica, 9. argitalpena. McGraw-Hill interamericana argitaletxea, Madrid; Gye M. C., Kang H. H., Kang H. J.: Expression of cannabinoid receptor 1 in mouse testes. Arch Androl 2005, 51(3): Habayeb O. M. H., Bell S. C., Konje J. C.: Endogenous cannabinoids: Metabolism and their role in reproduction. Life Sciences 2002, 70(17): Habayeb O. M. H., Taylor A. H., Evans M. D., Cooke M. S., Taylor D. J., Bell S. C., Konje J. C.: Plasma levels of the endocannabinoid anandamide in women - A potential role in pregnancy maintenance and labor? J Clin Endocr Metab 2004, 89(11): Harclerode J.: Endocrine effects of marijuana in the male: preclinical studies. NIDA Res Monogr 1984, 44: Harrison R. A. P.: Capacitation mechanisms, and the role of capacitation as seen in eutherian mammals. Reprod Fert Develop 1996, 8(4): Hembree W., Nahas G., Zeidenberg P.: Oligospermia in Cannabis Smokers. Sem Hop Therapeut 1976, 52(7-8): Herkenham M., Lynn A. B., Little M. D., Johnson M. R., Melvin L. S., Decosta B. R., Rice K. C.: Cannabinoid Receptor Localization in Brain. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87(5): Herrera B., Carracedo A., Diez-Zaera M., Guzman M., Velasco G.: P38 MAPK is involved in CB2 receptor-induced apoptosis of human leukaemia cells. FEBS Lett 2005, 579(22):

144 Bibliografia 129 Herrera B., Carracedo A., Diez-Zaera M., del Pulgar T. G., Guzman M., Velasco G.: The CB2 cannabinoid receptor signals apoptosis via ceramide-dependent activation of the mitochondrial intrinsic pathway. Exp Cell Res 2006, 312(11): Hillard C. J., Edgemond W. S., Jarrahian A., Campbell W. B.: Accumulation of N- arachidonoylethanolamine (anandamide) into cerebellar granule cells occurs via facilitated diffusion. J Neurochem 1997, 69(2): Hillard C. J., Jarrahian A.: Cellular accumulation of anandamide: consensus and controversy. Brit J Pharmacol 2003, 140(5): Hollandmoritz H., Krause W.: Semen Analysis and Fertility Prognosis in Andrological Patients. International J Androl 1992, 15(6): Hong C. Y., Desaintonge D. M. C., Turner P., Fairbairn J. W.: Comparison of the Inhibitory-Action of Delta-9-Tetrahydrocannabinol and Petroleum Spirit Extract of Herbal Cannabis on Human-Sperm Motility. Hum Toxicol 1982, 1(2): Howlett A. C., Barth F., Bonner T. I., Cabral G., Casellas P., Devane W. A., Felder C. C., Herkenham M., Mackie K., Martin B. R., Mechoulam R., Pertwee R. G.: International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol Rev 2002, 54(2): Hughes J., Kosterlitz H. W.: Opioid-Peptides - Introduction. Brit Med Bull 1983, 39(1):1-3. Hunter J. C., Leighton G. E., Meecham K. G., Boyle S. J., Horwell D. C., Rees D. C., Hughes J.: Ci-977, a Novel and Selective Agonist for the Kappa-Opioid Receptor. Brit J Pharmacol 1990, 101(1): Ignotz G. G., Suarez S. S.: Calcium/calmodulin and calmodulin kinase II stimulate hyperactivation in demembranated bovine sperm. Biol Reprod 2005, 73(3): Inaba K.: Molecular architecture of the sperm flagella: Molecules for motility and signaling. Zool Sci 2003, 20(9): Irazusta J., Valdivia A., Fernandez D., Agirregoitia E., Ochoa C., Casis L.: Enkephalin-degrading enzymes in normal and subfertile human semen. J Androl 2004, 25(5): Iversen L. L.: Overview: peptides in the nervous system. Neuropeptides and their peptidases-ean. Turner A. J. Ellis Horwood Ltd. argitaletxea, Chichester; Jenab S., Morris P. L.: Interleukin-6 regulation of kappa opioid receptor gene expression in primary Sertoli cells. Endocrine 2000, 13(1): Jequier A. M., Crich J.: Semen analysis: a practical guide. Blackwell Scientific publications, Oxford; 1986.

145 130 Bibliografia Jin D. F., Muffly K. E., Okulicz W. C., Kilpatrick D. L.: Estrous Cycle-Related and Pregnancy-Related Differences in Expression of the Proenkephalin and Proopiomelanocortin Genes in the Ovary and Uterus. Endocrinology 1988, 122(4): Jordan B., Devi L. A.: Molecular mechanisms of opioid receptor signal transduction. Brit J Anaesth 1998, 81(1): Jordan B. A., Cvejic S., Devi L. A.: Opioids and their complicated receptor complexes. Neuropsychopharmacology 2000, 23(4):S5-S18. Jordan B. A., Trapaidze N., Gomes I., Nivarthi R., Devi L. A.: Oligomerization of opioid receptors with beta(2)-adrenergic receptors: A role in trafficking and mitogenactivated protein kinase activation. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(1): Kakidani H., Furutani Y., Takahashi H., Noda M., Morimoto Y., Hirose T., Asai M., Inayama S., Nakanishi S., Numa S.: Cloning and Sequence-Analysis of Cdna for Porcine Beta-Neo-Endorphin Dynorphin Precursor. Nature 1982, 298(5871): Kalra S. P., Allen L. G., Sahu A., Kalra P. S., Crowley W. R.: Gonadal-Steroids and Neuropeptide-Y Opioid Lhrh Axis - Interactions and Diversities. J Steroid Biochem Mol Biol 1988, 30(1-6): Kaminski N. E., Abood M. E., Kessler F. K., Martin B. R., Schatz A. R.: Identification of a Functionally Relevant Cannabinoid Receptor on Mouse Spleen- Cells That Is Involved in Cannabinoid-Mediated Immune Modulation. Mol Pharmacol 1992, 42(5): Kew D., Muffly K. E., Kilpatrick D. L.: Proenkephalin products are stored in the sperm acrosome and may function in fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87(23): Kilpatrick D. L., Rosenthal J. L.: The Proenkephalin Gene Is Widely Expressed within the Male and Female Reproductive Systems of the Rat and Hamster. Endocrinology 1986, 119(1): Kraemer M., Fillion C., Martin-Pont B., Auger J.: Factors influencing human sperm kinematic measurements by the Celltrak computer-assisted sperm analysis system. Hum Reprod 1998, 13(3): Kraus J., Borner C., Giannini E., Hollt V.: The role of nuclear factor kappa B in tumor necrosis factor-regulated transcription of the human mu-opioid receptor gene. Mol Pharmacol 2003, 64(4): Kumar G., Patel D., Naz R. K.: C-Myc Messenger-Rna Is Present in Human Sperm Cells. Cell Mol Biol Res 1993, 39(2): Lauckner J. E., Hille B., Mackie K.: The cannabinoid agonist WIN55,212-2 increases intracellular calcium via CB1 receptor coupling to G(q/11) G proteins. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102(52):

146 Bibliografia 131 Lawrence D. K., Gill E. W.: Effects of Delta1-Tetrahydrocannabinol and Other Cannabinoids on Spin-Labeled Liposomes and Their Relationship to Mechanisms of General Anesthesia. Mol Pharmacol 1975, 11(5): Lee C. Y. G., Ho J., Chow S. N., Yasojima K., Schwab C., McGeer P. L.: Immunoidentification of gonadotropin releasing hormone receptor in human sperm, pituitary and cancer cells. Am J Reprod Immunol 2000, 44(3): Lemaire S., Magnan J., Regoli D.: Rat Vas-Deferens - Specific Bioassay for Endogenous Opioid Peptides. Brit J Pharmacol 1978, 64(3): Leslie F. M.: Methods Used for the Study of Opioid Receptors. Pharmacol Rev 1987, 39(3): Leung D., Saghatelian A., Simon G. M., Cravatt B. F.: Inactivation of N-acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D reveals multiple mechanisms for the biosynthesis of endocannabinoids. Biochemistry 2006, 45(15): Liu J., Gao B., Mirshahi F., Sanyal A. J., Khanolkar A. D., Makriyannis A., Kunos G.: Functional CB1 cannabinoid receptors in human vascular endothelial cells. Biochem J 2000, 346: Lord J. A. H., Waterfield A. A., Hughes J., Kosterlitz H. W.: Endogenous Opioid Peptides - Multiple Agonists and Receptors. Nature 1977, 267(5611): Lorenzo P, Ladero J. M., Leza J. C., Lizasoain I.: Drogodependencias. Panamericana argitaletxea, Madrid; Luconi M., Bonaccorsi L., Maggi N., Pecchioli P., Krausz C., Forti G., Baldi E.: Identification and characterization of functional nongenomic progesterone receptors on human sperm membrane. J Clin Endocr Metab 1998, 83(3): Maccarrone M., Cecconi S., Rossi G., Battista N., Pauselli R., Finazzi-Agro A.: Anandamide activity and degradation are regulated by early postnatal aging and follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells. Endocrinology 2003, 144(1): Maccarrone M., Barboni B., Paradisi A., Bernabo N., Gasperi V., Pistilli M. G., Fezza F., Lucidi P., Mattioli M.: Characterization of the endocannabinoid system in boar spermatozoa and implications for sperm capacitation and acrosome reaction. J Cell Sci 2005, 118(Pt 19): Maccarrone M.: CB(2) receptors in reproduction. Br J Pharmacol Makriyannis A., Tian X. Y., Guo H. X.: How lipophilic cannabinergic ligands reach their receptor sites. Prostag Oth Lipid M 2005, 77(1-4):

147 132 Bibliografia Mansour A., Fox C. A., Thompson R. C., Akil H., Watson S. J.: Mu-Opioid Receptor Messenger-Rna Expression in the Rat Cns - Comparison to Mu-Receptor Binding. Brain Research 1994, 643(1-2): Mari G., Rizzato G., Iacono E., Merlo B., Minoia R., Belluzzi S.: Effects of betaendorphin and naloxone on motility of cooled equine spermatozoa. Anim Reprod Sci 2005, 89(1-4): Marigomez I., Cajaraville M. P.: Zelula. Udako Euskal Unibertsitatea argitaletxea, Bilbo Mato S., Del Olmo E., Pazos A.: Ontogenetic development of cannabinoid receptor expression and signal transduction functionality in the human brain. Eur J Neurosci 2003, 17(9): Matsuda L. A., Lolait S. J., Brownstein M. J., Young A. C., Bonner T. I.: Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cdna. Nature 1990, 346(6284): McPartland J. M.: Phylogenomic and chemotaxonomic analysis of the endocannabinoid system. Brain Res Rev 2004, 45(1): Mechoulam R., Benshabat S., Hanus L., Ligumsky M., Kaminski N. E., Schatz A. R., Gopher A., Almog S., Martin B. R., Compton D. R., Pertwee R. G., Griffin G., Bayewitch M., Barg J., Vogel Z.: Identification of an Endogenous 2-Monoglyceride, Present in Canine Gut, That Binds to Cannabinoid Receptors. Biochem Pharmacol 1995, 50(1): Meizel S., Turner K. O.: Serotonin or Its Agonist 5-Methoxytryptamine Can Stimulate Hamster Sperm Acrosome Reactions in a More Direct Manner Than Catecholamines. J Exp Zool 1983, 226(1): Meizel S.: The sperm, a neuron with a tail: 'neuronal' receptors in mammalian sperm. Biol Rev Camb Philos Soc 2004, 79(4): Meizel S., Son J. H.: Studies of sperm from mutant mice suggesting that two neurotransmitter receptors are important to the zona pellucida-initiated acrosome reaction. Mol Reprod Dev 2005, 72(2): Mejean A., Hawkinson J., Guthapfel R., Goeldner M., Hirth C.: A Photoactivatable Naltrexone Derivative Labels Glycoproteins of Different Molecular-Weight Corresponding to the Mu-Opioid and Kappa-Opioid Receptors. Biochemistry 1992, 31(40): Metcalf M. D., Coop A.: Kappa opioid antagonists: Past successes and future prospects. Aaps J 2005, 7(3):E704-E722. Miller D., Ostermeier G. C., Krawetz S. A.: The controversy, potential and roles of spermatozoal RNA. Trends Mol Med 2005, 11(4):

148 Bibliografia 133 Miller D., Ostermeier G. C.: Towards a better understanding of RNA carriage by ejaculate spermatozoa. Hum Reprod Update 2006, 12(6): Minami M., Satoh M.: Molecular-Biology of the Opioid Receptors - Structures, Functions and Distributions. Neurosci Res 1995, 23(2): Minami M., Nakagawa T., Seki T., Onogi T., Aoki Y., Katao Y., Katsumata S., Satoh M.: A single residue, Lys108, of the delta-opioid receptor prevents the muopioid-selective ligand [D-Ala(2),N-MePhe(4),Gly-ol(5)]enkephalin from binding to the delta-opioid receptor. Mol Pharmacol 1996, 50(5): Minelli A., Miscetti P., Proietti A., Luzi L., Mezzasoma I.: Adenosine-Triphosphate Catabolism in Bovine Spermatozoa. Comp Biochem Phys B 1995, 110(3): Molina-Holgado E., Vela J. M., Arevalo-Martin A., Almazan G., Molina-Holgado F., Borrell J., Guaza C.: Cannabinoids promote oligodendrocyte progenitor survival: Involvement of cannabinoid receptors and phosphatidylinositol-3 kinase/akt signaling. J Neurosci 2002, 22(22): Mollereau C., Parmentier M., Mailleux P., Butour J. L., Moisand C., Chalon P., Caput D., Vassart G., Meunier J. C.: Orl1, a Novel Member of the Opioid Receptor Family - Cloning, Functional Expression and Localization. FEBS Lett 1994, 341(1): Mortimer S. T.: A critical review of the physiological importance and analysis of sperm movement in mammals. Hum Reprod Update 1997, 3(5): Mortimer S. T.: CASA--practical aspects. J Androl 2000, 21(4): Munkelwitz R., Gilbert B. R.: Are boxer shorts really better? A critical analysis of the role of underwear type in male subfertility. J Urol 1998, 160(4): Munro S., Thomas K. L., Abu-Shaar M.: Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature 1993, 365(6441): Nakanishi S., Inoue A., Kita T., Nakamura M., Chang A. C. Y., Cohen S. N., Numa S.: Nucleotide-Sequence of Cloned Cdna for Bovine Corticotropin-Beta-Lipotropin Precursor. Nature 1979, 278(5703): Naz R. K., Sellamuthu R.: Receptors in spermatozoa: Are they real? J Androl 2006, 27(5): Nelson L., Cariello L.: Adrenergic-Stimulation of Sea-Urchin Sperm Cells. Gamete Res 1989, 24(3): Neudeck B. L., Loeb J., Buck J.: Activation of the kappa-opioid receptor in Caco-2 cells decreases interleukin-8 secretion. Eur J Pharmacol 2003, 467(1-3): Nunez E., Benito C., Pazos M. R., Barbachano A., Fajardo O., Gonzalez S., Tolon R. M., Romero J.: Cannabinoid CB2 receptors are expressed by perivascular

149 134 Bibliografia microglial cells in the human brain: An immunohistochemical study. Synapse 2004, 53(4): Osei-Hyiaman D., DePetrillo M., Pacher P., Liu J., Radaeva S., Batkai S., Harvey- White J., Mackie K., Offertaler L., Wang L., Kunos G.: Endocannabinoid activation at hepatic CB1 receptors stimulates fatty acid synthesis and contributes to diet-induced obesity. J Clin Invest 2005, 115(5): Ostermeier G. C., Dix D. J., Miller D., Khatri P., Krawetz S. A.: Spermatozoal RNA profiles of normal fertile men. Lancet 2002, 360(9335): Ostermeier G. C., Miller D., Huntriss J. D., Diamond M. P., Krawetz S. A.: Reproductive biology - Delivering spermatozoan RNA to the oocyte. Nature 2004, 429(6988): Ostermeier C. G., Goodrich R. J., Diamond M. P., Dix D. J., Krawetz S. A.: Toward using stable spermatozoal RNAs for prognostic assessment of male factor fertility. Fertil Steril 2005, 83(6): Peckys D., Landwehrmeyer G. B.: Expression of mu, kappa, and delta opioid receptor messenger RNA in the human CNS: A P-33 in situ hybridization study. Neuroscience 1999, 88(4): Persson A. I., Thorlin T., Eriksson P. S.: Comparison of immunoblotted delta opioid receptor proteins expressed in the adult rat brain and their regulation by growth hormone. Neurosci Res 2005, 52(1):1-9. Pertwee, R.: Cannabinoids, Handbook of Experimental Pharmacology-ean. Springer argitaletxea, Germany; 2005a. Pertwee R. G.: Inverse agonism and neutral antagonism at cannabinoid CBI receptors. Life Sciences 2005b, 76(12): Pessot C. A., Brito M., Figueroa J., Concha I. I., Yanez A., Burzio L. O.: Presence of Rna in the Sperm Nucleus. Biochem Bioph Res Co 1989, 158(1): Petraglia F., Segre A., Facchinetti F., Campanini D., Ruspa M., Genazzani A. R.: Beta-Endorphin and Met-Enkephalin in Peritoneal and Ovarian Follicular Fluids of Fertile and Postmenopausal Women. Fertil Steril 1985, 44(5): Petraglia F., Facchinetti F., Mfuta K., Ruspa M., Bonavera J. J., Gandolfi F., Genazzani A. R.: Endogenous Opioid-Peptides in Uterine Fluid. Fertil Steril 1986, 46(2): Petraglia F., Dimeo G., Storchi R., Segre A., Facchinetti F., Szalay S., Volpe A., Genazzani A. R.: Proopiomelanocortin-Related Peptides and Methionine Enkephalin in Human Follicular-Fluid - Changes During the Menstrual-Cycle. Am J Obstet Gynecol 1987, 157(1):

150 Bibliografia 135 Picatoste F., Sarri E., Claro E.: Proteinas G y sistema adenilil ciclasa. Monografías de Neurociencias (7): Receptores para Neurotransmisores-ean. Ediciones en Neurociencias, J. A. Garcia Sevilla argitaletxea. Barcelona Pilapil C., Welner S., Magnan J., Gauthier S., Quirion R.: Autoradiographic Distribution of Multiple Classes of Opioid Receptor-Binding Sites in Human Forebrain. Brain Res Bull 1987, 19(5): Pol O., Alameda F., Puig M. M.: Inflammation enhances mu-opioid receptor transcription and expression in mice intestine. Mol Pharmacol 2001, 60(5): Ragni G., De Lauretis L., Gambaro V., Di Pietro R., Bestetti O., Recalcati F., Papetti C.: Semen evaluation in heroin and methadone addicts. Acta Eur Fertil 1985, 16(4): Ramos J. A., De Miguel R., Cebeira M., Hernandez M. and Fernandez-Ruiz J.: Exposure to cannabinoids in the development of endogenous cannabinoid system, Neurotox Res 2002, 4(4): Ravina C. G., Seda M., Pinto F. M., Orea A., Fernandez-Sanchez M., Pintado C. O., Candenas M. L.: A role for tachykinins in the regulation of human sperm motility. Hum Reprod 2007, 22(6): Relton J. M., Gee N. S., Matsas R., Turner A. J., Kenny A. J.: Purification of Endopeptidase (Enkephalinase) from Pig Brain by Immunoadsorbent Chromatography. Biochem J 1983, 215(3): Rhoades R. A., Tanner G. A.: Fisiología médica. Masson argitaletxea, Barcelona; Riviere P. J. M.: Peripheral kappa-opioid agonists for visceral pain. Brit J Pharmacol 2004, 141(8): Roques B. P., Noble F., Fournie-Zaluski M. C.: Endogenous opioid peptides and analgesia. Opioids in pain control. Basic and clinical aspects-ean. Stein C. Cambridge University Press argitaletxea, Cambridge; Rosen H., Itin A., Schiff R., Keshet E.: Local-Regulation within the Female Reproductive-System and Upon Embryonic Implantation - Identification of Cells Expressing Proenkephalin-A. Mol Endocrinol 1990, 4(1): Rossato M., Ion Popa F., Ferigo M., Clari G., Foresta C.: Human sperm express cannabinoid receptor Cb1, the activation of which inhibits motility, acrosome reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab 2005, 90(2): Rueda D., Galve-Roperh I., Haro A., Guzman M.: The CB1 cannabinoid receptor is coupled to the activation of c-jun N-terminal kinase. Mol Pharmacol 2000, 58(4):

151 136 Bibliografia Ruiz-Llorente L., Sanchez M. G., Carmena M. J., Prieto J. C., Sanchez-Chapado M., Izquierdo A., Diaz-Laviada I.: Expression of functionally active cannabinoid receptor CB1 in the human prostate gland. Prostate 2003, 54(2): Sadler T. W.: Langman. Embriología médica, 9. argitalpena. Panamericana argitaletxea, Madrid; Sanchez C., Galve-Roperh I., Rueda D., Guzman M.: Involvement of sphingomyelin hydrolysis and the mitogen-activated protein kinase cascade in the Delta(9)-tetrahydrocannabinol-induced stimulation of glucose metabolism in primary astrocytes. Mol Pharmacol 1998, 54(5): Sanchez C., de Ceballos M. L., del Pulgar T. G., Rueda D., Corbacho C., Velasco G., Galve-Roperh I., Huffman J. W., Cajal S. R. Y., Guzman M.: Inhibition of glioma growth in vivo by selective activation of the CB2 cannabinoid receptor. Cancer Research 2001, 61(15): Santen R. J., Sofsky J., Bilic N., Lippert R.: Mechanism of Action of Narcotics in Production of Menstrual Dysfunction in Women. Fertil Steril 1975, 26(6): Sarfaraz S., Afaq F., Adhami V. M., Mukhtar H.: Cannabinoid receptor as a novel target for the treatment of prostate cancer. Cancer Res 2005, 65(5): Sastry B. V., Janson V. E., Owens L. K., Tayeb O. S.: Enkephalin- and substance P-like immunoreactivities of mammalian sperm and accessory sex glands. Biochem Pharmacol 1982, 31(21): Sastry B. V., Janson V. E., Owens L. K.: Significance of substance P- and enkephalin-peptide systems in the male genital tract. Ann N Y Acad Sci 1991, 632: Schaefer M., Hofmann T., Schultz G., Gudermann T.: A new prostaglandin E receptor mediates calcium influx and acrosome reaction in human spermatozoa. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95(6): Schatz A. R., Lee M., Condie R. B., Pulaski J. T., Kaminski N. E.: Cannabinoid receptors CB1 and CB2: A characterization of expression and adenylate cyclase modulation within the immune system. Toxicol Appl Pharm 1997, 142(2): Schmid P. C., Paria B. C., Krebsbach R. J., Schmid H. H. O., Dey S. K.: Changes in anandamide levels in mouse uterus are associated with uterine receptivity for embryo implantation. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(8): Schneider U., Schwenk H. U., Bornkamm G.: Characterization of Ebv-Genome Negative Null and T-Cell Lines Derived from Children with Acute Lymphoblastic Leukemia and Leukemic Transformed Non-Hodgkin Lymphoma. Int J Cancer 1977, 19(5):

152 Bibliografia 137 Schuel H., Chang M. C., Berkery D., Schuel R., Zimmerman A. M., Zimmerman S.: Cannabinoids inhibit fertilization in sea urchins by reducing the fertilizing capacity of sperm. Pharmacol Biochem Behav 1991, 40(3): Schuel H., Goldstein E., Mechoulam R., Zimmerman A. M., Zimmerman S.: Anandamide (arachidonylethanolamide), a brain cannabinoid receptor agonist, reduces sperm fertilizing capacity in sea urchins by inhibiting the acrosome reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91(16): Schuel H., Burkman L. J., Lippes J., Crickard K., Forester E., Piomelli D., Giuffrida A.: N-Acylethanolamines in human reproductive fluids. Chem Phys Lipids 2002, 121(1-2): Schuel H., Burkman L. J.: A tale of two cells: endocannabinoid-signaling regulates functions of neurons and sperm. Biol Reprod 2005, 73(6): Schuel H.: Tuning the oviduct to the anandamide tone. J Clin Invest 2006, 116(8): Shapira M., Vogel Z., Sarne Y.: Opioid and cannabinoid receptors share a common pool of GTP-binding proteins in cotransfected cells, but not in cells which endogenously coexpress the receptors. Cell Mol Neurobiol 2000, 20(3): Sharp B., Pekary A. E., Meyer N. V., Hershman J. M.: Beta-Endorphin in Male- Rat Reproductive-Organs. Biochem Bioph Res Co 1980, 95(2): Sharp B. M., Roy S., Bidlack J. M.: Evidence for opioid receptors on cells involved in host defense and the immune system. J Neuroimmunol 1998, 83(1-2): Shire D., Calandra B., RinaldiCarmona M., Oustric D., Pessegue B., BonninCabanne O., LeFur G., Caput D., Ferrara P.: Molecular cloning, expression and function of the murine CB2 peripheral cannabinoid receptor. Bba-Gene Struct Expr 1996, 1307(2): Siegel G. J., Agranoff B. W., Albers R. W., Molinoff P. B.: Basic neurochemestry. Raven press argitaletxea, New York Simon J., Benyhe S., Hepp J., Khan A., Borsodi A., Szucs M., Medzihradszky K., Wollemann M.: Purification of a Kappa-Opioid Receptor Subtype from Frog Brain. Neuropeptides 1987, 10(1): Simonin F., Befort K., Gaveriauxruff C., Matthes H., Nappey V., Lannes B., Micheletti G., Kieffer B.: Molecular Characterization of the Human Delta-Opioid Receptor. Regul Peptides 1994, 54(1): Skaper S. D., Buriani A., DalToso R., Petrelli L., Romanello S., Facci L., Leon A.: The ALIAmide palmitoylethanolamide and cannabinoids, but not anandamide, are protective in a delayed postglutamate paradigm of excitotoxic death in cerebellar granule neurons. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(9):

153 138 Bibliografia Smith C. G., Asch R. H.: Drug-Abuse and Reproduction. Fertil Steril 1987, 48(3): Snyder S. H.: Drogas y cerebro. Biblioteca Scientific American. Prensa Científica argitaletxea, Barcelona; Solakidi S., Psarra A. M. G., Nikolaropoulos S., Sekeris C. E.: Estrogen receptors alpha and beta (ER alpha and ER beta) and androgen receptor (AR) in human sperm: localization of ER beta and AR in mitochondria of the midpiece. Hum Reprod 2005, 20(12): Stansfield S. C., Cunningham F. J.: Involvement of Opiate Receptor Subtypes in the Modulation of Lhrh Secretion by the Cockerel (Gallus-Domesticus) Mediobasal Hypothalamus Invitro. J Endocrinol 1987, 114(1): Subiran N., Agirregoitia E., Valdivia A., Ochoa C., Casis L., Irazusta J.: Expression of enkephalin-degrading enzymes in human semen and implications for sperm motility. Fertil Steril Sugiura T., Kondo S., Sukagawa A., Tonegawa T., Nakane S., Yamashita A., Waku K.: Enzymatic synthesis of anandamide, an endogenous cannabinoid receptor ligand, through N-acylphosphatidylethanolamine pathway in testis: Involvement of Ca2+dependent transacylase and phosphodiesterase activities (vol 218, pg 113, 1996). Biochem Bioph Res Co 1996, 221(1): Surprenant A., Shen K. Z., North R. A., Tatsumi H.: Inhibition of Calcium Currents by Noradrenaline, Somatostatin and Opioids in Guinea-Pig Submucosal Neurons. J Physiol-London 1990, 431: Tablado L., Perez-Sanchez F., Soler C.: Is sperm motility maturation affected by static magnetic fields? Environ Health Persp 1996, 104(11): Tash J. S.: Protein-Phosphorylation - the 2nd Messenger Signal Transducer of Flagellar Motility. Cell Motil Cytoskel 1989, 14(3): Thorn N. A., Russell J. T.: Torp-Pedersen C., Treiman M.: Calcium and neurosecretion. Ann N Y Acad Sci 1978, 307: Todd A. R.: Hashish. Experientia 1946, 2(2): Turner A. J. Endopeptidase and neuropeptide metabolism. Neuropeptides and their peptidases-ean. Turner A. J., Ellis Horwood Ltd., Chichester; Turner R. M.: Moving to the beat: a review of mammalian sperm motility regulation. Reprod Fertil Dev 2006, 18(1-2): Utleg A. G., Yi E. C., Xie T., Shannon P., White J. T., Goodlett D. R., Hood L., Lin B.: Proteomic analysis of human prostasomes. Prostate 2003, 56(2):

154 Bibliografia 139 Van Sickle M. D., Duncan M., Kingsley P. J., Mouihate A., Urbani P., Mackie K., Stella N., Makriyannis A., Piomelli D., Davison J. S., Marnett L. J., Di Marzo V., Pittman Q. J., Patel K. D., Sharkey K. A.: Identification and functional characterization of brainstem cannabinoid CB2 receptors. Science 2005, 310(5746): Vescovi P. P., Pedrazzoni M., Michelini M., Maninetti L., Bernardelli F., Passeri M.: Chronic Effects of Marijuana Smoking on Luteinizing-Hormone, Follicle- Stimulating-Hormone and Prolactin Levels in Human Males. Drug Alcohol Depen 1992, 30(1): Vigano D., Rubino T., Parolaro D.: Molecular and cellular basis of cannabinoid and opioid interactions. Pharmacol Biochem Be 2005, 81(2): Waksman G., Bouboutou R., Devin J., Bourgoin S., Cesselin F., Hamon M., Fourniezaluski M. C., Roques B. P.: Invitro and Invivo Effects of Kelatorphan on Enkephalin Metabolism in Rodent Brain. Eur J Pharmacol 1985, 117(2): Waldhoer M., Bartlett S. E., Whistler J. L.: Opioid receptors. Annu Rev Biochem 2004, 73: Wang D., King S. M., Quill T. A., Doolittle L. K., Garbers D. L.: A new spermspecific Na+/H+ Exchanger required for sperm motility and fertility. Nat Cell Biol 2003, 5(12): Wang H., Dey S. K., Maccarrone M.: Jekyll and hyde: two faces of cannabinoid signaling in male and female fertility. Endocr Rev 2006, 27(5): Wen X. H., Yang Z. W.: Quantitative (stereological) study on the spermatozoal storage capacity of epididymis in rats and monkeys. Asian J Androl 2000, 2(1): Wenger T., Ledent C., Csernus V., Gerendai I.: The central cannabinoid receptor inactivation suppresses endocrine reproductive functions. Biochem Biophys Res Commun 2001, 284(2): World Health Organization: Collection and examination of human semen. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 4. argitalpenean. Cambridge University Press argitaletxea, Cambridge; Wick M. J., Minnerath S. R., Lin X. Q., Elde R., Law P. Y., Loh H. H.: Isolation of a Novel Cdna-Encoding a Putative Membrane-Receptor with High Homology to the Cloned Mu-Opioid, Delta-Opioid, and Kappa-Opioid Receptors. Mol Brain Res 1994, 27(1): Williams N., Clouet D. H.: The Effect of Acute Opioid Administration on the Phosphorylation of Rat Striatal Synaptic Membrane-Proteins. J Pharmacol Exp Ther 1982, 220(2):

155 140 Bibliografia Wittert G., Hope P., Pyle D.: Tissue distribution of opioid receptor gene expression in the rat. Biochem Bioph Res Co 1996, 218(3): Wykes S. M., Visscher D. W., Krawetz S. A.: Haploid transcripts persist in mature human spermatozoa. Mol Hum Reprod 1997, 3(1): Xu W., Filppula S. A., Mercier R., Yaddanapudi S., Pavlopoulos S., Cai J., Pierce W. M., Makriyannis A.: Purification and mass spectroscopic analysis of human CB1 cannabinoid receptor functionally expressed using the baculovirus system. J Pept Res 2005, 66(3): Yanagimachi R.: Mammalian fertilization. The Physiology of reproduction 2. argitalpenean. Raven Press Ltd, New York argitaletxea; Zalata A., Hafez T., VanHoecke M. J., Comhaire F.: Evaluation of beta-endorphin and interleukin-6 in seminal plasma of patients with certain andrological diseases. Hum Reprod 1995, 10(12): Zorgniotti A. W., Sealfon A. I., Toth A.: Chronic scrotal hypothermia as a treatment for poor semen quality. Lancet 1980, 1(8174): Zygmunt P. M., Petersson J., Andersson D. A., Chuang H. H., Sorgard M., Di Marzo V., Julius D., Hogestatt E. D.: Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature 1999, 400(6743):

156 Eranskinak

157

158 Eranskinak ERANSKINA PCRan anplifikatutako anplikoien sekuentziazioa 1. Helburua: Opioide-hartzaileentzako RT-PCRan lortutako datuak egiaztatzea. 2. Oinarria RT-PCRa egin eta gero lortutako anplikoien sekuentzia jakinda, baiezta dezakegu agarosako geletan ikusitako bandak benetan guk pentsatzen ditugun sekuentziak dauzkatela. Sekuentziazioa egiteko, lehenik eta behin, PCRtik lortutako produktuak araztu behar dira kit bat erabilita (High pure PCR product purification kit, Roche) eta, gero, araztutakoa sekuentziazten da. Lortutako sekuentziazio-emaitzak NCBI-BLAST datubaseko ( mrna guztiekin konparatzen dira. Hala baieztatu dugu PCRtik lortutako produktuaren sekuentzia ea bat ote datorren bilatzen ari garen mrnarekin. 3. Protokoloa 100 µl PCR Binding buffer 500 µl gehitu Ondo nahastu eta High Pure tutu filtrodunetara pasa, zentrifugatu g / 1 min Iragazitako likidoa baztertu Zentrifugatu g / 1 min Wash buffer 500 µl gehitu Iragazitako likidoa baztertu Iragazitako likidoa baztertu Zentrifugatu g / 1 min Zentrifugatu g / 1 min Wash buffer 200 µl gehitu Elution buffer 500 µl gehitu PCR produktua araztua 2. irudia: PCRaren produktua arazteko prozeduraren eskema.

159 144 Eranskinak Araztutako parte bat % 1,5-2ko agarosako gel batean korriarazten da (putzuko, araztutako 5 µl + 1µl karga-buffer), arazketa ondo egin dela baieztatzeko. Beste partea sekuentziazio-zerbitzura eramaten da. 4. Emaitzak eta eztabaida Emaitzen arabera, PCRtik lortutako produktuaren sekuentzia bat dator datu-basetako κ eta µ opioide-hartzaileen mrnarekin. hkor 5 TAATATTTACCTGGCTTTGGCAGATGCTTTAGTTACTACAACCATGCCCTTTCAGAGTACGGTCTACTTGATGAATTCC TGGCCTTTTGGGGATGTGCTGTGCAAGATAGTAATTTCCATTGATTACTACAACATGTTCACCAGCATCTTCACCTTGACC ATGATGAGNGTGGACCGCTACATTGCCGTGTGCCACCCCGTGAAGGCTTTGGACTTCCGCACACCCTTGAAGGCAAAGATC ATCAATATCTGCATCTGGCTGCTGTCGTCATCTGTTGGCATCTCTGCAATAGTCCTTGGAGGCACCAAAGGTCAGGGAA 3 hmor 5 CGTCTCGAGGTGAATTACCTAATGGGAACATGGCCATTTGGAACCATCCTTTGCAAGATAGTGATCTCCATAGATTACT ATAACATGTTCACCAGCATATTCACCCTCTGCACCATGAGTGTTGATCGATACATTGCAGTCTGCCACCCTGTCAAGGCCT TAGATTTCCGTACTCCCCGAAATGCCAAAATTATCAATGTCTGCAACTGGATCCTCTCTTCAGCCATTGGTCTTCCTGTAA TGTTCATGGCTACAACAAAATACAGGCAAGGTTCCATAGATTGTACACTAACATTCTCTCATCCAACCTGGTACTGGGAAA ACCTGCTGAAGATCTGTGTTTTCATCTTCGCCTTCATTATGCCAGTGCTCATCATTACCGTGTGCTATGGACTGATGATCT TGCGCCTCA 3 3. irudia: κ (hkor) eta µ opioide-hartzaileentzako (hmor) RT-PCRaren produktuen sekuentziak giza espermatozoideetan. hkor anplikoiaren sekuentzia NCBI-BLAST datubaseko BC , Homo sapiens-aren Kappa 1 opioide-hartzailearen mrnarekin bat dator. hmor anplikoiaren sekuentzia NCBI-BLAST datu-baseko NM_ , Homo sapiensaren mu 1 opioide-hartzailearen MOR-1X transkriptoaren mrna-rekin bat dator.

160 Eranskinak ERANSKINA Denbora errealean egindako PCR kuantitatiboa (qrt-pcr) 1. Helburua: Opioide-hartzaileentzako RT-PCRan lortutako datuak balioztatzea. 2. Oinarria Roche-ren Universal Probe Library sistema denbora errealean egindako Taqman-PCR sistema klasikoan oinarritzen da, baina hiru primer erabiltzen dira. Horietako bi primer ohiko PCRa egiteko kontzeptua erabiliz diseinatzen dira (forward eta reverse primerak). Hirugarren primer-ak talde fluoreszentea du, eta anplifikaziora gehitzen denean (sortzen ari den anplikoira gehitzean), emisio fluoreszentea handitzen du (primer horrek aldaketa kimikoak ditu, eta, polimerasak primer-aren muturretan nukleotidoak gehitzen dituenean, fluoreszentzia igortzen da). Sistema honek anplifikazioaren espezifizitatea areagotzen du (hiru primer erabiltzeagatik) eta DNA-harizpi bikoitz ez-espezifikoen detekzioa baztertzen ditu, fluoreszentzia primer bati lotua dagoelako. Termozikladore espezifiko batekin, anplifikazio-ziklo bakoitzean, fluoreszentzia jaso eta kuantifikatu egiten da. Hala, zikloz ziklo lorturiko fluoreszentziaren datuak irudikatuz bilatzen dugun mrna anplifikatzen bada, fluoreszentziaren portaera sigmoideoa lortuko dugu. Anplifikazio-kurbaren alde lineala analizatzeko, mozte-marra bat egiten da erreakzio guztietarako; hala, laginen arteko anplifikazio-zikloen desberdintasunak analiza daitezke. Datu horiekin, erreferentzia-lagin bat hartuta, lagin bakoitzaren espresio-datu erlatiboak lor daitezke. 3. Protokoloa a) cdna Transcriptor kit (Roche) erabiliz sortu zen. b) Introien artean sortutako primer-ak Roche Universal Probe Library metodoaz sortu ziren ( Primer bikote hauek erabili ziren: - Giza δ opioide-hartzailerako (f) primer: 5 -ttgtcatgttcggcatcg-3 (r) primer: 5 -aaggccaggttgaagatgtaga-3 Probe: Human #49

161 146 Eranskinak - Giza κ opioide-hartzailerako (f) primer: 5 -ccttgaaggcaaagatcatca-3 (r) primer: 5 -tgcaaggagcactcaatgac-3 Probe: Human #71 - Giza µ opioide-hartzailerako (f) primer: 5 -cggccaatacagtggatagaa-3 (r) primer: 5 -gttagggcaacggagcagt-3 Probe: Human #38 d) 96 edo 384 putzuko plaketan gehitu behar dena putzu bakoitzeko - Lagina: 1-5 µl - Master mix: 5 µl (Roche Faststart Taqman Probe Master 1,25 ml + ROX 8,5 µl) - Primer-ak (f-r): 0,1 µl (200 nm) - Roche Primera (Probe): 0,1 µl (100 nm) - H 2 O 10 µl arte e) Anplifikazioa eta datuen analisia 7900 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) gailuan egin ziren. 4. Emaitzak eta eztabaida qrt-pcra erabiliz, δ opioide-hartzailearen mrnaren anplifikaziorik ez da topatzen espermatozoide helduetan. Aitzitik, κ eta µ opioide-hartzaileen mrnaren anplifikazioa topatzen da zelula horietan (Ct = 36,4 ± 0,3 eta 30,7 ± 0,3 hurrenez hurren). hkor hmor hdor 1. irudia: Opioide-hartzaileentzako qrt-pcr analisiaren anplifikazio-kurbak giza espermatozoideetan. hkor: giza κ opioide-hartzailea; hmor: giza µ opioide-hartzailea; hdor: giza δ opioide-hartzailea. hkor-en eta hmor-en mrna anplifikatzen da eta hdor-en mrna ez da anplifikatzen.

PROTEINA MOTORRAK ETA MUGIMENDU ZELULARRAK

PROTEINA MOTORRAK ETA MUGIMENDU ZELULARRAK 17 PROTEINA MOTORRAK ETA MUGIMENDU ZELULARRAK Zelularen mugimendu gehienak, eta egitura mugikorrak ere bai, zitoeskeletoan eta proteina motorren jardueran oinarritzen dira (iturria: JCB). Argi dago zitoeskeletoaren

More information

Nola eragiten du 2-Interleukinak T-zelulen nukleoko proteinen fosforilazio mailan?

Nola eragiten du 2-Interleukinak T-zelulen nukleoko proteinen fosforilazio mailan? Nola eragiten du 2-Interleukinak T-zelulen nukleoko proteinen fosforilazio mailan? (How does interleukin-2 affect the phosphorylation state of nuclear proteins in T-cells?) Nerea Osinalde Biokimika eta

More information

Gizonezkoentzako pilula antikontzeptiboa: errealitatea ala fikzioa?

Gizonezkoentzako pilula antikontzeptiboa: errealitatea ala fikzioa? Gizonezkoentzako pilula antikontzeptiboa: errealitatea ala fikzioa? Amaia Maite Erdozain Fernández Farmakologia Saila, Medikuntza eta Ondontologia Fakultatea, UPV/EHU Leioa Laburpena: Gaur egun gizonezkoengan

More information

Leptina: funtzio fisiologiko garrantzitsuak dituen molekula

Leptina: funtzio fisiologiko garrantzitsuak dituen molekula Leptina: funtzio fisiologiko garrantzitsuak dituen molekula (Leptin: a molecule with important physiological functions) Gómez Zorita, Saioa Univ. del País Vasco/Euskal Herriko Unib. Farmazia Fak. Farmazia

More information

Kanabinoideoak: onuragarriak ala kaltegarriak?

Kanabinoideoak: onuragarriak ala kaltegarriak? Kanabinoideoak: onuragarriak ala kaltegarriak? Jon Zarate Sesma* Itziar Txurruka Ortega* Enrique Etxebarria Orella** * Farmazian lizentziatuak ** Medikuntzan doktorea Fisiologia Saila, Farmazia Fakultatea

More information

GIBaren EGITURA- PROTEINA-KOLESTEROL ELKARREKINTZAREN AZTERKETA

GIBaren EGITURA- PROTEINA-KOLESTEROL ELKARREKINTZAREN AZTERKETA GIBaren EGITURA- PROTEINA-KOLESTEROL ELKARREKINTZAREN AZTERKETA Biokimika eta Biologia Molekularreko Gradua Gradu Amaierako Lana Egilea: Ariane Araujo Lombraña Leioan, 2016ko ekainaren 28a Zuzendaria:

More information

LABURDURAK. Eskuineko blokeo osoa. Eskuin-bentrikuluaren hipertrofia. Ezkerreko blokeo osoa. Ezker-bentrikuluaren hipertrofia

LABURDURAK. Eskuineko blokeo osoa. Eskuin-bentrikuluaren hipertrofia. Ezkerreko blokeo osoa. Ezker-bentrikuluaren hipertrofia 1 LABURDURAK AEA AEE AKZ AMP AP ATHB AUHB BAAAK BAB BBB BGBK BTE EAK EB EKG ESBEO ESBH ESBO EZBEO EZBH EZBO FA KASN Aldi errefraktario absolutua Aldi errefraktario erlatiboa Arteria koronario zirkunflexua

More information

Populazio-baheketaren garrantzia: giza papilomabirusaren aurkako borroka

Populazio-baheketaren garrantzia: giza papilomabirusaren aurkako borroka Populazio-baheketaren garrantzia: giza papilomabirusaren aurkako borroka Nerea Fontecha 1, Miren Basaras* 1, Jose C. Quilez 2, Silvia Hernáez 3, Daniel Andía 2, Ramon Cisterna 1,3 1 Immunologia, Mikrobiologia

More information

Ingurune aberastuaren eragina eskizofrenian

Ingurune aberastuaren eragina eskizofrenian Ingurune aberastuaren eragina eskizofrenian Harkaitz Bengoetxea* 1, Irantzu Rico-Barrio 1, Naiara Ortuzar 1, Enrike G. Argandoña 2, Jose Vicente Lafuente 1 1 Neurozientziak Saila, Medikuntza eta Odontologia

More information

Analisi farmakozinetiko/farmakodinamikoa antimikrobianoen erabilera hobetzeko gaixo larrietan

Analisi farmakozinetiko/farmakodinamikoa antimikrobianoen erabilera hobetzeko gaixo larrietan Analisi farmakozinetiko/farmakodinamikoa antimikrobianoen erabilera hobetzeko gaixo larrietan (Pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling to optimize antimicrobial agents dosage in critically ill patients)

More information

MUGIMENT TXORIERRI PROGRAMAREN DATUAK

MUGIMENT TXORIERRI PROGRAMAREN DATUAK MUGIMENT TXORIERRI PROGRAMAREN DATUAK 1. Partaidetza-datuak 2. Arrisku kardiobaskularraren faktoreak 3. Partaideen ezaugarriak 4. Esku-hartzearen ondorengo hobekuntzak 5. Gogobetetasun-inkesta 6. Ondorioak

More information

LGMD2A gaixotasunaren diagnostiko molekularra

LGMD2A gaixotasunaren diagnostiko molekularra LGMD2A gaixotasunaren diagnostiko molekularra Oihane Jaka Biodonostia Institutua eta King s College London oihane.jaka@kcl.ac.uk DOI: 10.1387/ekaia.14528 Jasoa: 2015-05-22 Onartua: 2015-06-16 Laburpena:

More information

Kalamua: maria-ren sekretua

Kalamua: maria-ren sekretua Kalamua: maria-ren sekretua Aitziber Mendiguren Ordorika Jose Angel Ruiz Ortega Joseba Gotzon Pineda Ortiz Farmakologia Saila Medikuntza Fakultatea. EHU Azken urteotan kalamuaren gaitasun terapeutikoa

More information

Droga berriak merkatu berritzailean New drugs in an innovative market

Droga berriak merkatu berritzailean New drugs in an innovative market Errebisio-artikulua Droga berriak merkatu berritzailean New drugs in an innovative market Igor Horrillo 1, 2, 3 1, 2, 3 eta Luis F. Callado 1 Farmakologia Saila, Euskal Herriko Unibertsitatea, UPV/EHU

More information

MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN

MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN Jakintza-arloa: Natur Zientziak MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN Egilea: BEÑAT ZALDIBAR ARANBURU Urtea: 2006 Zuzendaria:

More information

1. Sarrera eta motibazioa. 2. Arloko egoera eta ikerketaren helburuak. Jatorrizko artikulua

1. Sarrera eta motibazioa. 2. Arloko egoera eta ikerketaren helburuak. Jatorrizko artikulua Tumoreek, estres sozialak eta estresari aurre egiteko estrategiek jokabide depresiboan eta garunaren aktibitatean duten eragina Effect of tumor, social stress and stress-coping strategies on depressive-like

More information

From the bench to the bed: Sendagai berri baten garapena

From the bench to the bed: Sendagai berri baten garapena From the bench to the bed: Sendagai berri baten garapena Amaia M. Erdozain Fernández Farmakologia Saila, Medikuntza eta Odontologia Fakultatea, UPV/EHU, Leioa Laburpena: Luzea eta konplexua da botika baten

More information

MPERen ezagumendua GIB birusaren mintzean 4E10 eta 10E8 antigorputzen aldetik

MPERen ezagumendua GIB birusaren mintzean 4E10 eta 10E8 antigorputzen aldetik Gradu Amaierako Lana Biokimika eta Biologia Molekularra Gradua MPERen ezagumendua GIB birusaren mintzean 4E10 eta 10E8 antigorputzen aldetik CDR-H3 eta mintzaren garrantziaren azterketa mikroskopia bidez

More information

Zaintzaren alde goxoa, zentzua eta alde positiboaren bilaketa menpekotasuna duen adinekoaren zainketan

Zaintzaren alde goxoa, zentzua eta alde positiboaren bilaketa menpekotasuna duen adinekoaren zainketan Zaintzaren alde goxoa, zentzua eta alde positiboaren bilaketa menpekotasuna duen adinekoaren zainketan J. López Martínez* I. Lizaso Elgarresta** M. Sánchez de Miguel** *San Pablo-CEU Unibertsitatea **Psikologia

More information

GIB-1 birusaren env fusio proteinaren ingurune lipidikoaren azterketa

GIB-1 birusaren env fusio proteinaren ingurune lipidikoaren azterketa Gradu Amaierako Lana Biokimikako eta Biologia Mokularreko Gradua GIB-1 birusaren env fusio proteinaren ingurune lipidikoaren azterketa Egilea: Irati Odriozola Lerchundi Zuzendaria: Maier Lorizate Nogales

More information

Arrain gelatinan oinarrituriko film biodegradagarriak

Arrain gelatinan oinarrituriko film biodegradagarriak Arrain gelatinan oinarrituriko film biodegradagarriak Alaitz Etxabide, Itsaso Leceta, Pedro Guerrero, Koro de la Caba* BIOMAT Ikerketa Taldea. Ingeniaritza Kimikoa eta Ingurumenaren Ingeniaritza Saila.

More information

ELIKAGAIAK, ELIKADURA ETA DIETETIKA. Edurne Simón Bittor Rodríguez Idoia Labayen

ELIKAGAIAK, ELIKADURA ETA DIETETIKA. Edurne Simón Bittor Rodríguez Idoia Labayen ELIKAGAIAK, ELIKADURA ETA DIETETIKA Edurne Simón Bittor Rodríguez Idoia Labayen Udako Euskal Unibertsitatea Bilbo, 2007 Udako Euskal Unibertsitatea Edurne Simón, Bittor Rodríguez, Idoia Labayen ISBN: 978-84-8438-092-4

More information

ERRESBERATROLAREN HAINBAT EFEKTU ETA ERABILERA

ERRESBERATROLAREN HAINBAT EFEKTU ETA ERABILERA ERRESBERATROLAREN HAINBAT EFEKTU ETA ERABILERA Giza nutrizioa eta dietetikako gradua 2012/2013 ikasturtea Gradu amaierako lana Tutorea: Encarnación Goikoetxea Egilea: Iñaki Milton Laskibar AURKIBIDEA

More information

Azido Linoleiko Konjokatua: obesitatearen aurkako irtenbidea ala mehatxua?

Azido Linoleiko Konjokatua: obesitatearen aurkako irtenbidea ala mehatxua? Azido Linoleiko Konjokatua: obesitatearen aurkako irtenbidea ala mehatxua? Jonatan Miranda, Arrate Lasa, Edurne Simón, Itziar Txurruka Farmazia eta Elikagaien Zientziak Departamentua, Farmazia Fakultatea.

More information

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE BIOENERGETIKA. metabolikoak.

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE BIOENERGETIKA. metabolikoak. BIOENERGETIKA 1. GAIA. Bide metabolikoak Jarduera Fisikoan 1.2.1.- Substratuen erabilpena eta moldaketa metabolikoak Substratuen erabilpena zehazten duten faktoreak ariketan zehar Ariketaren intentsitatea.

More information

B12 BITAMINAREN ETA FOLATOREN ESKASIAREN DIAGNOSTIKOA BERRIKUSKETA BIBLIOGRAFIKOA ETA GOMENDIOAK. 2015eko abendua

B12 BITAMINAREN ETA FOLATOREN ESKASIAREN DIAGNOSTIKOA BERRIKUSKETA BIBLIOGRAFIKOA ETA GOMENDIOAK. 2015eko abendua B12 BITAMINAREN ETA FOLATOREN ESKASIAREN DIAGNOSTIKOA BERRIKUSKETA BIBLIOGRAFIKOA ETA GOMENDIOAK. 2015eko abendua LANTALDEA: Carmen Mar Medina, koordinatzailea, Laborategia, Galdakao- Usansoloko Ospitalea

More information

EREMU ELEKTROMAGNETIKOAK ETA OSASUNEAN DUTEN ERAGINA FROGA ZIENTIFIKOAK

EREMU ELEKTROMAGNETIKOAK ETA OSASUNEAN DUTEN ERAGINA FROGA ZIENTIFIKOAK OSASUN SAILA Osasun Sailburuordetza Osasun Publikoaren eta Adikzioen Zuzendaritza DEPARTAMENTO DE SALUD Viceconsejería de Salud Dirección de Salud Pública y Adicciones EREMU ELEKTROMAGNETIKOAK ETA OSASUNEAN

More information

AURKIBIDEA. Sarrera Azterketen diseinua Emaitzak Ondorioak. Iruzkinak Proposamen terapeutikoa Bibliografia...

AURKIBIDEA. Sarrera Azterketen diseinua Emaitzak Ondorioak. Iruzkinak Proposamen terapeutikoa Bibliografia... SUKAR-NEUTROPENIA LUZEA ANTIFUNGIKO BERRIEN EGINKIZUNA AURKIBIDEA Sarrera................................................. 4 Azterketen diseinua......................................... 5 Emaitzak.................................................

More information

Umearen sobera. Esku-hartzea Lehen Mailako Arretako Pediatrian. Doktoretza-tesia. Xabier Txakartegi Etxebarria. Gernika-Lumon, 2015ko maiatzaren 12an

Umearen sobera. Esku-hartzea Lehen Mailako Arretako Pediatrian. Doktoretza-tesia. Xabier Txakartegi Etxebarria. Gernika-Lumon, 2015ko maiatzaren 12an Umearen pisu sobera Esku-hartzea Lehen Mailako Arretako Pediatrian Doktoretza-tesia Xabier Txakartegi Etxebarria Gernika-Lumon, 2015ko maiatzaren 12an Ondoko Doktoretza-Tesi hau Lourdes, Jokin, Maddalen,

More information

HPV infection, a described cause for human cancer: HPV detection and molecular mechanisms of HPV carcinogenesis (Review).

HPV infection, a described cause for human cancer: HPV detection and molecular mechanisms of HPV carcinogenesis (Review). Bachelor s Thesis Degree in Biology HPV infection, a described cause for human cancer: HPV detection and molecular mechanisms of HPV carcinogenesis (Review). Author: Josu Aguirre Gomez Director: Ainhoa

More information

3. GAIA DIAGNOSTIKO PERIODONTALAREN SARRERA

3. GAIA DIAGNOSTIKO PERIODONTALAREN SARRERA 3. GAIA DIAGNOSTIKO PERIODONTALAREN SARRERA Egileak: García-De La Fuente AM, Estefanía-Fresco R, Aguirre-Zorzano L A OCW-2016 DESKRIBAPENA Bakterio-plaka (B-P) ez-espezifikoa pilatzen denean hortzen inguruan,

More information

4. GAIA: Farmakoen banaketa organismoan

4. GAIA: Farmakoen banaketa organismoan 4. GAIA: Farmakoen banaketa organismoan Lan hau Creative Commons-en Nazioarteko 3.0 lizentziaren mendeko Azterketa-Ez komertzial- Partekatu lizentziaren mende dago. Lizentzia horren kopia ikusteko, sartu

More information

Urte bat baino gutxiagoko umeengan agertutako nerbio-sistema zentraleko tumoreak: berrikuspena Gurutzetako Unibertsitate Ospitalean eta literaturan

Urte bat baino gutxiagoko umeengan agertutako nerbio-sistema zentraleko tumoreak: berrikuspena Gurutzetako Unibertsitate Ospitalean eta literaturan Urte bat baino gutxiagoko umeengan agertutako nerbio-sistema zentraleko tumoreak: berrikuspena Gurutzetako Unibertsitate Ospitalean eta literaturan Central Nervous System (CNS) tumors in an under 1 year-old

More information

Listeria monocytogenes. Agiriaren data: 2006ko martxoa

Listeria monocytogenes. Agiriaren data: 2006ko martxoa Listeria monocytogenes Agiriaren data: 2006ko martxoa 1.- SARRERA Listería monocytogenes (LM) sortu ahal den patogenoa da. Bakteria horiek sortzeko prozesu batzuk oso larriak izan ahal dira, eta umeki,

More information

1. Ikasgaia. Garezur oinaldeko hobiak

1. Ikasgaia. Garezur oinaldeko hobiak 1. Ikasgaia Garezur oinaldeko hobiak Garezurra buruaren hezurrezko euskarria da. Bere barruan entzefaloa eta zentzumen bereziak babesten ditu, hau da, entzumena, usaimena, ikusmena eta dastamena. Arnasbideen

More information

GRADU AMAIERAKO LANA

GRADU AMAIERAKO LANA GRADU AMAIERAKO LANA ARIKETA FISIKOAREN ETA DIETA OSASUNTSUAREN PROGRAMA BATEN EPE LUZEKO EFEKTUAK LEHENENGO MAILAKO HIPERTENTSIOA ETA OBESITATE MORBIDOA ZUEN PERTSONA BATENGAN: IKASKETA KASUA EGILEA:

More information

RPAQ. Jarduera fisiko egin berriari buruzko galdesorta

RPAQ. Jarduera fisiko egin berriari buruzko galdesorta RPAQ Basque_RPAQ Version Number 1.1 updated 11/September/27 RPAQ Jarduera fisiko egin berriari buruzko galdesorta Azkeneko 4 asteetan egunero zer jarduera fisiko egin duzun neurtu nahi da galdesorta honen

More information

MUSIKOTERAPIA ZAINKETA

MUSIKOTERAPIA ZAINKETA MUSIKOTERAPIA ZAINKETA ARINGARRIETAN GRADU AMAIERAKO LANA MUSIKOTERAPIA ZAINKETA ARINGARRIETAN GRADU AMAIERAKO LANA Vitoria-Gasteizko Erizaintza Eskola EGILEA: Maider Gorritxategi ZUZENDARIA: Yolanda López

More information

LINFOMA FOLIKULARRA:LINFOMA FOLIKULARRA 11/6/07 11:02 Página 1 LINFOMA FOLIKULARRA 2006ko berrikuspena

LINFOMA FOLIKULARRA:LINFOMA FOLIKULARRA 11/6/07 11:02 Página 1 LINFOMA FOLIKULARRA 2006ko berrikuspena LINFOMA FOLIKULARRA 2006ko berrikuspena AURKIBIDEA 1. Sarrera............................................... 5 2. PETen erabilgarritasuna linfoma folikularraren azterketan............. 5 3. Faktore pronostikoak.....................................

More information

Zahartzaroa eta lekukoen oroimena

Zahartzaroa eta lekukoen oroimena PSIKOLOGIA Zahartzaroa eta lekukoen oroimena Alaitz Aizpurua, Elvira Garcia-Bajos eta Malen Migueles Euskal Herriko Unibertsitatea Ikerketa honen helburua da gertaera baten oroimenean pertsona gazteen

More information

Peroxisomen proliferazioaren markatzaileak diren geneen klonazioa eta espresio ikerketak

Peroxisomen proliferazioaren markatzaileak diren geneen klonazioa eta espresio ikerketak Jakintza-arloa: Biologia Peroxisomen proliferazioaren markatzaileak diren geneen klonazioa eta espresio ikerketak Xenobiotiko organikoen eragina Egilea: EIDER BILBAO CASTELLANOS Urtea: 2007 Zuzendaria:

More information

Haur-depresioa Lehen Hezkuntzako etapan: zertan datzan eta irakasleek zer egin dezaketen

Haur-depresioa Lehen Hezkuntzako etapan: zertan datzan eta irakasleek zer egin dezaketen PSIKOLOGIA Haur-depresioa Lehen Hezkuntzako etapan: zertan datzan eta irakasleek zer egin dezaketen Marian Soroa, Elena Bernaras eta Joana Jauregizar* EHUko Donostiako Irakasleen Unibertsitate Eskola,

More information

Gaitasun kognitiboen aplikazioa 5G sareen kontrol- eta kudeaketa-mailetan

Gaitasun kognitiboen aplikazioa 5G sareen kontrol- eta kudeaketa-mailetan Gaitasun kognitiboen aplikazioa 5G sareen kontrol- eta kudeaketa-mailetan (Application of cognitive capabilities in control and management planes of 5G networks) Bego Blanco*, Jose Oscar Fajardo, Fidel

More information

BIGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA EGITARAU TEORIKOA

BIGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA EGITARAU TEORIKOA BIGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA IRAUNALDIA: Lauhilabetekoa KREDITUAK: 5,5 teorikoak eta 1,5 praktikoak IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA Farmakologia interes kliniko handia duen oinarrizko

More information

Pregabalinaren eraginkortasuna min neuropatikoa tratatzeko: Berrikustapen sistematikoa

Pregabalinaren eraginkortasuna min neuropatikoa tratatzeko: Berrikustapen sistematikoa Revisión Gac Med Bilbao. 2016;113(3):113-128 Pregabalinaren eraginkortasuna min neuropatikoa tratatzeko: Berrikustapen sistematikoa Iratxe Ruiz, Aitziber Mendiguren Farmakologia Saila. Medikuntza eta Erizaintza

More information

GRADU AMAIERAKO LANA. EGILEA: Amaia Ganboa Aldaba ZUZENDARIA: Sara Maldonado Martin KURTSOA: 2016/2017 DEIALDIA: Ohikoa

GRADU AMAIERAKO LANA. EGILEA: Amaia Ganboa Aldaba ZUZENDARIA: Sara Maldonado Martin KURTSOA: 2016/2017 DEIALDIA: Ohikoa GRADU AMAIERAKO LANA ARIKETA FISIKOAREN ETA DIETA OSASUNTSUAREN PROGRAMA BATEN EFEKTUAK GORPUTZEKO MASAN ETA GAITASUN FISIKOAN LEHENENGO MAILAKO HIPERTENTSIOAN ETA GAINPISUA DUTEN PERTSONENGAN EGILEA:

More information

GRADU AMAIERAKO LANA

GRADU AMAIERAKO LANA GRADU AMAIERAKO LANA Berrikuspen bibliografikoa Antsietate Asaldura Orokorraren tratamenduaren hausnarketa eta Erizaintzaren esku hartzea. ARANTZA AGIRRE VALLE 2015eko Maiatzak 15 1 LABURPENA: Antsietate

More information

LANDARE-OSASUNERAKO PRODUKTUEN HONDAKINAK: LETXUGA, TOMATEA, ZERBAK ETA PIPERRA. 2005eko azaroa

LANDARE-OSASUNERAKO PRODUKTUEN HONDAKINAK: LETXUGA, TOMATEA, ZERBAK ETA PIPERRA. 2005eko azaroa LANDARE-OSASUNERAKO PRODUKTUEN HONDAKINAK: LETXUGA, TOMATEA, ZERBAK ETA PIPERRA 2005eko azaroa 1.- SARRERA Osasunaren Munduko Erakundeak (OME) horrela definitzen du plagizida hitza (pestizida edo landare-osasunerako

More information

GRADU AMAIERAKO LANA

GRADU AMAIERAKO LANA GRADU AMAIERAKO LANA BERRIKUSPEN BIBLIOGRAFIKOA Distrofia miotonikoa duten pazienteen eta euren senideen bizi-kalitatearen azterketa MAITE BILBAO CORTINA 2015eko maiatzaren 14a Eskerrak eman nahi dizkiet

More information

Urdaibai estuarioko plankton mikrobianoaren dinamika trofikoa

Urdaibai estuarioko plankton mikrobianoaren dinamika trofikoa Jakintza-arloa: Biologia Urdaibai estuarioko plankton mikrobianoaren dinamika trofikoa Egilea: AITZIBER SAROBE EGIGUREN Urtea: 2009 Zuzendariak: Unibertsitatea: ARANTZA IRIARTE GABIKAGOGEASKOA, EMMA ORIBE

More information

Protokoloa. MIELOMA ANIZKOITZA eko berrikuspenaren eguneratzea

Protokoloa. MIELOMA ANIZKOITZA eko berrikuspenaren eguneratzea Protokoloa MIELOMA ANIZKOITZA 2008 2005eko berrikuspenaren eguneratzea 37 MIELOMA ANIZKOITZA 2008 2005eko berrikuspenaren eguneratzea DONOSTIA OSPITALEA Osakidetza Begiristain pasealekua, z.g. 20014 Donostia-San

More information

GABAPENTINA ETA PREGABALINA: ERABILERAREN ETA ABUSUAREN ARTEAN

GABAPENTINA ETA PREGABALINA: ERABILERAREN ETA ABUSUAREN ARTEAN Infac ESKUALDEKO 22 LIBURUKIA 4 Zk 2014 FARMAKOTERAPI INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA DE LA COMARCA http://www.osakidetza.euskadi.net/cevime Intranet Osakidetza http:/www.osakidetza.net GABAPENTINA

More information

ALZHEIMER MOTAKO DEMENTZIA. Aurkibidea

ALZHEIMER MOTAKO DEMENTZIA. Aurkibidea ALZHEIMER MOTAKO DEMENTZIA Aurkibidea 1.1. Funtzio kognitiboak balioesteko galde-sortak 1.1.1. MMSE, Mini-Mental State Exam 1.1.2. SPMSQ, Short Portable Mental Status 1.1.3. ADAS-COG, Alzheimer s Disease

More information

GAIXOTASUN INFEKZIOSOEN AURKAKO JARDUERA-PROTOKOLOAK (III) PROTOCOLOS DE ACTUACIÓN FRENTE A ENFERMEDADES INFECCIOSAS (III)

GAIXOTASUN INFEKZIOSOEN AURKAKO JARDUERA-PROTOKOLOAK (III) PROTOCOLOS DE ACTUACIÓN FRENTE A ENFERMEDADES INFECCIOSAS (III) GAIXOTASUN INFEKZIOSOEN AURKAKO JARDUERA-PROTOKOLOAK (III) PROTOCOLOS DE ACTUACIÓN FRENTE A ENFERMEDADES INFECCIOSAS (III) OSASUN SAILA DEPARTAMENTO DE SANIDAD ISBN 84-457-2148-8 Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen

More information

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE EDUKIAK

JARDUERA FISIKOAREN ETA KIROLAREN ZIENTZIEN FAKULTATEA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ACTIVIDAD FISICA Y DEL DEPORTE EDUKIAK EDUKIAK 4.. Hormona-sistema: oroimena. 4.1. Hipotalamoko eta hipofisiko hormonak. 4.2. GH eta sexu-hormonak. 4.3. Guruin suprarrenalak: 4.3.1. Kortex suprarrenala (kortisol eta aldosterona). 4.3.2. Muin

More information

MEDIKAZIO KRONIKOAREN MANEIUA EBAKUNTZA INGURUKO ALDIAN

MEDIKAZIO KRONIKOAREN MANEIUA EBAKUNTZA INGURUKO ALDIAN 25 LIBURUKIA 09 Zk 2017 FARMAKOTERAPIA INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA MEDIKAZIO KRONIKOAREN MANEIUA EBAKUNTZA INGURUKO ALDIAN AURKIBIDEA SARRERA FARMAKO ANTIDIABETIKOAK FARMAKO ANTITRONBOTIKOAK

More information

Mutazioak progranulina genean: eragiten duten klinika, patologia eta RNA mailako adierazpena

Mutazioak progranulina genean: eragiten duten klinika, patologia eta RNA mailako adierazpena Mutazioak progranulina genean: eragiten duten klinika, patologia eta RNA mailako adierazpena (Progranulin gene mutations: manifestations of clinical, pathological and RNA level) López de Munain Arregui,

More information

6. GAIA: FARMAKOEN IRAIZKETA

6. GAIA: FARMAKOEN IRAIZKETA 6. GAIA: FARMAKOEN IRAIZKETA Lan hau Creative Commons-en Nazioarteko 3.0 lizentziaren mendeko Azterketa-Ez komertzial- Partekatu lizentziaren mende dago. Lizentzia horren kopia ikusteko, sartu http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/es/

More information

BIOTEKNOLOGIA ETA PHARMA UNITATEA

BIOTEKNOLOGIA ETA PHARMA UNITATEA BIOTEKNOLOGIA ETA PHARMA UNITATEA Gure jarduerak hiru eremu barne hartzen ditu: TECNALIAko Bioteknologia eta Pharmaren Unitateak ikerketak egin eta zerbitzu teknologiko aurreratuak ematen ditu bioprozesuen

More information

SEXOLOGIAKO HIZTEGIA

SEXOLOGIAKO HIZTEGIA SEXOLOGIAKO HIZTEGIA Iñaki Ugartebururen omenez Zuzendaria: Nerea Sancho Esnaola Aholkulari teknikoa: Itziar Alonso-Arbiol Hizkuntza-arduraduna: Juan Kruz Igerabide Sarasola Hizkuntza-begiralea: Iñigo

More information

Arreta gabezia hiperaktibitatearekin. nahastea 15. monografikoa

Arreta gabezia hiperaktibitatearekin. nahastea 15. monografikoa hik hasi 5 euro 2005eko NEGUA 15. Arreta gabezia hiperaktibitatearekin monografikoa nahastea Arreta gabezia hiperaktibitatearekin nahastea Mikel HARANBURU EHUko irakaslea Jesus GUERRA EHUko irakaslea Esther

More information

Parametro desberdinen konparaketa saskibaloi jokalari gizonen eta emakumeen artean

Parametro desberdinen konparaketa saskibaloi jokalari gizonen eta emakumeen artean Gradu Amaierako Lana Fisioterapia Gradua Parametro desberdinen konparaketa saskibaloi jokalari gizonen eta emakumeen artean Egilea: Mikel Urretabizkaia Astigarraga Zuzendaria: Iratxe Duñabeitia Usategui

More information

3.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK

3.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK 3.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK Streptococcus pneumoniae bakterioa da herritarren artean pneumonia komunitarioaren eragile nabarmenena eta haurrei erdiko otitisa eragitearen arrazoi nagusia.

More information

I ATALA: Farmakologia Aplikatuaren Orokortasunak

I ATALA: Farmakologia Aplikatuaren Orokortasunak I ATALA: Farmakologia Aplikatuaren Orokortasunak 1. Elkarrekintza farmakologikoak (4. Gaia) Ariketa honetan bi farmako mota agertzen dira: 1 Farmakoa (F1): Pazienteak odontologoaren kontsultara joan baino

More information

AURKIBIDEA. 01. BIZTANLERIAREN ZAHARTZEA Zahartzea, sistema neuromuskularra eta gaitasun funtzionala

AURKIBIDEA. 01. BIZTANLERIAREN ZAHARTZEA Zahartzea, sistema neuromuskularra eta gaitasun funtzionala AURKIBIDEA 01. BIZTANLERIAREN ZAHARTZEA Zahartzea, sistema neuromuskularra eta gaitasun funtzionala 02. AHULTASUNA: OSO ZAHARREN ZAHARTZE ZAURGARRIA ETA EZGAITASUNA Indarraren entrenamendua zahar ahularengan.

More information

LC teknika desberdinen erabilera sindrome metabolikoaren aurkako terapian erabiltzen diren farmakoen determinaziorako

LC teknika desberdinen erabilera sindrome metabolikoaren aurkako terapian erabiltzen diren farmakoen determinaziorako Jakintza-arloa: Kimika LC teknika desberdinen erabilera sindrome metabolikoaren aurkako terapian erabiltzen diren farmakoen determinaziorako Egilea: GORKA IRIARTE SAENZ DE OJER Urtea: 2011 Zuzendariak:

More information

Aurkezpena Operazio kirurgikoa egiteko denbora Infekzioaren profilaxia Profilaxi antibiotikoa... 6

Aurkezpena Operazio kirurgikoa egiteko denbora Infekzioaren profilaxia Profilaxi antibiotikoa... 6 ALDAKAKO HAUSTUREN PROTOKOLOA AURKIBIDEA Aurkezpena.............................................. 5 1. Operazio kirurgikoa egiteko denbora............................ 6 2. Infekzioaren profilaxia.....................................

More information

Epilepsia eta genetika*

Epilepsia eta genetika* Epilepsia eta genetika* (Epilepsy and genetics) Urtasun, Miguel; Poza, Juan José; Cobo, Ana Mª; Azpitarte, Margarita; Martí Massó, José Félix; Martínez-Gil, Ángel; Bautista Espinal, Juan; Carrera, Edurne;

More information

ZEFALEAREN KUDEAKETA LARRIALDIETAN

ZEFALEAREN KUDEAKETA LARRIALDIETAN ZEFALEAREN KUDEAKETA LARRIALDIETAN Kasu baten harira Ane Mateos Aurrekoetxea, Maialen Alday Munilla, Joseba Fdz de Retana Corres eta Garazi Agirre Beitia KASU KLINIKOA Kontsulta arrazoia: zefaleagatik

More information

Arreta medikoei murrizketarik?

Arreta medikoei murrizketarik? Arreta medikoei murrizketarik? (Health care rationing?) Martínez Urionabarrenetxea, Koldo Arreta Trinkoak. Nafarroako Ospitalea. Irunlarrea, z/g. 31008 Pamplona/Iruñea BIBLID [1577-8533 (2004), 6; 131-139]

More information

Helduen altuera iragarpena: belaunerainoko altuera neurriak*

Helduen altuera iragarpena: belaunerainoko altuera neurriak* Helduen altuera iragarpena: belaunerainoko altuera neurriak* (Prediction of stature in adults: knee height measurements) Arroyo Izaga, Marta 1 ; Martínez de la Pera, Concha 2 ; Ansotegui Alday, Laura 3

More information

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA urtea

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA urtea EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA 2012. urtea EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOKO TUBERKULOSIAREN PROGRAMA 2012. urtea Vitoria-Gasteiz 2014 Lan honen bibliografia-erregistroa Eusko Jaurlaritzaren

More information

4.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK

4.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK AGENTE ERAGILEA TRANSMISIO-MODUA INKUBAZIO-DENBORA IMMUNITATEAREN IRAUPENA TXERTOAREN EZAUGARRIAK 4.7. PNEUMOKOKOA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK Streptococcus pneumoniae bakterioa da herritarren artean pneumonia komunitarioaren eragile nabarmenena eta haurrei erdiko otitisa eragitearen arrazoi nagusia.

More information

ERIZAINTZAKO GRADUA GIPUZKOA GRADO EN ENFERMERIA

ERIZAINTZAKO GRADUA GIPUZKOA GRADO EN ENFERMERIA ERIZAINTZAKO GRADUA GIPUZKOA GRADO EN ENFERMERIA 2015 / 2016 ikasturtea ALZHEIMER GAIXOTASUNA DUEN PERTSONARI ESKAINI BEHARREKO ZAINKETA INTEGRALAK GRADU AMAIERAKO LANA Silvia Tellechea Iraola Zuzendaria:

More information

Gaceta Médica de Bilbao

Gaceta Médica de Bilbao Gac Med Bilbao. 2011;8(4):1 7 Gaceta Médica de Bilbao www.elsevier.es/gmb ORIGINAL ARTICLE Sociodemographic characteristics by primary cancer diagnosis of patients dying in a palliative care unit: A retrospective

More information

BOSTGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA KLINIKOA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA

BOSTGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA KLINIKOA IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA BOSTGARREN IKASTURTEA-FARMAKOLOGIA KLINIKOA IRAUNALDIA: Lauhilabetekoa KREDITUAK: 2 teorikoak eta 2,5 praktikoak IRAKASGAIAREN HELBURU OROKORRAK ETA ANTOLAKETA Farmakologia klinikoko kurtso honen helburu

More information

4. Kapitulua TXERTOAK

4. Kapitulua TXERTOAK 4. Kapitulua TXERTOAK 4.1. DIFTERIA GAIXOTASUNAREN EZAUGARRIAK Gaixotasun bakteriano akutua da, eta arnaseko traktuaren goiko aldeari sudurreko mukosa, amigdalak, laringea edo faringea erasaten dio sarritan

More information

Lan-asma BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK PROTOCOLOS DE VIGILANCIA SANITARIA ESPECIFICA

Lan-asma BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK PROTOCOLOS DE VIGILANCIA SANITARIA ESPECIFICA OSALAN Laneko Segurtasun eta Osasunerako Euskal Erakundea Instituto Vasco de Seguridad y Salud Laborales BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO PROTOKOLOAK Lan-asma LAN-OSASUNA LAN-OSASUNA BERARIAZKO OSASUN-ZAINKETARAKO

More information

Gaixotasun infekziosoen aurkako jarduera-protokoloak (V) Protocolos de actuación frente a enfermedades infecciosas (V) LEGIONELOSIA

Gaixotasun infekziosoen aurkako jarduera-protokoloak (V) Protocolos de actuación frente a enfermedades infecciosas (V) LEGIONELOSIA Gaixotasun infekziosoen aurkako jarduera-protokoloak (V) Protocolos de actuación frente a enfermedades infecciosas (V) LEGIONELOSIA OSASUN SAILA Osasun Sailburuordetza Osasun Publikoko Zuzendaritza DEPARTAMENTO

More information

Pazientearen motibazioa eta. Aho-higiene argibideak. Kontrol mekanikoa.

Pazientearen motibazioa eta. Aho-higiene argibideak. Kontrol mekanikoa. Pazientearen motibazioa eta Aho-higiene argibideak. Kontrol mekanikoa. Egileak: Aguirre-Zorzano L A,Estefanía-Fresco R, Fernández-Jiménez A,, OCW-2017 Egileak: Aguirre LA, Estefanía R, Fernández A, García

More information

EAEko jardun-prozedura, Zika birusaren gaixotasunaren susmoa dagoen kasuetan

EAEko jardun-prozedura, Zika birusaren gaixotasunaren susmoa dagoen kasuetan EAEko jardun-prozedura, Zika birusaren gaixotasunaren susmoa dagoen kasuetan (Eguneratzea: 2016ko urriaren 17a) Osasunaren Mundu Erakundeak (OME), Zika birusaren gaixotasuna dela-eta, ezarri duen alerta

More information

HERPES GENITALAREN IKERKETA EPIDEMIOLOGIKO, KLINIKO ETA MIKROBIOLOGIKOA BILBO HIRIAN

HERPES GENITALAREN IKERKETA EPIDEMIOLOGIKO, KLINIKO ETA MIKROBIOLOGIKOA BILBO HIRIAN Medikuntza eta Erizaintza Fakultatea Immunologia, Mikrobiologia eta Parasitologia Saila HERPES GENITALAREN IKERKETA EPIDEMIOLOGIKO, KLINIKO ETA MIKROBIOLOGIKOA BILBO HIRIAN Doktorego Tesia Mikele Macho

More information

ASMA HELDUETAN ETA NERABEETAN

ASMA HELDUETAN ETA NERABEETAN 25 LIBURUKIA 08 Zk 2017 FARMAKOTERAPIA INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA ASMA HELDUETAN ETA NERABEETAN AURKIBIDEA SARRERA DIAGNOSTIKOA TRATAMENDUA TRATAMENDUAREN HELBURUAK ETA OSAGAIAK JARRAIPEN

More information

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA

EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA EUSKAL AUTONOMIA ERKIDEGOAN GENETIKAREN GARAPENERAKO PLANA Vitoria-Gasteiz, 2012 Lan honen bibliografia-erregistroa Eusko Jaurlaritzako Liburutegi

More information

JARDUERA FISIKO EGOKITUA ETA ELIKADURA: OSASUNAREN BIDEAN

JARDUERA FISIKO EGOKITUA ETA ELIKADURA: OSASUNAREN BIDEAN 12 13 Iratxe Ibarra, markinarra, afizionatu mailako paletaria eta bertso - laria Koikili Lertxundi, otxandiotarra, Athletic-eko futbolaria izana, gaur egun futbol entrenatzailea; kirol mundua euskaraz

More information

Activos O.I.T. afijación. afijación igual. afijación óptima. agregación. agrupamiento de datos. ajuste. aleatorio. algoritmo

Activos O.I.T. afijación. afijación igual. afijación óptima. agregación. agrupamiento de datos. ajuste. aleatorio. algoritmo Activos O.I.T. Son todas las personas que aportan un trabajo para producir bienes y servicios, y las que carecen de empleo en ese momento, lo buscan y están disponibles para corporarse a él. Se compone

More information

GIZA ELIKADURA (06086)

GIZA ELIKADURA (06086) GIZA ELIKADURA (06086) HELBURU OROKORRAK Ikasgai honen helburua, ikaslei elikadura orekatuaren oinarriak irakustea izango da, baita hazten hari diren gizakietan eta baita gizaki helduetan eta zaharretan.

More information

Osasun Zientzien Arloan Oinarrezkoa Derrigorrezkoa ) Ikasle-taldea Euskara (32)

Osasun Zientzien Arloan Oinarrezkoa Derrigorrezkoa ) Ikasle-taldea Euskara (32) Ikasleentzako irakasgai-gidak egiteko EREDUA talde bakoitzean 1 1.- IRAKASGAIAREN INFORMAZIO OROKORRA Irakasgaiaren izena Saila Ikasturtea (Lauhilekoa) Farmakologia Medikoaren Oinarriak Farmakologia 1.

More information

Hipertentsio arterialari buruzko Praktika klinikoaren gida

Hipertentsio arterialari buruzko Praktika klinikoaren gida Osakidetzako praktika klinikoko gidak Hipertentsio arterialari buruzko Praktika klinikoaren gida Laburpena 2007ko eguneratzea FINANTZAKETA: PKG hau Osakidetzak eta Eusko Jaurlaritzaren Osasun Sailak finantzatu

More information

Osakidetzako praktika klinikoko gidaliburuak. Lipidoen erabilerari buruzko praktika klinikoko gidaliburua arrisku kardiobaskularreko faktore bezala

Osakidetzako praktika klinikoko gidaliburuak. Lipidoen erabilerari buruzko praktika klinikoko gidaliburua arrisku kardiobaskularreko faktore bezala Osakidetzako praktika klinikoko gidaliburuak Lipidoen erabilerari buruzko praktika klinikoko gidaliburua arrisku kardiobaskularreko faktore bezala FINANTZAKETA: PKG hau Osakidetzak eta Eusko Jaurlaritzako

More information

ZAHARREN MEDIKAZIOA BERRIKUSTEN: Zer jakin beharko nuke?

ZAHARREN MEDIKAZIOA BERRIKUSTEN: Zer jakin beharko nuke? Infac ESKUALDEKO 23 LIBURUKIA 2 Zk 2015 FARMAKOTERAPI INFORMAZIOA INFORMACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA DE LA COMARCA http://www.osakidetza.euskadi.eus/cevime Intranet Osakidetza http:/www.osakidetza.eus ZAHARREN

More information

Euskadiko energiapobretasunari. buruzko gizarteeztabaidarako

Euskadiko energiapobretasunari. buruzko gizarteeztabaidarako Euskadiko energiapobretasunari buruzko gizarteeztabaidarako oinarriak Arartekoaren 1/2016 Gomendio orokorra, urtarrilaren 26koa. w w w. a r a r t e k o. e u s 2 Euskadiko energiapobretasunari buruzko gizarte-eztabaidarako

More information

Salud Pública. Osasun Publikoa seihilekoa. Editoriala. Aurkibidea. a u r k i b i d e a

Salud Pública. Osasun Publikoa seihilekoa. Editoriala. Aurkibidea. a u r k i b i d e a Salud Pública 202006 1. seihilekoa zenbakia Osasun Publikoa EHAEko Epidemiologi Aldizkaria http: //www.osanet.euskadi.net/ OSASUN SAILA DEPARTAMENTO DE SANIDAD a u r k i b i d e a Aurkibidea Epidemiologi

More information

Nature Structural & Molecular Biology: doi: /nsmb Supplementary Figure 1. Generation and validation of mtef4-knockout mice.

Nature Structural & Molecular Biology: doi: /nsmb Supplementary Figure 1. Generation and validation of mtef4-knockout mice. Supplementary Figure 1 Generation and validation of mtef4-knockout mice. (a) Alignment of EF4 (E. coli) with mouse, yeast and human EF4. (b) Domain structures of mouse mtef4 compared to those of EF4 (E.

More information

Ungueal Morphology and Pathology of the human mummy found in the Val Senales (Eastern Alps, Tyrol, Bronze Age)

Ungueal Morphology and Pathology of the human mummy found in the Val Senales (Eastern Alps, Tyrol, Bronze Age) MUNIBE (Antropologia-Arkeologia) Nº 46 123-132 SAN SEBASTIAN 1994 ISSN1132-2217 Aceptado: 1994-01-28 Ungueal Morphology and Pathology of the human mummy found in the Val Senales (Eastern Alps, Tyrol, Bronze

More information

Dementziaren aurkako medikamentuen jarraipena eta ezabapena. 2016ko ekaina

Dementziaren aurkako medikamentuen jarraipena eta ezabapena. 2016ko ekaina Dementziaren aurkako medikamentuen jarraipena eta ezabapena 2016ko ekaina Vitoria-Gasteiz, 2016 Lan honen Lan honen bibliografia-erregistroa Eusko Jaularitzaren Bibliotekak sarearen katalogoan aurki daiteke:

More information

Zainak. Analytic Summary. Nutritional uses and customs. Esther Rebato, lit. ed.

Zainak. Analytic Summary. Nutritional uses and customs. Esther Rebato, lit. ed. Zainak CUADERNOS DE ANTROPOLOGÍA-ETNOGRAFÍA ZAINAK 30, 1-256, DONOSTIA 2008 ISSN: 1137-439X Nutritional uses and customs Esther Rebato, lit. ed. 30 Copying of the summary pages is authorised Campillo Álvarez,

More information

Axularren liburutegia irudikatzen. Erlijiozko aipuak Geron

Axularren liburutegia irudikatzen. Erlijiozko aipuak Geron Axularren liburutegia irudikatzen. Erlijiozko aipuak Geron PATXI SALABERRI MUÑOA patxi.salaberri@ehu.eus Modo, ecce modo; sine paululum Agustin Hiponakoa 0.- Literaturan literatura orotan garrantzizko

More information

Neuro-fuzzy Modeling of Multi-field Surface Neuroprostheses for Hand Grasp

Neuro-fuzzy Modeling of Multi-field Surface Neuroprostheses for Hand Grasp Neuro-fuzzy Modeling of Multi-field Surface Neuroprostheses for Hand Grasp PhD Thesis - 2016 Eukene Imatz Ojanguren Supervised by Eloy Irigoyen Gordo and Thierry Keller Neuro-fuzzy Modeling of Multi-field

More information

IKASLEAREN GIDA. Aholkularitza Psikologikoa

IKASLEAREN GIDA. Aholkularitza Psikologikoa IKASLEAREN GIDA Aholkularitza Psikologikoa Ikasturtea: 2016-2017 TITULAZIOA: GRADUA PSIKOLOGIAN ZENTRO: PSIKOLOGIA FAKULTATEA IKASTURTEA: 2016-2017 IKASLEAREN GIDA 1. IRAKASGAIAREN OINARRIZKO EZAUGARRIAK

More information