Oblika eritrocita in njegova deformabilnost pri spremenjenih zunanjih pogojih 2

Transcription

1 MED RAZGL 2000; 39: 3 RAZISKOVALNI ^LANEK Toma` Smrkolj Oblika eritrocita in njegova deformabilnot pri premenjenih zunanjih pogojih 2 Erythrocyte hape and deformability due to variation in external factor IZVLE^EK KLJU^NE BESEDE: eritrociti u~inki zdravil, eritrocit deformabilnot, natrijev alicilat, diamid Med pretakanjem krvi morajo eritrociti talno preminjati vojo obliko, zato je njihova deformabilnot ena njihovih onovnih latnoti. V razikavi mo ku{ali ugotoviti vlogo podmembrankega beljakovinkega ogrodja pri mehanki tabilnoti eritrocitov. Predvidevali mo, da bodo premenjene mehanke latnoti ogrodja vplivale na deformabilnot membrane eritrocita. Membranke latnoti, ki pogojujejo deformabilnot eritrocitov, mo zaledovali z opazovanjem premembe oblike, ki jo eritrociti zavzamejo ob preminjanju zunanjih pogojev. Za preminjanje oblike eritrocitov mo uporabili natrijev alicilat, ki premeni bikonkavni dik, to je fiziolo{ko oblika eritrocita, v ehinocit-kroglo {tevilnimi membrankimi izratki. Nato mo utrdili podmembranko beljakovinko ogrodje z diamidom in ponovno opazovali premembo oblike ob dodatku natrijevega alicilata. Rezultati o pokazali, da diamid zmanj{a deformabilnot eritrocitove membrane. Zmanj{anje je odvino od koncentracije diamida. Deformabilnot membrane je dolo~ena z mehankimi latnotmi podmembrankega beljakovinkega ogrodja. Zmanj{anje deformabilnoti je poledica utrditve ogrodja. ABSTRACT KEY WORDS: erythrocyte drug effect, erythrocyte deformability, odium alicylate, diamide Change in erythrocyte hape are neceary in the circulation of blood, therefore deformability i one of the baic propertie of erythrocyte. A reearch project wa conducted in order to determine the role of the ubmembrane protein keleton in the mechanical tability of erythrocyte. Our hypothei uggeted that change in the mechanical propertie of the protein keleton hould reult in changed deformability of the erythrocyte membrane. The propertie affecting the deformability of erythrocyte were determined by oberving change in erythrocyte hape reulting from variation in external factor. Change in erythrocyte hape were induced uing odium alicylate, which tranform biconcave dic (the phyiological hape of the erythrocyte) into echinocyte, i. e. phere with numerou membrane picule. Diamide wa added to trengthen the ubmembraneou protein keleton and hape change reulting from the addition of odium alicylate were oberved again. The reult ugget that diamide lower the deformability of the erythrocyte membrane. The degree of decreae in deformability depend on diamide concentration. Membrane deformability depend on the mechanical characteritic of the ubmembrane protein keleton. Lower deformability i the reult of higher keleton trength. Toma` Smrkolj, {tud. med., In{titut za biofiziko, Medicinka fakulteta, Lipi~eva 2, 000 Ljubljana. 2 Objavljeno delo je bilo nagrajeno Pre{ernovim priznanjem {tudentom za leto 996.

2 T. SMRKOLJ OBLIKA ERITROCITA IN NJEGOVA DEFORMABILNOST MED RAZGL 2000; UVOD ^love{ki eritrociti (rde~e krvni~ke) o krvne celice, katerih naloga je preno kiika iz plju~ do tkiv in ogljikovega diokida iz tkiv v plju~a. Njihovo funkcijo odra`ata oblika in zgradba. V proceu eritropoeze retikulociti (predtopnja eritrocitov) izgubijo jedro in e koraj docela napolnijo z beljakovino hemoglobinom, kar omogo~a eritrocitom, da prena{ajo potrebne koli~ine dihalnih plinov. Tudi oblika eritrocita je prilagojena fiziolo{kim potrebam pri prenou kiika. Fiziolo{ka oblika eritrocita, ~e ga opazujemo v fiziolo{ki raztopini pod mikrokopom, je bikonkavni dik. Normalni eritrociti imajo premer od 7,5 do 8,3 μm in o debeli okrog,7 μm. Njihova povpre~na protornina je 95 μm 3, povpre~na povr{ina pa 38 μm 2 (). Razmerje protornin eritrocita in krogle z enako povr{ino je 0,6 zaradi plo{~ene oblike eritrocita. Tako je izpolnjen geometrijki pogoj, da eritrociti lahko premenijo vojo obliko. ^e bi bil eritrocit okrogel, bi ne mogel premeniti oblike in bi ne mogel preiti kozi tanke kapilare, ki imajo premer odprtine med 3 in 2 μm ali v vranici celo 0,5 μm (). Membrana eritrocita je zgrajena iz dveh plati membrankih lipidov, v eno ali v obe plati hkrati pa o potopljene membranke beljakovine. Membranki lipidi o fofo- in fingolipidi, njihova razporeditev med notranjo in zunanjo platjo je neimetri~na. Tako na zunanji trani prevladujeta fingomielin in fofatidilholin, na notranji pa fofatidiletanolamin in fofatidilerin. Setavina membrane je tudi holeterol. Poebnot eritrocitov je podmembranka mre`a beljakovin, ki daje membrani trdnot in elati~not. Najpomembnej{e beljakovine te mre`e o pektrin, aktin, beljakovina 4. in beljakovina 4.9. Med eboj in z membrano e ta mre`a povezuje preko poebnih beljakovinkih komplekov, v katerih odelujejo tranmembranke beljakovine (glikoforin in band 3 beljakovina), aducin in tropomiozin (2). ^e podmembranko mre`o raztegnemo, vidimo, da je etavljena ve~inoma iz {eterokotnikov, pa tudi petero- (3 %) in edmerokotnikov (8 %) (3). Spektrin je beljakovina, ki tvori dolge, tanke, elati~ne niti, katerih dol`ina v raztegnjenem tanju je 94 nm. Onova pektrinkih vlaken je dimer z dvema podenotama (α in β). Prevladujo~a oblika v mre`i je tetramer (85%) (3), na{li pa o tudi di- in oligomere te beljakovine. Preko β-podenote e pektrin in z njim celotna beljakovinka mre`a ve`e na ankirin, ta pa e nato ve`e na band 3 beljakovino, lahko pa e mre`a ve`e tudi na beljakovino 4.. Ta e nato pove`e z band 3 beljakovino ali glikoforinom C ali celo neporedno fofatidilerinom (2). Aktin je v eritrocitih v obliki kratkih, debelih vlaken, etavljenih iz 2 do 4 aktinkih podenot. Vezavo med aktinom in pektrinom omogo~a aducin, ki pove~uje afiniteto pektrina do vezave z aktinom (2). Oblika in deformabilnot membrane eritrocita in tem celotne celice ni talna, temve~ je fiziolo{ko in patolo{ko premenljiva. Fiziolo{ko preminjanje oblike e pojavlja pri prehodu kozi ozke kapilare, kjer mora biti oblika eritrocita prilagodljiva tenam kapilare in tem membrana razmeroma mehka. Naprotno pa mora biti v velikih krvnih `ilah in rcu membrana eritrocita zelo nedeformabilna zaradi velikih turbulentnih tokov. Hitro kro`enje krvi v krvnem obtoku zato narekuje tudi hitro in dinami~no prilagajanje elati~noti in trdnoti eritrocitne membrane. Mehanizmi za preminjanje elati~nih latnoti membrane oziroma njene trdnoti vklju~ujejo: foforilacijo beljakovin ogrodja, preminjanje koncentracije magnezija, 2,3-difofoglicerata (v odvinoti od okigeniranoti hemoglobina) in kalcija poredno preko delovanja kalmodulina (2). Za razumevanje obna{anja eritrocita pri raznih pogojih je pomembno poznati elati~ne latnoti membrane, ki jih dolo~amo na onovi meritev (4). Zelo dobro o razikane elati~ne latnoti membrane kot celote, medtem ko je vloga poameznih plati dokaj neznana. Poebej zanimiva je vloga podmembrankega beljakovinkega ogrodja, aj o ugotovili, da prememba v beljakovinki mre`i zaradi genetkih prememb vpliva na mehanke latnoti membrane (5). S preminjanjem ekperimentalnih dejavnikov lahko iz obi~ajne dikoidne oblike eritrocitov dobimo {e dve: ehinocitno in tomatocitno. Stomatocitne oblike dobimo, ~e na dikocite u~inkujemo kationkimi amfifilnimi reagenti, npr. fenotiazinom ali klorpromazinom (). Ehinocite dobimo, ~e eritrocite peremo v fiziolo{ki raztopini in jih nato opazujemo na teklenem objektnem in krovnem teklu. Prav tako lahko ehinocitne oblike dobimo

3 MED RAZGL 2000; 39 pomo~jo nepolarnih ali anionkih amfifilnih kemikalij npr. ma{~obnih kilin, lecitina, `ol~nih kilin, barbituratov, dipiridamola, fenilbutazona in alicilata (). Prehod od dikocitne do ehinocitne oblike je potopen in zajema 4 topnje: ehinocit je dikoiden in nepravilne oblike, ehinocit 2 je plo{~at z `e opaznimi izratki, ehinocit 3 je okrogel ali jaj~at z 0 do 30 majhnimi membrankimi izratki, ki pri feroehinocitu (4. topnja) potanejo ve~ji. Ehinocitno tranformacijo razlo`imo tem, da neka kemikalija vtopi v zunanji loj membrane, ki vebuje predvem nevtralne fofolipide, in tem pove~a povr{ino tega loja, tako pove~a razliko med povr{inama obeh lojev in tem povpre~no ukrivljenot membrane ter povzro~i natanek izratkov, zna~ilnih za ehinocite (7). Za ukrivljenot membrane je pomembna razlika v povr{inah notranjega in zunanjega lipidnega loja (5). Pri protornini 95 μm 3 in povr{ini 38 μm 2 je pri dikocitu potrebna razlika povr{in 0,4 μm 2, pri feroehinocitu pa 0,93 μm 2 (8). Ob upo{tevanju modela, ki predvideva, da kemi~na nov vtopi v membranko plat in tem pove~a njeno povr{ino, lahko hitro klepamo, da je pove~anje povr{ine in tem prememba oblike odvina od koncentracije te kemi~ne novi. Kljub temu da zgoraj navedeni mehanizem za ehinocitno premembo ne vklju~uje ogrodja, e ne moremo ogniti dejtvu, da ogrodje kot tretja plat tudi odeluje v teh tranformacijah. Pri analizi vpliva ogrodja na mehanke latnoti membrane mo membrano obravnavali kot triplatno trukturo, etavljeno iz dveh plati lipidov in beljakovinkega ogrodja (9). Namen na{e naloge je bil razikati vlogo ogrodja pri mehanki tabilnoti eritrocitov, in icer z opazovanjem prememb v eritrocitu po dolo~eni modifikaciji ogrodja. Haet in odelavci o leta 980 ugotovili, da z diamidom lahko u~inkovito vplivamo na latnoti ogrodja in tem plo{ne eritrocitove mehanke latnoti, kar o tudi razikali in kvantitativno izmerili premembe v deformabilnoti membrane po delovanju dveh razli~nih koncentracij diamida pomo~jo reokopa (6). V na{em primeru pa mo deformabilnot ocenjevali na onovi premembe oblike eritrocita zaradi zunanjih dejavnikov ter pove~anje ali zmanj{anje deformabilnoti povezali z razli~nimi koncentracijami diamida, v priotnoti katerega mo inkubirali eritrocite. Tako mo lahko poredno klepali tudi na premenjene mehanke latnoti ogrodja. MATERIALI IN METODE Priprava eritrocitov in inkubacija z SH-reagenti Najprej mo izmerili hematokritko vrednot upenzije ~love{kih eritrocitov v fiziolo{ki raztopini. Supenzijo eritrocitov v fiziolo{ki raztopini (54mmol/l NaCl) mo centrifugirali pri 2500/min 0 minut in nato odtranili upernatant. Dodali mo 9 protornin raztopine A (90 mmol/l KCl, 45 mmol/l NaCl, 0 mmol/l Na 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4, 44 mmol/l aharoze, 0,05% albuminov, ph 8,0) in centrifugirali tako natalo upenzijo pri 2500/min 0 minut. Po odtranitvi upernatanta mo dodali protornino 00 mmol/l jodoacetata in upenzijo inkubirali pri 37 C 5 minut. Sledilo je 3-kratno piranje z raztopino A (ph 8,0), med dvema piranjema mo centrifugirali pri 2500/min 0 minut in odtranili upernatant. Nato mo inkubirali eritrocite v 0,05, 0,, 0,25 in 0,5mmol/l raztopini diamida pri 37 C 5 minut (po Haetu in odelavcih) (6). Potopki za preminjanje oblike eritrocitov Po inkubaciji v raztopini z izbrano koncentracijo diamida (glej Priprava eritrocitov in inkubacija SH-reagenti), mo 3-krat pirali z raztopino A (ph 7,4), med dvema piranjema mo centrifugirali pri 2500/min 0 minut. Po piranju mo dodali utrezne koncentracije natrijevega alicilata tako, da mo dobili hematokritko vrednot 2 %. Supenzijo mo centrifugirali pri 000/min minuto in nato odpipetirali zgo{~eno upenzijo pri dnu, aj bi druga~e v vidnem polju mikrokopa opazovali premajhno {tevilo eritrocitov, ker je pri 2 % hematokritu upenzija redka (po Haetu in odelavcih) (6). Zajem in obdelava like eritrocitov Kapljico upenzije mo preneli na objektno teklo, ga pokrili in opazovali eritrocite pod 000-kratno pove~avo (z imerzijkim objektivom) ter nato pomo~jo videokamere poneli liko v vidnem polju na videotrak. Sledila je digitalizacija like in preno na PC-ra- ~unalnik, nato pa izri like tikalnikom. 25

4 T. SMRKOLJ OBLIKA ERITROCITA IN NJEGOVA DEFORMABILNOST MED RAZGL 2000; 39 Kvantitativna obdelava je potekala na podlagi natinjenih lik. Na vaki liki mo dolo- ~ili {tevilo dikocitov, ehinocitov in vmenih oblik (takih, ki {e nio bili ehinociti, vendar o bile premembe oblike membrane `e opazne). REZULTATI Oblike eritrocitov Najprej mo pripravili raztopini, ki ta na likah jano pokazali razlike med dikocitom in ehinocitom. Raztopina brez natrijevega alicilata je dala liko, na kateri o ami dikociti, 20mmol/l raztopina natrijevega alicilata pa povzro~ila, da o koraj vi dikociti pre{li v ehinocite. Vpliv natrijevega alicilata na obliko eritrocitov pri razli~nih koncentracijah diamida Pri vaki koncentraciji natrijevega alicilata mo naredili ve~ lik, odvino od gotote eritrocitov v vidnem polju, tako da mo pre{teli vaj 00 eritrocitov pri poamezni koncentraciji natrijevega alicilata. Rezultati o prikazani v tabelah 5. Skoraj pri veh meritvah je mo~ opaziti, da je dolo~en odtotek ehinocitov prioten tudi v raztopinah brez dodanega natrijevega alicilata (glej tabele pri koncentraciji natrijevega alicilata 0), zatorej mo e odlo~ili, da razliko med odtotkom dikocitov in 00 % imenujemo ozadje, ker o~itno ni natala zaradi delovanja natrijevega alicilata, temve~ zaradi variacij v uporabljenih vzorcih. Za vrednotenje rezultatov in rianje grafov mo zato uporabili popravljene vrednoti odtotka dikocitov in vote ehinocitov in vmenih oblik. Popravljene vrednoti dobimo, ~e odtotku dikocitov pri vaki koncentraciji natrijevega alicilata pri- {tejemo vrednot ozadja, oziroma voti ehinocitov in vmenih oblik od{tejemo to vrednot. 26 Tabela. [tevilo poameznih oblik eritrocitov pri razli~nih koncentracijah natrijevega alicilata, brez inkubacije z diamidom. Ozadje = 0 %. c (Na-al) koncentracija natrijevega alicilata v mmol/l; n (d) in % (d) {tevilo in odtotek dikocitov; n (v) in % (v) {tevilo in odtotek eritrocitov vmene oblike; n (e) in % (e) {tevilo in odtotek ehinocitov; n (kupaj) {tevilo veh eritrocitov; % (e + v) vota odtotkov ehinocitov in eritrocitov vmene oblike ,9 9,4,7 3, ,9 30,5 6,7 47, , 36,3 9, ,9 35,5 27,6 63, ,4 37,9 39,7 77, ,8 5,5 92,7 98,2 Tabela 2. [tevilo poameznih oblik eritrocitov pri razli~nih koncentracijah natrijevega alicilata, po inkubaciji z 0,05mmol/l diamidom. Ozadje = 5,6 %. c (Na-al) koncentracija natrijevega alicilata v mmol/l; n (d) in % (d) {tevilo in odtotek dikocitov; n (v) in % (v) {tevilo in odtotek eritrocitov vmene oblike; n (e) in % (e) {tevilo in odtotek ehinocitov; n (kupaj) {tevilo veh eritrocitov; % (e+v) vota odtotkov ehinocitov in eritrocitov vmene oblike ,4 5,6 0 5, ,6 8,5,9 0, ,6 26, 6,3 32, ,3 55,6 3,2 68, , 29, ,5 44,2 39,3 83, ,9 95, 00

5 MED RAZGL 2000; 39 Tabela 3. [tevilo poameznih oblik eritrocitov pri razli~nih koncentracijah natrijevega alicilata, po inkubaciji z 0,mmol/l diamidom. Ozadje = 3,9 %. c (Na-al) koncentracija natrijevega alicilata v mmol/l; n (d) in % (d) {tevilo in odtotek dikocitov; n (v) in % (v) {tevilo in odtotek eritrocitov vmene oblike; n (e) in % (e) {tevilo in odtotek ehinocitov; n (kupaj) {tevilo veh eritrocitov; % (e+v) vota odtotkov ehinocitov in eritrocitov vmene oblike ,,7 2,2 3, ,4 9, 3,5 2, ,2,5 6,3 29, ,6 45 4,4 59, ,5 5,5 74,5 Tabela 4. [tevilo poameznih oblik eritrocitov pri razli~nih koncentracijah natrijevega alicilata, po inkubaciji z 0,25mmol/l diamidom. Ozadje = 2,8 %. c (Na-al) koncentracija natrijevega alicilata v mmol/l; n (d) in % (d) {tevilo in odtotek dikocitov; n (v) in % (v) {tevilo in odtotek eritrocitov vmene oblike; n (e) in % (e) {tevilo in odtotek ehinocitov; n (kupaj) {tevilo veh eritrocitov; % (e+v) vota odtotkov ehinocitov in eritrocitov vmene oblike ,2 7,9 4,8 2, ,7,7 0,5 22, ,3 24 5,7 39, ,3,6 7, 40, , 35, 7,8 52, ,8 27,5 29,6 57, ,7 35,8 22,4 58, ,7 34,8 26,6 6,4 27 Tabela 5. [tevilo poameznih oblik eritrocitov pri razli~nih koncentracijah natrijevega alicilata, po inkubaciji z 0,5mmol/l diamidom. Ozadje = 7,7 %. c (Na-al) koncentracija natrijevega alicilata v mmol/l; n (d) in % (d) {tevilo in odtotek dikocitov; n (v) in % (v) {tevilo in odtotek eritrocitov vmene oblike; n (e) in % (e) {tevilo in odtotek ehinocitov; n (kupaj) {tevilo veh eritrocitov; % (e+v) vota odtotkov ehinocitov in eritrocitov vmene oblike ,3 7,7 0 7, , 9,8 2,, ,5 2,4 7, 28, ,8 9 2,2 3, ,8 24 3,2 37, ,6 36,5 6,9 53,4

6 T. SMRKOLJ OBLIKA ERITROCITA IN NJEGOVA DEFORMABILNOST MED RAZGL 2000; Slika. Odvinot odtotka dikocitov od koncentracije natrijevega alicilata po inkubaciji v raztopinah diamida razli~nih koncentracij. Tabela 6. Koncentracija natrijevega alicilata, pri kateri je odtotek dikocitov enak 50 %, (c /2 ) v odvinoti od koncentracije diamida (c d ). c d (mmol/l) RAZPRAVLJANJE c /2 (mmol/l) 0,00 7,5 0,05 8,6 0,0,8 0,25 22,0 0,50 65,5 V na{em delu mo preu~evali vpliv podmembrankega beljakovinkega ogrodja pri deformabilnoti eritrocitove membrane, zato mo z reagenti, ki preminjajo obliko membrane, delovali na eritrocite, katerih ogrodje mo utrdili do razli~nih topenj z razli~nimi koncentracijami diamida. Opazovali mo preminjanje dele`a poameznih oblik eritrocitov z nara{~anjem koncentracije natrijevega alicilata in nara{~anjem koncentracije diamida, v katerem mo inkubirali eritrocite. Vrednot % (e + v) je v na{ih ekperimentalnih pogojih bolj zaneljiva za ocenjevanje dogajanj kot vrednoti % (e) in % (v) poebej. V metodah mo namre~ `e omenili, da je {tetje potekalo na onovi like. Precej zaneljivo e da oceniti, da ima neki eritrocit obliko dikocita, toda lo~evanje med ehinocitom in vmeno obliko je v~aih te`avno, Slika 2. Odvinot koncentracije natrijevega alicilata, pri kateri je odtotek dikocitov enak 50 %, (c /2 ) od koncentracije diamida (c d ). ker e iz like ne da natan~no koli~inko oceniti topnje deformacije. Tako mo med {tetjem lahko neki zgodnji ehinocit {teli {e za vmeno obliko, pozno vmeno obliko pa `e za ehinocit, zato ka`e vrednotima % (e) in % (v) pripiovati manj{o te`o. Iz rezultatov lahko vidimo, da zvi{anje koncentracije natrijevega alicilata pomeni tudi ve~anje vote dele`ev ehinocitov in vmenih oblik v populaciji eritrocitov, kar potrjuje ugotovitve, da je natrijev alicilat ehinocitni dejavnik (0). Njegov u~inek razlagamo z razliko povr{in notranjega in zunanjega lipidnega loja: ΔA A 2 kjer je A povr{ina zunanjega in A 2 notranjega lipidnega loja. Po tem mehanizmu torej ne upo- {tevamo mehankih latnoti ogrodja, ki neutrjen prakti~no ne vpliva na deformabilnot in obliko membrane (4). Za plokovni pro`notni modul ogrodja (K ) v tem primeru lahko re~emo, da je bitveno manj{i od plokovnih pro`notnih modulov zunanje (K ) oziroma notranje lipidne plati (K 2 ). Pozitivna razlika ΔA povzro~i ehinocitno tranformacijo, in icer je tranformacija tem bolj izrazita, ~im ve~ja je ta razlika. Pove~anje zunanje povr{ine v primerjavi z notranjo natane zaradi mno`i~nej{ega vklapljanja molekul natrijevega alicilata v zunanji lipidni loj membrane. Natrijev alicilat je namre~ negativno nabit in ga fofatidilerin, ki je tudi negativno nabit in ga je ve~ v notranjem lipidinem loju, odbija (). Najdemo pa tudi

7 MED RAZGL 2000; 39 drugo razlago, po kateri pride do razlike v povr{inah zaradi delovanja ehinocitnih dejavnikov na band 3 beljakovine, ki premenijo vojo konformacijo tako, da e pove~a povr{ina zunanje plati (2). Izra~un vrednoti % (e + v) nam poredno pove, kako mo~no e eritrociti deformirajo z nara{~ajo~o koncentracijo natrijevega alicilata, pri ~emer privzamemo, da je odtotek premenjenih eritrocitov v populaciji (% (e + v)) pokazatelj deformacije, ki bi jo utrpel povpre~en eritrocit. Tako je pri nizkih koncentracijah natrijevega alicilata vrednot % (e + v) majhna, pri vi{jih pa ve~ja. Zanimiva je tudi oblika krivulje, ~e % (e + v) nana{amo v odvinoti od koncentracije natrijevega alicilata, ki je igmoidna. Iz odvinoti odtotka premenjenih dikocitov od koncentracije natrijevega alicilata (lika ) opazimo, da predhodna inkubacija upenzije v diamidu zmanj{a deformabilnot eritrocitov, kar o ugotovili tudi Haet in odelavci (6). U~inek dolo~ene koncentracije natrijevega alicilata je odvien od priotnoti in koncentracije diamida. V modelu, ki ga za mehanke latnoti membrane eritrocita predvidevajo Svetina in odelavci (9), definiramo 3 plokovne pro`notne module: po enega za vako lipidno plat (K, K 2 ), zadnji modul pa opiuje vpliv podmembrankega beljakovinkega ogrodja (K ). Modula, ki e nana{ata na lipidno dvoplat, nita odvina od priotnoti diamida, za modul, ki e nana{a na beljakovinko ogrodje pod membrano, pa je to pri~akovano. Sam mehanizem delovanja diamida na pro`notne latnoti ogrodja je {e dokaj nejaen, znano pa je, da diamid zamre- `i povezave med molekulami pektrina (6) z okidacijo SH-kupin, ki med eboj nato tvorijo diulfidne moti~ke. Pove~a e tudi {tevilo pektrinkih molekul v dimerni obliki. Z utrditvijo ogrodja dvoplaten model membrane, katerim mo razlagali ehinocitno tranformacijo z natrijev alicilatom, potane triplaten, kajti ogrodje potane viden dejavnik pri deformabilnoti membrane. Njegov u~inek opi{emo z efektivno razliko povr{in. Kot je bilo povedano v uvodu, je razlika povr{in med zunanjo in notranjo lipidno platjo pri dikocitu 0,4 μm 2, pri feroehinocitu pa 0,93 μm 2. Efektivno razliko povr{in zapi{emo formulo (9): 29 ( h( K + K ) + h ΔA efek = (.) K ) K A + ( h K hk ) K A K ( K + K ) h + 2K K h 0 20 ( hk + 2h 2 h + 2KK h K ) K A 30 h je oddaljenot med redinama obeh lipidnih plati, h pa oddaljenot med ogrodjem in redino notranje plati, A 0, A 20, A 30 o ravnovene povr{ine zunanje in notranje lipidne plati ter ogrodja. ^e formuli za efektivno razliko povr{in pri ehinocitu in dikocitu od{tejemo, dobimo: Δ ( ΔA( efek. ) = ΔA( efek. ) ΔA( efek. ) h(( K + K ) + h K ) K ( A A 2, eh, d eh d = 2 K K K h K Kh ( 2 + ) + 2 h + K( K + K2) h ) Za poenotavitev formule definirajmo dve K h vrednoti: r = in β = in napi{imo K h izraz za razliko efektivnih razlik povr{in ehinocita in dikocita: Δ ( ΔA( efek. ) ( A, eh A, d )( + r + rβ) = + r + 2rβ( + β) Dokler je vpliv ogrodja zanemarljiv (K = 0 in r = 0), velja: Δ(ΔA(efek.)) = A,eh A,d Ko pa K nara{~a (ogrodje potaja trdnej- {e), e Δ(ΔA(efek.)) zmanj{uje, ker e r pove- ~uje in pri r = vidimo, da je enaka ( + β)( A, eh A, d ). + 2β( + β)

8 T. SMRKOLJ OBLIKA ERITROCITA IN NJEGOVA DEFORMABILNOST MED RAZGL 2000; β Tabelirajmo vrednot p =, ki + 2β(+ β) podaja razmerje med razliko efektivnih razlik povr{in Δ(ΔA(efek.)) ter razliko povr{in zunanje plati ehinocita in dikocita A,eh A,d. Tabela 7. Odvinot vrednoti p od β. β 0,40 2 0, 3 0,6 4 0,2 p Iz tabele vidimo, da je pri β ve~jih od ena, Δ(ΔA(efek.)) precej manj{a od A,eh A,d, kar pomeni, da moramo za Δ(ΔA(efek.)), ki je potrebna za ehinocitno tranformacijo (0,53 μm 2 ) z natrijev alicilatom, povzro~iti zelo veliko ΔA. Torej za tranformacijo po inkubaciji z diamidom potrebujemo veliko vi{- jo koncentracijo natrijevega alicilata. V na{i razikavi icer nimo mogli neporedno izmeriti modula K z opazovanjem deformacij eritrocitov, vendar mo z opazovanjem prememb koncentracije natrijevega alicilata, ki je potrebna za vidno premembo oblike ve~jega {tevila celic, pri zvi{anju koncentracije diamida dobili ne amo kvalitativne, temve~ tudi kvantitativne vrednoti, ki poredno opiujejo deformabilnot eritrocita in tem preminjanje tretjega pro`notnega modula (K ). Prikladna vrednot za ugotavljanje u~inka diamida na deformabilnot membrane je c /2, ki podaja koncentracijo natrijevega alicilata, pri kateri je polovica eritrocitov premenjena bodii v vmeno obliko ali ehinocite, oziroma je polovica eritrocitov {e nepremenjenih dikocitov. Tako lahko K ocenimo tudi kvantitativno. Ve~ji K pomeni manj deformabilno membrano in tem vi{jo koncentracijo natrijevega alicilata, potrebno za tranformacijo 50 % dikocitov. Pove~ana trdnot e odrazi na vrednoti c /2. Vpra{ajmo e torej, kako je pro`notni modul ogrodja in z njim c /2, odvien od koncentracije diamida c d. Iz tabele 6 in like 2 vidimo, da odno med c /2 in c d ni linearen, temve~ je c /2 neka poten~na funkcija c d. Zvi- {anje koncentracije diamida progreivno pove~uje trdnot membrane, vendar je mehanizem, ki je odgovoren za tak{no odvinot, neznan. Razpravljanje naj zaklju~imo z ugotovitvijo, da ekperimentalni podatki podpirajo predlagane modele in mehanizme za ehinocitne tranformacije ter pove~anje trdnoti beljakovinkega ogrodja, vendar pa lahko natopajo tudi druga~ni pojavi. V literaturi najdemo podatek, da pri dolo~enih ehinocitnih tranformacijah pride do trganja ogrodja od membrane, kar je razlog, da v ehinocitnih izratkih le-tega nio na{li (3). Potavlja e vpra{anje, ali bi torej utrditev ogrodja lahko prepre~ila trganje in tem natanek izratkov. Natan~nej{e ugotovitve o u~inku diamida na latnoti ogrodja, predvem na molekularni ravni, bi morda zagotovile vaj nekaj podatkov, ki bi lahko dali odgovor na zgornje vpra{anje. ZAKLJU^KI Sprememba oblike eritrocita je teno povezana z deformabilnotjo membrane, ki je dolo~ena z mehankimi latnotmi obeh lipidnih lojev in beljakovinkega ogrodja tik pod membrano. Spremembo oblike, ki natane v okolju z natrijev alicilatom, zmanj{amo z utrjevanjem podmembrankega beljakovinkega ogrodja z dodatkom diamida. S fizikalnim modelom membrane eritrocita mo pokazali, da je zmanj{anje efektivne razlike povr{in dveh lipidnih lojev, ki neporedno dolo~a obliko eritrocita, odvino od utrditve beljakovinkega ogrodja. ZAHVALA Zahvaljujem e mentorju prof. dr. Sa{i Svetini za vodenje in navete pri tem delu. Zahvaljujem e tudi doc. dr. Marjanu Grou in dr. Sonji Vrhovec za uvajanje v laboratorijko delo ter mag. Primo`u Peterlinu in Marjanu Kozamerniku za pomo~ pri ra~unalni{ki obdelavi in izdelavi likovnega gradiva.

9 MED RAZGL 2000; 39 LITERATURA. Bei M. Living Blood Cell and their Ultratructure. Berlin: Springer-Verlag; 973. p Bennett V. The pectrin-actin junction of erythrocyte membrane keleton. Biochim Biophy Acta 989; 988: Liu S, Derick LH. Molecular anatomy of the red blood cell membrane keleton: Structure-function relationhip. Sem Hematol 992; 29: Mohanda N, Evan E. Mechanical propertie of the red cell membrane in relation to molecular tructure and genetic defect. Annu Rev Biomol Struct 994; : Chabanel A, Sung KLP, Rapiejko J, Prchal JT, Palek J, Liu SC, Chien S. Vicoelatic propertie of red cell membrane in hereditary elliptocytoi. Blood 989; 73: Haet CWM, Ficher TM, Plaa G, Deuticke B. Stabilization of erythrocyte hape by a chemical increae in membrane hear tiffne. Blood Cell 980; 6: Beck JS. Echinocyte Formation: A tet cae for mechanim of cell hape change. J Theor Biol 978; 7: Beck JS. Relation between membrane monolayer in ome red cell hape tranformation. J Theor Biol 978; 75: Svetina S, Brumen B. The Role of Membrane Elatic Propertie and Cell Volume in the Formation of Red Blood Cell Shape. In: Benga Gh, Tager JM, editor. Biomembrane Baic and Medical Reearch. Berlin: Springer-Verlag, 988. p Vrhovec S. Vpliv membranko aktivnih u~inkovin na veikulacijo eritrocitov. Doktorko delo. Ljubljana 990. p Sheetz MP, Singer SJ. Biological membrane a bilayer couple. A molecular mechanim of drug-erythrocyte interaction. Proc Nat Acad Sci USA 974; 7: Gima J, Ried C. Do band 3 protein conformational change mediate hape change of human erythrocyte? Mol Membr Biol 995; 2: Pripelo