UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA DIPLOMSKO DELO Evelina MOHORKO

2 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijski program: Kemija in biologija ODZIV TREH VODNIH RASTLIN NA SPREMEMBO VSEBNOSTI SELENITA V OKOLJU DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij THE RESPONSE OF THREE AQUATIC PLANTS TO DIFFERENT CONCENTRATION OF SELENITE IN MEDIA GRADUATION THESIS University studies Mentorica: doc. dr. Mateja Germ Somentorica: dr. Špela Mechora Kandidatka: Evelina Mohorko Ljubljana, 2013

3 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. II Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija Kemije in Biologije na Pedagoški fakulteti. Opravljeno je bilo na Katedri za ekologijo in varstvo okolja na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Študijska komisija Oddelka za biologijo je 11. april 2013 odobrila predlagano temo diplomske naloge z naslovom Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. Za mentorico je imenovala doc. dr. Matejo Germ, za somentorico pa dr. Špelo Mechora. Komisija za oceno in zagovor: Predsednica: Članica: Članica: prof. dr. Alenka Gaberščik Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo doc. dr. Mateja Germ Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo dr. Špela Mechora Član: prof. dr. Ivan Kreft Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Datum zagovora: Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Podpisana se strinjam z objavo svojega dela v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je delo, ki sem ga oddala v elektronski obliki, identično tiskani verziji. Evelina Mohorko

4 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. III ŠD Dn KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA DK :546.23(043.2)=163.6 KG AV SA vodne rastline/vpliv selenita/fotokemična učinkovitost/ets/barvila MOHORKO, Evelina GERM, Mateja (mentorica)/mechora, Špela (somentorica) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 ZA LI 2013 IN TD OP IJ JI AI Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta ODZIV TREH VODNIH RASTLIN NA SPREMEMBO VSEBNOSTI SELENITA V OKOLJU Diplomsko delo (univerzitetni študij) X, 63 str., 24 sl., 5 pregl., 1 pril., 117 vir. sl sl/en V diplomskem delu smo ugotavljali odziv treh vodnih rastlin (klasasti rmanec Myriophyllum spicatum, navadni rogolist Ceratophyllum demersum in preraslolistni dristavec Potamogeton perfoliatus) na spremembo vsebnosti selenita v okolju. Vse izbrane vodne rastline smo najprej različno dolgo izpostavljali mediju z dodanim selenitom (NaSeO 3 ) 10 mg/l, in sicer od 1 do 15 dni. Po končanih obravnavanjih smo rastline za 5 dni presadili v medij brez dodanega selenita. Po vsakem obravnavanju smo izmerili fiziološke in biokemijske lastnosti preučevanih rastlin. Spremljali smo fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II), aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS), vsebnost fotosinteznih barvil (klorofil a, klorofil b in karotenoidov) in vsebnost antocianov. Ugotovili smo, da so se izbrane rastline različno odzvale na različen čas obravnavanja v mediju z dodanim selenitom; po daljšem obravnavanju v mediju z dodanim selenitom smo opazili negativne vplive na izbrane rastline. Vrsta P. perfoliatus je bila najbolj občutljiva, saj je začela propadati že 4. in 5. dan obravnavanja v mediju z dodanim selenitom. Za vse tri vrste velja, da so si rastline opomogle, ko smo jih presadili iz medija z dodanim selenitom po krajših izpostavitvah v medij brez dodanega selenita. Rastline so namreč imele po presaditvi v medij brez dodanega selenita namreč višjo potencialno fotokemično učinkovitost od obravnavanih rastlin. Po daljših obravnavanjih rastlin v mediju z dodanim selenitom, se aktivnost ETS, vsebnost klorofila a in klorofila b ter vsebnost antocianov v večini primerov zniža v primerjavi s krajšimi obravnavanji.

5 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. IV DN Dn DC :546.23(043.2)=163.6 CX AU AA KEY WORDS DOCUMENTATION aquatic plants/effect of selenite/photochemical efficiency/ets/pigments MOHORKO, Evelina GERM, Mateja (supervisor)/mechora, Špela (co-supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 PB PY 2013 TI DT NO LA AL AB Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta THE RESPONSE OF THREE AQUATIC PLANTS TO DIFFERENT CONCENTRATION OF SELENITE IN MEDIA Graduation Thesis (University studies) X, 63 p., 5 tab., 24 fig., 1 ann., 117 ref. sl sl/en The response of three aquatic plants (Myriophyllum spicatum, Ceratophyllum demersum and Potamogeton perfoliatus) to the change in selenite content in their environment was studied. All chosen aquatic plants were at first exposed to the medium with 10 mg/l of added selenite for various days of exposure (1 to 15 days). After the treatments the plants were transplanted to medium without added selenite for 5 days. After each treatment the photochemical efficiency of photosystem II (PS II), electron transport system activity (ETS), content of chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoids and anthocyanin were measured. The chosen plants responded differently to various days of exposure in the medium with the added selenite; negative effects was noticed on the chosen plants after longer exposure to the medium with added selenite. P. perfoliatus proved to be the most sensitive since it started decaying already after 4 and 5 days of treatment in the selenite medium. All three plants recovered after being transplanted from selenite medium (shorter treatments) to the medium without added selenite. When transplanted to medium without added selenite the plants showed a higher photochemical efficiency then the plants exposed to selenite. After longer treatments in the medium with added selenite the electron transport system activity, content of chlorophyll a and chlorophyll b and content of anthocyanins mostly decreased in comparison to levels, measured during shorter treatments.

6 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. V OKRAJŠAVE IN SIMBOLI CaCO 3 Cys DMDSe DMSe ETS FS II Fv/Fm kar kl a kl b Met MgSO 4 Se Se-cisteil-tRNA SeCys SeMeSeCys SeMet UGA UV kalcijev karbonat cistein dimetil diselenid dimetil selenid elektronski transportni sistem fotosistem II potencialna fotokemična učinkovitost karotenoidi klorofil a klorofil b metionin magnezijev sulfat selen selenocisteil-trna selenocistein selenometil selenocistein selenometionin Uracil-Gvanin-Adenin ultravijolično sevanje

7 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. VI KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA...III KEY WORDS DOCUMENTATION...IV OKRAJŠAVE IN SIMBOLI...V KAZALO SLIK...VIII KAZALO TABEL...X 1 UVOD NAMEN DELA HIPOTEZE PREGLED OBJAV SELEN POMEN SELENA ZA ŽIVALI IN LJUDI SELEN V OKOLJU Selen v zraku Selen v tleh Selen v vodi SELEN IN RASTLINE Privzem in transport selena Neakumulatorske in akumulatorske rastline Vpliv selena na rastline MAKROFITI Vloga makrofitov v vodnem okolju ZMANJŠANJE PRISOTNOSTI SELENA V VODNEM OKOLJU MATERIALI IN METODE POSKUS Poskusne rastline Poskusne razmere MERITVE Fiziološke meritve... 16

8 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. VII Potencialno fotokemična učinkovitost FS II Meritve aktivnosti elektronskega transportnega sistema (ETS) Biokemijske meritve Vsebnosti klorofilov a in b ter karotenoidov Vsebnost antocianov STATISTIČNE ANALIZE REZULTATI Fiziološke meritve Potencialna fotokemična učinkovitost FS II Aktivnost elektronskega transportnega (ETS) sistema Biokemijske meritve Vsebnosti klorofilov a in b ter karotenoidov Klorofil a Klorofil b Karotenoidi Vsebnost antocianov RAZPRAVA Potencialna fotokemična učinkovitost FS II Aktivnost ETS Barvila Klorofil a, klorofil b in karotenoidi Antociani SKLEPI POVZETEK SUMMARY PRENOS PRIDOBLJENEGA ZNANJA NA POUK V OSNOVNI ŠOLI Analiza učnih načrtov za devetletno osnovno šolo v povezavi s temo diplomskega dela Učna priprava VIRI ZAHVALA PRILOGE

9 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. VIII KAZALO SLIK Slika 1: Posoda z vrsto Potamogeton perfoliatus L. preraslolistni dristavec Slika 2: Vrsta Ceratophyllum demersum L. navadni rogolist Slika 3: Posoda z vrsto Myriophyllum spicatum L. klasasti rmanec Slika 4: Razporeditev posod za poskus Slika 5: Postavitev poskusa Slika 6: Potencialna fotokemična učinkovitost pri vrsti M. spicatum (n=5, povprečna vrednost ± SD) Slika 7: Potencialna fotokemična učinkovitost pri vrsti C. demersum (n=5, povprečna vrednost ± SD) Slika 8: Potencialna fotokemična učinkovitost pri vrsti P. perfoliatus (n=5, povprečna vrednost ± SD) Slika 9: Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) [µl(o 2 )mg -1 (sm)h -1 ] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 10: Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) [µl(o 2 )mg -1 (sm)h -1 ] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 11: Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) [µl(o 2 )mg -1 (sm)h -1 ] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 12: Vsebnost klorofila a (kl a) [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 13: Vsebnost klorofila a (kl a) [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 14: Vsebnost klorofila a (kl a) [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 15: Vsebnost klorofila b (kl b) [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 16: Vsebnost klorofila b (kl b) [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 17: Vsebnost klorofila b (kl b) [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 18: Vsebnost karotenoidov [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 19: Vsebnost karotenoidov [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 20: Vsebnost karotenoidov [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 21: Vsebnost antocianov [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD) Slika 22: Vsebnost antocianov [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD)... 35

10 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. IX Slika 23: Vsebnost antocianov [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost± SD) Slika 24: Vrsta Myriophyllum spicatum obravnavana 1 oz. 15 dni v mediju z dodanim selenitom

11 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. X KAZALO TABEL Tabela 1: Tabela obravnavanj za posamezno rastlino Tabela 2: Fotokemična učinkovitost rastlin po presaditivi iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita Tabela 3: Aktivnost ETS rastlin po presaditivi iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita Tabela 4: Vsebnost klorofila a, klorofila b in karotenoidov v rastlinah po presaditvi iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita Tabela 5: Vsebnost antocianov v rastlinah po presaditvi iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita... 44

12 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 1 1 UVOD Se je esencialno hranilo v sledovih za ljudi, živali in mikroorganizme, vendar je meja med esencialnostjo in strupenostjo ozka ter odvisna od oblike Se, koncentracije in drugih okoljskih spremenljivk (Fan in sod., 2002). Esencialnost Se za višje rastline pa je še vedno vprašljiva (Shanker, 2006), vendar vedno več raziskav kaže na to, da utegne igrati pomembno biološko vlogo tudi pri njih (Hartikainen in sod., 2000; Xue in sod., 2001; Seppänen in sod., 2003). Se najdemo v zraku, v tleh in v vodnih sistemih. Za vodno življenje je Se strupen pri relativno nizkih koncentracijah (US EPA, 1987). US EPA (1998) je za kronično mejo strupenosti postavila koncentracijo Se nad 5 µg/l. V Sloveniji se v izbranih celinskih vodotokih koncentracija Se giblje v razponu od 0,07 do 0,15 ng/l (Mechora in sod., 2011). V naravnih vodnih sistemih prevladujeta dve oksidirani obliki Se: selenit in selenat (US EPA, 1987), ki sta zaradi visoke topnosti dostopne za rastline (Carvalho in Martin, 2001) in sta potencialno strupeni za vodne organizme (Mechora in sod., 2011). Če ju primerjamo med seboj, je selenit bolj biorazpoložljiv in približno 5-10 krat bolj strupen za organizme kot selenat (Lemly in sod., 1993). Po privzemu Se v rastlino, pride do sprememb v rastlinskem metabolizmu (Mechora in sod., 2013). Se ima lahko na rastline negativne (zaradi povišane koncentracije Se pride do: bledenje listov, slabša rast in razvoj, predčasno umiranje rastline), kot tudi pozitivne učinke (deluje kot antioksidant, poviša toleranco na oksidativni stres, upočasni staranje in ima sposobnost reguliranja vodnega statusa rastlin v sušnih pogojih). Malo pa je znanega o učinkih Se na fiziološke lastnosti makrofitov. Glede na sposobnost absorpcije Se iz tal (iz peska, zemlje, vodnih raztopin) razvrščamo rastline na Se neakumulatorske, Se akumulatorske in Se sekundarno akumulatorske (Läuchli, 1993). V študijah je bilo dokazano, da vrsti M. spicatum in C. demersum privzemata velike količine elementov v sledovih (Rai in sod., 1995; Robinson in sod., 2006; Mechora in sod., 2011). Mechora in sodelavci (2011) so v raziskavi identificirali SeMeSeCys v vrstah M. spicatum in C. demersum in iz tega sklepali, da imata vrsti podobne transformacijske poti Se kot akumulatorske rastline. Makrofite zato lahko uporabljamo v procesu fitoremediacije, saj odstranjujejo Se in druge elemente iz odpadnih voda, ki pritekajo iz poljedelskih predelov. Veliko pozornosti pa moramo posvetiti kasnejši varni odstranitvi rastlin, ki so privzele Se oziroma druge elemente.

13 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju NAMEN DELA Namen našega dela je bil: - Ugotoviti, ali se izbrane vodne rastline različno odzovejo na različno trajanje izpostavitve selenitu. - Ugotoviti, ali selenit negativno vpliva na izbrane vodne rastline (Ceratophyllum demersum, Myriophyllum spicatum in Potamogeton perfoliatus). - Ugotoviti, ali si izbrane vodne rastline po presaditvi iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, opomorejo. 1.2 HIPOTEZE Postavili smo si sledeče hipoteze: - Predvidevamo, da se bodo tri preučevane vrste različno odzvale na različen čas izpostavitve selenitu. - Predvidevamo, da bo selenit po daljši izpostavitvi rastlin negativno vplival na izbrane biokemijske in fiziološke značilnosti pri vrstah Ceratophyllum demersum, Myriophyllum spicatum in Potamogeton perfoliatus. - Predvidevamo, da si bodo izbrane vodne rastline po presaditvi v medij brez dodanega selenita opomogle, vendar samo pri predhodnih krajših izpostavitvah v mediju z dodanim selenitom.

14 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 3 2 PREGLED OBJAV 2.1 SELEN Se je bil prvič določen v začetku 19. stoletja. Odkril ga je Jöns Jakob Berzelius leta 1817 v blatu na dnu svinčevih komor v tovarni žveplove kisline (Lazarini in Brenčič, 2004). Se je poimenoval po grški boginji lune, ''Selene'' (Oldfield, 1998). Ugotovili so, da je strupenost selena odvisna od danih razmer (Wilhelm, 2010). V periodnem sistemu se Se nahaja v VI. skupini, med žveplom (S) in telurjem (Te) ter spada med metaloide, saj ima lastnosti kovin in nekovin (Lazarini in Brenčič, 2004). Njegovo vrstno število je 34, relativna atomska masa pa 78,96 (Lazarini in Brenčič, 2004). Se je kemijsko podoben žveplu, kar vodi do nespecifične zamenjave žvepla s Se v proteinih in drugih žveplovih spojinah (Nowak in sod., 2004). V naravi se Se pojavlja v obliki šestih izotopov: 74 Se (0,87 %), 76 Se (9,02 %), 77 Se (7,58 %), 78 Se (23,52 %), 80 Se (49,82 %) in 82 Se (9,19 %) (Žnidarčič, 2010). Se lahko v različnih oksidacijskih stanjih nastopa v organskih in anorganskih spojinah: -2 (selenid), 0 (elementarni Se 0 ), +4 (Se0 3 ² - selenit), +6 (Se0 4 ² - selenat) (Barak in Goldman, 1997), v naravi pa je vezan v obliki hlapnih (DMSe, DMDSe) in nehlapnih organskih spojin (SeCys, SeMet in druge) (Foster in Sumar, 1997). 2.2 POMEN SELENA ZA ŽIVALI IN LJUDI Se je esencialno hranilo v sledovih in je pomemben za ljudi ter živali kot antioksidant. Pri visokih koncentracijah pa se pojavlja strupenost, do katere pride zaradi zamenjave žvepla s Se v amino kislinah, zaradi česar lahko pride do spremenjene tercialne zgradbe proteinov in njihove nefunkcionalnosti (Germ in Stibilj, 2007). Meja med esencialnostjo in strupenostjo je ozka ter odvisna od oblike Se, koncentracije in drugih okoljskih spremenljivk (Fan in sod., 2002). Se ima za živali, ljudi in mikroorganizme tri nivoje biološke aktivnosti (Hamilton, 2004): 1. koncentracije v sledovih so potrebne za normalno rast in razvoj, 2. zmerne koncentracije ohranijo homeostatske funkcije in 3. povišane koncentracije lahko dosežejo strupene učinke. Večino Se živali in ljudje zaužijejo s hrano, in sicer v obliki Se-amino kislin (SeMet in SeCys) (Žnidarčič, 2010), Se pa je esencialni sestavni del Se-proteinov, ki igrajo pomembno vlogo v mnogih bioloških procesih (Mehdi in sod., 2013). Priporočen dnevni vnos Se v človeško telo je med 30 in 70 µg/dan (Referenčne vrednosti, 2004). To priporočilo je privzela tudi Slovenija. Ljudje in živali v nekaterih regijah, kot je Slovenija, trpijo za relativnim pomanjkanjem Se (Pirc in Šajn, 1997). Gojenje rastlin, obogatenih s Se, je lahko učinkovit način pridelovanja

15 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 4 s Se obogatenih živil in tako lahko izboljšujemo zdravje (Ip in Lisk, 1994; Finley in sod., 2001; Lyons in sod., 2005). Pomanjkanje Se v živalih in človeku lahko vodi do srčnih bolezni, oslabljenega imunskega sistema in hipotiroidizma (Tinggi, 2002). Se ima pomembno vlogo pri preprečitvi ateroskleroze, specifičnih rakavih obolenj, artritisa in spremembah imunskega sistema (Rayman, 2000). Učinki Se so odvisni od kemijske oblike (Germ in Stibilj, 2007). SeMet je Se spojina, ki se najhitreje asimilira (Behne in Kyriakopoulos, 2001) in prehranski dodatki, ki vsebujejo SeMet, dokazano zmanjšujejo tveganje za pojav raka na prostati (Duffield-Lillico in sod., 2003). Epidemiološke raziskave, ki so jih opravili v ZDA in jih potrdili tudi na Kitajskem in Finskem, pa so pokazale tudi obratno sorazmerno povezavo med količino Se v prehrani in tveganjem za obolelostjo za nekaterimi drugimi rakavimi obolenji (debelo črevo, pljuča, dojke, levkemija, prebavni trakt, jajčniki) (Brooks in sod., 2001; Finley, 2003; Lipsky in sod., 2004; Finley, 2007). 2.3 SELEN V OKOLJU Onesnaženje s Se v okolju izvira tako iz naravnih, kot tudi antropogenih virov (Mechora in Vrhovšek, 2012). Naravno se nahaja v zemeljski skorji (povprečna koncentracija je 0,09 mg/kg) (Mehdi in sod., 2013), mineralih, v sladki in morski vodi ter v sedimentih (Fan in sod., 2002). Se, ki je v okolju zaradi človeške dejavnosti, pa najdemo v gospodinjskih odplakah, rudarskih ostankih, v odplakah iz rafinerij, pepelu iz termoelektrarn in industrijskih odpadnih vodah ter v poljedelskih odpadnih vodah za namakanje (Fan in sod., 2002; Lemly, 2004). Se prav tako pogosto dodajajo v krmo in gnojila. Del dodanega Se porabijo živali, presežek pa se neposredno ali preko izločkov živali preide v okolje (Mechora in Vrhovšek, 2012). Pomanjkanje Se se pojavlja v številnih delih sveta (Germ, 2005). V te regije so vključeni nekateri deli Kitajske, Finske, Nove Zelandije in Centralne Evrope (Tinggi, 2002) Selen v zraku Atmosfera igra pomembno vlogo v biogeokemijskem ciklu Se, saj vpliva na njegov prenos in transformacijo (Mehdi in sod., 2013). Vsebnost Se v zraku je na splošno nizka in se giblje med 1 do 10 ng/m 3 (Barceloux, 1999; Wen in Carignan, 2007). Razlikujemo tri skupine Se spojin, ki so v zraku: hlapljive organske spojine (DMSe, DMDSe in metanselenol), hlapljive anorganske spojine (selenov dioksid) in elementarni Se, vezan na pepel in delce (Mehdi in sod., 2013).

16 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju Selen v tleh Se se v tleh kopiči zaradi erozije kamnin, bogatih s Se, in uporabe fosfatnih gnojil, ki vsebujejo Se (Barceloux, 1999). Se najdemo v prsti v obliki elementranega Se, selenata in selenita ali pa v organski obliki (Mehdi in sod., 2013). Seleniti (SeO 3 2- ) in selenati (Se ), ki so najdeni v sulfidnih mineralih (Wilhem, 2010), so dobro topni, mobilni, biorazpoložljivi in potencialno strupeni (Mehdi in sod., 2013). V tleh je Se neenakomerno porazdeljen, porazdelitev pa je odvisna od klimatskih razmer, narave in izvora tal ter tudi od posegov človeka v okolje (Žnidarčič, 2010). Slovenija je dežela z nizkimi količinami Se v prsti (Kreft in sod., 2002). Že študija Pirca in Šajna (1997) je pokazala, da se vsebnost Se v tleh giblje med <0,1 in 0,7 mg/kg. Se je prav tako malo v tleh na Novi Zelandiji, Tasmaniji (Reilly, 1993) in Finskem, v vzhodni Sibiriji in na območjih Kitajske in Koreje (Bronzetti in della Croce, 1993). Na aridnih območjih ZDA, Kanade, Avstralije in osrednje Azije, pa je v tleh veliko Se in na teh območjih je prisoten selenat, ki je za rastline lahko dostopen (Hack in Brüggemann, 1996). Razpoložljivost Se za rastline je poleg oblike Se (Reilly, 1996) odvisna tudi od dejavnikov, kot so ph, slanost in vsebnost CaCO 3 v tleh (Kabata Pendias, 2001) Selen v vodi Se najdemo tudi v vodih sistemih (Mehdi, 2013). Za vodno življenje je Se strupen pri relativno nizkih koncentracijah (US EPA, 1987). US EPA (1998) je za kronično mejo strupenosti postavila koncentracije Se nad 5 µg/l. V vodnih sistemih se Se pojavlja v štirih oksidacijskih stanjih, in sicer v Se 0 (elementarna oblika), Se +4 (selenit), Se +6 (selenat) in Se -2 (selenid) (Calton in Van Derveer, 1997), oblika Se pa je odvisna od redoks potenciala in ph (Jayaweera in Biggar, 1996). V naravnih vodnih sistemih prevladujeta oksidirani obliki selenit in selenat (US EPA, 1987), ki sta zaradi visoke topnosti dostopni za rastline (Carvalho in Martin, 2001) in sta potencialno strupeni za vodne organizme (Mechora in sod., 2011). Če ju primerjamo med seboj, je selenit bolj biorazpoložljiv in približno 5-10 krat bolj strupen za organizme kot selenat (Lemly in sod., 1993). Elementarni Se je stabilen, netopen in se slabo asimilira v rastline, zato ima majhno stopnjo strupenosti (US, 1987). Ko se onesnaženje s Se začne, se sproži veriga bioakumulacijskih dogodkov, ki jo je zelo težko ustaviti. Se namreč hitro doseže raven, pri kateri postane strupen za vodne organizme, bioakumulira se v rastlinah in povzroči izpostavljenost celotne prehranjevalne verige. Do tega ne pride, če je onesnaževanje ustrezno predvideno, planirano in nadzorovano. (Lemly, 2004). Koncentracije Se v izbranih celinskih vodah po Sloveniji se gibljejo v razponu od 0,07 do 0,15 ng Se/g (Mechora in sod., 2011). Kot so poročali že Fournier in sod. (2010) se tipične koncentracije Se v celinskih vodah gibljejo med 0,01 do 0,5 µg Se/L. Se najdemo tudi v

17 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 6 podzemni vodi (Žnidarčič, 2010). V geotermalni vodi v severovzhodni Sloveniji pa se vsebnost Se giblje v mejah od >0,1 do 41 ppm (Kralj, 2001). 2.4 SELEN IN RASTLINE Esencialnost Se za višje rastline je še vedno vprašljiva (Shanker, 2006), medtem ko je dokazana za zeleno algo Chlamydomonas reinhardtii (Novoselov in sod., 2002). Vedno več raziskav kaže na to, da utegne Se igrati pomembno biološko vlogo v višjih rastlinah (Hartikainen in sod., 2000; Xue in sod., 2001; Seppänen in sod., 2003). Višje rastline, kot tudi drugi organizmi, vsebujejo Se-cisteil-tRNA (dekodira triplet nukleotidov UGA), s katerim se v beljakovine vgrajuje SeCys (Läuchli, 1993) Privzem in transport selena Privzem in kopičenje Se v rastlini sta odvisna od kemijske oblike in koncentracije, dejavnikov, kot so ph, slanost in prisotnost CaCO 3, identitete in koncentracije tekmovalnih ionov ter od zmožnosti rastline, da absorbira in metabolizira Se (Kabat Pendias, 2001). Pri privzemu Se tekmuje z žveplom, ki ima podobne kemijske lastnosti kot Se, oba pa se asimilirata preko skupnih poti (Eapen in D'Sauza, 2005). Ko enkrat rastlina privzame Se, pride do sprememb v rastlinskem metabolizmu (Mechora in sod., 2013). Malo je znanega o sposobnosti makrofitov o privzemanju Se iz sedimenta in vode (Carvalho in Martin, 2001). Študije so pokazale antagonističen učinek sulfata na privzem in akutno strupenost Se pri makrofitih (Sappington, 2002). Makrofitska vrsta Ruppia maritima privzame dva velikostna reda več selenata pri nizkih koncentracijah sulfata kot pri visokih koncentracijah sulfata (Bailey in sod., 1995). Visoka koncentracija sulfata pa močno zmanjša akumulacijo Se, kar kaže na to, da je fitoremediacija večja v slanih območjih, kjer je raven sulfata nizka (Vickerman in sod., 2002). Privzem selenata (20 µg/l in 10 mg/l) v makrofite so preučevali Mechora in sodelavci (2011). Pri dodajanju selenata (10 mg/l) so ugotovili, da je povprečna koncentracija Se v vrsti M. spicatum (izpostavljena 8-13 dni) 212 ± 12 µg Se/g suhe snovi in v vrsti C. demersum (izpostavljena 31 dni) 492 ± 85 µg Se/g suhe snovi. Zaključili so, da obe vrsti privzameta visoke koncentracije selenata. Prav tako so Mechora in sodelavci (2013) preučevali privzem selenita v treh vodnih rastlinah (Ceratophyllum demersum, Myriohyllum spicatum in Potamogeton perfoliatus). Izbrane vodne rastline so izpostavljali v vodi z dodanim 10 mg selenitom. Ugotovili so, da je vrsta M. spicatum (izpostavljen 5-16 dni) vsebovala µg Se/L suhe snovi, vrsta C. demersum (izpostavljen 5-11 dni) µg Se/L suhe snovi in vrsta P. perfoliatus (izpostavljen 4-6 dni) µg Se/L suhe snovi. Carvalho in Martin (2001) pa sta preučevala rogoz (Typha domingensis) in močvirsko lilijo (Crinum americanum L.), ki so rastle v selenitu (200 mg Se/L). Rogozi so vsebovali le 80 µg Se/g, močvirske lilije pa 30 µg Se/g.

18 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju Neakumulatorske in akumulatorske rastline Rastline transportirajo in akumulirajo znatne količine selenata, veliko manj pa selenita ali SeMet (Çakır in sod., 2012). Selenit se namreč hitro pretvori v organske oblike Se kot na primer SeMet, ki ostane v koreninah (Zayed in sod, 1998). S tem lahko razložimo, zakaj se selenit slabo premešča v poganjke. Porazdelitev Se v različnih delih rastlin je vrstno specifična in odvisna od faze razvoja ter od fiziološkega stanja rastline (Çakır in sod., 2012). Kahakachchi in sodelavci (2004) so dognali, da aktivno rastoče tkivo običajno vsebuje največjo količino Se. Večina rastlin kopiči več Se v listih in poganjkih kot v koreninskih tkivih, obstajajo pa tudi izjeme (Germ in sod., 2007). Glede na sposobnost absorpcije Se iz tal (iz peska, zemlje, vodnih raztopin) razvrščamo rastline na Se neakumulatorske, Se akumulatorske in Se sekundarno akumulatorske (Läuchli, 1993; Terry in sod., 2000). Se akumulatorji se razlikujejo od neakumulatorjev po tem, da metabolizirajo SeCys v različne neproteinske Se-amino kisline (SeMeSeCys, Secistation, γ-glutamyl-semesecys) (Terry in sod., 2000). Prevladujejo Se neakumulatorske rastline, ki vsebujejo manj kot 25 mg Se/kg suhe snovi, če pa rastejo na tleh, bogatih s Se, lahko akumulirajo do 100 mg Se/kg (Çakır in sod., 2012). V rastlinah je Se prisoten pretežno v obliki aminokisline SeMet (Wang in sod., 1996). Primarno indikatorske ali Se akumulatorske rastline akumulirajo nekaj tisoč mg Se/kg suhe snovi (Çakır in sod., 2012), tudi do 4000 mg Se/kg suhe snovi (Žnidarčič, 2007). Med primarno indikatorske rastline uvrščamo nekatere vrste iz rodov Morinda, Neptunia, Stanleya, Oonopsis, Astragalus in Xylorhiza (Brown in Shrift, 1982). Poročali so, da se v predelih, kjer je veliko Se, Se kopiči v mnogih rastlinah v tako velikih količinah, da je lahko škodljiv za živino, če se hrani s temi rastlinami (Tinggi, 2002). Večina žitnih poljščin in krmnih rastlin ima relativno šibko sposobnost absorpcije Se, tudi takrat, ko rastejo na zemlji z visoko vsebnostjo Se (Nowak in sod., 2004). Tretja skupina so Se sekundarno akumulatorske ali indikatorske rastline, ki lahko rastejo na tleh, bogatih s Se, lahko pa tako tudi tam, kjer je Se v tleh manj (Terry in sod., 2000). Akumulirajo lahko do 1000 mg Se/ kg suhe snovi (Çakır in sod., 2012). Primeri takih rastlin so vrste iz rodov Aster, Astragalus, Castilleja, Atriplex, Comandra, Grayia, Grindelia, Gutierrezia in Machaeranthera (Parker in Page, 1994) Vpliv selena na rastline Se ima lahko tako negativne kot tudi pozitivne učinke na rastline. Zelo malo je znanega o učinkih Se na fiziološke lastnosti makrofitov (Mechora in sod., 2011). Mechora in sodelavci (2013) so ugotovili, da nizka koncentracija selenita (20 µg/l) ni znižala fotokemične učinkovitosti FS II, medtem ko je imela višja koncentracija selenita (10 mg/l) negativen učinek na potencialno fotokemično učinkovitost FS II pri izbranih makrofitih (vrste M. spicatum, P. perfoliatus, C. demersum). Enako so ugotovili tudi v prejšnji študiji

19 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 8 pri vrstah M. spicatum in C. demersum (Mechora in sod., 2011), kjer so namesto selenita, izbrane rastline obravnavali s selenatom. Poglejmo si še raziskave na ljuljki (Lolium perenne) in zeleni solati (Lactuca sativa), ki so pokazale, da je Se škodljiv pri višjih koncentracijah (>10 mg kg -1 za ljuljko in 1,0 mg kg -1 za zeleno solato), lahko pa ima tudi pozitivne učinke pri nižjih koncentracijah (0,1 mg kg -1 prsti) (Hartikainen in sod., 2000; Xue in sod, 2001). Se deluje v rastlinah kot antioksidant (Hartikainen in sod., 2000), poviša toleranco rastlin na oksidativni stres zaradi UV sevanja, upočasni staranje (Xue in sod., 2001; Pennanen in sod., 2002). Ima sposobnost uravnavanja vodnega statusa rastlin v sušnih pogojih, tako da poviša privzemno kapaciteto vode s koreninskim sistemom (Kuznetsov in sod., 2003). Bledenje listov in črne pike na listih, rdečkaste pike na koreninah, slabša rast in razvoj ter predčasno umiranje rastlin, so znaki povišane koncentracije Se (Kabata-Pendias, 2001). Pri Se neakumulatorskih rastlinah so mejne koncentracije selena poleg starosti rastline in prisotnost sulfatnih ionov, odvisne tudi od oblike Se, ki ga rastlina akumulira. Strupenost pri visoki akumulaciji Se v rastlinska tkiva sproži mehanizem, ki vključuje SeMet in SeCys v proteine na mesto Cys in Met. Kot smo že omenili, imata Se in žveplo podobne kemijske lastnosti, zato pride do sprememb v zgradbi proteinov. Tako je spremenjena tercialna struktura proteina, ki negativno vpliva na katalitično aktivnost (Terry in sod., 2000). Vendar obstaja več mehanizmov tolerance pred strupenim delovanjem Se: v nekaterih akumularatorskih rastlinah se SeMet sploh ne izgrajuje, Se se akumulira v vakuolah v obliki aniona (pretežno selenata) ali pa se Se akumulira v obliki prostih aminokislin (posebno v obliki SeMeSeCys). Mechora in sodelavci (2011) so v raziskavi identificirali SeMeSeCys v vrstah M. spicatum in C. demersum. Iz tega so sklepali, da imata ti dve vrsti podobne transformacijske poti selena kot tiste v akumulatorskih rastlinah. 2.5 MAKROFITI Makrofiti ali vodne rastline so skupina rastlin, ki so v vodi vidne s prostim očesom. Makrofiti so skupno ime za nekatere alge, praproti, mahove in višje rastline (Gaberščik in Kuhar, 2007). Naseljujejo površinske vodne ekosisteme, kot so jezera, vodna zajetja, močvirja, potoke, reke, morska okolja in celo brzice (primer Podostomaceae) (Thomaz in da Cunha, 2010). Ta raznolikost poseljevanja je posledica adaptacijskih strategij skozi evolucijski čas (Thomaz in da Cunha, 2010). Vodne rastline delimo glede na rastno obliko, in sicer: - amfibijske rastline, - submerzne in natantne makrofite / hidrofiti, - emerzni makrofiti / helofiti. Predstavniki amfibijskih rastlin so navadna streluša (Sagittaria sagittifolia), vodna meta (Mentha aquatica) in številne druge. Submerzne ali potopljene makrofite delimo še na potopljene ukoreninjene (klasasti rmanec Myriophyllum spicatum, kodravi dristavec Potamogeton crispus, preraslolistni dristavec Potamogeton perfoliatus) in potopljene

20 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 9 neukoreninjene (navadni rogolist Ceratophyllum demersum, trižilna vodna leča Lemna trisulca). Natantne ali plavajoče makrofiti pa prav tako delimo na plavajoče ukoreninjene (rumeni blatnik Nuphar luteum, beli lokvanj Nymphaea alba) in plavajoče neukoreninjene (mala vodna leča Lemna minor, žabji šejek Hydrocharis morsusranae). Predstavniki emeznih makrofitov pa je na primer navadni trst (Phragmites australis) Vloga makrofitov v vodnem okolju Makrofiti vplivajo na kakovost vode tako, da privzemajo hranila, večajo biodiverziteto ekosistemov in pospešujejo kemijske in biokemijske reakcije (Kuhar in sod., 2004). Makrofiti lahko vplivajo tudi na fitokemijske lastnosti vode: opazne so spremembe v koncentraciji kisika, anorganskega ogljika, ph in alkalnosti, kar je rezultat njihovega metabolizma (Caraco and Cole, 2002). Lahko pa povzročijo tudi evtrofikacijo sistema (Nicholas in Shaw, 1986), zaradi mobilizacije hranil iz sedimenta (Hutchinson, 1975) in izpiranja hranil iz rastlin po njihovem propadu (Karpati in Pomogy, 1979). Makrofiti vplivajo na kroženje hranil, tako da zadržujejo trdne snovi in hranila s koreninami in listi (Meerhoff in sod., 2003) ter zmanjšujejo sproščanje hranil iz sedimenta (varujejo pred vetrom in valovi) (Madsen in sod., 2001), na tak način stabilizirajo obrežje in zmanjšajo erozijo (Esteves, 1998). Makrofiti so vključeni v prehranjevalno verigo in prispevajo k primarni produkciji v vodi (Mechora in sod., 2011), ki lahko preseže produkcijo drugih vodnih primarnih producentov (Kalff, 2002). Prav tako dajejo zavetje mnogim nevretenčarjem (Nichols in Shaw, 1986), ki so vir hrane za vodne ptice in ribe. Makrofite uporabljamo kot indikatorje za nizke koncentracije okoljskih onesnaževal, ki bi jih drugače težko zaznali (Mazej in Germ, 2009). Že v zgodnjih 70. letih so jih uporabljali za indikatorje elementov v sledovih (Phillips, 1977). Če jih primerjamo z nevretenčarji, imajo nekaj prednosti; makrofiti so relativno veliki, število vrst je v primerjavi z nevretenčarji majhno, makrofiti omogočajo oceno vode in sedimenta, majhni organski izpusti prizadenejo makrofite (navadno ne vplivajo na nevretenčarje) ter ob pregledovanju makrofitov ne poškodujemo mesta vzorčenja (Haslam, 1987). 2.6 ZMANJŠANJE PRISOTNOSTI SELENA V VODNEM OKOLJU Onesnaženje s Se je svetovni problem in zato je potreba po čiščenju s Se onesnažene vode zelo velika (Dhote in Ditix, 2009). Kopenske rastline lahko odstranijo Se iz zemlje (Kahakachchi in sod., 2004), makrofiti pa lahko asimilirajo Se, prisoten v s selenom onesnaženih poljedelskih vodah (Lin in sod, 2002). Za čiščenje obremenjenih vod so primerne tiste vrste makrofitov, ki imajo zelo veliko kapaciteto za absorbiranje hranil in drugih snovi iz vode (Boyd, 1970).

21 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 10 Se je možno odstraniti iz prsti in odpadnih voda, ki pritekajo iz poljedelskih predelov, in sicer z uporabo rastlin v procesu fitoremediacije. Fitoremediacija je metoda, ki temelji na rastlinah in z njimi povezano mikrobiološko aktivnostjo ter je bila že uspešno uporabljena za izločitev, kopičenje in izhlapevanje (volatilizacijo) Se (Pilon-Smits in sod., 1999). Poleg tega, da ga rastline kopičijo v svojo biomaso, so glavno gonilo za izhlapevanje Se s produkcijo metiliranih selenidov, kot sta DMSe in DMDSe (Fan in sod., 2002). Anorganski Se, spremenjen v plin DMSe, je približno 600-krat manj toksičen v primerjavi z anorganskim Se (de Souza in sod., 2002). Pri makrofitih celotna rastlina igra pomembno vlogo pri odstranjevanju onesnaževalcev iz vodnega okolja (Mechora in sod., 2011). Zaradi njihovega visokega razmerja med površino in biomaso je privzem kovin znaten (Baudo in sod., 1981). Vodne rastline lahko privzamejo elemente v sledovih skozi korenine, medtem ko jih submerzne rastline lahko privzamejo skozi korenine in liste (Mechora in sod., 2011). Vse submerzne vrste akumulirajo relativno velike količine elementov v sledovih (Fritioff in Greger, 2003). V prejšnjih študijah je bilo dokazano, da vrsti M. spicatum in C. demersum privzameta velike količine elementov v sledovih (Rai in sod., 1995; Robinson in sod., 2006; Mechora in sod., 2011). Vrsta M. spicatum je namreč znana po sposobnosti velikega absorbiranja svinca in bakra iz raztopine (Keshinkan in sod., 2003). Vrsta Myriophyllum propinquum pa je bila razglašena za akumulatorsko rastlino, ki akumulira čez 1000 mg As kg -1 in jo tako lahko uporabljamo za remediacijo odpadnih voda (Robinson in sod., 2006). Ko rastline enkrat uspešno akumulirajo Se v svojih tkivih, morajo biti odstranjene iz obremenjenega okolja na varen način. Poznamo več varnih načinov odstranitve. Rastline, ki so akumulirale Se, lahko uporabimo kot krmo za živali ali pa kot gnojilo za poljščine. Če pa vsebuje tudi druge toksične elemente, kot so na primer živo srebro in arzen, jih lahko uporabljamo kot gorivo za proizvodnjo električne energije (Carvalho in Martini, 2001).

22 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju MATERIALI IN METODE 3.1 POSKUS Poskusne rastline V raziskavi smo kot poskusne rastline izbrali naslednje vodne rastline: Myriophyllum spicatum L. - klasasti rmanec, Ceratophyllum demersum L. - navadni rogolist in Potamogeton perfoliatus L. - preraslolistni dristavec. Rastline smo pridobili na različnih lokacijah po Sloveniji. Vrsto Potamogeton perfoliatus smo nabrali v reki Ižici (Ig: 308 mnv 45º56' N, 14º32' E, Slovenija), vrsto Ceratophyllum demersum iz bazena Botaničnega vrta (Ljubljana: 320 mnv, 46º35 N, 14º55 E, Slovenija) in vrsto Myriophyllum spicatum iz potoka Glinščica ob Biološkem središču (Ljubljana, 300 mnv, 46 2' 58.95" N, 14 28' 30.40" E, Slovenija). Preraslolistni dristavec (Potamogeton perfoliatus) je potopljen (submerzen) ukoreninjen makrofit (Martinčič in sod., 2007). Spada v družino Potamogetonaceae dristavčevk. Potopljeni listi obdajajo steblo, so celi z veliko površino, okrogli ali jajčasti, dolgi do 6 cm, s srčastim dnom in sedeči. Steblo je okroglo, močno in razraslo (Martinčič in sod., 2007). Pojavlja se v mirnih in počasi tekočih sladkovodnih vodah v zmernem klimatskem pasu (Global invasive species database). Slika 1: Posoda z vrsto Potamogeton perfoliatus L. preraslolistni dristavec

23 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 12 Navadni rogolist (Ceratophyllum demersum L.) je potopljen (submerzen) neukoreninjen makrofit, ki prosto plava v vodnem stolpcu (Martinčič in sod., 2007). Spada v družino Ceratophyllaceae rogolistovk. Najdemo ga v stoječih in počasi tekočih vodah. Je podvodno zelišče s členastim steblom, brez razvitega koreninskega sistema (Martinčič in sod., 2007). Ker nima koreninskega sistema, absorbira hranila iz vode. Če pa raste blizu jezerskega dna, tvori modificirane liste, ki služijo za pritrjevanje v sediment (Foroughi in sod., 2011). Listi so ena- do dva-krat vilasto deljeni (Martinčič in sod., 2007) in imajo inkrustrirano povrhnjico z apnencem. Uporabljajo ga za meritve jezerskih onesnaženosti, ker lahko privzame kovine, kot na primer kadmij in svinec (Stankovic in sod., 2000). Slika 2: Vrsta Ceratophyllum demersum L. navadni rogolist (vir: Marginup) Klasasti rmanec (Myriophyllum spicatum L.) je potopljen (submerzen) ukoreninjen makrofit, ki ima večino asimilacijskih površin pod vodno gladino (Martinčič in sod., 2007). Spada v družino Haloragaceae rmančevk. V vretencu so po štirje listi (Martinčič in sod., 2007). Listi so manjši od 5 cm, dolgi, mehki, pernato deljeni. Steblo je vitko, gladko, 2-6 metrov dolgo. Najdemo ga v jezerih, ribnikih, počasi tekočih rekah in potokih. Zelo hitro se razrašča in zasenči druge vrste, saj oblikuje gosto vegetacijsko preprogo. Dobro prenaša zmrzal in preživi tudi pod ledom. Je izredno prilagodljiva rastlinska vrsta, ki je strpna na različne okoljske dejavnike: visoko slanost, spremembe temperature, globino vode do treh metrov (Global invasive species database).

24 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 13 Slika 3: Posoda z vrsto Myriophyllum spicatum L. klasasti rmanec

25 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju Poskusne razmere Izbrane vodne rastline (M. spicatum, C. demersum in P. perfoliatus) smo posadili v posode velikosti 120 cm x 52 cm x 45 cm, ki so vsebovale plast zemlje in peska, ter jih napolnili s 150 L vode. V celotnem poskusu smo potrebovali 9 velikih posod, ki so bile postavljene pred Biotehniško fakulteto, oddelek za biologijo. Nasajene tri izbrane vodne rastline v mediju brez dodanega selenita za presajanje v medij z dodanim selenitom. Posode z medijem brez dodanega selenita rastline presajene iz medija z dodanim selenitom. Slika 4: Razporeditev posod za poskus Posode z 10 mg/l selenita rastline v mediju z dodanim selenitom. Najprej smo imeli v posodah (levi stolpec na sliki 4) nasajene rastline v mediju brez dodanega selenita, in sicer dva tedna, da so se aklimatizirale. Nato smo rastline postopoma presajali v medij z dodanim 10 mg natrijevega selenita (Na 2 SeO 3 ) (posode v desnem stolpcu na sliki 4). Za izbrano koncentracijo 10 mg/l selenita smo predvidevali, da bo imela toksičen vpliv na poskusne rastline. Koncentracijo selenita smo skozi poskus tedensko merili in jo vzdrževali na želeni koncentraciji. Izbrane vodne rastline (vrste M. spicatum, C. demersum in P. perfoliatus) smo različno dolgo izpostavljali mediju z dodanim selenitom, in sicer od 1 do 15 dni (Tabela 1). Vrsta P. perfoliatus je pri obravnavanju 5 dni v mediju z dodanim selenitom že propadala, zato je nismo obravnavali 10 in 15 dni v mediju z dodanim selenitom. Vrsti M. spicatum in C. demersum pa sta preživeli do 15 dni.

26 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 15 Tabela 1: Tabela obravnavanj za posamezno rastlino vrsta čas izpostavitve v vodi z dodanim selenitom (dnevi) Myriophyllum spicatum 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 Ceratophyllum demersum 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 Poramogeton perfoliatus 1, 2, 3, 4, 5 izpostavitev v mediju brez dodanega selenita po različno dolgem obravnavanju s selenitom 5 dni Legenda: 1 pomeni obravnavanje v mediju z dodanim selenitom 1 dan, 2 pomeni obravnavanje v mediju z dodanim selenitom 2 dni, 3 pomeni obravnavanje v mediju z dodanim selenitom 3 dni, 4 pomeni obravnavanje v mediju z dodanim selenitom 4 dni, 5 pomeni obravnavanje v mediju z dodanim selenitom 5 dni, 10 pomeni obravnavanje v mediju z dodanim selenitom 10 dni in 15 pomeni obravnavanje v mediju z dodanim selenitom 15 dni. Po vsakem končanem obravnavanju v mediju z dodanim selenitom smo izmerili izbrane fiziološke in biokemijske meritve ter vodne rastline presadili iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita (sredinska vrsta na sliki 4), ter jih pustili v mediju brez dodanega selenita 5 dni. Po 5 dneh smo izmerili fiziološke in biokemijske meritve. Slika 5: Postavitev poskusa

27 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju MERITVE Fiziološke meritve Fiziološke meritve so potekale v laboratoriju Biotehniške fakultete na Oddelku za biologijo, v skupini za ekologijo rastlin Potencialno fotokemična učinkovitost FS II Fotokemična učinkovitost FS II je metoda za določitev stresa pri rastlinah v okolici (Lichenthaler, 1988). Fotokemično učinkovitost FS II izbranih vodnih rastlin, ki je določena preko klorofilne fluorescence klorofila a v FS II, smo merili s fluorometrom PAM 2100 (Klorofil Fluorometer, HeinzWalz, GmbH, Nemčija). Pred merjenjem smo na list pritrdili ščipalko za temotno adaptacijo. Po 10 minutah adaptacije, ki zadošča za oksidacijo prejemnikov elektronov FS II, smo list osvetlili s saturacijskim pulzom bele svetlobe (PPFD= 8000 µmol m -2 s -1, 0.8 s). Na aparatu smo odčitali vrednost potencialne fotokemične učinkovitosti, ki jo izražamo s parametrom F v /F m ( ), pri tem je F v variabilna fluorescenca, F m pa maksimalna fluorescenca temotno adaptiranega vzorca. Variabilna fluorescenca je razlika med F m in F o (minimalna fluorescenca temotno adaptiranega vzorca), ki je kazalnik obsega redukcije kinona A (Q A ), ki je prvi stabilni prejemnik elektronov v FS II. Meritve fotokemične učinkovitosti so bile merjene na petih vzorcih za posamezno obravnavanje pri posamezni vrsti rastline Meritve aktivnosti elektronskega transportnega sistema (ETS) S pomočjo meritev aktivnosti ETS ugotavljamo nivo dihalnega potenciala pri rastlinah (Germ in Gaberščik, 2003). Metodo za meritev aktivnosti ETS v mitohondrijih je razvil Packard (1971) in temelji na redukciji umetnega elektronskega akceptorja jodo-nitrotetrazolium-klorida (INT) in na spektrofotometrični meritvi netopnega, rdečega formazana, pri valovni dolžini 490 nm. Najprej smo pripravili raztopine, in sicer raztopino za homogenizacijo, raztopino substrata, raztopino reagenta (INT) in raztopino, ki zaustavi reakcijo. Vse raztopine smo hranili na ledu. Nato smo vzeli štiri vzorce iz vsakega obravnavanja vsake vodne rastline (klasasti rmanec, navadni rogolist in preraslolistni dristavec) in jih stehtali. Vzorce smo zavili v aluminijasto folijo in vse skupaj položili v sušilnik za 24 ur pri 105ºC do konstantne mase. Druge štiri vzorce (iste rastline) smo strli v terilnici in dodali 4 ml ohlajene raztopine za homogenizacijo (0,1 M fosfatnega pufra, 0,15 % (w/v) polivinil pirolidon, 75 µm MgSO 4, 0,2 % (v/v) Triton-X-100). Nato smo vsak vzorec homogenizirali 20 s z ultrazvočnim homogenizatorjem (40 W, 4710, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ZDA) in tako dodatno razbili celične membrane in membrane mitohondrijev. Homogenat smo centrifugirali 4 minute pri rpm in pri 0ºC (2K15, Sigma, Osterode, Nemčija). Nastali supernatant

28 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 17 smo razdelili v tri paralelke po 0,5 ml. Supernatantu smo dodali 1,5 ml raztopine substrata (0,1 M fosfatni pufer, 1,7 mm NADH, 0,25 Mm NADPH, 0,2 % (v/v) Triton-X- 100) in 0,5 ml raztopine INT (jodo-nitro-tetrazolium-klorid) ter inkubirali v temnem prostoru pri 20ºC, 40 minut. Med inkubacijo se je namesto kisika, ki je naravni akceptor elektronov, reduciral umetni elektronski akceptor INT v formazan. Po inkubaciji smo dodali še raztopino, ki zaustavi reakcijo (0,5 ml raztopina formalina (HCHO): fosforna kislina (H 3 PO 4 ) = 1:1). Rdeče obarvan formazan v vzorcih smo prelili v kivete in izmerili absorpcijo pri 490 nm s spektrofotometrom (Lambda 12, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, ZDA). Izmerjene ekstinkcije smo izrazili kot količino porabljenega kisika na suho maso vzorca na čas (µl(o 2 ) mg -1 (sm)h -1 ) (Kenner in Ahmed, 1975). Formula za izračun aktivnosti ETS: aktivnost ETS [µl(o 2 ) mg -1 (sm)h -1 ] = 4 Legenda oznak: Abs490 nm absorpcija vzorca Vh volumen osnovnega homogenata Vr končni volumen reakcijske zmesi t čas inkubacije (40 minut) Va volumen inkubiranega homogenata S velikost vzorca (g suhe mase) 1,42 faktor pretvorbe v volumen kisika (Kenner in Ahmed, 1975) Biokemijske meritve Biokemijske meritve so potekale v laboratoriju Biotehniške fakultete na Oddelku za biologijo, v skupini za ekologijo rastlin Vsebnosti klorofilov a in b ter karotenoidov Vsebnost klorofilov a in b ter karotenoidov smo določili po metodi Lichtenthaler in Buschmann (2001a in 2001b). Štiri sveže vzorce vodne rastline iz vsakega obravnavanja z znano svežo maso smo strli v terilnici in ekstrahirali z 8 ml 90 % (v/v) acetona. Ekstrakte smo nato centrifugirali 4 minute v ohlajeni (4ºC) ultracentrifugi (2K15, Sigma, Osterode, Nemčija) pri 4000 rpm. Nato smo vzorcem izmerili absorbanco z UV/VIS spektrofotometrom (Lamba 12, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) pri valovni dolžini 470 nm (za karotenoide), 644 nm (za klorofil b) in 662 nm (za klorofil a). Na računalniku so se

29 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 18 po vsaki meritvi izpisale ekstinkcijske vrednosti, ki smo jih kasneje uporabili za izračun vsebnosti klorofilov a in b ter karotenoidov po spodnjih enačbah. (1) kl a [mg g -1 sm] = c a V / sm = (11,24 E 662 2,04 E 644 ) V / sm (2) kl b [mg g -1 sm] = c b V/ sm = (20,13 E 644 4,19 E 662 ) V / sm (3) kar [mg g -1 sm] = (1000 E 470 1,9 c a 63,14 c b ) V / sm / 214 Legenda oznak: c a... koncentracija klorofila a c b... koncentracija klorofila b E ekstinkcija pri izbrani valovni dolžini V volumen ekstrakcijskega medija (90 % (v/v) acetona) sm suha masa vzorca Vsebnost antocianov Vsebnost antocianov smo določili po metodi, ki sta jo opisala Drumm in Mohr (1978). Štiri sveže vzorce vodne rastline iz vsakega obravnavanja z znano suho maso smo strli v terilnici in dodali metanol (CH 3 OH) in klorovodikovo kislino (HCl), in sicer v razmerju 99:1. Nato smo ekstrakt centrifugirali 4 minute v ultracentrifugi (2K15, Sigma, Osterode, Nemčija), pri 4ºC in 4000 rpm. Izmerili smo volumne ekstraktov. S spektrofotometrom (Lamba 12, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) smo določili ekstinkcije ekstraktov pri valovni dolžini 530 nm. Iz izmerjenih ekstinkcijskih vrednosti smo po spodnji enačbi določili vsebnost antocianov. ant [mg g -1 sm] = E 530 V / sm Legenda oznak: E ekstinkcija pri izbrani valovni dolžini V volumen ekstrakcijskega medija sm suha masa vzorca 3.3 STATISTIČNE ANALIZE Za obdelavo podatkov (urejanje podatkov, risanje tabel in grafov) smo uporabili računalniški program M.O. Excel Za statistično obdelavo podatkov smo uporabili Statgraphics 4.0.

30 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju REZULTATI 4.1 FIZIOLOŠKE MERITVE Potencialna fotokemična učinkovitost FS II Slika 6: Potencialna fotokemična učinkovitost pri vrsti M. spicatum (n=5, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti M. spicatum s selenitom so imele najvišjo fotokemično učinkovitost FS II rastline, ki so bile obravnavane 1 in 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 10 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zvišanja fotokemične učinkovitosti, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo fotokemično učinkovitost v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz najkrajših obravnavanj (1, 2 dni) v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline presajene iz obravnavanj 4, 10 in 15 dni. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 3 dni oziroma 5 dni (Slika 6).

31 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 20 Slika 7: Potencialna fotokemična učinkovitost pri vrsti C. demersum (n=5, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti C. demersum s selenitom so imele najvišjo fotokemično učinkovitost FS II rastline, ki so bile obravnavane 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 2 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zvišanja fotokemične učinkovitosti, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo fotokemično učinkovitost v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz najkrajšega obravnavanja (1 dan) v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 3 in 10 dni. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 2 dni, 4 dni, 5 dni oziroma 15 dni (Slika 7).

32 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 21 Slika 8: Potencialna fotokemična učinkovitost pri vrsti P. perfoliatus (n=5, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti P. perfoliatus s selenitom so imele najvišjo fotokemično učinkovitost FS II rastline, ki so bile obravnavane 5 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 4 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zvišanja fotokemične učinkovitosti, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo fotokemično učinkovitost v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 2 in 5 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 1 dan. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 2 dni, 3 dni, 4 dni oziroma 5 dni (Slika 8).

33 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju Aktivnost elektronskega transportnega (ETS) sistema Slika 9: Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) [µl(o 2 )mg -1 (sm)h -1 ] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legedna: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti M. spicatum s selenitom so imele najvišjo aktivnost ETS rastline, ki so bile obravnavane 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 5 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zniževanja aktivnosti ETS, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom (obravnavanje 1, 2, 3, 4, 15 dni) v medij brez dodanega selenita. Najvišjo aktivnost ETS v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 10 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 2, 3 in 15 dni. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 2 dni, 3 dni, 4 dni oziroma 15 dni (Slika 9).

34 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 23 Slika 10: Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) [µl(o 2 )mg -1 (sm)h -1 ] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti C. demersum s selenitom so imele najvišjo aktivnost ETS rastline, ki so bile obravnavane 10 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 2 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zviševanja (po obravnavanju 1, 2 dni) kot tudi zniževanja (po obravnavanju 3, 4, 5, 10 in 15 dni) aktivnosti ETS, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo aktivnost ETS v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 15 dni. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 2 dni, 3 dni, 4 dni, 5 dni, 10 dni oziroma 15 dni (Slika 10).

35 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 24 Slika 11: Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) [µl(o 2 )mg -1 (sm)h -1 ] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti P. perfoliatus s selenitom so imele najvišjo aktivnost ETS rastline, ki so bile obravnavane 3 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 5 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zviševanja (po obravnavanju 1, 2 dni) kot tudi zniževanja (po obravnavanju 3, 4 dni) aktivnosti ETS, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo aktivnost ETS v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 4 dni. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 2 dni oziroma 3 dni (Slika 11).

36 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju BIOKEMIJSKE MERITVE Vsebnosti klorofilov a in b ter karotenoidov Klorofil a Slika 12: Vsebnost klorofila a (kl a) [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti M. spicatum s selenitom so imele najvišjo vsebnost klorofila a rastline, ki so bile obravnavane 1 in 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 4 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zniževanja vsebnosti klorofila a, ko rastline presadimo iz obravnavanj 1, 2, 3, 5, 10 in 15 dni mediju z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost klorofila a v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 2 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 2 dni, 3 dni, 5 dni, 10 dni oziroma 15 dni (Slika 12).

37 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 26 Slika 13: Vsebnost klorofila a (kl a) [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti C. demersum s selenitom so imele najvišjo vsebnost klorofila a rastline, ki so bile obravnavane 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 10 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki ne opazimo izrazite težnje zviševanja ali zniževanja vsebnosti klorofila a. Najvišjo vsebnost klorofil a v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 4 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 10 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 4 dni, 5 dni oziroma 10 dni (Slika 13).

38 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 27 Slika 14: Vsebnost klorofila a (kl a) [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti P. perfoliatus s selenitom so imele najvišjo vsebnost klorofila a rastline, ki so bile obravnavane 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 2 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki ne opazimo težnje zniževanja ali zviševanja vsebnosti klorofila a, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost klorofila a v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 3 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 4 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan oziroma 4 dni (Slika 14).

39 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju Klorofil b Slika 15: Vsebnost klorofila b (kl b) [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti M. spicatum s selenitom so imele najvišjo vsebnost klorofila b rastline, ki so bile obravnavane 15 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 10 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zniževanja vsebnosti klorofila b, ko rastline presadimo iz obravnavanj 2, 3, 4, 5 in 15 dni mediju z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost klorofila b v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 3 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 2 dni, 3 dni, 5 dni oziroma 15 dni (Slika 15).

40 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 29 Slika 16: Vsebnost klorofila b (kl b) [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti C. demersum s selenitom so imele najvišjo vsebnost klorofila b rastline, ki so bile obravnavane 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 10 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki ne opazimo izrazite težnje zviševanja ali zniževanja vsebnosti klorofila b, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita.. Najvišjo vsebnost klorofila b v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 10 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 4 dni, 5 dni, 10 dni oziroma 15 dni (Slika 16).

41 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 30 Slika 17: Vsebnost klorofila b (kl b) [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti P. perfoliatus s selenitom so imele najvišjo vsebnost klorofila b rastline, ki so bile obravnavane 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 4 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki ne opazimo težnje zniževanja ali zviševanja vsebnosti klorofila b, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost klorofila b v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 3 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 4 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan oziroma 4 dni (Slika 17).

42 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju Karotenoidi Slika 18: Vsebnost karotenoidov [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti M. spicatum s selenitom so imele najvišjo vsebnost karotenoidov rastline, ki so bile obravnavane 10 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 4 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zniževanja vsebnosti karotenoidov, ko rastline presadimo iz obravnavanj 2, 3, 5, 10 in 15 dni mediju z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost karotenoidov v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 5 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 2 dni, 5 dni, 10 dni oziroma 15 dni (Slika 18).

43 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 32 Slika 19: Vsebnost karotenoidov [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti C. demersum s selenitom so imele najvišjo vsebnost karotenoidov rastline, ki so bile obravnavane 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 10 dni v mediju z dodanim selenitom (Slika 19). Na sliki ne opazimo izrazite težnje zviševanja ali zniževanja vsebnosti karotenoidov. Najvišjo vsebnost karotenoidov v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 4 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 10 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 4 dni oziroma 10 dni (Slika 19).

44 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 33 Slika 20: Vsebnost karotenoidov [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti P. perfoliatus s selenitom so imele najvišjo vsebnost karotenoidov rastline, ki so bile obravnavane 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 2 in 5 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zniževanja (po obravnavanju 1 in 4 dni) vsebnosti karotenoidov, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost karotenoidov v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 3 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 4 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 3 dni oziroma 4 dni (Slika 20).

45 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju Vsebnost antocianov Slika 21: Vsebnost antocianov [mg g -1 sm] pri vrsti M. spicatum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti M. spicatum s selenitom so imele najvišjo vsebnost antocianov rastline, ki so bile obravnavane 4 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 15 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zviševanja (po obravnavanju 1, 2 in 10 dni) kot tudi zniževanja (po obravnavanju 3, 4, 5 in 15 dni) vsebnosti antocianov, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost antocianov v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 1 dan v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 5 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 3 dni oziroma 5 dni (Slika 21).

46 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 35 Slika 22: Vsebnost antocianov [mg g -1 sm] pri vrsti C. demersum (n=4, povprečna vrednost ± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti C. demersum s selenitom so imele najvišjo vsebnost antocianov rastline, ki so bile obravnavane 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 5 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zviševanja (po obravnavanju 4 in 5 dni) kot tudi zniževanja (po obravnavanju 1, 2, 3, 10 in 15 dni) vsebnosti antocianov, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost antocianov v mediju brez dodanega selenita so imele rastline, presajene iz obravnavanj 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 10 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan, 3 dni, 4 dni oziroma 10 dni (Slika 22).

47 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 36 Slika 23: Vsebnost antocianov [mg g -1 sm] pri vrsti P. perfoliatus (n=4, povprečna vrednost± SD). Legenda: Modri stolpci prikazujejo rastline, ki so bile različno dolgo izpostavljene v mediju z dodanim selenitom. Rdeči stolpci pa prikazujejo rastline, ki so bile presajene iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita, kjer so bile po 5 dneh opravljene meritve. Rezultati, označeni z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo. Pri obravnavani vrsti P. perfoliatus s selenitom so imele najvišjo vsebnost antocianov rastline, ki so bile obravnavane 5 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile obravnavane 4 dni v mediju z dodanim selenitom. Na sliki opazimo težnjo zviševanja (po obravnavanju 2 in 3 dni) kot tudi zniževanja (po obravnavanju 1, 4 in 5 dni) vsebnosti antocianov, ko rastline presadimo iz medija z dodanim selenitom v medij brez dodanega selenita. Najvišjo vsebnost antocianov v mediju brez dodanega selenita so imele rastline presajene iz obravnavanj 2 dni v mediju z dodanim selenitom, najnižjo pa rastline, ki so bile presajene iz obravnavanja 4 dni mediju z dodanim selenitom. Statistično značilne razlike med rastlinami, ki so uspevale v mediju z dodanim selenitom in rastlinami v mediju brez dodanega selenita so pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan (Slika 23).

48 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju RAZPRAVA 5.1 POTENCIALNA FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FS II Iz podatkov pri vseh treh izbranih vrstah smo opazili pri vseh obravnavanjih v mediju z dodanim selenitom (Slika 6, 7, 8), da je bila potencialna fotokemična učinkovitost nižja od teoretične vrednosti. Teoretična vrednost potencialne fotokemične učinkovitosti pri kopenskih rastlinah je v ugodnih razmerah med 0,8 0,83 (Björkman in Demmig-Adams, 1995), kar kaže na nepoškodovan antenski kompleks (Germ in sod., 2007). Nižja fotokemična učinkovitost kaže na to, da so bile vse izbrane vodne rastline, zaradi dodatka selenita, pod stresom (Schreiber in sod., 1995). Nizko fotokemično učinkovitost so opazili tudi v študiji Mechora in Vrhovšek (2012) (okrog 0,36 za vrsto C. demersum in 0,48 za vrsto M. spicatum), kjer so bile rastline obravnavane 5 dni v vodi z dodanim selenitom (10 mg/l). Iz tega so sklepali, da so bile rastline pod stresom. Fotokemično učinkovitost vodnih rastlin (M. spicatum, C. demersum, P. perfoliatus) je selenit nižal tudi v študiji Mechora in sod. (2013). V študiji Mechora in sod. (2011) so rastline (M. spicatum in C. demersum), obravnavane v vodi z dodanim selenatom (10 mg/l), imele prav tako nižjo fotokemično učinkovitost od 0,83. Ugotovili so tudi, da je učinek večji pri vrsti M. spicatum, vrsta C. demersum pa je bolj odporna na dodan selenat. V našem poskusu je imela vrsta P. perfoliatus, obravnavana s selenitom, najnižjo fotokemično učinkovitost med vsemi tremi vrstami. Zato sklepamo, da je bila najbolj občutljiva na dodan selenit. Enako so ugotovili tudi v študiji Mechora in sod. (2013). Zaključili so, da so rastline s celimi listi bolj občutljive na selenit v primerjavi z rastlinami, ki imajo razcepljene liste. Kot primerjava pa nižja koncentracija dodanega selenata (20 µg/l) ni imela vpliva na fotokemično učinkovitost (Mechora in sod., 2011), saj so bile vrednosti blizu 0,8. Pri vrsti M. spicatum so med izpostavitvijo selenatu (31 dni) opazili nove tvorbe poganjkov (v kontrolni skupini jih niso opazili), tako so zaključili, da so nizke koncentracije selena koristne za rastlino (Mechora in sod., 2011). Primerjamo lahko tudi vodno rastlino Lemna minor L., ki so jo v študiji Šut (2012) obravnavali z različnimi koncentracijami selenata (0,5; 1; 2; 5 in 10 mg/l). Če se osredotočimo samo na najvišjo koncentracijo dodanega selenata (10 mg/l), opazimo vzorec nižanja potencialne fotokemične učinkovitosti. Sklepali so, da je imel dodatek visoke koncentracije selenata negativen vpliv na potencialno fotokemično učinkovitost, saj so pri tej koncentraciji izmerili najnižjo fotokemično učinkovitost. Zaključili so, da je verjetno prišlo do fotooksidativnih poškodb v reakcijskem centru FS II. Dodan selenat pa ni imel vpliva na fotokemično učinkovitost pri vrsti Eruca sativa, saj so bile vrednosti F v /F m v kontrolnih in obravnavanih rastlinah okoli 0,8, kar nakazuje, da so rastline bile v dobrem fiziološkem stanju in da je bil tok elektronov v FS II nemoten (Germ in Osvald, 2005).

49 Mohorko, E. Odziv treh vodnih rastlin na spremembo vsebnosti selenita v okolju. 38 Pri vrstah M. spicatum in C. demersum opazimo visoko fotokemično učinkovitost po obravnavanju v mediju z dodanim selenitom 1 dan (0,54 in 0,50), zato sklepamo, da je selenit pri tako kratki izpostavitvi najmanj škodoval rastlinam (Slika 6, 7). Večji stres in z njim povezano nižjo fotokemično učinkovitost, smo opazili pri daljših izpostavitvah selenitu (Slika 6, 7). Vrsta P. perfoliatus pa je v nasprotju z omenjenima vrstama imela pri obravnavanju 1 dan v mediju z dodanim selenitom nizko fotokemično učinkovitost (0,27), kar kaže, da je rastlina že pri krajši izpostavitvi v mediju z dodanim selenitom pod stresom (Slika 8). Vrsta M. spicatum je v našem poskusu pri izpostavitvah 10 in 15 dni v mediju z dodanim selenitom imela vrednosti fotokemične učinkovitosti 0,28 oz. 0,33 (Slika 6). Vrsta M. spicatum je po obravnavanju 10 in 15 dni v selenitu že propadala, rastline so postale rjave. Spodnja slika (Slika 24) prikazuje vrsto M. spicatum, ki je bila izpostavljena selenitu 1 oz. 15 dni. Iz slike 24 lahko opazimo vidno razliko med vplivom selenita odvisnega od časa izpostavitve. Obravnavanje 1 dan v mediju z dodanim selenitom Obravnavanje 15 dni v mediju z dodanim selenitom Slika 24: Vrsta Myriophyllum spicatum obravnavana 1 oz. 15 dni v mediju z dodanim selenitom. Vrsta C. demersum je v našem poskusu pri izpostavitvah selenitu 5, 10 in 15 dni imela fotokemično učinkovitost 0,41, 0,31 oz. 0,36. Prav tako je vrsta C. demersum po 15 dnevnem obravnavanju s selenitom pričela razpadati in rjaveti, kar opazimo tudi na izmerjeni fotokemični učinkovitosti, ki je nižja kot pri rastlinah, ki so bile obravnavane s selenitom 1 dan (Slika 7). Vrsta P. perfoliatus pa je začela rjaveti že 4. dan obravnavanja s selenitom, kar kaže tudi izmerjena vrednost fotokemične učinkovitosti, ki je bila nizka - 0,14 (Slika 8). Sklepamo,