Penjanaan Kultur Akar Adventitius Daripada Andrographis paniculata Serta Analisis Profil Metabolit

Transcription

1 Undergraduate Research Journal for Biomolecular Sciences and Biotechnology ISSN Penjanaan Kultur Akar Adventitius Daripada Andrographis paniculata Serta Analisis Profil Metabolit Nurul Nadiah Rusli 1, Chew Jin Kiat 2 & Ismanizan Ismail 1 1 Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Selangor, Malaysia 2 Institut Biologi Sistem (INBIOSIS), Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Selangor, Malaysia *mel-e pengarang rujukan: maniz@ukm.edu.my Abstrak: Andrographis paniculata merupakan tumbuhan perubatan dengan kemampuan menghasilkan pelbagai bioaktif kompaun. Pengekstrakan terus kompaun bioaktif daripada tumbuhan kurang efisyen kerana dipengaruhi oleh faktor persekitaran. Teknik kultur tisu diaplikasikan untuk menjana akar adventitius serta menganalisis profil metabolit daripada A. paniculata. Kajian awal dengan menyediakan anak pokok A. paniculata in vitro di dalam MS medium dan hormon BAP menunjukkan bahawa biji benih tidak matang bercambah. Penjanaan akar adventitius dilaksanakan dengan MS medium pada kepekatan NAA yang berbeza. Peratus jumlah eksplan yang menghasilkan akar tertinggi pada kepekatan NAA 1.0 mg/ml (daun: 72 %, batang 100 %) tanpa kehadiran cahaya. Perambatan menggunakan media cecair 1.0 mg/ml NAA dan faktor pencahayaan untuk meningkatkan biojisim akar adventitius. Tanpa kehadiran cahaya, kadar pertumbuhan tinggi (biojisim akhir: g) berbanding kehadiran cahaya (biojisim akhir: g). Hormon NAA memberikan kesan kepada morfologi akar adventitius dengan faktor pencahayaan. Pengekstrakan menggunakan metanol dan kaedah pengesanan GC-MS untuk menganalisis profil metabolit memberikan keputusan bahawa akar adventitius dijana dengan kehadiran cahaya memberikan metabolit yang konsisten. Melalui data GC-MS, metabolit akar yang dijana dengan kehadiran cahaya lebih tinggi berbanding metabolit sampel akar in vitro. Ini membuktikan akar utuh A. paniculata menghasilkan pelbagai jenis metabolit untuk mengatasi tekanan-tekanan persekitaran. Kesimpulannya, akar adventitius positif dijana menggunakan 1.0 mg/ml NAA dan metabolit di dalam akar A. paniculata in vitro konsisten berbanding tumbuhan utuh. Kata kunci: Andrographis paniculat; kultur tisu; akar adventitius; profil metabolit Abstract: Andrographis paniculata is a medicinal plant with the ability to produce a variety of bioactive compounds. Direct extraction of bioactive compounds from plants less efficient because influenced by environmental factors. Tissue culture technique was applied to generate adventitious roots and analyzing the metabolite profile of A. paniculata. Preliminary studies by providing saplings of A. paniculata in vitro in MS medium and hormone BAP showed that immature seeds germinate. Adventitious root regeneration was carried out with MS medium at different concentrations of NAA. Percentage of total root explants produce the highest concentrations of NAA 1.0mg / ml (leaf: 72%, rod 100%) in the absence of light. Propagation using liquid media 1.0mg / ml of NAA and lighting factor for increasing biomass adventitious roots. Without the presence of light, high growth rates (final biomass: 4.554g) as compared to the presence of light (biomass end: 3.906g). NAA hormones affect the morphology of adventitious roots with the lighting. Using methanol extraction and GC-MS detection method for analyzing the metabolic profile. Adventitious roots generated by the presence of light gives a metabolite consistent. By GC-MS data, metabolite roots intact root samples compared metabolites in vitro. This proves the roots intact A. paniculata produce various kinds of metabolites to cope with the pressures of the environment. In conclusion, the positive adventitious roots generated using 1.0mg / ml of NAA and its metabolites in the roots of A. paniculata in vitro consistent compared to intact plants. Keywords: Andrographis paniculata; tissue culture; adventitious roots; metabolite profiling 190

2 1. Pengenalan Tumbuhan berasaskan perubatan adalah sumber ubatan utama dalam industri perubatan dan sebatian bioaktif. Sebatian ini diekstrak daripada tumbuh-tumbuhan yang digunakan sebagai bahan tambahan makanan, pigmen, pewarna, racun serangga, kosmetik, minyak wangi dan bahan kimia (Balandrin et al. 1985). Andrographis paniculata Nees (keluarga Aanthaceae) yang turut dikenali sebagai Hempedu Bumi di Malaysia adalah salah satu daripada tumbuh-tumbuhan ubatan dan biokilang sebatian bioaktif yang mempunyai ciri-ciri perubatan yang meluas, seperti imun-rangsangan, anti-keradangan, anti-kesuburan, pelindung hati, anti-hiv dan hempedu rembesan rangsangan (Jarukamojorn & Nemoto 2008). Andrographis paniculata juga adalah salah satu tumbuhtumbuhan ubatan yang paling penting dan digunakan secara meluas dalam sistem perubatan tradisional serta mempunyai aktiviti farmakologi (Mathew et al. 2016). Beberapa metabolit sekunder yang terdapat pada Andrographis paniculata, termasuk lactones diterpene, flavonoid dan polifenol (Li et al. 2007). Tumbuh-tumbuhan adalah kaya dengan sumber metabolit sekunder yang berharga dan sentiasa disintesis serta metabolit sekundernya berkumpul semasa kitar hidupnya. Kualiti dan kuantiti metabolit sekunder yang dikumpul daripada tumbuhan liar dan di kawasan terjaga tidak tetap dan heterogen bergantung kepada keadaan alam sekitar. Serangan, penyakit dan penggunaan racun perosak tambahan mengurangkan kualiti bahan-bahan tumbuhan. Masalah-masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan teknik in vitro. Penggantungan sel tumbuhan, akar rerambut dan akar adventitius secara kultur digunakan sebagai "kilang-kilang bahan bioaktif" semula jadi untuk menghasilkan sebatian tumbuhan yang diperolehi (Gerth et al. 2007). Dengan teknik tersebut, metabolit sekunder diekstrak dan dihasilkan dalam kuantiti yang besar, serta kualiti yang baik dan stabil serta dihasilkan dengan cepat dalam medium kultur yang sesuai. Oleh itu, penghasilanmetabolit sekunder dalam keadaan in vitro telah menjadi medan aktif penyelidikan (Sato et al., 2001). Akar adventitius telah berjaya dikulturkan kerana mudah dilaksanakan untuk pengeluaran metabolit bernilai tinggi sebagai bahan sekunder farmaseutikal, kepentingan nutraseutikal dan perindustrian (Murthy et al. 2008). Kaedah kultur tisu dan akar secara in vitro adalah stabil dan boleh membiak dengan cepat di dalam medium kultur yang sesuai. Penanaman secara in vitro adalah alternatif yang sesuai untuk penanaman tumbuhan keseluruhan untuk penghasilan sebatian yang dikehendaki (Sharma 2012). Oleh itu, di dalam kajian ini, penjanaan kultur akar adventitius daripada Andrographis paniculata secara in vitro dilaksanakan untuk menganalisis profil metabolit sekunder. 2. Bahan dan Kaedah 2.1 Bahan Kajian Biji benih daripada pokok Andrographis paniculata Nees (Acanthaceae) diperolehi daripada Rumah Tumbuhan Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Selangor Darul Ehsan. Medium pertumbuhan yang digunakan adalah medium Murashige dan Skoog (MS). Hormon pengawalatur percambahan biji benih adalah 6-benzilaminopurin (BAP) manakala α-naphthelene asid asetik (NAA) untuk penjanaan akar adventitius. Agen penstrilan adalah alkohol etanol pada kepekatan 70%, sodium hipoklorit (Clorox) pada kepekatan 50% dan bahan pencuci Tween Penyediaan anak pokok Andrographis paniculata secara in vitro Biji benih dibasuh menggunakan air yang mengalir selama 30 minit. Biji benih direndam di dalam larutan 30 ml 0.3% Tween-20 selama 20 minit. Seterusnya, biji benih direndam di dalam larutan 30 ml 70% etanol selama 2 minit, ditambah larutan 100% etanol dan 9 ml air suling (H 2O). Biji benih tersebut kemudian direndam di dalam larutan 30 ml Clorox dengan kepekatan 50% selama 5 191

3 minit. Selepas itu, biji benih dibilas dengan air steril sebanyak 5 kali dan dikeringkan. Biji benih dikulturkan ke atas media MS dan ditambah 1mg/L 6-benzilaminopurin (BAP). Proses percambahan direkodkan selama 1-6 minggu. 2.3 Penjanaan kultur akar adventitius Daun dan batang anak pokok Andrographis paniculata dipotong secara aseptik ke dalam cm 2 dan diinokulasi pada MS (Murashige & Skoog 1962) medium dengan berbeza kepekatan α- naphthelene asid asetik (NAA) (0.0 mg/ml-2.0mg/ml. Kultur dieram di tempat yang tiada kehadiran cahaya dan kehadiran cahaya pada 25±1⁰C. Pertumbuhan akar adventitius direkodkan dengan mengira jumlah akar yang telah dihasilkan dalam jangka masa 7 hari selama 7 minggu. 2.4 Kultur akar adventitius di dalam media cecair Pertumbuhan akar adventitius telah diukur berdasarkan berat awal dan berat akhir jisim kering dalam tempoh satu sehingga 6 minggu. Kadar pertumbuhan yang tertentu adalah dikira dari (X - Xo) melawan masa (t) plot, di mana Xo adalah biojisim awal pada masa inokulasi, X adalah biojisim akhir selepas masa inokulasi. 2.5 Pemencilan metabolit sekunder Pemencilan metabolit sekunder daripada akar adventitius Andrographis paniculata menggunakan bahan pelarut iaitu metanol. 3 gram sampel akar adventitius dicampurkan dengan 100 ml metanol dan dibiarkan di atas 0ºС plat panas pengacau magnet selama 3 hari. Selepas 3 hari, campuran itu ditapis menggunakan corong turas dan cecair yang keluar adalah campuran metanol dan metabolit sekunder daripada akar adventitius A. Paniculata. 2.6 Pemekatan sampel Sampel campuran yang mengandungi bahan pelarut dan metabolit sekunder A. Paniculata ditingkatkan kadar kepekatannya menggunakan pengewap putaran. Melalui proses ini, bahan pelarut akan ditingkatkan daripada sampel melalui proses evaporasi. Sampel yang digunakan diletakkan di dalam kelalang dan kemudiannya diletakkan dengan betul pada mesin pengewap putaran. Kelalang dipusingkan pada kelajuan yang sesuai dan penyedut vakum kemudiannya diaktifkan. Kelalang direndam di dalam rendaman air dan suhu air hendaklah tidak melebihi suhu takat didih bahan pelarut. Bahan pelarut akan dikumpul di dalam kondenser dan menitis ke dalam kelalang pengumpul. Setelah semua bahan pelarut diasingkan daripada sampel melalui proses evaporasi, vakum dilepaskan. Kelalang yang mengandungi sampel dikeluarkan daripada rendaman air dan pusingan dihentikan. Bahan pelarut yang dikumpul di dalam kelalang pengumpul dibuang manakala sampel yang dipekatkan akan dianalisa menggunakan kaedah GC-MS. 2.7 Analisis metabolit sekunder menggunakan kaedah GC-MS Analisis metabolit sekunder daripada A. Paniculata menggunakan kaedah GC-MS. Sampel akar adventitius telah dihantar ke INBIOSIS UKM untuk dijalankan ujian pengesanan biomolekul menggunakan teknik Gas Chromatography Mass Spectrophotometry (GC-MS). Sampel akar adventitius dianalisis menggunakan Agilent 7890A Gas Chromatography (GC) yang dipasangkan terus kepada sistem Mass Spectrometer (MS) Agilent 5975C MSD lengai dengan pengesan paksi ganda tiga. Sebatian dipisahkan pada 30m 250µm 0.25µm kolum DB-5MS UI (Agilent Technologies). Suhu kolum telah ditingkatkan daripada 50⁰C hingga 250⁰C pada kadar 6⁰C/min; suhu penyuntik, 250⁰C; isipadu penyuntik, 1µL; suhu pindah, 325⁰C. MSD Chemstation telah digunakan untuk mengenalpasti puncak dalam GC kromatogram mentah. Pencarian kepustakaan 192

4 Bilangan biji benih Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech. 1, 2017 telah dijalankan untuk semua puncak menggunakan NIST/EPA/NIH versi 2.0, dan hasil telah digabungkan di dalam satu jadual. 3. Hasil dan Perbincangan 3.1 Percambahan biji benih anak pokok Andrographis paniculata secara in vitro 450 Graf bilangan percambahan biji benih selama 1-6 minggu Bilangan biji benih yang tidak bercambah Bilangan biji benih yang bercambah Minggu Rajah 1. Graf bilangan percambahan biji benih selama 1-6 minggu. Bilangan biji benih mula bercambah pada minggu pertama dan percambahan biji benih terhenti pada minggu keenam. Berdasarkan Rajah 1, jumlah biji benih yang telah bercambah adalah 330 daripada jumlah keseluruhan sebanyak 400. Jumlah percambahan biji benih ini dikira berdasarkan 20 piring petri yang setiap satunya mengandungi 20 biji benih, MS media dan hormon pengawalatur BAP (1mg/mL). Berdasarkan pemerhatian, didapati hanya biji benih yang berwarna putih bercambah dengan cepat seawal 3 hari manakala biji benih yang berwarna coklat tidak bercambah. Sebanyak 70 biji benih yang berwarna coklat pula merupakan biji benih yang telah matang. Permukaan biji benih tersebut diselaputi oleh lapisan testa yang tebal. Lapisan ini menghalang penyerapan air daripada agar dan seterusnya menyebabkan percambahan sukar untuk berlaku. Testa ini merupakan bahagian luar biji benih atau selaput kulit yang berfungsi sebagai perlindungan biji benih (Kolotelo, 1997). Biji benih yang berwarna putih merupakan biji benih yang muda. Biji benih ini mudah bercambah kerana mempunyai lapisan testa yang nipis yang membolehkan penyerapan air daripada medium percambahan berlaku dengan lebih pantas. 3.2 Penjanaan kultur akar adventitius daripada anak pokok Andrographis paniculata secara in vitro Di dalam penjanaan kultur akar adventitius, hanya daun dan batang yang muda digunakan sebagai eksplan. Eksplan yang muda digunakan kerana mempunyai lapisan epidermis yang nipis yang memudahkan eksplan menyerap air dan sumber nutrisi daripada medium pengkulturan dengan pantas. Eksplan daun dan batang dikulturkan di dalam MS medium dengan kepekatan NAA yang berbeza dan dieram di dalam keadaan gelap dan terang pada suhu 25 ± 1 C. MS media yang mengandungi hormon pengawalatur NAA telah menjana akar adventitius dan menunjukkan keputusan yang positif (Jadual 1). 193

5 Jadual 1. Kadar peratusan penjanaan akar adventitius dengan faktor pencahayaan di dalam kekuatan MS media yang berbeza. 0.0mg/mL NAA bertindak sebagai pengawal. Kadar peratusan penjanaan akar adventitius daripada jumlah sampel tanpa kehadiran cahaya di dalam kekuatan MS media yang berbeza Kepekatan NAA (mg/ml) Jumlah eksplan yang menghasilkan akar Jumlah akar adventitius pada ekpslan Peratus jumlah ekplan yang menghasilkan akar (%) Akar adventitius per eksplan Daun Batang Daun Batang Daun Batang Daun Batang Kadar peratusan penjanaan akar adventitius daripada jumlah sampel tanpa kehadiran cahaya di dalam kekuatan MS media yang berbeza Di dalam keadaan gelap, kepekatan NAA pada 1.0 mg/ml menginduksi akar adventitius per eksplan yang paling tinggi (purata daun: 1.667, batang: 2.362) diikuti oleh kepekatan NAA pada 0.5 mg/ml (purata daun: 1.333, batang: 2.318). Peratus jumlah eksplan yang menghasilkan akar yang tertinggi adalah pada kepekatan NAA 1.0mg/mL (daun: 72%, batang 100%) diikuti oleh kepekatan NAA pada 1.5 mg/ml (daun: 60%, batang: 88%). Jumlah akar adventitius per eksplan dan peratus jumlah eksplan yang menghasilkan akar di dalam kepekatan NAA 2.0 mg/ml adalah yang paling rendah. Di dalam kehadiran cahaya, kepekatan NAA pada 1.0 mg/ml menginduksi akar adventitius per eksplan yang paling tinggi (daun: 2.035, batang: 2.5) diikuti oleh kepekatan NAA pada 1.5 mg/ml (daun: 1.85, batang: 2.381). Peratus jumlah eksplan yang menghasilkan akar yang tertinggi adalah pada kepekatan NAA 1.0 mg/ml (daun: 56%, batang 96%) diikuti oleh kepekatan NAA pada 0.5 mg/ml (daun: 40%, batang: 84%). Jumlah akar adventitius per eksplan dan peratus jumlah eksplan yang menghasilkan akar di dalam kepekatan NAA 2.0 mg/ml adalah yang paling rendah. Berdasarkan peratus jumlah eksplan yang menghasilkan akar. 1.0 mg/ml NAA merupakan kekuatan medium yang sesuai untuk menginduksi akar adventitius. Pada kepekatan NAA yang tinggi, penghasilan akar adventitius berkurangan walaupun dipengaruhi oleh faktor pencahayaan. Kepekatan NAA yang lebih tinggi telah ditunjukkan mengurangkan kecekapan proses penghasilan akar. Ini dapat dijelaskan oleh fakta bahawa auksin pada kepekatan yang tinggi boleh bersifat herbicidal dan menghalang pemanjangan sel, yang boleh menghalang induksi akar daripada eksplan daun (DE et al. 2003). Kekuatan media yang berbeza telah diuji untuk mengoptimumkan pertumbuhan akar adventitius (X et al.2010). 3.3 Perambatan akar adventitius di dalam media cecair 0.5g berat segar akar adventitius daripada 1.0mg/L NAA piring petri diinokulasikan ke dalam MS media cecair untuk mendapatkan berat akar adventitius yang lebih besar. Sebanyak 5 kelalang yang mengandungi MS media dan hormon pengawalatur NAA disediakan bagi setiap kajian terhadap faktor kehadiran cahaya yang mempengaruhi kadar pertumbuhan akar adventitius. Berdasarkan Rajah 2, kadar pertumbuhan dikira secara purata bagi setiap kelalang selama 6 minggu. Berdasarkan Rajah 2, dengan kehadiran cahaya biojisim akhir akar adventitius adalah lebih rendah berbanding ketidakhadiran cahaya. Ini menunjukkan bahawa kadar pertumbuhan akar adventitius di dalam media cecair adalah lebih tinggi dengan ketidakhadiran cahaya. 194

6 Biomass Akhir, g Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech. 1, Kadar Pertumbuhan Akar Adventitius di Dalam Media Cecair Kehadiran cahaya Ketidakhadiran cahaya Minggu Rajah 2. Graf kadar pertumbuhan akar adventitius di dalam media cecair Berdasarkan Rajah 3, perbezaan secara morfologi menunjukkan bahawa akar adventitius yang dirambat di dalam MS media cecair tanpa kehadiran cahaya mempunyai tekstur akar yang lebih halus dan mempunyai rerambut akar yang banyak. Manakala akar adventitius yang dirambat dengan kehadiran cahaya memberikan tekstur yang lebih kasar, akar yang lebih panjang dan kurang rerambut pada akar. Ini membuktikan bahawa faktor kehadiran cahaya turut memberikan kesan kepada proses pemanjangan dan pertumbuhan akar adventitius yang dikawalatur oleh hormon pengawalatur NAA dengan memberikan kesan kepada ciri-ciri morfologi tumbuhan yang baru dihasilkan terutamanya kepada pertumbuhan akar (Sevik & Guney 2013). (a) Tanpa kehadiran cahaya (b) Dengan kehadiran cahaya Rajah 3. Morfologi akar adventitius di dalam media cecair, media MS dengan faktor a)tanpa kehadiran cahaya dan b) dengan kehadiran cahaya. 4.4 Profil metabolit menggunakan teknik GC-MS Bahan metabolit telah diekstrak menggunakan metanol. Pengekstrakan adalah langkah pertama yang penting dalam analisis tumbuhan herba, kerana perlu untuk mengeluarkan komponen kimia daripada tumbuhan untuk analisis dan pencirian (Sasidharan et al. 2011). Daripada data GC-MS kultur akar yang dieram pada kehadiran cahaya, 8 metabolit sekunder dikesan di dalam ketiga-tiga replikasi. Metabolit tersebut adalah benzenemethanol, à-[1-(methylamino)ethyl]-, (R*,S*)-(ñ)-, glyoxime, bis(trimethylsilyl)-, acetic acid, 2,2'-thiobis-, bis(trimethylsilyl) ester, silane, [(1- methoxy-1,3-propanediyl)bis(oxy)]bis[trimethyl-, n-propylmalonic acid, bis(trimethylsilyl)- ester, tris(trimethylsiloxy)ethylene, cyclohexene, 4,5-bis(trimethylsilyloxy)-, trans-, dan cyclopentane, 2- methyl-1,4-bis[(trimethylsilyl)oxy]-3-(2-propenyl)-. Sampel ketiga-tiga replikasi bagi faktor kehadiran cahaya yang mempengaruhi penghasilan metabolit memberikan 21, 24 dan 28 jenis sebatian yang berbeza selepas GC-MS teknik dijalankan bagi setiap replikasi. Berdasarkan Rajah 4, produk yang tertinggi bagi ketiga-tiga sampel replikasi dengan kehadiran cahaya adalah glyoxime, bis (trimethylsilyl)- kerana mempunyai puncak yang tertinggi. 195

7 (a) Sampel replikasi pertama (b) Sampel replikasi kedua (c) Sampel replikasi ketiga Rajah 4. Kromatogram tiga sampel replikasi dengan kehadiran cahaya Daripada data GC-MS kultur akar adventitius, terdapat 2 metabolit sekunder yang dikenalpasti hadir di dalam ketiga-tiga replikasi di dalam kultur tisu yang telah dirawat dengan hormon pengawalatur NAA (1.0mg/L) tanpa kehadiran cahaya. Metabolit sekunder tersebut adalah glyoxime, bis(trimethylsilyl)- dan acetic acid, 2,2'-thiobis-, bis(trimethylsilyl) ester. 23, 17 dan 18 jenis sebatian telah dikenalpasti di dalam replikasi setiap sampel akar adventitius yang telah dijana tanpa kehadiran cahaya. Berdasarkan data GC-MS tersebut, sebatian yang terhasil di dalam akar adventitius Andrographis paniculata adalah lebih konsisten dengan kehadiran cahaya. Keputusan secara jelas mendapati bahawa glyoxime, bis (trimethylsilyl)- dan acetic acid, 2, 2 -thiobis-,bis(trimethsilyl) ester memberikan puncak yang lebih tinggi berbanding dengan metabolit yang lain. Sebatian-sebatian yang terdapat di dalam tiga replikasi ini dielut dalam masa penahanan yang hampir sama. Sampel-sampel akar adventitius yang dieram tanpa kehadiran cahaya menunjukkan kadar penghasilan sebatian yang tidak konsisten kerana keseluruhan metabolit berada pada masa 196

8 penahanan yang berbeza walaupun mempunyai beberapa sebatian yang sama dan replikasi biologi yang berbeza. Sebatian di dalam akar adventitius tanpa kehadiran cahaya terganggu semasa pengendalian sampel kerana semasa pengendalian sampel, sampel akar adventitius tersebut turut terdedah dengan cahaya dan persekitaran luar bilik tisu kultur walaupun di dalam masa yang singkat. Ini memberikan tekanan kepada pertumbuhan akar adventitius tersebut. Apabila tekanan berlaku, penghasilan sebatian turut terganggu bagi akar adventitus untuk beradaptasi dengan persekitaran yang tidak tetap (Vialet-Chabrand et al. 2017). (a) Sampel replikasi pertama (a) Sampel replikasi kedua (c) Sampel replikasi ketiga Rajah 5. Kromatogram tiga sampel replikasi tanpa kehadiran cahaya 197

9 Berdasarkan Rajah 6, sebatian yang paling banyak ialah propanedioic acid, dimethyl-, bis(trimethylsilyl) ester kerana mempunyai puncak yang tertinggi. Akar pokok utuh Andrographis paniculata terdapat 17 jenis sebatian berbeza berdasarkan analisis GC-MS. Di dalam kajian ini, sebatian-sebatian yang diperolehi adalah metabolit sekunder yang turut dikenali sebagai fitokimia telah dikesan menggunakan kaedah GCMS. Terdapat 39 metabolit yang terdapat di dalam sampel akar tumbuhan dan untuk sampel akar adventitius adalah 21, 28 dan 24. Data ini membuktikan bahawa jumlah metabolit yang terdapat di dalam sampel akar tumbuhan utuh adalah tinggi berbanding di dalam akar adventitius. Metabolit sekunder di dalam tumbuhan utuh banyak kerana tumbuhan utuh berdepan dengan pelbagai tekanan (Huang et al. 2017). Tekanan tersebut seperti suhu yang tidak tetap, interaksi antara akar dengan komuniti mikrob bawah tanah dan kandungan air. Secara umumnya, tumbuhan yang tumbuh di luar persekitaran makmal mengalami tekanan biotik dan abiotik yang menyebabkan tumbuhan utuh ini untuk menghasilkan pelbagai jenis metabolit sekunder. Rajah 6. Kromatogram sampel akar tumbuhan utuh Andrographis paniculata Kajian ini membuktikan bahawa metabolit di dalam akar tumbuhan utuh lebih tinggi berbanding akar adventitius kerana factor tekanan biotik dan abiotic. Jenis-jenis pengekstrakan dan kaedah pengesanan turut memberikan jenis metabolit yang berbeza (Sasidharan et al., 2011). Disebabkan ini, metabolit sekunder yang digunakan di dalam kajian masa kini seperti andrografolida, flavonoid dan benzene tidak dapat dikesan. Pengekstrakan menggunakan pelbagai larutan seperti klorofom dan etanol serta kaedah pengesanan yang berbeza seperti Solid Phase Microextraction (SPME) dan teknik-teknik kromatografi perlulah dilaksanakan untuk mengesan mengekstrak metabolit di dalam akar adventitius. 4. Kesimpulan Pemilihan biji benih hendaklah dilaksanakan sebaik-baiknya semasa penyediaan anak pokok agar hanya biji benih yang tidak matang sahaja diperolehi. Secara keseluruhannya, dapat disimpulkan bahawa akar adventitius dijana secara positif menggunakan 1.0 mg/ml NAA dan melalui analisis profil metabolit, metabolit yang terhasil di dalam akar anak pokok Andrographis paniculata secara in vitro adalah konsisten berbanding tumbuhan utuh. Hasil daripada kajian ini mencadangkan bahawa penjanaan akar adventitius dijadikan sebagai kaedah untuk menganalisis metabolit sekunder yang diingini daripada Andrographis paniculata. Penghargaan Penghargaan kepada warga Makmal Bioteknologi Tumbuhan, UKM, Bangi. Rujukan Balandrin, M., Klocke, J., Wurtele, E., & Bollinger, W. (1985). Natural plant chemicals: sources of industrial and medicinal materials. Science, 228: DE, E., JO, C., & A, K. (2003). Plant Cell Culture. London, New York: BIOS Scientific Publishers. Gerth, A., Schmidt, D., & Wilken, D. (2007). The production of plant secondary metabolites using 198

10 bioreactors. In Proceedings of the XXVII IHC-S10 Plant Biotechnology, Huang, J., Reichelt, M., Chowdhury, S., Hammerbacher, A., & H Hartmann. (2017). Increasing carbon availability stimulates growth and secondary metabolites via modulation of phytohormones in winter wheat. Journal of Experimental Botany, 68(5): Jarukamojorn, K., & Nemoto, N. (2008). Pharmacological aspects of Andrographis paniculata on health and its major diterpenoid constituent andrographolide. Journal of Health Science, 54: Kolotelo, D. (1997). Anatomy & Morphology of Conifer Tree Seed. Li, W., Xu, X., Zhang, H., Ma, C., Fong, H., Breemen, R. V, & Fitzloff, J. (2007). Chemical and Pharmaceutical Bull, 55: Mathew, L., Rajasekaran, A., Arivukkarasu, R., & Mathew, L. (2016). A systematic comprehensive review on therapeutic potential of Andrographis paniculata ( Burm. f.) Wall. ex Nees. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 5(5): Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15: Murthy, H. N., Hahn, E. J., & Paek, K. Y. (2008). Adventitious root and secondary metabolism. Chinese Journal of Biotechnology, 24: Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., & Latha, L. Y. (2011). Extraction, Isolation and Characterization of Bioactive Compounds from Plants Extracts. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines: AJTCAM, 8(1): Sato, F., Hashimoto, T., Hachiya, A., Tamura, K., Choi, K., Morishige, T., Yamada, Y. (2001). Metabolic engineering of plant alkaloid biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98: Sevik, H., & Guney, K. (2013). Effects of IAA, IBA, NAA, and GA3 on Rooting and Morphological Features of Melissa officinalis L. Stem Cuttings. The Scientific World Journal, 2013: 5. Sharma, S.. (2012). Production of Andrographolide From Callus and Cell Suspension Culture of Andrographis Paniculata. Cell and Tissue Research, 12(3): Vialet-Chabrand, S., Matthews, J. S. A., Simkin, A. J., Raines, C. A., & Lawson, T. (2017). Importance of Fluctuations in Light on Plant Photosynthetic Acclimation. American Society of Plant Biologists, 173(4): X, C., HN, M., C, W., & K, P. (2010). Adventitious root suspension cultures of Hypericum perforatum: effect of nitrogen source on production of biomass and secondary metabolites. In Vitro Cell Developmental Biology Plant, 46: