KOKKUVÕTE JA SELGITUS

Transcription

1 B ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay /1 Eesti U 44 USA patendinumbrid ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; SIHTOTSTARVE The BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae perekonna [CF] amplifitseeritud DNA analüüs) kasutamiseks koos BD ProbeTec ET süsteemiga, rakendab ahela asendusamplifikatsioontehnoloogiat (SDA Strand Displacement Amplification) Chlamydiaceae perekonna (k.a kuid mitte ainult Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci) DNA kvalitatiivseks otsetuvastamiseks. Analüüs on mõeldud kurguproovide (koos transportsöötmega või ilma) testimiseks, mis on võetud patsientidelt, kel on kopsupõletiku kliiniline pilt, sümptomid ja muud diagnostilised näitajad. Analüüsi saab kasutada Chlamydiaceae perekonnaga seotud kopsupõletiku oletuslikuks diagnoosimiseks. KOKKUVÕTE JA SELGITUS Chlamydophila pneumoniae põhjustab ligikaudu 5 15% olmepneumoonia (community-acquired pneumonia - CAP) juhtudest. 1 Inimesed on ainus teadaolev reservuaar. Nakatumine toimub inimeselt inimesele respiratoorsete sekreetide kaudu ning vajab üldiselt lähedast kontakti, 2 inkubatsiooniperiood on mõne nädala pikkune. Enamike C. pneumoniae põhjustatud kopsupõletiku juhtumid on suhteliselt kerged ja suremus on madal. Kuid taasnakatumine on sage ning esineb tavaliselt vanemate patsientide seas, kes vajavad hospitaliseerimist. C. pneumoniae külvamismeetodid on aeglased ning neid on keeruline läbi viia, seega neid regulaarselt diagnoosimiseks ei kasutata. Kuid külvamismeetodid on siiski olulised organismi elujõulisuse dokumenteerimiseks ja ravimitundlikkuse testimiseks proovide saamiseks. IgM ja IgG antikehade mikroimmuunfluorestsentstest (MIF) on kõige levinum diagnoosimisel kasutatav seroloogiline analüüs ja see võimaldab eristada esmast nakatumist taasnakatumisest. Ägedat nakkust näitab neljakordne tõus IgG tiitris akuutse haigusega ja paraneva patsiendi vereseerumi vahel, või IgM tiitris 16. Varasemat kokkupuudet näitab IgG tiiter 16. Üksiku kõrgendatud IgG tiitri kasutamist diagnoosiks ei julgustata. Seega on seroloogiline diagnoos kasulik pigem tagasivaatelise epidemoloogilise töövahendina kui patsiendi käsitsemise küsimuses. Pneumoonia diagnoosimise ja selle etioloogia määramise tähtsus suureneb seoses üha kasvava murega antibiootikumide liigtarvitamise pärast. Kiirtehnikad, milles kasutatakse nukleiinhappe amplifikatsiooni, võivad olla abiks diagnoosi määramisel, võimaldades seega õigeaegset kohaselt suunatud ravi rakendamist. PROTSEDUURI PRINTSIIBID BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae perekonna [CF] amplifitseeritud DNA analüüs) põhineb sihtmärk-dna samaaegsel amplifitseerimisel ja tuvastamisel, kasutades amplifikatsiooni praimereid ja fluorestseeruva märgistusega tuvastusmarkerit. SDA reagente kuivatatakse kahes eraldi ühekordse kasutusega mikrotiiterribas. Töödeldud proov lisatakse praimimis-mikrotiiterribale, mis sisaldab amplifikatsiooni-praimereid, fluorestseeruva märgistusega tuvastusmarkerit ja teisi amplifikatsiooniks vajalikke reagente. Praimerid on loodud kordistama Chlamydiaceae perekonna, k.a Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis ja Chlamydophila psittaci RNAse P geeni 6 aluspaari pikkust konserveerunud piirkonda. Pärast inkubatsiooni kantakse reaktsiooni segu üle amplifikatsiooni mikrotiiterribale, mis sisaldab kahte SDA-ks vajalikku ensüümi (DNA polümeraasi ja restriktsioonendonukleaasi). Amplifikatsiooni mikrotiiterribad suletakse tihedalt saastumise vältimiseks ja seejärel inkubeeritakse need termiliselt kontrollitud fluorestsentsidetektoris, mis monitoorib amplifitseeritud produktide generatsiooni iga reaktsiooni. Iga reaktsioon kaaskordistab ja tuvastab sisemise amplifikatsiooni kontrolli (IAC), mille eesmärk on kindlaks teha, et on olemas amplifikatsiooniks sobivad tingimused ning vähendada võimalust, et analüüsi inhibiitorite olemasolu tõttu teatatakse valenegatiivsest tulemusest. Chlamydiaceae perekonna DNA olemasolu või selle puudumine määratakse proovi PAT-skooride (Passes After Threshold sooritused pärast lävendit) arvutamise kaudu, võttes aluseks ettemääratud lävendväärtused. Masin teatab automaatselt kas positiivsest, negatiivsest või piiripealsest tulemusest. REAGENdid ja MATERjalid Iga BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay reagentide pakk sisaldab: Chlamydiaceae perekonna (CF) praiming-mikrotiiterriba (1x24) 6 oligonukleotiidi 7,5 pmol, dntp-d 15,2 nmol, 2 tuvastusmarkerit 22,5 pmol Sünteetilised oligonukleotiidid 75 eksemplari Chlamydiaceae perekonna (CF) praimimis-mikrotiiterriba (1x24) Restriktsioonensüüm: ühikut, DNA polümeraas 14 ühikut 1 praimimiskatet, 16 amplifikatsiooni pitseerijat (1/2), 8 prügikotti BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP*/MP**): Koostis: Respiratoorse ja söötme lahjendi: Bicine (bitsiin), kaaliumfosfaat, kaaliumhüdroksiid, DMSO ja Proclin; 1 (CF/LP/MP) positiivset kontrolli: 15 ng lõhe sperma DNA-d, 47. µg Tris, 9. µg EDTA, 6 eksemplari CF plasmiidi, 48 eksemplari LP plasmiidi, 54 eksemplari MP p lasmiidi; 1 (CF/LP/MP)

2 negatiivset kontrolli: 15 ng lõhe sperma DNA-d, 47, µg Tris, 9, µg EDTA; 1 2-mL plõksatava korgiga katsutit. * Viitab BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay le ** Viitab BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay le BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp)*: Koostis: Proovi lahjendi: Bicine (bitsiin), kaaliumfosfaat, kaaliumhüdroksiid, DMSO ja Proclin; 1 (tcf/tmp) positiivset kontrolli: 175 ng lõhe sperma DNA-d, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA, 6 eksemplari CF plasmiidi, 8 eksemplari LP plasmiidi, 9 eksemplari MP plasmiidi; 1 (tcf/tmp) negatiivset kontrolli: 175 ng lõhe sperma DNA-d, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA * Markeering t viitab reagentidele, mis on määratud kasutamiseks üksnes kurguproovi analüüsiks (ilma transportsöötmeta) kasutamiseks. Instrumendid, varustus ja tarvikud: BD ProbeTec ET Instrument and Instrument Plate, BD ProbeTec ET Lysing Heater, BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, BD ProbeTec ET Lysing Rack, BD ProbeTec ET Pipettor, statiiv ja voolutoide, BD ProbeTec ET Accessories Kit, BD ProbeTec ET 2 ml ja 4 ml Sample Tubes and Caps, BD ProbeTec ET Pipette Tips Nõutavad, kuid komplekti mittekuuluvad materjalid: II klassi bioloogilise ohutuse kapp (BSC), pöörissegur (vorteks) -2 C ja/või -7 C (või külmem) temperatuuritsüklita külmuti, mikrotsentrifuug võimsusega 16 x g, veevannid, digitaaltermomeeter, veevanniraam koos mahakruvitava kaanega, 2 ml katsuti alus ja muud sobivad katsutialused, BBL CultureSwab EZ tampoonid, ühekordselt kasutatavad kindad, mikropipetid mahutavusega 2 1 µl, aerosool-resistentsed pipeti otsakud, destilleeritud vesi, molekulaarbioloogiaklassi vesi, 1% (v/v) naatriumhüpoklorit Alconoxiga* * Lahustage 7,5 g Alconox 1 L 1% (v/v) naatriumhüpokloriti lahusega ja segage. Valmistage iga päev värske lahus. Hoiustamis- ja käitlemisnõuded: BD ProbeTec ET CF reagentide pakki võib hoiustada temperatuuril 2 C. Ärge kasutage avamata reagendipakette pärast aegumiskuupäeva. Kord avatud kotikeses on mikrotiiterribad stabiilsed 12 nädala jooksul, kui see on uuesti korralikult suletud või kuni aegumiskuupäevani, sõltuvalt sellest, kumb varem kätte jõuab. Mitte hoida sügavkülmas. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kiti (CF/LP/MP) võib hoida temperatuuril 2 C. Ärge kasutage reagente pärast aegumiskuupäeva. Mitte hoida sügavkülmas. The BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kiti (tcf/tmp) võib hoida temperatuuril 2 C. Ärge kasutage reagente pärast aegumiskuupäeva. Mitte hoida sügavkülmas. Hoiatused ja ettevaatusabinõud: Kasutamiseks in vitro diagnostikas. 1. Kliinilistes analüüsides võib esineda patogeenseid mikroorganisme, sh hepatiidiviiruseid ja HI-viirust. Kõikide vere ja teiste kehavedelikega saastunud esemete käsitsemisel tuleks järgida Standardseid ettevaatusabinõusid 4-7 ja asutusesiseseid juhtnööre. 2. BD ProbeTec ET Swab Diluent and Respiratory and Media Diluent sisaldavad dimetüülsulfoksiidi (DMSO). DMSO on kahjulik sissehingamisel, kokkupuutel nahaga või allaneelamisel. Vältige selle kemikaali sattumist silma ning kasutage käsitsemisel alati kindaid. Silma sattumisel loputage kohe rohke veega ja pöörduge arsti poole. Pärast nahale sattumist peske kokkupuute kohta kohe rohke veega.. Ehkki eraldi töötsoonid pole nõutavad, kuna BD ProbeTec ET ehitus vähendab DNA-osakeste saastumise võimalust testimiskeskkonnas, on muud saastumise vältimise ettevaatusabinõud vajalikud, eriti proovide töötlemise ajal. 4. Reagendikotikesed, mis sisaldavad kasutamata praimimis-mikrotiiterribasid ja amplifikatsiooni mikrotiiterribasid, PEAB pärast avamist hoolikalt uuesti sulgema. Enne reagendikotikeste uuesti sulgemist kontrollige, kas kuivatusained on olemas. 5. Plaat, mis sisaldab amplifikatsiooni mikrotiiterribasid, PEAB olema amplifikatsiooni sulguriga korralikult suletud, enne kui eemaldate plaadi BD ProbeTec ET praimimise- ja soojenduskuumutist BD ProbeTec ET instrumenti. Pitseerimine kindlustab amplifikatsiooniks ja tuvastuseks suletud reaktsiooni ning on vajalik instrumendi ja töötsooni amplifikatsiooniproduktidega saastumise vältimiseks. Ärge eemaldage pitseerimismaterjali mikrotiiterribadelt enneaegselt. 6. Jääkvedelikuga praimimis-mikrotiiterribad (pärast vedeliku ülekannet praimimis-mikrotiiterribadelt amplifikatsiooni mikrotiiterribadele) kujutavad endast kontaminatsiooniallikat. Pitseerige praimimismikrotiiterribad enne minemaviskamist hoolikalt plaat-sulguriga. 7. Töökeskkonna amplifikatsioonitoodetega saastumise vältimiseks kasutage testitud amplifikatsiooni mikrotiiterribade äraviskamiseks prügikotte, mis on reagentide paketiga kaasas. Veenduge, et kotid on enne äraviskamist korralikult suletud. 8. VAHETAGE KINDAID analüüsi töötlemise ja analüüsi protseduuri kindlaksmääratud etappide ajal, et vältida proovide rist-saastumist. Kui kindad puutuvad prooviga kokku, vahetage need otsekohe uute vastu, et vältida teiste proovide saastumist. 9. Töötsooni või varustuse analüüsideaga või kontrollidega saastumise puhul puhastage saastunud piirkond hoolikalt 1% (v/v) naatriumhüpoklorit Alconoxiga ja loputage seejärel rohke veega. Laske pinnal enne järgmiste testidega jätkamist täielikult kuivada. 1. Kasutage ainult BD ProbeTec ET Pipettorit (pipetti) ja BD ProbeTec ET Pipette tipse (pipeti otsakuid) töödeldud näidiste kandmiseks praimimis-mikrotiiterribadele ja nende kandmisel praimimismikrotiiterribadelt amplifikatsiooni mikrotiiterribadele. 11. Kasutatud pipeti otsakute, katsutite, praimimis-mikrotiiterribade ja muude ühekordse kasutusega elementide minemaviskamisel järgige laboris kindlaksmääratud põhimõtteid. Visake ühekordselt kasutavad elemendid hoolikalt minema. Pitseerige ja visake prügimahutid minema, kui need on ¾ ulatuses täis või iga päev (sõltuvalt sellest, kumb varem kätte jõuab). 2

3 12. Ärge omavahel vahetage ega segage erineva partiinumbriga mikrotiiterribasid, kontrolle ega töötlusreagente. 1. Võtke tehniliste teenuste osakonnaga ühendust ebahariliku olukorra tekkimisel, nt leke BD ProbeTec ET instrumenti või DNA-kontaminatsioon, mida pole võimalik puhastamisega eemaldada. PROOVI VÕTMINE JA TRANSPORTIMINE 1. Proovi võtmine Proove tuleb võtta vastavalt Clinical Microbiology Procedures Handbook 8 (Kliiniliste mikrobioloogia protseduuride käsiraamat) või teie labori protseduurijuhendile. BBL CultureSwab EZ (BD kat. # 22144) tuleks kasutada kurguproovide võtmisel, mida hoiustatakse ilma transportsöötmeta. 2. Proovi hoiustamine ja transportimine Kurguproovid (ilma transportsöötmeta): Proove võib hoiustada/transportida temperatuuril 18 C mitte kauem kui 2 päeva. Proove võib hoida külmas temperatuuril 2 8 C mitte kauem kui päeva. Proove võib hoida temperatuuril -2 C või madalamal mitte kauem kui 14 nädalat. Kurguproovid 2SP söötmes: 8 Proovid tuleks kohe panna külmkappi, milles on temperatuur 2 8 C. Transportimine märjal jääl või külmpakenditel, kui transpordiaeg ületab paari minutit. Proove tohib hoida temperatuuril 2 8 C mitte kauem kui 2 päeva. Pikemat hoiustamisaega vajavaid proove tuleks hoida temperatuuril -7 C. TESTI PROTSEDUUR Spetsiifiliste tööjuhiste saamiseks ja süsteemi komponentide hooldamiseks lugege BD ProbeTec ET süsteemi kasutusjuhendit. A. Masina ettevalmistus: 1. Enne analüüsi alustamist peab instrumendi toide olema sisse lülitatud ja instrumentidel tuleb lasta soojeneda. a. Lüüsumiskuumuti ja praimimis- ja soojenduskuumuti soojenemiseks ning stabiliseerumiseks kulub ligikaudu 9 minutit. Lüüsimiskuumuti sättepunkt on 114 C. Praimimiskomponendi ja soojenduskuumuti sättepunkt on 72,5 C. Praimimis- ja soojenduskuumuti soojenduskomponendi sättepunkt on 54 C. b. BD ProbeTec ET instrument on tarkvara juhitav ja selle soojenemiseks kulub ligikaudu minutit. 2. Termostaadi temperatuure tuleb kontrollida enne analüüsi alustamist. Salvestage temperatuurid BD ProbeTec ET süsteemi hoolduse logiraamatusse. a. Lüüsumiskuumuti Eemaldage plastikust kate ja laske temperatuuril 15 minuti jooksul tasakaalustuda. Termomeetri näit peab olema vahemikus C. b. Praimingu- ja soojendustermostaat Praimimistermostaadi termomeetri näit peab olema vahemikus 72 7 C. Soojendustermostaadi termomeetri näit peab olema vahemikus 5,5 54,5 C.. Kontrollige BD ProbeTec ET ekraanil kuvatavat temperatuuri. Temperatuuri näit peab olema vahemikus 47,5 55, C. Salvestage temperatuurid BD ProbeTec ET süsteemi hoolduse logisse. B. Pipett: Üksikasjalikku kirjeldust pipeti BD ProbeTec ET Pipettori klahvistiku funktsioonide kohta lugege BD ProbeTec ET süsteemi kasutusjuhendist. Lisaks tuleb pipetti BD ProbeTec ET Pipettor iga kasutuskorra järel puhastada. Seadme BD ProbeTec ET Pipettor puhastuse ja hoolduse kohta saate juhtnööre tehnilise teeninduse esindajalt. BD ProbeTec ET CF-analüüsi teostamiseks on vaja järgmisi programme. 1. programm kannab vedeliku töödeldud näidistest üle CF praimingu mikrotiiterribadesse. 5. programm kannab vedeliku CF praimingu mikrotiiterribadest üle CF amplifikatsiooni mikrotiiterribadesse. Programmeerige pipett järgnevalt: 1. programm: 1. Lülitage pipett SISSE. Pipett piiksub korra, vilgub ZERO ( NULL ), vilgub Software Version # (tarkvara versiooni nr) ja piiksub veel korra. 2. Vajutage sinisele klahvile Prog (Programm). Vajutage klahvile Vol (Tugevus), kuni kuvatakse 1, et valida Programm 1. Vajutage Enter (Sisesta).. Programmeerimisrežiimi sisenemiseks vajutage ja hoidke klahvi Prog (Programm). Hoides all klahvi Prog (Programm), vajutage samal ajal pipetiotsakuga või kirjaklambri otsaga klahvile Special Function Key (erifunktsiooni klahv). 4. Vajutage Fill (Täida). Vajutage noolt üles, kuni kuvatakse näit 2. Vajutage Enter (Sisesta). 5. Vajutage Disp (Doseeri). Vajutage noolt üles, kuni kuvatakse näit 15. Vajutage Enter (Sisesta). 6. Vajutage teist korda Enter (Sisesta), et programm salvestada ja väljuda. Peaksite kuulma piiksu, mis näitab, et programmeerimine on lõpetatud. 7. Kontrollige oma programmi, vajutades päästikule ja liikudes kõik etapid läbi. Iga etappi läbides määrake aspireerimise/doseerimise kiirus, kasutades klahvi Vol (Tugevus). Igal etapil ilmub kiiruse näidik.

4 Kasutage klahvi Vol (Tugevus) kiirusenäidiku reguleerimiseks, et näidata Fill (Täida) ja Disp (Doseeri) etappide 2 ruutu. 5. programm: 1. Vajutage klahvile Prog (Programm). Vajutage klahvile Vol (Tugevus), kuni kuvatakse 5, et valida Programm 5. Vajutage Enter (Sisesta). 2. Programmeerimisrežiimi sisenemiseks vajutage ja hoidke klahvi Prog (Programm). Hoides all klahvi Prog (Programm), vajutage samal ajal pipetiotsakuga või kirjaklambri otsaga klahvile Special Function Key (erifunktsiooni klahv).. Vajutage Fill (Täida). Vajutage noolt üles, kuni kuvatakse näit 1. Vajutage Enter (Sisesta). 4. Vajutage Disp (Doseeri). Vajutage noolt üles, kuni kuvatakse näit 1. Vajutage Enter (Sisesta). 5. Vajutage Mix (Sega). Vajutage noolt üles, kuni kuvatakse näit 5. Vajutage Enter (Sisesta). 6. Vajutage teist korda Enter (Sisesta), et programm salvestada ja väljuda. Peaksite kuulma piiksu, mis näitab, et programmeerimine on lõpetatud. 7. Kontrollige oma programmi, vajutades päästikule ja liikudes kõik etapid läbi. Iga etappi läbides määrake aspireerimise / doseerimise / segamise kiirus, kasutades klahvi Vol (Tugevus). Igal etapil ilmub kiiruse näidik. Kasutage klahvi Vol (Tugevus) kiirusenäidiku reguleerimiseks, et näidata aspireerimise ja doseerimise funktsioonide 2 ruutu. Kasutage klahvi Vol (Tugevus) segamise kiiruse reguleerimiseks, et see näitaks ruutu. Programmi ülevaade Programmid tuleks enne protseduuri alustamist üle vaadata. Programmi ülevaatamiseks lülitage pipett SISSE. Vajutage sinisele klahvile Prog (Programm). Vajutage klahvile Vol (Tugevus), kuni kuvatakse vastav programmi number (1 või 5). Vajutage klahvile Enter (Sisesta). Kasutage pipettimispäästikut, et etapihaaval läbi programmi liikuda. 1. programm: See programm aspireerib 2 µl ja doseerib 15 µl CF mikrotiiterribasse. Pipeti kuva peaks näitama järgmist: Fill (Täida) 2 µl SII Dispense (Doseeri)15 µl SII 5. programm: See programm aspireerib 1 µl, doseerib 1 µl ja segab 5 µl kolm korda. Pipeti kuva peaks näitama järgmist: Fill (Täida) 1 µl SII Dispense (Doseeri)1 µl SII Mix (Sega) 5 µl SIII Null (vilgub vaheaegadega) C. Plaadi paigutus: Plate Layout Report (Plaadi paigutuse aruanne) luuakse BD ProbeTec ET instrumendist pärast seda, kui analüüsi tüüp, proovi identifikatsioon, kontrollpartii numbrid ja komplektipartii numbrid on süsteemi logitud. Plate Layout Report (Plaadi paigutuse aruanne) näitab proovide ja kontrollide füüsilist paigutust igal testitaval plaadil. Seda orientatsiooni kasutatakse nii praimingu mikrotiiterriba plaadi kui ka amplifikatsiooni mikrotiiterriba plaadi puhul. CF-analüüsi puhul on praimingu mikrotiiterribad tugevad helesinised mikrotiiterriba ribad. Amplifikatsiooni mikrotiiterribad on triibulised helesinised mikrotiiterriba ribad. D. Kurguproovide (ilma transportsöötmeta) proovi töötlemine: MÄRKUSED: Laske BD ProbeTec ET Swab Diluent (tcf/tmp) (proovi lahjendi) toatemperatuurini soojeneda ning segage enne kasutamist õrnalt ümber tõstes. Jaotage vajalik BD ProbeTec ET proovi lahjendi (tcf/tmp) kogus puhtasse anumasse. Vajaliku koguse hindamiseks kasutage iga proovi jaoks 1 ml ja lisage pipettimiskerguse huvides veel 1 2 ml. Lahjendi saastumise vältimiseks ärge kallake järelejäänud lahjendit pudelisse tagasi. 1. Märgistage iga töödeldava kurguproovi jaoks 4 ml proovi katseklaas. 2. Laske proovidel toatemperatuurini soojeneda.. Kandke pipetiga 1 ml proovi lahjendit (tcf/tmp) igasse proovi katseklaasi. 4. Sisestage proov. Segage, keerutades proovi lahjendis 5 1 sekundit. 5. Suruge tampoon vastu katseklaasi siseseina, nii et vedelik valguks katseklaasi põhja. 6. Eemaldage tampoon hoolikalt, vältides pritsmeid. MÄRKUS: Piisad võivad töötsooni saastada. 7. Asetage tampoon transportkatseklaasi tagasi ja visake see minema. 8. Pange katseklaasile kork tihkelt peale. 9. Loksutage katseklaasi 5 s. 1. Korrake etappe 9 täiendavate kurguproovidega. 11. Valmistage kontrollid ette. Vt Kurguproovi kontrolli ettevalmistus (osa F). 12. Kasutades aruannet Plaadi paigutus, asetage näidised ja kontrollid järjekorras lüüsumisraami. 1. Lukustage näidised BD ProbeTec ET Lysing Rack (lüüsimisraam) kohale. 14. Sisestage lüüsimisraam BD ProbeTec ET Lysing Heaterisse (lüüsimiskuumutisse). 15. Kuumutage proove 1 min. 4

5 16. 1 minuti pärast eemaldage BD ProbeTec ET Lysing Rack BD ProbeTec ET Lysing Heaterist ja laske vähemalt 15 min jahtuda. Koputage raami õrnalt tööpinnal, et koguda katseklaasi põhja võimalikult palju kondensaati. MÄRKUS: Pärast näidiste lüüsimist: a. Neid võib hoida temperatuuril 18 C uni 6 h ja testida ilma taaslüüsimiseta. b. Temperatuuril 2 8 Cvõib proove hoida kuni päeva. Enne testimist tuleb proove loksutada ja taaslüüsida. c. Temperatuuril -2 C võib proove hoiustada kuni 14 nädalat. Enne testimist tuleb näidiseid toatemperatuuril sulatada, loksutada ja taaslüüsida. 17. Proovid on valmis BD ProbeTec ET CF Assay testimisprotseduuriks (osa G). E. Kurguproovi (2SP sööde) proovi töötlemine Protseduurilised märkused: Vahetage pipetiotsakuid kõigi vedelike ülekannete vahel. Soovitatav on kasutada filter-barjääriga otsakuid. Laske BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluentil (CF/LP/MP) toatemperatuurini soojeneda ning segage enne kasutamist õrnalt ümber tõstes. Jaotage vajalik kogus BD ProbeTec ET Respiratory and Media Sample Diluenti (CF/LP/MP) puhtasse anumasse. Vajaliku koguse hindamiseks kasutage iga proovi jaoks,4 ml ja lisage pipeteerimiskerguse huvides veel 1 2 ml. Lahjendi saastumise vältimiseks ärge kallake järelejäänud lahjendit pudelisse tagasi. 1. Laske proovidel toatemperatuurini soojeneda. 2. Sildistage iga testitava proovi jaoks 2 ml keeratava korgiga katseklaas.. Kandke üle 4 µl respiratoorse ja söötme lahjendit (CF/LP/MP) igasse keeratava korgiga katseklaasi. Järgnevad etapid 4 6 tuleks läbi viia bioloogilise ohutuse tõmbekapis (BSC): 4. Põhjalikuks segamiseks keerutage proove 5 15 s pulseerivalt. 5. Pipeteerige 2 µl proovist sildistatud katseklaasi. MÄRKUS: Kui proovi maht on alla 2 µl (näidis peab olema vähemalt 1 µl), suurendage mahtu 2 µl-ni, kasutades molekulaarbioloogia-klassi vett. 6. Vahetage pärast proovide lisamist kindaid. MÄRKUS: Täitke veevann destilleeritud veega ja ajage see enne 7. etapile üleminekut keema. 7. Keerutage pulseerivalt 5 s. 8. Valmistage kontrollid ette. Vt 2SP söötme kontrolli ettevalmistus (osa F). 9. Tõstke proovis ja kontrollid veevanni raamile. 1. Asetage veevanni raam 1 min vanni keevasse vette. 11. Pärast 1 min möödumist, tõstke veevanni raam välja ja laske katseklaasidel 15 min toatemperatuuril jahtuda. HOIATUS: Olge ettevaatlik, et end mitte põletada keeva veega, veevanni raamiga või veevanni pindadega, mis võivad olla tulised. 12. Pärast jahutamist tsentrifuugige (16 x g) ligikaudu 5 s. MÄRKUS: Pärast proovide keetmist: Neid võib hoida temperatuuril 18 C kuni 6 h ja testida taaskeetmiseta. Temperatuuril 2 8 C võib proove hoida kuni päeva. Enne testimist tuleb proove loksutada ja taaslüüsida. Neid võib hoiustada temperatuuril -2 C kuni 14 nädalat. Enne testimist tuleb näidiseid toatemperatuuril sulatada, loksutada ja taaslüüsida. 1. Proovid on valmis BD ProbeTec ET CF Assay testimisprotseduuriks (osa G). F. Kontrolli ettevalmistus: Kurguproovi kontrolli ettevalmistus 1. Iga seeria (plaadi) testimiseks valmistage ette üks negatiivne kontrollkatseklaas (tcf/tmp) ja üks positiivne kontrollkatseklaas (tcf/tmp). Kui plaat sisaldab rohkem kui ühe partiinumbriga reagente, peab kontrolle iga partiiga testima. 2. Eemaldage kork negatiivselt kontrollkatseklaasilt (tcf/tmp).. Uut pipetiotsakut kasutades lisage 1 ml proovi lahjendit. 4. Korkige katseklaas tihedalt uuesti kinni. 5. Eemaldage kork positiivselt kontrollkatseklaasilt (tcf/tmp). 6. Uut pipetiotsakut kasutades lisage 1 ml proovi lahjendit. 7. Korkige katseklaas tihedalt uuesti kinni. 8. Keerutage kontrollkatseklaase 5 s. 9. Kontrollkatseklaasid on lüüsimiseks valmis. Vt kurguproovi töötlemine (osa D). 2SP söötme kontrolli ettevalmistus: 1. Iga seeria (plaadi) testimiseks valmistage ette üks negatiivne kontrollkatseklaas (CF/LP/MP) ja üks positiivne kontrollkatseklaas (CF/LP/MP). Kui plaat sisaldab rohkem kui üht reagendipakendi partiinumbrit, peab kontrolle iga partiiga testima. 5

6 2. Enne kasutamist pöörake respiratoorse ja söötme lahjendi õrnalt ümber.. Eemaldage kork negatiivselt kontrollkatseklaasilt (CF/LP/MP). 4. Kasutades iga kontrollkatseklaasi puhul uut pipetiotsakut, lisage 2 µl molekulaarbioloogia-klassi vett. 5. Kasutades iga kontrollkatseklaasi puhul uut pipetiotsakut, lisage 4 µl respiratoorse ja söötme lahjendit. 6. Korkige katseklaas tihedalt uuesti kinni. 7. Eemaldage kork positiivselt kontrollkatseklaasilt (CF/LP/MP). 8. Kasutades iga kontrollkatseklaasi puhul uut pipetiotsakut, lisage 2 µl molekulaarbioloogia-klassi vett. 9. Kasutades iga kontrollkatseklaasi puhul uut pipetiotsakut, lisage 4 µl respiratoorse ja söötme lahjendit. 1. Korkige katseklaas tihedalt uuesti kinni. 11. Keerutage kontrollkatseklaase 5 s. 12. Kontrollid on keetmiseks valmis. Vt 2SP söötme näidise töötlemine (osa E). G. BD ProbeTec ET CF Assay testimisprotseduur: MÄRKUS: Enne testimisprotseduuri teostamist paigutage töödeldud proovid ja töödeldud kontrollid raami, mis suudab käidelda 2 ml või 4 ml katsuteid, nt BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tube Rack (katsutialus) või BD ProbeTec ET Lysing Rack (lüüsimisraam), mis mõlemad ühilduvad BD ProbeTec ET Pipettoriga (pipett). 1. Eemaldage ja visake ära jahutatud proovide ja kontrollide korgid. 2. VAHETAGE KINDAID enne jätkamist, et vältida saastumist.. Plaadi paigutuse aruannet kasutades valmistage ette praimingu mikrotiiterriba plaat vt Paadi paigutus (osa C). 4. Pitseerige mikrotiiterriba kotikesed uuesti järgnevalt: a. Asetage kotike tasasele pinnale. Hoidke avatud otsa ühe käega tasasena. b. Avaldades survet, libistage sõrmega mööda sulguri välispinda ühest kotikese äärest teiseni. c. Kontrollige, et kotike oleks suletud. 5. Valige BD ProbeTec ET Pipettoril 1. programm. 6. Võtke kätte pipetiotsakud. Pikendage BD ProbeTec ET Pipettorit vahehooba lõpuni välja tõmmates. MÄRKUS: Veenduge, et otsakud on lekkimise vältimiseks kindlalt pipeti külge kinnitatud. 7. Aspireerige 2 µl proovide esimesest tulbast. 8. Laske pipetil sujuvalt tühjeneda otsakutega katsuti seina puudutades ja doseerige 15 µl praimingu mikrotiiterribade vastavasse tulpa (1 A H). MÄRKUS: Ärge tühjendage pipetti näidiste või mikrotiiterribade kohal, kuna see võib põhjustada saastumist. Äkilised liigutused võivad tekitada piisku või udu. 9. Visake otsakud minema. Pipeti lähtestamiseks vajutage pipeteerimispäästik alla. MÄRKUS: Visake otsakud ettevaatlikult minema, et vältida piiskade ja udu teket, mis võib põhjustada töötsooni saastumise. 1. Võtke uued otsakud, pikendage pipetti ja aspireerige 2 µl teisest näidiste tulbast. 11. Laske pipetil sujuvalt tühjeneda, puudutage pipetiotsakutega süvendite külgi ja doseerige 15 µl praimingu mikrotiiterribade vastavasse tulpa (2 A H). 12. Visake otsakud minema. 1. Jätkake seeria ülejäänud näidiste ülekannet. 14. Katke praimingu mikrotiiterriba plaat praimingu kattega ja laske plaadil toatemperatuuril vähemalt 2 minutit inkubeeruda. (Inkubatsioon võib kesta kuni 6 h). MÄRKUS: Pange töödeldud proovidele uued korgid jälle peale. VAHETAGE KINDAID. 15. Praimingu inkubatsiooni lõppedes valmistage ette amplifikatsiooni mikrotiiterriba plaat. Konfigureerige amplifikatsiooni mikrotiiterribad plaadil nii, et need vastaksid plaadi paigutusaruandele (sama mis praimingu plaat). Pitseerige mikrotiiterriba kotike uuesti nii, nagu on kirjeldatud 4. etapis. 16. Eemaldage praimingu mikrotiiterriba plaadilt kate ja tõstke plaat praimingu termostaadile. Asetage amplifikatsiooni mikrotiiterriba plaat KOHE soojendustermostaati eelsoojenema. 17. Lülitage taimer 1 minuti peale. (MÄRKUS: selle etapi puhul on aeg väga oluline) min (± 1 min) inkubatsiooniperioodi lõppedes valige pipetil 5. programm. 19. Võtke pipetiotsakud ja kandke 1 µl praimingu mikrotiiterriba plaadi esimesest tulbast amplifikatsiooni mikrotiiterriba plaadi esimesse tulpa. Laske pipetiotsakutel puudutada süvendite külgi ja doseerige vedelik. Pärast doseerimist laske pipetil vedelikku tiiterribades automaatselt segada. Tõstke ettevaatlikult pipett plaadilt ära. Vältige teiste tiiterribade puudutamist. 2. Visake otsakud minema. Võtke uued otsakud ja jätkake reaktsioonisegu kandmist praimingu mikrotiiterribadelt amplifikatsiooni mikrotiiterribadele tulp tulba haaval, kasutades iga tulba puhul uusi otsakuid. 21. Pärast viimase tulba ülekandmist eemaldage amplifikatsiooni sulguri aluskiht (üks amplifikatsiooni sulgur (1/2) katab kuni 6 tulpa. (Kui plaadil on üle 6 tulba, PEAB kasutama tervet sulgurlehte). Hoidke sulgurit servadest ja asetage üle mikrotiiterribade. Kasutage soojendustermostaadil olevaid juhikuid, mis aitavad sulguri paigaldamisel. Vajutage sulgurit allapoole, kindlustamaks, et kõik mikrotiiterribad on täielikult suletud. 6

7 22. BD ProbeTec ET kasutajaliidesel tooge kandur välja ja avage uks ning tõstke plaadi kate üles. KOHE ( s jooksul) paigutage pitseeritud amplifikatsiooni mikrotiiterriba plaat BD ProbeTec ET instrumenti ja käivitage programm. (Üksikasjalikke juhiseid lugege BD ProbeTec ET süsteemi kasutusjuhendist.) 2. Pärast seeria käivitamist jätkake koristusprotseduuri järgmise osaga: a. Pitseerige praimingu mikrotiiterribad amplifikatsiooni sulguriga ja eemaldage plaat praimingu ja soojendustermostaadist. HOIATUS: Temperatuur on kõrgem kui 7 C kasutage plaadi eemaldamiseks kuumuskindlat kinnast. b. Laske plaadil tööpinnal 5 minutit jahtuda. c. Eemaldage suletud praimingu mikrotiiterribad plaadilt, hoides sulgurit mõlemalt poolt ja tõstes süvendid ühe üksusena otse üles. Pange suletud mikrotiiterribad prügikotti ja sulgege see. d. Puhastage metallplaat: Loputage plaati 1% (v/v) naatriumhüpokloriti ja Alconoxi lahusega. Loputage plaati veega. Mässige plaat puhtasse pabersalvrätikusse ja laske enne uuesti kasutamist täielikult kuivada. 24. Kui seeria on lõpetatud, prinditakse testi tulemused välja. 25. Liigutage plaadikandur platvormilt eemale, avage uks ja eemaldage plaat. Sulgege uks ja pange plaadi platvorm tagasi instrumendi sisse. 26. Eemaldage plaadilt suletud amplifikatsiooni mikrotiiterribad. ETTEVAATUST: Ärge eemaldage mikrotiiterribadelt pitseerimismaterjali. Suletud mikrotiiterribasid saab kergelt ühe üksusena eemaldada, hoides sulgurit üleval ja all ning tõstes plaadilt otse üles ja eemale. Pange suletud mikrotiiterribad prügikotti. Sulgege kott. 27. Puhastage metallplaat: Loputage plaati 1% (v/v) naatriumhüpokloriti ja Alconoxi lahusega. Loputage plaati veega. Mässige plaat puhtasse pabersalvrätikusse ja laske enne uuesti kasutamist täielikult kuivada. 28. Pärast päeva viimast seeriat viige läbi järgmised koristusprotseduurid: a. Küllastage pabersalvrätikud või marlitampoonid 1% (v/v) naatriumhüpokloriti ja Alconoxi lahusega ning pühkige nendega üle lüüsimiskuumuti, praimingu- ja soojendustermostaadi, katsutite aluse, veevanni, tsentrifuugi ja BD ProbeTec ET instrumendi tööpinnad ja välispinnad. Laske lahusel 2 min pindadele mõjuda. Niisutage pabersalvrätikud või marlitampoonid veega ja eemaldage puhastuslahus. Vahetage salvrätte või marlitampoone sageli nii lahusega pühkides kui ka veega loputades. Niisutage pabersalvrätikud või marlipatju 1% (v/v) naatriumhüpokloriti ja Alconoxiga ja pühkige pipeti käepidet (AINULT KÄEPIDET). Pärast 2 min pühkige käepide vees niisutatud pabersalvrätikute või marlipatjadega. b. Kastke lüüsimisraam, lüüsimisraami alus, lüüsimisraami kate ja plaadid või veevanni raam 1-2 minutiks 1% (v/v) naatriumhüpokloriti ja Alconoxi lahusesse. c. Laadige pipett uuesti täis. d. Visake pitseeritud prügikott ja bioloogiliselt ohtlikud jäätmed minema vastavalt saastunud jääkmaterjalide utiliseerimise kindlaksmääratud protseduuridele. 29. Vähemalt kord nädalas viige läbi järgmised protseduurid: a. Kallake veevannides olev vesi ära. b. Puhastage veevanne 1% (v/v) naatriumhüpokloriti ja Alconoxi lahusega. Loputage veega ja laske kuivada. c. Täitke uuesti destilleeritud veega. Kvaliteedikontroll Kvaliteedikontrolli nõudeid tuleb täita vastavalt kohalikele, osariiklike ja/või riiklike seadustele või akrediteerimisnõuetele ja teie laboratooriumi standardsete kvaliteedikontrolli protseduuridele. Soovitatav on, et kasutaja tutvuks asjakohaste CLIS-i (endine NCCLS) juhendis ja CLIA regulatsioonides toodud kvaliteedikontrolli kirjeldustega. Proovi lahjendi ja kontrollid on kaasas koos proovi lahjendi ja kontrolli komplektiga (tcf/tmp). Respiratoorse ja söötme lahjendi ja kontrollid on kaasas respiratoorse ja söötme lahjendi ja kontrollide komplektis (CF/LP/MP). Igas plaadil teostatavas proovi tüübis / analüüsis ja igas uues reagendi komplektipartii numbris peab sisalduma üks positiivne ja üks negatiivne kontroll. Kontrollid võivad paikneda juhuslikult. Positiivne kontroll näitab olulist reagendi tõrget. Negatiivne kontroll monitoorib reagendi ja/või keskkonna saastumist. Positiivsed ja negatiivsed kontrollid peavad testimisel olema vastavalt kas positiivsed või negatiivsed, et analüüside tulemustest teavitada. Kui kontrollid ei toimi eeldatud viisil, loetakse analüüsi seeria vigaseks ja instrument ei teavita patsiendi tulemustest. Kui seeria kontrollid ei anna oodatud tulemusi, korrake kogu seeriat uuesti, kasutades uut kontrollide komplekti, uusi mikrotiiterribasid ja töödeldud proove. Kui kordustesti jaoks jääb ebapiisav töödeldud proov, siis töödelge uuesti primaarse proovi teist alikvooti. Kui korratud kontrollid ei anna oodatud tulemusi, võtke ühendust tehnilise teenindusega (vt Tulemuste esitamine ). Sisemine amplifikatsiooni kontroll (IAC) on kuivatatud praimingu mikrotiiterribasse. IAC sisaldab sihtnukleiinhapet, mida amplifitseeritakse näidise maatriksi olemasolul. IAC on loodud kinnitama amplifikatsiooni reaktsiooni usaldusväärsust ning tuvastama töödeldud proovi potentsiaalset inhibitsiooni. Proovi töötlemiskontrollid Proovi töötlemiskontrolle võib testida kooskõlas vastavate atesteerimisorganisatsioonide nõuetega. Positiivsed ja negatiivsed kontrollid peavad testima kogu analüüsisüsteemi. Sel eesmärgil saavad teadaolevalt 7

8 positiivsed proovid täita kontrollide otstarvet, kui neid töödeldakse ja testitakse koostöös tundmatute proovidega. Proove, mida kasutatakse töötlemiskontrollidena, tuleb hoiustada, töödelda ja testida vastavalt toote infolehele. Positiivsed ja negatiivsed kontrollid on loodud kontrollima proovide töötlemisprotseduuride efektiivsust, kui testitakse kurguproove (vastavalt kas transportsöötmega, proovi kontrolliga ja respiratoorse ja söötme kontrollidega või ilma), sest kontrolle töödeldakse proovidega sarnasel viisil. DNA-saastumise tuvastamise monitooring Vähemalt kord kuus tuleks DNA-saastumise tuvastamiseks viia läbi järgmisi töötsooni ja aparatuuri pindade monitoorimise testprotseduure. Saastumise avastamisel juba enne probleemi tekkimist on olulise tähtsusega keskkonna monitooring. 1. Iga testitava ala* jaoks kasutage BBL CultureSwab EZ proovi. 2. Sildistage näidiskatseklaas iga piirkonna kohta, kust proov võetakse ja pange pipetiga 1 ml proovi lahjendit (tcf/tmp) igasse katseklaasi.. Kastke esimene proovitampoon lahjendisse ja pühkige laia pühkimisliigutusega esimene ala üle. 4. Segage proovitampooni lahjendis, suruge vastu seina, pange katseklaasile uuesti kork peale ja segage 5 s. Visake tampoonid minema. 5. Korrake sama protseduuri iga tampooniga ülepühitud ala puhul. 6. Asetage katseklaasid lüüsimisraami ja kuumutage lüüsimiskuumutis 1 min. Võtke raam kuumutist välja ja laske proovidel enne jätkamist 15 min jahtuda. 7. Katseklaaside kuumutamise ajal kasutage veega küllastatud puhtaid pabersalvrätte puhversegu jääkide eemaldamiseks pühitud pindadelt. 8. Kui proovid on jahtunud, jätkake BD ProbeTec ET CF Assay testimisprotseduuridega (osa G). * Testimiseks soovitatavad alad on: lüüsimisraami, lüüsimiskuumuti, veevanni raami, mikrotsentrifuugi, praimingu- ja soojendustermostaadi pindu, musti mikrotiiterribade plaate, pipeti käepidet, instrumendi puuteklahve, instrumendi klaviatuuri, veevannide kuivi pindu, näidiste aluste pindu ja tööpindu, kaasa arvatud näidiste töötlemistsoone. Kui ala annab positiivse tulemuse, puhastage seda värske 1% (v/v) naatriumhüpokloriti ja Alconoxi lahusega. Kandke hoolt, et kogu ala oleks puhastuslahusega märjaks tehtud ja laske puhastuslahusel jääda pinnale vähemalt 2 minutiks või kuni kuivamiseni. Vajaduse korral eemaldage üleliigne puhastuslahus puhta salvrätiga. Pühkige ala puhta, vees küllastatud salvrätikuga ja laske pinnal kuivada. Testige ala uuesti. Korrake kuni negatiivse tulemuse saamiseni. Kui saastus ei kao, võtke lisateabe saamiseks ühendust tehnilise teenindusega. TESTITULEMUSTE ESITAMINE Chlamydiaceae perekonna DNA olemasolu või selle puudumine määratakse proovi PAT-skooride (Passes After Threshold sooritused pärast lävendit) arvutamise kaudu, võttes aluseks ettemääratud lävendväärtused. PAT-skoor on mõõdik, mida kasutatakse reaktsiooni tulemusena tekkiva signaali suurusjärgu hindamiseks. Selle mõõdiku puhul näitavad suuremad numbrid, et lävend saavutati amplifikatsiooni varastes faasides, samas kui väiksemad numbrid tähendavad, et lävend saavutati hiljem, reaktsiooni käigus. PAT-skoori suurusjärk ei viita Chlamydiaceae perekonna DNA kogusele proovis. Kui analüüsi kontrolltulemused pole sellised, nagu võis eeldada, ei tohiks patsienti tulemustest teavitada. Vt eeldatavate kontrollväärtuste alast teavet kvaliteedikontrolli osast. Teavitatud tulemusi määratakse järgnevalt: PAT-skoor CF siht IAC siht Tulemus Tõlgendus Teavitus > > või = Positiivne SDA tuvastatud Chlamydiaceae perekonna DNA. Chlamydiaceae perekonna organismide suhtes positiivne, viidates käesolevalt nakatumisele. Avastatud liigi tuvastamiseks on vajalik lisatestimine. = > Negatiivne SDA ei tuvastanud Chlamydiaceae perekonna DNA-d. Eeldatavalt Chlamydiaceae perekonna organismide suhtes negatiivne. Chlamydiaceae st tingitud nakkust ei saa välistada, kuna olemasolev DNA-tase võib olla allpool testi tuvastuspiiri. = = Määramatu Amplifikatsiooni kontroll pärsitud. Tulemuste tõlgendamiseks on vajalik lisatestimine. a a Korrake BD ProbeTec ET CF Assay analüüsi töödeldud katseklaasist. Kui töödeldud proovist jääb ebapiisav kogus, korrake testi esialgsest proovist või nõudke vajaduse korral uut proovi. Kui kordustulemus on positiivne või negatiivne, tõlgendage vastavalt ülaltoodud kirjeldusele. Kui kordustulemused on määramatud, tuleks nõuda uut proovi. CF-i ja IAC-i lävendi määramine: Chlamydiaceae perekonna siht-dna ja IAC-i lävendväärtused määrati algselt, kasutades vastuvõtja operaatori iseloomulikku positiivsetelt ja negatiivsetelt kontrollidelt saadud andmekõvera analüüsi. Neid lävendväärtusi kontrolliti ja kinnitati kliiniliste uuringute käigus. protseduuri piirangud 1. BD ProbeTec ET CF Assay on ette nähtud spetsiaalselt Chlamydiaceae perekonna liikide tuvastamiseks, kuid see ei erista selle perekonna erinevaid liikmeid (s.t C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. abortus, C. percorum, C. caviae, C. pneumoniae, C. felis ja C. psittaci). 8

9 2. BD ProbeTec ET CF Assayd on hinnatud ainult kurguproovidega (koos 2SP transportsöötmega ja ilma). Muud tüüpi proovide efektiivsust pole kindlaks määratud.. BD ProbeTec ET CF Assayd on hinnatud ainult patsientidel, kes on vähemalt aasta vanused või vanemad. 4. Nagu paljude diagnostiliste testidega, tuleb BD ProbeTec ET CF Assay tulemusi tõlgendada teiste arstile kättesaadavate laboratoorsete ja kliiniliste andmete kontekstis. Selle analüüsi positiivne tulemus kombineerituna teiste kliiniliste märkide ja sümptomitega ning pneumoonia diagnostiliste näitajatega osutab Chlamydiaceae perekonnaga seotud kopsupõletikule. 5. Negatiivset testitulemust ei tohiks kasutada Chlamydiaceae perekonnaga seotud kopsupõletiku diagnoosi välistamiseks, kuna testitulemusi võivad mõjutada proovide ebaõige võtmine, tehniline viga, proovide segiminek, kaasnev antibiootikumiravi või Chlamydiaceae perekonna DNA kogus proovis, mis jääb allapoole testi tundlikustaset. Seega võivad vajalikuks osutuda täiendavad diagnostilised testiprotseduurid, nt kultiveerimise, seroloogia ja/või kinnitatud nukleiinhappe amplifikatsiooni test BD ProbeTec ET CF Assayd ei saa kasutada ravi edukuse või nurjumise hindamiseks, kuna Chlamydiaceae perekonna nukleiinhapped võivad püsida ka pärast edukat antimikroobset ravi. 7. Selle analüüsi optimaalse tulemuse saavutamiseks on vaja asjatundlikku proovide kogumist ja töötlemist. 8. BD ProbeTec ET CF Assay kasutamine on piiratud ning lubatud ainult neile, kes on saanud nii BD ProbeTec ET süsteemi kui analüüsi protseduuri alase koolituse. 9. BD ProbeTec ET CF Assay annab kvalitatiivseid tulemusi. PAT-skoori suurusjärgu ja proovis sisalduva Chlamydiaceae perekonna DNA hulga vahel mingit korrelatsiooni leida ei ole võimalik. oodatavad TULEMUSED A: Levik Chlamydiaceae testimisel tuvastatud positiivsuse määr varieerub, sõltuvalt kasutatud testimismeetodist, patsiendi vanusest, põhiliste riskifaktorite olemasolust, geograafilisest asukohast ja eelkõige kohalikust haiguse levikust. B: PAT-skoori sagedusjaotus Prospektiivne uuring Märkus: Kõiki BD ProbeTec ET CF Assay tulemusi võrreldi 2SP transportsöötmes avalduva kurguproovi kultuuri tulemusega. Kliinilise uuringu kavandamise üksikasjaliku kirjelduse kohta lugege Resultatiivsuse karakteristikute osast. BD ProbeTec ET CF Assayga testiti kokku 54 kurguproovi (hoiustatud ilma transportsöötmeta), mis koguti prospektiivselt seitsmes kliinilises keskuses Ameerika Ühendriikide ja Kanada 54 patsiendilt. Esialgse CF PATskooride sagedusjaotus kultuuride tulemustega võrreldes on näidatud joonisel 1. Seitsetkümmet viit prospektiivselt kogutud kurguproovi ja 2SP transportsöötmes kurguproovi testi samuti BD ProbeTec ET CF Assayga. Esialgse CF PAT-skooride sagedusjaotus kultuuride tulemustega võrreldes on näidatud joonisel 2. Retrospektiivne uuring Kahtekümmet viit retrospektiivset kurguproovi, mida esitati 2SP transportsöötmes ja hoiustati külmutatuna, testiti BD ProbeTec ET CF Assay ga Euroopa kliinilises asutuses. Algne CF PAT-skooride sagedusjaotus võrrelduna esialgse kultuuri tulemusega on näidatud joonisel. Algne CF PAT-skooride sagedusjaotus võrrelduna sama proovi esialgse PCR tulemusega on näidatud joonisel 4. Joonis 1: CF PAT-skoori sagedusjaotus prospektiivsete kurguproovide (ilma transportsöötmeta) tulemused külviga võrreldes Külvi tulemus Kokku Negatiivne Positiivne Kokku

10 Joonis 2: CF PAT-skoori sagedusjaotus prospektiivse kurguproovi (2SP sööde) tulemused külviga võrreldes Sagedus (-) (+) 1 CF PAT-skoor Külv ( ) Külv (+) Külvi tulemus Kokku Negatiivne Positiivne Kokku Joonis : CF PAT-skoori sagedusjaotus retrospektiivsete kurguproovide (2SP sööde) tulemused külviga võrreldes (2SP sööde) Sagedus,5 2,5 2 1,5 1,5 (-) (+) CF PAT-skoor 1 Külv ( ) Külv (+) Külvi tulemus Kokku Negatiivne Positiivne 1 4 Kokku 1 4 1

11 Joonis 4: CF PAT-skoori sagedusjaotus retrospektiivse kurguproovi (2SP sööde) tulemused külviga võrreldes PCR-ga PCR (2SP sööde) Sagedus (-) (+) CF PAT-skoor Külv ( ) Külv (+) PCR tulemus Kokku Negatiivne Positiivne Kokku C. Kontrollid Kliinilise hindamise ajal viidi läbi kokku 45 seeriat, kasutades respiratoorseid ja söötmekontrolle (CF/LP/MP). Kõigil seeriatel olid aktsepteeritavad kontrolltulemused. Kokku viidi läbi 78 seeriat, kasutades proovikontrolle (tcf/tmp). Kahel seerial kontrollid ebaõnnestusid. Üks nurjumine toimus protseduurilise vea tõttu; teise puhul ei olnud võimalik konkreetset põhjust määrata. CF/LP/MP kontrollide PAT-skoorid ja tcf/tmp kontrollid on kokku võetud vastavalt tabelites 1 ja 2. Tabel 1: Respiratoorsete ja söötme (CF/LP/MP) kontrollide CF PAT-skooride kokkuvõte Kontroll N Vahemik 5. protsentiil Keskmine Mediaan 95. protsentiil CF negatiivne 45 CF positiivne 45 9,5 52, 41,4 49, , Tabel 2: Proovi (tcf/tmp) kontrollide CF PAT-skooride kokkuvõte Kontroll N Vahemik 5. protsentiil Keskmine Mediaan 95. protsentiil CF negatiivne 77 CF positiivne 76 28, 52,7 48,5 51,1 51,8 52,5 RESULTATIIVSUSE KARAKTERISTIKUD Prospektiivne uuring BD ProbeTec ET CF Assayd hinnati prospektiivselt 22-2 respiratoorsete haiguste hooaja jooksul seitsmes kliinilises keskuses Ameerika Ühendriikides ja Kanadas. Kurguproov (CultureSwab EZ - hoiustatud ilma transportsöötmeta) võeti testimiseks BD ProbeTec ET CF Assayga. Külvitestiks võeti polüestertupsutiga üks proov ning hoiti 2SP (sahharoosfosfaat) transportsöötmes ning polümeraaasi ahelreaktsiooni (PCR) testimiseks võeti proov teise polüestertupsutiga ja hoiti Tris-EDTA (TE) puhverlahuses. Seetõttu võrreldi kõigilt prospektiivselt kogutud proovidelt saadud BD ProbeTec ET CF Assay tulemusi 2SP söötmelt saadud kurguproovi kultuuri tulemusega. Seitsmest meditsiinikeskusest üks viis läbi kõik Chlamydiaceae kultuuri testimise etalontestid. Vähemalt ühe inklusiooni olemasolu pärast perekonnaspetsiifilise monokloonse antikehaga kontrastimist, loeti Chlamydiaceae liikide positiivseks näiduks selles proovis. Vähemalt ühe inklusiooni olemasolu pärast FITCkonjugeeritud C. pneumoniae-spetsiifilise monokloonilise antikehaga kontrastimist, loeti C. pneumoniae positiivseks näiduks selles proovis. Seitsmest meditsiinikeskusest üks viis läbi kõik prospektiivsete proovide PCR-testimise etalontestid. PCR tehti kõigile TE-puhverlahuses hoitud BD ProbeTec ET CF Assay positiivsete patsientide kurguproovidele ning osale ühilduvatest negatiivsetest proovidest ja kõigile lahknevate tulemustega proovidele (st proovidele, mille puhul oli lahknevusi BD ProbeTec ET CF Assay ja referentsmeetodi vahel). PCR-analüüs oli C. pneumoniae spetsiifiline ja see on üks neljast avaldatud protokollist, mis vastab valideeritud PCR-analüüsi optimaalsetele kriteeriumitele.,9 Kokku koguti 54 kurguproovi (hoiustatud ilma transportsöötmeta) 54 patsiendilt, mis kõik vastasid uuringusse kaasamise kriteeriumidele (st pneumoonia radiograafilised näidud, patsiendi vanus 1 aasta, antibiootikumiravil 14 päeva, kogutud kehtivad proovi tüübid, läbi viidud vastavad viitamismeetodid jne.) Et hinnata BD ProbeTec ET CF Assay resultatiivsuse karakteristikuid võrreldi kurguproovide (ilma transportsöötmeta) tulemusi paralleelse 2SP söötmes aktiveeritud kurguproovi külvi tulemustega. Proovi peeti positiivseks, kui külvi tulemus oli positiivne. Proovi peeti negatiivseks, kui külvi tulemus oli negatiivne. 11

12 Kurguproovi (ilma transportsöötmeta) tulemused on kokku võetud tabelis. Määramatuid tulemusi ei täheldatud. Tabel : BD ProbeTec ET CF Assay prospektiivse kurguproovi (ilma transportsöötmeta) tulemused külviga võrreldes Külv Asukoht CF tulemus Positiivne Negatiivne Kokku 1 Positiivne Negatiivne 2 a Kokku Positiivne Negatiivne Tundlikkus (95% CI) % (/2) (% 84,2%) Kokku P/R Positiivne 1 b 1 Negatiivne Kokku P/R 4 Positiivne Negatiivne Kokku P/R 6 Positiivne Negatiivne 4 4 Kokku 4 4 P/R 7 Positiivne Negatiivne 1 c 8 81 Kokku Üldine Positiivne 1 1 Negatiivne 5 5 Kokku % (/1) (% 97,5%) % (/) (% 7,8%) Spetsiifilisus (95% CI) 1% (89/89) (95,9% 1%) 1% (26/26) (86,8% 1%) 99% (97/98) (94,4% 1%) 1% (24/24) (85,8% 1%) 1% (4/4) (89,7% 1%) 1% (8/8) (95,5% 1%) 99,7% (5/51) (98,4% 1%) a Mõlema proovi külvi tulemuses oli 1+ kordne kasv (1 inklusioon lahtri kohta või 5 inklusiooni ml kohta 2SP söötmes). Mõlema proovi PCR tulemused olid negatiivsed. b PCR tulemused olid positiivsed. c Külvil oli hinnanguliselt 2+ kordne kasv (72 inklusiooni lahtri kohta või 6 inklusiooni ml kohta 2SP söötmes). PCR tulemus oli negatiivne. P/R = pole rakendatav MÄRKUS: PCR-analüüs on C. pneumoniae spetsiifiline ja see on üks neljast avaldatud protokollist, mis vastab valideeritud PCR-analüüsi optimaalsetele kriteeriumitele.,9 Seitsetkümmet viit prospektiivselt kogutud kurguproovi ja 2SP transportsöötmes esitatud kurguproovi testiti samuti BD ProbeTec ET CF Assayga. 2SP transportsöötmes esitatud kurguproovi tulemusi võrreldi sama proovi söötmest saadud külvi tulemustega. Proovi peeti positiivseks, kui külvi tulemus oli positiivne. Proovi peeti negatiivseks, kui külvi tulemus oli negatiivne. Transportsöötmes 2SP hoitud kurguproovide tulemused on võetud kokku tabelis 4. Määramatuid tulemusi ei täheldatud. 12

13 Tabel 4: BD ProbeTec ET CF Assay prospektiivsete kurguproovide (2SP sööde) tulemused külviga võrreldes Külv Asukoht CF Assay tulemus Positiivne Negatiivne Kokku 2 Positiivne Negatiivne 1 a 6 7 Kokku Positiivne 1 c 1 Negatiivne 2 b 5 7 Kokku Üldine Positiivne 1 1 Negatiivne Kokku Tundlikkus (95% CI) % (/1) (% 97,5%) % (/2) (% 84,2%) % (/) (% 7,8%) Spetsiifilisus (95% CI) 1% (6/6) (9,% 1%) 97,2% (5/6) (85,5% 99,9%) 98,6% (71/72) (92,5% 1%) a Külvil on hinnanguliselt 2+ kordne kasv (72 inklusiooni lahtri kohta või 6 inklusiooni ml kohta 2SP söötmes). PCR tulemus oli negatiivne. b Mõlema proovi külvi tulemuses oli 1+ kordne kasv (1 inklusioon tiitri kohta või 5 inklusiooni ml kohta 2SP söötmes). Mõlema proovi PCR-tulemused olid negatiivsed. c PCR-tulemus oli positiivne. MÄRKUS: PCR-analüüs on C. pneumoniae spetsiifiline ja see on üks neljast avaldatud protokollist, mis vastab valideeritud PCR-analüüsi optimaalsetele kriteeriumitele.,9 Igalt BD ProbeTec ET CF Assay uuringutes osalenud patsiendilt kogutud proovidest üht hoiti PCR-testimiseks Tris-EDTA puhverlahuses. Kõiki positiivseid, lahknevaid (BD ProbeTec ET CF Assay-positiivne, külvi negatiivne või vastupidi) ja ligikaudu 1% ühilduvatest negatiivsetest proovidest testiti kindlakskujunenud C. pneumoniae-spetsiifilise PCR-meetodiga. Kogu PCR testimine viidi läbi ühes kliinilises asutuses. Kokku testiti 27 patsiendi proove C. pneumoniae PCR-analüüsiga (st 21 patsiendi ühilduvate negatiivsete tulemustega proove ja kuue ebakõlaliste tulemustega patsiendi proove). Tabelis 5 võetakse kokku külvi BD ProbeTec ET CF Assay ja PCR-analüüsi tulemuste kombinatsioonid. Tabel 5: Prospektiivsete patsientide testimeetodite ja BD ProbeTec ET CF Assay tulemused Külvi tulemus BD ProbeTec ET CF Assay tulemused Kurguproov 2SP sööde PCR-tulemus c Patsientide arv + a Mitte vastav b + P/S P/S 65 P/S 17 P/S P/S 26 P/S P/S 1 Legend: P/S = pole saada + tähistab positiivset tulemust tähistab negatiivset tulemust a Kahe külvi tulemustes oli hinnanguliselt 1+ kordne kasv (1 inklusioon lahtri kohta või 5 inklusiooni ml kohta 2SP söötes). Ühel külvil oli hinnanguliselt 2+ kordne kasv (72 inklusiooni lahtri kohta või 6 inklusiooni ml kohta 2SP söötmes). b Proov jõudis testimispaika sulanult. Külv viidi siiski läbi ja oli negatiivne. Kuna proov oli rikutud, ei kasutatud kultuuri tulemust BD ProbeTec ET CF Assay resultatiivsuse karakteristikute hindamisel. c PCR-analüüs on C. pneumoniae spetsiifiline ja see on üks neljast avaldatud protokollist, mis vastab valideeritud PCR-analüüsi optimaalsetele kriteeriumitele.,9 Retrospektiivne uuring Positiivsete proovide madala arvu tõttu, mida esines prospektiivses uuringus, tuvastas BD Euroopas koha, kus oli kasutatud ja hoiustatud külmutatuna 2SP transportsöötmes 25 kurguproovi. Neid retrospektiivseid proove hoiustatud külmutatuna kuni kaheksa aastat, enamikke proovidest (84%, 21/25) alla kuue aasta. 25 retrospektiivset proovi iseloomustas külvi ja PCR kombinatsioon või ainult PCR. 25 proovist olid kõigil PCR tulemused (22 positiivset, kolm negatiivset). 22 PCR positiivsest proovist oli ainult neljal positiivne C. pneumoniae külvi tulemus. Järelejäänud 18 PCR positiivse proovi ja kolme PCR negatiivse proovi puhul külvitestimist ei tehtud. Proov loeti positiivseks, kui kas külvitulemus või PCR tulemus oli positiivne. Proovi peeti negatiivseks, kui olemasolev PCR tulemus oli negatiivne. BD ProbeTec ET CF Assay protsentuaalse vastavuse hinnangud 2SP transportsöötmes hoiustatud kurguproovide võrdlusest olemasolevate külvide ja/või PCR tulemustega on kokku võetud tabelis 6. Külviga võrreldes oli protsentuaalne ühilduvus 1% (4/4). Positiivne, negatiivne ja üldine protsentuaalne vastavus võrreldes PCR-ga oli vastavalt 81,8% (18/22), 1% (/) ja 84% (21/25).