UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO PETER GRDEŠIČ

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO PETER GRDEŠIČ RAZVOJ IN VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA SOČASNO DOLOČANJE PLAZEMSKIH KONCENTRACIJ PROTIEPILEPTIČNIH UČINKOVIN DRUGE GENERACIJE S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF SECOND GENERATION ANTIEPILEPTIC DRUGS IN PLASMA BY LIQUID CHROMATOGRAPHY DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana, 2011

2 Diplomsko nalogo sem opravljal na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom doc. dr. Tomaža Vovka. ZAHVALA Za mentorstvo in pomoč pri delu se iskreno zahvaljujem doc. dr. Tomažu Vovku. Hvala tudi vsem sodelavcem Katedre za biofarmacijo in farmakokinetiko, ki so mi s svojimi nasveti pomagali pri izdelavi diplomske naloge. Zahvaljujem se svojim staršem in bratom, punci Kristini in njeni družini ter prijateljem in sošolcem/sošolkam za podporo na moji študijski poti. IZJAVA Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelal pod mentorstvom doc. dr. Tomaža Vovka. Peter Grdešič Ljubljana, julij 2011 Predsednica diplomske komisije: prof. dr. Janja Marc Član diplomske komisije: doc. dr. Janez Ilaš

3 Vsebina Vsebina 1. Uvod Epilepsija Zdravljenje epilepsije Protiepileptična zdravila 1. generacije Protiepileptična zdravila 2. generacije Protiepileptična zdravila 3. generacije Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil (TDM) Referenčno in terapevtsko območje Klinične indikacije za terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil TDM novejših protiepileptičnih zdravil Določanje antiepileptikov v bioloških vzorcih Derivatizacijske metode za fluorescenčno detekcijo Namen dela Materiali in metode Materiali Biološki material Standardi Reagenti in topila Naprave in pribor Metode Priprava osnovnih raztopin, reagentov in pufrov Izbira internega standarda Priprava plazemskih vzorcev Ekstrakcija na trdnih nosilcih (SPE) in njena optimizacija Optimizacija derivatizacije I

4 Vsebina Razvoj kromatografije (HPLC) Validacija metode Aplikacija metode na realne vzorce in primerjava metod Rezultati Izbira internega standarda Ekstrakcija na trdnih nosilcih (SPE) in njena optimizacija Optimizacija derivatizacije Razvoj kromatografije (HPLC) Končna optimizirana metoda Validacija metode Linearnost Točnost Ponovljivost Območje Meja kvantifikacije Selektivnost Robustnost Uspešnost ekstrakcije Postpreparativna stabilnost Aplikacija metode na realne vzorce in primerjava metod Razprava Izbira internega standarda Ekstrakcija na trdnih nosilcih (SPE) in njena optimizacija Optimizacija derivatizacije Razvoj kromatografije (HPLC) Validacija metode Linearnost in območje Točnost Ponovljivost Meja kvantifikacije II

5 Vsebina Selektivnost Robustnost Uspešnost ekstrakcije Postpreparativna stabilnost Aplikacija metode na realne vzorce in primerjava metod Sklepi Literatura III

6 Povzetek Povzetek V diplomski nalogi smo razvili metodo s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti in fluorescenčno detekcijo za sočasno določanje plazemskih koncentracij štirih antiepileptikov druge generacije, in sicer vigabatrina, topiramata, pregabalina in gabapentina. Po ekstrakciji plazemskih vzorcev na trdnih nosilcih Oasis MCX smo le-te derivatizirali s 7-kloro-4- nitrobenzofurazanom v prisotnosti metanola, acetonitrila in boratnega pufra (250 mm; ph=10,5), saj analiti v svoji strukturi ne vsebujejo kromoforov oz. ne fluorescirajo. Analite smo nato ločili na koloni Eclipse plus C18 (150 x 4,6 mm 5 µm) z izokratsko mobilno fazo iz metanola (43 %) in 50 mm fosfatnega pufra ph = 4,90 (57 %) ter jih detektirali pri λ em = 530 nm (λ ex = 470 nm). Pretok mobilne faze je bil 1,5 ml/min, kolono pa smo termostatirali pri 45 C. Kot interni standard smo uporabili p-fluoro-dl-fenilalanin. Metoda je bila linearna v območju 0,375-30,0 μg/ml za vigabatrin, pregabalin in gabapentin oz. 0,50-20,0 μg/ml za topiramat. Spodnja meja kvantifikacije za vigabatrin, pregabalin in gabapentin je bila 0,375 μg/ml, za topiramat pa 0,50 μg/ml. Metoda se je izkazala kot točna (vsa odstopanja 15 %, razen drugi dan pri najvišjem kontrolnem vzorcu topiramata), ponovljiva (koeficient variance je bil 11,9 % pri znotrajdnevni oz. 9,85 % pri meddnevni ponovljivosti) in selektivna v prisotnosti učinkovin, ki jih bolniki pogosto sočasno jemljejo. Študija robustnosti metode je pokazala, da je kromatografski del analizne metode bolj robusten od priprave vzorcev, pri čemer sta najbolj občutljiva topiramat in vigabatrin. Izkoristki ekstrakcije so bili relativno visoki (>80 %) in ponovljivi (za vigabatrin, pregabalin in gabapentin je bil koeficient variance izkoristkov 3,33 %, za topiramat pa 9,44 %). Derivatizirani plazemski vzorci topiramata, pregabalina in gabapentina so bili stabilni najmanj 24 ur, če so bili hranjeni v avtomatskem vzorčevalniku pri 4 C (povprečni odziv se ni spremenil več kot 6,2 %). Derivatizirani plazemski vzorci vigabatrina pa so bili pod temi pogoji stabilni le 6 ur (povprečni odziv se je v tem času povečal za približno 10 %). Po validaciji smo metodo aplicirali na realne vzorce bolnikov z epilepsijo, ki prejemajo topiramat. Rezultati so se dobro ujemali z rezultati, dobljenimi s predhodno razvito metodo za topiramat, pri kateri so kot derivatizacijski reagent uporabili 9-fluorenilmetil kloroformat (povprečna razlika v koncentraciji med obema metodama -0,07982 μg/ml, 95 % interval ujemanja od -1,478 do 1,318 μg/ml). Metoda je primerna za terapevtsko spremljanje koncentracij omenjenih antiepileptikov v plazmi. IV

7 Abstract Abstract A new high-performance liquid chromatographic method with fluorescence detection was developed for the simultaneous determination of four second generation antiepileptic drugs vigabatrin, topiramte, pregabalin and gabapentin in plasma. After solid phase extraction of plasma samples with Oasis MCX cartridges, derivatization of the samples was performed with 4-chloro-7-nitrobenzofurazan in the presence of methanol, acetonitrile and borate buffer (250 mm; ph = 10,5). The analytes were separated on an Eclipse plus C18 (150 x 4,6 mm 5 µm) column with an isocratic mobile phase composed of methanol (43 %) and 50 mm phosphate buffer ph = 4,90 (57 %) and detected at λ em = 530 nm (exciting at λ ex = 470 nm). The column oven temperature was set at 45 C and the mobile phase was pumped a t a flow rate of 1,5 ml/min. p-fluoro-dl-phenylalanine was used as the internal standard. Linearity was found in the 0,375-30,0 μg/ml range for vigabatrin, pregabalin and gabapentin and in the 0,50-20,0 μg/ml range for topiramate. Lower limit of quantification of 0,375 μg/ml was obtained for vigabatrin, pregabalin and gabapentin and of 0,50 μg/ml for topiramate. Method was accurate (relative error 15 %, except on the second day at the highest Quality Control sample of topiramate), precise (the coefficient of variation values of both intra- and inter-day analysis were 11,9 %) and selective in the presence of commonly co-administrated drugs. The robustness study showed that the chromatographic part of the method is more robust than the sample preparation, where topiramate and vigabatrin are affected most by the changes in parameters. Extraction yields were relatively high (> 80 %) and precise (the coefficient of variation values of extraction yields were 3,33 % for vigabatrin, pregabalin and gabapentin and 9,44 % for topiramate). Derivatized plasma samples of topiramate, pregabalin and gabapentin were stable for at least 24 h when stored in the autosampler at 4 C ( 6,2 % from initial response). Derivatized plasma samples of vigabatrin were stable for only 6 h when stored under these conditions (+10 % from initial response). After validation, the method was applied to plasma samples from patients undergoing therapy with topiramate. There was a good agreement with the results obtained by previously developed method for determination of topiramate using 9-fluorenylmethyl chloroformate as derivatization agent (mean difference of -0,07982 μg/ml, 95 % limits of agreement from -1,478 to 1,318 μg/ml). Therefore, the method is suitable for the therapeutic drug monitoring of mentioned drugs in plasma. V

8 Seznam okrajšav Seznam okrajšav AED protiepileptična zdravila CV koeficient variance EEG elektroencefalogram FDA Ameriška agencija za hrano in zdravila (Food and Drug Administration) FLD fluorescenčni detektor FMOC 9-fluorenilmetil kloroformat GABA γ-aminobutirna kislina Gaba gabapentin GC plinska kromatografija GIT gastrointestinalni trakt HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti ILAE Mednarodna liga proti epilepsiji (International League Against Epilepsy) IS interni standard Konc. koncentracija LLOQ spodnja limita kvantifikacije LOD limita detekcije MF mobilna faza MS masni spektrometer NBD-Cl 7-kloro-4-nitrobenzofurazan NBD-F 7-fluoro-4-nitrobenzufurazan OSR osnovna standardna raztopina Povp. povprečje Preg pregabalin QC kontrolni vzorci SD standardni odklon SPE ekstrakcija na trdnih nosilcih (Solid Phase Extraction) T temperatura TDM terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil (Therapeutic Drug Monitoring) Točn. točnost VI

9 Seznam okrajšav TOC celokupni organski ogljik (total organic carbon) Topi topiramat UV ultravijolično Viga vigabatrin λ em emisijska valovna dolžina λ ex ekscitacijska valovna dolžina VII

10 Uvod 1. Uvod 1.1. Epilepsija Epilepsija je skupina možganskih okvar, za katero so značilni trajna predispozicija za nastanek epileptičnih napadov in nevrobiološke, kognitivne, psihološke ter socialne posledice tega stanja, ki velikokrat predstavljajo problem za bolnika, njegovo družino in družbo. Definicija epilepsije zahteva pojav vsaj enega epileptičnega napada. Epileptični napad je definiran kot prehoden pojav znakov in simptomov (konvulzije, motnje zavesti, nenavadne čutne zaznave itd.) zaradi nenormalne aktivnosti nevronov v možganih (1). V razvitih državah ima epilepsijo med 0,5 in 1 % populacije, v nerazvitih državah pa je lahko prevalenca še višja (2). Incidenca epileptičnih napadov ima dva vrha, in sicer prvega doseže v prvih dveh desetletjih življenja, drugega pa po 65. letu starosti (3). Klasifikacija epileptičnih napadov po Mednarodni ligi proti epilepsiji (International League against Epilepsy, ILAE) obsega dve glavni skupini, in sicer generalizirane epileptične napade in fokalne/žariščne epileptične napade. Tretja skupina je za primere, ko ni na voljo dovolj informacij za uvrstitev napada v eno izmed obeh glavnih kategorij (2,4). Preglednica I prikazuje klasifikacijo epileptičnih napadov po organizaciji ILAE (5). Preglednica I: Klasifikacija epileptičnih napadov po organizaciji ILAE (5) GENERALIZIRANI EPILEPTIČNI NAPADI (ob nastanku napada le-ta zajema obe možganski hemisferi; običajno pride do motnje/izgube zavesti) o o o o o o TONIČNI-KLONIČNI NAPADI ABSENCE TIPIČNE ATIPIČNE ABSENCE S POSEBNIMI LASTNOSTMI MIOKLONIČNE ABSENCE MIOKLONIJA VEK MIOKLONIČNI NAPADI MIOKLONIČNI MIOKLONIČNI ATONIČNI MIOKLONIČNI TONIČNI KLONIČNI NAPADI TONIČNI NAPADI ATONIČNI NAPADI FOKALNI/ŽARIŠČNI EPILEPTIČNI NAPADI (napad se začne v določenem predelu ene hemisfere možganov; če se napad začne v oz. sekundarno razširi na retikularno formacijo, pride do motnje/izgube zavesti) o Za nadaljno opredelitev fokalnih napadov ILAE predlaga oporabo nekaterih specifičnih deskriptorjev, kot so npr. stanje zavesti idr. NEZNANI (epileptični krči) 1

11 Uvod Od pravilne klasifikacije epileptičnih napadov je odvisna identifikacija epilepsije oz. epileptičnega sindroma in izbira ustreznega antiepileptičnega zdravljenja ter prognoza (2). Epilepsije oz. epileptični sindromi niso okarakterizirani le z epileptičnimi napadi, ampak tudi z nekaterimi drugimi lastnostmi, kot so starost, pri kateri se pojavi epileptični napad, etiologija, vzorci elektroencefalograma (EEG), družinska predispozicija, odziv na zdravila itd. Organizacija ILAE deli epileptične sindrome glede na nivo specifičnosti in natančnosti diagnoze, znotraj teh nivojev pa glede na starost, pri kateri se pojavi napad idr. (2,4,5). Preglednica II prikazuje klasifikacijo epilepsij oz. epileptičnih sindromov po organizaciji ILAE (5). Preglednica II: Klasifikacija epilepsij oz. epileptičnih sindromov po organizaciji ILAE (5) ELEKTROKLINIČNI SINDROMI, UREJENI GLEDE NA STAROST, PRI KATERI SE POJAVI NAPAD (klinična stanja, za katera je značilna skupina kliničnih lastnosti, znakov in simptomov, ki skupaj omogočajo zanesljivo specifično in natančno diagnozo) o o o o o OBDOBJE PO ROJSTVU (zgodnja mioklonična encefalopatija ) DOJENČKI (Westov sindrom ) OTROŠTVO (epilepsije z miokloničnimi atoničnimi napadi ) ADOLESCENCA-ODRASLA DOBA (juvenilna mioklonična epilepsija ) NESPECIFIČNO GLEDE NA STAROST KLINIČNO RAZLOČNA UREDITEV (klinična stanja, ki so dovolj razločno identificirana na osnovi specifičnih lezij in ostalih vzrokov, vendar še ne sodijo med elektroklinične sindrome) o Rasmussenov sindrom EPILEPSIJE, KI SO POSLEDICA STRUKTURNEGA/METABOLIČNEGA VZROKA (tumor, infekcija, travma, možganska kap ) EPILEPSIJE, ZA KATERE VZROK NI ZNAN (najnižja raven specifičnosti in natančnosti diagnoze, saj je njihovo razumevanje zaenkrat preslabo) STANJA Z EPILEPTIČNIMI NAPADI, KI JIH NE SMATRAMO KOT EPILEPSIJE KOT TAKE (fibrilni napadi ) 1.2. Zdravljenje epilepsije Namen zdravljenja je preprečiti nadaljnje epileptične napade in ohraniti kakovost življenja s protiepileptičnim zdravilom (AED), ki ima čim manj neželenih učinkov. Zdravljenje mora biti individualno. Pri izbiri ustreznega zdravljenja se morajo upoštevati lastnosti posameznega AED (spekter delovanja, neželeni učinki, kontraindikacije...) in lastnosti bolnika (spol, starost, 2

12 Uvod tip napada in sindroma, sočasno jemanje drugih zdravil...). Če je zdravljenje optimalno, lahko pričakujemo prenehanje napadov pri približno 70 % bolnikov. Nasprotno lahko nepravilna izbira in uporaba AED celo poslabša klinično stanje oz. sproži nastanek novih napadov. Ker se okrog 30 % bolnikov ne odziva na zdravljenje z nobenim trenutno uveljavljenim AED, je potreba po novih bolj učinkovitih in varnih AED velika. Idealno AED bi imelo naslednje farmakokinetične in farmakodinamične lastnosti: odsotnost neželenih učinkov, preprečevanje širšega spektra epileptičnih napadov, popolna absorpcija, linearna kinetika, dolg eliminacijski razpolovni čas, čim šibkejša vezava na serumske proteine, odsotnost aktivnih metabolitov, izločanje skozi ledvice in čim manj interakcij z drugimi zdravili. V zadnjih 20 letih so se uveljavila številna novejša AED. Danes poznamo tri generacije AED (4,6) Protiepileptična zdravila 1. generacije Med predstavnike AED 1. generacije spadajo fenobarbital, fenitoin, etosuksimid, karbamazepin, valprojska kislina, klonazepam in klobazam. Najstarejši, še vedno pogosto uporabljani, predstavnik je fenobarbital, katerega antiepileptične učinke so opazili že leta Glede natančnih mehanizmov delovanja posameznih AED je še vedno veliko nejasnosti. Večina AED deluje na več tarč in največkrat se ne ve, katera je najpomembnejša za protiepileptični učinek. Nekatera starejša AED delujejo predvsem preko blokade napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov, ki so nujni za nastanek in širjenje akcijskega potenciala (fenitoin, karbamazepin), drugi delujejo preko modulacije delovanja kalcijevih kanalčkov (etosuksimid), tretji pa preko ojačanja z γ -aminobutirno kislino (GABA) posredovanega inhibitornega odgovora (fenobarbital, valprojska kislina, benzodiazepini). Slabost AED 1. generacije so pogosti in številni neželeni učinki ter njihova farmakokinetika. To dejstvo predstavlja problem za bolnike, saj morajo v večini primerov jemati AED doživljenjsko. Najpomembnejši neželeni učinki so sedacija (fenobarbital, benzodiazepini), ataksija (fenitoin, karbamazepin), preobčutljivostne reakcije (fenitoin, karbamazepin, etosuksimid), hepatotoksičnost (karbamazepin, valprojska kislina), vedenjske motnje itd. Številna starejša AED, ki se presnavljajo v jetrih, inducirajo jetrne mikrosomalne encime in tako pospešujejo razgradnjo mnogih sočasno predpisovanih zdravil. Valprojska kislina pa 3

13 Uvod ravno nasprotno zviša serumske koncentracije nekaterih zdravil, saj zavira metabolne procese v jetrih. AED 1. generacije se tudi v veliki meri vežejo na plazemske proteine in imajo daljši razpolovni čas. Za fenitoin je značilna tudi saturacijska (nelinearna) kinetika (4,6,7) Protiepileptična zdravila 2. generacije Med predstavnike AED 2. generacije spadajo lamotrigin, felbamat, gabapentin, vigabatrin, topiramat, tiagabin, okskarbazepin, levetiracetam, pregabalin in zonisamid. Mehanizem delovanja je podoben kot pri AED 1. generacije: Blokada napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov: okskarbazepin, lamotrigin, topiramat, zonisamid in felbamat Modulacija kalcijevih kanalčkov: levetiracetam, pregabalin, zonisamid in topiramat Ojačanje z GABA-o posredovanega inhibitornega odgovora: vigabatrin in tiagabin Nekatera novejša AED delujejo tudi na druge tarče, npr. inhibicija sproščanja glutamata (lamotrigin) in blokada receptorjev za glutamat (felbamat). Glutamat je glavni ekscitatorni nevrotransmiter v možganih. Klinične študije so pokazale, da je učinkovitost novejših AED primerljiva s starejšimi, ob tem pa imajo novejši AED manj neželenih učinkov, manj interakcij z drugimi zdravili, manjši vpliv na kognitivne funkcije, se manj vežejo na plazemske proteine in se v večji meri izločajo skozi ledvice. Zato jih bolniki lažje prenašajo (4,6,7,8) Vigabatrin Vigabatrin (slika 1) je analog GABA-e, ki ireverzibilno inhibira GABA-transaminazo. Ta encim je odgovoren za razgradnjo GABA-e v nevronih. Na ta način vigabatrin poveča koncentracijo GABA-e v možganih. Učinkovit je predvsem pri zdravljenju Westovega sindroma pri dojenčkih (monoterapija) in fokalnih epileptičnih napadov (dodatna terapija). Farmakokinetika vigabatrina je linearna, poleg tega pa se ne Slika 1: Vigabatrin veže na plazemske proteine, se ne metabolizira, se v celoti izloči nespremenjen z urinom in nima znanih interakcij z ostalimi zdravili in AED. 4

14 Uvod Pogost neželen učinek vigabatrina je zožitev vidnega polja (velikokrat ireverzibilno), zato se v mnogih primerih opušča. Vseeno pa je zdravilo izbire pri krčih pri dojenčkih (Westov sindrom), kjer je korist zdravljenja za normalen razvoj dojenčka večja od tveganja za pojav neželenih učinkov (6,9) Topiramat Topiramat (slika 2) je sulfamatno substituiran monosaharid, ki inhibira napetostno odvisne natrijeve kanalčke in napetostno odvisne kalcijeve kanalčke tipa L, ojača z GABA-o posredovan inhibitorni odgovor ter zmanjša z glutamatom posredovan ekscitatorni odgovor oz. nevrotransmisijo. Učinkovit je proti širokemu spektru epileptičnih napadov (fokalni napadi, generalizirani tonični-klonični in mioklonični napadi). Posebno mesto ima tudi pri zdravljenju rezistentnih oblik epilepsije, ko ostala zdravila niso učinkovita. Je zdravilo izbora pri bolnikih z Lennox-Gastautovim sindromom. Uporabljamo ga lahko kot začetno monoterapijo pri novodiagnosticirani epilepsiji. Ugodno deluje tudi pri preprečevanju migrenskih glavobolov. Farmakokinetika topiramata je linearna, poleg tega pa se ga le 15 % veže na plazemske proteine. Le Slika 2: Topiramat manjši del se ga presnavlja do neaktivnih metabolitov % se ga izloči skozi ledvice nespremenjenega. Pogosti neželeni učinki topiramata so upočasnjena psihomotorika, utrujenost, sedacija, kognitivne spremembe, upad telesne teže, povečano tveganje za nastnek ledvičnih kamnov, ataksija, zamegljen vid, glavkom itd. Topiramat je teratogen (6,9) Pregabalin Pregabalin je analog GABA-e, ki se veže na α2δ podenoto napetostno odvisnih kalcijevih kanalčkov, s čimer zmanjša sproščanje nevrotransmiterjev in nevronsko aktivnost. Na GABA in njene receptorje nima vpliva, kljub strukturni podobnosti. Uporablja se kot dodatna terapija pri fokalnih/žariščnih napadih, predvsem v primerih, ko so ostale kombinacije neučinkovite. Učinkovit je tudi pri zdravljenju nevropatske bolečine in deluje anksiolitično. 5

15 Uvod Farmakokinetika pregabalina je linearna, poleg tega pa se ne veže na plazemske proteine. Metabolizira se manj kot 2 % in se v 98 % izloči nespremenjen z urinom. Njegove interakcije z ostalimi zdravili in AED niso znane. Slika 3: Pregabalin Pogosti neželeni učinki pregabalina so ataksija, utrujenost, zmedenost, zamegljen vid, motnje koordinacije, erektilna disfunkcija itd. (6,9) Gabapentin Gabapentin je analog GABA-e z enakim mehanizmom delovanja kot pregabalin, a ima šibkejši učinek. Zato je njegova vloga pri zdravljenju fokalnih/žariščnih napadov omejena. Bolj pogosto se uporablja za zdravljenje nevropatske bolečine. Farmakokinetika gabapentina ni linearna zaradi nasitljive absorpcije. Posledica tega je tudi nizka biološka uporabnost (60 %), ki se pri višjih odmerkih še dodatno zniža. Prednost tega je relativna varnost pred previsokimi toksičnimi odmerki. Gabapentin se ne veže na plazemske proteine, se Slika 4: Gabapentin ne metabolizira in se v celoti izloči nespremenjen z urinom. Pogosti neželeni učinki gabapentina so ataksija, omotičnost, utrujenost, zamegljen vid, povečan apetit itd. (6,9) Protiepileptična zdravila 3. generacije Farmacevtska podjetja so v zadnjem času izdelala okrog 20 novih AED. Med te sodijo brivaracetam, karabersat, karisbamat, DP-valprojska kislina, eslikarbazepin acetat, fluorofelbamat, fosfenitoin, ganaksolon, lakozamid, losigamon, remacemid, retigabin, rufinamid, safinamid, seletracetam, soretolid, stiripentol, talampanel in valrocemid. Podjetja so do njih prišla s strukturno modifikacijo že obstoječih ''starševskih'' AED in rešetanjem številnih substanc na različnih eksperimentalnih modelih. Namen je bil dobiti bolj učinkovita zdravila z manj neželenimi učinki, ki bi delovala tudi na sam potek bolezni oz. epileptogenezo in ne samo na nastanek epileptičnih napadov. Nekatera od teh so že na trgu v nekaterih 6

16 Uvod državah (eslikarbazepin acetat, fosfenitoin, lakozamid, retigabin, rufinamid, stiripentol), tudi v Sloveniji, druga pa so še v fazi kliničnih raziskav (10) Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil (TDM) Zdravljenje epilepsije je bilo eno prvih področij, ki je doseglo velik napredek s pomočjo farmakokinetičnih študij in uporabo TDM (Therapeutic Drug Monitoring). TDM je meritev in spremljanje koncentracij zdravil v bioloških vzorcih, s pomočjo katerega se določi individualen režim odmerjanja zdravila, prilagojen vsakemu pacientu posebej. Koncentracije se najpogosteje določajo v serumu ali plazmi, lahko pa tudi v polni krvi, slini, urinu, cerebrospinalni tekočini, solzah ali laseh. Individualizacija odmerjanja AED je ključnega pomena za njihovo optimalno učinkovitost pri preprečevanju epileptičnih napadov in zmanjšanje pojava neželenih učinkov. Koncept in uporabnost TDM temelji na predpostavki, da farmakološki učinek boljše korelira s koncentracijo zdravila v telesu kot z odmerkom. Klinična uporabnost TDM je torej v veliki meri odvisna od farmakoloških lastnosti zdravila. TDM je primerno za učinkovine, ki izkazujejo naslednje lastnosti: nelinearen odnos med odmerkom in plazemsko koncentracijo (fenitoin) velika interindividualna variabilnost (nepredvidljivost) v farmakokinetiki intraindividualna variabilnost v farmakokinetiki zaradi interakcij z drugimi zdravili znan odnos med plazemsko koncentracijo zdravila in terapevtskim/toksičnim učinkom ozko referenčno koncentracijsko območje reverzibilen mehanizem delovanja brez razvoja tolerance neaktivni metaboliti (razen, če določamo tudi aktivne metabolite) Za zdravila, pri katerih se razvije toleranca, imajo ireverzibilen mehanizem delovanja ali aktivne metabolite, je značilna manjša korelacija med koncentracijo in učinkom. Za takšna zdravila je TDM manj primerno. Primernost TDM je manjša tudi pri zdravilih s širokim referenčnim območjem in bolj predvidljivo farmakokinetiko (če se v celoti izločijo nespremenjena skozi ledvice, se ne vežejo na serumske proteine...) (11). 7

17 Uvod Referenčno in terapevtsko območje Za razumevanje koncepta TDM sta pomembna dva pojma, in sicer referenčno območje in terapevtsko območje. Referenčno območje je definirano kot koncentracijsko območje, znotraj katerega je zdravljenje optimalno za večino bolnikov. Zanj sta značilna spodnja meja, pod katero je terapevtski učinek malo verjeten, in zgornja meja, nad katero so toksični učinki zelo verjetni. Potrebno pa se je zavedati, da je pri mnogih bolnikih zaradi individualne variabilnosti zdravljenje lahko optimalno tudi zunaj referenčnega območja. Referenčno območje torej ni vedno tudi terapevtsko območje. Terapevtsko območje je definirano kot koncentracijsko območje, znotraj katerega je zdravljenje optimalno za posameznega bolnika. Pomemben vpliv na optimalno plazemsko koncentracijo ima poleg interindividualne variabilnosti v farmakokinetiki tudi tip epileptičnega napada oz. sindroma (12). Perucca pravi, da je najbolj optimalno zdravljenje epilepsije možno doseči z identifikacijo 'individualne terapevtske koncentracije' protiepileptičnega zdravila, pri kateri posameznik nima napadov in neželenih učinkov. Ta koncentracija nato služi kot referenca pri iskanju vzrokov in sprejemanju kliničnih odločitev v primeru spremembe kliničnega stanja pacienta. Aplikacja TDM je tako možna tudi, če ne poznamo referenčnega območja zdravila. Slabost tega pristopa je morebitna sprememba 'individualne terapevtske koncentracije' v primeru poslabšanja oz. napredovanja epilepsije. V tem primeru jo je potrebno ponovno določiti (13) Klinične indikacije za terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil Spremljanje koncentracij AED je pomembno iz več razlogov. Mnoga AED imajo ozko referenčno območje, kjer je meja med terapevtskimi in toksičnimi koncentracijami tanka. Poleg tega pa lahko sočasne bolezni (ledvična insuficienca, jetrna insuficienca...), določena fiziološka stanja (nosečnost...) in sočasna terapija z drugimi zdravili (inhibitorji ali induktorji jetrnih encimov...) vplivajo na farmakokinetiko in s tem koncentracijo AED v plazmi ter izid zdravljenja. TDM tudi prisili pacienta, da jemlje zdravila v skladu z navodili (večja komplianca). TDM naj bi se izvajalo v naslednjih primerih: po uvedbi zdravljenja oz. spremembi odmerka, če se zdravnik odloči, da bo ciljal na predhodno določeno tarčno koncentracijo 8

18 Uvod ko je dosežen željen klinični odziv oz. učinek (za določitev individualne terapevtske koncentracije) po spremembi odmerka AED z nelinerano farmakokinetiko (fenitoin) kadar se napadi ponavljajo (iskanje vzrokov za neuspešno terapijo, npr. slaba komplianca, sprememba v farmakokinetiki, prenizek odmerek, previsok odmerek v primeru paradoksalnih učinkov zdravila...) kadar obstaja sum za spremembe v farmakokinetiki in posledično koncentraciji (stanja povezana z leti, nosečnost, pridružene bolezni, interakcije z drugimi zdravili...) po generični zamenjavi ali zamenjavi farmacevtske oblike s takojšnjim sproščanjem z farmacevtsko obliko s prirejenim sproščanjem in obratno kadar obstaja sum za slabo komplianco v primeru neželenih učinkov v primeru nepričakovane spremembe kliničnega stanja (11,12). Prednosti, ki jih prinaša TDM, omogočajo večjo učinkovitost zdravljenja in boljšo kontrolo epilepsije, kar tudi poveča verjetnost za remisijo bolezni. Iz vidika stroškovne učinkovitosti pa je zelo pomembno, da se TDM ne aplicira vedno, ko za to obstaja možnost, ampak le takrat, ko je to klinično pomembno. Klinično uporabnost TDM v največji meri omejuje pomanjkanje kakovostnih podatkov glede korelacije med plazemskimi koncentracijami AED in učinkom (predvsem pri novejših AED). Klinično uporabnost TDM omejujejo tudi zdravniki, ki zaradi pomanjkljivega poznavanja farmakokinetike velikokrat ne znajo optimalno interpretirati dobljenih rezultatov (14) TDM novejših protiepileptičnih zdravil Klinične indikacije, omenjene v poglavju , se nanašajo na AED vseh generacij. Uporabnost TDM je pri novejših AED (AED 2. in 3. generacije) manjša. Novejša AED imajo namreč bolj predvidljivo farmakokinetiko v primerjavi s starejšimi AED, za katere je značilna velika interindividualna variabilnost farmakokinetike in ozko referenčno območje. Uporabnost TDM pri novejših AED je omejena tudi zaradi pomanjkanja informacij glede njihovih referenčnih območij. Z uvedbo koncepta 'individualne terapevtske koncentracije' pa 9

19 Uvod je TDM vseeno lahko učinkovito orodje za optimizacijo zdravljenja epilepsije tudi z novejšimi AED. Ker je uporabnost TDM torej odvisna predvsem od farmakoloških lastnosti posameznega zdravila, je potrebno smiselnost uporabe TDM opredeliti za vsako AED posebej (15). Vigabatrin Vigabatrin se zelo hitro absorbira iz gastrointestinalnega trakta (GIT) (tmax = 2 h). Njegova biološka uporabnost je %. Njegove plazemske koncentracije so linearno odvisne od odmerka. Vigabatrin se ne veže na serumske proteine, se ne metabolizira in se nespremenjen izloča skozi ledvice. Zato tudi ni pričakovati interakcij z drugimi zdravili, ki bi vplivale na njegovo farmakokinetiko. Jetrna insuficienca ne vpliva na plazemske koncentracije vigabatrina, je pa potrebno ustrezno zmanjšati odmerek pri ledvični insuficienci. TDM pri vigabatrinu torej ni primerno zaradi njegove predvidljive farmakokinetike in specifičnega mehanizma delovanja. Vigabatrin namreč ireverzibilno inhibira GABA transaminazo, zato ni dobre korelacije med plazemskimi koncentracijami in učinkom. Učinek je bolj odvisen od časa, ki je potreben za regeneracijo encima, in je pogosto prisoten tudi, ko vigabatrina več ni v plazmi. TDM pri vigabatrinu pride v poštev le za nadzor kompliance. Pri odmerkih med 1000 in 3000 mg/dan naj bi bile serumske koncentracije 0,8-36 μg/ml (12,15,16). Topiramat Topiramat se zelo hitro absorbira iz GIT (tmax = 1-4 h). Njegova biološka uporabnost je 81-95%. Njegove plazemske koncentracije so linearno odvisne od odmerka. Le 15 % se ga veže na serumske proteine. Približno 50 % absorbiranega odmerka se metabolizira v jetrih in se izloča skozi ledvice. Očistek topiramata je pri otrocih za približno 30 % višji kot pri odraslih, zato je potrebno odmerek ustrezno prilagoditi. Pri pacientih s pridruženo ledvično insuficienco je potrebno odmerek ustrezno zmanjšati, prav tako pa je potrebna previdnost pri pacientih z jetrno insuficienco. Na plazemske koncentracije topiramata imajo pomemben vpliv tudi interakcije z drugimi zdravili (AED, ki inducirajo jetrne encime, lahko zmanjšajo koncentracijo topiramata za 50 %). 10

20 Uvod TDM pri topiramatu je zaradi omenjene interindividualne variabilnosti v farmakokinetiki (predvsem v metabolizmu) primerno za določanje individualne terapevtske koncentracije pri posamezniku in v povezavi z interakcijami z drugimi zdravili. Referenčno območje topiramata naj bi bilo 5-20 μg/ml (12,15,16). Pregabalin Pregabalin se zelo hitro absorbira iz GIT (tmax = 1 h). Njegova biološka uporabnost je > 90 %. Njegove plazemske koncentracije so linearno odvisne od odmerka. Pregabalin se ne veže na serumske proteine, se ne metabolizira ( 2 %) in se nespremenjen (98 %) izloča skozi ledvice. Zato tudi ni pričakovati interakcij z drugimi zdravili, ki bi vplivale na njegovo farmakokinetiko. Paziti je potrebno le pri bolnikih z ledvično insuficienco ter jim ustrezno zmanjšati odmerek. Zaradi predvidljive farmakokinetike in majhne interindividualne variabilnosti je uporabnost TDM pri pregabalinu omejena (le za nadzor kompliance). Referenčno območje pregabalina naj bi bilo 2,8-8,2 μg/ml (12,15,16). Gabapentin Gabapentin se zelo hitro absorbira iz GIT (tmax = 2-3 h) preko transportnega sistema za L- aminokisline. Njegova biološka uporabnost je 60 %, ki pa se z višanjem odmerka zniža, kar je posledica nasičenosti transportnega sistema. Sočasno jemanje antacidov še dodatno zmanjša biološko uporabnost do 24 %. Gabapentin se ne veže na serumske proteine, se ne metabolizira in se nespremenjen izloča skozi ledvice. Zato tudi ni pričakovati interakcij z drugimi zdravili, ki bi vplivale na njegovo farmakokinetiko (razen že omenjeni antacidi). Paziti je potrebno le pri bolnikih z ledvično insuficienco in jim ustrezno zmanjšati odmerek. Razmerje med plazemsko koncentracijo in odmerkom gabapentina narašča s starostjo, zato obstajajo med bolniki interindividualne razlike. Zaradi omenjenih interindividualnih razlik in od odmerka odvisne absorpcijske kinetike (saturacijska oz. nelinearna kinetika) ter biološke uporabnosti, je farmakokinetika gabapentina nepredvidljiva. Zato je gabapentin primeren kandidat za TDM (posebej po spremembi odmerka). Referenčno območje gabapentina naj bi bilo 2-20 μg/ml (12,15,16). 11

21 Uvod 1.4. Določanje antiepileptikov v bioloških vzorcih Terapevtsko spremljanje koncentracij ni mogoče brez ustrezne zanesljive analizne metode za določanje AED v bioloških vzorcih. Danes so na voljo različne metode. Nekatere so bile razvite le za raziskovalne namene, druge pa za rutinsko uporabo. Večina laboratorijev uporablja imunološke in kromatografske metode, v preteklosti pa so se uporabljale tudi spektrofotometrične metode (z ali brez predhodne derivatizacije učinkovin). Imunološke metode omogočajo specifično določanje ene same učinkovine, so zelo občutljive, hitre, a tudi relativno drage. Gre za metode, ki kvantificirajo produkt, ki nastane in vitro pri reakciji med preiskovano učinkovino in proti njej usmerjenim protitelesom (npr. merjenje fluorescence, če je protitelo označeno s fluorokromom itd.). Slabost imunoloških metod je morebitna navzkrižna reaktivnost nekaterih protiteles z metaboliti preiskovane učinkovine (slaba specifičnost). Rezultat je v tem primeru lahko zavajajoč (posebej, če je metabolit neaktiven). Na drugi strani pa kromatografske metode (plinska kromatografija oz. GC in tekočinska kromatografija visoke ločljivosti oz. HPLC) omogočajo sočasno določanje večjega števila učinkovin in tudi njihovih metabolitov. Poleg tega so občutljive in specifične. Zelo pomembno je, da je metoda sposobna selektivno analizirati preiskovano učinkovino, kljub prisotnosti drugih zdravil (tudi AED). Spektrofotometrične metode (UV spektrofotometrija) se uporabljajo zelo redko zaradi slabe občutljivosti in specifičnosti. Velikokrat je potrebna tudi predhodna derivatizacija učinkovin, ki omogoči UV detekcijo (11,14). Pogosto se za določanje antiepileptikov uporablja tudi tekočinska kromatografija, vezana z MS (masni spektrometer) detektorjem. Te metode so zelo specifične, občutljive in selektivne, poleg tega pa ni potrebna predhodna derivatizacija. Njihova največja slabost je visoka cena (17,18,19) Derivatizacijske metode za fluorescenčno detekcijo Številni AED, predvsem novejši, nimajo kromofornih skupin in zato ne absorbirajo svetlobe v ultravijoličnem (UV) območju, prav tako pa tudi ne fluorescirajo. Posledično jih ne moremo določati z HPLC metodami z UV ali fluorescenčnim detektorjem (FLD). Za določanje teh 12

22 Uvod spojin je potrebna HPLC metoda z masnim spektrometrom ali pa predhodna derivatizacija spojin z ustreznimi reagenti, ki nato omogoči detekcijo s FLD ali UV detektorjem (20). Derivatizacijski reagenti za fluorescenčno detekcijo se delijo v dve skupini: fluorogeni reagenti: sami po sebi ne fluorescirajo, a reagirajo s tarčnimi spojinami do produktov, ki fluorescirajo reagenti za fluorescenčno označevanje: fluorescirajo že sami po sebi (fluorofor) (20). Benzofurazani (NBD-X) Halogenobenzofurazani (NBD-Cl in NBD-F) so pogosto uporabljani fluorogeni reagenti za fluorescenčno detekcijo primarnih in sekundarnih aminov. S slednjimi reagirajo pod alkalnimi pogoji (ph= 8-9) pri temperaturi C. Reakcija z NBD-F poteče desetkrat hitreje kot pri NBD-Cl. Ker hidroliziran produkt (NBD-OH) intenzivno fluorescira, se oba reagenta uporabljata le za predkolonsko derivatizacijo. ne fluorescira R X NBD-Cl NO2 Cl NBD-F NO2 F DBD-F SO2N(CH3)2 F DBD-COCl SO2N(CH3)2 H3C-N-CH2COCl fluorescira Slika 5: Benzofurazani DBD-F je fluorogeni derivatizacijski reagent za določanje aminov. V primerjavi z NBD-F je manj reaktiven. 13

23 Uvod DBD-COCl je bil sintetiziran za določanje primarnih in aromatskih aminov v raztopini benzena pri sobni temperaturi. Ne reagira pa le z amini, ampak tudi z alkoholi, tioli in fenoli (20). Do danes so bile razvite že številne metode za določanje novejših AED s pomočjo derivatizacije z NBD-Cl (7-kloro-4-nitrobenzofurazan). Bahrami s sod. so razvili metodi za določanje topiramata in gabapentina v serumu (21,22). Erturk s sod. so razvili metodo za določanje vigabatrina v plazmi (23), Olgun s sod. pa za določanje vigabatrina v tabletah (24). 14

24 Namen dela 2. Namen dela Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil (TDM) in individualizacija režima odmerjanja sta ključnega pomena za optimalen izid zdravljenja epilepsije. TDM pa ni mogoče brez ustrezne analizne metode za določanje koncentracij učinkovin v bioloških vzorcih. Zato bomo v diplomski nalogi razvili analizno metodo za sočasno določanje plazemskih koncentracij štirih protiepileptičnih učinkovin druge generacije, in sicer vigabatrina, topiramata, pregabalina in gabapentina. Plazemske vzorce bomo ekstrahirali na trdnih nosilcih (SPE). Ker preiskovane učinkovine ne absorbirajo svetlobe v UV in vidnem območju, bomo posušene ekstrahirane vzorce derivatizirali s 7-kloro-4-nitrobenzofurazanom (NBD-Cl). NBD-Cl tvori fluorescenčne derivate s primarnimi in sekundarnimi amini, v literaturi pa najdemo tudi njegovo aplikacijo za derivatizacijo sulfamatov oz. topiramata (21). Derivatizirane analite bomo separirali in kvantificirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z uporabo fluorescenčnega detektorja. Pri razvoju in optimizaciji metode bomo izhajali iz začetega razvoja in diplomskega dela Marka Benkovića (25). Razlog za nadaljevanje njegovega dela je neuspešna validacija za topiramat, saj zanj metoda ni bila točna, ponovljiva in linearna. Vzrok za to je lahko v neustrezni ekstrakciji vzorcev, sušenju po ekstrakciji, postopku derivatizacije ali v kromatografiji. Z optimizacijo omenjenih korakov bomo poskušali metodo ponovno validirati za vse štiri preiskovane učinkovine. Pomagali si bomo tudi z v literaturi objavljenimi metodami za določanje teh učinkovin. Razvoj metode bomo začeli v več stopnjah. Najprej bomo optimizirali postopek ekstrakcije na trdnih nosilcih (predvsem korak spiranja in elucije) in sušenja ekstrahiranih vzorcev. V drugem delu bomo določili optimalne pogoje derivatizacije, predvsem koncentracijo NBD-Cl in ph reakcije. Na koncu bomo optimizirali še kromatografsko ločbo. Izbrali bomo ustrezno kolono in interni standard ter določili optimalno sestavo mobilne faze, pretok mobilne faze in temperaturo kolone, s čimer bomo poskušali zagotoviti dobro resolucijo preiskovanih analitov in čim krajše analizne čase. Po razvoju metode bomo le-to validirali po smernicah ameriške agencije za hrano in zdravila (FDA) ter določili točnost, ponovljivost, linearnost, območje, mejo kvantifikacije, 15

25 Namen dela selektivnost, uspešnost ekstrakcije, robustnost in postpreparativno stabilnost naših vzorcev. Metodo bomo tudi aplicirali na realne vzorce bolnikov z epilepsijo, ki prejemajo topiramat. Rezultate bomo primerjali z rezultati, dobljenimi s predhodno razvito metodo za topiramat, pri kateri so kot derivatizacijski reagent uporabili 9-fluorenilmetil kloroformat (FMOC) (26), in določili ujemanje med njimi oz. med metodama. Na ta način bomo ugotovili, ali je metoda primerna za TDM. 16

26 Materiali in metode 3. Materiali in metode 3.1. Materiali Biološki material Uporabljali smo humano plazmo (antikoagulant EDTA), pridobljeno na Zavodu za transfuzijsko medicino, Šlajmerjeva ulica 6, 1000 Ljubljana. Realni plazemski vzorci so iz klinične študije z naslovom:»populaciona farmakokinetika antiepileptika kod pacijenata obolelih od epilepsije uticaj na kontrolu napada, neželjena dejstva i kvalitet života postignut terapijom.« Standardi Vigabatrin, C 6 H 11 NO 2 ; M = g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Topiramat, C 12 H 21 NO 8 S; M = g/mol (Sequoia Research Products Ltd., Pangbourne, Združeno kraljestvo) Pregabalin, C 8 H 17 NO 2 ; M = g/mol (Sequoia Research Products Ltd., Pangbourne, Združeno kraljestvo) Gabapentin, C 9 H 17 NO 2 ; M = g/mol (Sequoia Research Products Ltd., Pangbourne, Združeno kraljestvo) DL-norvalin, C 5 H 11 NO 2 ; M = g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Izoniazid, C 6 H 7 N 3 O; M = g/mol, Fluka Analytical DL-p-klorofenilalanin, C 9 H 10 ClNO 2 ; M = g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) p-fluoro-dl-fenilalanin, C 9 H 10 FNO 2 ; M = g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) 2-fluoro-DL-fenilalanin, C 9 H 10 FNO 2 ; M = g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Cikloheksil-D-alanin hidrat, C 9 H 17 NO 2 xh 2 O; M = g/mol (anhidrid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) 7-kloro-4-nitrobenzofurazan, C 6 H 2 ClN 3 O 3 ; M = 199,55 g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Reagenti in topila Metanol CH 3 OH Chromasol V ; M = 32,04 g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) 17

27 Materiali in metode Acetonitril C 2 H 3 N Chromasol V ; M= 41,05 g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Borna kislina H 3 BO 3 ; M = 61,83 g/mol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Puferske raztopine ph = 2, ph = 3, ph = 4, ph = 5, ph = 6, ph = 7, ph = 9, ph = 10 (Kefolab, Ljubljana, Slovenija) Ultračista voda, pridobljena z Milli Q Advantage A10 (Millipore Corp., Billerica, MA); specifična upornost 18,2 MΩcm, celokupni organski ogljik (TOC) 5 85 % ortofosforna kislina H 3 PO 4 ; M = 98 (Merck, Darmstadt, Nemčija) Kalijev dihidrogen fosfat pro analysi KH 2 PO 4 ; M=136,09 g/mol (Merck, Darmstadt, Nemčija) 2 M amonijak v metanolu NH 3 ; M = (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Ocetna kislina CH 3 COOH; M = g/mol (JT Baker, Deventen, Nizozemska) Trietilamin C 6 H 15 N; M = g/mol (Merck, Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Nemčija) Naprave in pribor HLADILNIK (LTH, Škofja Loka, Slovenija) ZAMRZOVALNIK -20 C (Gorenje, Velenje, Slovenija) ZAMRZOVALNIK -70 C MDF-U50V (Sanyo Electric Biomedical, Japonska) TEHTNICA AG 245 (Mettler Toledo, Schwarzenbach, Švica) TEHTNICA H 54 AR (Mettler, Greinfansee, Švica) PH METER MA 5750 (Iskra, Kranj, Slovenija) TURBOVAP LV (Caliper, Hopkinton-MA, ZDA) ELEKTROMAGNETNO MEŠALO HI 190M (Hanna instruments, Póvoa de Varzim, Portugalska) MEŠALNIK VIBROMIX 114EV (Tehtnica, Železniki, Slovenija) ULTRAZVOČNA KADIČKA SONIS 4 (Iskra, Kranj, Slovenija) POLAVTOMATSKE PIPETE 2-20 µl, µl in µl (Eppendorf research, Hamburg, Nemčija) PLASTIČNE EPRUVETE oz. MIKROCENTRIFUGIRKE 1,5 ml (Eppendorf research, Hamburg, Nemčija) in 2,0 ml (Sarstedt, Nümbrecht, Nemčija) CELULOZNO ACETATNI FILTER 0,45 µm (Sartorius AG, Göttingen, Nemčija) 18

28 Materiali in metode SPE APARATURA Machery-Nagel vakuumska kadička s pokrovom in nastavki za kolone (Machery -Nagel, Düren, Nemčija) SPE KOLONA Oasis MCX 3 ml/60 mg (Waters, Milford Massachusetts Združene države Amerike) HPLC KOLONE Gemini C x 4,6 mm 5 µm (Phenomenex, Torrance, Kalifornija, Združene države Amerike) Eclipse plus C x 4,6 mm 5 µm (Agilent technologies, Santa Clara, Kalifornija, Združene države Amerike) HPLC PREDKOLONE Gemini C18 5 µm (Phenomenex, Torrance, Kalifornija, Združene države Amerike) STEKLENI INVENTAR: merilne bučke, čaše, tehtiči, merilni valji, viale, inserti za viale, presesalna buča, lij za presesalno bučo OSTALI INVENTAR: spatule, nastavki za pipete, palčke za mešanje, Parafilm M HPLC SISTEM Agilent technologies 1100 series z UV in FLD detektorjem (Agilent technologies, Santa Clara, Kalifornija, Združene države Amerike) 3.2. Metode Pri razvoju in optimizaciji metode smo nadaljevali predhoden razvoj oz. diplomsko delo Marka Benkovića (25). Kot izhodišče smo vzeli njegovo metodo, ki za topiramat ni bila točna, ponovljiva in linearna. Metoda po Benkoviću: Priprava plazemskega vzorca: k 500 μl bolnikove plazme v 2 ml mikrocentrifugirki dodamo 20 μl vode in 10 μl internega standarda (DL-p-klorofenilalanin) s koncentracijo 0,38 mg/ml. Zmes nato vorteksiramo 15 sekund, dodamo 1 ml 0,1 M raztopine HCl in ponovno vorteksiramo 15 sekund. Ekstrakcija vzorca na trdnem nosilcu (SPE): kolona Oasis MCX 60 mg/ml (Waters, ZDA) Kondicioniranje: dvakrat po 2 ml metanola (MeOH) Ekvilibracija: dvakrat po 2 ml vode Dodajanje vzorca: 1,5 ml predhodno pripravljenega plazemskega vzorca 19

29 Materiali in metode Spiranje: dvakrat po 1 ml 0,1 M HCl, dvakrat po 1 ml 50 mm fosfatnega pufra s ph=5,0 in 1 ml vode Elucija: 2 ml NH 3 :H 2 O:acetonitril (5:15:80) v steklene epruvetke. Sušenje vzorca: s pomočjo aparature Turbovap, in sicer z dušikom (N 2 ) pri povišanem tlaku 35 minut (5 bar 20 min, 7 bar 15 min) in pri konstantni temperaturi 50 C. Derivatizacija vzorca: suhemu vzorcu dodamo 100 μl raztopine NBD-Cl s koncentracijo 10 mg/ml, 100 μl MeOH:acetonitril v razmerju 1:1 (vol/vol) in 25 μl 250 mm boratnega pufra s ph=10,0. Mešanico nato vorteksiramo 30 sekund in nato prenesemo 200 μl v 1,5 ml mikrocentrifugirko. Mikrocentrifugirko nato postavimo na vodno kopel s temperaturo 60 C, kjer poteka derivatizacija 15 minut. Centrifugiranje vzorca: vzorec centrifugiramo 3 minute pri g in temperaturi 8 C. Nato 140 μl vzorca prenesemo v inserte, ki jih vstavimo v viale za HPLC. HPLC: kolona Gemini C x 4,6 mm 5 µm (Phenomenex, ZDA) o Mobilna faza (MF): gradientna metoda 0-5min: 50% MeOH in 50% 50 mm fosfatni pufer s ph=4,5 5,1-15min: 56% MeOH in 44% 50 mm fosfatni pufer s ph=4,5 15,1-18min: 50% MeOH in 50% 50 mm fosfatni pufer s ph=4,5 o Pretok mobilne faze: 1,3 ml/min o Temperatura kolone: 45 C o Ekscitacijska in emisijska valovna dolžina: λ ex = 470 nm, λ em = 530 nm o Ojačitev fotopomnoževalke: 0-5,30 min: 9 5,31-8,25 min: 13 8,26-18,00 min: 9 Pri razvoju metode smo lahko optimirali številne parametre, in sicer na nivoju priprave vzorca, ekstrakcije, sušenja, derivatizacije ali kromatografije. 20

30 Materiali in metode Priprava osnovnih raztopin, reagentov in pufrov Osnovne raztopine naših učinkovin s približno koncentracijo 5 mg/ml smo pripravili v 1,5 ml mikrocentrifugirkah. Učinkovine smo najprej zatehtali v mikrocentrifugirke, nato pa vsako raztopili v 1 ml vode. Zatehte učinkovin so prikazane v preglednici III. Preglednica III: Zatehte učinkovin za pripravo osnovnih raztopin posameznih učinkovin Učinkovina Masa (mg) Vigabatrin 5,11 Topiramat 5,10 Pregabalin 5,05 Gabapentin 4,98 Osnovno raztopino internega standarda s koncentracijo 0,2 mg/ml smo pripravili tako, da smo 2 mg internega standarda (IS) kvantitativno prenesli v 10 ml merilno bučko in jo z vodo dopolnili do oznake. Raztopino derivatizacijskega reagenta NBD-Cl s koncentracijo 10 mg/ml smo pripravili vsak dan svežo. V 1,5 ml mikrocentrifugirko smo zatehtali 10 mg NBD-Cl, nato pa ga raztopili v 1 ml MeOH:acetonitril (1:1 vol/vol). Priprava 50 mm fosfatnega pufra ph=5,0 za spiranje pri SPE in 50 mm fosfatnega pufra ph= 4,9 za mobilno fazo: na tehtič smo zatehtali 3,402 g KH 2 PO 4 in ga kvantitativno prenesli v 500 ml merilno bučko, katero smo nato z vodo dopolnili do oznake. 50 ml alikvot smo nato s pomočjo predhodno umerjenega ph metra med 4 in 5 titrirali z 0,1 M NaOH do ph=5,0. Ta pufer smo uporabljali za spiranje pri SPE. Preostalih 450 ml smo na enak način titrirali do ph=4,9, prefiltrirali s pomočjo presesalne buče in razplinili na ultrazvočni kadički. Ta pufer smo uporabljali za mobilno fazo pri HPLC. Priprava 250 mm boratnega pufra ph=10,5 za reakcijo derivatizacije: na tehtič smo zatehtali 1,544 g H 3 BO 3 in jo kvantitativno prenesli v 100 ml merilno bučko, katero smo nato z vodo dopolnili do oznake. Nato smo raztopino s pomočjo predhodno umerjenega ph metra med 10 in 11 titrirali z 1 M NaOH do ph = 10,5. 21

31 Materiali in metode Osnovne raztopine, boratni pufer in fosfatni pufer za spiranje pri SPE smo hranili v hladilniku pri 4 C in smo jih uporabljali, dokler jih ni zmanjkalo oz. največ en mesec. Fosfatni pufer za MF in raztopino derivatizacijskega reagenta NBD-Cl smo pripravili vsak dan sveže Izbira internega standarda Izbirali smo med šestimi internimi standardi (DL-norvalin, DL-p-klorofenilalanin, izoniazid, cikloheksil-d-alanin hidrat, 2-fluoro-DL-fenilalanin in p-fluoro-dl-fenilalanin). Izbirali smo na podlagi dveh kriterijev: 1. dobra resolucija z vrhovi preiskovanih učinkovin in vrhovi, ki izvirajo iz plazme 2. čim krajši retencijski čas (t r ), da ne podaljšamo časa analize (če je le možno, naj bi se IS izločil iz kolone pred našimi preiskovanimi analiti) Priprava plazemskih vzorcev Priprava realnih plazemskih vzorcev: 500 μl bolnikove plazme smo odpipetirali v 2 ml mikrocentrifugirko in dodali 20 μl vode ter 30 μl raztopine internega standarda (p-fluoro- DL-fenilalanin) s koncentracijo 0,2 mg/ml. Zmes smo nato vorteksirali 15 sekund, dodali 1 ml 0,1 M raztopine HCl in ponovno vorteksirali 15 sekund. Priprava plazemskih vzorcev za razvoj metode: 500 μl slepe plazme smo odpipetirali v 2 ml mikrocentrifugirko in dodali 20 μl mešanice naših štirih učinkovin v ustrezni koncentraciji ter 30 μl internega standarda s koncentracijo 0,2 mg/ml. Zmes smo nato vorteksirali 15 sekund, dodali 1 ml 0,1 M raztopine HCl in ponovno vorteksirali 15 sekund Ekstrakcija na trdnih nosilcih (SPE) in njena optimizacija Plazemske vzorce smo ekstrahirali na trdnih nosilcih (SPE) z namenom očiščenja preiskovanih analitov od nečistot oz. komponent, ki so prisotne v plazmi. Po tem, ko smo izbrali ustrezno kolono oz. nosilec, je bil SPE postopek sestavljen iz petih korakov: kondicioniranje trdnega nosilca (trdni nosilec omočimo z ustreznim topilom) ekvilibracija trdnega nosilca (trdni nosilec naredimo bolj kompatibilen z vodnim matriksom plazemskega vzorca) dodajanje vzorca (med analiti in nosilcem se tvorijo interakcije) 22