УНИВЕРЗИТЕТУ У БЕОГРАДУ ВЕЋУ НАУЧНИХ ОБЛАСТИ МЕДИЦИНСКИХ НАУКА

УНИЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ МЕДИЦИНСКИ ФАКУЛТЕТ БРОЈ: 61206-648/2-14 ДАТУМ:24.04.2015. Б Е ОГ Р А Д УНИВЕРЗИТЕТУ У БЕОГРАДУ ВЕЋУ НАУЧНИХ ОБЛАСТИ МЕДИЦИНСКИХ НАУКА Поштовани чланови Већа, Поступајући по закључку и налогу Већа научних области Универзитета у Београду са седнице одржане 24. фебруара 2015. године достављамо Вам на поновно разматрање предмет за следећег кандидата: Мр др Лејла Париповић, назив теме Значај клиничких, биомолекуларних и патолошких параметара за прогнозу Ewing саркома кости код деце. Предмет је враћен са захтевом да се у извештају прошири радна хипотеза и конкретизују циљеви научног истраживања. Узимајући у обзир овај закључак достављамо Вам проширену радну хипотезу и конкретизоване циљеве научног истраживања у прилогу. Срдачно, ДЕКАН МЕДИЦИНСКОГ ФАКУЛТЕТА Проф. др Небојша Лалић

ZNAČAJ KLINIČKIH, BIOMOLEKULARNIH I PATOLOŠKIH PARAMETARA ZA PROGNOZU EWING SARKOMA KOSTI KOD DECE UVOD Tumori iz grupe Ewing sarkoma su visoko maligni tumori porekla malih, plavih, okruglih tumorskih ćelija koji mogu nastati u kosti ili u mekim tkivima. Najčešće se javljaju kod dece i adolescenata i predstavljaju drugi najčešći primarni maligni koštani tumor u toj uzrasnoj grupi (1). Incidenca Ewing sarkoma je oko 3 slučaja godišnje na milion stanovnika (2). Srednja uzrasna dob pacijenata obolelih od Ewing sarkoma je 15 godina a više od 50% pacijenata su adolescenti. Zapažena je predominacija muškog pola (2). Savremeni literaturni podaci ukazuju na postojanje 10 podtipova Ewing sarkoma (3). Ove tumore karakteriše rearanžman hromozoma 22, kod više od 95% slučajeva u formi translokacije t (11, 22) (4,). Za intraosealni Ewing sarkom najčešća primarna mesta lokalizacije su donji ekstremiteti (41%), karlica (26%), grudni koš (16%), gornji ekstremiteti (9%), kičma (6%), šake i stopala (3%) i l obanja (2%) (2, 5). U trenutku postavljanja dijagnoze bolesti oko 25% pacijenata već ima metastatsku formu bolesti i to najčešće plućne i/ili koštane metastaze (2). Savremeno lečenje Ewing sarkoma zahteva multidisciplinarni terapijski pristup koji podrazumeva primenu hemioterapije, hirurško lečenje i/ili primenu zračne terapije. Kod pacijenata sa procenjenim visokim rizikom bolesti indikovana je primena visokodozne hemioterapije i transplantacija matićnih ćelija hematopoeze Poslednjih decenija značajno je poboljšano preživljavanje dece obolele od Ewing sarkoma. ( 6,7,8). I pored evidentnog progresa u primeni multimodalnog terapijskog pristupa, ukupno preživljavanje, prema objavljenim podacima, iznosi oko 70% za lokalizovani oblik bolesti i 20-30% za pacijente sa metastatskom formom bolesti. Prisustvo koštanih metastaza ima nepovoljniju prognozu od prisustva plućnih/pleuralnih metastaza. (8,9,10). Različiti klinički, patološki i biomolekularni parametri su ispitivani kao mogući prognostički ili prediktivni pokazatelji koji bi uticali na kreiranje optimalnog terapijskog pristupa (11). Klinički (preterapijski) parametri su uzrast, pol, lokalizacija tumora, veličina ili volumen tumora, vrednost serumske Laktat- dehidrogenaze (LDH), metastatska bolest. Na osnovu literaturnih podataka parametri povezani sa povoljnijom prognozom su uzrast ispod 15 godina, ženski pol i lokalizacija tumora u predelu distalnih delova ekstremiteta. Volumen tumora veći od 200 ml i povišen nivo Laktat-dehidrogenaze su povezani sa nepovoljnom prognozom kao i prisustvo metastatske forme bolesti u trenutku dijagnostikovanja, koji je opisan kao pojedinačni najjači prediktivni faktor ishoda bolesti ( 12,13). Utvrđeni su brojni biomolekularni markeri (biomarkeri) koji predstavljaju moguće prognostičke parameter. TP53 gen kodira za jedarni P53 fosfoprotein. P53 je esencijalan za prevenciju neadekvatne ćelijske proliferacije i održavanje integriteta genoma po izloženosti različitim stresogenim faktorima poput DNK oštećenja, onkogene aktivacije, hipoksije itd. Mutacije u TP53 genu vode malignoj transformaciji i intenzivno su proučavane kod različitih tipova malignih neoplazmi za razliku od TP53 polimorfizama (14,15).

Jedan od najviše izučavanih SNP ( eng. single nucleotide polimorphism) u TP53 genu je polimorfizam u kodonu 72. Kodon 72 se nalazi u egzonu 4 TP53 gena i ima sekvencu CGC koja kodira za arginin (Arg72) ili CCC koja kodira za prolin (Pro72). Ove dve varijante P53 proteina se strukturno i funkcionalno razlikuju. Razlike se odnose na sposobnost vezivanja komponenti transkripcione mašinerije, aktivaciji transkripcije, indukciji apoptoze i supresiji tumorskog rasta. Varijanta P53 proteina sa Arg72 je efikasnija u indukciji apoptoze od Pro72 koji indukuje viši nivo G1 zastoja (16,17,18). MDM2 gen kodira za MDM2 protein koji je negativan regulator P53. MDM2 se vezuje za P53 i stimuliše ubikvitinaciju i degradaciju P53 u proteazomima. SNP na poziciji 309 (T>G) u promotorskom region MDM2 gena utiče na transkripcionu aktivnost MDM2, a time i na P53 inhibiciju, P53- zavisnu apoptozu i tumor-supresorski odgovor (17,18). Različite studije su pokazale vezu između Arg72Pro TP53 i T309G MDM2 polimorfizama i rizika za nastanak različitih tipova kancera. Studije o vezi ovih polimorfizama i nastanka Ewing sarkoma su malobrojne (17,18). Patološki parametri su vezani za patohistološku procenu odgovora na primenjenu preoperativnu hemioterapiju i predstavljaju parametar efikasnosti primenjene terapije a ujedno i prognostički faktor (19,20) Posle hirurške intervencije određuje se patohistološki stepen nekroze tumora tj. procenat vijabilnosti tumora. Procenat nekroze tumora veći od 90% (prisustvo vijabilnih ćelija ispod 10%) se smatra povoljnim prognostičkim parametrom. Identifikacija prognostičkih faktora može dovesti do razvoja adaptiranih terapijskih protokola na osnovu procenjene grupe rizika pacijenata sa Ewing sarkomom.. RADNA HIPOTEZA U istraživanju se pošlo od pretpostavke da su klinički, patološki i biomolekularni parametri značajni za prognozu Ewing sarkoma kod dece. Pretpostavlja se da su klinički parametri kao što su uzrast deteta ispod 15 godina, ženski pol, lokalizacija tumora u predelu distalnih delova ekstremiteta, volumen tumora manji od 200ml kao i lokalizovan oblik bolesti kriterijumi za selekciju pacijenata u grupu standardnog rizika. Takođe, pretpostavlja se da patološki parametri kao što je određivanje patohistološkog odgovora na primenjenu neoadjuvantnu (preoperativnu) hemioterapiju u smislu postojanja minimalno vijabilnog tumora ili bez vijabilnog tumora predstavlja parametar dobre efikasnosti primenjene terapije na osnovu čega se pacijenti selektuju u grupu standardnog rizika. Podaci iz literature ukazuju da prisustvo polimorfizma pojedinih biomarkera povećava rizik za nastanak malignih tumora. Pretpostavlja se da će se u našoj ispitivanoj grupi dece obolele od Ewing sarkoma kosti potvrditi postojanje Arg72Pro TP53 i T309G MDM2 polimorfizma. Očekuje se da će rezultati ovog istraživanja omogućiti izdvajanje parametara značajnih za identifikaciju prognostičkih grupa dece obolele od Ewing sarkoma kosti.

CILJEVI ISTRAŽIVANJA 1. Određivanje prognostičkog značaja kliničkih parametara (uzrast, pol, primarna lokalizacija tumora, volumen tumora, stepen proširenosti bolesti) 2. Određivanje prognostičkog značaja patoloških parametara-određivanje procenta vijabilnih ćelija u tumorskom tkivu nakon sprovedene neoadjuvantne hemioterapije 3. Određivanje prognostičkog značaja prisustva polimorfizma biomarkera Arg72Pro TP53 i T309G MDM2 kao faktora rizika za nastanak tumora 4. Analiza ishoda lečenja ispitivanih pacijenata sa dijagnostikovanim Ewing sarkomom u odnosu na ukupno preživljavanje, preživljavanja bez znakova bolesti i vreme do pojave relapsa bolesti MATERIJAL I METODE Tip studije Istraživanje će biti dizajnirano po tipu kohortne studije. Selekcija ispitanika U studiju će biti uključeni svi pacijenti uzrasta od 0 do 18 godina sa histopatološki potvrđenom dijagnozom Ewing sarkoma koji su lečeni na Institutu za onkologiju i radiologiju Srbije u periodu od januara 2000 godine do decembra 2014 godine, a koji ispunjavaju kriterijume za uključivanje u istraživanje. Očekuje se da ukupni broj pacijenata koji će biti uključeni u studiju bude najmanje 70. Kriterijumi za uključivanje u istraživanje su: pacijenti uzrasta od 0 do 18 godina sa histopatološki postavljenom dijagnozom Ewing sarkoma, pacijenti koji prethodno nisu lečeni od maligne bolesti. Kod svih pacijenata je primarno sprovedena hirurška intervencija po tipu biopsije radi histopatološke verifikacije tumora. Po dobijanju definitivnog histopatološkog nalaza od strane patologa Instituta za patologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu, shodno protokolu, pacijenti su započinjali lečenje primenom neoadjuvantne hemioterapije. Lokalni tretman je podrazumevao primenu hirurške ekstirpacije tumora, primenu zračne terapije ili primenu kombinovanog hirurškog i zračnog tretmana a sve to u zavisnosti od procenjenog terapijskog odgovora na primenjenu neoadjuvantnu tj. preoperativnu hemioterapiju. Nakon toga, nastavljeno je sa primenom adjuvantne hemioterapije. Shodno protokolu EURO EWING 99 i EWING 2008 kod nekih pacijenata sa proširenom formom bolesti sprovođena je autologna transplantacija matičnim ćelijama hematopoeze na Institutu za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Vukan Čupić.

Uzorci U radu će biti analizirani uzorci krvi oko 70 dece sa dijagnozom Ewing sarkoma. U cilju procene kliničkih, patoloških i biomolekularnih parametara u odnosu na rezultat lečenja ispitanika sa Ewing sarkomom analiziraće se: - petogodišnje i desetogodišnje ukupno preživljavanje - petogodišnje i desetogodišnje preživljavanje bez znakova bolesti - vreme proteklo od završetka lečenja do pojave recidiva bolesti, lokalizacija recidiva bolesti, broj recidiva bolesti u odnosu na definisane kliničke, patološke i biomolekularne parametre. Klinički parametri koji će biti ispitivani su: uzrast ispitanika, pol, primarna lokalizacija tumora, veličina/volumen tumora, stepen proširenosti bolesti (prisustvo metastaza), vrednost serumske Laktat dehidrogenaze (LDH). Biomolekularni parametri koji će biti ispitivani su: polimorfizmi Arg72Pro TP53 i T309G MDM2. Postterapijski patološki parametri koji će biti ispitivani su: patohistološki odgovor na primenjenu neoadjuvantnu preoperativnu hemioterapiju. Instrumenti merenja Sakupiće se sledeći podaci o pacijentima: uzrast pacijenta u vreme postavljanja dijagnoze, pol, primarna lokalizacija tumora, veličina/volumen tumora, stepen proširenosti bolesti na osnovu učinjenih dijagnostičkih procedura (MR/CT evaluacija primarnog mesta tumora, CT thoraxa, scintigrafija skeleta, MR/RTG evaluacija eventualnih pozitivnih scintigrafskih mesta, aspirat kosne srži), vrednost serumske LDH. Izolacija DNK DNK će biti izolovana iz limfocita periferne krvi metodom isoljavanja. Detekcija polimorfizama Arg72Pro TP53 i T309G MDM2 polimorfizmi će se ispitivati analizom polimorfizma dužine restrikcionih fragmenata (eng. restriction fragment lenght polymorphism RFLP). Metoda se sastoji u umnožavanju egzona 4 TP53 gena i promotorskog regiona MDM2, u kojima se nalaze pomenuti polimorfizmi, lančanom reakcijom polimeraze (eng. polymerase chain reaction PCR). Elektroforezom u 2% agaroznom gelu proveravaju se prinos i specifičnost amplifikovanih produkata nakon PCR-a. Potom se PCR produkti TP53 gena (296 bp) i MDM2 gena (157 bp) tretiraju restrikcionim nukleazama Bsh1236I i MspA1I.

Digerirani fragmenti se detektuju putem Agilent DNA 1000 Assay na 2100 Bioanalyzer aparatu (Agilent Technologies). Bsh1236I restrikciona nukleaza seče Arg alel na dva fragmenta tako da se Arg/Arg, Arg/Pro i Pro/Pro polimorfne varijante TP53 gena vizualizuju kao dve trake (126 i 170 bp), tri trake (126, 170 i 296 bp) ili jedna traka (296 b p). Tri polimorfne varijante MDM2 gena se vizualizuju kao jedna traka od 157 bp za TT, tri trake (48, 109 i 157 bp) za TG i dve trake od 48 i 109 bp za GG. Određivanje stepena nekroze se vrši na osnovu Huvosove skale, analizom minimum 15 reprezentativnih isečaka iz tumorskog tkiva, uzetih transverzalnim presecima udaljenosti od 5cm kroz resekovanu leziju, Svaki fiksirani i ukalupljeni uzorak se seče serijski na po 3 preseka debljine 4µm sa razmacima od minimum 8µm. na svakom uzorku se odredjuje procenat nekroze, a potom izračunava njegova aritmetička vrednost, koja se piše u zvaničnom patohistološkom izveštaju. Histopatološki odgovor na primenjenu preoperativnu hemioterapiju će se proceniti na osnovu stepena nekroze tumora tj vijabilnosti ćelija. Procenat nekroze tumora veći od 90% tj. prisustvo manje od 10% vijabilnih ćelija će se smatrati kao dobar terapijski odgovor. Kao loš terapijski odgovor će se smatrati prisustvo više od 10% vijabilnih ćelija tj. nekroza tumora manja od 90%. Statistička analiza Predviđena statistička metodologija obuhvataće: - opis parametara od značaja (frekvencije, procenti, prosek, medijana, standardna devijacija (SD) i opseg) - ispitivanje saglasnosti uzoračkih raspodela sa normalnom raspodelom (testovi: Kolmogorov- Smirnov i Shapiro-Wilk) - ispitivanje povezanosti faktora od značaja primenom statističkih testova (Pearson 2 ﭏ test, Fisher exact test, Wilcokson rank sum test, t-test i drugi parametarski i/ili neparametarski testovi primenljivi u zavisnosti od prirode i kvaliteta podataka) - za analizu ukupnog preživljavanja i vremena do relapsa/progresije bolesti u odnosu na parametre od značaja, koristiće se Survival Analysis metodologija (Kaplan -Meier product-limit metoda, Log-rank test) - za identifikaciju faktora od značaja za ukupno preživljavanje i vremena do relapsa/progresije koristiće se regresiona analiza - Cox-ov proporcionalni hazardni model. - Za nivo statističke značajnosti biće usvojena vrednost α=0.05

PROCENA KANDIDATA O POTENCIJALNOM NAUČNOM DOPRINOSU Naše istraživanje bi uključivalo do sada najveću i prvi put na ovaj način obrađenu kohortnu seriju dece obolele od Ewing sarkoma lečenih u Srbiji. Pored do sada primenjivanih kriterijuma za planiranje terapije, očekivani rezultati naše studije o prognostičkom značaju kliničkih, biomolekularnih i patoloških parametara kod dece obolele od Ewing sarkoma će omogućiti bolju stratifikaciju pacijenata u prognostičke grupe (standardni rizik, visoki rizik) i u zavisnosti od toga će se planirati optimalna terapija. Deca iz grupe pacijenata sa standardnim rizikom će primiti manje agresivnu terapiju čime će se dobri rezultati preživljavanja održati ali će se poboljšati kvalitet života. Kod pacijenata sa procenjenim visokim rizikom bolesti će se primeniti agresivniji terapijski protokol. REFERENCE 1. Bernstein M, Kovar H, Paulussen M, Randall RL, Schuck A, Teot LA, et al. Ewing's Sarcoma Family of Tumors: Current Management. Oncologist, 2006, 11(5):503-519. 2. Esiashvili N, Goodman M, Marcus RB Jr. Changes in incidence and survival of Ewing sarcoma patients over the past 3 decades: Surveillance Epidemiology and End Results data. J Pediatr Hematol Oncol, 2008,30(6):425-30 3. Ioannina University Courses in Pathology (IUCP). Bosh AL. Pathology of Ewing/s Sarc oma of Bone: Problems on Differentiation Diagnosis of Classical Es versus PNET (Peripheral neuroectodermal Tumor). Supported with grants from PROTHETS CONTRACT 503036 FROM eu and FIS 04/0822 and FIS06/5176,Madrid, Spain. In: Bone and Soft Tissue Pathology-Oncology Part 1 and 2. Ioannina University Courses in Pathology (IUCP) Series 2. 25th Silver Course, May 27-30, 2008, Ioannina, Greece. ISBN 978-960-98299-0-8 4. Dockhorn-Dworniczak B, Schafer KL, Dantcheva R, Blasius S, Winkelmann W, Strehl S et al. Diagnostic value of the molecular genetic detection of the t(11;22) translocation in Ewing's tumours. Virchows Arch, 1994,425(2):107-112. 5. Froeb D, Ranft A, Boelling T, Paulussen M, Klco-Brosius S, Jürgens H. et al. Ewing sarcoma of the hand or foot. [Ewing Sarkom der Hände oder Füße]. A Retrospective Analysis of 80 Patients Treated According to the Clinical Trial EICESS-92 and Euro-E.W.I.N.G.99. Klin Padiatr, 2012, 224(6): 348-52 6. Raney RB, Asmar L, Newton WA Jr, Bagwell C, Breneman JC, Crist W et al. Ewing's sarcoma of soft tissues in childhood. A report from the Intergroup Rhabdomyosarcoma Study, 1972 to 1991. J Clin Oncol, 1997,5(2): 574-82. 7. Juergens C, Weston C, Lewis I, Whelan J, Paulussen M, Oberlin O, et al. Safety assessment of intensive induction with vincristine, ifosfamide, doxorubicin, and etoposide (VIDE) in the treatment of Ewing tumors in the EUROE.W.I.N.G. 99 clinical trial. Pediatr Blood Cancer, 2006,47(1):22-29.

8. Ferrari S, Alvegard T, Luksch R, Tienghi A, Hall KS, Bernini G, et al. Non-metastatic Ewing's family tumors: High-dose chemotherapy with stem cell rescue in poor responder patients. Preliminary results of the Italian/Scandinavian ISG/SSG III protocol. ASCO Annual Meeting Proceedings. Journal of Clinical Oncology, 2007, 25, Suppl 18: 10014. 9. Paulussen M, Fröhlich B, Jürgens H. Ewing tumour. Incidence, prognosis and treatment options. Paediatr. Drugs 2001, 3(12):899-913 10. Cotterill SJ, Ahrens S, Paulussen M, Jürgens HT, Voûte PA, Gadner H, et al. Prognostic factors in Ewing's tumor of bone: analysis of 975 patients from the European Intergroup Cooperative Ewing's Sarcoma Study Group. J Clin Oncol, 2000,18(17): 3108-14. 11. Oberlin O, Deley MC, Bui BN, Gentet J C, T Philip, Terrier P, et al.: Prognostic factors in localized Ewing's tumours and peripheral neuroectodermal tumours: the third study of the French Society of Paediatric Oncology (EW88 study). Br J Cancer 2001, 85(11): 1646-54. 12. Bacci G, Ferrari S, Longhi A, Rimondini S, Versari M, Zanone A, et al. Prognostic significance of serum LDH in Ewing's sarcoma of bone. Oncology Reports 1999, 6 (4):807-811, 1999. 13. Pinto A, Dickman P, Parham D. Pathobiologic Markers of the Ewing Sarcoma Family of Tumors: State of the Art and Prediction of Behaviour. Hindawi Publishing Corporation, Sarcoma 2011, Article ID 856190. 14. Thurow HS, Hartwig FP, Alho CS, Silva DS, Roesler R, Abujamra AL, et al. Ewing Sarcoma: influence of TP53 Arg72Pro and MDM2 T309G SNPs. Mol Biol Rep, 2013,40(8): 4929-34 15. Mackintosh C, Madoz-Gurpide J, Ordonez JL, Osuna D, Herrero-Martin D. The molecular pathogenesis of Ewing's sarcoma. Cancer Biol Ther 2010, 9:655-67. 16. Whibley C, Pharoah PD, Hollstein M p53 polymorphisms: cancer implications. Nat Rev Cancer 2009,9(2):95-107. 17. Francisco G, Menezes PR, Eluf-Neto J, Chammas R. Arg72Pro TP53 polymorphism and cancer susceptibility: A comprehensive meta-analysis of 302 case-control studies. Int J Cancer, 2011,29(4):920-930. 18. Toffoli G, Biason P, Russo A, De Mattia E, Cecchin E, Hattinger CM, et al. Effect of TP53 Arg72Pro and MDM2 SNP309 polymorphisms on the risk of high-grade osteosarcoma development and survival. Clin Cancer Res 2009,15(10):3550-56 19. Lin PP, Jaffe N, Herzog CE, Costelloe CM, Deavers DM, Kelly JS, et al. Chemotherapy response is an important predictor of local recurrence in Ewing sarcoma. Cancer 2007, 109(3): 603-11 20. Ferrari S, Bertoni F, Palmerini E, Errani C, Bacchini P, Pignotti E, et al. Predictive factors of histologic response to primary chemotherapy in patients with Ewing sarcoma. J Pediatr Hematol Oncol 2007, 29(6):364-8