Volumen 64, Broj 1 VOJNOSANITETSKI PREGLED Strana 7 ORIGINALNI Č L A N C I UDC: 618.146-006-091.8:616.16 Angiogeneza kod skvamoznih prekanceroznih lezija grlića materice Angiogenesis in squamous precancerous cervical lesions Milan Panjković*, Tatjana Ivković-Kapicl *Institut za plućne bolesti i tuberkulozu, Sremska Kamenica; Institut za onkologiju, Sremska Kamenica Apstrakt Uvod/Cilj. Vaskularizacija je jedno od osnovnih obeležja malignih tumora. Neoangiogeneza započinje još u fazi displazije i in situ karcinoma, dakle pre progresije u invazivni tumorski stadijum. Cilj rada bio je analiza angiogeneze u stromi ispod displastički izmenjenog epitela u zavisnosti od stepena cerviksne intraepitelne displazije (CIN). Metode. Odabrani isečci konusa grlića materice 50 bolesnica (pet sa normalnim epitelom, sedam sa CIN1 promenama, 13 sa CIN2 i 25 sa CIN3 promenama), bojeni su imunohistohemijski sa anti-cd31 antitelom, markerom za endotelne ćelije, pri čemu su brojani svi krvni sudovi ispod bazalne membrane i to u tri vidna polja velikog uveličanja, na osnovu čega je određen njihov prosečan broj. Rezultati. Prosečan broj krvnih sudova (BKS) strome neposredno ispod epitela sa elementima displazije bio je 18,1±7,83. Prosečan BKS u stromi grlića bolesnica sa epitelnim promenama CIN1 stepena iznosio je 12,9±4,54, dok je kod bolesnica sa promenama CIN2 i CIN3 stepena ovaj broj bio 18,72±8,56, odnosno 19,24±7,83. Srednja vrednost BKS strome kod bolesnica sa prisustvom intraepitelnih krvnih sudova (n = 23) iznosila je 22±8,64, a kod bolesnica bez prisustva ovih struktura u epitelu ova vrednost je bila 12,91±4,36. Iako je zabeležen porast prosečnog BKS sa porastom stepena skvamoznih intraepitelnih promena, statistički značajna razlika nađena je samo između CIN1 i CIN3 stepena promena. Prosečan BKS kod bolesnica sa prisustvom epitelnih krvnih sudova bio je statistički značajno veći od prosečnog BKS kod bolesnica bez ovih elemenata. Zaključak. Prosečan broj krvnih sudova u stromi i stepen skvamoznih prekancerskih lezija grlića pozitivno korelišu u statistički značajnom stepenu, učestalost prisustva krvnih sudova u epitelu raste sa porastom stepena skvamoznih prekancerskih promena grlića, a prosečan broj krvnih sudova u stromi je statistički značajno veći u slučajevima sa prisustvom ovih struktura. Ključne reči: grlić materice; prekancerska stanja; neovaskularizacija, patološka. Abstract Background/Aim. Vascularisation is one of basic tumor's characteristics. Neoangiogenesis starts at the stage of the dysplastic epithelial changes, thus before the progression into invasive lesion. This study was designed to determine the relation between stromal angiogenesis and the grade of cervical intraepithelial changes (CIN). Methods. The tissue sections of 50 cone biopsies were immunohistochemically stained for CD31 antigen, a marker for endothelial cells. All microvessels along the basement membrane subtending dysplastic epithelium were counted. The mean microvessel count was calculated from the three separate fields for each specimen. All the cases were devided into four groups: normal cervical epithelium (n = 5), CIN1 (n = 7), CIN2 (n = 13), and CIN3 (n = 25). Results. The mean microvessel count (MVC) under the dysplastic epithelium was 18.1. For the patients with CIN1 changes the mean MVC was 12.9, while this number was 18.72 and 19.24 for the patients with CIN2 and CIN3 grade of epithelial changes, respectively. In a subset of the high grade lesions vascular structures were also noted in the upper layer of the epithelium. The mean MVC in the cases with the presence of these structures was 22, while this number was 12.91 in the cases without intraepithelial vessels. Althoug we found an increase of the mean MVC with the increase of the CIN grade, statisticaly significant differences were found out between CIN1 and CIN3 lesions. The mean MVC of the patients with the presence of intraepithelial vessels was statisticaly higher than the mean MVC of the patients without these structures. Conclusion. On the basis of the obtained results, we can conclude that the mean MVC and CIN grade positively correlated, while the number of cases with intraepithelial vessels increased with the CIN grade. Key words: cervix uteri; precancerous conditions; neovascularization, pathologic. Correspondence to: Milan Panjković, Institut za plućne bolesti i tuberkulozu, Institutski put 4, 21 000 Sremska Kamenica.
Strana 8 VOJNOSANITETSKI PREGLED Volumen 64, Broj 1 Uvod Angiogeneza, stvaranje novih kapilara iz prethodno postojeće vaskularne mreže, kompleksan je proces koji se sastoji iz aktivacije, migracije i proliferacije endotelnih ćelija. Ovaj proces leži u osnovi reprodukcije, razvoja, zarastanja rana, kao i angiogenih i neoplastičkih bolesti 1, 2. Vaskularizacija je jedno od osnovnih obeležja rasta malignih tumora. Najviše proučavana forma vaskularizacije je tumorski indukovana neoangiogeneza 3, 4. Značaj tumorske neoangiogeneze je u tome što omogućava rast tumora ne samo zahvaljujući perfuziji nego i parakrinom efektu različitih materija na tumorske ćelije. Faktori oslobođeni iz endotelnih ćelija stimulišu tumor na rast. Angiogeneza je i sastavni deo procesa metastaziranja. Novostvoreni kapilari su propustljivi i izuzetno pogodni za ulazak ćelija tumora u cirkulaciju. Zato bogato vaskularizovani tumori imaju veći metastatski potencijal 4 7. Zbog svega navedenog tumorska angiogeneza ima prognostički značaj što je i dokazano kod bolesnika sa karcinomom endometrijuma 8, dojke 9, prostate 10, creva 11, nazofarinksa 12, malignog melanoma 13 i želuca 14. Neoangiogeneza započinje još u fazi displazije i in situ karcinoma, dakle pre progresije u invazivni tumorski stadijum. Makroskopski uočljivo prisustvo vaskularne mreže u kolposkopskom nalazu cerviksne displazije najočigledniji je dokaz njenih vaskularnih karakteristika 15. Brojne studije ukazuju na angiogeni potencijal različitih displastičkih promena kao što su displazija epitela mokraćne bešike, in situ karcinom dojke, vulvarna intraepitelna neoplazija i druge. Na osnovu toga moglo bi se zaključiti da povećana angiogena aktivnost može biti jedan od predznaka maligne alteracije 16. Cilj rada bio je analiza stepena angiogeneze u stromi ispod displastično izmenjenog epitela u zavisnosti od stepena cerviksne intraepitelne neoplazije (CIN). Metode Ispitivanjem je obuhvaćeno 50 bolesnica kod kojih izvršena konizacija u Institutu za onkologiju, Sremska Kamenica, u vremenskom periodu od 1999. do 2003. godine. Konusni isečak (konizat), otvaran je i serijski sečen na isečke debljine do 2 mm (najmanje 12), koji su fiksirani u 10% formalinu i nakon parafinskog kalupljenja, sečeni mikrotomom na isečke debljine 4 6 μm. Deparafinisani tkivni isečci su zatim bojeni metodom hematoksilin-eozin. Patohistološkim pregledom svih dobijenih isečaka iz konizata izabran je po jedan, sa promenama epitela najvišeg stepena, a zatim je određen stepen CIN, na osnovu klasifikacije World Health Organisation and International Society of Gynaecological Pathologists Classification (WHO/ISGYP). Bolesnice su na osnovu dijagnoze koja je dobijena patohistološkim pregledom konizata podeljene u četiri grupe: pet bolesnica je bilo bez promena, sedam sa promenama CIN1 stepena, 13 sa promenama CIN2 stepena i 25 sa promenama CIN3 stepena. Grupe su zatim međusobno upoređivane u odnosu na imunohistohemijsku ekspresiju CD-31 antigena (stepen tumorski indukovane angiogeneze). Za imunohistohemijske analize korišćeni su izabrani uzorci iz konusa, fiksirani u formalinu i ukalupljeni u parafin, sečeni su na isečke debljine 4 μm i zatim lepljeni na Superfrost (Menzel-Glaser) pozitivno naelektrisane staklene pločice unapred pripremljene za imunohistohemijske reakcije. Nakon deparafinizacije pristupalo se blokiranju endogene peroksidaze sa 3% H 2 O 2 u trajanju od 5 minuta. Imunohistohemijska identifikacija vršena je primenom streptavidin-biotinperoksidaza tehnike (B-SA), prema standardnoj LSAB proceduri (DAKO). Za analizu neovaskularizacije korišćena je imunohistohemijska identifikacija primarnim antitelom DAKO CD31 M 0823, koji markira endotelne ćelije reagujući sa 130 kda glikoproteinom platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM). Prilikom bojenja korišćeno je razblaženje 1 : 10, a vreme inkubacije iznosilo je 32 minuta. Isečci su inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi sa biotiniliziranim antimišijim antitelom, a zatim inkubirani sa streptavidin-peroksidaza kompleks sistemom, u trajanju od 30 minuta. Kao hromogeni supstrat primenjen je 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC, DAKO). Nakon svakog inkubiranja uzorci su isprani u tris puferisanom rastvoru (TBS: 0,05 M, ph 7,6) i rađen je kontrast hematoksilinom. Isečci su pokrivani specijalnim vodenim medijumom. Normalno tkivo grlića u okolini promene služilo je kao pozitivna kontrola, a kao negativna kontrola služili su uzorci tkiva kod kojih je tokom tretmana izostavljeno primarno antitelo, dok su ostale faze imunohistohemijske procedure sprovedene. Utvrđivanje područja sa najintenzivnijom neovaskularizacijom (hot spots) vršeno je svetlosnim mikroskopom na malom povećanju. Ove zone su se nalazile na granici epitela i strome uz bazalnu membranu. Svaka crvenkastosmeđe obojena endotelna ćelija, ili grupa endotelnih ćelija, brojana je kao pojedinačni krvni sud. Analiza angiogeneze vršena je kvantitativno, brojanjem krvnih sudova, na polju sa velikim uveličanjem, u tri područja najaktivnije neovaskularizacije. Broj novoformiranih krvnih sudova određivan je kao srednja vrednost izmerenih vrednosti. Radi što bolje evaluacije angiogeneze, brojanje krvnih sudova vršeno je dva puta, pri čemu vrednosti prethodnog brojanja nisu bile poznate. Statistička obrada dobijenih rezultata izvršena je prema osnovnim statističkim metodama: ocena postojanja i nivoa statističkog značaja razlike parametrijskih podataka testirana je primenom Studentovog t testa, a vrednost p < 0,05 smatrana je statistički značajnom. Rezultati Citoplazma svih endotelnih ćelija bila je CD31 antitelom obojena crvenkasto smeđe. Sve pojedinačne endotelne ćelije, kao i grupice sa ili bez lumena, brojane su kao pojedinačni krvni sudovi (slika 1). Prosečan broj krvnih sudova (BKS) u stromi grlića ispod normalnog pločasto-slojevitog epitela iznosio je 8±0,78. Broj krvnih sudova kretao se u intervalu od 5 do 10. Prosečan BKS strome neposredno ispod epitela, sa elementima displazije, bio je 18,1±7,83 i kretao se u intervalu od 6 do 57. Razlika u BKS strome ispod neizmenjenog epitela i epitela sa elementima displazije pokazivala je visoku statističku značajnost (t = 2,83; p < 0,01). Krvni sudovi nalazili su se neposredno uz bazalnu membranu, kao i u okolini žlezda sa
Volumen 64, Broj 1 VOJNOSANITETSKI PREGLED Strana 9 displastičnim skvamoznim epitelom. Odnos srednjeg broja krvnih sudova i stepena skvamozne displazije prikazan je na slici 2. Prosečan BKS u stromi grlića bolesnica sa promenama epitela CIN1 stepena iznosio je 12,9±4,54, dok je kod bolesnica sa promenama CIN2, tj. CIN3 stepena ovaj broj bio 18,72±8,56, tj.19,24±7,83. Razlika u srednjem BKS između promena epitela CIN1 : CIN2, kao i CIN2 : CIN3 stepena nije dostizala statističku značajnost (t = 1,59 i t = 0,19), dok je statistički značajna razlika nađena između promena CIN1 i CIN3 stepena (t = 2,07; p < 0,05). Prosečan BKS u stromi ispod epitela korelisao je sa stepenom displastičnih promena (ρ = 0,32; p < 0,05). Analizom materijala u pojedinim slučajevima je uočeno prisustvo intraepitelnih krvnih sudova (slika 3). Ovi krvni sudovi nađeni su kod jedne (14%) bolesnice sa diplazijom epitela CIN1 stepena, sedam (54,46%) sa displazijom CIN2 i 15 (60%) sa promenama CIN3 stepena. Sl. 3 Krvni sudovi u displastično izmenjenom epitelu grlića (CD31 200) U normalnom epitelu ovi krvni sudovi nisu nađeni. Statistički značajna razlika u prisustvu ovih struktura nađena je između stepena promena CIN1 i CIN2 (t = 2,105; p < 0,05), dok između CIN2 i CIN3 lezija ova razlika nije dostigla statističku značajnost (t = 0,35; p > 0,1). Srednja vrednost BKS strome kod bolesnica sa prisustvom intraepitelnih krvnih sudova (n = 23) iznosila je 22±8,64, a kod bolesnica bez nalaza ovih struktura u epitelu ova vrednost bila je 12,91±4,36, što je prikazano na slici 4. Razlika u broju krvnih sudova strome između grupe bolesnica sa prisustvom intraepitelnih krvnih sudova i grupe bez tih elemenata bila je visoko statistički značajna (t = 4,73; p < 0,001). 25 Prosečan BKS 20 15 Sl. 1 Krvni sudovi uz bazalnu membranu ispod displastično izmenjenog epitela grlića (CD31 10) 10 20 18 16 14 12 10 8 6 Prosečan BKS 5 0 Slučajevi sa prisustvom krvnih sudova u epitelu Slučajevi bez prisustvom krvnih sudova u epitelu Sl. 4 Prosečan broj krvnih sudova (BKS) u zavisnosti od prisustva krvnih sudova u epitelu kod skvamoznih prekanceroznih lezija grlića materice 4 2 0 CIN 1 CIN 2 CIN 3 Sl. 2 Odnos prosečnog broja krvnih sudova (BKS) i stepena skvamoznih prekanceroznih lezija grlića materice Diskusija Proces interakcije između tumorskih, endotelnih i ćelija strome tokom progresije tumora veoma je dinamičan i determiniše rast tumora i prisustvo metastaza 17. Stepen angiogeneze i njena progresija u toku prekancerskih promena epi-
Strana 10 VOJNOSANITETSKI PREGLED Volumen 64, Broj 1 tela grlića materice praćena je u ovom radu. Nađeno je da je neovaskularizacija bila ograničena na usku zonu neposredno ispod displastičkog epitela, kao i oko endocerviksnih žlezda koje su zamenjene skvamoznim displastičkim epitelom. Prema dobijenim rezultatima nije bilo statistički značajne razlike u godinama starosti između bolesnica s niskim i visokim prosečnim BKS. Nađena je statistički značajna razlika između prosečnog BKS u slučajevima sa normalnim epitelom i onim sa prisustvom displastičnih promena. Zabeležen je porast prosečnog BKS, sa porastom stepena skvamoznih intraepitelnih promena i pozitivna značajna korelacija ovog parametra i stepena cerviksne displazije. U određenom broju slučajeva zapaženo je prisustvo vaskularnih struktura u samom epitelu, posebno u gornjoj polovini. Ovi krvni sudovi verovatno potiču od stromnih vaskularnih papila koje se šire prema površini epitela. Broj slučajeva sa prisustvom ovih struktura rastao je sa stepenom displastičnih promena epitela. Prosečan BKS kod bolesnica sa prisustvom epitelnih krvnih sudova bio je statistički značajno veći od prosečnog BKS kod bolesnica bez ovih elemenata. Moguće je da krvni sudovi nađeni u epitelu nastaju kao posledica nastavka procesa vaskularizacije duž bazalne membrane i širenja stromnih papila prema površini epitela. Naši rezultati su u saglasnosti sa rezultatima Smith-McCunea i Weidnera 18 koji su u svom pionirskom radu na malom broju slučajeva (n = 23), koristeći faktor VIII i angiogeni odnos, našli da postoji povećanje stepena angiogeneze sa porastom težine displastičkih promena epitela. U navedenom radu autori ističu i prisustvo vaskularnih struktura u displastičnom epitelu, posebno u površnim delovima, a ističu i porast broja slučajeva sa ovim promenama sa progresijom lezija, što je u saglasnosti sa našim rezultatima. Međutim, za razliku od naših nalaza, prosečan broj krvnih sudova kod bolesnica sa ovim strukturama i bez njih ne pokazuje statistički značajnu razliku, tako da autori pretpostavljaju da je stvaranje epitelnih krvnih sudova deo potpuno odvojenog procesa od neoangiogeneze duž bazalne membrane. U našem radu su u ovu analizu uključeni svi slučajevi sa prisustvom intraepitelnih krvnih sudova, dok Smith-McCune i Weidner 18 su analizirali samo one sa CIN3 stepenom promena, što može biti jedan od uzroka neslagnja rezultata. Keith i sar. 19 su našli slične promene u displastičkom epitelu bronha kod pušača. Pored povećanja prosečnog BKS u stromi neposredno ispod, prisustvo ovih struktura prema njima predstavlja abnormalan tip vaskularizacije, koji se javlja pre pojave bronijalnog karcinoma. U novijem radu Smith-McCune i sar. 20 su ukazali na to da i normalan epitel grlića, pored displastičkog, ima angiogene karakteristike što ukazuje na mogućnost da inflamacija izazvana displazijom dovodi do povećanog stvaranja angiogenih citokina i krvnih sudova i u okolini. Abulafia i sar. 21 su, koristeći faktor VIII kao marker krvnih sudova, našli da ne postoji statistički značajna razlika između prosečnog BKS kontrolnih slučajeva sa normalnim epitelom i onih sa cerviksnim in situ karcinomom i da značajan porast BKS postoji tek sa progresijom lezija u invazivni oblik, iako korelacija sa dubinom invazije nije nađena. Prema ovim autorima cerviksni in situ karcinom predstavlja prevaskularnu fazu neoplastičnog procesa. Lee i sar. 22, 23 su koristili CD 34 kao marker krvnih sudova i pokazali su da postoji jaka korelacija između prosečnog BKS u stromi ispod prekancerskih lezija glića materice i progresije ovih promena. Ozalp i sar. 24 su u svom radu našli da postoji statistički značajna razlika u prosečnom BKS u stromi, između bolesnica sa CIN1 promenama, sa jedne, i onih sa CIN2 i CIN 3 promenama, sa druge strane, što je u saglasnosti sa našim rezultatima. Soini i sar. 25 su koristeći faktor VIII našli da, iako postoji blag porast, nema statistički značajne razlike u prosečnom BKS po stepenima CIN promena, dok su Bancher- Todesca i sar. 16 koristeći isti marker našli značajnu korelaciju ekspresije ovog antigena i porast broja krvnih sudova duž bazalne membrane sa progresijom displastičnih promena kod bolesnica sa vulvarnom intraepitelnom neoplazijom. Feng i sar. 26 su u svojoj studiji ukazali na povećanje ekspresije vaskularnogenolateralnog faktora rasta (VEGF) na lestvici promena od normalne sluznice želuca, preko lake i teške displazije do invazivnog karcinoma, dok su Kondo i sar. 27 na osnovu porasta ekspresije VEGF u ovom spektru promena našli da postoji porast broja krvnih sudova u njima. Navedeni rezultati pokazuju da se angiogeni preobražaj i sticanje angiogenog fenotipa odvija još u toku preinvazivnih displastičkih lezija i da se neovaskularizacija u cerviksnoj intraepitelnoj neoplaziji razvija u fazama. U displastičkim promenama težeg stepena češće prisustvo krvnih sudova u epitelu, ukazuje na sledeću fazu angiogeneze u kojoj se stromne vaskularne papile izdužuju prema površini epitela. Nije, međutim, poznato da li ove papile potiču iz već postojećih stromnih papila ili nastaju daljim sazrevanjem mreže krvnih sudova neposredno ispod bazalne membrane. Hipotetično, u sledećoj fazi angiogeneze krvni sudovi mogu stići do površine epitela i biti detektovani kao atipični krvni sudovi kolposkopski, što je prekretnica u progresiji ovih promena u invazivni karcinom. Angiogeneza je verovatno jedan od faktora koji je značajan za rast, perzistiranje i progresiju displastičnih promena, što otvara mogućnost korišćenja antiangiogenih materija u njihovoj terapiji 16, 18. Zaključak Prosečan broj krvnih sudova u stromi i stepen skvamoznih prekanceroznih lezija grlića pozitivno korelišu u statistički značajnom stepenu, učestalost prisustva krvnih sudova u epitelu raste sa porastom stepena skvamoznih prekanceroznih promena grlića, a prosečan broj krvnih sudova u stromi statistički značajno je veći u slučajevima sa prisustvom ovih struktura.
Volumen 64, Broj 1 VOJNOSANITETSKI PREGLED Strana 11 L I T E R A T U R A 1. Tomanek RJ, Schatteman GC. Angiogenesis: new insights and therapeutic potential. Anat Rec 2000; 261(3): 126 35. 2. Timar J, Dome B, Fazekas K, Janovics A, Paku S. Angiogenesisdependent diseases and angiogenesis therapy. Pathol Oncol Res 2001; 7(2): 85 94. 3. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285(21): 1182 6. 4. Shing Y, Folkman J, Sullivan R, Butterfield C, Murray J, Klagsbrun M. Heparin affinity: purification of a tumor-derived capillary endothelial cell growth factor. Science 1984; 223(4642): 1296 9. 5. Patan S, Munn LL, Jain RK. Intussusceptive microvascular growth in a human colon adenocarcinoma xenograft: a novel mechanism of tumor angiogenesis. Microvasc Res 1996; 51(2): 260 72. 6. Pluda JM. Tumor-associated angiogenesis: mechanisms, clinical implications, and therapeutic strategies. Semin Oncol 1997; 24(2): 203 18. 7. Zetter BR. Angiogenesis and tumor metastasis. Annu Rev Med 1998; 49: 407 24. 8. Obermair A, Tempfer C, Wasicky R, Kaider A, Hefler L, Kainz C. Prognostic significance of tumor angiogenesis in endometrial cancer. Obstet Gynecol 1999; 93(3): 367 71. 9. Gasparini G, Harris AL. Clinical importance of the determination of tumor angiogenesis in breast carcinoma: much more than a new prognostic tool. J Clin Oncol 1995; 13(3): 765 82. 10. Offersen BV, Borre M, Overgaard J. Immunohistochemical determination of tumor angiogenesis measured by the maximal microvessel density in human prostate cancer. APMIS 1998; 106(4): 463 9. 11. Choi HJ, Hyun MS, Jung GJ, Kim SS, Hong SH. Tumor angiogenesis as a prognostic predictor in colorectal carcinoma with special reference to mode of metastasis and recurrence. Oncology 1998; 55(6): 575 81. 12. Roychowdhury DF, Tseng A Jr, Fu KK, Weinburg V, Weidner N. New prognostic factors in nasopharyngeal carcinoma. Tumor angiogenesis and C-erbB2 expression. Cancer 1996; 77(8): 1419 26. 13. Bayer-Garner IB, Hough AJ Jr, Smoller BR. Vascular endothelial growth factor expression in malignant melanoma: prognostic versus diagnostic usefulness. Mod Pathol 1999; 12(8): 770 4. 14. Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, Takatsuka S, Kang SM, Ogawa M, et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma. Cancer 1996; 77(5): 858 63. 15. Paku S. Current concepts of tumor-induced angiogenesis. Pathol Oncol Res 1998; 4(1): 62 75. 16. Bancher-Todesca D, Obermair A, Bilgi S, Kohlberger P, Kainz C, Breitenecker G, et al. Angiogenesis in vulvar intraepithelial neoplasia. Gynecol Oncol 1997; 64(3): 496 500. 17. Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis--correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991; 324(1): 1 8. 18. Smith-McCune KK, Weidner N. Demonstration and characterization of the angiogenic properties of cervical dysplasia. Cancer Res 1994; 54(3): 800 4. 19. Keith RL, Miller YE, Gemmill RM, Drabkin HA, Dempsey EC, Kennedy TC, et al. Angiogenic squamous dysplasia in bronchi of individuals at high risk for lung cancer. Clin Cancer Res 2000; 6(5): 1616 25. 20. Smith-McCune KK, Zhu Y, Darragh T. Angiogenesis in histologically benign squamous mucosa is a sensitive marker for nearby cervical intraepithelial neoplasia. Angiogenesis 1998; 2(2): 135 42. 21. Abulafia O, Triest WE, Sherer DM. Angiogenesis in squamous cell carcinoma in situ and microinvasive carcinoma of the uterine cervix. Obstet Gynecol 1996; 88(6): 927 32. 22. Lee JS, Kim HS, Jung JJ, Lee MC, Park CS. Angiogenesis, cell proliferation and apoptosis in progression of cervical neoplasia. Anal Quant Cytol Histol 2002; 24(2): 103 13. 23. Lee JS, Kim HS, Park JT, Lee MC, Park CS. Expression of vascular endothelial growth factor in the progression of cervical neoplasia and its relation to angiogenesis and p53 status. Anal Quant Cytol Histol 2003; 25(6): 303 11. 24. Ozalp S, Yalcin OT, Oner U, Tanir HM, Acikalin M, Sarac I. Microvessel density as a prognostic factor in preinvasive and invasive cervical lesions. Eur J Gynaecol Oncol 2003; 24(5): 425 8. 25. Soini Y, Pollanen R, Kemppainen S, Paakko P, Lehto VP. The association of vascular proliferation with HPV status and epithelial PCNA positivity in cervical intraepithelial lesions. APMIS 1996; 104(3): 183 90. 26. Feng CW, Wang LD, Jiao LH, Liu B, Zheng S, Xie XJ. Expression of p53, inducible nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor in gastric precancerous and cancerous lesions: correlation with clinical features. BMC Cancer 2002; 2: 8. 27. Kondo Y, Arii S, Furutani M, Isigami S, Mori A, Onodera H, et al. Implication of vascular endothelial growth factor and p53 status for angiogenesis in noninvasive colorectal carcinoma. Cancer 2000; 88(8): 1820 7. Rad je primljen 28. II 2006.