Monolisa Anti-HBs PLUS 2 plaati

Transcription

1 Monolisa Anti-HBs PLUS 2 plaati ENSÜÜMNE IMMUNOANALÜÜS (EIA) HEPATIIT B PINNA ANTIGEENI VASTASTE ANTIKEHADE (ANTI-HBs) KVALITATIIVSEKS JA KVANTITATIIVSEKS MÄÄRAMISEKS INIMESE VERESEERUMIS JA PLASMAS /01

2 SISUKORD 1. KASUTUSALA 2. TESTI ISELOOMUSTUS 3. TESTI PÕHIMÕTE 4. TESTKOMPLEKTI ELEMENDID 5. ETTEVAATUSABINÕUD 6. TERVISEKAITSE- JA OHUTUSNÕUDED 7. VAJALIKUD MATERJALID, MIS EI SISALDU KOMPLEKTIS 8. REAGENTIDE ETTEVALMISTUS 9. KEHTIVUSAEG JA SÄILITAMINE 10. PROOVID 11. ANALÜÜSI KÄIK 12. KVALITATIIVSE JA KVANTITATIIVSE MEETODI TULEMUSTE USALDUSVÄÄRSUS 13. TULEMUSTE ARVUTAMINE JA TÕLGENDAMINE 14. PROOVIDE JA REAGENDI PIPETEERIMISE SPEKTROFOTOMEETRILINE TÕESTAMINE 15. TESTI VÕIMALUSED 16. ANALÜÜSI NÄITAJAD 17. KASUTATUD KIRJANDUS 2 [EE]

3 1. KASUTUSALA Monolisa Anti-HBs PLUS on ensüümne immunoanalüüs hepatiit B pinna antigeeni vastaste antikehade (anti- HBs) kvalitatiivseks ja kvantitatiivseks määramiseks inimese vereseerumis või -plasmas. 2. TESTI ISELOOMUSTUS Antikehade olemsolu hepatiit B pinna antigeenil on tähtis faktor hepatiit B viirusega (HBV) nakatumise diagnoosimisel ja prognoosimisel. Ägeda hepatiit B nakkusega patsientidel leitakse anti-hbs peaaegu 80% juhtudest 1 3 kuu jooksul pärast hepatiit B pinna antigeeni (HBsAg) ilmumist. Anti-HBs kasutatakse epidemioloogises järelevalves, et määrata viimane hepatiit B ilming potentsiaalsetel hepatiit B vaktsiini saajatel vaktsineerimiste jälgimiseks ja kõrge antikehade kontsentratsiooniga plasma valimiseks spetsiifiliste immunoglobuliinide valmistamisel. Monolisa Anti-HBs PLUS on otsene antikehade sändvitš ensüümne immunoanalüüs, milleks kasutatakse polüstüreenist mikrotiiterplaate, mis on kaetud HbsAg (alatüübid ad ja ay) tahke faasina ja konjugaadiga, mis sisaldab mädarõika peroksüdaasiga märgistatud HBsAg (inimesele kuuluvad alatüübid ad ja ay). Anti-HBs tasemete määramine on standardiseeritud, kasutades WHO Anti-HBs Reference Preparationit, väljendatuna millirahvusvahelistes ühikutes milliliitri kohta (miu/ml). 10 miu/ml või kõrgemat taset loetakse üldiselt standardiks, et demonstreerida vaktsineerimisjärgset kaitset HBV suhtes. Vähemalt minimaalse anti-hbs tiitri 10 miu/ml ehk immuunsusläve tõestamine on tähtis vaktsineeritud isikute õige kohtlemise huvides, kes võivad seejärel jääda kaitseta HBs Ag-positiivsete vedelike ja proovide suhtes. 3. TESTI PÕHIMÕTE Analüüsi käigus inkubeeritakse patsientide proove ja kontrolle koos antigeeniga kaetud mikrotiiterplaatidega. Kui proovid või kontroll sisaldavad HBs vastaseid antikehi, ühinevad nad antigeeniga. Liigne proov eemaldatakse pesemisega. Siis lisatakse testkannudesse konjugaati. Konjugaat ühineb igasuguste mikroplaadi testkannudes sisalduvate antigeen-antikeha kompleksidega. Liigne konjugaat eemaldatakse pesemisega ja kromogeen/substraadi lahust lisatakse mikroplaadi testkannudesse ning inkubeeritakse. Kui proov sisaldab anti-hbs, põhjustab sellega seotud ensüüm (HRP) tetrametüülbensidiini (TMB) värvumise siniseks kromogeeni lahuses. Sinine värvus muutub kollaseks pärast stopplahuse lisamist. Kui proov ei sisalda anti-hbs, siis jääb kromogeen/substraadi lahus testkannus värvituks substraadi inkubatsiooni ajal ja pärast stopplahuse lisamist. Spektrofotomeetriliselt mõõdetud värvuse intensiivsus on võrdeline proovis sisalduva anti-hbs kogusega. Patsientide proovide optilisi tihedusi võrreldakse (10 miu/ml) kalibraatori väärtustega. 3 [EE]

4 4. TESTKOMPLEKTI ELEMENDID Kõik reagendid on eranditult in vitro diagnostikas kasutamiseks. Tähis Reagendi Pakend R1 Microplate Mikroplaat 12 x 8 hepatiit B pinna antigeeni alatüüpide ad ja ay (inimese päritolu) seguga sensibiliseeritud testkannu 2 mickoplaati R2 Concentrated washing solution (20X) Kontsentreeritud pesulahus (20X) Tris NaCl puhver ph =7,4 Säilitusaine: ProClin 300 (0,04%) 1 viaal 235 ml C0 Negative control Anti-HBs negatiivne kontroll Vasika loote vereseerumi ja proteiini stabilisaatoritega puhver Konservant: ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) C1 10 mlu/ml calibrator 10 miu/ml kalibraator* Puhver inimese anti-hbs antikehade, vasika loote vereseerumi, proteiini stabilisaatorite ja proovi inikaatorvärviga Konservant: ProClin 300 (0,5%) (3 ml) C2 100 mlu/ml calibrator 100 miu/ml kalibraator - positiivne kontroll Puhver inimese anti-hbs antikehade, vasika loote vereseerumi, proteiini stabilisaatorite ja proovi inikaatorvärviga Konservant: ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) C3 400 mlu/ml calibrator 400 miu/ml kalibraator Puhver inimese anti-hbs antikehade, vasika loote vereseerumi, proteiini stabilisaatorite ja proovi inikaatorvärviga Konservant: ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) C mlu/ml calibrator 1000 miu/ml kalibraator Puhver inimese anti-hbs antikehade, vasika loote vereseerumi, proteiini stabilisaatorite ja proovi inikaatorvärviga Konservant: ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) R6 Specimen diluent Proovide lahjendaja Puhver vasika loote vereseerumi, proteiini stabilisaatorite ja proovi indikaatorvärviga Konservant: ProClin 300 (0,1%) (27 ml) R7a Conjugate (11X) Kontsentreeritud konjugaat (11X) Puhver HbsAg (inimese ad ja ay alatüübid) peroksüdaasi ja proteiini stabilisaatoritega Konservant: ProClin 300 (0,5%) (2,5 ml) R7b Conjugate dilent Konjugaadi lahjendaja Puhver vasika loote seerumi ja proteiini stabilisaatoritega Konservant: ProClin 300 (0,1%) (25 ml) R8 Substrate buffer Substraatpuhver Sidrunhappe ja naatriumatsetaadi lahus, ph=4,0 Sisaldab H 2 O 2 (0,015 %) ja DMSO (4%) (60 ml) R9 Chromogen: TMB solution (11X) Kromogeen Tetrametüülbensidiini (TMB) sisaldav lahus (5 ml) R10 Stopping solution Stopplahus 1 N väävelhappe lahus (28 ml) * Kontrollid kalibreeritakse vastavalt sisestandardile, mis kalibreeritakse vastavalt 1.IRP WHO 1977 juhendile. 4 [EE]

5 Hoidke testkomplekti temperatuuril +2-8 C. Tooge kõik reagendid, välja arvatud konjugaadi kontsentraat, enne kasutamist toatemperatuurile (18-30 C). Pange reagendid temperatuurile +2-8 C otsekohe pärast kasutamist. Hoidke kõiki kasutamata ribasid/plaate taassuletavas kotis. Ärge võtke ära kuivatusainet. Hoidke plaate temperatuuril +2-8 C. 5. ETTEVAATUSABINÕUD Tulemuste kvaliteet sõltub järgmistest hea laboritava eeskirjadest: Testi nimi nagu ka testi spetsiaalne ID number kirjutatakse iga mikrotiiterplaadi raamile. See spetsiaalne ID number kirjutatakse ka igale ribale. Monolisa Anti-HBs PLUS spetsiaalne ID number = 63. Veenduge spetsiaalse ID numbri olemasolus enne iga kasutamist. Kui ID number puudub või on erinev ülalmärgitud numbrist, ei tohi seda riba kasutada. Ärge kasutage aegunud reagente. Ärge segage kokku reagente erinevatest partiidest antud testi käigus. MÄRKUS: Pesemislahus (R2, märgistus sildil: 20X, roheline), peroksüdaasi puhverdatud substraat (R8, märgistus sildil: TMB puhv, sinine), kromogeen (R9, märgistus sildil: TMB 11X, purpurpunane) ja stopplahus (R10, märgistus sildil: 1N, punane) võib kasutada ka teisest partiist pärinevaid reaktiive, kui neid kasutatakse ühe analüüsi käigus. Mainitud reaktiive võib kasutada koos mõnede teiste meie firma toodetega. Lisaks võib pesemislahust (R2, märgistus sildil: 20X, roheline) segada kahe teise pesemislahusega, mis sisalduvad erinevates Bio-Rad testkomplektides (R2, märgistus sildil: 10X, sinine või 10X, oranž), kui nad on korrektselt lahjendatud, eeldades, et sama segu kasutatakse ühe testi piires. Detailsema informatsiooni saamiseks võtke ühendust meie tehnilise teenindusega. Enne kasutamist oodake 30 minutit, et reagendid stabiliseeruksid toatemperatuuril. Lahjendage reagente ettevaatlikult, et vältida igasugust saastumist. Ärge sooritage testi agressiivsete aurude (happe, leelise, aldehüüdi aurud) või tolmu keskkonnas, mis muudab konjugaadi ensüümimisaktiivsust. Kasutage põhjalikult pestud ja deioniseeritud veega loputatud klaasnõusid või eelistatult ühekordseid materjale. Ärge laske mikrotiiterplaadil kuivada pesuoperatsiooni lõpu ja reagendi doseerimise vahel. Ensüümreaktsioon on väga tundlik igasuguste metallide ja metalliioonide suhtes. Järelikult ei tohi ükski metalliioon kokku puutuda erinevate lahustega, mis sisaldavad konjugaati või substraati. Ilmutuslahus (substraatpuhver + kromogeen) peab olema roosa värvusega. Roosa värvi muutumine mõne minuti jooksul pärast lahjendamist viitab, et reagenti ei või kasutada ja see tuleb asendada. Ilmutuslahus tuleb valmistada puhtas ühekordseks kasutamiseks mõeldud plastanumas või klaasnõus, mis on eelnevalt pestud 1N HCl lahusega ja põhjalikult loputatud destilleeritud veega ning kuivatatud. Seda reagenti peab hoidma pimedas. Kasutage iga seerumiproovi puhul uut pipetiotsa. Hea pesu on üks kriitiline samm selles protsessis: pidage kinni soovitatud pesutsüklite arvust ja garanteerige, et kõik pesad on tervenisti täidetud ja siis täielikult tühjendatud. Lohakas pesu võib kaasa tuua ebaõiged tulemused. Ärge kunagi kasutage sama anumat konjugaadi ja ilmutuslahuse doseerimiseks. 5 [EE]

6 6. TERVISEKAITSE- JA OHUTUSNÕUDED Monolisa Anti-HBs PLUS sisaldab inimvere komponente, mis on testitud ja leitud olevat mittereaktiivsed hepatiit B pinna antigeeni (HBsAg), hepatiit C viiruse (HCV) antikehade ja inimese immuunsuspuudulikkuse viiruste (HIV-1 ja HIV-2) antikehade suhtes. Kuna mitte ükski teadaolev testimeetod ei saa anda täielikku kindlust, et nakkuskandjad puuduvad, käsitlege reagente ja patsientide proove just nagu need kannaksid nakkushaigust. Inimese allikmaterjali sisaldavaid proovide ja reagentidega otseses kontaktid olevaid materjale, nagu ka pesulahuseid, tuleb käsitleda kui nakkusohtlikku materjali. Vältige proovide või proove sisaldavate lahuste maha loksumist. Kandke reagentide ja proovidega töötamisel ühekordseid kindaid ning pärast töö lõppu peske põhjalikult käsi. Ärge pipeteerige suuga. Inimese päritolu proovid ja reagendid, nagu ka saastunud materjal ja ained, tuleb ära visata pärast kahjutustamist - kas 5% naatriumhüpokloriti lahuses (1 mahuosa 10 mahuosa saastunud vedeliku või vee kohta) 30 minuti jooksul, - või autoklaavides 121 C juures minimaalselt 2 tundi. Autoklaavimine 121 C juures minimaalselt 1 tund on parim meetod desaktiveerida HIV ja HBV viirused. HOIATUS: ÄRGE PANGE NAATRIUMHÜPOKLORITIT SISALDAVAID LAHUSEID AUTOKLAAVI. Pritsmeid tuleb töödelda 10%-lise naatriumhüpokloritiga. Kui saastav vedelik on hape, tuleb pritsmed eelnevalt neutraliseerida naatriumvesinikkarbonaadiga ja kuivatada absorbentpaberiga. Puhastamiseks kasutatav materjal tuleb panna saastunud jääkide konteinerisse Ärge unustage neutraliseerida ja/või autoklaavida lahuseid, pesujäätmeid ning igasuguseid vedelikke, mis sisaldavad bioloogilisi proove enne nende kallamist valamust alla. Ohutusnõuete loetelu väljastatakse nõudmisel. Palun vaadake selle testikomplekti mõnede keemiliste komponentidega seotud ohutussoovitusi ja ettevaatusabinõusid etikettidel viidatud piktogrammi(de)lt ning kasutusjuhendi lõpus toodud teavet. Ohutuskaart on saadaval veebilehel 7. VAJALIKUD MATERJALID, MIS EI SISALDU KOMPLEKTIS Destilleritud või deioniseeritud vesi. Naatriumhüpoklorit (pleegitaja) ja naatriumvesinikkarbonaat. Automaatsed või poolautomaatsed reguleeritavad või kindla mahuga pipetid, millega saab mõõta µl, 1 ml, 5 ml ja 10 ml. Mõõtsilindrid 25 ml, 100 ml ja 1000 ml. Saastunud jääkide konteiner.. Vesivann või kuivaõhu termostaat temperatuuriga 37 C ± 1 C. Automaatne, poolautomaatne või käsitsi mikroplaatide pesemise süsteem. Mikroplaadi lugeja (varustatud 490, 450 ja 620 nm filtritega). Absorbentpaber. Ühekordsed kindad. Puhtad polüpropüleennõud TMB valmistamiseks. 6 [EE]

7 8. REAGENTIDE VALMISTAMINE Enne Monolisa Anti-HBs PLUS analüüsikomplekti reagentide kasutamist laske neil stabiliseeruda toatemperatuuril 30 minutit. 1) Valmis reagendid Mikroplaat (R1) Igal raamalusel on 12 riba; alus on hermeetilises alumiiniumpakendis. Lõigake pakend kääride või skalpellinga 0,5 kuni 1 cm kaugusel õmblusest lahti. Avage pakend ja võtke raam välja. Pange kasutamata ribad tagasi pakendisse. Sulgege pakend hoolikalt ja pange see tagasi säilitusruumi, mille temperatuur on +2-8 C. Proovide lahjendaja (R6) Anti-HBs negatiivne kontroll (C0) 10 miu/ml kalibraator (C1) 100 miu/ml kalibraator positiivne kontroll (C2) 400 miu/ml kalibraator (C3) 1000 miu/ml kalibraator (C4) Homogeniseerige reagente enne kasutamist Vortex segajaga või loksutage kergelt. 2) Lahjendatavad reagendid Kontsentreeritud pesulahus (20X): R2 Lahjendage 1:20 destilleeritud vees, et saada kasutamiseks valmis pesulahus. 12 ribaga plaadi jaoks kulub 800 ml lahust. Konjugaadi töölahus (R7a + R7b) Võtke konjugaadi lahjendaja (R7b) toatemperatuurile. Loksutage konjugaadi lahjendajat (R7b, värvitu kuni kahvatukollakas) ja konjugaadi kontsentraati (R7a, roheline) et nad seguneksid enne tarvitamist. Valmistage 1:11 lahjendus iga testitava riba jaoks [näide: lisage 100 µl konjugaadi kontsentraati (R7a) 1 ml konjugaadi lahjendajale (R7b) puhtas polüpropüleenist katseklaasis]. Kasutage järgmist tabelit. Segage hästi, kuid rahulikult, et vältida vahutamist. Konjugaadi töölahust tuleb kaitsta valguse eest, nii ruumitemperatuuril kui ka +2-8 C juures säilitades. Konjugaadi töölahus peab olema roheline. See püsib stabiilne 8 tundi toatemperatuuril ja 2 nädalat +2-8 C juures. Konjugaadi lahust saab valmistada, kui kogu konjugaadi kontsentraadi (R7a) pudeli sisu pipeteerida konjugaadi lahjendajasse (R7b). Alati enne kasutamist segage töölahust kerge loksutamise teel. Pange kasutamata konjugaadi kontsentraat (R7a) otsekohe pärast tarvitamist tagasi külmikusse. Et vältida kokkupuudet konjugaadiga, kandke kindaid ja ärge puutuge pipetiotsi. Konjugaadi töölahuse valmistamine ribade arvu järgi Kasutatavate ribade arv Kontsentreeritud konjugaadi R7a kogus (µl) Konjugaadi lahjendaja R7b kogus (ml) * 24** * 1 terve plaat ** 2 tervet plaati 7 [EE]

8 Lahjendatud substraadi töölahus (R8 + R9) Võtke kromogeen (R9) ja substraatpuhver (R8) toatemperatuurile. Loksutage kromogeeni ja substraatpuhvrit enne kasutamist. Lahjendage kromogeen (R9) 1:11 substraatpuhvriga (R8) iga testiriba jaoks (näide: lisage 1 ml R9 reagenti 10 ml R8 reagendile). 10 ml on vajalik ja piisav kogus 1-12 ribale. Homogeniseerige. Segage lahjendatud substraadi töölahust kergelt enne kasutamist. Oodake veel 5 minutit enne kasutamist. Lahjendatud substraadi töölahus tuleb ära kasutada 8 tunni jooksul pärast valmistamist ja hoida pimedas toatemperatuuril. Kromogeen (R9) peaks olema roosa. Teine värvus viitab reagendi saastumisele: sel juhul ei tohi kromogeeni kasutada. Valmistage ainult selline kogus reagenti, mis kastatakse ära 6 tunni jooksul, tagades samas, et lahjendatud reagenti jätkuks kogu analüüsiks. Kasutage järgmist tabelit: Lahjendatud substraadi töölahuse valmistamine ribade arvu järgi Kasutatavate ribade arv Kromogeeni R9 kogus (µl) Substraatpuhvri R8 kogus (ml) * 24** * 1 terve plaat ** 2 tervet plaati 9. KEHTIVUSAEG JA SÄILITAMINE Hoidke komplekti enne kasutamist temperatuuril +2-8 C. Säilitage komplekti temperatuuril +2-8 C. Säilitades antud temperatuuril, saab kõiki komplektis sisalduvaid reagente kasutada kuni pakendile märgitud aegumistähtajani (väljaarvatud erandjuhtudel). R1: Korralikult suletud kotis ja +2-8 C juures säilitadavad ribad on kasutuskõlblikud veel 1 kuu jooksul pärast pakendi avamist. R2: Lahjendatud pesulahust saab +2-30ºC juures säilitada 2 nädalat. Kontsentreeritud pesulahust (R2) saab säilitada +2-30ºC juures. R7a + R7b: Konjugaadi töölahust tuleb kaitsta valguse eest, nii ruumitemperatuuril kui ka +2-8 C juures säilitades. Peale valmistamist saab konjugaadi töölahust kasutada toatemperatuuril (18-30 C) 8 tunni jooksul ja säilitades +2-8 C juures, 2 nädala jooksul. R8 + R9: Peale lahuse valmistamist saab substraadi töölahust, mida hoitakse pimedas, kasutada ruumitemperatuuril (18-30 C) 6 tunni jooksul. Pärast avamist on kõik teised reagendid stabiilsed kuni kehtivusaja lõpuni (märgitud karbil), kui neid hoida temperatuuril +2-8 C. 10. PROOVID Võtke vereproov vastavalt tavalisele praktikale. Test tuleb läbi viia vereseerumis või plasmas. Testitakse ainult järgmisi proove: seerum võetakse standardsesse või eraldusgeeli sisaldavasse katseklaasi, plasma võetakse EDTA või hepariini sisaldavasse katseklaasi. Kui plasma võetakse tsitraati või ACD sisaldavasse katseklaasi, on tulemused 20% madalamad seerumi analüüsil saadud tulemustest. Proovid, mis sisaldavad tükke, tuleb tsentrifuugimisega selgitada enne testimist. Hõljuv fibriin või osakesed võivad anda ekslikke positiivseid tulemusi. 8 [EE]

9 Proove tuleb hoida temperatuuril +2-8 C, kui analüüs tehakse 7 päeva jooksul, või sügavkülmutatuna temperatuuril -20 C. Vältige korduvat külmutamist/sulatamist. Proove, mida on külmutatud ja sulatatud rohkem kui 3 korda, ei tohi kasutada. Kui proove tuleb transportida, pakkige nad vastavalt eeskirjadele, mis puudutavad etioloogiliste ainete transporti ja vedage neid eelistatult külmutatuna. MÄRKUS: Proovides sisalduv albumiin kuni 90 g/l ja bilirubiin kuni 100 mg/l, lipiidsetes proovides sisalduvad triglütseriidid kuni 36 g/l, ja hemolüüsunud proovides sisalduv hemoglobiin kuni 2,55 g/l ei mõjuta tulemusi. Ärge kasutage proove pärast töötlemist 56 C juures 30 minuti vältel. 11. ANALÜÜSI KÄIK Järgige täpselt juhendit. Kasutage negatiivset ja positiivset kontrollseerumit iga testi puhul, et kindlustada testi kvaliteet. Järgige head laboritava. Meetodid 1. Hoolikalt määratlege proovi võtmise ja töötlemise plaan. 2. Võtke kõik reagendid toatemperatuurile enne kui alustate analüüsi. 3. Valmistage konjugaadi töölahus (R7a + R7b), lahjendatud substraadi töölahus (R8+R9) ja lahjendatud pesulahus (lahjendatud R2). 4. Võtke kaitsekotist mikroplaadi raam ja ribad (R1). Eemaldage analüüsiks mittevajalikud ribad ja asendage need märgistatud nullribadega kui vaja. 5. Lahjendage proovid, kalibraatorid ja kontrollid 3:4 proovide lahjendajaga R6, järgides üht kahest allpool pakutud töö käigust: a. Proove, kalibraatoreid ja kontrolle võib lahjendada testkannu sees (lisage kõigepealt igasse testkannu 25 µl proovi lahjendajat R6, seejärel vähemalt 15 minuti jooksul 75 µl proovi või kontrolli, siis segage kergelt, vältides vahutamist). b. Proove, kalibraatoreid ja kontrolle võib eelnevalt lahjendada 3:4 proovi lahjendajaga R6 (näiteks lahjendage 150 µl proovi 50 µl proovi lahjendaja R6- ga, segage kergelt, vältides vahutamist, ja siis mõõtke 100 µl testkannu). MÄRKUS: Pärast proovi lisamist värvub lahjendaja purpurpunasest siniseks. On võimalik tõestada proovide olemasolu testkannudes spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 620 nm (Viide 14. punktile: PROOVI JA REAGENDI PIPETEERIMISE SPEKTROFOTOMEETRILINE TÕESTAMINE). 6. Lisage otse, ilma plaati eelnevalt pesemata, ja selles järjekorras, millise meetodi valite: Kvalitatiivne määramine - Anti-HBs negatiivne kontroll (C0) testkannu A1, - 10 miu/ml kalibraator (C1) testkannudesse B1, C1 ja D1, miu/ml kalibraator-positiivne kontroll (C2) testkannu E1, - Proovid testkannudesse F1, G1, jne. Kvantitatiivne määramine - Anti-HBs negatiivne kontroll (C0) testkannu A1, - 10 miu/ml kalibraator (C1) testkannudesse B1 ja C1, miu/ml kalibraator-positiivne kontroll (C2) testkannu D1, miu/ml kalibraator (C3) testkannu E1, miu/ml kalibraator (C4) testkannu F1, - Proovid testkannudesse G1, H1, jne. Sõltuvalt kasutatavast süsteemist, saab muuta kontrollide asukohta või väljajagamise järjekorda. 7. Kui võimalik, katke mikrotiiterplaat kogu pinna ulatuses tihedalt kleepkilega, et tagada hermeetilisus. 9 [EE]

10 8. Inkubeerige plaati 60 ± 5 minutit temperatuuril 37 ± 2 C. 9. Eemaldage kleepkile. Imege testkannude sisu vedelikujääkide konteinerisse ja lisage viivitamatult igasse testkannu minimaalselt 375 µl pesulahust. Leotage iga testkannu sekundit iga pesutsükli vahel. Imege testkannud jälle tühjaks. Korrake pesemist 4 korda (minimaalselt 5 pesu). Vedeliku järelejääv maht peab olema vähem kui 10 µl (kui vaja, kuivatage plaati, pöörates selle pealmise poolega absorbentpaberile). 10. Kui kasutatakse automaatpesijat, järgige sama töö käiku. 11. Lisage kiiresti igasse testkannu 100 µl konjugaadi töölahust (R7a + R7b). Kui võimalik, katke testkannud uue kleepkilega ja inkubeerige 60 ± 5 minutit temperatuuril 37 C ± 1 C. MÄRKUS : Konjugaat on roheline. On võimalik tõestada konjugaadi olemasolu testkannudes spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 620 nm (Viide 14. punktile: PROOVI JA REAGENDI PIPETEERIMISE SPEKTROFOTOMEETRILINE TÕESTAMINE). 12. Eemaldage kleepkile. Imege testkannude sisu vedelikujääkide konteinerisse ja lisage viivitamatult igasse testkannu minimaalselt 375 µl pesulahust. Leotage iga testkannu sekundit iga pesutsükli vahel. Imege testkannud jälle tühjaks. Korrake pesemist 4 korda (minimaalselt 5 pesu). Vedeliku järelejääv maht peab olema vähem kui 10 µl (kui vaja, kuivatage plaati, pöörates selle pealmise poolega absorbentpaberile). 13. Kui kasutatakse automaatpesijat, järgige sama töö käiku. 14. Lisage kiiresti igasse testkannu 100 µl lahjendatud substraadi töölahust (R8+R9). Võimaldage reaktsioonil toimuda pimedas toatemperatuuril (18-30 C) 30 ± 5 minutit. Selle inkubatsiooni ajal ärge kasutage kleepkilet. MÄRKUS: Lahjendatud substraadi töölahus on roosa. On võimalik tõestada konjugaadi olemasolu testkannudes spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 490 nm (Viide 14. punktile PROOVI JA REAGENDI PIPETEERIMISE: SPEKTROFOTOMEETRILINE TÕESTAMINE). 15. Lisage 100 µl stopplahust (R10), kasutades sama järjekorda ja kiirust doseerimisel, nagu lahjendatud substraadi töölahuse puhul. Homogeniseerige reaktsioonisegu. 16. Pühkige hoolikalt plaadi põhi ära. Vähemalt 4 minutit pärast stopplahuse lisamist ja 30 minuti jooksul pärast reaktsiooni peatumist mõõtke optiline tihedus 450/ nm ja 405/ nm juures, kasutades plaadi lugejat. Enne tulemuste fikseerimist kontrollige vastavust lugemite ja mikroplaadiga ning proovi võtmise ja töötlemise plaaniga. 12. KVALITATIIVSE JA KVANTITATIIVSE MEETODI TULEMUSTE USALDUSVÄÄRSUS 10 miu/ml kalibraatori (C1) keskmine optiline tihedus on analüüsiseeria lõige. Anti-HBs negatiivne kontroll (C0) Mõõdetud optilise tiheduse väärtus peab olema suurem kui 0,000 ja väiksem või võrdne 0,070 (0,000 < OD C0 0,070). Positiivne kontroll (C2) Mõõdetud optilise tiheduse väärtus peab olema suurem või võrdne 0,400 (OD C2 0,400). Kui negatiivsel kontrollil (C0) ja positiivsel kontrollil (C2), mõni ülalnimetatud kriteeriumidest ei ole täidetud kvalitatiivsel ja kvantitatiivsel meetodil, siis on analüüs ebaõnnestunud ja määramist tuleb korrata. 10 [EE]

11 10 miu/ml kalibraator (C1) Mõõdetud optilise tiheduse väärtus peab olema suurem või võrdne 0,050 ja väiksem või võrdne 0,200 (0,050 OD C1 0,200). Iga mõõdetud optilise tiheduse väärtus peab olema suurem või võrdne 1,5 x OD C0 väärtusest, kus CO on negatiivne kontroll: OD C1 (1,5 x OD C0 ). Kvalitatiivsel meetodil Kui üks 10 miu/ml kalibraatori lõike väärtus on väljaspool lubatud piirkonda (mõõdetud optilise tiheduse väärtus peab olema suurem või võrdne 0,050 ja väiksem või võrdne 0,200), siis keskmine optiline tihedus tuleb arvutada kahest ülejäänud optilise tiheduse väärtusest. Analüüsi tulemused on aktsepteeritavad. Kui mõned OD C1 mõõdetud väärtused on väljaspool lubatud piire, on analüüs ebaõnnestunud ja määramist tuleb korrata. Kvantitatiivsel meetodil Kui üks kahest OD C1 mõõdetud väärtusest on väljaspool lubatud piire (optiline tihedus peab olema suurem või võrdne 0,050 ja väiksem või võrdne 0,200), on analüüs ebaõnnestunud ja määramist tuleb korrata. 13. TULEMUSTE ARVUTAMINE JA TÕLGENDAMINE Iga proovi jaoks mõõdetud optiliste tiheduste väärtuste võrdlus arvutatud lõike väärtusega võimaldab määrata anti-hbs antikehade olemasolu või puudumist. 1. Kvalitatiivne meetod 10 miu/ml kalibraatori (C1) keskmise mõõdetud optilise tiheduse arvutamine. Näide: 10 miu/ml kalibraator (C1) B1 0,078 C1 0,079 D1 0,089 Kokku = 0,246 Keskmine OD C1 = 0,246 / 3 = 0,082 Kui üks optilise tiheduse väärtus on väljaspool lubatud piire (optilise tiheduse väärtus peab olema suurem või võrdne 0,050 ja väiksem või võrdne 0,200), siis keskmine optiline tihedus tuleb arvutada kahe ülejäänud optilise tiheduse väärtuse põhjal. Piirväärtuse arvutamine (CO) Antud analüüsi piirväärtus on 10 miu/ml kalibraatori (C1) keskmine optiline tihedus: CO = Keskmine OD C1 Tulemuste tõlgendamine Proove, mille optilise tiheduse väärtus on suurem või võrdne piirväärtusega, loetakse reaktiivseteks. Proove, mille optiline tihedus on väiksem kui piirväärtus, loetakse mittereaktiivseks. Neid proove, mille optiline tihedus on suurem kui mõõtja ülemised lineaarsuspiirid, peaks lugema reaktiivseteks. MÄRKUS: Igas analüüsiseerias kasutatavate antikehade ja antigeenide mitmekesisuse tõttu võivad tulemused olla erinevad olenevalt katseseeriast. Vakstineerimisstrateegia: antakse erinevaid soovitusi olenevalt piirkonnast ja riikidest. Analüüsimeetodi muutmise korral vaktsineerimise järel tuleb anti-hbs antikehade kontsentratsioon määrata üleminekuperioodil mõlema meetodiga. 11 [EE]

12 2. Kvantitatiivne meteod Anti-HBs antikehade kontsentratsiooni määramiseks seerumi- ja plasmaproovides tuleb kasutada järgmisi anti-hbs kalibraatoreid: C0 (0 miu/ml), C1 (10 miu/ml), C2 (100 miu/ml), C3 (400 miu/ml) and C4 (1000 miu/ml). Kalibraatorid lisatakse otse igasse testkannu ilma eelnevalt plaati pesemata ja jätkatakse nagu kirjeldatud töö käigus (Viide punktile 11: ANALÜÜSI KÄIK). Mõõtke optiline tihedus lainepikkustel 450/ nm, kasutades plaadi lugejat (A450). Suurema arvu provide puhul, mille optiline tihedus (A450) on suurem või võrdne C3 optilise tiheduse väärtusega (A450 OD C3 ), mõõtke optiline tihedus lainepikkustel 405/ nm. Nelja kalibraatori C0, C1, C2 ja C3 optilised tihedused A450 kujutatakse graafiliselt sõltuvana nende kontsentratsioonist, kasutades polünoomset (kvadraatset) regressiooni. Palun pange tähele, et 1000 miu/ml kalibraatori (C4) A450 ei saa kasutada selles graafikus, kuna optiline tihedus peaks olema väljaspool spektrofotomeetri mõõtmispiirkonda, siit ka vajadus teise graafiku järele. Proove, mille optilise tiheduse väärtused on väiksemad kui OD C3, saab interpreteerida graafikuga, mis on koostatud nelja kalibraatori A450 optiliste tiheduste põhjal. Kalibraatorite C3 (400 miu/ml) ja C4 (1000 miu/ml) optiliste tiheduste A405 ja nende kontsentratsioonide alusel koostatakse graafik. Läbi kahe punkti tõmmatakse sirge. Nüüd saab sellelt graafikult lugeda igale optilise tiheduse väärtusele vastava anti-hbs kontsentratsiooni (miu/ml). A405 sirget kasutatakse nende seerumi ja plasma kontsentratsioonide määramiseks, mis jäävad vahemikku 400 miu/ml kuni 1000 miu/ml. Proove, mille anti-hbs kontsentratsioonid on suuremad kui 1000 miu/ml, saab lahjendada, kasutades lahjendatud pesulahust (lahjendatud R2) ja seejärel need analüüsitakse uuesti. 14. PROOVI JA REAGENDI PIPETEERIMISE SPEKTROFOTOMEETRILINE TÕESTAMINE (POLE KOHUSTUSLIK) PROOVI LAHJENDAJA (R6) JA PROOVI PIPETEERIMISE TÕESTAMINE Pärast proovi lisamist värvub purpurpunane proovi lahjendaja R6 siniseks. Proovi ja proovi lahjendaja (R6) olemasolu testkannus saab tõestada spektrofotomeetriliselt, mõõtes selle optilise tiheduse lainepikkusel 620 nm: iga proovi või proovi lahjendajaga lahjendatud kontrolli testkannu OD peab olema suurem või võrdne 0,150 (väiksem väärtus viitab proovi või kontrolli halvale valmistamisele). KONJUGAADI TÖÖLAHUSE (R7a + R7b) PIPETEERIMISE TÕESTAMINE Konjugaadi töölahus (R7a +R7b) on rohelist värvi. Konjugaadi töölahuse olemasolu testkannus saab tõestada spektrofotomeetriliselt, mõõtes selle optilise tiheduse lainepikkusel 620 nm: iga testkannu OD peab olema suurem või võrdne kui 0,070 (väiksem väärtus viitab konjugaadi töölahuse halvale valmistamisele). LAHJENDATUD SUBSTRAADI TÖÖLAHUSE (R8+R9) TÕESTAMINE Lahjendatud substraadi töölahus (R8 + R9) on roosat värvi. On võimalik tõestada roosa ilmutuslahuse olemasolu testkannus automaatse mõõtmisega lainepikkusel 490 nm: ilmutuslahusega testkannu optiline tihedus peab olema suurem kui 0,100 (madalam OD viitab ilmutuslahuse halvale valmistamisele). Tühjades testkannudes toimub tähelepanuväärne värvimuutus värvitust roosaks pärast lahjendatud substraadi töölahuse lisamist. 12 [EE]

13 15. TESTI PIIRANGUD Kui määratakse seerumi- või plasmaproovides HBs antikehi, peab analüüsidele järgnema tulemuste tõlgendamine. Selle komplekti kasutajal on soovitav lugeda pakis sisalduvat juhendit enne testi läbiviimist. Eriti hoolikalt tuleb testi käigus teostada proovi ja reagendi pipeteerimist, plaadi pesemist ning kinni pidada inkubeerimise aegadest. Juhendist kõrvalekaldumine proovi või reagendi lisamisel võib kaasa tuua valenegatiivsed tulemused. Soovitatakse testi korrata, kui tekib kahtlus, et töö käigus tehti viga. Asjaolud, mis mõjutavad tulemuste usaldusväärsust, on eksimus proovi lisamisel pessa, ebapiisav mikroplaadi pesemine, inkubeerimise aegadest ja temperatuuridest mittekinnipidamine, valede reagentide lisamine pesadesse, metallide juuresolek või naatriumhüpokloriti sattumine pesadesse. Immunoloogilise reaktsiooni muutlikkuse tõttu erinevatel patsientidel, nagu ka pärast HBV nakkust ja edasist vaktsineerimist või ravivat immunoglobuliini süsti soovitatakse ettevaatlikult tõlgendada liiga madala optilise tiheduse tulemusi. 16. ANALÜÜSI NÄITAJAD Allpool toodud analüütilised näitajad saadi Monolisa Anti-HBs PLUS analüüsi hindamisel. Laboris saadud tulemused võivad olla neist erinevad. 1. Analüüsiseeria sisene reproduktiivsus: 5 positiivset ja 1 negatiivset ühe seeria proovi testiti 10 korda (iga kord 3 paralleelproovi). Proov Keskmine suhe SD CV% Anti-HBs negatiivne 0,023 0,003 13,6 Anti-HBs positiivne ~ 0,143 0,005 3,4 20 miu/ml Anti-HBs positiivne ~ 0,358 0,012 3,3 50 miu/ml Anti-HBs positiivne 0,715 0,019 2,6 ~100 miu/ml Anti-HBs positiivne 1,231 0,037 3,0 ~150 miu/ml Anti-HBs positiivne ~300 miu/ml 1,982 0,048 2,4 2. Analüüsiseeriate vaheline reproduktiivsus 3 positiivset ja 1 negatiivset proovi testiti 2 korda päevas (iga kord 2 paralleelproovi) 20 päeva jooksul, järgides EP5 NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) toiminguid. Proov Keskmine suhe SD CV% Anti-HBs negatiivne 0,023 0,004 15,5 Anti-HBs positiivne ~20 0,146 0,008 5,5 miu/ml Anti-HBs positiivne 1,284 0,060 4,9 ~150 miu/ml Anti-HBs positiivne ~300 miu/ml 2,015 0,067 3,6 13 [EE]

14 3. Täpsus Kvantitatiivsed tulemused on antud miu/ml ja kalibreeritud vastavalt sisestandardile, mis omakorda kalibreeritakse vastavalt 1. IRP WHO Reference Standard Viidi läbi korrelatsioonuurimus, testides WHO rahvusvahelise standardi kontsentratsioone 0, 10, 100, 400 and 1000 miu/ml paralleelselt komplekti kalibraatoritega. Korrelatsioonikoefitsient ja korrelatsioonikõvera kalle on vastavalt R2 = 0,99 ja a = 0, Analüütiline tundlikkus oli alla 2 miu/ml vastavalt NCCLS toimingutele. MÄRKUS: Analüütiline tundlikkus vastab madalamale määramispiirile, mis vastab madalamale määratavale analüütilisele kontsentratsioonile, mis erineb nullist ning on arvutatud keskmistest ja standardhälvetest, mis saadi punktides 0 ja 10 miu/ml. 5. Meetodi lineaarsus 5 tugevalt anti-hbs Ab positiivsest proovist (924 miu/ml, 330 miu/ml, 326 miu/ml, 544 miu/ml ja 857 miu/ml) tehti kaks lahjendust 1:32 või 1:64. Tulemuste kattuvus on vahemikus %. 6. Mõõtevahemik Mõõtevahemik on miu/ml, mille määrab alumine määramispiir ja võrdluskõvera maksimum. Määramispiirist madalamaid tasemeid väljendatakse järgmisel viisil: < 2,00 miu/ml; mõõtevahemikust kõrgemaid tasemeid väljendatakse järgmisel viisil: > 1000 miu/ml. 7. Haagi efekt Testiti 4 lahjendamata kõrge anti-hbs antikehade kontsentratsiooniga proovi ( miu/ml, 5500 miu/ml, miu/ml ja 9000 miu/ml). Kontsentratsioon miu/ml miu/ml 9000 miu/ml 5500 miu/ml DO 450 Lugem 405 nm Lugem 405 nm Lugem 405 nm Lugem 405 nm DO 405 1,342 1,596 1,629 1,310 Tulemus > 1000 miu/ml > 1000 miu/ml > 1000 miu/ml > 1000 mlu/ml Mingit haagi efekti ei ilmnenud näitajate hindamisel. 8. Spetsiifilisus a) Monolisa Anti-HBs PLUS iga testiti 179 erineva patoloogiaga patsienti (hepatiit A, hepatiit C, VIH1, VIH2, HTLV, HSV, EBV, rubella, toksoplasmoos, müeloom (IgG, IgM), RF, ANA, HAMA, tsirroos ja multitransfusioon). 21 proovi osutusid Monolisa Anti-HBs PLUS iga positiivseks ja veel kaks teist CE märgitud anti-hbs analüüsi. 1 ANA positiivne proov oli positiivne anti-hbs Ab suhtes ainult komplektiga Monolisa Anti-HBs PLUS. Veel 2 proovi (1 HIV1 ja 1 HIV2) osutusid positiivseks anti-hbs Ab suhtes komplektiga Monolisa Anti-HBs PLUS ja teise võistleva analüüsiga. 14 [EE]

15 b) Monolisa Anti-HBs PLUS spetsiifilisus määrati veredoonorite proovide ja juhuslike kliiniliste patsientide provide analüüsi põhjal. Grupp 1 Doonorid ja hospitaliseeritud Grupp 2 Doonorid Grupp 3 Hospitaliseeritud KOKKU Nb proovid Nb positiivsed Spetsiifilisuse % 99,4% 100% 98,7% 99,4% Spetsiifilisus on 99,4% (98,8-99,8% 95%-lise usaldusintervalliga). 9. Tundlikkus Monolisa Anti-HBs PLUS ja ühe teise anti-hbs analüüsimeetodiga testiti 654 proovi, mis võeti erinevatelt vaktsineeritud elanikkonnakihtidelt või loomulikult nakatunud patsientidelt. Vastuolulisi proove testiti uuesti kolmanda CE märgistusega tehnikaga. Monolisa vastuoluline Patsientide taust N Test 1 CEmärgistusega Test 2 CE märgistusega* Vaktsineeritud ,8% 99,1% Kindel hepatiit B 71 95,8% 100% Krooniline hepatiit B % Ei testitud Hospitaliseeritud ,6% Ei testitud patsiendid Kokku ,5% 99,5% Nende 654 testitud patsiendi seas leiti 617 anti-hbs positiivset ja 37 negatiivset (kroonilise hepatiidiga patsiendid) test 1 põhjal. Nende 617 patiendi jaoks vastuolulisus 98.4% (97%-99,2% 95%-lise usaldusintervalliga). * Monolisa Anti-HBs PLUS tundlikkus pärast vastuoluliste proovide analüüsi testiga 2 on 99,2% (98,1-99,7% 95%-lise usaldusintervalliga). 17. KASUTATUD KIRJANDUS 1. Lai CL, Ratziu V, Yuen M-F, Poynard T: Viral hepatitis B. Lancet 362 : , Maddrey WC: Hepatitis B : an important public health issue. J Med Virol 61: , Delmonico FL, Snydman DR: Organ donor screening for infectious diseases. Transplantation 65 : , Centers for Disease Control : Recommendations for preventing transmission of infections among chronic hemodialysis patients. MMWR 50 (No. RR-5): 1-43, Tiollais P, Pourcel C, Dejean A : The hepatitis B virus. Nature 317: , Lee WM: Hepatitis B infection. New Engl J Med 337 : , Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, McGrath LC, Decker RH, Overby LR Interpretation of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 76: , McMahon BJ, Alward WLM, Hall DB, et al.: Acute hepatitis B infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis 151: , Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM: Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis 11: 73-83, [EE]

16 10. Centers for Disease Control: Hepatitis B vaccination United States, MMWR 51(No. 25): , Yu AS, Cheung RC, and Keefe EB : Hepatitis B vaccines. Clin Liver Dis 8: , Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AHWM : 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J Immunoassay 2 : , Garner RC, Walpole AL, Rose FL : Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1 : 39-42, Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, Ebert JW : Inactivation of hepatitis B virus by intermediate- to-high-level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol 18: , U.S. Environmental Protection Agency, Office of Solid Waste : EPA Guide for Infectious Waste Management, Washington D.C., (USG PO 530-SW ). 16. Sehulster LM, Hollinger FB, Dreesman GR, Melnick JL : Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl and Envi Microbiol 42 : , [EE]

17 17 [EE]

18 18 [EE]

19 19 [EE]

20 20 [EE]

21 21 [EE]