TUBERKULOZA TUBERCULOSIS. Bajrović T., Nurkić M., Zvizdić Š.

Transcription

1 TUBERKULOZA TUBERCULOSIS Bajrović T., Nurkić M., Zvizdić Š. Abstract - Tuberculosis, known as the "White Plague" in the early 19 th century, is the infectious disease, which is being researched today even in some of the most developed countries in the world. Epidemiological- epizootiological research points to the importance of pasteurizing milk as well as the transmission in aerosolized droplets in humans and animals. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), M. bovis, M. africanum and M. microti are the mycobacteria that cause tuberculosis. Other mycobacteria cause diseases commonly known as mycobacteriosae. Pathogenesis of tuberculosis includes both hostrelated and mycobacterium-related factors (virulence). Mtb acts through the expression of various genes and their proteins that are detectable in the serums of the diseased only, proving these proteins are formed in the course of the disease. In humans, a diagnosis is established by the detection of antigens (and antibodies), and in animals, with the allergy tests. As far as the bovine tuberculosis is concerned, the combination of skin tuberculin and blood gamma interferon test is recommended. Sequential genome (Mtb) analysis has given the basis for further research of the new vaccines. Key words: Tuberculosis, pathogenesis, immunity Kratak sadržaj - Tuberkuloza, u ranom 19. vijeku nazvana "Bijelom kugom" je zarazna bolest koja se danas intenzivno proučava, a aktuelna je čak i u ekonomski najrazvijenijim zemljama svijeta. Epidemiološko-epizootiološka istraživanja ukazuju na važnost pasterizacije mlijeka, te aerosolni prenos infekta i među ljudima i među životinjama. Samo prave mikobakterije izazivaju tuberkulozu, a tu spadaju Dr. sc. Bajrović Tarik, DVM, redovni profesor, tbajrović@hotmail.com; Zavod za epizootiologiju; Veterinarski fakultet, Univerzitet u Sarajevu; dr. sc. Nurkić Mahmud, MD, redovni profesor, Institut za mikrobiologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Tuzli; dr. sc. Zvizdić Šukrija, MD, redovni profesor, Katedra za mikrobiologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Sarajevu. Bajrović Tarik, DVM, PhD, Professor, tbajrović@hotmail.com; Department of Epizootiology; Veterinary Faculty, University of Sarajevo; Nurkić Mahmud, MD, Professor, Institute of Microbiology, Medical Faculty, University of Tuzla; Zvizdić Šukrija, MD, Professor, Department of Microbiology, University of Sarajevo. Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

2 Mycobacterium tuberculosis (Mtb), M. bovis, M. africanum i M. microti. Ostale mikobakterije izazivaju bolesti koje nazivamo mikobakterioze. U patogenezu tuberkuloze uključeni su faktori od strane domaćina i od strane uzročnika bolesti (virulentnost). Učinak Mtb je kroz ekspresiju različitih gena i njihovih proteina koji se mogu dokazati samo u serumima oboljelih, što ukazuje na njihovo stvaranje tokom bolesti. U oboljelih ljudi, dijagnostika se bazira na dokazu antigena (i antitijela), a kod životinja na alergijskim testovima. Za goveda se preporučuje kombinacija kožnog tuberkulinskog i krvnog gama interferon testa. Sekvencijske analize genoma (Mtb) su dale osnovu za istraživanje novih vakcina. 122 Ključne riječi: Tuberkuloza, patogeneza, imunitet Historijat Tuberkuloza je stara i pažnje dostojna zarazna bolest koja tiho muči i ljude i domaće životinje širom svijeta. Bolest je dostizala epidemične razmjere za vrijeme ranog devetnaestog vijeka, pa je tada procijenjena kao "Bijela kuga" (5). Veoma važnim doprinosom u kontroli humane tuberkuloze nakon drugog svjetskog rata smatra se razvijanje prakse pasterizacije mlijeka, koja je vršena u većini zapadnih država. Prema Georgu i Payneu (cit. prema 5) time su se značajno smanjile infekcije djece Mycobacterium bovis. Prema Pollocku i sar. (19), goveđa tuberkuloza predstavlja veliki ekonomski problem, a potencijalno je značajna i za zdravlje ljudi. Tradicionalno testiranje i praksa klanja goveda bazirana na kožnom testu tuberkulinom nisu bili potpuno uspješni. U USA, tuberkuloza je bila glavni uzrok smrti ljudi u dvadesetom vijeku, a reducirana je poboljšanjem životnih prilika i upotrebom antibiotika (9). Od do godine približno 6% ljudi umrlih od tuberkuloze je u Velikoj Britaniji bilo inficirano goveđim mikobakterijama, a više od 50% svih tuberkuloznih cervikalnih limfadenitisa u djece je pripisano ovim mikobakterijama (Cosivi i sar god., Watson god.) (cit. prema 35). Pojave goveđe tuberkuloze u epidemijskoj formi u stadima u Engleskoj Wilesmith i sar god. su doveli u vezu sa inficiranim divljim jazavcima, a koji se prema Littleu i sar god. (cit. prema 32) pojavljuju kao alternativni domaćini za Mycobacterium tuberculosis. Dinamiku goveđe tuberkuloze u jazavaca pratili su Trewhella i Andersan god. i utvrdili da prevalenca raste sa gustinom naseljenosti jazavaca i da se oscilacije u prevalenci događaju periodično sa razmakom od 18 godina (cit. prema 32). Etiologija Uzročnici tuberkuloze su mikobakterije iz roda Mycobacterium gdje spadaju Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Mycobacterium bovis, M. africanum i M. microti. Ostale mikobakterije izazivaju bolesti, koje jednim imenom nazivamo mikobakterioze (15), a podijeljene su na prave i atipične mikobakterije. Mycobacterium leprae i M. africanum su patogeni za ljude i životinje. M. africanum je uzročnik tuberkuloze pluća

3 kod ljudi u Africi. M. microti izaziva tuberkulozu kod tekunica, zamoraca, kunića i goveda. Nieman i sar. (14) su opisali oboljenje pluća kod dva čovjeka koji su bili imunokompetentni. I za humanu i za veterinarsku medicinu značajne su brojne mikobakterije, a podjela prema patogenosti data je u tabeli 1. Tabela 1. Podjela mikobakterija prema patogenosti Table 1. Classification of mycobacteria according to their pathogenesis Grupe Vrste Oboljenja Patogene M. tuberculosis Tuberkuloza pluća i drugih organa ljudi i životinja M. bovis Tuberkuloza pluća i drugih organa životinja i ljudi M. africanum Tuberkuloza ljudi u Africi M. microti Tuberkuloza voluharica i sitnih glodara Uslovno patogene M. ulcerans Mikobakterioza kože ljudi M. avium Mikobakterioza pluća, limfnih čvorova M. intracellularae Mikobakterioza limfnih čvorova M. scrofulaceum Mikobakterioza limfnih čvorova M. xenopi Mikobakterioza pluća ljudi i ptica M. malmoensae Mikobakterioza pluća ljudi M. marinum Mikobakterioza kože M. kansasii Mikobakterioza pluća ljudi i dr. Saprofitne M. fortuitum Mikobakterioza pluća, apscesi nakon davanja injekcija. M. chelonae Mikobakterioza pluća i apscesi koji nastaju nakon davanja injekcija M. smegmatis Mikobakterije posjeduju ćelijski zid, citoplazmatsku membranu i citoplazmu sa inkluzijama. Ćelijski zid se sastoji od peptidoglikanskog skeleta sa kovalentno vezanim molekulama arabinogalaktan-mikolata prekrivenim slobodnim lipidima i polipeptidima. Dokazano je da u filtratu kulture Mtb postoji više od 100 proteina od kojih se samo 26 do 28 moglo prepoznati u serumima bolesnika od kavitarne tuberkuloze pluća koji su imali antitijela na 38 kilo Daltona (kda) protein. Karakteristike proteina (heat chock proteini, lipoproteini, sekretorni proteini) i enzima iskorištene su za klasifikaciju mikobakterija u grupe (tab. 2.). Heat shock proteini reaguju ukršteno sa monoklonskim antitijelima na ostale mikobakterije i oko 50 vrsta drugih bakterija. Među sekretorne proteine su klasificirani i ranije opisivani antigeni 85 kompleksa (antigen 85A, antigen 85B i antigen 85C) koji se luče u aktivnoj fazi rasta Mtb. Ovi proteini imaju aktivnost u sintezi mikobakterijskog ćelijskog zida i u preživljavanju mikobakterija. Ovi sekretorni proteini omogućavaju brzu invaziju alveolarnih makrofaga putem direktne interakcije između imunog sistema domaćina i Mtb (4). Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

4 Tabela 2. Klasifikacija proteina Mtb i M. bovis u grupe (11) Table 2. Classification of Mtb proteins and M. bovis in groups (11) Vrsta proteina prema Naziv proteina Napomena molekulskoj težini Het šok proteini 71 kda DnaK Monoklonska antitijela dobijena na ove proteine 65 kda GroEL reaguju na antigene ostalih mikobakterija i sa oko 12 kda GroES 50 vrsta bakterija. Lipoproteini 38 kda PhoS (Ag5) 19 kda 124 Monoklonska antitijela na ove antigene reaguju sa ostalim mikobakterijama. Sekretorni proteini 41 kda MPT kda MPT 45 (p) 31 kda MPT 44 (p) Glavni protein citopl.membrane 30 kda MPT 59 (p) Protein prisutan u citozolu. 27 kda MPT kda MPT 64 Antitijela su specifična za Mtb 23 kda MPB 70 Antitijela su specifična za Mtb 18 kda MPT 63 Antitijela su specifična za Mtb 15 kda MPT 53 Inducira strogi antitijelni odgovor na Mtb. Ne izaziva kasni ćelijski imunitet Enzimi 40 kda EC 23 kda SOD SOD - Superoksid dismutase, (p) izaziva protektivni imunitet. MPT - Mycobacterial protein tuberculosis, MPB - Mycobacterial protein bovis, EC-Enzim Catalase Epizootiologija Tuberkuloza se javlja najviše u mliječnim stadima i u objektima sa slabom ventilacijom i nedovoljnim osvjetljenjem, a frekventnija je u goveda starijih od 3 godine. Rijetke su koitalne i infekcije sa majke na fetus. Izlučivanje M. bovis kod eksperimentalno inficiranih goveda je prema Neillu i sar. (cit. prema 20) intermitirajuće i nije učestalo (10 do 60 dana postinfektivno), a uslovi pod kojima inficirana goveda prenose infekciju nisu jasni i vjerovatno zavise od broja izlučenih bacila, gustine stada i stvaranja aerosola. U ranijim pokusima Maddock je god. (cit. Prema 19) konstatovao da se u goveda "stražara", izloženih paši kontaminiranoj M. bovis nisu razvile lezije. Slab uticaj na širenje tuberkuloze s jednog govečeta na drugo u okolini kontaminiranoj inficiranim govedima konstatovali su i Francis god. i Morris i sar god. (cit. prema 19). Prema Pritchardu (1988. god.), Neilleu i sar. (1994. god.), Corneru (1994. god.) i Whippleu i sar. (1996. god.) (cit. prema 20) tuberkuloza, uključujući i goveđu bolest, je primarno infekcija respiratornog sistema.

5 Inicijalni pokušaji inficiranja goveda, bazirani na subkutanom i intravenskom challengeu, (Francisa god., Waddingtona i Ellwooda god. cit. prema 199). rezultirali su jakom sistemskom bolesti, ali pri tome nisu utvrđene patološke promjene koje bi ličile onima u prirodno inficiranih goveda. Infektivna doza, odnosno broj bacila potreban da izazove infekciju, različit je kod različitih individua iste vrste, a također i različitih vrsta. Eksperimentalna oralna infekcija goveda izazvana visokim dozama je rezultirala crijevnim lezijama koje uglavnom nisu zapažene u goveda tokom programa eradikacije tuberkuloze u razvijenim zemljama cit. prema Pollock i sar., 2005 (19). Palmer i sar. (cit. prema 20) su u prirodnoj infekciji ustanovili sličnu bolest nakon što su goveda izložili aerosolu sa više od 10 3 cell formol unite (cfu) M. bovis (cit. prema 20). To sugeriše da je inficiranje aerosolom važno za reproduciranje ove bolesti u goveda. Neill i sar. (cit. prema. 20) su dokazali da infekcija može biti izazvana i nakon inhalacije samo jednog bacila unutar kapljice aerosola. Patogeneza Patogeneza zavisi od najmanje dvije grupe faktora. To su faktori od strane domaćina i faktori od strane uzročnika bolesti. 1. Faktori od strane domaćina a. Putevi infekcije i infektivna doza Na osnovu anatomskih lokacija primarnih lezija u zaklanih tuberkuloznih goveda, prema Nieberleu (cit. prema 10), putevi tuberkulozne infekcije vode kroz pluća, crijeva i kongenitalno umbilikalnom venom. Mtb, kao obligatni aerobni mikroorganizam i intracelularni patogen ima predilekciju plućno tkivo odakle se širi limfnim ili krvnim putem u druge dijelove tijela, plućne vrhove i regionalne limfne čvorove. Ekstrapulmonalna tuberkuloza, kao što je tuberkuloza pleure, urogenitalnog, koštanozglobnog sistema, kože i drugih organa razvija se u oko 15 % slučajeva (21). b. Ćelije i citokini Alveolarni makrofagi i dendritične ćelije Mtb unešen u pluća aerogeno najčešće biva fagocitiran od strane alveolarnog makrofaga, i dolazi u kontakt sa dendritičnim ćelijama koje (DCs) koje čine mrežu oko sitnih disajnih puteva, krvnih sudova i vezivnog tkiva pluća. Nedavno je dokazano da se nakon ulaska u pluća Mtb veže za DCs pomoću intracelularne adhezivne molekule-3 (ICAM-3). U poređenju sa komplement receptorom-3 (CR-3) i manoza receptorima koji su glavni receptori za komplement, vezanje Mtb za DCs je mnogo značajnije, a mikobakterijski lipoglikan ili lipoarabinomanan (LAM) je identifikovan kao glavni ligand za stvaranje signala u dendritričnim ćelijama (DCs-SIGN) (33). DCs i alveolarni makrofagi prezentiraju T4 limfocitima mikobakterijske antigene, a mogu da aktiviraju i nativne T limfocite nakon njihove migracije na mjesto infekcije. Oni, nakon kontakta sa mikobakterijskim antigenima, vrše ekspresiju velikih Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

6 količina antigen-prezentirajućih molekula, kao što su molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti - major complex hystocompatibility (MHC I) i MHC II kompleksa kao i kostimulatorne molekule, kao što su CD 80 i CD 86 i solubilne faktore, kao što u IL-12, IL-18 ili IL-23. Kod prezentacija antigena značajnu ulogu ima Toll-like receptor-2 (TLR-2), i to u sazrijevanju mijeloidnih prekursora DCs ćelija u kompetentne antigen-prezentirajuće ćelije koje vrše ekspresiju CD 1 proteina (a, b, c). Kod mikobakterija su za aktivaciju lipid- reaktivnih T limfocita potrebna dva signala: lipidni antigen koji aktivira T-ćelijske receptore (TCRs) i lipidni adjuvant koji aktivira antigen-prezentirajuće ćelije (APCs) preko TLR-2 (26). Nakon kontakta sa Mtb DCs migriraju u regionalne limfne čvorove, gdje aktiviraju memorijske CD 4 i CD 8 koje postaju centralne komponente stečenog imunog sistema i iz tog razloga su postale osnova za izučavanje vakcinacije ljudi. Uloga DCs u aktivaciji CD 4 i CD 8 ćelija i izazivanju T-ćelijskog imunog odgovora nakon infekcije Mtb je potvrđena u mišijem modelu nakon deplecije ovih CDs (31). Prirodne ćelije ubice (natural killer cells-nk cells) su također baktericidne za Mtb. Dokazano je da postoji povezanost u aktivaciji između NK ćelija i dendritičnih ćelija putem mehanizama zavisnih od međućelijskog kontakta i solubilnih faktora (7). Tumor Necrosis Factor (TNF) sam po sebi ne inhibira rast bakterija kao što su Mycobacterium avium, ali može da bude značajan u aktivaciji makrofaga ljudi. On igra ulogu kao sekundarni signal u aktivaciji T ćelija koje onda aktiviraju makrofage. Kod nedostatka TNF primijećeno je defektno formiranje granuloma, oštećenje baktericidne aktivnosti makrofaga i oštećenje T-limfocita (Th) 1 imunog odgovora indukovanog mikobakterijama (8). Mehanizmi odgovorni za insuficijentnu T-ćelijsku protekciju u odgovoru na BCG vakcinaciju i infekciju Mtb su još nejasni, ali je sigurno da su ovdje upletene regulatorne T ćelije (Treg). Kako su Treg ćelije odgovorne za supresiju optimalnog imunog odgovora na Mtb ili BCG, vakcinalna strategija se treba usmjeriti na redukciju razvoja Treg ćelija (24). c. Uloga Th2 citokina i humoralnog imuniteta Humoralni imunitet kod tuberkuloze igra sekundarnu ulogu u odbrani organizma od Mtb. Međutim, stvaranje antitijela na različite mikobakterijske antigene može da pokaže razvoja i tuberkuloznog oboljenja. Ukoliko se povisio titar antitijela na neke mikobakterije uz pojavu povišenih vrijednosti citokina Th2 tipa, onda oboljenje ide u progresiju, a ako se titar smanji uz pojavu citokina Th1, onda dolazi do razvoja protektivnog imuniteta (34). d. Uloga antitijela Antitijela, inducirana sa BCG vakcinom, su većinom specifična za lipoarabinomanan. Fagocitoza bacila iz ove vakcine, uz prisustvo seruma osoba u postvakcinalnom periodu, značajno je povećana. Također, efekat inhibicije neutrofila i 126

7 monocitno-makrofagnih ćelija na rast Mtb je pojačan u prisutnosti seruma osoba koje su vakcinisane BCG vakcinom (1). e. Uloga gena čovjeka na oboljevanje od tuberkuloze Osjetljivost kod ljudi na tuberkulozu je uslovljena poligenetski, što ukazuje povećana osjetljivost kod monozigotnih u odnosu na dizigotne blizance i povećana osjetljivost kod nekih populacija. Geni koji kodiraju humani leukocitarni antigen (HLA- DRB1) receptore za vitamin D i NRAMP-1 (Natural Resistance-Associated Macrophage Protein -1) imaju ulogu u razvoju tuberkuloze kod ljudi. Mutacije u genima za sintezu receptora 1 i 2 za interferon gama (IFNγ), receptor (STAT 1), interleukini (IL-12 p40, IL -12R β1) dovode do redukcije djelovanja ili do smanjene sinteze IFNγ i favoriziraju virulenciju Mtb. Varijacija promotora u DC-SIGN, glavnog receptora za vezivanje Mtb je udružena u populacijama tuberkuloznih bolesnika u Evropi i Aziji (1). Catepsin Z. (2), stvoren u ranom fagozomu, adaptor TLR-a, komplement receptor 1 (CR1) (1) ili CD35 igraju ulogu u osjetljivosti domaćina na razvoj tuberkuloze. Nedavne studije kod tuberkuloznih pacijenata u Koreji su pokazale da je mikrosatelitni polimorfizam u intronu IL gena za TLR-2 udružen sa oboljevanjem od tuberkuloze (12). 2. Faktori od strane uzročnika bolesti (virulencija Mtb) a. Mehanizmi adaptacije Mtb u organizmu Nakon infekcije Mtb većina individua razvija imuni odgovor koji zaustavlja progresiju bolesti i do reaktivaciju latentnih bacila. Iz ovog razloga samo kod 10 do 15 % inficiranih individua bolest se razvija u pravcu primarne ili reaktivacije sekundarne tuberkuloze (11). Mtb se nakon ulaska u pluća adaptira na nove uslove, a to se ogleda u ekspresiji različitih gena, i njihovih proteina. U predkliničkom stadiju, Mtb stvara četiri antigena. Proteini Rv 3810, Rv3367 i Rv0538, imaju karakteristike sekretornih proteina, a četvrti Rv3246c ima karakteristike regulatornog proteina. Svi se mogu dokazati u serumima pacijenata bolesnih od tuberkuloze, ali ne i u serumima zdravih individua, što znači da se stvaraju tokom bolesti (11) b. Mehanizmi izbjegavanja imunog nadzora Nakon fagocitoze i stvaranja fagozoma u alveolarnom makrofagu obično dolazi do fuzije fagozoma i lizozoma u fagolizozom i dekstrukcije mikroorganizma. U fagozomima se nalaze žive mikobakterije udružene sa lizozomskim membranskim proteinima (lyzozome - associated membrane protein-lamp), kao što su LAMP -1 i LAMP-1 i catepsin D. Nakon smrti makrofaga Mtb se oslobađa i biva fagocitiran od neaktiviranih monocita ili makrofaga koji imigriraju u tkivo iz krvotoka. Intracelularna replikacija Mtb u neaktiviranim makrofazima se nastavlja i traje od 3 do 5 sedmica dok se ne aktivira i celularni i humoralni imuni odgovor. Tada na mjesto Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

8 infekcije dolaze limfociti i makrofagi koji su aktivirani i replikacija bacila se stavlja pod kontrolu (25). c.mehanizam nastanka latentne infekcije U akutnoj fazi Mtb se aktivno razmnožava i luči ESAT-6 (early secreted antigenic target 6 kda ) antigen koji izaziva ćelijski tip imuniteta i prevođenje infekcije u latentno stanje. Mtb je obligatni mikroorganizam koji u hipoksičnoj sredini alveolarnog makrofaga vrši dramatične promjene u transkripciji gena, što dovodi do nereplicirajuće perzistencije bacila (25). Osobe sa akutnom tuberkulozom, ili nedavno inficirane, imaju Thl imuni odgovor mjeren produkcijom IFNγ usmjeren prema ranom sekretornom 6kDa (ESAT-6 antigenu), dok osobe sa latentnom infekcijom imaju imuni odgovor usmjeren prema Rv2031c antigenu. Vrijednosti odnosa imunog odgovora na ESAT-6/Rv2031c su visoke kod tuberkuloznih bolesnika, a niske kod latentno inficiranih ljudi (30). Međutim, i studije izvedene sa panelom antigena, uključujući i Rv2031c su pokazale isti fenomen. Antitijela na Rv2031c su kod bolesnika u akutnoj fazi bila u niskom titru, dok se tokom liječenja titar istih antitijela povećavao (23). Prelaz bacila iz aktivne faze u latentnu fazu može se objasniti alteracijom transkripcije gena Mtb prilikom njegovog prelaska iz aerobne u hipoksičnu sredinu (2). Oko 2% genoma Mtb čine geni koji su potrebni za sintezu kompleksa lipida. Kod sinteze ćelijskog zida putem glikoziltransferaze i metiltransferaze ugrađuju se u njega različiti lipidi među kojima su samo fenolni udruženi sa virulencijom Mtb i modulacijom imunog odgovora (24). Inficirane ćelije produkuju methylglyoxal, tuberkulostatsku komponentu, koja participira u ćelijskoj apoptozi, koja je krucijalna za ubijanje mikobakterija (13). Nedavno, sekvencijska analiza genoma Mtb dala je osnovu za istraživanje novih vakcina protiv Mtb. Genom Mtb sadrži oko 4000 gena i pruža mogućnost identifikacije novih mikobakterijskih antigena. Uporednom hibridizacijom DNA Mtb i BCG vakcine utvrđena je genetička razlika između ove dvije vrste mikobakterija. Pored toga obaveznom BCG vakcinacijom Mtb se adaptirao na ovu vakcinu stvarajući iste prominentne antigene kao što ih stvara i BCG. Iz tog razloga, kod nove vakcine je potrebno naći specifične antigene za Mtb (13). Trehaloza, glavni intracelularni šećer, je komponenta glikolipida i igra ulogu u transportu mikolnih kiselina tokom sinteze ćelijskog zida, što može biti glavni faktor u zaštiti od ćelijskog stresa (29). Patomorfološki oblici bolesti kao rezultat infekcije Kao rezultat infekcije Mtb nastaje granulom čiji razvoj može ići, najkraće rečeno, u pet pravaca (17): 1. Labilan balans između rezistentnog mikroba i lokalne zaštite rezultira stabilnim imunitetom i odsustvom bolesti. U više od 90 % M. tuberculosis inficiranih individua infekcija se zaustavlja u toj fazi. 128

9 2. U rijetkim slučajevima proliferativni granulomi vode do potpunog uništenja patogena i nestanu. 3. Pri jakom imunom odgovoru preovladavaju nekrotične reakcije održavajući tkivne povrede. Klinička bolest je ograničena na zahvaćeni organ (tipično pluća), više benignog toka i uobičajeno nekontagiozna. 4. Zbog citolitičkih i ćelijskih mehanizama granulom postane eksudativan i uskoro tekuć. Nastaje kaverna. U ćelijskim ostacima Mtb se razvija nekontrolisano, a oštećenja u tkivu se markantno pogoršavaju na zahvaćenom organu. Mikrobna diseminacija putem krvi rezultira širenjem infekcije na različite (sekundarne) organe i prodor u bronhoalveolarni sistem, lako se šireći u okolinu. Bolest ima malignu formu i visoko je kontagiozna. 5. U slučaju insuficijencije ili deficijencije T-ćelijske imunosti, infekcije napreduju (AIDS i novorođenčad) do fatalne milijarne tuberkuloze. Mladi granulomi su promjera 1 mm ili manji, sivi i providni, a sa napredovanjem bolesti pojedini otvrdnu, a promjera su 10 cm ili viši. Kazeozni centar je žućkast, suh i pjeskovit, okružen fibroznim tkivom. U nekim slučajevima pleura (i visceralna i parijetalna) sadrži pojedinačne i multiple tvrde čvoriće smještene na površini (10). Klinička slika Zavisno od mjesta lokalizacije infekcije klinički znaci variraju, a budući da je bolest uvijek progresivna, tada je konstantna toksemija koja dovodi do slabosti, iznurenosti i eventualno do uginuća životinje. Goveda postaju tromija i pitomija. Kada su pluća jako zahvaćena javlja se dispnea, a kod tuberkuloze vimena induracija i hipertrofija vimena. U svinja se najčešće utvrde neprogresivni abscesi limfnih čvorova glave i vrata (22). Mačke su prirodno mnogo otpornije na M. tuberculosis nego na M. bovis, dok su psi i mačke otporniji od ljudi na netuberkulozne mikobakterije (Mycobacterium Avium Complex (MAC). Infekcije sa tuberkuloznim mikobakterijama i u pasa i u mačaka su često subkliničke, pa psi na farmama mogu biti rezervoari M. bovis za prijemčiva goveda (16). Pse sa limfadenomegalijom i čvorićima u plućima prati groznica, mršavost, anoreksija i grub neproduktivan kašalj, a i psi i mačke mogu imati hipersalivaciju, disfagiju, povraćanje i otok tonzila. U mačaka je češća crijevna lokalizacija nego u pasa, pri čemu povraćaju i imaju proljev, a širenje bolesti sa kože na pluća kod mačke rezultira respiratornim poremećajima. Kod nekih mačaka se zapaze tuberkulozni horioiditis i odvajanje retine te smetnje u CNS-u. Kod ljudi osnovni klinički znaci infekcije su kašalj, noćno znojenje i subfebrilna temperatura. Rendgenološki se nađu infiltrativne promjene na plućima, u uznapredovalim slučajevima sa kavernoznim promjenama (15). Netuberkulozne mikobakterije u starijih ljudi izazivaju plućne infiltrate i diseminiranu bolest, a u djece i mačaka lokalizirane limfadenitise. Nakon uvođenja genetičkih analiza neki slučajevi mačijeg leproznog sindroma su pripisani ovim mikobakterijama (6). Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

10 Dijagnostika Mikrobiološka dijagnostika se zasniva na izolaciji i identifikaciji uzročnika. Mikroskopsko ispitivanje različitih materijala kao što su sputum, urin, stolica, krv, različiti punktati i bioptički materijali, je nedovoljno osjetljivo, a za kultivisanje materijala na hranljivim podlogama je potrebno dugo vremena (15). Od molekularno-bioloških metoda u dijagnostici tuberkuloze koriste se genske probe i lančana reakcija polimeraze (Polymerase chain reaction PCR). Genske probe su kratki segmenti DNA koji se vežu za specifično mjesto odgovarajuće sekvencije DNA mikroorganizma. (36). Lančana reakcija polimeraze (Polymerase chain reaction PCR) se zasniva na amplifikaciji specifičnih segmenata hromozoma Mtb kao što je IS6110 segment uz pomoć enzima polimeraze. Ako se uporedi sa pozitivnim kulturama uzoraka na Mtb, njena osjetljivost se kreće skoro 100%, a specifičnost u 93%. Za njeno izvođenje potrebno je izdvojiti DNA Mtb, a zatim amplificirati specifični segment IS6110 uz prisustvo DNA polimeraze I DNA Mtb uz pomoć specifične mašine (Gene Amp PCR system 9600; Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT). Tako stvoreni PCR produkti se detektuju obično metodom elektroforeze i bojenja na gelu (28). Real-Time PCR Assay se zasniva na otkrivanju regiona razlikovanja (Regions difference RD) na genomu mikobakterija kao što su RD9 kod Mtb, RD4 kod M. africanum, M. caprae, M. microti i RD1 kod M. bovis BCG (18). Genske metode, koje se koriste za dokazivanje i identifikaciju mikobakterija, su različite i koriste različite ciljne fragmente (tabela 3). Tabela 3. Ciljni fragmenti i metode genotipizacije Table 3. Target fragments and methods of genotypisation Metoda genotipizacije PCR (Polymerase chain reaction - PCR) TMA (Transcription mediated amplification) SDA (the strand displacement amplification) NASBA (nuleic acid sequence based amplification) bdna (branched DNA) LiPA (line probe assay) Ciljni fragmenti IS6110, 65 kda i 85 kda 16S rrna IS S rrna IS6110, 65 kda, 85 kda IS6110, 65 kda, 85 kda Kožni testovi Još godine R. Koch je opisao reakciju kasne preosjetljivosti na dati ekstrakt dobijen od M. tuberculosis, prvo kod zamoraca, a potom i kod ljudi sa aktivnom tuberkulozom pluća (3). Nakon 54 godine Seibert dobiva prečišćeni proteinski derivat (PPD), koji je postao referentan za tuberkulinski test. Ovi bakterijski preparati su postali sredstva za postavljanje dijagnoze latentne tuberkuloze, jer se pokazalo da izazivaju kasnu reakciju preosjetljivosti kod senzibiliziranih osoba, ali koji ne izazivaju protektivni imunitet. Samo infekcije atenuiranim bacilom, kao što je Bacillus Calmette-Guerin (BCG) ili Mtb nose izvjestan stepen imuniteta protiv sekundarne infekcije Mtb (16). 130

11 Reakcije kasne preosjetljivosti naročito na mjestima u koži, u kožnom testu (tuberkulinska reakcija), obično se manifestira kao indurativni otok. Ova reakcija se može izbjeći tretiranjem životinja antikoagulansom (eksperimentalno). Depoziti fibrina su karakteristika kasnog tipa preosjetljivosti, a otvrdnuće čini deponovani fibrin koji je u vezi sa vezanom ekstravaskularnom vodom. Tkivna oštećenja nastala od ove reakcije mogu rezultirati gubitkom funkcije, zavisno od širine tkivne lokacije i oštrine reakcije (27). Reakcija u monokožnom testu (M. tuberculosis ili M. bovis) se čita između 48 i 96 sati nakon injekcije sa prioritetom od 48 do 72 sata za maksimalnu osjetljivost i 96 sati za maksimalnu specifičnost. Pozitivna reakcija se proglašava pojavom difuznog otoka na mjestu injekcije. Aplikacija tuberkulina u kožni nabor na vratu je osjetljivija, a u repni nabor specifičnija. Za maksimalnu specifičnost tuberkulinskog testa treba da doza bude između i tuberkulinskih jedinica (0.1 ml tuberkulina sadrži 0.1 ili 0.2 mg goveđeg PPD-a). Za test na vratu preporučuje se doza od 0.1ml tuberkulina za stada sa nepoznatim statusom, a 0.2 ml za poznata inficirana stada gdje su jedinke slabije osjetljivosti i oprezno se traže. Minimalna osjetljivost se nađe u ranoj ili kasnoj fazi bolesti, u starih krava i u krava koje su tek oteljene. Nakon provedenog monotesta, desenzibilizacija mora trajati 60 dana. Tuberkulozna goveda pred i nakon telenja prolaze kroz period hiporeaktivnosti dajući oko 30 % lažno negativnih reakcija sa povratkom na pozitivan status 4-6 sedmica kasnije. Injekcija tuberkulina u intradermalnom monotestu se vrši u vratni nabor. Nabor kože se izabere iznad centra ili iznad lateralnog dijela vrata (22). Serološke metode Mogu se dokazati antigeni raznih vrsta mikobakterija i razne vrste citokina kao produkt celularnog imuniteta. Dokazivanje antigena U svrhu dijagnoze tuberkuloze najčešće se dokazuje Lipoarabinomanan (LAM) u urinu i sputumu bolesnika ELISA metodom. Dokazivanje antitijela Za dokazivanje antitijela najčešće se koristi ELISA metoda. Kao antigeni se koriste Liporabinomanan, rekombinantni protein, 38kDa i A60 antigen. Specifičnost testova je od 70 do 100%, a osjetljivost od 50 do 90% (tab. 4). Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

12 Tabela 4. Testovi za dokazivanje antitijela Table 4. Tests for detection of antibodies Ime testa MycoDot Detect TB (ELISA) Pathozyme Myco (ELISA) Antigen A60 ICT (Imunohromatografski test) Antimycobacterial superoxide dismutase assay Korišteni antigeni Lipoarabinomanan (LAM) Rekombinantni protein peptid 38kDa i LAM Ag A60 38kDa Superoxid dismutasa Mjerenje produkcije IFNγ od strane senzibilisanih limfocita Najznačajniji korak u razvoju dijagnostičkih metoda baziranih na otkrivanju citokina IFNγ učinili su Wood i Rothel (cit. prema. 19). Oni su pokazali da se IFNγ testovi mogu koristiti uz PPD sa porastom specifičnosti na Mtb kompleks. Mjerenje produkcije IFNγ od strane senzibilisanih limfocita zasniva se na nizu utvrđenih dosadašnjih spoznaja: Mtb posjeduje regione razlike (Regions differences RD) koji mogu da kodiraju relevantne antigene za zaštitu ili za dijagnozu. RD1 kodira produkciju ESAT6 (early secretory antigen TB) specifičnog antigena kda kod tuberkuloznih bolesnika. ESAT-6 antigen je moćan induktor sekrecije IFNγ T ćelija. ESAT-6 antigen prepoznaju T ćelije kod tuberkuloznih bolesnika, a ne kod besežiranih ili zdravih individua. Nivo produkcije IFNγ se povećava kod liječenih u odnosu na neliječene tuberkulozne bolesnike i povezan je sa povećanjem otpornosti protiv Mtb. Ovaj metod se može koristiti za monitoring tuberkuloznih bolesnika Pollock i Andersen (cit. prema. 19), su pokazali da antigen ESAT-6 poboljšava specifičnost u poređenju sa PPD-B, a Pollock i sar. (2000. god.) da korištenje ESAT 6 u IFNγ testu poboljšava specifičnost testa do 99,2 % u poređenju sa 92,2 % za PPD. Neka goveda mogu biti pozitivna na oba testa, ali neka mogu biti pozitivna samo na kožni ili IFNγ test (19). Kada su Pollock i sar. (cit. prema. 19). poredili veličine reaktivnosti kožnog i IFNγ testa i dobili visoke odgovore u jednom i niske u drugom testu, Neill i sar. (cit. prema. 19). su to protumačili tvrdnjom da prekomjerna dijagnostička osjetljivost može biti smanjena paralelnom upotrebom dva testa. Ovi autori ističu da su ove IFNγ pozitivne, a kožnim testom negativne krave prilikom uklanjanja sa farme ispitivali postmortalno i da su lezije tipične za TBC utvrdili samo u jedne životinje. Činjenica da su neke inficirane krave sa M. bovis pozitivne u kožnom testu, a negativne u IFNγ testu je upućivala na mogućnost da povišeni nivo citokina bi mogao poboljšati osjetljivost kožnog testa. 132

13 Citokini IL-12, koji su najvažniji za uvođenje Thl odgovora, mogu pomoći otpuštanju antigenom stimulisanih IFNγ. Kako infekcija napreduje i životinje razvijaju snažne IFN gama odgovore, relacije između nivoa IFNγ i nivoa bolesti postaju manje jasne. Dodatno, cirkulirajući IgG1 (ali ne i IgG 2) nivoi antitijela su bili u pozitivnoj korelaciji sa patološkim promjenama u goveđe tuberkuloze (19). To upućuje na mogućnost aplikacije više od jednog testa radi dobijanja više informacija o statusu bolesti svake životinje. Ipak, da su oskudna antitijela i humoralna i celularna u inficiranih krava sa M. bovis izvijestili su Wood i sar., Ritacco i sar., Harboe i sar. i Plackett i sar. (cit. prema.19). Vakcine U radu sa vakcinama značajni su rezultati Vordermeier-a i sar. (cit. prema 35). Oni su pokazali da DNA vakcina dobijena sa mikobakterijalnim antigenom (MPB) 83 rezultira u jakom humoralnom i sistemskom ćelijskom imunom odgovoru, karakteriziranim sa IFNγ izlučenim od CD4 T-ćelija u testiranih goveda, dok vakcinacija sa MPB 70 inducira imuni odgovor u polovine vakciniranih goveda. Ni MPB 83 ni MPB 70 DNA vakcine ne ćine goveda osjetljivim na kožni tuberkulinski test. Tuberkulinski kožni test za BCG i DNA vakcine u goveda bio je procijenjen 4 do 6 sedmica kasnije komparativnom cervikalnom tuberkulinizacijom prema specifikaciji EEC, Direktiva 80/219 EEC, ispravka Direktiva 64/422/EEC aneks B upotrebom goveđeg i ptičijeg tuberkulina PPD-a (37). DNA je nova subjedinična vakcinalna strategija s obzirom da produkcija i purifikacija ne zahtijevaju nivo optimizacije koja se traži za na proteinu baziranim subjediničnim vakcinama. LITERATURA 1. Beck JM. The immunocompromized hosts: HIV infection. Proc Am Thorac Soc. 2005; 2(5): Bothamley GH. Epitope specific antibody levels demonstrate recognition of new epitopes and changes in titer but not affinity during treatment of tuberculosis. Clin Diag Lab Immunol 2004; 11: Collins FM. The immunology of tuberculosis. Am Rev Respir Dis.1982;125/3: De Valliere S, Abate G, Blažević A, i sar. Enhancement of innate and cell mediated immunity by antimycobacterial antibodies. Infect immune. 2005; 73(10): Germanier R. Bacterial Vaccines, 1984; Academic Press,INC 6. Greene CE. Infectious diseases of the dog and cat, 3 edit.2006; Saunders Elsevier. Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

14 7. Gerosa F, Baldani-Guerra B, Nissi C, i sar.reciprocal activating interaction between natural killer cells and dendritic cells. J Exp Med. 2002; 176(4): Guler R, Olleros ML, Vesin D, i sar. Differential effects of total and partial neutralization of TNF on cell-mediated immunity to Mycobacterium bovis, BCG infection. Infect Immunol. 2005; 73(6): Hunter RL. Overview of vaccine adjuvants: present and future Vaccine 2002; 20: Jensen R, Mackey R. Disease of FeedLot Cattle, 3. edit. 1979; Lea and Febiger, Philadelphia. 11. Johnson S, Brusascka P, Lyashchenko K, i sar. Characterisation of the secreted MPT53 Antigen of MTB. Infection and Immunity. 2001; 69/9: Kampmann B, Hemigway C, Stephens A, i sar. Acqured predisposition to mycobacterial disease due to antibodies to IFN gama. J clin Invest. 2005; 115(9): Kaufmann SH, Cole ST, Mizrahi V, i sar. Mycobacterium tuberculosis and the host response. J Exp Med. 2005; 201(11): Niemann S, Richter E, Falugge-Tamm H, i sar. Two cases of Mycobacteriu microti derived tuberculosis in HIV negative immunocompetent patients. Emer infect dis. 2000; 6(5): Nurkić M. i sar. Mikobakterije, Klinički značaj i dijagnostičke metode.univerzitet u Tuzli i PrinCom Tuzla Orne IM. Characteristics and specifity of acquired immunologic memory to Mycobacterium tuberculosis is mediated by human monocyte complement component C3. J Immunolog. 1988; 140: Paul WE. Fundamental immunology, 3. edition. 1993; Raven Press, LTD; 1185 Avenue of the Americas New York. 18. Pinsky AB, Banaei N. Multiplex real-time PCR assay rapid identification of mycobacterium complex members to the species level. JCM 2008; 46(7): Pollock J M, Welsh MD, McNair J. Immune responses in bovine tuberculosis: Towards new strategies for the diagnosis and control of disease.vet. Immunology and Immunopathology. 2005; 108: Pollock J M, Rodgers JD, Welsh MD, i sar. Pathogenesis of bovine tuberculosis :The role of experimental models of infection.veterinary Microbiology.2006;112: Raja A.Immunology of tuberculosis. Indian J Med Res. 2004; 120: Radostits OM, Blood DC, Gay CC. Veterinary medicine. 8.edit. 1994; Bailliere Tindall, W.B. Saunders. 23. Ramachandra L, Noss E, Boom H, i sar. Proccesing of Mycobacterium tuberculosis Antigen 85B Involves Intraphagosomal Formation of Peptide-major 134

15 Histocompatibility Complex II Conplexes and Is Inhibited by Live Bacilli that Decrease Phagosome Maturation. JEM 2001; 194/10: Reed MB, Domenech P, Manca C, i sar.a glycolipid of hypervirulent tuberculosis strains that inhibits the innate immune response.nature 2004; 431(7004): Ronning DR, Vissa V, Besra GS, i sar. Mycobacterium tuberculosis Antigen 85A and 85C Structures Confirm Binding Orientation and Conserved Substrate Specificity. Biol Chem. 2004; 279/35: Roura Mir C, Wang I, Cheng TY, i sar. Mycobacterium tuberculosis regulates CD1 antigen presentation pathways through TL.R-2. J Immunolog. 2005; 175/3: Slauson DO, Cooper BJ. Mechanisms of Disease. 1982; Williams and Willkins. 28. Salian VN, Rish AJ, Eisenach DA, i sar. Polimerase chain reaction to detect Mycobacterium tuberculosis in histologie specimens.am J resp crit care med. 1998; 158(4): Schalible UE, Winau F, Sielin PA, i sar. Apoptosis facilitates antigen presentation to the lymphocytes trough MHC -1 and CD1 in tuberculosis. Nat Med. 2003; 9(8): Singh KK, Zhang X, Patibandla AS, i sar. Antigens of Mycobacterium tuberculosis during preclinical tuberculosis. Serological immunodominance of proteins with repetitive amino acid sequences. Infection and Immunity. 2001; 69/6: Stegelmann F, Bastian M, Swoboda K, i sar. Coordinate expression of CC chemokine ligand 5, granulysin and perforin in CD8 plus T cells provides a host defense mechanism against Mycobacterium tuberculosis. J Immunol.2005; 175(11): Thrusfield M. Veterinary epidemiology, 2. edit.1997; Blackwell Science LTD. 33. Tailleux L, Schwartz O, Hermann JL, i sar. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med. 2003; 197/1: Torres M, Herrera T, Villareal H, i sar. Cytokine Profiles for Peripherzia Blood Lymphocytes from Patients with Active Pulmonary Tuberculosis and Healthy Household Contacs in Respoonse to the 30-Kilodalton Antigen of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun.1998; 1: Vordermeier HM, Cockle PJ, Whelan AO,i sar. Effective DNA vaccination of cattle With the mycobacterial antigens MPB 83 and MPB70 does not compromise the specifity of the comparative intradermal tuberculin skin test.vaccine, 2000; (19): :Anonymous (BW) gen probe rapid tuberculosis test wins FDA approval; test uses genetic probe technology to dramatically cut detection time, business wire, 18 dec Veterinaria 58 (1-2), , Sarajevo

16 Community EE,EEC directiva 80/219 EEC, amending directive 64/432 annexe B. Official Journal.1980; LO47: Uredništvo primilo rukopis