Središnja medicinska knjižnica

Transcription

1 Središnja medicinska knjižnica Milković Periša, Marija (2011) Imunohistokemijska izraženost i prognostička vrijednost proteina nm23-h1 i COX-2 u papilarnom karcinomu štitnjače. Doktorska disertacija, Sveučilište u Zagrebu. University of Zagreb Medical School Repository

2 SVEUČILIŠTE U ZAGREBU MEDICINSKI FAKULTET Marija Milković Periša Imunohistokemijska izraženost i prognostička vrijednost proteina nm23-h1 i COX-2 u papilarnom karcinomu štitnjače DISERTACIJA Zagreb, 2011.

3 SVEUČILIŠTE U ZAGREBU MEDICINSKI FAKULTET Marija Milković Periša Imunohistokemijska izraženost i prognostička vrijednost proteina nm23-h1 i COX-2 u papilarnom karcinomu štitnjače DISERTACIJA Zagreb, 2011.

4 Disertacija je izrađena u Zavodu za patologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Za istraživanje su korišteni arhivirani uzorci biopsija tumora Službe za patologiju Klinike za tumore u Zagrebu. Voditelj rada: Prof.dr.sc. Božena Šarčević Zahvaljujem se svojoj mentorici Prof.dr.sc. Boženi Šarčević, koja se bezrezervno prihvatila mentorstva i usmjeravala ovo istraživanje te u svakom trenutku brzo i učinkovito svoje znanje i iskustvo koristila za izradu ovog rada. Zahvaljujem Prof.dr.sc. Svenu Seiwerthu koji je omogućio provedbu istraživanja na Zavodu za patologiju Medicinskog fakulteta te svim djelatnicima Zavoda za patologiju Medicinskog fakulteta koji su svojom stručnošću doprinjeli provedbi istraživanja. Posebne zahvale iskazujem svojoj obitelji, suprugu i roditeljima, na financijskoj i moralnoj podršci.

5 Mojim najdražima, Niki i Jeleni.

6 SADRŽAJ POPIS OZNAKA I KRATICA 1. UVOD ANATOMIJA ŠTITNJAČE EMBRIOLOGIJA ŠTITNJAČE HISTOLOGIJA ŠTITNJAČE RAZVOJNI POREMEĆAJI ŠTITNJAČE Aplazija i hipoplazija štitnjače Ektopično tkivo štitnjače Cista duktusa tireoglosusa DIFUZNE PROMJENE ŠTITNJAČE Treoiditis Akutni tireoiditis Granulomatozni tireoiditis Ostale granulomatozne upale Automiuni (limfocitni i Hashimotov) tireoiditis Riedelov tireoiditis Hiperplazija štitnjače Dishormogenetska guša Gravesova bolest Nodularna hiperplazija TUMORI ŠTITNJAČE Folikularni adenom Papilarni karcinom Histološki podtipovi papilarnog karcinoma Folikularni karcinom Medularni karcinom Anaplastični karcinom MOLEKULARNA OSNOVA TUMORA Genske promjene stanica papilarnog karcinoma COX-2 i papilarni karcinom...16

7 nm23-h1 i papilarni karcinom COX-2 i nm23-h HIPOTEZA CILJEVI ISTRAŽIVANJA BOLESNICI I METODE BOLESNICI METODE STATISTIČKA OBRADA PODATAKA REZULTATI SPOL I DOB BOLESNIKA I VELIČINA TUMORA HISTOLOŠKE ZNAČAJKE PAPILARNOG KARCINOMA, ŠTITNJAČE I LIMFNIH ČVOROVA IZRAŽENOST PROTEINA nm23-h1 I COX Izraženost proteina nm23-h Izraženost proteina COX Dob i spol bolesnika i veličina tumora Histološki podtip papilarnog karcinoma Infiltrat limfocita u papilarnom karcinomu Širenje tumora u tkivu štitnjače Dobroćudne promjene štitnjače Metastaze u regionalnim limfnim čvorovima Usporedba izraženosti nm23-h1 i COX Veličina tumora, metastaze u limfnim čvorovima, nm23-h1 i COX RASPRAVA ZAKLJUČCI SAŽETAK SUMMARY LITERATURA ŽIVOTOPIS... 77

8 POPIS OZNAKA I KRATICA BRAF onkogen (engl. v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) COX enzim ciklooksigenaza (engl. cyclooxigenase), tipovi 1 i 2 CREB transkripcijski faktor (engl. camp response element-binding protein) DIT dijod-tirozin DNA deoksiribonukleinska kiselina (engl. deoxyribonucleic acid) EBV Epstein-Barrov virus FA folikularni adenom Hash Hashimotov tireoiditis H.E. hemalaun-eozin HLA-sustav sustav proteina tkivne podudarnosti (engl. human leukocyte antigen) IGF-1 inzulinu-nalik čimbenik rasta 1 (engl. insulin-like growth factor) IIB imunohistokemijski indeks bojenja IL interleukin IMH - imunohistokemija MIT monojod-tirozin mrna prijenosnička ribonukleinska kiselina (engl. messenger ribonucleic acid) NFκB transkripcijski čimbenik (engl. nuclear factor Kappa B) nm23-h1 tumorosupresorski gen u ljudi (engl. nonmetastatic gene) RET protoonkogen kodira receptor tirozin kinaze (engl. rearranged during transfection protooncogene) RET/PTC protoonkogen RET u papilarnom karcinomu štitne žlijezde ( PTC od engl. papillary thyroid carcinoma), tipovi 1, 2 i 3 Th chr limfocitni tireoiditis TNFα čimbenik tumorske nekroze α (engl. tumor necrosis factor) TRK onkogen kodira receptor tirozin kinaze (engl. tropomyosin-receptor kinase) TSH tireotropni hormon (engl. thyroid-stimulating hormone) T3 trijod-tirozin T4 tiroksin VEGF vaskularni endotelni čimbenik rasta (engl. vascular endothelial growth factor)

9 1. UVOD 1.1. ANATOMIJA ŠTITNJAČE Štitnjača (lat. glandula thyreoidea) je neparna žlijezda s unutrašnjim izlučivanjem smještena u donjem dijelu vrata, ispred dušnika. Teška je grama. Sastoji se od desnog i lijevog lateralnog režnja (lat. lobus dexter et sinister) koje povezuje središnji suženi dio (lat. isthmus glandulae thyreoideae) što žlijezdi daje oblik slova H. Režnjevi su individualno različito veliki. Površina štitnjače je neravna i izbrazdana brojnim arterijskim i venskim žljebovima. Medijalne površine lateralnih režnjeva oblikuju duboki žlijeb u kojem se nalaze dušnik i jednjak.(1) Središnji, suženi dio štitnjače nalazi se neposredno ispred dušnika, u visini 2. do 3. trahealne hrskavice, dok medijalna strana lateralnih režnjeva pokriva početni dio dušnika. Položaj istmusa znatno varira, a može biti i nerazvijen pa su u tom slučaju lateralni režnjevi odvojeni. Na lateralnim se režnjevima razlikuju medijalna, stražnja i lateralna površina. Medijalna površina obuhvaća lateralnu stranu gornjeg dijela dušnika i u gornjem dijelu doseže do krikoidne hrskavice grkljana. Stražnja površina je zaobljeni prošireni dio režnja koji se nalazi na prijelazu medijalne i lateralne površine te u gornjem dijelu seže do hipofarinksa. U tom se dijelu stražnje površine nalaze doštitne žlijezde, povratni grkljanski živac (medijalno) i žilno-živčani snop vrata (lateralno). Lateralnu površinu pokrivaju infrahioidni mišići.(1) Štitnjaču obavijaju dvije ovojnice, unutarnja i vanjska. Vanjska je ovojnica dio srednjeg lista vratne fascije. Unutarnja je ovojnica građena od vezivnog tkiva od kojeg se odvajaju tanki vezivni tračci koji pregrađuju tkivo žlijezde. Između vanjske i unutarnje ovojnice nalaze se doštitne žlijezde. (1) Štitnjača prima arterijsku krv od dvije donje i dvije gornje tireoidne arterije koje su ogranci arterije subklavije i vanjske karotidne arterije. Vene štitnjače nastaju iz kapilarne mreže, idu kroz vezivne tračke te probijaju unutarnju i vanjsku ovojnicu i skupljaju se u gornje, srednje i donje tireoidne vene koje se ulijevaju u facijalnu venu ili unutarnju jugularnu venu. (2) Unutrašnji splet limfnih žila započinje u interfolikularnom prostoru i u limfatičnim prostorima oko acinusa. Spajanjem nastaju vodovi kojima limfa otiče u dva smjera. Gornjim medijalnim smjerom limfa odlazi u prelaringealne i infrahioidne čvorove, odnosno, u gornje duboke vratne čvorove, a lateralnim smjerom u duboke vratne 1

10 čvorove. Donjim medijalnim smjerom limfa odlazi u pretrahealne i paratrahealne čvorove, dok lateralni smjer vodi u supraklavikularne čvorove. Može postojati i limfni vod koji je usporedan s tireoglosalnim vodom, a drenira se u submandibularne i sublingvalne limfne čvorove.(1) Štitnjača je inervirana simpatičkim i parasimpatičkim živcima koje donose povratni i gornji grkljanski živac (lat. nervus laryngeus recurrens et nervus laryngeus superior).(1) 1.2. EMBRIOLOGIJA ŠTITNJAČE Štitnjača se počinje razvijati umnažanjem i izrastanjem endodermalnog epitela u dnu ždrijela, na granici između medijalne jezične kvržice i kopule. Na tom će se mjestu kasnije nalaziti slijepi otvor (lat. foramen coecum), a potom i šuplja epitelna osnova, podijeljena na dva režnja, koja se spušta ispred ždrijelnog crijeva ostajući pritom uskim kanalom (lat. ductus thyreoglossus) povezana s jezikom. Taj kanal tijekom daljnjeg razvoja izgubi lumen te postaje solidan epitelni tračak koji u kasnijem razvoju redovito iščezne. Štitnjača se spušta ispred jezične kosti i hrskavice grkljana te u 7. tjednu dosegne svoj konačni položaj, ispred dušnika. Već tada se sastoji od dva lateralna režnja i središnjeg uskog dijela. Krajem trećeg mjeseca intrauterinog razvoja pojavljuju se prvi folikuli ispunjeni koloidom i žlijezda počinje izlučivati hormone.(3) 1.3. HISTOLOGIJA ŠTITNJAČE Tkivo štitnjače izgrađuju folikuli, okrugle strukture obložene jednoslojnim epitelom i ispunjene želatinoznim homogenim sadržajem koloidom. Folikuli su različite veličine, a folikularne stanice mogu biti pločaste, kubične ili niske cilindrične. Žlijezda je obavijena ovojnicom građenom od rahlog vezivnog tkiva. Od nje se u parenhim žlijezde odvajaju tanki vezivni tračci koji ju pregrađuju. Oni se postepeno stanjuju i dosežu do svih folikula obavijajući ih nježnim, neformiranim vezivnim tkivom, izgrađenim pretežno od retikulinskih vlakana. U sklopu vezivnih tračaka nalazi se 2

11 gusta mreža krvnih i limfnih kapilara koja okružuje svaki folikul. Endotelne stanice kapilara su fenestrirane. Izgled folikula štitnjače različit je u odnosu na područje žlijezde i njezinu aktivnost. U istoj žlijezdi veliki se folikuli, ispunjeni koloidom i obloženi kubičnim ili pločastim epitelom, nalaze uz folikule obložene cilindričnim epitelom. Unatoč ovim razlikama, žlijezda se smatra manje aktivnom ukoliko dominiraju folikuli obloženi pločastim epitelom. Epitel štitnjače leži na bazalnoj lamini. Posebna vrsta stanica u štitnjači jesu parafolikularne ili C-stanice, koje mogu biti uključene u folikularni epitel ili čine odvojene nakupine stanica između folikula. Ove stanice su nešto veće i svjetlije u odnosu na folikularne stanice. Najizrazitija značajka su brojna mala citoplazmatska zrnca koja se vide elektronskim mikroskopom. Sadrže hormon kalcitonin, čiji je glavni učinak smanjenje razine kalcija u krvi. Štitnjača je jedina žlijezda s unutrašnjim izlučivanjem u kojoj se pohranjuje velika količina proizvoda sekrecije. Pohranjivanje se obavlja u izvanstaničnom koloidu, a sam proces proizvodnje i nakupljanja hormona odvija se u četiri faze: a) sinteza tireoglobulina; b) unošenje jodida iz krvi; c) aktiviranje jodida; d) jodiranje tirozinskih ostataka. Na poticaj tireotropnim hormonom (TSH), folikularne stanice pinocitozom unose koloid u citoplazmu u kojoj se koloid stapa s lizosomima. Djelovanjem lizosomskih proteaza se u citoplazmi oslobađaju tiroksin (T4), trijod-tirozin (T3), dijodtirozin (DIT) i monojod-tirozin (MIT). Slobodni T4 i T3 prolaze kroz staničnu membranu i otpuštaju se u kapilare, a MIT i DIT se razgrađuju na osnovne sastavnice, jod i tirozin, koji se u folikularnim stanicama ponovno koriste u procesu proizvodnje hormona. Po količinskom udjelu, T4 prevladava i čini 90% hormona štitnjače u krvi, iako T3 djeluje brže i snažnije. Oba hormona stimuliraju disanje i oksidativnu fosforilaciju u mitohondrijima. Većina učinaka posljedica je djelovanja na bazalni metabolizam, povećanje apsorpcije ugljikohidrata iz crijeva, reguliranje metabolizma lipida i utjecanja na rast tijela i razvoj živčanog sustava.(4) 3

12 1.4. POREMEĆAJI RAZVOJA ŠTITNJAČE Poremećaji razvoja štitnjače povezani su s abnormalnim spuštanjem fetalne žlijezde od slijepog otvora na jeziku do konačnog mjesta na vratu te djelomičnog ili potpunog nerazvijanja štitnjače Aplazija i hipoplazija štitnjače Aplazija i hipoplazija su poremećaji koji uključuju potpuni ili djelomični nedostatak tkiva štitnjače. Najčešći su razlog urođenog hipotireoidizma. Bolesnici s Di Georgeovim sindromom, koji je karakteriziran poremećenim razvojem trećeg i četvrtog škržnog luka, imaju aplaziju ili hipoplaziju prsne i doštitnih žlijezda te parafolikularnih C-stanica štitnjače.(5) Ektopično tkivo štitnjače Tkivo štitnjače može biti izdvojeno od tkiva same žlijezde, a može se naći duž razvojnog puta žlijezde. Najčešći oblici ovog poremećaja su: a) jezična; b) akcesorna; c) lateralna aberantna štitnjača.(6) Cista duktusa tireoglosusa Cista duktusa tireoglosusa nastaje nepotpunom involucijom duktusa tireoglosusa i može nastati u njegovom bilo kojem dijelu. Najčešće je promjera od 1 do 4 cm, ispunjena sluzi, a obložena cilindričnim respiratornim i metaplastičnim pločastim epitelom. U stijenci ciste mogu se vidjeti tireoidni folikuli. Najčešće komplikacije uključuju infekciju i razvoj karcinoma istovjetnih onima u štitnjači.(5) 4

13 1.5. DIFUZNE PROMJENE ŠTITNJAČE Tireoiditis Akutni tireoiditis Akutni tireoiditis najčešće je izazvan infekcijom. Može biti udružen s akutnom infekcijom gornjeg dijela respiratornog i probavnog sustava, sepsom ili traumom vrata s otvorenom ranom.(7) Češće se javlja u neuhranjene djece, onemoćalih starijih osoba i osoba s oslabljenim imunitetom. Najčešći uzročnici su bakterije, gljivice i Pneumocystis, dok je virusna infekcija izuzetno rijetka.(8-11) Morfološki, glavne promjene akutnog tireoiditisa su infiltrati neutrofilnih granulocita i nekroza tkiva. Postoje negnojni i gnojni oblici, koji mogu prijeći u apscese. U slučajevima ponavljajućih, akutnih gnojnih oblika nerijetko postoji fistula piriformnog sinusa.(12-14) Liječenje se uspješno postiže upotrebom lijekova, a u slučajevima apscesa potrebna je kirurška drenaža.(12) Granulomatozni tireoiditis Granulomatozni tireoiditis, poznat i pod nazivima de Quervainov ili subakutni tireoiditis, najčešće se javlja u žena srednje životne dobi sa simptomima bolnog grla, bolnog gutanja i osjetljivošću na dodir u području štitnjače. Ovi simptomi su često praćeni povišenom temperaturom i slabošću.(15) Makroskopski, štitnjača je difuzno povećana, ali vrlo često nesimetrično. Čvršće je konzistencije, bez prijenosa upalnog procesa na okolne strukture. Mikroskopski se vide područja upale s nekazeoznim granulomima građenim od histiocita i multinuklearnih orijaških stanica koje nakupljaju koloid te područja fibroze u obliku mrljastih žarišta. U istoj žlijezdi mogu biti vidljivi različiti stadiji bolesti.(16) Bolest učestalo slijedi nakon infekcije gornjeg dijela respiratornog i probavnog sustava, ali etiologija bolesti nije poznata.(9) 5

14 Ostale granulomatozne upale Ostale granulomatozne bolesti štitnjače uključuju palpacijski tireoiditis, tuberkulozu, sarkoidozu, postoperativne nekrotizirajuće granulome i, rijetko, infekciju gljivicama. Palpacijski tireoiditis je naziv za relativno čest, klinički neznačajan i makroskopski neupadljiv proces koji najčešće nastaje kao rezultat malih trauma žlijezde. One mogu biti spontane, a ponekad su posljedica grublje palpacije žlijezde. Mikroskopski se vide nakupine histiocita, od kojih su neki pjenušavog izgleda, limfocita i multinuklearnih orijaških stanica unutar lumena razbacanih folikula. Žarišno upalni infiltrat razara folikularni epitel i širi se u perifolikularno tkivo.(17) Tuberkuloza štitnjače, kao primarna klinička manifestacija, je rijetka. Sekundarno zahvaćanje žlijezde moguće je u slučajevima širenja infekcije iz vratnih limfnih čvorova ili grkljana te u slučaju milijarne diseminirane infekcije.(18) Sarkoidoza može zahvatiti štitnjaču, u obliku intersticijskih nekazeoznih granuloma. Granulomi se rjeđe nalaze u centrima folikula, u bolesnika sa sistemskom bolešću.(19) Ponekad se bolest može manifestirati pojavom solitarnog čvora.(20) Autoimuni (limfocitni i Hashimotov) tireoiditis Smatra se da limfocitni tireoiditis i Hashimotov tireoiditis predstavljaju različite faze ili ispoljavanje autoimunog tireoiditisa odnosno organsko-specifičnog imunosno posredovanog upalnog poremećaja. Njegovo je funkcionalno obilježje stvaranje vlastitih protutijela koja mijenjaju funkciju štitnjače.(21-23) Mehanizmi koji pokreću autoimuni tireoiditis humoralne su i stanične prirode. Cirkulirajuća protutijela uključuju ona protiv tireoglobulina i drugih antigena stanica folikula, osobito tireotropinskih (TSH) receptora.(24) Smatra se da je uzročni čimbenik nastanka autoimunog tireoiditisa specifični defekt u supresorskim limfocitima T (25). Zasada nije dokazana statistički značajna povezanost autoimunog tireoiditisa s HLA-sustavom.(26,27) Makroskopski se, u većini slučajeva, vidi difuzno povećanje štitnjače. Morfološko glavno obilježje autoimune bolesti štitnjače jest proširena infiltracija limfocita, udružena sa stvaranjem germinativnih centara. Izgled zahvaćenih folikula određuje kojoj skupini tireoiditis pripada; u Gravesovoj su bolesti (koja će biti opisana kasnije) 6

15 folikuli difuzno hiperplastični, u limfocitnom tireoiditisu su relativno normalni, dok su u Hashimotovom tireoiditisu obloženi epitelom koji pokazuje onkocitne promjene.(28) Riedelov tireoiditis Riedelov tireoiditis, poznat i pod nazivima Riedelova struma, fibrozni tireoiditis i invazivni tireoiditis, vrlo je rijedak poremećaj koji se javlja u odraslih i starijih bolesnika, nešto češće u žena.(29) Klinički se javlja kao povećanje štitnjače, često udruženo s otežanim disanjem. Žlijezda je izrazito čvrsta i često vezana za meko tkivo vrata u obliku željeznog ovratnika. Moguć je pritisak na dušnik tako da se može zamijeniti s karcinomom. Histološki, žlijezda je prožeta hijaliniziranim vezivnim tkivom koje se širi i zahvaća okolne strukture. Upala je vidljiva u obliku nakupina mononuklearnih upalnih stanica, pretežno limfocita i plazma-stanica, koje se mogu vidjeti i u stijenkama vena srednjeg promjera.(28) Ova je bolest razvrstana u skupinu idiopatskih poremećaja, poznatih kao upalna fibroskleroza. Može se pojavljivati zajedno s medijastinalnom ili retroperitonealnom fibrozom, sklerozirajućim kolangitisom ili upalnim pseudotumorom orbite.(30) Hiperplazija štitnjače Dishormogenetska guša Dishormogenetska guša nastaje kao rezultat enzimskog poremećaja u sintezi hormona. Ovo uključuje odsutnost odgovora na TSH, te poremećaje: a) prijenosa, organifikacije i vezanja joda; b) sinteze i sekrecije tireoglobulina; c) dejodiranja i prijenosa hormona štitnjače i ostalo.(31) Makroskopski, štitnjača je povećana i multinodozna, a histološki se vide hipercelularni čvorovi raznolike građe s najčešće, solidnim ili mikropapilarnim oblicima, uz fibrozu. Fibroza rezultira nepravilnostima, osobito na rubovima čvorova, što može nalikovati invaziji čahure. Ostali česti nalazi uključuju značajnu atipiju jezgara, minimalne količine koloida i pojavu mitotske aktivnosti.(28) 7

16 Gravesova bolest Gravesova bolest, poznata i pod nazivima Basedowljeva bolest, tireotoksikoza, difuzna toksična guša i egzoftalmična guša, najčešće se javlja u žena mlađe životne dobi. Karakterizirana je slabošću mišića, gubitkom težine, egzoftalmusom, razdraženošću, tahikardijom i, vrlo često, povećanim apetitom. Razina hormona štitnjače je povišena, dok je vrijednost tireotropnog hormona snižena. Makroskopski je žlijezda blago do srednje jako, simetrično povećana, na prerezu mesnata i crvenkasta, konzistencije poput gušterače. Histološki se vide izrazito hiperplastični folikuli s naglašenim papilarnim izbočenjima koja mogu uzrokovati zamjenu s papilarnim karcinomom. Folikularni epitel je cilindričan s bazalno smještenim normokromatskim i hiperkromatskim jezgrama. Citoplazme su svijetle, katkad mikrovakuolizirane, a mogu sadržavati mast i glikogen ili izgledati oksifilno. Koloid je blijed i fino vakuoliziran, s jasno izraženim nazubljenjima na mjestima uz epitel. U stromi se mogu vidjeti nakupine limfocita s germinativnim centrima.(28) Nodularna hiperplazija Nodularna hiperplazija štitnjače, poznata i pod nazivima nodozna ili multinodozna guša, adenomatoidna guša i adenomatoidna hiperplazija, najčešća je bolest štitnjače. Poznata je kao endemska guša, bolest koja nastaje zbog niskog unosa joda u hrani, a može biti spriječena jodiranjem soli. Nedostatak stvaranja hormona štitnjače uzrokovan nedostatkom joda dovodi do pojačanog izlučivanja tireotropnog hormona koji, u početku, stimulira štitnjaču, a nakon dugog vremena dovodi do njezinog iscrpljivanja i kasnije atrofije folikula s obilnim odlaganjem koloida, sa čvorovima ili bez njih. Makroskopski je žlijezda asimetrično povećana i iskrivljenog oblika, napete čahure. Na poprečnom rezu vide se različito veliki čvorovi koji mogu, ali i ne moraju, biti obavijeni čahurom. Sekundarne promjene u obliku krvarenja, kalcifikacija i cističnih degeneracija su česte. Histološki se vide raznolike slike koje uključuju različito velike folikule obložene epitelom koji može biti izrazito stanjen ali i hiperplastičan; može izgledati oksifilno. U pojedinim folikulima mogu se vidjeti nakupine malih aktivnih stanica smještenih na jednom polu te papilarni produljci okrenuti u lumen cističnih folikula što može dovesti do zamjene s papilarnim 8

17 karcinomom. Prsnuće folikula izaziva granulomsku reakciju koloida, s pojavom histiocita i orijaških stanica tipa stranog tijela.(28) 1.6. TUMORI ŠTITNJAČE Većina tumora u štitnjači je primarna, epitelnog podrijetla. Ovi tumori su prema ponašanju dobroćudni ili zloćudni, a prema podrijetlu se dijele na tumore podrijetla: a) stanica folikula; b) C-stanica; i c) tumore koji pokazuju diferencijaciju obiju skupina stanica. U više od 95% slučajeva su tumori štitnjače podrijetla folikularnog epitela. Najčešći dobroćudni tumor štitnjače je folikularni adenom, a od zloćudnih tumora, koji u razvijenim zemljama čine 1% svih zloćudnih tumora, najčešći je papilarni karcinom (70-80%), a slijede ga folikularni karcinom (10-15%), medularni karcinom (5-10%) i anaplastični karcinom (<5%). Svi tumori štitnjače učestaliji su u žena, a prikazuju se kao bezbolni čvor u žlijezdi koji je u slučaju zloćudnih tumora tipično hladan pri scintigrafskom snimanju radioaktivnim jodom.(28, 32) Folikularni adenom Folikularni adenom je dobroćudni tumor štitnjače folikularne građe, obavijen vezivnom čahurom. Najčešća je novotvorina štitnjače koju je teško razlikovati od dominantnog čvora, u slučaju nodozne hiperplazije. Adenom je najčešće jedan, potpuno okružen čahurom i ne nalikuje okolnom parenhimu štitnjače; najčešće je građen od manjih folikula u odnosu na zdravo tkivo žlijezde, koje opisani čvor potiskuje. Adenomi mogu pokazivati različite histološke slike, pojedinačne ili u kombinaciji. Stoga razlikujemo normofolikularne (jednostavne), makrofolikularne (koloidne), mikrofolikularne (fetalne) i trabekularne/solidne (embrionalne). Morfološke razlike mogu biti upadljive, ali je biološko ponašanje uvijek dobroćudno. Mitotska aktivnost je niska, a sekundarne degenerativne promjene (krvarenje, edem, fibroza, kalcifikacije, stvaranje kosti i cistične degeneracije) su česte.(28) 9

18 Papilarni karcinom Papilarni karcinom štitnjače je tumor podrijetla folikularnog epitela. Može se pojaviti u bilo kojoj životnoj dobi, no najčešći je između 20. i 50. godine života, tri do četiri puta učestaliji u žena. Etiologija nastanka papilarnog karcinoma štitnjače nije u potpunosti razjašnjena, ali se povezuje s izloženošću zračenju. Klinički se ovaj tumor prikazuje kao bezbolni čvor u štitnjači, a ponekad se očituje povećanjem vratnih limfnih čvorova bez opipljivog čvora u samoj žlijezdi. Makroskopski se u većini slučajeva radi o solidnoj, bjelkasto-sivoj tumorskoj masi koja je samo prividno oštro ograničena od okolnog tkiva, uz ponekad prisutne cistične promjene i žarišna ovapnjenja. U okolnom se parenhimu često nalaze i multipla žarišta tkiva tumora koja su u većine oboljelih samo mikroskopski vidljiva. U uznapredovalim slučajevima tumor probija čahuru žlijezde i širi se u okolne strukture. Histološki, tumor je građen od razgranatih resica koje su građene od fibrovaskularne strome i na površini prekrivene jednorednim ili višerednim kubičnim do cilindričnim stanicama karakterističnog izgleda jezgara. Kromatin je fino raspršen, izgleda mliječnog stakla, a u jezgri se nalaze inkluzije koje označuju invaginaciju citoplazme, koja je oskudnija u odnosu na normalne folikularne stanice pa se vidi preklapanje jezgara susjednih stanica. Pločasta metaplazija je učestala, kao i kalcisferiti ( psamomska tjelešca ), koji mogu biti prisutni uz stanice tumora, ili u njegovoj stromi. Stroma tumora može biti proširena umnoženim vezivnim tkivom i infiltrirana limfocitima, uz mjestimično stvaranje limfatičnih folikula. (32) Papilarni karcinom štitnjače je sklon širenju unutar same žlijezde, u obliku malih žarišta, kao i lokalno invaziji vena i metastaziranju u regionalne limfne čvorove. Prognoza u pojedinačnim slučajevima ovisi o dobi, spolu te o veličini i diferenciranosti tumora, invaziji u okolne strukture, prisustvu metastaza u regionalne limfne čvorove i udaljenim metastazama. Izlječenje se može postići u više od 90% operiranih bolesnika.(32-36) 10

19 Histološki podtipovi papilarnog karcinoma S obzirom na histološku sliku tumora, uz njegov klasični podtip, postoji više podtipova papilarnog karcinoma. Najčešći su folikularni, makrofolikularni, onkocitni, svijetlih stanica, visokih stanica ( tall cell ), difuzno-sklerozirajući i solidni podtip. Navedeni podtipovi se od klasičnog podtipa razlikuju histološkom građom ili izgledom citoplazmi stanica tumora, dok je za sve podtipove karakterističan jednak izgled jezgara. Od navedenih podtipova, difuzno-sklerozirajući podtip i podtip visokih stanica češće se agresivnije ponašaju. Poseban oblik papilarnog karcinoma je papilarni mikrokarcinom, odnosno karcinom koji se slučajno otkrije, a promjer mu je manji ili jednak jednom centimetru. Histološki, ovaj tumor ima karakterističnu sliku papilarnog karcinoma, a najčešće je smješten uz čahuru štitnjače, te neoštro ograničen, s izraženom sklerozacijom strome. U djece ovaj tumor može biti puno agresivnijeg tijeka, dok se u odraslih rijetko očituje metastazama u limfne čvorove vrata.(32) Folikularni karcinom Folikularni karcinom je tumor podrijetla folikularnog epitela koji histološki ne pokazuje promjene jezgara karakteristične za papilarni karcinom. Učestao je u petom desetljeću života, a etiološki se povezuje s nedostatnim unosom joda i povećanoj izloženosti radioaktivnom zračenju. Klinički se najčešće prezentira kao bezbolni čvor u štitnjači. Učestalost metastaziranja u istostrane limfne čvorove vrata nalazi se u manje od 5% bolesnika, dok su udaljene metastaze prisutne u 20% oboljelih, najčešće u pluća i kosti. Makroskopski je najčešće očahuren, okrugao do ovalan, žućkasto-sive do smeđe boje. Uobičajeno je većeg promjera od jedan centimetar, površine koja se na prerezu izdiže iznad rezne plohe. Histološka slika je raznolika: od jasno formiranih folikula ispunjenih koloidom do solidnog i trabekularnog načina rasta. Za postavljanje dijagnoze neophodno je odrediti invadiranost čahure tumora, odnosno krvnih žila u čahuri ili izvan tumora. S obzirom na izraženost invazije navedenih struktura razlikuju se minimalno i široko invazivni oblik. Minimalno invazivni tumor prodire u čahuru tumora i/ili manje od 4 krvne žile unutar čahure ili u okolnom tkivu žlijezde, a široko invazivni tumor probija čahuru tumora i prodire u okolno tkivo žlijezde i/ili zahvaća 4 ili 11

20 više krvnih žila u čahuri ili okolnom tkivu žlijezde. Prema histološkom izgledu tumorskih stanica razlikuju se, uz klasični podtip, i onkocitni podtip (oksifilni, Hürtle cell) i podtip svijetlih stanica.(28,32) Prognoza ovisi o izraženosti invazije: smrtnost bolesnika u skupini s minimalno invazivnim oblikom iznosi 3-5%, a u skupini sa široko invazivnim 50%.(32) Medularni karcinom Medularni karcinom je tumor podrijetla C-stanica štitnjače. Približno 25% medularnih karcinoma pripada nasljednom obliku tumora s mutacijom protoonkogena RET. Sporadični oblik tumora učestao je u petom desetljeću života. Klinički se najčešće prikazuje kao bezbolan čvor, a u trenutku dijagnosticiranja približno 50% bolesnika ima metastaze u limfnim čvorovima, dok se udaljene metastaze nalaze u približno 15% bolesnika. Makroskopski se najčešće radi o oštro ograničenoj, neočahurenoj tvorbi bijelo-sive do žućkaste boje. Histološki, tumor je građen od tračaka, gnijezda ili trabekula poligonalnih, okruglih ili vretenastih stanica između kojih se vide različito široki tračci fibrovaskularne strome i nakupina amiloida. Stanice sintetiziraju kalcitonin. Preživljenje bolesnika s opisanim tumorom ovisi o dobi, spolu, lokalnoj invaziji i udaljenim metastazama, a 5-godišnje preživljenje je približno 80%.(32) Anaplastični karcinom Anaplastični karcinom je izrazito zloćudan tumor štitnjače koji se najčešće javlja u starijoj životnoj dobi. Klinički se očituje kao brzo rastuća tvorba povezana s promuklošću, poremećajima gutanja, paralizom glasa, bolovima u vratu i otežanim disanjem. Prilikom dijagnosticiranja, često je prisutna lokalna invazija u anatomski bliske strukture, a metastaze u regionalnim limfnim čvorovima su prisutne u više od 40% bolesnika. I udaljene se metastaze nalaze u približno 40% bolesnika. Makroskopski se najčešće radi o većoj bjelkasto-smećkastoj tvorbi infiltrativnog rasta u samoj žlijezdi i prema okolnim strukturama, unutar koje se vide područja nekroze i 12

21 krvarenja. Histološki je tumor građen od nakupina vretenastih, pleomorfnih orijaških i epiteloidnih stanica. Prognoza bolesnika s opisanim tumorom ovisi o veličini tumora i zahvaćenosti okolnih struktura, a medijan preživljenja iznosi 2,5 do 6 mjeseci.(32) 1.7. MOLEKULARNA OSNOVA TUMORA Zloćudna preobrazba predstavlja složen slijed događaja koji nastaju u zdravoj stanici i za posljedicu imaju nakupljanje različitih molekularnih promjena koje se prenose na stanice-kćeri. U konačnici je osnovna značajka neoplastične stanice njezino izbjegavanje fiziološkim regulatornim mehanizmima rasta i dijeljenja (autonomnost) što za posljedicu ima besmrtnost odnosno, neograničenu mogućnost dijeljenja. U zloćudno promijenjenoj stanici su najčešće promjene u genima koji pripadaju jednoj od četiri velike skupine: onkogeni, tumor supresorski geni, geni koji sudjeluju u apoptozi i geni koji sudjeluju u popravku molekule DNA.(37) Onkogeni su aktivirani (amplifikacijom, rearanžmanom, insercijom dijela genoma virusa ili mutacijom) oblici normalnih staničnih gena - protoonkogena. Otkriveni su kao dijelovi genoma onkogenih virusa, a kasnije je dokazano da su aktivirani u stanicama tumora ljudi i životinja. U zdravim stanicama, proteini koji nastaju aktiviranjem protoonkogena sudjeluju u fiziološkoj regulaciji staničnog rasta i diobe i razvrstani su u nekoliko skupina: a) čimbenici rasta i njihovi receptori; b) signalne molekule; c) proteini koji se vežu za molekulu DNA; d) regulatori mitotičkog ciklusa. Strukturne promjene protoonkogena ili abnormalni uvjeti u kojima se protoonkogen nalazi mogu rezultirati nastankom onkogena. Na razini poremećaja funkcioniranja stanice, svojstva određena onkogenima su dominantna svojstva.(37) Prigušivači, kočničari raka ili tumor supresorski geni imaju aktivnost koja je suprotna aktivnosti onkogena te se zbog toga nazivaju i antionkogenima. Gubitak funkcije tumor supresorskog gena najčešće je posljedica delecije jednog alela (što se vrlo često otkriva metodama koje se temelje na dokazivanju gubitka heterozigotnosti) koju prati mutacija u preostalom alelu. Ovaj se fenomen naziva Knudsenova hipoteza o dva hica.(37,38) 13

22 Apoptoza je oblik smrti stanice u kojem se aktivira endogeni genski program njezinog vlastitog samouništenja. Naziva se i programirana smrt stanice. Izuzetno je važna tijekom nekih razvojnih procesa, ali i u postupcima odstranjvanja stanica u kojima je genski materijal oštećen, odnosno onih stanica u kojima, na razini DNA/RNA/proteina postoje greške. Apoptoza je složen, stupnjeviti proces koji mogu otpočeti različiti endogeni signali iz jezgre i/ili citoplazme, ali i egzogeni podražaji koji djeluju na staničnu membranu. U potonjem se slučaju, početni signali pojačavaju u citoplazmi, što zahtijeva složenu interakciju enzima-kaspaza, ali i velikog broja proapoptotičnih i anti-apoptotičnih proteina.(37) S obzirom na to da je molekula DNA stalno izložena djelovanju raznih potencijalno toksičnih kemikalija, radikala kisika i štetnih fizikalnih utjecaja, mogućnost nastanka oštećenja DNA je stalno prisutna. U cilju zaštite integriteta genskog materijala koji se diobom treba prenijeti u stanicu-kćer, popravljanje oštećene molekule DNA prije samog dijeljenja stanice je iznimno važno. Za popravljanje oštećene DNA odgovorni su specifični proteinski produkti, najčešće enzimi, ali (posredno) i proteini koji sudjeluju u rekombinaciji molekule DNA. Ukoliko postoji smanjenje i/ili oštećenje funkcije ovih proteina, oštećena se DNA prenosi u stanicu-kćer. Ovo je jedan od načina na koji otpočinje zloćudna preobrazba.(37) Genske promjene stanica papilarnog karcinoma Najčešće genske promjene u papilarnom karcinomu vezane su uz kromosomsku preuredbu gena za receptore tirozin kinaza, RET i TRK. Tirozin kinaze su skupina receptora na površini stanice koji imaju kinaznu aktivnost. Međudjelovanjem s brojnim čimbenicima rasta iz seruma sudjeluju u staničnom odgovoru koji za posljedicu ima rast i/ili diobu stanice. Preuredba kojom je zahvaćen gen za tirozin kinazu TRK javlja se u približno 10% ovih karcinoma. Preuređenje gena za tirozin kinazu RET, RET/PTC onkogen, nalazi se, prema različitim studijama, u različitog broja bolesnika s papilarnim karcinomom (0-80%). Srednja vrijednost pojavnosti je 20-30% u odraslih bolesnika. Učestalost je veća u mlađih bolesnika (45-60%) kao i u bolesnika izloženih terapijskom zračenju (50-80%). Do danas je otkriveno 12 tipova kimeričnog gena RET/PTC, a najučestaliji su RET/PTC1 i RET/PTC3 koji nastaju paracentričnom inverzijom na kromosomu 10. Kimera 14

23 RET/PTC2 i svi drugi kimerični oblici čine manje od 5% svih preuredbi i nastaju translokacijom na druge kromosome.(32, 39) Izraženost jednog ili više članova obitelji RET/PTC, prema nekim studijama, postoji u većini papilarnih karcinoma štitnjače, posebno u ranom stadiju zloćudne preobrazbe. Izraženiji je u okultnim karcinomima i mikrokarcinomima, u odnosu na slabo diferencirane karcinome. Ovo dovodi do zaključka da RET/PTC onkogen sudjeluje u ranoj fazi neoplastične transformacije štitnjače.(40-43) Prema nekim studijama, izraženost RET/PTC češća je u bolesnika s papilarnim karcinomom štitnjače udruženim s autoimunim tireoiditisom.(43-45) Njegova je izraženost dokazana i u bolesnika s autoimunim tireoiditisom, koji nisu imali dokazan tumor štitnjače.(44-47) Tireociti i fibroblasti s izraženim RET/PTC3 sintetiziraju upalne citokine in vitro i pozitivno utječu na signalnu infiltraciju limfocita in vivo. Dodatno, u uvjetima in vitro, potiču transkripciju mijeloidnih medijatora upale.(48) Studija na netransgeničnim i transgeničnim miševima pokazala je da RET/PTC3 tireociti, za razliku od TRK-T1 tireocita, aktivacijom signalnog puta NF-κB sintetiziraju upalne medijatore kao što su IL1α, IL1β, IL6 i TNFα te enzim ciklooksigenaza 2. (49) Unutar skupina različitih histoloških podtipova tumora RET/PTC1 je učestaliji u klasičnom podtipu kao i u mikrokarcinomu, dok je RET/PTC3 češći u solidnom podtipu i podtipu visokih stanica.(32) Istraživanja provedena na papilarnim karcinomima s i bez metastaza pokazala su da tumori s metastazama imaju gubitak tumor supresorskog gena p27 ili pojačanu aktivnost ciklina D1.(50,51) Gen za ciklin D1 je smješten na 11. kromosomu. Kodira nastanak proteina koji s ciklin ovisnim kinazama 4 i 6 tvori kompleks koji fosforilira i inaktivira tumor supresorski protein retinoblastoma (Rb) i omogućuje prelazak staničnog ciklusa iz G1 u S-fazu. Tumor supresorski gen p27 nalazi se na kromosomu 12 i kodira protein koji spriječava učinak opisanog kompleksa.(52) Ovi su geni/proteini/mehanizmi prisutni i u skupini karcinoma manjih ili jednakih jednom centimetru, podijeljenim na one koji nemaju i one koji imaju metastaze.(51) Na temelju prikazanih rezultata zaključeno je da je biološka osnova papilarnog karcinoma koji nije metastazirao drugačija od biološke osnove papilarnog karcinoma koji se očituje metastazama u limfne čvorove, a ovo se odnosi i na papilarne karcinome u promjeru manje ili jednake jednom centimetru.(32) 15

24 COX-2 i papilarni karcinom Ciklooksigenaze (COX) su ključni enzimi u pretvorbi arahidonske kiseline u prostaglandine. Dva proteina COX, COX-1 i COX-2, kodirani su različitim genima, smještenim na kromosomima 9 (9q32-q33.3) i 1 (1q25.2-q25.3). Protein COX-1 je konstitutivno izražen u većini tkiva u kojima potiče stvaranje prostaglandina potrebnih za održavanje homeostaze.(53,54) Protein COX-2 je izražen nakon poticanja mitogenom, a izrazito je izražen na mjestima upale, kao i u različitim vrstama karcinoma (debelo crijevo, želudac, jednjak, gušterača, pluća, dojka, prostata, vrat maternice, mokraćni mjehur, glava i vrat, melanom i gliom).(55-66) Jaka izraženost COX-2 korelira s lošijom prognozom u bolesnika s različitim vrstama karcinoma(64-68), a ciljana inhibicija COX-2 dovodi do supresije rasta tumora.(70-75) Izraženost COX-2 je povećana u tkivu tumora prostate tijekom proliferacije in vivo i in vitro (76), a COX-2 inhibitori potiskuju proliferaciju i potiču apoptozu u tkivu tumora prostate in vitro (77). Povišena razina COX-2 u različitim vrstama zloćudnih tumora povezana je s povišenom razinom vaskularnog endotelnog čimbenika rasta (VEGF) što se povezuje s pojačanom angiogenezom(78). Dodatno, povišena razina COX-2 dokazana je u zloćudnim tumorima vrata maternice i dojke bolesnica koje su imale metastaze u limfnim čvorovima.(79,80) Razina izraženosti COX-2 ovisi o vrsti karcinoma štitnjače.(81-86) Njegova najviša izraženost nađena je u papilarnom karcinomu, dok je izraženost značajno niža u anaplastičnom i folikularnom karcinomu.(85) U bolesnika oboljelih od papilarnog karcinoma, značajno je smanjena u bolesnika starije životne dobi s većim tumorom uznapredovalog stadija, sa satelitskim tumorima. Njegov visok izražaj postoji i u bolesnika s tumorom solidnog, trabekularnog ili sciroznog načina rasta.(85) U skladu s tim, aktivacija COX-2 se povezuje s ranom fazom nastanka karcinoma štitnjače.(83,85) Međutim, neka istraživanja provedena u bolesnika koji su bili podijeljeni u skupine po životnoj dobi, pokazala su povećanu izraženost COX-2 u starijim dobnim skupinama što bi moglo biti objašnjenje za agresivnije ponašanje ovog karcinoma u bolesnika starije životne dobi.(82,87) COX-2 je slabije izražen u folikularnoj podvrsti papilarnog karcinoma štitnjače.(88) Povećana izraženost COX-2 pronađena je, osim u bolesnika s papilarnim karcinomom, i u bolesnika s novotvorinama onkocitnih stanica (Hürtle cell adenom i Hürtle cell karcinom)(89), a vrlo slaba izraženost postoji 16

25 u dobroćudnim promjenama štitnjače (folikularni adenom i Hashimotov tireoiditis).(83-86) S druge strane, u tri istraživanja koja su provedena na relativno malom uzorku papilarnih karcinoma (ukupan broj manji od 50) izraženost COX-2 u papilarnom karcinomu je prisutna, ali se ne nalazi statistički značajna razlika izraženosti u odnosu na normalno tkivo štitnjače (90), odnosno, u odnosu na benigne promjene u štitnjači.(91,92) nm23-h1 i papilarni karcinom Geni, čiji se proteinski produkti smatraju supresorima metastaziranja, ključni su u kontroli metastatskog potencijala različitih karcinoma. U ovoj se skupini gena nalazi obitelj gena nm23.(93) Postoji nekoliko oblika gena nm23. Prvi je otkriven u stanicama melanoma i karcinoma dojke u miša i nazvan je nm23-m1.(94) U tkivu čovjeka je prvi član obitelji nm23 otkriven u fibroblastima i nazvan je nm23-h1 (17q21.3). Pokazano je da je razina mrna nm23-h1 smanjena u stanicama tumora visokog metastatskog potencijala.(91) Smatra se da djeluje kao tumor supresorski gen u mnogim tumorima.(96,97) Smanjena izraženost nm23 je statistički značajno povezana s agresivnijim ponašanjem melanoma te karcinoma želuca, debelog crijeva i dojke.(98-101) Suprotno tome, visoka izraženost nm23-h1 nalazi se u uznapredovalim stadijima karcinoma štitnjače (102,103), a povezana je i sa značajno smanjenim preživljenjem bolesnika s neuroblastomom i osteosarkomom. (104,105) U bolesnika s pločastim karcinomom jednjaka nije dokazana povezanost izraženosti nm23 i sklonosti metastaziranju.(106) Prema nekim istraživanjima na papilarnom i folikularnom karcinomu, nm23-h1 nije statistički značajno različito ispoljen u bolesnika sa ili bez metastaza u regionalnim limfnim čvorovima.(107) Dodatno, ove studije ne ukazuju na povezanost između izraženosti nm23-h1 i biološkog ponašanja karcinoma štitnjače.(108,109) Obrnuta povezanost izraženosti nm23-h1 i metastaziranja pronađena je u bolesnika s folikularnim karcinomom štitnjače.(110) 17

26 COX-2 i nm23-h1 Povezanost nm23-h1 i COX-2 pokazana je u stanicama inficiranim Epstein-Barr virusom (EBV) in vitro, u kojima je infekcija potaknula ispoljavanje nm23-h1 koji je potaknuo aktivaciju transkripcije COX-2 pomoću transkripcijskih čimbenika (NFκB i CREB).(111) Istraživanje provedeno na modelu karcinoma debelog crijeva pokazalo je jaču izraženost nm23-h1 i COX-2 u skupini bolesnika s tumorima nižeg stupnja diferencijacije, u slabije uznapredovalim stadijima bolesti. Smanjena ispoljenost ova dva proteina dokazana je u tumorima s udaljenim metastazama.(112) Međutim, istraživanje provedeno na tkivu pločastog karcinoma jednjaka pokazalo je da je izraženost COX-2 prisutna u skupini tumora s lošijim prognostičkim parametrima, za razliku od nm23-h1 čija je izraženost bila značajno manja u navedenoj skupini.(113) 18

27 2. HIPOTEZA U skupini bolesnika s papilarnim karcinomom štitnjače, kao i u bolesnika s papilarnim mikrokarcinomom štitnjače, prisutnost enzima COX-2 i tumor supresorskog proteina nm23-h1 izdvojit će manju skupinu bolesnika s biološki agresivnijim primarnim tumorom, u vrijeme postavljanja dijagnoze. 19

28 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA Oboljeli od papilarnog karcinoma štitnjače imaju dobru prognozu s vrlo visokim postotkom preživljenja. Međutim, postoji manji broj bolesnika u kojih se ovaj tumor ponaša agresivno. U cilju otkrivanja ove manje skupine bolesnika istražene su razlike vezane uz dob i spol bolesnika, veličinu i histološki podtip tumora, prisutnost širenja tumora unutar žlijezde i prisutnosti metastaza u regionalnim limfnim čvorovima. Stoga su ciljevi ovog istraživanja: - u grupi od 130 bolesnika oboljelih od papilarnog karcinoma izdvojiti podatke o spolu, dobi i veličini tumora u trenutku postavljanja dijagnoze - na histološkim rezovima bojenim hemalaun eozin (H.E.) odrediti: A) histološki podtip tumora B) prisutnost limfocitnog upalnog infiltrata C) prisutnost širenja tumora unutar žlijezde D) prisutnost dodatnih dobroćudnih promjena u štitnjači E) prisutnost metastaza u limfnim čvorovima - na dva dodatna reza primarnog tumora, odrediti razinu proteina nm23-h1 i COX-2, korištenjem monoklonskih protutijela, metodom imunohistokemije - korelirati podatke o izraženosti proteina nm23-h1 i COX-2 s podacima o dobi, spolu, veličini tumora i prije navedenim parametrima, A-E. 20

29 4. BOLESNICI I METODE 4.1. BOLESNICI U istraživanje je bilo uključeno 130 bolesnika s papilarnim karcinomom štitnjače, operiranih u Klinici za tumore u Zagrebu u razdoblju od godine. Analizirani su arhivirani uzorci biopsija tumora koji su dobiveni prilikom operacijskog zahvata, a istraživanje je u cijelosti provedeno u Zavodu za patologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Iz baze podataka Klinike za tumore u Zagrebu koristili su se klinički podaci METODE Materijal je obrađen standardnom patohistološkom metodom što uključuje fiksaciju tkiva u 10% puferiranom formalinu i uklapanje u parafinske blokove, rezanje na debljinu od 5 µm, deparafiniranje i bojenje standardnom metodom hemalaun eozin (H.E.). Na tako dobivenim rezovima određeno je: A) histološki podtip tumora; B) prisutnost limfocitnog upalnog infiltrata koji je izražen kao prisutan (+) ili odsutan (-); C) prisutnost širenja tumora unutar štitnjače te D) prisutnost dodatnih dobroćudnih promjena u tkivu štitnjače (nodozna guša, Hashimotov tireoiditis, limfocitni tireoiditis, folikularni adenom). Analizirani su i limfni čvorovi s obzirom na prisutnost metastaza. Na dva dodatna reza primarnog tumora se metodom imunohistokemije, monoklonskim protutijelima miša, odredilo prisustvo proteina nm23-h1 (Santa Cruz Biotechnology; sc-56928; 1:200) i COX-2 (Santa Cruz Biotechnology; sc-58344; 1:100). Korišten je aparat za imunohistokemijsko bojenje (Autostainer, DakoCytomation), po preporuci proizvođača. Jačina signala dobivenog imunohistokemijskim bojenjem izražena je semikvantitativno, određivanjem imunohistokemijskog indeksa bojenja (IIB), uzimajući u obzir intenzitet reakcije i postotak obojenih stanica. Intenzitet obojenja označen je na slijedeći način: 0: negativna reakcija; 1: slabo pozitivna reakcija; 2: srednje pozitivna reakcija; 3: jako pozitivna reakcija. Postotak imunoreaktivnih stanica izražen je kao: 0 negativna reakcija; 1 slabo izražena reakcija, do 10% 21

30 pozitivnih tumorskih stanica; 2 srednje izražena reakcija, >10-50% pozitivnih tumorskih stanica i 3 jako izražena reakcija, >50% pozitivnih tumorskih stanica. S obzirom na to da je imunohistokemijski indeks bojenja umnožak intenziteta reakcije i postotka obojenih stanica, rezultati su razvrstani u četiri skupine: 0 negativna reakcija I slabo izražena reakcija (umnožak je 1, 2 ili 3) II srednje jaka reakcija (umnožak je 4 ili 6) III jako pozitivna reakcija (umnožak je 9).(114) 4.3. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA Dobiveni podaci su prikazani u tablicama i grafički. Razdioba pojedinih varijabli je provjerena Smirnov-Kolmogorovljevim testom. U daljnjoj analizi se koristio Pearsonov hi-kvadrat (Pearson chi square) test razlika razdioba. Izračunat je Spearmanov korelacijski koeficijent za korelaciju izraženosti nm23-h1 i COX-2 u odnosu na dob i veličinu tumora. Napravljen je i Kruskal-Wallisov test za razlike u medijanima dobi, veličine tumora i izraženosti nm23-h1 i COX-2, između skupina s različitim histološkim podtipom karcinoma. Sve P-vrijednosti ispod 0,05 su se smatrale značajnima. U analizi se koristila programska podrška PASW for Windows verzija (Chichago, IL). 22

31 5. REZULTATI U tablici 1 prikazane su kliničke i patohistološke osobitosti uzoraka dobivenih od 130 bolesnika s papilarnim karcinomom štitnjače. Tablica 1. Kliničke i patohistološke osobitosti uzoraka spol dob lokalizacija tip (WHO) veličina (mm) širenje tumora u žlijezdi metastaze dodatne bolesti infiltrat limfocita nm23- H1 1 ž 53 desno folikularni 8 ne neg FA, th chr neg ž 49 lijevo klasični 8 ne poz Hash neg m 68 desno klasični 50 ne poz neg neg ž 78 desno klasični 30 ne neg neg poz ž 29 istmus klasični 14 ne neg neg neg ž 56 istmus sklerozirajući 10 da neg neg neg ž 56 desno klasični 6 ne neg neg poz ž 29 desno folikularni 6 ne poz neg poz ž 45 lijevo klasični 10 ne neg struma neg ž 45 lijevo folikularni 25 da neg neg neg ž 55 desno folikularni 7 ne neg struma neg ž 31 lijevo klasični 14 ne poz neg neg m 66 lijevo klasični 20 ne neg neg neg ž 48 desno klasični 15 ne neg th chr poz ž 63 istmus folikularni 15 ne neg neg neg ž 48 desno makrofolikularni 25 da neg neg neg ž 46 desno klasični 30 da neg neg neg ž 44 desno folikularni 11 ne poz neg neg m 46 istmus klasični 15 ne neg neg neg ž 30 lijevo klasični 15 da neg neg neg ž 61 lijevo oksifilni 20 ne neg neg poz ž 48 desno klasični 10 ne neg struma neg ž 43 desno sklerozirajući 12 ne neg th chr poz ž 34 desno klasični 11 da poz neg poz m 28 lijevo folikularni 20 ne neg neg neg m 44 lijevo folikularni 26 da poz neg neg ž 26 lijevo klasični 22 ne neg th chr neg ž 22 desno klasični 18 ne neg neg neg ž 34 desno klasični 12 ne neg neg poz ž 56 desno oksifilni 5 ne neg FA, th chr neg ž 49 desno klasični 6 da poz neg neg ž 20 desno klasični 7 ne poz struma neg ž 42 desno oksifilni 6 ne neg neg neg ž 54 desno klasični 25 ne neg struma, th chr poz ž 63 desno klasični 30 ne poz neg neg ž 53 desno oksifilni 6 ne neg Hash poz ž 67 desno sklerozirajući 15 ne neg th chr neg ž 41 desno klasični 8 ne neg struma neg ž 58 desno oksifilni 6 ne neg Hash poz 3 2 COX- 2 23

32 40 m 36 desno klasični 40 ne neg struma neg ž 40 desno klasični 9 ne neg neg neg ž 35 lijevo folikularni 10 da poz neg neg ž 56 lijevo klasični 9 ne neg neg neg ž 78 desno folikularni 20 ne neg neg neg m 48 desno folikularni 15 ne neg FA neg ž 63 desno sklerozirajući 11 ne neg neg neg m 34 desno klasični 20 ne poz neg neg m 43 desno klasični 15 ne neg neg neg ž 56 lijevo klasični 13 da poz struma neg ž 64 desno klasični 10 da neg neg neg ž 56 lijevo klasični 12 da poz FA, th chr neg m 67 lijevo oksifilni 15 ne neg struma neg ž 70 desno folikularni 27 da neg neg neg ž 65 lijevo oksifilni 10 ne neg neg neg m 64 lijevo klasični 12 da neg neg neg ž 67 lijevo klasični 10 ne neg FA neg ž 36 desno sklerozirajući 11 ne neg th chr neg m 66 desno sklerozirajući 21 ne neg neg neg m 31 desno sklerozirajući 20 da poz neg neg ž 74 desno tall cell 37 ne neg struma neg ž 29 desno sklerozirajući 28 ne neg neg neg ž 46 lijevo klasični 4 ne neg Hash poz ž 56 desno oksifilni 12 ne poz neg poz m 35 istmus folikularni 15 ne neg struma neg m 75 desno klasični 15 da neg th chr neg ž 50 desno inzularni 25 da poz neg neg ž 54 lijevo klasični 30 da poz neg neg m 80 lijevo klasični 5 da neg neg neg ž 34 lijevo folikularni 50 ne neg neg neg ž 32 lijevo klasični 15 da neg neg neg m 64 lijevo klasični 15 ne neg FA neg ž 61 desno klasični 10 da neg struma neg ž 39 desno klasični 27 ne poz struma neg ž 46 lijevo klasični 9 ne neg Hash poz ž 45 desno folikularni 10 ne neg Hash poz ž 46 lijevo klasični 6 ne neg struma poz ž 59 desno klasični 6 ne neg FA neg ž 66 desno klasični 24 ne neg th chr poz ž 50 lijevo klasični 9 da neg neg poz ž 29 lijevo klasični 13 ne poz Hash poz ž 44 desno klasični 11 ne neg neg neg ž 32 desno sklerozirajući 6 ne neg struma neg ž 54 istmus sklerozirajući 5 ne neg struma neg ž 26 istmus folikularni 3 ne poz struma neg m 55 desno folikularni 12 ne neg FA neg ž 58 desno klasični 25 da neg Hash neg ž 44 desno klasični 10 ne neg struma neg ž 35 desno folikularni 15 da neg Hash poz ž 62 desno klasični 10 ne poz neg neg ž 72 istmus sklero-oksif 8 da neg neg neg ž 61 lijevo folik-inzular 65 ne neg neg neg

33 92 ž 47 desno folikularni 35 da neg struma neg ž 49 lijevo sklerozirajući 7 ne neg Hash poz m 49 lijevo folikularni 10 da neg Hash poz ž 55 istmus folikularni 30 da neg struma neg ž 43 lijevo klasični 8 ne neg neg neg ž 65 desno klasični 25 da neg neg poz ž 52 desno folikularni 8 da neg neg poz m 52 desno folikularni 32 ne neg neg neg ž 80 desno klasični 17 ne neg FA, th chr poz ž 76 desno folikularni 7 ne neg FA, struma poz ž 58 desno oksifilni 4 ne neg FA, th chr neg ž 42 desno folikularni 26 ne neg th chr neg ž 41 lijevo folikularni 5 da neg Hash neg ž 73 lijevo klasični 10 ne neg struma, th chr poz ž 37 lijevo klasični 22 da neg neg poz ž 60 lijevo folikularni 5 da neg neg neg ž 64 desno folikularni 7 ne neg neg poz ž 32 lijevo klasični 12 ne neg struma neg m 76 lijevo folikularni 36 da poz struma neg ž 54 lijevo oksifilni 9 ne neg struma poz ž 30 desno folikularni 25 ne neg th chr neg m 72 lijevo sklerozirajući 40 ne neg neg neg m 53 lijevo klasični 7 ne poz neg neg ž 53 lijevo sklero-oksif 10 da neg neg neg ž 50 desno folikularni 20 ne neg FA, struma neg ž 57 lijevo klasični 6 ne neg Hash, FA neg ž 28 desno klasični 5 ne neg struma poz ž 47 desno oksifilni 15 ne neg struma neg ž 74 lijevo klasični 15 ne neg FA, struma poz ž 42 lijevo folik-sklero 12 ne neg neg poz ž 58 desno clear cell 25 ne neg neg neg ž 33 desno klasični 20 da poz struma, th chr poz ž 47 desno klasični 8 ne neg neg poz ž 36 lijevo klasični 21 da neg neg poz ž 33 desno sklerozirajući 8 ne poz neg poz ž 32 desno klasični 10 ne neg Hash poz ž 50 lijevo folikularni 10 ne neg neg neg ž 53 desno klasični 32 ne poz Hash poz ž 27 desno klasični 10 ne neg Hash neg 2 2 Kratice u tablici: sklero-oksif = sklerozirajući-oksifilni, folik-inzular = folikularno-inzularni, folik-sklero = folikularnosklerozirajući, FA = folikularni adenom, th chr = limfocitni tireoiditis, Hash = Hashimotov tireoiditis, struma = nodozna guša. 25

34 5.1. SPOL I DOB BOLESNIKA I VELIČINA TUMORA U istraživanje je bilo uključeno 130 bolesnika, pretežno ženskog spola (M:Ž=23:107), u dobi od 20 do 80 godina (medijan 49,5). Tumor je češće bio u desnom režnju (74 bolesnika), dok je u lijevom režnju bio lokaliziran u 47, a u istmusu u 9 bolesnika. Veličine tumora su bile od 3 do 65 mm (medijan 12 mm), a u ukupno 55 bolesnika tumor je bio manji ili jednak 10 mm HISTOLOŠKE ZNAČAJKE PAPILARNOG KARCINOMA, ŠTITNJAČE I LIMFNIH ČVOROVA Na rezovima tumorskog tkiva bojenog H.E. određen je histološki podtip tumora. Klasični podtip bio je prisutan u većine bolesnika (51,5%; N=67), a slijedili su ga folikularni podtip (24,6%; N=32), sklerozirajući podtip (10%; N=13) i oksifilni podtip (7,7%; N=10). U skupinu ostali uključeni su: podtip visokih stanica, podtip svijetlih stanica, makrofolikularni, inzularni i kombinacije više podtipova. Ovi podtipovi tumora bili su prisutni u 8 bolesnika (6,2% ukupnog uzorka). Infiltracija limfocita u tkivu tumora postojala je u 30% uzoraka (N=39) dok je odsutna bila u 70% uzoraka (N=91). Širenje tumora unutar žlijezde dokazano je u 28,5% uzoraka (N=37), dok je 71,5% ukupnog uzorka bilo bez izdvojenih žarišta tumora unutar žlijezde. Dobroćudne promjene u okolnom tkivu štitnjače (nodozna guša, limfocitni tireoiditis, Hashimotov tireoiditis i folikularni adenom) dokazane su u 50% uzoraka (N=65). Metastaze u regionalnim limfnim čvorovima bile su prisutne u 27 bolesnika što čini 20,8% ukupnog uzorka. 26

35 5.3. IZRAŽENOST PROTEINA nm23-h1 i COX-2 Jačine signala dobivenog metodom imunohistokemije izražene su semikvantitativno, određivanjem imunohistokemijskog indeksa bojenja (IIB), uzimajući u obzir intenzitet reakcije i postotak obojenih stanica Izraženost proteina nm23-h1 U tkivu tumora štitnjače, u većem je broju ukupnog uzorka dokazana izraženost nm23-h1 (N=128). Slabo izražena reakcija bila je prisutna u 10 tumora (7,7%), srednje jaka reakcija u 41 tumoru (31,5%) i jako pozitivna reakcija u 77 tumora (59,2%) dok je negativna bila u samo 2 tumora (1,6%) (uzorci #43 i #64). Jako pozitivna reakcija u citoplazmama stanica tumora prikazana je na slici 1. Slika 1. nm23-h1 u papilarnom karcinomu štitnjače (uzorak #21, objektivx25, IMH) 27

36 Izraženost proteina COX-2 U tkivu tumora štitnjače u većem je broju ukupnog uzorka dokazana izraženost COX-2 (N=123). Slabo izražena reakcija bila je prisutna u 35 tumora (26,9%), srednje jaka reakcija u u 49 tumora (37,7%) i jako pozitivna reakcija u 39 tumora (30%) dok je negativna bila u 7 tumora (5,4%). Na slici 2 je prikazana jako pozitivna reakcija izraženosti COX-2 u citoplazmama stanica papilarnog karcinoma štitnjače. Slika 2. COX-2 u papilarnom karcinomu štitnjače (uzorak #4, objektivx25, IMH) 28

37 Dob i spol bolesnika i veličina tumora Koreliranjem izraženosti nm23-h1 i COX-2 u tkivu tumora s dobi bolesnika i veličinom tumora korištenjem Spearmanovog korelacijskog koeficijenta nije pronađena statistički značajna povezanost (Tablica 2). Tablica 2. Spearmanov korelacijski koeficijent odnosa izraženosti proteina s dobi bolesnika i veličinom tumora Dob Veličina tumora (mm) nm23 cox2 Korelacijski koeficijent -0,065-0,110 P 0,465 0,213 N Korelacijski koeficijent 0,060 0,079 P 0,495 0,373 N

38 Također, bolesnici su svrstani u dvije dobne skupine: a) mlađi od 45- i stari točno 45 godina, b) stariji od 45 godina. U skupni mlađih od ili starih točno 45 godina bilo je 49 bolesnika (37,7% ukupnog uzorka), a u skupini starijih od 45 godina 81 bolesnik (62,3% ukupnog uzorka). Izraženosti proteina nm23-h1 i COX-2 u te dvije skupine prikazane su u tablicama 3 i 4. U tablici 3 je uočljivo da se s povećanjem jačine izraženosti proteina nm23-h1 u obje dobne skupine povećava i broj bolesnika. U tablici 4 vidi se da je najveći broj tumora bolesnika mlađih od ili točno starih 45 godina pokazivao srednje jaku i jako izraženu reakciju na COX-2, dok je u skupini starijih od 45 godina najveći broj tumora imao srednje jaku reakciju izraženosti COX-2, a slijedili su ih, po broju, bolesnici sa slabom te jako izraženom reakcijom. Nije nađena statistički značajna P-vrijednost. Tablica 3. Izraženost nm23-h1 u odnosu na dobne skupine nm23-h Dob:skupine 45 godina >45 godina N % 2,0% 6,1% 30,6% 61,2% 100,0% N % 1,2% 8,6% 32,1% 58,0% 100,0% N % 1,5% 7,7% 31,5% 59,2% 100,0% (Pearson chi square=0.455, df=3, P=0,929) Tablica 4. Izraženost COX-2 u odnosu na dobne skupine COX Dob:skupine 45 godina >45 godina N % 8,2% 16,3% 38,8% 36,7% 100,0% N % 3,7% 33,3% 37,0% 25,9% 100,0% N % 5,4% 26,9% 37,7% 30,0% 100,0% (Pearson chi square=5.621, df=3, P=0,132) 30

39 U tablicama 5 i 6 prikazana je izraženost nm23-h1 i COX-2 u odnosu na spol bolesnika. Iz tablice 5 je vidljivo da je u obje skupine bolesnika najveći broj tumora imao jako pozitivnu reakciju na nm23-h1 te da se broj bolesnika smanjuje sa smanjenjem izražene reakcije. Najveći broj bolesnika ženskog spola imao je tumor sa srednje jako izraženom reakcijom na COX-2, a u skupini bolesnika muškog spola najveći broj tumora je pokazivao jako pozitivnu reakciju na COX-2 (Tablica 6). Nije nađena statistički značajna P-vrijednost. Tablica 5. Izraženost nm23-h1 u odnosu na spol bolesnika Spol Muški Ženski nm23-h N % 0,0% 1,9% 1,5% N % 8,7% 7,5% 7,7% N % 17,4% 34,6% 31,5% 3 N % 73,9% 56,19% 59,2% N % 100,0% 100,0% 100,0% (Pearson chi square=3.257, df=3, P=0,354) Tablica 6. Izraženost COX-2 u odnosu na spol bolesnika Spol Muški Ženski COX N % 0,0% 6,5% 5,4% N % 34,8% 25,2% 26,9% N % 21,7% 41,1% 37,7% 3 N % 43,5% 27,1% 30,0% N % 100,0% 100,0% 100,0% (Pearson chi square=5.725, df=3, P=0,126) 31

40 Tumori su razvrstani u dvije skupine ovisno o veličini, tako da u skupini bolesnika s tumorima koji su manji ili jednaki 10 mm ima 55 bolesnika, dok tumor, veći od 10 mm, ima 75 bolesnika. Promatrana je razdioba izraženosti nm23-h1 i COX-2 u ove dvije skupine bolesnika, što je i prikazano na slikama 3 i 4. Statističkom obradom ovih podataka nije nađena statistički značajna P-vrijednost. Slika 3. Izraženost nm23-h1 u odnosu na veličinu tumora (Pearson chi square=0.476, df=3, P=0,924) Slika 4. Izraženost COX-2 u odnosu na veličinu tumora (Pearson chi square=2.751, df=3, P=0,432) 32

41 5.3.4 Histološki podtip papilarnog karcinoma Izraženost nm23-h1 u tkivu tumora u odnosu na histološki podtip tumora prikazana je u tablici 7 i slici 5. Zamjećuje se da je najveći broj tumora klasičnog i folikularnog histološkog podtipa pokazivao jako pozitivnu reakciju izraženosti nm23- H1. Međutim, ukoliko se uzmu udjeli tumora s jako izraženom i srednje jakom reakcijom na nm23-h1, uočljivo je da je u svim histološkim podtipovima dominantan broj tumora zastupljen upravo u ovim skupinama. Tablica 7. Izraženost nm23-h1 u odnosu na podtipove papilarnog karcinoma Podtip karcinoma: skupine Folikularni Klasični Oksifilni Sklerozirajući Ostali nm23-h N % 0,0% 1,5% 0,0% 7,7% 0,0% 1,5% N % 3,1% 7,5% 10,0% 15,4% 12,5% 7,7% N % 28,1% 25,4% 60,0% 38,5% 50,0% 31,5% N % 68,8% 65,7% 30,0% 38,5% 37,5% 59,2% N % 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% (Pearson chi square=14.694, df=12, P=0,259) Slika 5. Izraženost nm23-h1 u odnosu na histološke podtipove papilarnog karcinoma 33

42 Izraženost COX-2 u tkivu tumora u odnosu na histološki podtip tumora prikazana je u tablici 8 i slici 6. Primjećuje se da u skupini sklerozirajućeg podtipa najveći broj tumora ima slabo pozitivnu reakciju, dok je u ostalim podtipovima tumora najveći broj imao srednje jaku i/ili jako izraženu reakciju. Tablica 8. Izraženost COX-2 u odnosu na podtipove papilarnog karcinoma Podtip karcinoma: skupine Folikularni Klasični Oksifilni Sklerozirajući Ostali COX N % 3,1% 6,0% 0,0% 7,7% 12,5% 5,4% N % 15,6% 25,4% 40,0% 53,8% 25,0% 26,9% N % 28,1% 44,8% 30,0% 30,8% 37,5% 37,7% N % 53,1% 23,9% 30,0% 7,7% 25,0% 30,0% N % 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% (Pearson chi square=18.243, df=12, P=0,108) Slika 6. Izraženost COX-2 u odnosu na histološke podtipove papilarnog karcinoma 34