Ana Babić (Dragan) Antinociceptivno djelovanje botulinum toksina A na eksperimentalnom modelu visceralne boli DIPLOMSKI RAD

Transcription

1 Ana Babić (Dragan) Antinociceptivno djelovanje botulinum toksina A na eksperimentalnom modelu visceralne boli DIPLOMSKI RAD Predan Sveučilištu u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu Zagreb, 2012.

2 Ovaj diplomski rad je prijavljen na kolegiju Farmakologija 2 Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta i izrađen u Laboratoriju za molekularnu neurofarmakologiju Zavoda za farmakologiju Sveučilišta u Zagrebu Medicinskog fakulteta pod stručnim vodstvom doc. dr. sc. Lidije Bach-Rojecky i suvoditeljstvom prof. dr. sc. Zdravka Lackovića. Zahvaljujem se svojoj mentorici doc. dr. sc. Lidiji Bach-Rojecky na podršci, strpljenju i pomoći pri osmišljavanju i izradi ovog rada. Također, zahvaljujem se prof. dr. sc. Zdravku Lackoviću na ukazanoj prilici da se okušam u radu u njegovom laboratoriju te na pomoći prilikom izvođenja eksperimentalnog dijela rada. Zahvaljujem se Višnji Drinovac mag. pharm. i Ivici Mataku dipl. ing. biol. što su me poučili svemu što je trebalo znati i na nesebičnoj pomoći prilikom izrade ovog rada. Hvala mojoj obitelji koja me podržavala svaki korak mog studija i bez koje ovog rada ne bi bilo. Hvala najbližima koji su bili uz mene iz dana u dan.

3 SADRŽAJ 1. UVOD Botulinum toksin Sturktura botulinum toksina tipa A Mehanizam djelovanja botulinum toksina tipa A Klinička primjena botulinum toksina Bol Receptori za bol i prijenos bolng podražaja Neurotransmitori u prijenosu boli Sustav za suzbijanje boli u mozgu i kralježničnoj moždini Podjela boli Visceralna bol Senzitizacija, hiperalgezija i alodinija Terapija boli Botulinum toksin i bol OBRAZLOŽENJE TEME MATERIJALI I METODE Životinje Ispitivana tvar - botulinum toksin A Intracisternalna primjena Intratekalna primjena Kemikalije i reagensi Eksperimentalni model boli Statistička obrada rezultata REZULTATI I RASPRAVA ZAKLJUČAK LITERATURA SAŽETAK/SUMMARY... 32

4 1. UVOD 1.1. Botulinum toksin Clostridium botulinum anaerobna je, sporogena, gram pozitivna bakterija roda Clostridium. Sojevi C. botulinum razlikuju se prema serotipovima toksina koje proizvode; A, B, C1, D, E, F i G, od kojih je tip A najvirulentiji (Brooks i sur., 2007). Botulinum toksini blokiraju proces oslobađanja acetilkolina iz presinaptičkih mjehurića u sinaptičku pukotinu. Oni enzimski uklanjaju nekoliko aminokiselina iz jednog ili više proteina uključenih u proces spajanja vezikule i stanične membrane neurona (Katzung i sur., 2001). Trovanje botulinum toksinima izaziva bolest botulizma karakteriziranu silaznom mišićnom slabošću i respiratornom paralizom. Postoji pet kliničkih tipova botulizma: klasični botulizam nastao trovanjem hranom (food-borne botulism), infantilni botulizam (infant botulism), skriveni botulizam (hidden botulism), botulizam iz rana (wound botulism) te profesionalni botulizam. Toksin je opasan u nanogramskim količinama, te letalna doza hranom unijetog botulinum toksina varira od 0.1 do 1µg. Radi svoje potentnosti, botulinum toksin smatra se najvećom prijetnjom u svijetu biološkog oružja i bioterorizma (Wexler i sur., 2005). Unatoč tome, godine američki FDA 1 registrira pročišćeni, kristalični botulinum toksin tipa A (BT-A) za terapiju različitih poremećaja karakteriziranih mišićnom kontrakcijom (Shantz i Johnson, 1992) Sturktura botulinum toksina tipa A Klostridijski neurotoksini su proteinski kompleksi mase oko 900 kda 2 koje čine netoksična i toksična komponenta. Toksična komponenta kompleksa mase oko 150 kda jest dvolančani polipetid koji se sintetizira u stanici kao jednolančani polipeptid, a posttranslacijski se spaja u dvolančanu molekulu veličine 1295 aminokiselina. BT-A čine laki i teški lanac spojeni jednom disulfidnom vezom (Cys430-Cys454) (Slika 1). Laki lanac mase 1 Agencija za hranu i lijekove Sjedinjenih Američkih Država 2 Kilodalton, mjera molekularne težine velikih molekula poput proteina 3

5 oko 50 kda ima funkciju cink-ovisne endopeptidaze i cijepa ciljne proteine, dok je teški lanac, mase oko 100 kda, sačinjen od dvije domene koje služe vezanju toksina za membranu i ulasku toksina u neuron (Turton i sur., 2002). Slika 1 Dvolančana struktura botulinum toksina tipa A (Turton i sur., 2002) U kristalnoj strukturi BT-A razlikuju se tri funkcionalne domene: vežuća, translokacijska te katalitička domena (Slika 2). Slika 2 Kristalna struktura botulinum toksina tipa A (Turton i sur., 2002) Netoksična komponenta kompleksa služi zaštiti od niskog ph gastrointestinalnog trakta, a od toksičnog dijela disocira pri fiziološkom ph ( 4

6 Mehanizam djelovanja botulinum toksina tipa A Mehanizam djelovanja BT-A prikazan je na Slici 3. Četiri koraka su bitna u djelovanju BT-A na neuromuskularnoj vezi. U prvom koraku dolazi do interakcije toksina s dvostrukim akceptorom koji sadrži glikoproteinske strukture koje su specifično pokazane na okončinama kolinergičkih neurona. Upravo ova specifičnost receptora razlog je visoke selektivnosti BT-A za kolinergičke sinapse (Dressler i sur., 2005). Drugi korak je internalizacija kompleksa toksin-akceptor u intracelularnu vezikulu. U trećoj fazi kiseli ph vezikule uzrokuje strukturne promjene toksina gdje zbog izlaganja hidrofobnih domena strukture dolazi do ugradnje toksina u membranu vezikule ( Slijedi translokacija kratkog lanca (E) u citosol i odvajanje od dugog lanca (T i V) toksina. U četvrtom koraku, kratki lanac vrši proteolitičko cijepanje proteina SNAP25 (SyNaptosomal-Associated Protein 25kDa). SNAP25, sintaksini i sinaptobrevin dio su SNARE (Soluble N-ethylmaleimidesensitive factor Attachment protein REceptor) kompleksa koji je odgovoran za egzocitozu acetilkolina iz presinaptičke stanice u sinaptičku pukotinu. Drugi serotipovi botulinum toksina također inhibiraju lučenje acetilkolina, ali djeluju na različite dijelove SNARE kompleksa. Botulinum toksini tipa B, D, F i G cijepaju protein VAMP (Vesicle-Associated Membrane Protein) ili sinaptobrevin, tip C1 cijepa sintaksin i SNAP25, a tip E cijepa SNAP25 (Turton i sur., 2002); (Dressler i sur., 2005); ( Trajanje djelovanja botulinum toksina je različito, od 4-6 mjeseci za serotip A i C1, do 4-6 tjedana za serotip E. Nakon injiciranja botulinum toksina, neuron različitim mehanizmima pokušava povratiti funkciju egzocitoze acetilkolina. Jedan od mehanizama kojim to čini jest stvaranje novih Slika 3 Mehanizam djelovanja botulinum toksina (Turton i sur., 2002) 5

7 ogranaka neurona (Slika 4). Novi ogranci granaju se iz postojećeg neurona i stvaraju nove sinapse s mišićnom stanicom, obnavljajući tako mogućnost živca da uzrokuje mišićnu kontrakciju. Slika 4 Stvaranje novih živčanih ogranaka ( Promjene se dešavaju i na postsinapičkoj stanici, gdje dolazi do reorganizacije nikotinskih receptora koji se smještaju nasuprot novonastalim ograncima. Naposljetku, prvotna živčana okončina obnavlja svoju funkciju i ogranci se gube, što ukazuje na činjenicu da BT-A ne mijenja neuromuskularnu vezu trajno ( Klinička primjena botulinum toksina Danas se u kliničkoj praksi primjenjuju botulinum toksini tipa A i B koji se na tržištu nalaze kao onabotulinumtoxin A - BOTOX i BOTOX Cosmetic (Allergan), abobotulinumtoxin A - Dysport (Ipsen Biopharmaceuticals), incobotulinumtoxin A - Xeomin (Merz) i rimabotulinumtoxin B - Myobloc (Solstice Neurosciences). Ovi se pripravci međusobno razlikuju po potentnosti koja se izražava internacionalnim jedinicama (i.j.), gdje jedna internacionalna jedinica odgovara količini toksina koja nakon intraperitonealne primjene uzrokuje smrt 50% miševa (LD 50 ). Tako će 1 nanogram proteinskog kompleksa neurotoksina odgovarati 20 i.j. BOTOX -a ( a 1 nanogramu Myobloc -a odgovara i.j. ( Xeomin je prvi preparat botulinum toksina koji sadrži samo neurotoksičnu komponentu od 150 kda, dok ostali sadrže pročišćeni kompleks neurotoksina ( 6

8 BT-A je najprije bio odobren za liječenje blefarospazma, strabizma i hemifacijalnog spazma (Shantz i Johnson, 1992), a kasnije su slijedila i odobrenja za druga stanja. U Hrvatskoj je do godine BOTOX jedini registrirani pripravak botulinum toksina i odobren je kod blefarospazma, hemifacijalnog spazma, cervikalne distonije, dječije cerebralne paralize, primarne hiperhidroze aksile, uklanjanja bora i uklanjanja spazama koji su posljedica moždanog udara ( dok je FDA odobrio upotrebu BOTOX -a i kod urinarne inkontinencije uzrokovane hiperaktivnim mjehurom neurološke etiologije, kronične migrene te spasticiteta gornjih udova ( Mnoge indikacije za botulinum toksin još uvijek se istražuju, a posebno je bitan i zanimljiv analgetski učinak botulinum toksina kod stanja praćenih kroničnom boli (Ward i Barnes, 2007) Bol Prema Međunarodnoj udruzi za istraživanje boli (IASP 3 ), bol je... neugodno senzorno i emocionalno iskustvo vezano uz stvarnu ili moguću ozljedu tkiva... ( Bol je zaštitni mehanizam, nužan za preživljavanje i opstanak, koji aktivira refleksne reakcije kojima se uklanja bolni podražaj (Guyton i Hall, 2006) Receptori za bol i prijenos bolng podražaja Receptori za bol, ili nociceptori, slobodni su živčani završeci koji provode različite bolne podražaje u mozak gdje se stvara osjećaj boli. Bol mogu uzrokovati mnoge vrste podražaja, koje se svrstavaju u mehaničke, toplinske i kemijske bolne podražaje. Suprotno većini drugih osjetnih receptora u tijelu, receptori za bol se ne adaptiraju, već se u nekim slučajevima osjećaj boli povećava uslijed ponovnog podražaja. Klasifikacija nociceptora temelji se na podjeli živčanih vlakna koji prenose signal do kralježnične moždine. Dvije su vrste živčanih vlakana, C vlakna su tanka i nemijelinizirana vlakna koja akcijski potencijal provode sporo, brzinom 0,5-2 m/s, dok su Aδ vlakna šireg promjera i mijelinizirana a prenose impuls brzo, brzinom 6-30 m/s. C-nociceptori 3 IASP-International Association for the Study of Pain 7

9 polimodalno odgovaraju na toplinske, mehaničke i kemijske podražaje, a Aδ na mehaničke i mehano-toplinske podražaje. Zbog dvostrukog sustava inervacije receptora za bol, bolni podražaj često uzrokuje dvije faze boli; približno jednu sekundu poslije brze, oštre (epikriptičke) boli koja se prenosi Aδ vlaknima, javlja se spora, tupa (protopatska) bol koja se prenosi C-vlaknima. Obje vrste vlakana stražnjim spinalnim korijenovima ulaze u kralježničnu moždinu. Nakon ulaska u kralježničnu moždinu, bolni signali putuju prema mozgu dvama putevima; neospinotalamičkim traktom i paleospinotalamičkim traktom (Slika 5). Impulsi koji putuju s periferije Aδ-vlaknima završavaju u marginalnoj lamini stražnjih rogova te se neospinotalamičnim traktom prenose do talamusa; točnije do ventrobazalnog kompleksa, dok manji broj završava u retikularnim područjima moždanog debla. Neka vlakna završavaju na stražnjoj skupini talamičnih jezgara; signali se iz tih jezgara prenose u druga bazalna područja mozga i u somatosenzoričku koru. Živčani sustav ovakvu brzu i oštru bol koja se prenosi neospinotalamičnim putem može lokalizirati mnogo točnije od spore trajne boli. Impulsi koji se prenose perifernim C-vlaknima (za sporu i dugotrajniju bol) završavaju u gelatinoznoj tvari, tj. laminama II i III stražnjih rogova te se dalje prenose paleospinotalamičnim putom. Signal dalje prolazi kroz jedan ili više neurona kratkih vlakana da bi dugim aksonima završio u talamusu, retikularnim formacijama produžene moždine, ponsa i mezencefalona, u tektalnom području mezencefalona ili u sivom području oko akvedukta (Guyton i Hall, 2006) (Slika 6). Slika 5 Prijenos bolnih signala u kralježničnu moždinu i kroz nju, na putu do moždanog debla (Guyton i Hall, 2006) 8

10 Slika 6 Prijenos bolnih signala u moždano deblo, talamus i moždanu koru (Guyton i Hall, 2006) Neurotransmitori u prijenosu boli Glutamat je glavni ekscitacijski neurotransmitor u prijenosu boli. Njegov je učinak ekscitacijski preko ionotropnih AMPA 4 i NMDA 5 receptora koji se nalaze na perfiernim završecima aferentnih živaca, neuronima dorzalnog roga kralježnične moždine i neuronima u talamusu. Prilikom aktivacije nociceptora, na periferiji se luči glutamat i doprinosi nocicepciji. Glutamat se također luči i kod upale, zajedno s neuropeptidima supstancijom P i peptidom srodnim genu za kalcitonin. Glutamat djeluje i na presinaptičke NMDA receptore čime dodatno povećava lučenje neurotransmitora u sinapse. Drugi važni neurotransmitori u prijenosu bolnih impulsa su somatostatin, faktor lučenja kortikotropina, kolecistokinin, vazoaktivni intestinalni peptid i dr. koji se oslobađaju iz središnjih okončina aferentnog senzornog vlakna. U dorzalnom rogu kralježnične moždine oslobađaju se i medijatori iz ne-živčanih izvora, kao što su adenozin-3- fosfat, dušik-2-oksid i prostaglandini, koji mogu djelovati ekscitacijski i inhibicijski. U kralježničnoj moždini nalaze se ekscitacijski i inhibicijski interneuroni koji preko raznih medijatora reguliraju prijenos boli. Oni postoje i u talamusu i također reguliraju 4 AMPA - α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropionska kiselina 5 NMDA - N-metil-D-aspartat 9

11 transmisiju nociceptivnih signala. Od inhibicijskih interneurona važno je spomenuti kolinergičke, opioidne te interneurone koji djeluju preko GABA-e 6. (Bach-Rojecky, 2006) Sustav za suzbijanje boli u mozgu i kralježničnoj moždini Intenzitet reakcije na bol razlikuje se od osobe do osobe. To je dijelom posljedica sposobnosti samog mozga da aktiviranjem sustava za nadzor boli potiskuje ulaženje bolnih signala u živčani sustav. Bolni signali mogu se zaustaviti u dorzalnim rogovima kralježnične moždine prije nego se oni prekapčaju i krenu prema mozgu. Tzv. teorija o kontroli boli vratima pretpostavlja da se aktivacijom inhibicijskih interneurona u dorzalnim rogovima preko GABA-e ili endorfina smanjuje transmisija bolnih informacija. Sustav za suzbijanje boli kreće iz sive tvari oko akvedukta i periventrikularnih područja u mezencefalonu i gornjem dijelu ponsa iz kojih neuroni šalju signale u veliku jezgru rafe, tanku jezgru u središnjoj crti donjeg dijela ponsa i gornjeg dijela produljene moždine te u paragigantocelularnu jezgru u lateralnom dijelu produljene moždine. Iz tih se jezgara signali drugog reda prenose prema dolje, serotoninergičnim neuronima, čiji aksoni silaze u dorzalni rog duž spinalnog dorzolateralnog funikula. U analgezijskom sustavu sudjeluje nekoliko neurotransmitora, a osobito se ističe uloga serotonina i enkefalina. Mnoga živčana vlakna koja potječu iz periventrikularnih jezgara i sive tvari oko akvedukta luče na svojim završecima enkefaline koji uzrokuju presinaptičku i postsinaptičku inhibiciju ulaznih C- i Aδ-vlakana u dorzalnim rogovima (Guyton i Hall, 2006) Podjela boli Bol možemo podjeliti prema patofiziološkom nastanku, trajanju i porijeklu. Prema trajanju bol grubo dijelimo na akutnu i kroničnu. Akutna bol je najčešće uzrokovana ozljedom i ima zaštitnu ulogu, ukazujući na stvarno oštećenje tkiva. Javlja se naglo i prijašnjom definicijom je bila ograničena na rok od 6 mjeseci, međutim danas se ograničava na vrijeme od 3 mjeseca ili na vrijeme potrebno za 6 GABA - γ-amino maslačna kiselina 10

12 liječenje i/ili oporavak. Kronična bol traje i nakon vremena oporavka od ozljede (>3 mjeseca), ponekad uopće nije uzrokovana ozljedom i može biti bez otkrivenog štetnog uzroka te u pravilu dovodi do značajnog narušavanja kvalitete života. Karakteristična su dva tipa boli: kontinuirana pozadinska bol praćena često i funkcionalnom nesposobnošću, te probijajuća bol koja se javlja kod stabilne kronične boli u vidu naglih, kratkotrajnih i vrlo intenzivnih izboja boli ( Patofiziološki bol dijelimo na nociceptivnu, upalu i neuropatsku bol. Nociceptivna bol nastaje pri djelovanju podražaja visokog intenziteta na periferne nociceptore u fiziološkim uvjetima. Akutni bolni podražaj termalnog (>47 C), mehaničkog (pritisak, ubod) ili kemijskog karaktera aktivira specifične receptore (npr. vaniloidne TRPV1 7 receptore, tzv. kapsaicinske receptore) ili ionske kanale (npr. na kiselinu osjetljive ionske kanale - ASIC 8 ) na perifernim živčanim završecima C- i Aδ-vlakana. Podražaj TRPV1 receptora dovodi do lokalnog lučenja glutamata iz perifernih okončina koji djeluje preko AMPA, NMDA i kainatnih receptora doprinoseći nocicepciji. Nastali akcijski potencijal se prenosi u kralježničnu moždinu gdje se aktiviraju sljedeći neuroni u osjetnom putu. Izlučeni glutamat u središnjim sinapsama djeluje preko AMPA receptora koji su odgovorni za brzu sinaptičku transmisiju i preko NMDA receptora koji se aktiviraju uslijed učestalog ulaza impulsa s periferije. Ako je podražaj dovoljnog intenziteta, luči se i spori neurotransmitor supstancija P koji preko neurokininskih NK1 receptora pojačava postsinaptičku ekscitaciju spinalnih neurona. Upalna bol je posljedica upale ili ozljede tkiva. Periferno se, iz stanica oko nociceptora (npr. trombocita, mastocita, leukocita, fibroblasta) luče tvari, poput različitih kinina, serotonina, eikosanoida, citokina i dr. Aktivacijom nociceptora neke se tvari, poput supstancije P i peptida sličnom genu za kalcitonin (CGRP 9 -a), luče iz kolateralnih živčanih završetaka istog nociceptora (aksonski refleks). Živčani impuls koji je nastao u jednom ogranku aksonom se prenosi u kralježničnu moždinu, ali se antidromno rasprostire i u ostale kolateralne aksonske ogranke. To uzrokuje lučenje neuropeptida u koži. Supstancija P dovodi do vazodilatacije, a CGRP povećava kapilarnu permeabilnost. Neki medijatori upale, kao serotonin, ATP i protoni, djeluju izravno aktivirajući nociceptore, a drugi neizravno interferiraju sa signalnim procesima unutar nociceptora. Kao posljedica, smanjuje se prag aktivacije nociceptora, a podražljivost membrane aferentnog završetka se povećava što se 7 TRPV1 - transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 8 ASIC - acid sensing ion channel 9 CGRP - calcitonin gene-related peptide 11

13 naziva stanjem periferne senzitizacije. Pri upali dolazi do aktivacije i tzv. tihih ( silent ) nociceptora (10-20% C-nociceptora u koži koji se ne aktiviraju bolnim podražajima u fiziološkim uvjetima). Oni se, djelovanjem medijatora upale, senzitiziraju i odgovaraju na podražaje niskog i visokog intenziteta termalne, mehaničke i kemijske prirode. Neuropatska bol nastaje kao posljedica ozljede ili disfunkcije perifernog živčanog sustava i/ili SŽS-a npr. u dijabetesu, kroničnom alkoholizmu, HIV-infekciji, ozljedi kralježnične moždine i sl. Patofiziologija ove vrste boli je vrlo složena, a uključuje brojne patološke promjene na periferiji, tj. mjestu ozljede živca, kao i na spinalnoj te supraspinalnoj razini (Bach-Rojecky, 2006). Prema porijeklu bol se može podijeliti na kutanu, mišićnu, visceralnu, koštanu i dr Visceralna bol Bol različitih organa u trbušnoj ili u prsnoj šupljini jedan je od nekoliko kriterija koji se mogu primjeniti za kliničko dijagnosticiranje upale, zaraznih bolesti i drugih poremećaja unutarnjih organa. Ti organi često nemaju osjetnih receptora za druge modalitete osjeta osim za bol. Visceralna bol razlikuje se od kutane boli u nekoliko važnih pojedinosti, od kojih je najvažnija razlika u tome što točno lokalizirano oštećenje unutarnjih organa malokad uzrokuje jaku bol. Naprotiv, svaki podražaj koji vodi difuznoj stimulaciji živčanih završetaka za bol u nekom unutarnjem organu, uzrokovat će jaku bol. Svaki podražaj koji u velikim područjima abdomena pobuđuje živčana vlakna za bol može izazvati pojavu visceralne boli. Među takve podražaje pripadaju ishemija tkiva u utrobi, kemijsko oštećenje površine unutarnjih organa, spazam glatkog mišića šupljeg organa, prejako rastezanje šupljeg organa i istezanje vezivnog tkiva koje okružuje unuatrnji organ ili se u njemu nalazi. Gotovo svaka visceralna bol što potječe iz prsne ili trbušne šupljine prenosi se C aferentnim vlaknima, koji prenose dugotrajnu, tupu, nepodnošljivu bol. Kada neka bolest zahvati unutarnji organ, ona se često proširi i na parijetalni dio peritoneuma, pleure ili perikarda. Kao i koža, te su parijetalne površine obilno inervirane perifernim spinalnim živcima koji prenose osjet boli. Prema tome, bol iz parijetalne stijenke koja prekriva unutarnji organ je često oštrog karaktera. Dva su puta kojima se osjeti iz trbušne i prsne šupljine prenose u središnji živčani sustav; pravi visceralni put i parijetalni put. Prava visceralna bol prenosi se osjetnim vlaknima za bol u autonomnim živčanim snopovima, a osjet boli odražava se u područjima na površini tijela 12

14 koja su često udaljena od bolnog organa. Parijetalni se osjeti iz peritoneuma, pleure i perikarda provode izravno u lokalne spinalne živce. Ti se osjeti obično lokaliziraju neposredno iznad bolnog područja. Kada se visceralna bol odražava na površini tijela, općenito se lokalizira u onom dermatomskom segmentu iz kojeg unutarnji organ embriološki potječe, a ne u segmentu u kojemu se taj organ stvarno nalazi. Na Slici 7 vide se površinska područja u kojima se odražava visceralna bol iz unutarnjih organa (Guyton i Hall, 2006). Slika 7 Područja na površini tijela u kojima se odražava bol iz različitih unutarnjih organa (Guyton i Hall, 2006) Senzitizacija, hiperalgezija i alodinija Fenomeni senzitizacije, tj. pojačanja osjeta uslijed ponovljenog i učestalog podraživanja nociceptora, svojstveni samo kompleksnom osjetu boli, ostaju djelomično nerazjašnjeni. Dok kod drugih osjetnih stanica dugotrajniji podražaji uzrokuju njihovu prilagodbu i smanjenu podražljivost, kod senzornih neurona koji prenose bolne impulse to nije slučaj. Dugotrajnim podraživanjem nociceptora bol se pojačava i iz akutne prelazi u kroničnu. Periferna i središnja senzitizacija karakteriziraju upalnu i neuropatsku vrstu boli. Periferna senzitizacija je stanje povećane podražljivosti nociceptora. Periferno oslobođeni medijatori upale, poput bradikinina i prostaglandina, vežu se za metabotropne receptore spregnute s G-proteinima na membranama perifernih aferentnih završetaka. Oni dovode do aktivacije protein kinaza A i C koje fosforiliraju ionske kanale i receptore. Kao rezultat toga, smanjuju se pragovi aktivacije receptora i ionskih kanala, npr. TRPV1 receptora na termalni 13

15 podražaj, ASIC ionskih kanala na protone i dr. Podražljivost membrane nociceptora se povećava. Središnja senzitizacija, tj. povećana podražljivost neurona drugog reda u dorzalnom rogu kralježnične moždine, uključuje različite i vrlo kompleksne promjene u kralježničnoj moždini, a nastaje kao posljedica periferne sensitizacije i učestalog ulaza informacija s periferije. Središnja senzitizacija može biti brza i odgođena. Hiperalgezija i alodinija pojave su vezane uz bol koje se javljaju uz razna klinička stanja poput neuropatske boli. Njihova je pojava izrazitno bitna u eksperimentalnim modelima boli. Hiperalgezija je stanje povećane osjetljivosti na bolne podražaje. Može biti primarna; na mjestu ozljede tkiva ili živca, ili sekundarna; na mjestu izvan ozljede. Primarnu hiperalgeziju izazvat će termalni, mehanički i kemijski podražaji, a uzrok mogu biti ozljeda tkiva, upalni medijatori ili dugotrajni bolni podražaji. Mehanizam nastanka primarne hiperalgezije leži u promjeni fizioloških i farmakoloških ososbina C i Aδ vlakana. Sekundarnu hiperalgeziju izazivaju mehanički podražaji, a njezin uzrok mogu biti ozljeda tkiva ili živca. Nastaje zbog povećane podražljivosti središnjih neurona, a djelomično je neovisna o ulazu preko C i Aδ vlakana s periferije. Alodinija je stanje pojačane osjetljivosti na podražaje koji nisu bolni, primjerice dodir. Osim mehaničkog podražaja kao što je dodir, alodiniju će izazvati i hladnoća. Uzrok alodinije leži u ozljedi živčanog sustava, a mehanizam kojim se manifestira uključuje aktivaciju Aβvlakana, središnju senzitizaciju, reorganizaciju neurona dorzalnog roga kralježnične moždine, aktivaciju senzitiziranih neurona u dorzalnom rogu kralježnične moždine s C-vlaknima osjetljivim na kapsaicin. (Bach-Rojecky, 2006) Terapija boli Prema ATK (Anatomsko-Terapijsko-Kemijska klasifikacija lijekova) skupinama u terapiji boli primjenjuju se lijekovi iz skupine N 10 i M 11 : NSAIL (nesteroidni protuupalni lijekovi), opioidni i neopiodini analgetici i lokalni anestetici, ali se u liječenju boli primjenjuju i psihotropni lijekovi iz skupine antiepileptika i psihoanaleptika (triciklički antidepresivi), kao koanalgetici ( Pregled terapije boli vidljiv je u Tablici N - lijekovi s djelovanjem na živčani sustav 11 M - lijekovi s djelovanjem na koštano-mišićni sustav 14

16 Tablica 1 Odabir analgetika prema vrsti boli ( NOCICEPTIVNA NSAIL tramadol opioidi NEUROPATSKA antidepresivi antikonvulzivi tramadol opioidi spazmolitici adrenergici Nesteroidni anti-inflamatorni lijekovi (NSAIL) lijekovi su koji smanjuju sintezu prostaglandina blokirajući enzim ciklooksigenazu na periferiji i u kralježičnoj moždini, a djelotvorni su u boli blagog do srednje jakog intenziteta. Imaju protuupalni, analgetski i antipiretski učinak, a dijelimo ih na neselektivne i selektivne inhibitore izoenzima ciklooksigenaze 2. Opioidni agonisti djeluju u mozgu gdje pojačavaju silaznu inhibiciju, dok u kralježničnoj moždini smanjuju lučenje ekscitacijskih neurotransmitora i podražljivost neurona dorzalnog roga kralježnične moždine. Djeluju preko opioidnih receptora (Tablica 2). Djelotvorni su kod boli jakog intenziteta. Tablica 2 Tablica 3 Podtipovi, funkcija i afiniteti endogenih opioda za opioidne receptore (Katzung i sur., 2001) Podtip receptora Funkcija Afinitet endogenih opioida µ supraspinalna i spinalna analgezija, sedacija, depresija disanja, usporenje peristaltike, modulacija izlučivanja hormona i neurotransmitora endorfini > enkefalini > dinorfini δ κ supraspinalna i spinalna anlgezija, modulacija izlučivanja hormona i neurotransmitora supraspinalna i spinalna analgezija, psihotomimetski učinci, usporenje peristaltike enkefalini > endorfini i dinorfini dinorfini > endorfini i enkefalini 15

17 Lokalni anestetici, antiepileptici, antiaritmici i dr. svojim mehanizmima djelovanja, kao što je blokiranje N-tipa Ca 2+ kanala (gabapentin) i Na + kanala (lidokain), utječu na nastanak i/ili provođenje bolnih impulsa na periferiji i/ili u SŽS-u i tako stabiliziraju ili moduliraju funkciju nociceptora i drugih neurona u osjetnom putu. Dodatne terapijske mogućnosti uključuju primjenu kombinacije više tvari s različitim mehanizmima i mjestima djelovanja kako bi se postigao bolji i sigurniji analgetski učinak, a uz manje nuspojava (npr. kombinacija neopioidnih i opioidnih analgetika) i novije lijekove, od kojih su neki u fazama ispitivanja, poput agonista TRPV1 receptora, antagonista purinergičnih, serotoninergičnih 5-HT3 i glutamatnih NMDA receptora, ali i tvari poput kanabinoida (Bach-Rojecky, 2006) Botulinum toksin i bol Analgetski učinak BT-A prvi je puta pokazan na studijama u bolesnika s cervikalnom distonijom. Uočeno je kako analgetski učinak nastaje prije i traje duže od miorelaksirajućeg učinka BT-A (Jankovic i Schwartz, 1990). Analgetski učinak uočen je kasnije i u drugim studijama: smanjenje boli kod piriformis sindroma (Childers i sur., 2002), smanjenje boli u donjem dijelu leđa i poboljšanje funkcije (Foster i sur., 2001), smanjenje postoperacijske boli (Barwood i sur., 2000), učinak kod neuropatske boli; olakšavanje boli uzrokovane trigeminalnom neuralgijom (Allam i sur., 2005), postherpetičkom neuralgijom i perifernom neuropatijom (Klein, 2004.), smanjenje boli uzrokovane intersticijskim cistitisom i poboljšanje funkcije (Smith i sur., 2004), te povoljno djelovanje na kroničnu dnevnu glavobolju (Dodick i sur., 2005), kroničnu tenzionu glavobolju (Rozen i Sharma, 2006.) i migrenu (Chilson i Brown, 2005.). Prvi ciljani pokusi kojima je bila namjena istražiti analgetski učinak BT-A provedeni su formalinskim testom na šapi štakora. Formalinski model upalne boli karakteriziraju dvije odvojene faze; prva u trajanju od 0. do 15. minute i druga od 15. do 60. minute. Bol u prvoj fazi uzrokovana je izravnom stimulacijom nociceptora, dok se u drugoj fazi oslobađaju medijatori boli i dolazi do senzitizacije. Studija je pokazala da primjena BT-A smanjuje bolne reflekse štakora u drugoj fazi promatranja te da taj učinak traje 12 dana. Pretpostavljeni mehanizam analgezije jest inhibicija lučenja glutamata (i/ili neuropeptida) iz perifernih okončina neurona izazvanog formalinom (Cui i sur., 2004.). 16

18 Analgetički učinak dalje je promatran na modelu intersticijskog cistitisa izazvanog ocetnom kiselinom. Ocetna kislina primjenjena intravezikalno izazivala je kontrakcije trbuha u štakora. BT-A dan u mjehur životinje smanjio je kontrakcije uslijed boli i inhibirao otpuštanje CGRP-a s aferentnih živčanih završetaka. Ti su rezultati potpomogli tezu o terapiji intersticijskog cistitisa i drugih vrsta visceralne boli botulinum toksinom (Chuang i sur., 2004). Učinak periferno primenjenog BT-A proučavan je u dodatna tri modela: na modelu kirurški izazvane ozljede nervus ischiadicusa (Bach-Rojecky i sur., 2005), kapsaicinom te karagenanom uzrokovane upalne boli (Bach-Rojecky i Lacković, 2005). Na sva tri modela pokazano je da periferno primjenjeni BT-A smanjuje i mehaničku i toplinsku hiperalgeziju. U jednom od istraživanja na modelu neuropatije pokazalo se smanjenje neuropatske boli u trajanju od čak 21 dan nakon jednokratne primjene BT-A što je dalo veliku relevantnost botulinum toksinu kao analgetiku s obzirom na to da je farmakoterapija neuropatske boli izrazito siromašna učinkovitim i dugodjelujućim lijekovima (Luvisetto i sur., 2007). U modelu karagenanom uzrokovanog edema šape štakora i kod kapsaicinom uzrokovane eksravazacije proteina kao tipičnih karakteristika upale pokazalo se da BT-A nema nikakav utjecaj na upalu (Bach-Rojecky i sur., 2008). Na modelu dijabetičke neuropatije, te na modelu boli središnjeg porijekla uzrokovane intramuskularnim injiciranjem kisele fiziološke otopine (ph 4,0) postavljena je hipoteza o središnjem mjestu djelovanja BT-A. Budući da predtretman kolhicinom, blokatorom aksonalnog transporta, sprječava učinak BT-A pretpostavljeno je da je za djelovanje BT-A potreban retrogradni aksonalni transport (Bach-Rojecky i Lacković, 2009). Biokemijskim i imunohistokemijskim metodama istraživana je mogućnost aksonalnog transporta BT-A. Pronalazak pocijepanih SNAP25 (supstrata BT-A) u senzornim nociceptivnim jezgrama nakon periferne primjene BT-A (Matak i sur., 2011), kao i postojanje pocijepanog SNAP25 u kontralateralnom dijelu hipokampusa nakon unilateralne primjene BT-A potvrdili su teoriju o aksonalnom transportu i središnjem mjestu djelovanja BT-A (Antonucci i sur., 2008). Točan mehanizam djelovanja BT-A još uvijek nije u potpunosti razjašnjen i zahtjeva niz istraživanja, posebice jer mogućnosti primjene i širina indikacija BT-A rastu iz dana u dan. 17

19 2. OBRAZLOŽENJE TEME Visceralna bol je trajna, mukla i nepodnošljiva bol koja značajno smanjuje kvalitetu života bolesnika. Stoga je potrebno pronaći lijek koji će tijekom dužeg vremena učinkovito smanjiti patnju i bol, a pritom imati prihvatljivu podnošljivost i sigurnost, s minimalnim rizikom ulaska u interakcije s drugim lijekovima. U dosadašnjiim pretkliničkim ispitivanjima te u malom broju kliničkih studija, botulinum toksin se pokazao učinkovitim analgetikom sa svim prethodno navedenim svojstvima kvalitete. Dugotrajno djelovanje nakon jednokratne lokalne primjene je najvažnija karakteristika ovog toksina-lijeka koja ga razlikuje od svih analgetika na tržištu. Ukoliko bi se primjena botulinum toksina na visceralnu bol pokazala uspješnom, mnogim pacijentima pružila bi značajno poboljšanje kvalitete života, smanjila bi se potreba za korištenjem ostalih lijekova, što bi se odrazilo i na financijsko opterećenje pojedinca i čitavog zdravstvenog sustava. 18

20 3. MATERIJALI I METODE 3.1. Životinje U ovom istraživanju korišteni su mužjaci štakora soja Wistar u dobi od 3 do 4 mjeseca, težine 300 do 400g. Uzgajani su na Zavodu za farmakologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, u uvjetima 12-satnih ciklusa svjetla i tame uz neograničen pristup hrani i vodi. Slijedio se Zakon o dobrobiti životinja (Narodne novine 19/1999), te smjernice Međunarodne udruge za proučavanje boli (International Association for Study of Pain, IASP). Za obavljanje pokusa na projektima, čijih je ovaj diplomski rad dio, dobivena je dozvola Etičkog povjerenstva Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu (br / ). Za anesteziranje životinja prije određenog zahvata koristio se kloralhidrat i.p. 12 u dozi od 300 mg/kg Ispitivana tvar - botulinum toksin A U pokusima je korišten BT-A (Botox, Allergan, SAD). Bočica Botoxa sadrži 100 internacionalnih jedinica (i.j.) pročišćenog Clostridium botulinum toksina tipa A u obliku liofilizata. Jedna jedinica odgovara količini toksina koja nakon i.p. primjene uzrokuje smrt 50% miševa (LD50 = 0,048 ng = 1 i.j.). Sadržaj toksina u bočici otopljen je u fiziološkoj otopini, kako bi se dobila potrebna doza, a to je 2 i.j./kg. U pokusima za potrebe izrade ovog diplomskog rada BT-A je primjenjen na dva načina: intracisternalno (Takemoto, 2012) i intratekalno (Bach-Rojecky, 2006) Intracisternalna primjena Životinje su anestezirane kloralhidratom i namještene u odgovarajući položaj za injiciranje BT-A. U prostor cisterne magne 13 injicirano je (Tuberculin syringe 27G, Becton 12 i.p. - intraperitonealno 13 Cisterna cerebellomedullaris (Cisterna magna) je najveća subarahnoidna cisterna, smještena između malog mozga i medulle oblongate; prima cerebrospinalni likvor kroz otvore četvrtog ventrikula 19

21 Dickinson, SAD) 20 μl otopine BT-A. Ispravnost injiciranja potvrđena ekstrakcijom male količine likvora. Životinje su potom vraćene u kaveze. Prva mjerenja učinjena su 5 dana nakon injiciranja BT-A Intratekalna primjena Životinje su anestezirane kloralhidratom, a s leđne strane im je zarezana koža i potkožje dužinom od oko 2 cm iznad lumbalnog segmenta kralježnice. Između četvrtog i petog lumbalnog kralješka injicirano je (Tuberculin syringe 27G, Becton Dickinson, SAD) 20 μl otopine BT-A. Ispravnost injiciranja potvrđena je pomakom repa životinje. Životinjama su rezovi sašiveni, nakon čega su vraćene u kaveze. Prva mjerenja učinjena su 48 sati nakon injiciranja BT-A Kemikalije i reagensi Otopina anestetika kloralhidrata pripremljena je otapanjem 3g kloralhidrata (Chloral hydrate, Merck KGaA, Njemačka) u 40ml fiziološke otopine. Otopina octene kiseline masene koncentracije 1% pripremljena je razrijeđivanjem 0,5 ml octene kiseline (Kemika, Hrvatska) i 49,5 ml fiziološke otopine Eksperimentalni model boli Model visceralne boli korišten u ovom istraživanju bio je model grčeva uzrokovanih octenom kiselinom. Životinjama je injicirana otopina octene kiseline (1%) i.p. nakon čega su odmah smještene u kavez za promatranje. Kao pokazatelj boli uzet je broj grčeva, a životinje su promatrane tijekom 60 minuta. Grč je definiran kao kontrakcija abdominalnih mišića štakora popraćena pružanjem udova i elongacijom tijela, kao što je vidljivo na Slici 8 (Park i sur., 2012). Ovakvo ponašanje je posljedica somato-visceralnog odgovora budući da kemijski iritansi, uz to što izravno podražuju visceralna i somatska senzorna vlakna koja inerviraju trbušnu šupljinu, izazivaju i upalu. Dokazano je da citokini, kao što su TNFα (čimbenik nekroze tumora α), IL (interleukin)-1ß i kemokini, prostanoidi, bradikinin i cisteinil leukotrieni doprinose induciranju grčeva, zbog čega se ovaj test smatra modelom upalne visceralne boli. 20

22 Slika 8 Karakteristično grčenje štakora nakon i.p. primjene octene kiseline 1% 3.5. Statistička obrada rezultata Svi rezulatati dobiveni u ovom eksperimentu prikazani su kao srednja vrijednost skupine ± standardna pogreška aritmetičke sredine (SEM). Razlika varijanci između skupina analizirana je jednosmjernom analizom (One-Way ANOVA) nakon čega su rezultati dodatno provjereni Tukey's HSD 14 post-hoc testom. Kao statistički značajna, uzeta je vrijednost p< HSD - Honestly Significant Difference 21

23 4. REZULTATI I RASPRAVA Životinje su podijeljene u 5 skupina po 6 životinja. Dvije skupine služile su kao kontrola; prvoj skupini primjenjeno je 20 µl fiziološke otopine intracisternalno, a drugoj 20 µl otopine BT-A koja odgovara dozi od 2 i.j./kg intracisternalno, kako bi se utvrdilo utječe li sam postupak injiciranja na ponašanje životinja i uzrokuje li bolne odgovore. Životinje su, nakon buđenja iz anestezije promatrane tijekom 60 minuta. Na ovim skupinama životinja pokazano je da sam postupak injiciranja u cisternu magnu, ne uzrokuje bolne odgovore, niti utječe na ponašanje životinja. U prethodnim istraživanjima s BT-A pokazano je da sam postupak injiciranja fiziološke otopine i BT-A u spinalni kanal ne uzrokuje promjenu ponašanja životinja, tj. bolne odgovore koji bi utjecali na tijek pokusa (Bach-Rojecky i Lacković, 2009). Skupine životinja su tretirane kako je prikazano u Tablici 3. SKUPINA Tablica 3 Tretiranje životinja Fiziološka otopina (20 µl) BT-A (2 i.j./kg) Octena kiselina (10 ml/kg) 1 intracisternalno intracisternalno - 3 intracisternalno - intraperitonealno 4 - intracisternalno intraperitonealno 5 - intratekalno intraperitonealno U tablici 4 prikazani su pojedinačni rezultati srednjih vrijednosti broja bolnih odgovora (kontrakcije abdominalnih mišića praćene istezanjem i pružanjem udova) za 3 ispitivane skupine. Broj octenom kiselinom-uzrokovanih bolnih odgovora za skupine 4 i 5 uspoređivan je s vrijednostima skupine 3 koja je služila kao kontrola. Antinociceptivni učinak BT-A, izražen je i kao postotak inhibicije bolnih odgovora preko jednadžbe: ( ) 22

24 Tablica 4 Rezultati srednjih vrijednosti broja bolnih odgovora SKUPINA SREDNJA VRIJEDNOST ± STANDARDNA DEVIJACIJA ANTINOCICEPTIVNI UČINAK (%) KONTROLA (3) 137,5 ± 8,7 - BT-A i.cist. + octena kis. (4) 130,8 ± 10,3 4,87 BT-A i.t. + octena kis. (5) 89,8 ± 12,1 34,69 Iz navedenih rezultata (Tablica 4, Slika 9) vidljivo je da intracisternalno primjenjen BT-A (2 i.j./kg) nije smanjio broj bolnih odgovora u odnosu na kontrolu; p>0.05. S druge strane, intratekalna primjena BT-A u istoj dozi statistički je značajno smanjila broj bolnih odgovora u štakora; p<0.05. Antinociceptivni učinak BT-A nakon intratekalne primjene u dozi od 2 i.j./kg pokazan je u prijašnjim eksperimentima provedenim u Laboratoriju za molekularnu neurofarmakologiju Zavoda za farmakologiju Medicinskog fakulteta u Zagrebu i to na nekoliko eksperimentalnih modela boli, poput formalinskog testa i dijabetičke neuropatije. Na temelju tih rezultata pretpostavljeno je da je mjesto djelovanja BT-A središnje te da vjerojatno uključuje interferenciju sa središnjim neurotransmitorskim sustavima. U ovom radu prvi puta je ispitivana djelotvornost BT-A na modelu octenom kiselinomuzrokovane visceralne boli. Osim toga, do danas prema našim saznanjima, nije ispitivana djelotvornost BT-A nakon primjene u cisternu magnu. 23

25 Slika 9 Djelovanje BT-A na eksperimentalnu visceralnu bol uzrokovanu intraperitonealnom primjenom 1% octene kiseline. BT-A je primijenjen intracisternalno (i.cist.) ili intrateklano (i.t.) u dozi od 2 i.j./kg. Bolni odgovor podrazumijeva svaku kontrakciju abdominalnih mišića praćenu istezanjem i pružanjem udova. Rezultati su prikazani kao aritmetička sredina ± standardna devijacija, n=6. NS=nije signifikantno (p>0.05); *p<0.05 Inervacija unutarnjih organa dvostruka je (vidi Uvod; Visceralna bol) što predstavlja jedan od glavnih mogućih razloga neuspjeha intracisternalne primjene BT-A. Naime, unutarnji organi parasimpatički su inervirani nervus vagusom, koji ponire iz produljene moždine. Drugi put kojim se prenose osjeti iz unutarnjih organa je simpatički put, tj. inervacija spinalnim živcima koji u kralježničnu moždinu ulaze kod zadnjih torakalnih i prvih lumbalnih kralježaka. S obzirom da smo u cisternu magnu injicirali 20 µl otopine BT-A, moguće je da je taj volumen premalen da se proširi i djeluje, s obzirom da se volumen cerebrospinalne tekućine u štakora procjenjuje na oko 400 µl (Tomiyama i sur., 1999). Kako bi bolje razumjeli razloge neuspjeha intracisternalne primjene, potrebno je daljnjim pokusima ponajprije ispitati je li djelovanje BT-A nakon takvog injiciranja ovisno o dozi te volumenu i načinu injiciranja, kao i ispitati mogućnost širenja (razlijevanja) BT-A putem likvora u okolna područja i sl. Budući da ova ispitivanja zahtijevaju primjenu različitih doza BT-A u različitim volumenima, za njihovu provedbu potreban je i velik broj životinjama. Poštujući etičke smjernice i 24

26 principe, za potrebe ovog diplomskog rada ispitivana je samo jedna doza u jednom volumenu injiciranja. Važno je napomenuti da i.p. primjena octene kiseline uzrokuje bolne podražaje na unutarnjim organima, ali i na potrbušnici te ne predstavlja čisti eksperimentalni model za visceralnu bol, za razliku od modela kolorektalne distenzije, prostatitisa ili eksperimentalnog cistitisa (Yang i sur., 2006). Najvažniji rezultat ovog diplomskog rada je nalaz da intratekalna primjena BT-A u niskoj dozi značajno smanjuje bolne odgovore u modelu somato-visceralne boli čime su prošireni rezultati o antinociceptivnom djelovanju BT-A te dodatno učvršćena hipoteza o središnjem mjestu djelovanja BT-A; vjerojatno mehanizmom modulacije središnje senzitizacije (Lee i sur., 2011). 25

27 5. ZAKLJUČAK U ovom diplomskom radu ispitivano je djelovanje botulinum toskina tipa A na modelu visceralne boli uzrokovane intraperitonealnom primjenom 1%-tne octene kiseline u štakora. BT-A je primijenjen u dozi od 2 i.j./kg tjelesne mase štakora i injiciran je na dva načina: u cisternu magnu (intracisternalno) ili u spinalni kanal (intratekalno). Kao pokazatelj boli mjerio se broj abdominalnih grčeva tijekom 60 minuta nakon injiciranja 1%-tne octene kiseline. Dobiveni su sljedeći rezultati: - octena kiselina uzrokuje intenzivan bolni odgovor u životinja, koji je u skladu s podacima iz literature, - BT-A primijenjen u cisternu magnu 5 dana prije uzrokovanja boli ne smanjuje broj bolnih odgovora, - primijenjen u spinalni kanal 2 dana prije uzrokovanja boli, BT-A uzrokuje značajno smanjenje boli. Najvažniji rezultat ovog diplomskog rada je nalaz da intratekalna primjena BT-A u niskoj dozi značajno smanjuje bolne odgovore u modelu somato-visceralne boli čime su prošireni rezultati o antinociceptivnom djelovanju BT-A te je dodatno učvršćena hipoteza o njegovu središnjem mjestu djelovanja. Kako bi se razjasnila (ne)učinkovitost BT-A nakon intracisternalne primjene, potrebna su daljnja istraživanja koja bi uključivala primjenu više doza BT-A u različitim volumenima injiciranja te u različitim vremenima prije samog uzrokovanja boli. 26

28 6. LITERATURA 1. Allam N, Brasil-Neto JP, Brown G, Tomaz C. Injections of botulinum toxin type A produce pain alleviation in intractable trigeminal neuralgia. Clin J Pain, 2005, 21, Antonucci F, Rossi C, Gianfranceschi L, Rossetto O, Caleo M. Long-distance retrograde effects of botulinum neurotoxin A. J Neurosci, 2008, 28, Bach-Rojecky L, Lacković Z. Antinociceptive effect of botulinum toxin type A in rat model of carrageenan and capsaicin induced pain. Croat Med J, 2005, 46, Bach-Rojecky L., Lacković Z. Central origin of the antinociceptive action of botulinum toxin type A. Pharmacol Biochem Behav, 2009, 94, Bach-Rojecky L, Relja M, Lacković Z. Botulinum toxin type A in experimental neuropathic pain. J Neural Transm, 2005, 112, Bach-Rojecky L, Dominis M, Lacković Z. Lack of anti-inflammatory effect of botulinum toxin type A in experimental models of inflammation. Fundam Clin Pharmacol, 2008, 22, Bach-Rojecky L. Antinociceptivno djelovanje botulinum toksina tipa A. Zagreb, Sveučilište u Zagrebu, 2006, str Barwood S, Baillieu C, Boyd R, Brereton K, Low J, Nattrass G i sur. Analgesic effects of botulinum toxin A: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Dev Med Child Neurol, 2000, 42, Botox; Full prescribing information, 2012., pristupljeno Botox; Uputa o lijeku, 2010., pristupljeno

29 11. Botox mechanism of action, 2010., pristupljeno Botox medication guide, 2011., pristupljeno Botulism, 1996., pristupljeno Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA. Jawetz, Melnick & Adelberg's Medical Microbiology. New York, McGraw-Hill Medical, 2007, str Childers MK, Wilson DJ, Gnatz SM, Conway RR, Sherman AK. Botulinum Toxin Type A Use in Piriformis Muscle Syndrome: A Pilot Study. Am J Phys Med Rehabil, 2002, 81, Chilson CN, Brown SJ. Role of botulinum toxin type A in the prophylactic treatment of migraine headaches. Ann Pharmacother, 39, Chuang YC, Yoshimura N, Huang CC, Chiang PH, Chancellor MB. Intravesical botulinum toxin A administration produces analgesia against acetic acid induced bladder pain responses in rats. J Uro, 2004, 172, Cui M, Khanijou S, Rubino J, Aoki KR. Subcutaneous administration of botulinum toxin A reduces formalin-induced pain. Pain, 2004, 107, Davis MP. Drug Management of Visceral Pain: Concepts from Basic Research. Pain res Treat, 2012, Epub. 20. Dodick DW, Mauskop A, Elkind AH, DeGryse R, Brin MF, Silberstein SD. Botulinum toxin type a for the prophylaxis of chronic daily headache: subgroup analysis of patients not receiving other prophylactic medications: a randomized double-blind, placebo-controlled study. Headache, 2005, 45, Dressler D, Saberi FA, Barbosa ER. Botulinum Toxin Mechanism of Action. Arq Neuropsiquiatr, 2005, 1,

30 22. Foster L, Clapp L, Erickson M, Jabbari B. Botulinum toxin A and chronic low back pain; A randomized, double-blind study. Neurology, 2001, 56, Guide to Pain Management in Low-resource Settings, 2010., pristupljeno Guyton AC, Hall JE. Medicinska fiziologija. Zagreb, Medicinska naklada, 2006, str Jankovic J, Schwartz K. Botulinum toxin injections for cervical dystonia. Neurology, 1990, 40, Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. Temeljna i klinička farmakologija. Zagreb, Medicinska naklada, 2001, str Klein AW. The Therapeutic Potential of Botulinum Toxin. Dermatol Surg, 2004, 30(3), Lee WH, Shin TJ, Kim HJ, Lee JK, Suh HW, Lee SC. Intrathecal Administration of Botulinum Neurotoxi type A attenuates formalin-induced nociceptive responses in mice. Anest analg, 2010, 112, Luvisetto S, Marinelli S, Cobianchi S, Pavone F. Anti-allodynic efficacy of botulinum neurotoxin A in a model of neuropathic pain. Neuroscience, 2007, 145, Matak I, Bach-Rojecky L, Filipović B, Lacković Z. Behavioral and immunohistochemical evidence for central antinociceptive activity of botulinum toxin A. Neuroscience, 2011, 186, Myobloc; Full prescribing information, 2010., pristupljeno

31 32. Park SH, Sim YB, Kang YJ, Kim SS, Kim CH, Kim SJ i sur. Hop Extract Produces Antinociception by Acting on Opioid System in Mice. Korean J Physiol Pharmacol, 2012, 16, Rozen D, Sharma J. Treatment of tension-type headache with Botox: a review of the literature. Mt Sinai J Med, 2006, 73, Schantz EJ, Johnson EA. Properties and Use of Botulinum Toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine. Microbiol Rev, 1992, 1, Smith CP, Radziszewski P, Borkowski A, Somogyi GT, Boone TB, Chancellor MB. Botulinum toxin a has antinociceptive effects in treating interstitial cystitis. Urology, 2004, 64, Takemoto Y. Amino Acids That Centrally Influence Blood Pressure and Regional Blood Flow in Conscious Rats. J Amino Acids, 2012, Epub. 37. Tomiyama Y, Brian JE Jr, Todd MM. Cerebral Blood Flow During Hemodilution and Hypoxia in Rats. Storke, 1999, 30, Turton K, Chaddock JA, Acharya KR. Botulinum and tetanus neurotoxins: structure, function and therapeutic utility. Trends Biochem Sci, 2002, 27, Uloga ljekarnika u liječenju boli - općenito o boli, 2012., pristupljeno Uloga ljekarnika u liječenju boli - terapija boli, 2012., pristupljeno Ward AB, Barnes MP. Clinical Uses of Botulinum Toxins. Cambridge, Cambridge University Press, 2007, str Wexler P, Anderson B, de Peyster A, Gad S, Hakkinen PJ, Kamrin M i sur. Encyclopedia of Toxicology. Waltham, Academic Press, 2005, str

32 43. Xeomin; Prescribing information, 2011., pristupljeno Yang JP, Yao M, Jiang XH, Wang LN. Establishment of model of visceral pain due to colorectal distension and its behavioral assessment in rats. World J Gastroenterol, 2006, 12,

33 7. SAŽETAK/SUMMARY Mehanizmi nastanka visceralne boli, koja je posredovana perifernim i središnjim putevima te uključuje različite receptore, poput TRPV1, Na 1.8 i ASIC 3 ionskih kanala, kapa opiodinih receptora i dr. izuzetno su kompleksni i velikim dijelom nejasni. Budući da velik broj ljudi u svijetu pati od boli visceralnog porijekla, lijek koji bi tijekom dužeg vremena učinkovito i sigurno smanjivao patnju bolesnika je od neprocjenjive kliničke važnosti. Do danas je analgetsko djelovanje botulinum toksina tipa A pokazana u različitim eksperimentalnim modelima boli, te u nekoliko kliničkih studija. Dugotrajno djelovanje nakon jednokratne lokalne primjene je najvažnija karakteristika ovog toksina-lijeka koja ga razlikuje od svih analgetika na tržištu. U ovom diplomskom radu ispitivano je djelovanje botulinum toskina tipa A na modelu visceralne boli uzrokovane intraperitonealnom primjenom 1%-tne octene kiseline u štakora. BT-A je primijenjen u dozi od 2 i.j./kg i injiciran je na dva načina: u cisternu magnu (intracisternalno) ili u spinalni kanal (intratekalno). Kao pokazatelj boli mjerio se broj abdominalnih grčeva tijekom 60 minuta nakon injiciranja 1%-tne octene kiseline. Najvažniji rezultat ovog diplomskog rada je nalaz da intratekalna primjena, za razliku od intracisternalne primjene BT-A u niskoj dozi značajno smanjuje bolne odgovore u modelu somato-visceralne boli čime su prošireni rezultati o antinociceptivnom djelovanju BT-A te dodatno učvršćena hipoteza o njegovu središnjem mjestu djelovanja. Kako bi se razjasnila (ne)učinkovitost BT-A nakon intracisternalne primjene, potrebna su daljnja istraživanja koja bi uključivala primjenu više doza BT-A u različitim volumenima injiciranja te u različitim vremenima prije samog uzrokovanja boli. 32