STERILIZACIJA S PLAZMO

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO ODDELEK ZA FIZIKO SEMINAR STERILIZACIJA S PLAZMO Primož Dolenc Mentor: Doc.Dr. Miran Mozetič MAJ 2006

Izvleček V seminarju predstavim osnove nizko ionizirane plazme in njeno uporabnost za sterilizacijo. Opišem strukturo bakterij in obravnavam mehanizme s katerimi plazma uničuje bakterije. Trije glavni mehanizmi so: uničenje dednega zapisa z UV obsevanjem, segrevanje bakterije z oksidacijo in jedkanje celične stene zaradi stika s kemijsko aktivnimi radikali v plazmi. Podatke o medsebojnih vplivih teh procesov dobimo iz krivulj preživetja bakterij v plazmi. Kazalo 1. Uvod 3 2. Struktura bakterij in problemi sterilizacije 3 2.1 Struktura bakterij...3 2.2 Sterilizacija...5 3. Nizko energijska plazma 5 3.1 Osnove fizike plazme...5 3.2 Nizko ionizirana plazma...7 3.3 Ustvarjanje plazme...7 4. Sterilizacijski mehanizmi v nizkoenergijski plazmi 8 4.1 UV sevanje...8 4.2 Kemijska razgradnja...8 4.3 Termična razgradnja...9 5. Krivulje preživetja 11 6. Zaključek 12 7. Viri 13 2

3. Uvod Na lesorezu Albrechta Dürerja iz leta 1497 so upodobljeni štirje jezdeci apokalipse, med katerimi je tudi bolezen. Bolezni kot sta kuga in kolera sta bili dolga stoletja eden glavnih vzrokov smrti. Danes vemo, da je njun vzrok bakterijska okužba in da je podobna obolenja mogoče preprečiti z večjo higieno. Pomembno vlogo pri tem igra sterilizacija, postopek, ki preprečuje nastanek bolezni z uničenjem mikroorganizmov, ki jih povzročajo. Tradicionalne metode sterilizacije so bile toplotne, kot naprimer vretje vode in kemične, torej uporaba strupov. Pred približno desetimi leti [1] so odkrili, da je plazma dober sterilizator, saj združuje dobre strani prejšnjih metod, pri čemer ni potrebna uporaba strupenih snovi ali segrevanje celotnega sistema. Slika 1: Štirje jezdeci apokalipse (Albrecht Dürer, 1497, lesorez) 2. Struktura bakterij in problemi sterilizacije 2.1 Struktura bakterij Bakterije so enocelični organizmi, ki so prisotni povsod okrog nas in igrajo v različnih ekosistemih pomembne vloge. Odvisno od vrste so lahko človeku prijazne, (naprimer znana vrsta L. Casei imunitas iz Actimela) ali pa nevarne. Večinoma so velike okrog mikrometra, nekatere vrste pa zrastejo celo do pol milimetra. Majhna velikost je pomembna zaradi velikega kvocienta med površino in volumnom, kar omogoča hitro vsrkavanje hranilnih snovi in izločanje odpakov. 3

Tipično so okroglih ali podolgovatih oblik in nekatere se poganjajo naokrog z bičkastimi izrastki. Slika 2: Elektronski mikrograf Bakterij E. Coli [9] Bakterijo od okolja ločuje od 10 do 50 nm debela celična stena, čvrsta elastična membrana. Od celičnih sten drugih organizmov se ločijo predvsem po prisotnosti peptidoglikana, polimera, ki je odgovoren za trdnost celične stene in vzdržuje obliko bakterije. Glede na zgradbo celičnega stene ločimo dve vrsti bakterij: Gram pozitivne in Gram negativne. Gramovo barvanje je proces obarvanja bakterije z bakteriološkimi barvili. Celična stena Gram pozitivne bakterije je zgrajena pretežno iz že prej omenjenega peptidoglikana, ki vsrkava barve med Gramovim procesom, medtem ko so stene Gram negativnih bakterij tanjše, z manj peptidoglikana, vendar strukturno bolj zapletene. Zaradi kemijske inertnosti materialov, ki sestavljajo celično steno so mnoge bakterije zelo odporne na vplive iz okolice. Še posebej odporne pa so bakterijske spore, to so stanja bakterij, ki so namenjena preživetju v posebej težkih razmerah. 4

Notranje strukture bakterije obdaja citoplazmatska membrana debela od 5-10 nm. Ta membrana nadzoruje pretok snovi med bakterijo in okolico in pomembno vpliva na deljenje celice. Sama notranjost bakterije je napolnjena s citoplazmo, ki je koloidna mešanica različnih molekul in v citoplazmi plava kromosom. Slika 3: Shematična predstavitev zgradbe bakterijske ovojnice 2.2 Sterilizacija Sterilizacija je proces, pri katerem v določenem okolju uničimo vsa živa bitja še posebej mikroorganizme. Trenutno se za sterilizacijo najbolj uporabljajta termična in kemična metoda[1]. Pri termični metodi izpostavimo delce visoki temperaturi. Ponavadi uporabljamo vodno paro pri približno 130 C. Pri kondenzaciji na površini telesa, ki ga želimo sterilizirati, para odda svojo izparilno toploto. Tako je prenos toplote bistveno večji, kot če bi vzorce ogrevali s suhim zrakom. Vendar nekatere snovi in živila, ki bi jih radi sterilizirali ne prenesejo visokih temperatur, prav tako pa na ta način ne moremo sterilizirati velikih prezračevalnih sistemov. Vzorce lahko steriliziramo tudi tako, da jih izpostavimo zelo strupenemu plinu. Najboljši je etilen oksid (CH2 O CH2). Vzorcev ni potrebno ogrevati vendar pa sam proces traja mnogo dlje kot pri toplotni sterilizaciji, poleg tega pa je potrebno po končanem procesu vzorce razstrupiti. Etilen oksid je tudi zelo eksploziven. Za sterilizacijo so uporabna tudi različna sevanja, katerih energije so dovolj visoke, da poškodujejo celice (nad 4 ev ). Primerni so gama žarki, X žarki in UV sevanje. Težave UV sevanja so v slabi prodornosti ter pri zasenčenih območjih, gama in X žarki pa so nevarni in potrebujemo drage aparature. 3. Plazma 3.1 Osnove fizike plazme Plazma je plin ioniziranih delcev. V naravi jo opazimo v izjemno vročih okoljih. Ko se običajen plin segreva, dobijo sčasoma delci dovolj kinetične energije, da se 5

pri trkih ionizirajo. Takšna plazma je v termičnem ravnovesju, kar pomeni, da imajo različne vrste delcev v njej približno enako kinetično energijo. Nasprotno pa obstajajo v termično neravnovesnih plazmah velike razlike med kinetičnimi energijami predvsem elektronov in ionov. Takšnih je večina laboratorijskih plazem in v naravi plazma, ki nastane v ionosferi ali v medzvezdnih oblakih. Večina snovi v vesolju je v stanju termično ravnovesne plazme, saj so zvezde velike krogle plazme. Delež molekul, ki so v različnih vzbujenih stanjih v takšni ravnovesni plazmi lahko izračunamo iz Maxwell Boltzmannove porazdelitve Na = Ce 3.1 N Kjer je W energija vzbujenega stanja. V plinih so značilne energije vzbujenih a stanj naslednje: 3 ~ 10 ev rotacijska stanja molekul 1 ~ 10 ev vibracijska stanja molekul ~ ev - disociacijska energija molekul ~ 10 ev - ionizacija ~ 100 ev - večkratna ionizacija Pri sobni temperaturi okoli 300 K, je povprečna energija molekule enaka 0,026 ev. Lahko vidimo, da je temperatura potrebna za plazmo z opazno stopnjo ionizacije med 10 5 K do 10 6 K. Umetno ustvarimo plazmo tako, da nabitim delcem dovajamo energijo prek EM polja, ponavadi pri nizkem tlaku. Pri določenih pogojih gostota nabitih delcev ni več odvisna od temperature, ampak je mnogo višja od tiste pri termodinamičnem ravnovesju. To se dogaja predvsem zaradi dveh vzrokov: 1) Pri visokofrekvenčnem vzbujevalnem polju (~10 MHz), težji ioni niso sposobni slediti spremembam polja, medtem, ko se lažji elektroni lahko pospešujejo. 2) Delež kinetične energije, ki jo pospešeni elektron pri prožnem trku lahko preda ionu je enak Wk me = 2 (1 cosϕ) 3.2 W M k Ker je m e << M je to lahko le majhen del energije (približno tisočinka). Taka plazma je termično neravnovesna, saj hitrostna porazdelitev delcev ni več Maxwellova in tako temperatura plazme ni več definirana. V plazmi so poleg ioniziranih delcev prisotni tudi neionizirani atomi ali molekule prvotnega plina, ki pa so lahko v osnovnem, ali v različnih vzbujenih stanjih. Atomi v vzbujenih stanjih oddajajo energijo z izsevanjem UV in vidnih fotonov. Če so osnovni delci plina molekule, lahko elektron pri trku dovede tudi Wa kt 6

energijo ki razcepi molekulo na nenabita prosta radikala. Proces imenujemo disociacija. Najpogostejši parametri za opis plazme so elektronska temperatura in gostota in ionska temperatura, ter gostota. Pomemben parameter je tudi stopnja ionizacije, ki nam pove kakšen delež delcev v plinu je ioniziran. Število delcev, ki bodo ionizirani je odvisno od tega, koliko delcev se bo v časovni enoti ioniziralo in kakšno bo na drugi strani število rekombinacij, torej koliko ionov bo zajelo elektron. Ionizacijo določa razmerje elektronske temperature in ionizacijske energije. Šibkeje je ionizacija odvisna tudi od gostote delcev. Rekombinacija pa je v glavnem odvisna od razmerja med površino in volumnom posode v kateri se nahaja plazma, saj je verjetnost za rekombinacijo znatna le blizu površin. Torej več kot bo površin, več ionov in elektronov bomo izgubljali iz plazme. 3.2 Nizko ionizirana plazma Kot je razvidno že iz imena, je to plazma, v kateri je le majhen delež delcev ioniziran. Ionizirani delci tako niso prevladujoča vrsta delcev, ampak so to delci plina in v primernih pogojih prosti radikali. Prosti radikali se sicer ne odzivajo na elektromagnetna polja, ker niso nabiti, vendar so kemično mnogo bolj reaktivni kot prvotni plin. To pomeni, da je energijski prag za začetek nekaterih reakcij precej znižan, te reakcije torej lahko potekajo pri precej nižjih temperaturah ali hitreje kot običajno. 3.3 Ustvarjanje plazme Kot je že bilo omenjeno se plazmo najlažje ustvari tako, da zapremo plin v vakuumski sistem, katerega sestavni del je reaktorska komora, ki se nahaja v električnem polju. Najbolj priljubljena je uporaba radio-frekvenčne razelektritve(27.12 MHz in 13.56 MHz) [3]. V nizkotlačnih RF plazmah pozitivni ioni ustvarijo oblak pozitivnega naboja, ki s svojim potencialom preprečuje difuzijo elektronov proti stenam posode in tako povečuje stabilnost plazme. Za namene sterilizacije pa se na IJS uporablja predvsem kisikova plazma. Slika 4: 30 litrski RF plazemski reaktor na IJS 7

4. Sterilizacijski mehanizmi v nizkoenergijski plazmi Glavna prednost plazemske sterilizacije leži v nizkih temperaturah (<50 C) in dejstvu da je v primerjavi z etilen oksidom mnogo varnejša (manj strupena). Z raziskovanjem plazemske sterilizacije so se pričeli ukvarjati šele v prejšnjem desetletju [1]. Najprej so opravljali poskuse s vodikovim peroksidom, ki je tudi sam dober sterilizant, potem pa so ugotovili, da so doseženi rezultati boljši, če uporabijo kisik, vodik, vodo, argon in druge drugače popolnoma nestrupene pline. Vzroki za to ležijo v medsebojnih interakcijah treh glavnih mehanizmov, ki v plazmi delujejo sterilizacijsko Radiacijske poškodbe Posledica UV sevanja, ki uničuje kompleksne molekule Kemijske poškodbe Vzbujeni radikali in molekule v plazmi so kemijsko izredno aktivni Toplotne poškodbe Bakterija dobiva energijo od različnih visokoenergijskih delcev, ki se zaletavajo vanjo in še pomembneje iz eksotermnih reakcij oksidacije. Predlagan je tudi mehanizem elektrostatskega raztrganja bakterijske ovojnice. Nabiranje naboja na ovojnici povzroči odbojne sile ki ovojnico končno raztrgajo. Poglejmo si podrobneje tri glavne mehanizme. 4.1 Radiacijske poškodbe V določenih vrstah plazme je prisotnih veliko UV fotonov. Število teh fotonov je odvisno od plina iz katerega dobimo plazmo, to pomeni od dovoljenih prehodov med vzbujenimi stanji atomov oz. molekul tega plina. UV fotoni imajo zadostno energijo(~10 ev), da ionizirajo atome in razcepijo organske molekule znotraj bakterije. Fotoni pri teh energijah najpogosteje reagirajo s snovjo preko fotoefekta. UV fotoni lahko bakterijo onesposobijo tako, da direktno uničijo njen genetski material ali pa z razcepljanjem kompleksnih molekul v bakteriji. Radikali, ki nastanejo po raztrganju molekul v živi snovi, onemogočajo normalno delovanje živih celic. 4.2 Kemijske poškodbe Poglejmo si, kako bakterijska ovojnica, v kateri so v zunanjem ovoju ogljikovi obroči vezani s kisikovo vezjo, reagira z anionskim radikalom O2-8

O + O 2 - O O + O - Nastala struktura reagira z molekulo vode O O + H 2 O 2 O H + O Tako nastaneta dve manjši molekuli in dodaten kisikov atom, ki lahko spet reagira z negativnim ionom in reakcija se ponovi.na ta način se bakterijska stena razgrajuje. 4.3 Termično razgrajevanje bakterije Termično uničenje bakterije je posledica energije, ki se sprosti pri oksidaciji. Bakterija pravzaprav zgori. Reakciji oksidacije sta Corg + O = CO in 2Horg + O =H2O (Z indeksom org smo označili organsko vezan ogljik in vodik). Pri vsaki takšni reakciji se sprosti približno 10 ev energije na kisikov atom. Neposredna predaja kinetične energije bakterijam s trki je manj pomembna, saj je temperatura ionov v takšni plazmi le malo nad sobno temperaturo. Uporabimo visoko disociirano kisikovo plazmo (plazma z visokim deležem kisikovih radikalov, lahko tudi več deset odstotkov), ki jo ustvarimo v RF(radijske frekvence vzbujevalnega polja) ali MW razelektritvi (mikrovalovi).v taki plazmi je segrevanje najpomembnejši proces, saj kisikovi atomi nimajo sevalnih prehodov v UV področju. Preprost račun nam pove kako hitro se spreminja temperatura izolirane bakterije v takšni plazmi. Gostota toka kisikovih atomov (j) na površino bakterije je reda 10 24 m -2 s -1 Verjetnost za oksidacijo (p) pri sobni temperaturi je med 0.1 in 0.01 in kot smo že prej omenili, je sproščena temperatura na reakcijo 10 ev(vsi podatki [1]). Torej velja za gostoto energijskega toka 4 W P = jpw = 10 4.3.1 m Spremembo notranje energije bakterije lahko zapišemo kot 2 9

dw dt dt = mcp PS 4.3.2 dt n = Iz česar sledi za spremembo temperature na časovno enoto dt dt PS 4 K = = 10 4.3.3 mc s 12 2 Pri čemer smo vzeli za površino bakterije S = 10 m maso m = 10 15 kg in specifično toplotno kapaciteto c p = 1000J / kgk. Če upoštevamo, da je za uničenje bakterije dovolj, da se segreje za približno 100 lahko izračunamo da je potrebna energija približno 6 10 8 ev. p Slika 5: Levo živi primerki baccilus aureus in desno po 20 sekundah izpostavitve kisikovi plazmi z gostoto številskega toka 10 24 m -2 s -1 Slika 6: Transmisijski elektronski mikrograf bakterij E. Coli. Levo pred Izpostavitvijo zračni plazmi in desno po 30 s. izpostavitve plazmi.[4] 10

5. Krivulje preživetja Fizikalno kemijski procesi, ki potekajo med plazemsko sterilizacijo se lahko analizirajo s pomočjo t.i. krivulj preživetja (survival curve)[2]. To so grafi, na katerih na ordinato nanašamo logaritem števila preživelih bakterij na absciso pa čas izpostavljenosti plazmi. Reprezentativne krivulje dobijo s pomočjo bakterijskih spor, ki so med najbolj odpornimi oblikami mikroorganizmov. Če te spore izpostavimo običajnim toplotnim ali kemičnim sterilizatorjem dobimo na grafu ravno črto, kar pomeni da je tovrstna sterilizacija eksponenten proces. Pri plazemski sterilizaciji pa na grafu dobimo dva do tri ravne odseke. Iz tega sklepamo, da je na delu več procesov, ki so sicer eksponentni, vendar z različnimi časovnimi konstantami. Časovna konstanta D, nam poda čas, v katerem se število mikroorganizmov zmanjša za desetkrat. Slika 7: Krivulje preživetja spor B.subtilis v plazmi. Dodatek O 2 argonu vodi k popolni deaktivaciji spor v 40 min.[4] Na sliki 7 sta prikazani krivulji preživetja spor B.Subtilis za dva različna osnovna plina. Vidimo, da izpostavitev plazmi iz čistega argona ne privede do sterilizacije v razumnem času, medtem ko dodatek 5% kisika povzroči še eno koleno na grafu in sterilizacijo po 40 minutah. To pripišemo delovanju radikalov kisika, ki reagirajo z ovojnico. Začetni del obeh krivulj predstavlja deaktivacijo bakterij s strani UV sevanja. Ta proces se ustavi, ko preostanejo samo še bakterije, z debelejšo ovojnico oziroma skupki bakterij, ki onemogočajo prodor UV žarkom. 11

Slika 8: Interpretacija krivulje preživetja spor B.subtilis v plazmi.[4] Sledi faza v kateri delujejo že opisani kemijsko procesi, ki uničijo bakterijsko ovojnico in ko je ta zadostno stanjšana spet nastopijo UV fotoni, ki dokončno sterilizirajo vzorce. 7. Zaključek Razumevanje zapletene medigre različnih fizikalno kemijskih procesov, ki prispevajo k sterilizaciji v plazmi še ni popolno, vendar pa na tem področju potekajo intenzivne raziskave. Plazemska sterilizacija že predstavlja pomembno orodje v medicini, kjer jo uporabljajo za sterilizacijo toplotno občutljivih instrumentov, v prihodnosti pa je možna tudi sterilizacija prezračevalnih sistemov na ta način. V prehrambeni industriji bi uporaba plazemske sterilizacije lahko privedla do podaljšanja roka trajanja različnih izdelkov in povečanja varnosti proizvodov. Slika 9: Umetna žila. Zaradi toplotne občutljivosti in nevarnosti uporabe kemikalij pri tovrstnih proizvodih je plazemska sterilizacija dragoceno orodje. 12

8. Viri [1] M. Mozetič, T. Mozetič in P. Panjan,Plazemska sterilizacija, Vakuumist 21/3 (2001) [2] Michel Moisan, Jean Barbeau, Plasma sterilization. Methods and mechanisms, Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 3, pp. 349 358, 2002. [3] Uroš Cvelbar, Obdelava površine kompozita polimer-grafit s kisikovo plazmo, Doktorska disertacija,univerza v Ljubljani, 2005 [4] J. Reece Roth, Mechanisms of Sterilization, Decontamination, and Surface Energy Enhancement by Exposure to the One Atmosphere Uniform Glow Discharge Plasma (OAUGDP),Paper No. D -1, Proceedings of the 12th Asian Conference on Electrical Discharges, dostopno na http://aced2004.tsinghua.edu.cn/ [5] M. Laroussi, D. A. Mendis and M. Rosenberg, Plasma interaction with microbes, New Journal of Physics 5 (2003) [6] A. Drenik, Selective Etching of Nano-composites With Weakly Ionized Oxygen Plasma, Seminar [7] A. Drenik, Raziskave gostote nevtralnih kisikovih atomov v stranski cevi plazemskega reaktorja, Diplomsko delo, Univerza v Ljubljani, 2005 [8] Z. Vratnica, D. Vujoševič, Preiskave bakterij s sodobnim vrstičnim elektronskim mikroskopom, Vakuumist 25/1-2 (2005) [9] http://www3.niaid.nih.gov/biodefense/public/images.htm 13