Avtomatizirana analiza

Transcription

1 Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop Analizna kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2005 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza ( ). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

2 OSNOVNA LITERATURA: Journal of Chromatography B, 675(1996) Manual and automated (robotic) high-performance liquid chromatography methods for the determination of mycophenolic acid and its glucuronide conjugate in human plasma Irene Tsina, Frances Chu, Kyle Hama, Martin Kaloostian, Yuen Ling Tam, Thomas Tarnowski*, Belinda Wong Syntex, Inc., 3401 Hillview Avenue, Palo Alto, CA 94303, USA

3 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO Primerjava ročne in avtomatizirane (robotizirane) metode HPLC za določevanje mikofenolne kisline (MPA) in njenega glukuronidnega konjugata (MPAG) v človeški plazmi Tina Hriberšek Seminarska naloga pri predmetu Avtomatizirana analiza Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Ljubljana, junij 2005

4 KAZALO 1 UVOD MPA IN MPAG EKSPERIMENTALNI DEL REAGENTI, TOPILA, VZORCI KOLONE APARATURA (KOMPONENTE SISTEMA HPLC) KROMATOGRAFSKI POGOJI (ZA DOLOČITEV MPA IN MPAG) ROBOTIZIRAN SISTEM PRIPRAVA VZORCEV (ROČNA METODA) Priprava raztopin Ekstrakcija standardov za kalibracijo Ekstrakcija kliničnih vzorcev Obdelava podatkov in izračuni Priprava vzorcev za ugotavljanje pravilnosti metode PRIPRAVA VZORCEV (AVTOMATIZIRANA METODA) REZULTATI IN DISKUSIJA MEJA KVANTIFIKACIJE PRECIZNOST IN TOČNOST SPECIFIČNOST LINEARNOST VPLIV VOLUMNA STABILNOST PRIMERJAVA ROČNE IN AVTOMATIZIRANE METODE UPORABA ZAKLJUČEK LITERATURA

5 1 UVOD V tem članku sta opisani ročna in avtomatizirana (uporabljen je bil robot Zymark Pytechnology) HPLC metoda za simultano določevanje MPA (mikofenolna kislina) in njenega glukoronidnega konjugata (MPAG) v človeški plazmi. Obe metodi sta dobro ponovljivi in natančni. Sta ekvivalentni v vseh pogledih (meja kvantifikacije, območje linearnosti, preciznost in natančnost). Tako MPA kot MPAG sta bila stabilna glede na izbrane pogoje samih metod. 2 MPA IN MPAG Mikofenolat mofetil (slika 2-1) je 2-(4-morfolino) etil ester mikofenolne kisline. Mikofenolno kislino v medicini uporabljajo kot zdravilo za zaviranje imunske odzivnosti pri pacientih po presaditvi organov (jeter, ledvic, srca, ). Poleg tega se uporabljajo še ciklosporini, kortikostereoidi. Pri nas v Sloveniji uporabljajo zdravila, ki so znana pod imenom Arana, CellCept. So v obliki kapsul, vsebujejo pa mg učinkovine. V nadzorovanih kliničnih procesih se je pokazal kot izjemno učinkovit, ob dodatni terapiji z ciklosporinom in kortikostereoidi, pri preprečitvi akutne zavrnitve presajenega organa (ledvice). Ko pacient zaužije tableto mikofenolata mofetila se le ta hitro absorbira in hidrolizira. Tvori se prosti MPA, ki je aktivni metabolit. Iz MPA nato s konjugacijo nastane fenolni glukorinidni konjugat (MPAG), ki je farmakološko neaktiven vendar lahko v celicah hidrolizira in nastane prosti MPA. MPA potencialno, selektivno in reverzibilno inhibira inozin monofosfat dehidrogenazo (IMPDH) in posledično inhibira sintezo T in B limfocitov. V nasprotju z ostalimi celicami je sinteza limfocitov bolj odvisna od de novo poti kot od tako imenovane salvage poti (hypoxanthinegvanin fosforibizil transferaza; HGPRT) za sintezo purinov. Adicija gvanozina ali deoksigvanozina omogoča, da lahko MPA vpliva na limfocite. MPA prav tako inhibira sintezo protiteles v B limfocitih. Da bi lahko podpirali razvoj mikofenolat mofetila je bila razvita HPLC metoda za simultano določevanje MPA in MPAG v krvni plazmi. Posledično se je razvila tudi avtomatizirana metoda. Uporabili so robotizirani sistem opremljen z dvema HPSPE (high-performance solidphase Pysections). Razvita sta bila tudi on-line HPLC-ja. V tem članku sta opisani tako ročna kot avtomatizirana metoda. Rezultati, ki so jih dobili avtorji tega članka pa kažejo na ekvivalentnost obeh metod. 2

6 Slika 2-1: Mikofenolat mofetil [1]. Slika 3-1: MPA [1]. Glukorinidna dinatrijeva sol mikofenolne kisline (MPAG). Slika 3-2: MPAG [1]. Interni standard I. (RS ) 3 EKSPERIMENTALNI DEL 3.1 Reagenti, topila, vzorci Mikofenolna kislina: (E)-6-2(1,3-dihidro-4-hidroksi-6-metoksi-7-metil-3-okso-5-izobenzofuranil)-4-metil-4- heksenoat. (E)-6-[1,3-dihidro-4-(4-karboksi-butoksi)-4-metoksi-7-metil-3-okso-5-izobenzofuranil]-4- metil-4-heksenojska kislina (Syntex Research; Palo Alto,CA, ZDA). Slika 3-3: Interni standard I. 3

7 Interni standard II. Natrijeva sol fenolftalein mono-β-glukuronske kisline (Sigma; St. Louis, MO, ZDA). Slika 3-4: Interni standard II. Metanol, acetonitril (kromatografsko čista, Burdick and Jackson Laboratories; Muskegon, MI, ZDA). Prečiščena voda (MiliQ- prečiščevalni sistem; Milipore, Bedford,MA, ZDA). Fosforna kislina (85%, reagentno čista), natrijev acetat, ledocetna kislina (analitsko čista), monobazni kalijev fosfat (KH 2 PO 4 ), 0,1M HCl in citronska kislina (Mallinckrodt, St Louis, MO, ZDA). Heparinizirano (dodan ji je bil heparin, sredstvo za preprečevanje strjevanja krvi) človeško plazmo so darovali zdravi prostovoljci v okviru klinične študije (Syntex Research, Palo Alto, CA, ZDA). Vodne raztopine 0,125M in 0,025M citronske kisline, 0,1M pufra natrijevega acetata (ph 4) in 0,025M kalijevega dihidrogen fosfata (KH 2 PO 4 ) so pripravili v svojem laboratoriju. 3.2 Kolone Ekstrakcijska kolona s trdno stacionarno fazo (Bond Elut and Bond Elut LRC), C 18, 3 cm 3, vsebuje 200 mg absorbenta (Varian Sample Preparation Products; Harbor City, CA, ZDA). 3.3 Aparatura (komponente sistema HPLC) Ročna metoda - HPLC kromatograf (Hewlett-Packard, model 1090 L), - terciarna črpalka, - avtomatski vzorčevalnik, 4

8 - UV-VIS detektor (Shimadzu SPD-10A; Shimazu Scientific Instruments, Columbia, MD, ZDA), - programska oprema (Nelson 6000 Laboratory Data sistem; P. E. Nelson, Cupertino, CA, ZDA). Avtomatizirana metoda - dva HPLC kromatografa (Hewlett-Packard, model 1050), - dva UV-VIS detektorja, vključena v robotiziran sistem za kromatografsko analizo. 3.4 Kromatografski pogoji (za določitev MPA in MPAG) Ročna metoda - injicirani alikvoti ekstraktov vzorcev: za MPA µl ter za MPAG µl, - dve ločeni 5-µm koloni (BDS Hypersil C 18, 250 x 4,6 mm za MPA in 150 x 4,6 mm za MPAG; Keystone Scientific, Bellefonte, PA, ZDA), - mobilna faza: mešanica acetonitrila in 0,05% fosforne kisline v razmerju 45:55 (v/v) pri pretoku 0,8 ml/min za MPA in v razmerju 21:79 (v/v) pri pretoku 1 ml/min za MPAG, - UV detektor: 254nm (tako za MPA kot za MPAG), - C 18 zaščitna kolona (Keystone Scientific, Bellefonte, PA, ZDA), - 0,5 µm predkolonski filter (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, ZDA). Zaščitna kolona in predkolonski filter sta bila nameščena pred analitsko kolono. Zamenjali so ju vsakih 200 do 500 injiciranj. Avtomatizirana metoda - dve injekcijski zanki (50 µl za MPA in 10 µl za MPAG), - kolona za določanje MPA: 150 x 4,6 mm, 5 µm, Adsorbosphere HS C 18 kolona; Alltech, Deerfield, IL, ZDA; mobilna faza je bila mešanica acetonitrila in 0,05% vodne raztopine fosforne kisline (39:61, v/v), pri pretoku 0,8 ml/min. 5

9 - Kolona za določanje MPAG: 150 x 4,6 mm, 5 µm, Keystone Scientific BDS Hypersil C 18 ; mobilna faza je bila mešanica acetonitrila in 0,05% vodne raztopine fosforne kisline (21:79, v/v), pri pretoku 0,8 ml/min. - UV detektor: 254 nm (tako za MPA kot za MPAG), - predkolonski filter (enak kot pri ročni metodi), - zaščitna kolona: Applied Biosystems Newguard RP-8, 15 x 3,2 mm; Rainin Instruments, Woburn MA, ZDA. 3.5 Robotiziran sistem Da bi avtomatizirali metodo določevanja MPA in MPAG so uporabili Zymark PyTechnology robotiziran sistem, opremljen z dvema ekstrakcijskima kolonama visoke ločljivosti (highperformance solid-phase extraction Zymark Pysections) ter dvema on-line HPLC kromatografoma. Robota so upravljali preko sistemskega Zymatovega V kontrolerja, ki bil povezan z računalnikom. Program za upravljanje le tega, je sestavilo podjetje Easilab. Komponente in podenote tega robotiziranega sistema so prikazane na sliki 3-5. Slika 3-5: Zymark Pytechnology robotiziran sistem in razporeditev posameznih podenot. [1] 6

10 3.6 Priprava vzorcev (ročna metoda) Priprava raztopin Začetne raztopine vzorcev so pripravili z raztapljanjem MPA in MPAG v metanolu. Da bi pripravili raztopine MPA koncentracij 0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 100 in 200 µg/ml ter raztopine MPAG konc. 20, 30, 50, 100, 200, 500, 1000 in 2000 µg/ml so te osnovne raztopine redčili z mešanico metanol-voda v razmerju 9:1 (v/v). Osnovne raztopine internih standardov so pripravili z raztapljanjem le teh v metanolu. Za pripravo raztopine internega standarda I. koncentracije 10 µg/ml ter internega standarda II. koncentracije 200 µg/ml so osnovne raztopine redčili z mešanico metanol-voda v razmerju 9:1 (v/v) na podoben način kot v pripravi raztopin MPA in MPAG. Za pripravo kalibracijskih standardov, ki so jih potrebovali, da so naredili umeritveno krivuljo ter za validacijo metode, so k 0,5 ml slepega vzorca človeške plazme dodali 0,1 ml vsake od raztopin MPA ter MPAG. Tako so dobili vzorce v koncentracijskem območju od 0,1-40 µg/ml za MPA ter µg/ml za MPAG Ekstrakcija standardov za kalibracijo K vsakemu kalibracijskemu standardu so dodali 1,5 ml vode, 0,1 ml raztopine internega standarda in 0,75 ml raztopine HCl (0,1 N). Vse skupaj so 10 s homogenizirali in nato nanesli na ekstrakcijsko kolono (C 18, trdna stacionarna faza). Ekstrakcijsko kolono so predhodno sprali z 2 ml metanola nato pa še z 2 ml vode. Mešanica plazme je potovala po koloni le zaradi vpliva gravitacije. Nato so kolono sprali z 1 ml vode. Eluat so ponovno nanesli na isto ekstrakcijsko kolono. Ko je ves eluat odtekel iz kolone so ga zavrgli. Spojine, ki so se absorbirale na kolono so eluirali z mešanico 1 ml metanola in 0,1 M acetatnega pufra (80:20, v/v; ph = 4). Eluat so zbirali v viali, ki so jo postavili v avtomatski vzorčevalnik, rahlo pomešali in alikvot injicirali v HPLC kromatograf. Analizo MPA in MPAG so lahko opravljali sekvenčno, tako da so uporabljali en HPLC sistem ali pa simultano, s tem da so en ekstrakt vzorca razdelili na dva dela in ju injicirali v dva ločena HPLC sistema. 7

11 3.6.3 Ekstrakcija kliničnih vzorcev Vzorce heparinizirane plazme, ki so jo darovali zdravi prostovoljci-pacienti, ki so uživali mikofenolat mofetil, so shranjevali pri 20 o C. Najprej so jih odtalili, jih pustili, da so se segreli na sobno temperaturo, nato so jih homogenizirali (vortex mixer, 30 s) in centrifugirali (5 min). Za analizo so uporabili od 0,5 do 5 ml izoliranega vzorca. Kadar so imeli na razpolago manj kot 0,5 ml vzorca, so k vzorcu dodali toliko vode, da je bil končni volumen 0,5 ml. Ekstrakcija, ki je sledila, je bila izvedena kot v postopku ekstrakcije kalibracijskih standardov. Koncentracije MPA in MPAG so izračunali na podlag umeritvenih krivulj, ki so jih naredili z analizo serije kalibracijskih standardov Obdelava podatkov in izračuni S pomočjo linearne regresije, metode najmanjših kvadratov, so konstruirali umeritveno krivuljo. Narisali so graf odvisnosti razmerja višin kromatografskih vrhov (višina vrha analita/ višina vrha internega standarda) v odvisnosti od koncentracije standarda. Standardne raztopine, ki so jih uporabili, so bile koncentracij za MPA od 0,1 do 1,0 µg/ml ter za MPAG 4,0 do 40 µg/ml. Da bi verificirali ekstrapolacijo umeritvene krivulje so uporabljali tudi standarde višjih koncentracij ( do 40 µg/ml za MPA ter do 400 µg/ml za MPAG). Vsak verifikacijski standard mora biti znotraj 10 % svoje nominalne vrednosti. S postopkom verificiranja zgornjega koncentracijskega območja kalibracijske krivulje, so se izognili vplivu prevladujočega efekta zgornjih točk na točke spodnjega koncentracijskega območja. Zaradi večjega koncentracijskega območja ni bilo potrebe po večkratnem redčenju vzorcev, da bi dobili koncentracije v konc. območju kalibracijske krivulje. Neka druga raziskovalna ekipa pa je imela možnost narediti umeritveno krivuljo z uporabo utežene linearne regresije. Koncentracije MPA in MPAG v neznanih vzorci so odčitali iz umeritvene krivulje. 8

12 h X / h IS c X c X / c IS Slika 3-6: Primer določanja neznane koncentracije vzorca po metodi internega standarda Priprava vzorcev za ugotavljanje pravilnosti metode Pripravili so raztopine MPA in MPAG izbranih koncentracij v človeški plazmi. Ti vzorci so služili za določanje pravilnosti metode. Shranjevali so jih pri temperaturi 20 o C. Pripravili so štiri vzorce, štirih različnih koncentracij ter slepi vzorec. Slepi vzorec so pripravili tako, da so MPA in MPAG raztopili v mešanici topil metanol-voda (1:1, v/v, do 9:1, v/v), nato pa so temu dodali še primerno količino slepega vzorca človeške plazme. Vse skupaj so rahlo pomešali (magnetno mešalo, 10 min) nato pa prelili v polipropilensko epruvetko in shranili pri 20 o C. Tabela 3-1: Koncentracije MPA in MPAG v posameznih kontrolnih vzorcih. vzorec koncentracija MPA [µg/ml] koncentracija MPAG [µg/ml] QCs 1 0,216 8,02 QCs 2 2,14 78,1 QCs 3 19,9 153 QCs 4 36, Priprava vzorcev (avtomatizirana metoda) Raztopine vzorcev MPA in MPAG so pripravili na podoben način kot je opisano pri pripravi vzorcev za ročno metodo. Razlika je bila v tem, da so raztopine MPAG redčili z mešanico topil metanola in vode v razmerju 1:9 (v/v), v prejšnjem primeru je bilo to razmerje 9:1 (v/v). Koncentracije internih standardov so bile 2.5 µg/ml za IS I. ter 50 µg/ml za IS II. K vsakemu vzorcu so dodali 400 µl izbranega internega standarda. 9

13 Tudi pri avtomatizirani metodi so za kalibracijo uporabljali standardne raztopine z koncentracijami MPA 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5 in 2.0 µg/ml (za ekstrapolacijo so uporabili vzorce z konc. MPA 10 in 40 µg/ml) ter MPAG 4, 6, 10, 20, 30, 40, 60 in 100 µg/ml (za ekstrapolacijo so uporabili vzorce z konc. MPAG 200 in 400 µg/ml). Vzorci za ugotavljanje pravilnosti metode so bili pripravljeni na enak način kot pri ročni metodi. Pripravo samega vzorca so prilagodili, tako da jo je lahko izvajal robot. Za nakisanje plazme so uporabili 0,125 M vodno raztopino citronske kisline, namesto HCl. Ekstrakcijske kolone so najprej sprali z 2 ml vode in 4 ml 0,025M citronske kisline. MPA in MPAG so nato iz kolon eluirali z 3 ml raztopine, ki je vsebovala mešanico metanola in 0,1 M acetatnega pufra ( 80:20, v/v) s ph 4 (pretok 1,3 ml/min). Pri ročni metodi so bili vzorci obdelani kot šarža pri robotiziranem postopku pa so vzorci obdelani serijsko. 4 REZULTATI IN DISKUSIJA Opravljeni so bili naslednji testi za validacijo posamezne metode določevanja MPA in MPAG: meja kvantifikacije, preciznost in natančnost, specifičnost posamezne metode, linearnost, vpliv volumna in stabilnost. Na osnovi teh testov so nato lahko obe metodi primerjali in določili, če sta ustrezni za rutinsko določevanje želenih spojin v vzorcih plazme. 4.1 Meja kvantifikacije Meji kvantifikacije sta tako za ročno kot robotizirano metodo enaki. Za MPA znaša 0,100 µg/ml ter za MPAG 4,00 µg/ml pri volumnu vzorca - plazme 0,5 ml. Koncentracije pod temi vrednostmi so smatrane kot koncentracije pod mejo kvantifikacije (BQL). Na meji kvantifikacije je bilo razmerje signal/šum 8:1 za MPA in 35:1 za MPAG. 10

14 4.2 Preciznost in točnost Točnost se nanaša na ujemanje merskih rezultatov z dogovorjeno pravo vrednostjo. Odstopanja so lahko vzrok sistematične in naključne napake. Preciznost metod tako ročne kot avtomatizirane so določevali s pomočjo koeficientov variacije (CV, %). Relativni standardni odmik RSD izražen v % imenujejo v statistiki koeficient variacije. s CV = RSD 100 = 100(%) x 4.3 Specifičnost Pri analizi šestih različnih vzorcev človeške plazme, na kromatogramih ni bilo opaznih nobenih motečih vrhov v območju kjer se nahajata vrha za MPA in MPAG. Testirali so tudi različna zdravila, ki se souporabljajo pri zdravljenju z MPA, pri enakih pogojih kromatografskih kot MPA in MPAG. Prav tako ni bilo zaznati nobenih motečih vrhov na dobljenem kromatogramu. A B C Slika 4-1: Tipični kromatogrami ki so jih dobili pri analizi MPA v (A) slepemu vzorcu plazme; (B) v slepemu vzorcu plazme, ki mu je bila dodana MPA koncentracije 0,100 µg/ml; (C) v vzorcu plazme pacienta, ki uživa dvakrat dnevno 1500 mg mikofenolata mofetila, eno uro po zaužitju. 11

15 Pri nekaterih vzorcih plazme pacientov, ki uživajo to učinkovino, je bilo opaziti še en kromatografski vrh na kromatogramu. Predstavljal je neko nedefinirano endogeno substanco, ki je lahko nastala kot posledica delovanja metabolizma. Te interference so odpravili tako, da so spremenili vsebnost acetonitrila v mobilni fazi za približno 2 %. Če pa so se interference še kljub temu pojavljale C so uporabili mobilno fazo drugačne sestave A B Slika 4-2: Tipični kromatogrami ki so jih dobili pri analizi MPAG v (A) slepemu vzorcu plazme; (B) v slepemu vzorcu plazme, ki mu je bila dodana MPAG koncentracije 4 µg/ml; (C) v vzorcu plazme pacienta, ki uživa dvakrat dnevno 1500 mg mikofenolata mofetila, eno uro po zaužitju. 4.4 Linearnost Območje linearnosti je tako za ročno kot avtomatizirano metodo 0, µg na alikvot plazme za MPA ter 2, µg za MPAG. 12

16 4.5 Vpliv volumna Včasih je pomembna tudi količina razpoložljivega vzorca za analizo. Preverjali so kakšne so optimalne količine vzorcev, ki še dajejo dobre rezultate. Efekt vpliva spremembe volumna na rezultate so študirali z uporabo vzorcev, ki so jih uporabljali tudi za določitev pravilnosti metode (QC).Tako pri ročni kot avtomatizirani metodi so ugotovili, da so optimalni volumni med 0,05 do 0,5 ml tako za določevanje MPA kot MPAG. 4.6 Stabilnost Za določevanje stabilnosti vzorcev MPA in MPAG so pripravili raztopine, ki so bile označene z radioaktivnim izotopom 14 C. Takšne raztopine [ 14 C]MPA in [ 14 C]MPAG so ločeno vnesli v pravkar odvzete vzorce človeške plazme ter jih opazovali pri sobni temperaturi (20-23 o C) in pri temperaturi od 1 do 4 o C. Opazili so da so vzorci pri sobni temperaturi stabilni 4 ure pri 1-4 o C pa najmanj osem ur. Z uporabo radioaktivne označitve vzorcev so lahko določili koliko analita se je porazgubilo zaradi razpada in koliko ga je prešlo v celice. Uporabili so scintilacijski števec za ugotavljanje radioizotopov, ki se nahajajo v raztopini. Aparat povzroča iskrenje (scintillation = iskrenje, svetlikanje, bliskanje) pri dotiku z ioniziranim delcem ali fotonom elektromagnetnega sevanja. Oddano svetlobo ujame ojačevalec, jo spremeni v električni impulz, ga ojača in usmeri preko merilca, ki šteje impulze. V biologiji se uporablja predvsem za 14 C in 35 S, ki sta šibka beta oddajalca ter za 3 H kot zelo šibak beta-oddajalec. Pri pogojih kjer so vzorci stabilni je bila ugotovljena zanemarljivo majhna izguba analita zaradi porazdelitve MPA in MPAG v celice. Pri vzorcih, ki so bili pripravljeni za ugotavljanje kvalitete so ugotovili, da ostanejo nespremenjeni, če jih shranjujemo v zamrzovalniku pri -20 o C tudi do enajst mesecev. Trikrat jih lahko odtalimo in ponovno zamrznemo. Če iz plazme ekstrahiramo MPA in MPAG, lahko ekstrakt hranimo pri sobni temperaturi, pri normalnih laboratorijskih pogojih, tudi do šest dni. Če pa imamo vzorce ekstraktov v hladilniku pa tudi do dva tedna. Ko so z avtomatizirano metodo določevali koncentracije MPA in MPAG v QC vzorcih, ki so jih hranili v hladilniku in tistih, ki so bili na sobni temperaturi devet dni so dobili enake rezultate za oba vzorca. 13

17 4.7 Primerjava ročne in avtomatizirane metode Meje kvantifikacije so bile identične tako za avtomatizirano kot za ročno metodo. Ob študiju problematike določanja MPA in MPAG v kliničnih vzorcih je bilo odvzetih triinštirideset vzorcev plazme. Vsebnosti MPA in MPAG so določali po obeh metodah. Dva seta podatkov, ki so jih dobili z analizo po obeh metodah, so primerjali z uporabo metode linearne regresije. Premica, ki so jo dobili je imela korelacijski koeficient blizu ena, kar nakazuje na odlično ujemanje rezultatov (slika 4-3). A B Slika 4-3: Primerjava rezultatov ročne in avtomatizirane analize. (A) MPA v plazmi; y = -0, x; r = 0,9995. (B) MPAG v plazmi; y = 0, ,9959x; r = 0, Uporaba Raziskovane metode so uporabili za analizo vzorcev plazme zdravih prostovoljcev in pacientov, ki so jim presadili kakšen organ in se sedaj zdravijo z mikofenolat mofetilom. Na siki 4-4 je prikazano kako se spreminja koncentracija MPA in MPAG s časom, pri pacientu, ki se zdravi z to učinkovino. 14

18 Slika 4-4: Odvisnost koncentracije MPA in MPAG v plazmi od časa pri pacientu, ki so mu pred kratkim presadili ledvico. Sedaj uživa 1500 mg mikofenolat mofetila dvakrat dnevno v obliki tablet. - MPA; MPAG. 5 ZAKLJUČEK Tako ročna kot avtomatizirana metoda, ki so ju v tem članku raziskovali, sta primerni za določevanje MPA in MPAG v plazmi. Sta precizni in natančni. Lahko se uporabljata v namen kliničnih raziskav, določanja MPA in MPAG pri pacientih po presaditvi organov, ki se zdravijo z mikofenolat mofetilom. Obe metodi sta ekvivalentni. 6 LITERATURA 1. I. Tisna, F. Chu, K. Hama: Manual and automated (robotic) high-performance liquid chromatography metods for the determination of mycophenolic acid and its glucuronide conjugate in human plasma, Journal of Chromatography B, 675 (1996)