Katarina Grdiša Vrijednost galektina-3 i CA 125 kod procjene stadija kardiomiopatija DIPLOMSKI RAD predan Sveučilištu u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu Zagreb, 2016.
Ovaj diplomski rad prijavljen je na kolegiju Klinička biokemija organa i organskih sustava 2 Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta i izrađen na Kliničkom zavodu za kemiju KBC Sestre milosrdnice u Zagrebu pod stručnim vodstvom izv. prof dr.sc. Nade Vrkić. Zahvaljujem mentorici izv.prof.dr.sc. Nadi Vrkić na vodstvu, stručnoj pomoći te pruženom znanju i iskustvu pri izradi ovog diplomskog rada. Najljepše zahvaljujem prim. Danijelu Planincu, dr. med., specijalstu kardiologije, Klinke za bolesti srca i krvnih žila, KBC Sestre milosrdnice što je velikodušno omogućio realizaciju ovog diplomskog rada. Posebno hvala mojoj obitelji i prijateljima na velikoj podršci tijekom studiranja.
SADRŽAJ 1. UVOD... 1 1.1. GALEKTIN-3... 1 1.1.1.Struktura i funkcija... 1 1.1.1. Galektin-3 u srčanom zatajenju... 3 1.2. UGLJIKOHIDRATNI ANTIGEN 125... 3 1.2.1. Tumorski biljezi... 3 1.2.2. Struktura i funkcija CA 125... 4 1.2.3. CA 125 u tumorskim bolestima... 5 1.2.4.CA 125 u srčanom zatajenju... 5 1.3. MOŽDANI NATRIJURETSKI PEPTID... 6 1.3.2. Struktura i funkcija BNP... 6 1.3.3. BNP u srčanom zatajenju... 7 1.4. KARDIOMIOPATIJE... 9 1.4.1. Dilatativna ili kongestivna kardiomiopatija... 11 1.4.2. Restriktivna kardiomiopatija... 12 1.4.3. Hipertrofična kardiomiopatija... 13 1.5. POVEZANOST KARDIOMIOPATIJA S BILJEZIMA SRČANOG OŠTEĆENJA - GALEKTINOM-3, CA 125 I NT-proBNP... 14 2.OBRAZLOŽENJE TEME 19 3.MATERIJALI I METODE...20 3.1. ISPITANICI... 20 3.2.UZORKOVANJE... 20 3.3 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE CA 125... 20 3.3.1. Priprema uzorka... 20 3.3.2. Reagensi... 20 3.3.3. Postupak određivanja koncentracije CA 125... 21 3.3.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete... 21 3.3.3.2. Načelo metode i postupak... 21 3.4. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE NT-proBNP... 22 3.4.1 Priprema uzorka... 22 3.4.2. Reagensi... 22 3.4.3. Postupak određivanja NT-proBNP... 23
3.4.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete... 23 3.4.3.2. Načelo metode i postupak... 23 3.5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE GALEKTINA-3... 24 3.5.1. Priprema uzorka... 24 3.5.2. Reagensi... 24 3.5.3. Postupak određivanja koncentracije galektina-3... 24 3.5.3.1. Načelo metode... 24 3.5.3.2. Postupak određivanja galektina-3... 25 3.5.3.3. Izračunavanje koncentracije galektina-3... 26 3.6. STATISTIČKE METODE... 27 4.REZULTATI I RASPRAVA... 29 4.1.REZULTATI... 29 4.1.1 Prikaz rezultata kroz deskriptivnu statistiku... 29 4.1.2. Međuovisnost CA 125 i NT-proBNP... 32 4.1.2.1. Korelacija CA 125 i NT-proBNP... 32 4.1.2.2. Regresijski model za povezanost CA 125 i NT-proBNP... 33 4.1.3. Međuovisnost CA 125 i galektina-3... 35 4.1.3.1.Korelacija CA 125 i galektina-3... 35 4.1.3.2. Regresijski model za povezanost CA 125 i galektina-3... 36 4.1.4. Međuovisnost NT-proBNP i galektina-3... 38 4.1.4.1. Korelacija NT-proBNP i galektina-3... 38 4.1.4.2. Regresijski model za povezanost NT-proBNP i galektina-3... 39 4.1.5. Međuovisnost NYHA stadija i galektina-3, NT-proBNP i CA 125... 41 4.1.6. Multipla regresija... 42 4.1.6.1. Wilcoxonov test... 43 4.2. RASPRAVA... 44 5. ZAKLJUČCI... 50 6. LITERATURA... 51 7. SAŽETAK... 54 7.1 SUMMARY... 55 8. TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA/BASIC DOCUMENTATION CARD...56
POPIS KRATICA KORIŠTENIH U TEKSTU ACE engl.angiotensin-converting-enzym, angiotenzin konvertirajući enzim AIDS engl. acquired immune deficiency syndrome, stečeni sindrom humane imunodeficijencije ANP engl.atrial natriuretic peptide, atrijski natriuretski peptid BNP engl. B-type or Brain natriuretic peptide, moždani natrijuretski peptid Bcl-2 engl.b-cell lymphoma 2, onkogen CA 125 engl. Carbohydrate antigen 125, ugljikohidratni antigen 125 cgmp engl. Cyclic guanosine monophosphate, ciklički gvanozin monofosfat CNP engl. C-type natriuretic peptide, C tip natrijuretskog peptida CRD eng. carbohidrate-recognition-binding domain, domena koja veže šećere CREB engl. camp response element-binding protein, transkripcijski faktor CRP engl.c-reactive protein C-reaktivni protein ECLIA engl. electrochemiluminescnce immunoassay, imunoanaliza elektrokemiluminescencije egfr engl. estimated glomerular filtration rate, glomerularna filtracija EKG elektrokardiogram ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay, enzimska imunosorbent metoda hs CRP engl. high-sensitivity C-reactive protein, visoko osjetljivi CRP ICON engl. International Collaborative of NT-proBNP Study, Internacionalan kolaboracija NT-proBNP IL-1 interleukin-1 IL-5 interleukin-5
IL-6 interleukin-6 K-Ras engl. V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma, onkogen LPS engl. Lipopolysaccharide, lipopolisaharid MMP-2 engl. Matrix Metallopeptidase 2, matriksna metalopeptidaza-2 MUC 16 engl. Mucin 16, gen NYHA engl. New York Heart Association, Stručno društvo kardiologa u New Yorku čiji su kriteriji za stadije srčanog zatajenja usvojeni PIIINP engl. the amino terminal peptide of type III procollagen, biljeg kolagena tipa-3 PRIDE engl. Pro-BNP Investigation of Dyspnea in the Emergency Department, Akronim prospektivne kliničke studije za utvrđivanje kliničke valjanosti NT-proBNP RAAS renin-angiotenzin-aldosteron sustav RIA engl. Radioimmunoassay, radioimunološka metoda RTG, rendgen TGF-β engl. Transforming growth factor beta, transformirajući faktor rasta beta TIMP-1 engl. tissue inhibitor of metalloproteinases, inhibitor metaloproteinaza TNF-α engl. TNF, tumor necrosis factor alpha, faktor nekroze tumora alfa
1. UVOD 1.1. GALEKTIN-3 1.1.1.Struktura i funkcija Galektini su karakteristična skupina jedinstvenih proteina, lektina. Članovi porodice galektina su posebni po specifičnom vezanju β-galaktozidnih struktura. Najbolje istražen galektin je galektin-3, koji igra veliku ulogu u upali, imunosti te pojavi tumora. Do sada je identificirano 14 galektina u sisavaca, te je njihova poveznica evolucijski konzervirana sekvenca od otprilike 130 aminokiselina, poznatija kao domena koja veže šećere (eng. carbohidrate-recognition-binding domain, CRD). Galektini se svrstavaju u tri podskupine: prototipna skupina, kimerna skupina i skupina uzastopno ponavljajućeg slijeda. Podskupine su formirane na osnovi broja i organizacije CRD domena, pa tako prototipna skupina (galektin-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13 i -14) sadrži jednu CRD domenu, kimerna skupina u kojoj je samo galektin-3 također ima jednu CRD domenu, ali i dugačku N-terminalnu domenu, bogatu prolinom i glicinom. Treća skupina, skupina uzastopno ponavljajućeg slijeda (galektin-4, -6, -8, -9 i -12) sastoji se od jednog polipeptidnog lanca koji tvori dvije različite, ali homogene CDR domene, koje su odvojene nekonzerviranim povezujućim slijedom dugim 70-ak aminokiselina. Vezujuća sposobnost galektina ovisi o prisutnosti galaktoze, međutim vezujući afinitet raste ukoliko je galaktoza povezana na neki drugi saharid, kao npr. N- acetilglukozamin, te tako tvoreći N-acetillaktozamin (Dumić i sur., 2006). Slika 1. Struktura galektina-3 (preuzeto s https://en.wikipedia.org/wiki/galectin-3) 1
Galektin-3 kao glavni predstavnik ove široke skupine smješten je unutar stanične jezgre i citoplazme, na površini stanice i u izvanstaničnom prostoru. U humanom genomu kodira ga jedinstveni gen LGALS3 koji je smješten na kromosomu 14, lokus q21-q22. Humani LGALS3 sastoji se od 6 egzona i 5 introna, veličine oko 17 kb. Slijed koji kodira N- terminalnu domenu smješten je potpuno unutar egzona III, a slijed koji kodira CDR domenu unutar egzona V (Raimond J i sur., 1997). Tijekom prvog trimestra ljudske embriogeneze najviše je izražen u epitelu kože, epitelu koji oblaže gastrointestinalni i respiratorni trakt, te stanicama miokarda i jetre. Iako se galektin-3 može naći u gotovo cijelom tijelu, velika većina je koncentrirana u epitelnim i mijeloidnim stanicama. Galektin-3 eksprimiran je i kod različitih tumora, dok sam intenzitet ovisi o progresiji, invanzivnosti i metastatskom potencijalu tumora. Biološke uloge galektina-3 definirane su njegovom lokalizacijom u stanici. Prvi otkriveni ligand galektina-3 unutar citoplazme je Bcl-2, molekula uključena u regulaciju apoptoze. Daljnjim istraživanjima otkriveno je da ulazi u interakcije s mnogim drugim molekulama uključenim u regulaciju apoptoze. Svojim interakcijama s K-Ras proteinom te Akt proteinom utječe na regulaciju stanične proliferacije, diferencijacije, preživljavanja i smrti. U jezgri je galektin-3 povezan s ribonuklearnim proteinskim kompleksima. Djeluje kao pre-mrna faktor za izrezivanje. Također svojim mnogobrojnim interakcijama aktivira transkripcijske faktore CREB i SP1 te inducira promotorsku aktivnost ciklina D1 (Liu i sur., 2005). Izvanstanični galektin-3 nema prepoznatljiv sekrecijski signalni slijed niti prolazi klasičan put preko endoplazmatskog retikula i Golgijeva aparata. Međutim potvrđena je i njegova lokalizacija na staničnoj površini i u izvanstaničnom prostoru, vezanog na druge elemenete izvanstaničnog prostora, te u biološkim tekućinama i serumu. Izvanstanični galektin-3 ima brojne autokrine i parakrine efekte. Posreduje u staničnoj adheziji i staničnoj aktivaciji te djeluje kao kemoatraktant za određene stanične oblike. Kao takav ima biološku ulogu u postizanju stanične homeostaze, imunološkim reakcijama, organogenezi, angiogenezi te invazivnosti i metastaziranju tumora. Multivalentna svojstva i sposobnost vezanja glikoproteina staničnih površina te glikoliziranih komponenti izvanstaničnog matiksa, kao što su laminin, integrin, selektin, fibronektin, kolagen IV i dr. definiraju njegovu ulogu u staničnoj adheziji. Osim toga pojačava produkciju proupalnog interleukina-1 (IL-1) induciranu lipopolisaharidom (LPS) te potiče proizvodnju superoksidnog aniona u humanim monocitima periferne krvi i neutrofilima, što posljedično vodi do oksidativnog praska. Potiče otpuštanje medijatora u mast stanicama, a kao najčešći negativan učinak navodi se selektivna inhibicija ekspresije IL-5, na razini proteina i mrna. Kao što je već spomenuto djeluje kemoatraktivno na monocite, makrofage i alveolarne 2
makrofage. Dokazano je da su za tu njegovu ulogu neophodne obje podjedinice, N-terminalna domena i CDR domena. Pri višim koncentracijama djeluje kemoatraktivno, dok pri nižim uzrokuje kemokinezu, povećava neusmjerena gibanja stanica (Dumić i sur.,2006). 1.1.1. Galektin-3 u srčanom zatajenju Galektin-3 također ima važnu ulogu u razvoju fibroze i remodeliranju srčanog tkiva, što su dva najvažnija mehanizma razvijanja i progresije zatajenja srca (Cohn i sur., 2000). Istraživanja pokazuju da je neovisan pokazatelj smrtnosti u populaciji pacijenata s umjerenim i naprednim stupnjem srčanog zatajenja. Galektin potiče migraciju makrofaga, proliferaciju fibroblasta i sintezu kolagena. Lok i suradnici u svom istraživanju navode značajnu povezanost koncentracije galektina-3 i renalne disfunkcije (Lok i sur., 2010). Provedenim istraživanjem na štakorima kojima se 4 tjedna intraperikardijalno injicirao galektin-3 dokazana je povećana infiltracija makrofagima i mast stanicama, povećana intersticijska i perivaskularna fibroza srčanog tkiva, hipertrofija srčanog tkiva, povećana ekspresija TGF-β te smanjena sistolička i dijastolička funkcija srca (Liu YH i sur., 2009). 1.2. UGLJIKOHIDRATNI ANTIGEN 125 1.2.1. Tumorski biljezi Tumorski biljezi su široka skupina proteina, gena, enzima, hormona i antigena. Koriste se u procjeni rizika za nastanak karcinoma, probiranju tijekom rane pojave bolesti, kod postavljanja dijagnoze, procjene prognoze, predviđanja uspješnosti terapije te kod praćenja recidiva ili progresije bolesti. Ugljikohidratni antigeni su također skupina tumorskih biljega, CA 15-3 poznati je predstavnik ove skupine i koristi se za praćenje terapije kod pacijenata oboljelih od karcinoma dojke. Uz CA 15-3, u podskupini visokomolekularnih mucina su i CA 125, CA 549, CA 27.29. Druga podskupina su antigeni krvnih grupa, a najpoznatiji predstavnici su CA 19-9, CA 19-5, CA 50, CA 72-4, CA 242. Ugljikohidratni tumorski biljezi su klinički specifičniji od biljega koji se prirodno luče, poput enzima i hormona (Štraus, 2009). 3
1.2.2. Struktura i funkcija CA 125 CA 125 (engl. cancer antigen 125, carcinoma antigen 125, carbohydrate antigen 125) je visokomolekularni glikoprotein s molekularnom masom > 200 kda i 24 % ugljikohidrata. Eksprimiran je na epitelnim stanicama jajnika kod tumora jajnika, te u drugim patološkim i normalnim stanjima Műllerovog kanala. Naziva se i mucin 16, a kodira ga gen MUC 16, te ima jednu transmembransku domenu. Karakterističan je po svojoj dužini od 22 000 aminokiselina te je tako najduži mucin vezan na membranu. Sastoji se od tri domene, N- terminalne, tandem ponavljajuće i C-terminalne domene. N-terminalna i tandem ponavljajuća domena su ekstracelularne domene i pretežito O-glikozilirane. Aminokiseline koje se ponavljaju u tandem ponavljajućoj domeni su serin, treonin i prolin. C-terminalna domena sastoji se od ekstracelularne, transmembranske domene te citoplazmatskog repa. Proteolitičkim cijepanjem se odvaja ekstracelularna regija. Mucin 16 nalazi se u okularnom sustavu, respiratornom traktu te epitelu ženskog reproduktivnog trakta. Njegov visok stupanj glikozilacije stvara hidrofilni okoliš koji djeluje kao barijera prema stranim česticama i infektivnim agensima na apikalnoj strani epitelnih stanica, dok se citoplazmatski rep povezuje sa citoskeletom (Thomas, 1998). Slika 2. Struktura CA125 (preuzeto s https://en.wikipedia.org/wiki/file:the_structure_of_muc16_2.jpeg) 4
1.2.3. CA 125 u tumorskim bolestima Glavna dijagnostička važnost CA 125 je pomoć u prognozi i praćenju terapije tumora ovarija. Također je drugi izbor kod tumora pankreasa, nakon određivanja CA 19-9. Ne preporuča se određivanje kod drugih malignih bolesti zbog premale kliničke osjetljivosti i specifičnosti. Koncentracija CA 125 dobro korelira s veličinom tumora ovarija. (Thomas, 1998) Koncentracija CA 125 povišena je kod 50% pacijenata s fazom I bolesti, 90% pacijenata s fazom II te više od 90% pacijenata s fazom III i IV. Kada se koristi kao prognostički biljeg, preoperativne koncentracije manje od 65 ku/l povezane su s znatno većim petogodišnjim preživljenjem. Također se koristi za detekciju ostatne bolesti kod pacijenata na terapiji. Nakon kemoterapije praćenje koncentracije omogućava određivanje prognoze. Pad koncentracije CA 125 nakon prvog kruga kemoterapije pokazatelj je poboljšanja, dok perzistirajući porast koncentracije CA 125 nakon trećeg kruga kemoterapije indicira lošu prognozu. Kod detekcije ostatnih metastaza točnost CA 125 kao indikatora je 75% (Burtis, 2008). Povišene koncentracije CA 125 prisutne su kod brojnih drugih benignih stanja: endometrioze, peritonitisa, intestinalne opstrukcije, benignih gastrointestinalnih bolesti, akutnog pankreatitisa, kolecistitisa, akutnog i kroničnog aktivnog hepatitisa, kronične bolesti jetre, ciroze jetre, autoimunih bolesti, srčane i bubrežne insuficijencije. Referentni interval koji se navodi u literaturi je 35 U/ml, sa 99 %-tnom pouzdanošću za zdrave pacijente, a 65 U/ml s 99,8 %-tnom pouzdanošću za zdrave pacijente i pacijente s benignim bolestima. Princip određivanja CA 125 leži na postojanju monoklonalnog antitijela OC 125 koje reagira sa humanim epitelnim stanicama tumora ovarija te tumorskim stanicama u ascitesu, OC 125 također reagira sa normalnim i tumorski promijenjenim stanicama endometrija i endocerviksa, epitelom Műlerovog kanala, parijetalnim stanicama i mezotelijalnim stanicama (Thomas, 1998). 1.2.4.CA 125 u srčanom zatajenju CA 125 dobro poznat kako tumorski biljeg je također sve više istraživan kao potencijalni biomarker kod pacijenata sa zatajenjem srca. Etiologija povećane koncentracije kod zatajenja srca objašnjava se hipotezom nastanka u mezotelijalnim stanicama uz pojavu ascitesa te pleuralnog ili perikardijanog izljeva, ili sintezom potaknutom upalom i citokinskom stimulacijom. Citokini poput TNF-a (engl. Tumor necrosis factor, TNF) i IL-6 (engl. Interleukin-6) pokazuju povezanost sa ishodom bolesnika s kongestivnim srčanim 5
zatajenjem. IL-6 može inducirati proliferaciju stanica koje stvaraju CA 125. (Karaca i sur.,2012) Također je dokazano da perikardijalno tkivo stvara CA 125, nakon autopsije tkivo je obilježeno CA 125 protutijelima, te su serumske i perikardijalne vrijednosti CA 125 bile značajno više kod pozitivnih tj. obilježenih tkiva perikardija. Dosadašnje studije pokazuju dobre korelacije koncentracije CA 125 u serumu sa lošijom prognozom, funkcionalnim statusom te različitim prognostičkim ehokardiografskim parametrima (Duman i sur., 2008.). 1.3. MOŽDANI NATRIJURETSKI PEPTID 1.3.1. Natrijuretski peptidi BNP, moždani natrijuretski peptid (engl. Brain, ili B-type peptide) je hormon prvi put izoliran iz tkiva mozga svinje. Naziv moždani se zadržao do danas iako su istraživanja otkrila da su najveće koncentracije u ventrikulu miokarda te se preporuča naziv B tip natrijuretskog hormona. BNP je član porodice koju čine 4 natrijuretska peptida: atrijski natrijuretski peptid (ANP), natrijuretski peptid C-tipa (CNP), urodilatin te već spomenuti moždani natrijuretski peptid (BNP). BNP, ANP i CNP imaju vrlo sličnu strukturu sa 12 zajedničkih aminokiselina, od ukupno 28 aminokiselina kod ANP-a, 32 aminokiseline kod BNP-a te 22 aminokiseline kod CNP-a. Disulfidni mostovi između cisteina tvore prstenastu strukturu, koja je odgovorna za vezanje na specifične receptore ciljnih tkiva: bubrega, vaskularnog endotela, nadbubrežne žlijezde i stanica središnjeg živčanog sustava. Otkrivena su tri receptora natrijuretskog peptida (NPR-A, NPR-B i NPR-C). Vezanjem natrijuretskih hormona na receptore A i B stvara se drugi glasnik cgmp (engl. cyclic guanosine monophosphate; ciklički gvanozin monofosfat) koji posreduje u većini njegovih bioloških učinaka. NPR-C je receptor putem kojeg se BNP uklanja iz plazme. 1.3.2. Struktura i funkcija BNP Sinteza BNP-a ovisi o genskoj ekspresiji te pojačanoj regulaciji s mrna. Gen BNP-a aktivira se kad je zid miokarda izložen pojačanom stresu, uzrokovanom povećanim tlakom ili volumenom opterećenja miokarda. Mogući uzroci su ishemija, sepsa, kardiotoksične tvari te hemodinamski stres. Pre-proBNP sastoji se od 134 aminokiseline i početni je peptid u miocitu kojeg cijepaju proteaze na probnp (108 aminokiselina) te signalni peptid (26 aminokiselina). probnp, cirkulirajuće proteaze cijepaju na aktivni hormon BNP te amino-terminalni fragment (NT-proBNP). BNP se sastoji od 32 aminokiseline i karboksi-terminalni je kraj probnp-a, 6
dok amino-terminalni kraj ima 76 aminokiselina. Karboksi i amino fragmenti luče se u krv u ekvimolarnim količinima, međutim karboksi fragment, odnosno BNP ima kraći poluvijek života, pa su i njegove koncentracije u plazmi manje od koncentracija amino fragmenta, NTproBNP-a. Na koncentracije u plazmi utječe dnevni ritam, životna dob, tjelesni napor, položaj tijela, prehrambene navike, lijekovi te razna klinička stanja. Određeni lijekovi mogu utjecati na koncentraciju BNP-a, npr. diuretici, inhibitori angiotenzin-konvertaze te blokatori receptora angiotenzina II smanjuju koncentraciju BNP-a, a što može rezultirati koncentracijama BNP-a unutar referentnog intervala kod pacijenata sa kroničnim stabilnim zatajenjem srca. Na interpretaciju koncentracije NT-proBNP-a najviše utječe dob te prisutnost drugih komorbiditeta, posebno kronične bubrežne insuficijencije koja se očituje smanjenjem glomerularne filtracije (Raymond i sur., 2003). Dokazan je porast koncentracije NT-proBNPa otprilike 7% svakim desetljećem nakon 50-te godine života, te da sam porast s dobi ovisi o egfr (engl. estimated glomerular filtration rate) (Bernstein i sur., 2011). BNP se izlučuje degradacijom, razgradnjom endopeptidazama i vezanjem na specifične receptore te se dio izlučuje bubrezima, dok se NT-pro BNP u potpunosti izlučuje bubrezima, te je tako osjetljiviji na promjene u renalnoj funkciji. Iako je NT-proBNP neaktivan fragment može se koristiti u dijagnostici zatajenja srca jer je povišen prilikom istezanja srčanog mišića, slično kao BNP. Također njegove koncentracije koreliraju sa stupnjem oštećenja dijastoličke funkcije. Najvažniji fiziološki učinak srčanih natrijuretskih peptida je vazodilatacija i hipotenzivni učinak, iako imaju i brojne druge učinke kao odgovor na stanični stres: inhibicija simpatičkog živčanog sustava, inhibicija aktivnosti hormonskog sustava renin-angiotenzin-aldosteron, omogućavanje izlučivanja natrija mokraćom i mokrenja preko aferentnih i eferentnih hemodinamičkih mehanizama bubrega i distalnih tubula, smanjenje periferne krvožilne rezistencije, povećanje opuštanja glatkih mišića, usmjeravanje opuštajućih svojstava u srčani mišić, antiproliferativno i antifibrotičko djelovanje na krvožilno tkivo, sprječavanje rasta i hipertrofije srčanog mišića te djelovanje protivno mitogenezi koja uzrokuje histološke promjene u stjenci klijetke (Eroglu i sur., 2008). 1.3.3. BNP u srčanom zatajenju B tip natrijuretskog hormona je koristan pokazatelj srčane funkcije. Istraživanja pokazuju da je dobar u razlikovanju grudne boli odnosno srčane od ne-srčane dispneje te da je dobar pokazatelj dugoročne prognoze (Dvornik, 2009). 7
Slika 3. Sinteza od preprobnp-a do NT.proBNP-a i BNP-a (preuzeto s www.openi.nlm.nih.gov ) 8
1.4. KARDIOMIOPATIJE Kardiomiopatija se najlakše definira kao bolest srčanog mišića. To je bolest koja kao i svaka druga ima mnogo uzroka, znakova i simptoma te različitih načina dijagnostike i terapije. Glavno obilježje kardiomiopatija je da se srčani mišić mijenja, na način da postaje veći, deblji ili tvrđi, te u rijetkim slučajevima tkivo mišića biva zamijenjeno fibrotičnim tkivom i ožiljkom. Kako se miokard mijenja, srce postaje slabije i lošije pumpa krv i lošije održava normalni električni ritam. Kao rezultat javljaju se poremećaji srčanog ritma, aritmije, komplikacije s valvulama i najgori ishod, zatajenje srca. Postoji nekoliko glavnih tipova: ishemična, hipertenzivna, dilatativna kongestivna, hipertrofična, infiltrativna i restriktivna kardiomiopatija. Tri najčešća tipa su restriktivna, dilatativna i hipertrofična kardiomiopatija (www.msd-prirucnici.placebo.hr). Često se spominje i stresom inducirana kardiomiopatija popularno nazvana sindrom slomljenog srca. Stresom inducirana kardiomiopatija ima jednake simptome kao i srčani udar, kratkoća daha, bol u prsima, znojenje i bol u ruci. Nastanak tog sindroma tumači se velikim količinama hormona koji se luče kao odgovor na stres, pogotovo adrenalina i drugi okidača simpatičkog živčanog sustava koji može onesposobiti srčani mišić i njegovu funkciju pumpanja krvi. Ono što razlikuje ova dva stanja jest izgled koronarnih arterija, koje su kod sindroma slomljenog srca normalne, dok su kod srčanog udara začepljene (www.heart.org). Dijelimo ih na primarne, nasljedne kardiomiopatije gdje se nasljeđuje promijenjeni gen i na sekundarne, stečene, kao posljedica neke druge bolesti. Uzroci su često nepoznati, a bolest može zahvatiti sve dobne skupine. Ukoliko je kardiomiopatija posljedica mutacije u nekom genu, a do danas su istražene i otkrivene brojene mutacije u točno određenim gena koje vežemo za određeni tip kardiomiopatije, najčešće se taj gen odnosi na neki srčani protein koji omogućava kontrakciju. Nasljeđuje se autosomno dominantno. Kardiomiopatije se mogu razviti i uz nasljedne poremećaje metabolizma koji se nasljeduju autosomno recesivno. U rijetkim slučajevima kardiomiopatije zahvaćaju samo muške osobe, a to su Duchennova i Beckerova mišićna distrofija koje se nasljeđuju X vezano. Mitohondrijski naslijeđene kardiomiopatije često prate neurološki problemi, napadaji i gluhoća. Liječenje kardiomiopatija podrazumijeva promjenu životnog stila, medicinsko liječenje, operacije, te ugrađene uređaje i medikamentoznu terapiju kako bi se korigirala funkcija oštećenog miokarda, reducirale komplikacije i preveniralo daljnje pogoršanje. 9
Kardiomiopatije pogađaju sve dobne skupine i rase, ali određeni tipovi bolesti su češći u određenim grupama. Dilatativna kardiomiopatija je češća kod Afroamerikanaca nego kod bijelaca. Veća prevalencija je kod muškaraca nego kod žena. Glavni faktori koji povećavaju rizik pojave kardiomiopatija su: pozitivna obiteljska anamneza kardiomiopatija, zatajenja srca ili srčanog aresta, bolesti koje oštećuju srce kao što su koronarna srčana bolest, infarkt miokarda, virusna infekcija miokarda, dijabetes i druge metaboličke bolesti, bolesti koje u svojoj progresiji oštećuju srce, hemokromatoza, sarkoidoza, amiloidoza, alkoholizam i dugotrajno prisutan visok krvni tlak. Nekoliko rijetkih oblika kardiomiopatija ima glavne značajke koje se preklapaju s glavnim značajkama osnovnih tipova. Jedna od njih je aritmogena displazija desnog ventikula, karakterizirana je dilatiranim, loše funkcionalnim desnim ventrikulom koji ima i depozite masti u zidovima i životno ugrožavajućom ventrikluarnom tahikardijom. Mitohondrijska kardiomiopatija je posljedica kao što samo ime kaže abnormalnosti mitohondrija. Očituje se rano u djetinjstvu i često je povezana s abnormalnostima mišića, jetre ili neurološkog sustava. Najčešće se prenosi genski, a glavna klinička manifestacije je zadebljanje tj. hipertrofija zida miokarda (www.heart.org). Slika 4. Prikaz izgleda srčanog mišića, gore lijevo prikaz normalnog srca, gore desno prikaz dilatativne kardiomiopatije, dolje lijevo prikaz hipertrofične kardiomiopatije, dolje desno prikaz restriktivne kardiomiopatije. (preuzeto s http://cardiologydatabase.blogspot.hr) 10
1.4.1. Dilatativna ili kongestivna kardiomiopatija Dilatativna ili kongestivna kardiomiopatija je bolest srčanog mišića koja dovodi do zatajenja srca, a prevladava dilatacija ventrikula i sistolička disfunkcija. Najčešći je oblik kardiomiopatija. Simptomi su zaduha, opća slabost i periferni edemi. U razvoju bolesti mogu se razlikovati asimptomatski stadij, umjereno teška i teška klinička slika. Bolesnici se najčešće otkriju kod pojave zaduhe pri naporu ili kada se pojave znakovi kongestivnog zatajivanja srca kao noćni kašalj, ortopneja ili paroksizmalne noćne dispneje. Uzrok može biti genetski ili povezan s infekcijom ili uvjetima u okolišu. Česti uzrok su i virusi, (npr. coxackie B virus), te je bolest češća kod oboljelih od AIDS-a. Kao potencijalni uzročnici razvijanja ove bolesti, navode se i različite toksične tvari, poput alkohola, organskih otapala te kemoterapeutika (www.msd-prirucnici.placebo.hr). Također se može razviti posljedično zbog koronarne tromboze, srčanog udara ili upalne imunološke bolesti. Nasljedni oblik obuhvaća 30-50 % svih slučajeva bolesti, te se nasljeđuje autosomno dominantno ( Bielecka-Dabrowa i sur., 2008). Miokard se dilatira, stanjuje i kompenzatorno hipertofira, što posljedično dovodi do funkcionalne mitralne ili trikuspidne regurgitacije i proširenja atrija. Dakle glavne patološke karakteristike dilatativne kardiomiopatije jesu: dilatacija svih četiriju srčanih šupljina, a osobito lijevog ventrikula, povećana masa lijevog ventrikula, hipetrofični, izduženi miociti sa smanjenim brojem miofibrila te intersticijska fibroza. U većine bolesnika poremećaj zahvaća oba ventrikula. Simptomi ovise koji je ventrikul zahvaćen, disfunkcija lijevog ventikula uzrokuje zaduhu pri naporu i umaranje zbog povišenog dijastoličkog tlaka LV i niskog minutnog volumena. Ako simptomi zahvaćaju desni ventrikul doći će do pojave perifernih edema i proširenja vena vrata, te atrijskih aritmija. Česti su simptomi poremećaja srčanog ritma, koji uključuju palpitacije, sinkope, konvulzije i iznenadne srčane zastoje. Dijagnoza se postavlja na temelju anamneze, fizikalnog pregleda, RTG prsnog koša, EKG-a te ultrazvuka srca.. Prognoza je loša, otprilike 70 % bolesnika umire unutar 5 godina. Polovica smrti je iznenadna, zbog maligne aritmije ili embolije (www.heart.org). Ukoliko postoje primarni uzroci prva terapija je usmjerena na njih, u drugim slučajevima liječenje je isto kao kod zatajivanja srca, predvođeno ACE inhibitorima, beta blokatorima, diureticima i digoksinom. Bolesnici s dilatativnom kardiomiopatijom su često kandidati za transplantaciju srca. Prednost se daje bolesnicima mlađim od 60 godina, te je potrebno isključiti pridružene sistemske bolesti, psihijatrijske bolesti te visok otpor u žilama pluća. Iako transplantacija srca rješava problem simptoma zatajenja srca, također pokreće probleme kao što su: infekcije, 11
odbacivanje transplantata, bolest koronarnih arterija te nuspojave popratne terapije (www.msd-prirucnici.placebo.hr). 1.4.2. Restriktivna kardiomiopatija Restriktivna kardiomiopatija je najrjeđi oblik kardiomiopatija, a glavno patološko obilježje je restrikcija punjenja ventrikula te postojanje nerastezljivih zidova ventrikula koji se opiru dijastoličkom punjenju te tako uzrokuju opću slabost i zaduhu pri naporu. Sama kontraktilna funkcija i debljina zida ventikula je normalna, ali je abnormalna faza relaksacije ili punjenja. Zbog nemogućnosti pravilnog punjenja ventikula, krv se vraća u atrije, a posljedično i u pluća i ostatak tijela. Najčešće je zahvaćen desni ventrikul što vodi do perifernih edema, nakupljanja ascitesa te hepatomegalije, ali uz nepromijenjenu veličinu srca (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk2209/). Uzrok je u većini slučajeva nepoznat. Prema istraživanjima primarna restriktivna kardiomiopatija je autosomno dominantan poremećaj sa zahvaćanjem miokarda, provodnog sustava srca i skeletnih mišića. Uzroci sekundarne restriktivne kardiomiopatije mogu biti različiti patološki procesi koji infiltriraju miokard ili stvaraju ožiljke u endomiokardu. Neki poremećaji koji uzrokuju restriktivnu kardiomiopatiju također zahvaćaju i druga tkiva: amiloidoza, difuzna sistemska skleroza, fibroza endokarda, Fabryeva bolest, fibroelastoza, Gaucherova bolest, hemokromatoza, Löfflerov sindrom, sarkoidoza, hipereozinofilni sindrom. Zadebljanje endokarda ili prožimanje miokarda, ponekad je povezano i sa s odumiranjem miocita, hipertrofijom miokarda i fibrozom. Patološki proces kod endomiokardne fibroze zahvaća ulazne dijelove jednog ili obaju ventrikula, dok izlazni dijelovi ostaju nezahvaćeni. Postupno se razvije teška fibroza endokarda i subendokardijalnih slojeva miokarda s mutiplim muralnim trombima, koji se organiziraju u fibrozne ožiljke obliterirajući šupljinu ventrikula. Kao rezultat može nastati funkcionalna insuficijencija mitralnog ili trikuspidalnog zaliska, ili oštećenje sinoatrijskog čvora i različitih stupnjeva atrij-ventrikularnog bloka. Zbog oštećenog dijastoličkog punjenja i povišenog tlaka punjenja dolazi do hipertenzije vena pluća. Kompenzatorna hipertrofija dodatno pogoršava stanje, a nastali ugrušci u šupljini ventrikula mogu dovesti do sistemske embolizacije. Česte su atrijske i ventrikulske aritmije i atrij-ventrikularni blok, dok su angina i sinkope rijetke. Za postavljanje dijagnoze potrebno je učiniti EKG, RTG prsnog koša i ultrazvuk srca te pretrage za otkrivanje poznatih uzroka, npr. biopsija sluznice rektuma za amiloidozu ili određivanje željeza ili biopsiju jetre za hemokromatozu. Ehokardiogram 12
pokazuje povećanje atrija, normalnu veličinu ventrikula, normalnu funkciju srca, a progresijom bolesti i porast tlaka u plućnim arterijama. Liječenje je simptomatsko, a prognoza loša jer se često bolest otkrije u poodmaklom stadiju (www.msdprirucnici.placebo.hr). 1.4.3. Hipertrofična kardiomiopatija Hipertrofična kardiomiopatija jest prirođeni ili stečeni poremećaj srčanog mišića, koji se klinički očituje simetričnom ili asimetričnom hipertrofijom lijevog i/ili desnog ventrikula u odsutnosti bilo kojeg drugog uzroka hipertrofije. Simptomi su, kao i kod većine bolesti srca; bol u prsima, zaduha, sinkopa i iznenadna smrt. Kod nekih pacijenata razvija se i aritmija koja je faktor rizika pojave iznenadne srčane smrti. Zaduha je posljedica povećanog tlaka punjenja lijeve klijetke i povećanog tlaka u plućnim venama, a palpitacije su posljedica aritmija. U nastanku sinkope može sudjelovati više patofizioloških mehanizama, uključujući malo dijastoličko punjenje, ishemiju miokarda, srčane aritmije i opstrukciju izlaznog dijela ventrikula kod opstruktivnog tipa bolesti Dijagnoza se postavlja ultrazvukom srca. Liječi se β-blokatorima te se ponekad opstrukcija liječi kemijskim tvarima ili kirurški.za prevenciju iznenadne smrti. Zbog teških aritmija ugrađuje se implantibilni kardioverter defibrilator. On prati srčani ritam, kada se pojavi ventrikularna tahikardija ili fibrilacija otpušta šok kako bi se srčani ritam normalizirao. Također se izvodi septalna miomektomija, kojom se uklanja mišić koji dovodi do opstrukcije i sprječava protok krvi. Ovakva operacija kontrolira simptome, ali ne zaustavlja progresiju hipertrofije, niti tretira opasne aritmije (Docekal, 2016.). Upravo je hipertrofična kardiomiopatija čest uzrok neobjašnjivih sinkopa te iznenadnih smrti mladih sportaša, čiji se uzrok otkrije tek prilikom obdukcije. Većina poremećaja je nasljedno, gotovo 50 % svih slučajeva. Nasljeđuje se autosomno dominantno, ali su česte i spontane mutacije te ja fenotipski izričaj raznolik. Dio pacijenata ostaje asimptomatski tijekom života, dok drugi dio umire iznenadnom progresijom zatajenja srca. Hipertrofija se ne može objasniti povećanim tlakom niti volumenom (Uszenski i sur.,1993). Mutacije kod hipertrofične kardiomiopatije zahvaćaju DNA koji kodira za teški lanac β-miozina, α-tropomiozina i troponin T (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk2209/). Bolesnici obično razvijaju hipertrofiju za vrijeme brzog tjelesnog rasta u mladenaštvu, ali su poznati i slučajevi hipertrofične kardiomiopatije, koji su nastali u dobi starijoj od 60 godina. Zajedničko svim kardiomiopatijama je poremećena organizacija stanica i mišićnih vlakana. U najčešćem obliku 13
hipertrofične kardiomiopatije, gornji dio interventrikulskog septuma ispod aortnog zaliska je značajno hipertrofičan i zadebljao, uz istodobno blago ili nikakvo zadebljanje stražnjeg zida lijevog ventrikula. Za vrijeme sistole septum zadeblja i ponekad prednji listić mitralnog zaliska bude privučen prema septumu, što dodatno suzuje izlazni trakt i smanjuje minutni volumen. Kontraktilnost srca se najčešće ne promijeni, ali hipetrofija dovodi do ukočenosti i nerastezljivosti srčanih šupljina. Stvara se otpor dijastoličkom punjenju, raste tlak na kraju dijastole i posljedično tlak u plućnim venama. Mijenja se i protok krvi kroz koronarne arterije, što dovodi do pojave angine pektoris, sinkopa i aritmija bez prisutnosti same koronarne bolesti. Zbog nedovoljnog protoka krvi te suženog lumena intramiokardnih arterija zbog hipertrofije i hiperplazije intime i medije, dio miocita potpuno odumire. Oni bivaju zamijenjeni fibroznim tkivom i dovode do širenja hipertrofičnog miokarda te razvijanja sistoličke disfunkcije. Krvni tlak i srčana frekvencija su obično normalni, a često se čuje 4. srčani ton zbog snažne atrijske kontrakcije nasuprot slabe rastezljivog lijevog ventrikula u dijastoli. Kod postavljanja dijagnoze treba učiniti EKG i dvodimenzionalni ultrazvuk srca, a test opterećenja i 24-satni Holter EKG mogu biti od pomoći u bolesnika za koje se smatra da se pod povećanim rizikom. Stopa smrtnosti obrnuto je proporcionalna dobi u kojoj su se javili simptomi i najveća je u bolesnika koji imaju učestale, nepostojane ventrikulske tahikardije ili sinkope. Prognoza je lošija kod mladih bolesnika s pozitivnom obiteljskom anamnezom iznenadne smrti. Smrt obično nastupa iznenadno, rijetko dolazi do kroničnog zatajivanja srca (www.msd-prirucnici.placebo.hr). 1.5. POVEZANOST KARDIOMIOPATIJA S BILJEZIMA SRČANOG OŠTEĆENJA - GALEKTINOM-3, CA 125 I NT-proBNP PubMed kao najznačajnija elektronička baza znanstvene periodičke literature iz područja biomedicinskih znanosti ima više od 2700 publikacija o galektinu-3 što svakako pokazuje njegovu važnost i sudjelovanje u mnogim biološkim procesima. Poveznica je između upale i fibroze, povišene koncentracije nađene su kod ciroze, idiopatske plućne fibroze, pankreatitisa i renalnog zatajenja (Ahmad i Felker, 2012). Velik utjecaj ima i na srce, smatra se da povećava fibrozu i modulira imunološki odgovor, dva ključna procesa u srčanom remodeliranju. Njegova raznolika uloga i sudjelovanje u brojim procesima proširuje njegovu titulu i značenje biljega određenih stanja i bolesti na titulu modulatora istih stanja i bolesti. Gopal i suradnici pokazali su povezanost galektina-3 sa zatajenjem srca i jetrenom 14
funkcijom. Tijekom fibroze ekspresija galektina-3 je maksimalna dok je njegova ekspresija gotovo odsutna tijekom oporavka. Upravo taj podatak objašnjava njegovu važnost rutinskog određivanja kod pacijenata sa zatajenjem srca jer on kao takav ima kliničko prognostičko značenje, može identificirati pacijenta s visokim rizikom ponovne pojave zatajenja srca ili smrti te tako usmjeriti i individualizirati terapiju (de Boer i sur., 2009.). U samom srčanom mišiću galektin-3 je predominantno lokaliziran u miokardijalnom matriksu, u fibroblastima i makrofazima. Sharma i suradnici su u svom istraživanju pokazali da egzogeni rekombinantni galektin-3 značajno povećava migraciju makrofaga i time su potvrdili hipotezu da je galektin- 3 stimulator makrofagne migracije (Sharma i sur., 2008). U terapiji zatajenja srca a time i kardiomiopatija želi se primijeniti takav lijek koji će modificirati bolest i inhibirati sam proces razvoja zatajenja srca. Prognostička vrijednost galektina-3 ispitivana je u brojnim istraživanjima i dokazana je njegova povećana koncentracija kod hipertrofičnog miokarda, te da je povišena koncentracija neovisan prediktor smrtnosti kroz 60 dana (de Boer i sur., 2009). Određena cut-off vrijednost galektina-3 je 17,7 ng/ml, i predstavlja preporučenu gornju granicu normalnih vrijednosti (Lok i sur.,2010). Vrijednosti galektina-3 ovise o dobi, manje su kod mlađih osoba, renalnoj disfunkciji, porast koncentracije galektina-3 s porastom renalne disfunkcije, više koncentracije kod pacijenata s višim koncentracijama NT-proBNP te značajna povezanost s BMI (engl. body mass indeks, tj. indeks tjelesne mase). Noviji radovi pokazuju korelaciju galektina-3 sa serumskim kolagenskim markerom PIIINP (engl. N- terminal type III colagen peptide), matriksnom metalopreptidaza-2 (MMP-2) i tkivnim inhibitorom metaloproteinaza-1 (TIMP-1). Ove korelacije dodatno objašnjavaju ulogu galektina-3 u sintezi kolagena i reorganizaciji matriksa, migraciji i razvoju fibroze (Lok i sur., 2010.). Danas se kao biomarkeri srčanog zatajenja najčešće koriste BNP i NT-proBNP, koji su povišeni proporcionalno rastezanju ili povećanom volumenu miokarda. Ipak njihova primjenjivost je ograničena jer su njihove koncentracije varijabilne iz dana u dan i nisu povezane sa samim procesom srčane bolesti. Također na njihove koncentracije utječe puno faktora; dob, funkcija jetre, te anemija (Lok i sur., 2010). Većina biomarkera su zapravo svjedoci oštećenja srca kao što su CRP, troponin i BNP, a galektin-3 de Boer naziva krivcem jer ekstracelularni galektin sudjeluje u remodeliranju srčanog tkiva. Uz galektin kao ostali krivci navode se LDL i glukoza (de Boer i sur., 2009). 15
Kardiolozima je koncentracija natrijuretskih hormona korisna jer korelira s klinički definiranim stadijima zatajenja srca prema New York Heart Association (NYHA). Progresijom zatajenja srca opada njegova funkcija pumpe te veliku ulogu igra neurohormonalni sustav. U prvom stadiju NYHA I minimalno je oštećena funkcija srca te se ANP luči iz oba atrija zbog istezanja zidova atrija, a BNP zbog povećanja volumena i ventrikularnog tlaka oslobađa se iz kardiomiocita. ANP i BNP imaju kompenzatorni efekt, perifernu vazodilataciju i povećanje renalne eliminacije vode i natrija. Ako je minutni volumen srca smanjen u prvom stadiju, baroreceptori inhibiraju simpatički živčani sustav i renin-angiotenzin-aldosteron sustav (RAAS). U stadiju NYHA II poremećen je odgovor barorefleksa, nema inhibicije simpatičkog i RAAS sustava, te također natrijuretski peptidi ne mogu postići kompenzaciju, prevladava periferna vazokonstikcija i zadržavanje vode. U stadiju NYHA III oštećena je i renalna funkcija, natrijutski peptidi su prisutni u visokim koncentracijama ali bez svog fiziološkog utjecaja na bubrege. Posljedično dolazi do porasta intravaskularnog volumena i daljnje dilatacije srca koja dodatno pogoršava srčanu funkciju. NYHA IV stadij karakteriziran je dekompenziranim srčanim zatajenjem, kada natrijuretski peptidi više nemaju utjecaja, a prostanglandini stvoreni u bubrezima dodatno stimuliraju simpatički i RAAS sustav. ANP i BNP imaju gotovo iste fiziološke uloge, ANP se predominantno nalazi u atrijima, a BNP u ventrikulima, međutim kod zatajenja srca BNP se uz ventrikularni dio miokarda može naći i u atrijskom dijelu miokarda, u koncentracijama višim od koncentracije ANP-a. BNP je specifičan indikator porasta volumena u ventrikulima, porasta tlaka lijevog ventrikula i dijastoličkog tlaka što ga čini jako dobrim pokazateljem zatajenja srca. Ostale indikacije kod kojih se određuje su: procjena ventrikularne disfunkcije poslije infarkta miokarda, hipertrofična opstruktivna kardiomiopatija, hipertrofija lijevog ventikula te dilatirajuća kardiomiopatija (Thomas, 1998). Kod zdravih ljudi koncentracije BNP-a i NT-proBNP-a su slične, dok su kod pacijenata sa zatajenjem srca koncentracije NT-proBNP-a 2-10 puta veće od BNP-a. Iako se izlučuju u jednakim koncentracijama, BNP ima kraće poluvrijeme života u serumu pa je posljedično i njegova koncentracija manja. Poluvrijeme života BNP-a je 20 minuta, a NT-proBNP-a 60-120 minuta. Međutim mnogi faktori utječu na koncentraciju natrijuretskih peptida u serumu te su nezavisni o stupnju oštećenja srca. Neki od faktora su dob, koncentracija proporcionalno raste s dobi, spol, više koncentracije kod žena, glomerularna filtracija, koncentracije rastu s 16
bubrežnim oštećenjem, pretilost, koncentracija opada proporcionalno indeksu tjelesne mase (engl. body mass indeks BMI) (Bielecka-Dabrowa i sur., 2008). 2005. godine Januzzi i suradnici u svojoj velikoj studiji popularno nazvanoj PRIDE (engl. Pro-BNP Investigation of Dyspnea in the Emergency Department) istražili su važnost testiranja NT-proBNP-a kao biljega kroničnog srčanog zatajenja. Dodatnu značajnost ovoj studiji daje njezin velik broj ispitanika, 600 pacijenata koji su primljeni u hitni prijem s dispnejom. Kao rezultat ove studije izašlo je nekoliko kliničkih važnih vrijednosti NTproBNP-a. Ako govorimo o NT-proBNP-u kao neovisnom o dobi i s visokom negativnom prediktivnom vrijednošću (99%), 300 pg/ml je odlučujuća vrijednost za isključivanje kroničnog srčanog zatajenja. Obzirom da koncentracija NT-proBNP značajno ovisi o dobi te se povišena vrijednost kod starijih tumači pojavom komorbiditeta poput kroničnih strukturnih promjena srca, akutnog koronarnog sindroma i pogoršanja bubrežne funkcije, preporučene vrijednosti na temelju kojih se donosi klinička odluka zatajenja srca za pacijente mlađe od 50 godina iznosi >450 pg/ml s osjetljivošću 93% i specifičnošću 95%, dok za pacijente starije od 50 godina ta vrijednost jest > 900 pg/ml s osjetljivošću 91% i specifičnošću 80% (Januzzi i sur., 2005). Mnoge studije navode NT-proBNP kao korisniji biljeg od BNP-a. Također se želi naglasiti utjecaj različitih faktora i komorbiditeta na samu koncentraciju te se predlaže korekcija s obzirom na dob i vrijednosti egfr-a. Velikim istraživanjem 2011. godine uočilo se da koncentracija NT-proBNP a iznenada raste nakon dobi od 50 godina, porast koncentracije za 7 % svako desetljeće života nakon 50-te godine, pad egfr-a za 4 % svako desetljeće života iznad 50-te godine starosti, porast NT-proBNP-a može biti odgođen ili ubrzan zbog prisutnosti različitih komorbiditeta (Bernstein i sur., 2011). Određivanje BNP-a i NT-proBNP-a omogućuje bržu dijagnozu, smanjuje vrijeme provedeno u hitnoj ambulanti te tako smanjuje troškove i potrebu za rehospitalizacijom. Internacionalna kolaboracija NT-proBNP-a (engl. International Collaborative of NT-proBNP Study, ICON) potvrdila je cut-off vrijednost 300 pg/ml kao neovisnu o dobi, uz negativnu prediktivnu vrijednost od 98%, što ovu pretragu čini značajnijom u isključivanju nego u potvrdi zatajenja srca (Ekelund, 2014.). Filipiak i suradnici u svom istraživanju navode da simultano određivanje NT-proBNP-a i CA 125 daje najvišu prediktivnu točnost u izračunu rizika zatajenja srca. Zato se tumorski biljeg CA 125 sve češće spominje kao neovisni prediktivni biljeg ponovne hospitalizacije srčanih bolesnika (Filipiak i surad., 2007.). 17
NT-proBNP i CA 125 imaju različite patofiziološke mehanizme te tako daju i različite klinički važne informacije. NT-proBNP se luči kao odgovor na ventrikularnu dilataciju uzrokovanu povećanjem tlaka ili volumena, te je njegovo poluvrijeme života 60-120 minuta, dok je poluvrijeme života CA 125 tjedan dana i sintetizira se u seroznim stanicama kao odgovor na nakupljanje tekućine ili pojačano stvaranje citokina. Maksimalnu koncentraciju CA 125 postiže trećeg dana hospitalizacije pacijenta (Santoro i sur., 2016). Prvi rad koji je svojim rezultatima istraživanja pokazao sistemsku povezanost između kliničkog stanja zatajenja srca, hemodinamskog stanja, prognoze pacijenta i koncentracije CA 125 objavljen je 1999. U njemu je postavljena cut-off vrijednost od 35 U/mL. Zajedno s CA 125 dokazane su i istodobno povišene koncentracije neurohormona noradrenalina i atrijalnog natriuretskog peptida. U svim zabilježenim slučajevima progresivan porast vrijednosti CA 125 zabilježen je kod terminalnog stadija pacijenata, što uvelike pridonosi ranijoj intervenciji koja može prevenirat progresiju bolesti i potencijalno smanjiti mortalitet (Nägele i sur., 1999). Nägele i suradnici također navode da je IL-6 povezan sa CA 125 na način da potiče proliferaciju stanica koje proizvode CA 125 te se kao najvjerojatnija hipoteza postavlja činjenica da razvojem kongestije dolazi do aktivacije stanica peritonealnog mezotelijuma. Nägele i suradnici su u svojem istraživanju dobili rezultate koji upućuju na to da je koncentracija CA 125 povišena kod svih stupnjeva NYHA, dok su D'Aloia i sur. u svom istraživanju na 286 pacijanata, od kojih 23 ima dilatativnu kardiomiopatiju dobili rezultate iz kojih se zaključuje da je koncentracija CA 125 značajno povišena u NYHA stupnjevima III i IV. Rezultati su: niti jedan pacijent sa NYHA stupnjem I nije imao koncentraciju CA 125 veću od 35 U/mL, 12% pacijenata sa stupnjem II je imalo povišen koncentracije, 84 % pacijenata sa stupanjem III te 100 % pacijenata sa stupnjem IV je imalo značajno povišene koncentracije CA 125. Zaključak tog istraživanja jest da koncentracija CA 125 pada s primjenom agresivne terapije te da je povišena kod pleuralnog, perikardijalnog ili peritonelanog nakupljanja tekućine. Porast koncentracije CA 125 bez prisutnosti akumulacije tekućine objašnjava se hipotezom da sintezu potiče upala i citokinska stimulacija prilikom zatajenja srca. Karaca i suradnici su u istraživanju na pacijenatima s neishemičnom dilatirajućom kardiomiopatijom došli do zaključka da je koncentracija CA 125 povezana sa NYHA stupnjem, reduciranom sistoličkom i dijastoličkom funkcijom, pogresijom mitralne regrutacije i povećanom koncentracijom BNP-a (Karaca i sur., 2012). 18
2.OBRAZLOŽENJE TEME Današnja medicina i laboratorijska dijagnostika žele zajedničkim pristupom ubrzati dijagnostiku bolesti u najranijoj fazi, kako bi se terapija počela pravovremeno primjenjivati. Kod bolesti srčanog mišića, kardiomiopatija, izuzetno je važno otkriti bolest na vrijeme kako bi se terapijom pokušala zaustaviti progresija bolesti i krajnji ishod zatajenje srca. Dispneja, slabost te retencija tekućine glavni su simptomi srčanog zatajenja. Glavni simptomi kao tipični ipak nisu dovoljno specifični i nužno ih je razlikovati od ostalih hitnih stanja poput akutnog respiratornog zatajenja kod starijih osoba. Veliki napori ulažu se u otkrivanje novih biljega za dijagnozu, prognozu, praćenje i procjenu rizika. Osim rutinskih laboratorijskih pretraga: krvne slike, elektrolita i kreatinina brojne druge pretrage mogu pokazati stanje funkcije srca. Kardiomiopatije su bolesti srčanog mišića u kojima se mijenja sam oblik mišića, on postaje deblji, veći ili tvrđi te tako uvjetuje i promjene same srčane funkcije i opskrbe tijela krvlju. Cilj rada: Odrediti povezanost koncentracija galektina-3, CA-125 i NT-proBNP-a u serumu pacijenata s dijagnozom kardiomiopatija, različitog NYHA stadija. Specifični ciljevi: 1. Odrediti koncentraciju galektina-3 u uzorcima pacijenata 2. Odrediti koncentraciju CA-125 u uzorcima pacijenata 3. Odrediti koncentraciju NT-proBNP u uzorcima pacijenata 4. Odrediti međuovisnost koncentracija galektina-3, CA 125 i NT-proBNP kod kardiomiopatija 5. Odrediti međuovisnost NYHA stadija s koncentracijama galektina-3, CA 125 i NT-proBNP te metodom multiple regresije postaviti matematički model za procjenu stadija bolesti na temelju biokemijskih pokazatelja 19
3.MATERIJALI I METODE 3.1. ISPITANICI Ispitanici su pacijenti s dijagnosticiranim jednim od oblika kardiomiopatije, u dobi od 28 do 83 godina. Ukupan broj ispitanika bio je 65, a svrstani su u grupe prema NYHA stadiju: stadij I- 2 pacijenta, stadij II- 21 pacijent, stadij I/II- 3 pacijenta, stadij III- 10 pacijenta, stadij II/III- 5 pacijenata, stadij IV- 15 pacijenata i stadij III/IV- 7 pacijenata. 3.2.UZORKOVANJE Uzorkovanje se provodilo u prijemnoj ambulanti Kliničkog zavoda za kemiju KBC Sestre milosrdnice u Zagrebu, od 8 do 10 sati, prema smjernicama o rutinskom uzorkovanju venske krvi. Krv je uzeta u serumski spremnik, bez antikoagulansa sa crvenim čepom, tj. u standardizirani spremnik sa podtlakom (Greiner Bione, Austrija). Uzorci su ostavljeni 30 minuta prije centrifugiranja u standardnoj laboratorijskoj centrifugi brzinom od 3500 ok/min kroz 10 minuta. Takvi uzorci pohranjeni su na temperaturi -20 C do postupka obrade. Uzorci su prikupljeni u periodu od siječnja do prosinca 2015. godine. 3.3 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE CA 125 3.3.1. Priprema uzorka Prikupljeni uzorci dostavljeni su u obliku zamrznutog alikvota odvojenog od stanica centrifugiranog seruma, na lokaciju Klinike za tumore. Prije početka same analize dostavljeni uzorci su odmrznuti stajanjem na sobnoj temperaturi, nakon čega su homogenizirani na tresalici ili ručno. Analiza se provodila na analizatoru Cobas e411, tvrtke Roche, Njemačka. 3.3.2. Reagensi Korišten je komercijalno dostupa paket reagensa naziva CA125 II (II. generacija testa) koji sadrži: M mikročestice obložene streptavidinom (0,72 mg/ml), konzervans R1 anti-ca 125-At-biotin, monoklonsko protutijelo (anti-ca 125-At) obilježeno biotinom, (mišje protutijelo M 11), 1 mg/ml, fosfatni pufer (100 mmol/l), ph 7,4, konzervans R2 anti-ca 125-At-Ru(byp)3 2+ (OC 125, mišja), monoklonsko protutijelo (anti- CA 125-At) obilježeno rutenijevim kompleksom, (mišje protutijelo OC 125), 1 mg/l, fosfatni pufer (100mmol/L), ph 7,4, konzervans 20
OC 125 detekcijsko protutijelo, a M 11 vezajuće protutijelo, Ru(byp)3 2+, tris(2,2 ' - bipiridil)rutenijum(ii) kompleks 3.3.3. Postupak određivanja koncentracije CA 125 3.3.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete Ova metoda je sljediva i standardizirana do CA 125 II RIA, Fujirebio Diagnostics. Svaki set reagensa označen je barkodom koji sadrži specifične podatke o kalibraciji. Tako se preuzima i definirana kalibracijska krivulja. Kalibracija se mora provesti kod svakog novog lota, te se preporuča ponoviti nakon 8 tjedan korištenja istog lota reagensa, svakih 7 dana korištenja istog kita reagensa te ukoliko dođe do odstupanja kontrola od preporučenih vrijednosti. Za kontrolu kvalitete koriste se kontrole PreciControl Tumor Marker. Preporuča se puštanje kontrola različitih koncentracija barem jednom dnevno, jednom za svaki novi kit reagensa te nakon kalibracije. Svaki laboratorij treba definirati svoje raspone koncentracija kontrola koji zadovoljavaju definirane kriterije. 3.3.3.2. Načelo metode i postupak Za određivanje koncentracije CA 125 u serumu koristila se metoda imunoanalize elektrokemiluminescencije (engl. electrochemiluminescnce immunoassay, ECLIA). Luminometrija jest fotometrijska tehnika u kojoj mjerimo intenzitet emitirane svjetlosti. Podvrste luminometrije su fotoluminescencija, kemiluminescencija, elektrokoluminescencija, fosforescencija, termoluminescencija itd. ECLIA je kombinacija kemiluminescencije i elektroluminescencije. Kod kemiluminiscentnih metoda kao obilježivači imunokemijske reakcije upotrebljavaju se kemiluminescentne tvari. Njihovo osnovno svojstvo jest da se nakon pobuđivanja kemijskom reakcijom vraćaju u osnovno energijsko stanje i pritom emitiraju fotone, a reakcija se naziva kemiluminescencijom. Kod ove metode reakcija je izazvana električnom strujom i zato se naziva elektroluminescencija (Dodig, 2015). Test se bazira na principu sendvič, ukupno trajanje testa je 18 minuta. U prvoj inkubaciji pomiješa se 20 µl uzorka, monoklonalna CA 125 specifična protutijela obilježena biotinom te monoklonalna CA 125 protutijela obilježena rutenijevim komplekom. Komponente smjese formiraju takozvani sendvič, specifična protutijela obilježena biotinom vežu CA 125 iz uzorka, koji je antigen, te se s njegove druge strane veže monoklonalno protutijelo obilježeno 21
rutenijevim kompleksom. Nakon dodavanja mikročestica obloženih streptavidinom, kompleks se veže na čvrstu fazu zbog interakcija između biotina i streptavidina. Taj korak se događa tijekom druge inkubacije. Reakcijska smjesa se aspririra, a mikročestice s vezanim kompleksom antigena i protutijela se magnetski zadržavaju na površini elektrode. Nevezane čestice se uklanjanu s ProCell/ProCell M smjesom pufera. Primjenom napona na elektrodu inducira se kemiluminescentna emisija svjetla koja se mjeri uz pomoć fotomulitiplikatora. Količina nastalog svjetla je direktno proporcionalna količini analita tj. CA 125 u uzorku. Rezultati se dobivaju usporedbom s kalibracijskom krivuljom. 3.4. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE NT-proBNP 3.4.1 Priprema uzorka Prikupljeni uzorci dostavljeni su u obliku zamrznutog alikvota odvojenog od stanica centrifugiranog seruma, na lokaciju Kliničkog zavoda za kemiju, KBC Sestre milosrdnice. Prije početka same analize dostavljeni uzorci su odmrznuti stajanjem na sobnoj temperaturi, nakon čega su homogenizirani na tresalici ili ručno. Analiza se provodila na analizatoru Cobas e411, tvrtke Roche, Njemačka. 3.4.2. Reagensi Korišten je komercijalno dostupan paket reagensa Elecsys probnp II, N-terminalni probnp natrijuretski peptid koji sadrži: M mikročestice obložene streptavidinom (0,72 mg/ml), konzervans R1 anti-nt-probnp-biotin, monoklonska protutijela (anti-nt-probnp protutijela) obilježena biotinom (mišja protutijela), 1,1 µg/ml, fosfatni pufer 40 mmol/l, ph 5,8, konzervans R2 anti-nt-probnp-at- Ru(byp)3 2+ monoklonska (anti-nt-probnp) protutijela obilježena s rutenijevim kompleksom (ovčja protutijela), 1,1 µg/ml, fosfatni pufer 40 mmol/l, ph 5,8 i konzervans Ru(byp)3 2+ -tris(2,2 ' -bipiridil)rutenijum(ii) kompleks, oba monoklonska protutijela su usmjerena na epitope N-terminalnog dijela probnp-a (1-76 aminokiselina). 22
3.4.3. Postupak određivanja NT-proBNP 3.4.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete Ova metoda je sljediva i standardizirana do probnp II assay (REF 03121640). Svaki set reagensa označen je barkodom koji sadrži specifične podatke o kalibraciji. Tako se preuzima i definirana kalibracijska krivulja. Kalibracija se mora provesti kod svakog novog lota, te se preporuča ponoviti nakon 12 tjedan korištenja istog lota reagensa, svakih 7 dana korištenja istog kita reagensa te ukoliko dođe do odstupanja kontrola od preporučenih vrijednosti. Za kontrolu kvalitete koriste se kontrole PreciControl Cardiac II. Preporuča se puštanje kontrola različitih koncentracija barem jednom dnevno, jednom za svaki novi kit reagensa te nakon kalibracije. Svaki laboratorij treba definirati svoje raspone koncentracija kontrola koji zadovoljavaju definirane kriterije. 3.4.3.2. Načelo metode i postupak Za određivanje koncentracije NT-proBNP u serumu koristila se metoda imunoanalize elektrokemiluminescencije (engl. electrochemiluminescnce immunoassay, ECLIA). Ista metoda je korištena i za određivanje CA 125 te je opisana u prethodnom poglavlju. Test se bazira na principu sendvič, ukupno trajanje testa je 18 minuta. U prvoj inkubaciji pomiješa se 20 µl uzorka u kojem je prisutan antigen, NT-proBNP, monoklonala NTproBNP specifična protutijela obilježena biotinom te monoklonalna NT-proBNP protutijela obilježena rutenijevim komplekom. Komponente smjese formiraju takozvani sendvič, specifična protutijela obilježena biotinom vežu NT-proBNP iz uzorka, te se s njegove druge strane veže monoklonalno protutijelo obilježeno rutenijevim kompleksom. Nakon dodavanja mikročestica obloženih streptavidinom, kompleks se veže na čvrstu fazu zbog interakcija između biotina i streptavidina. Taj korak se događa tijekom druge inkubacije. Reakcijska smjesa se aspririra, a mikročestice se magnetski zadržavaju na površini elektrode. Nevezane čestice se uklanjanu s ProCell/ProCell M smjesom pufera. Primjenom napona na elektrodu inducira se kemiluminescentna emisija koja se mjeri uz pomoć fotomulitiplikatora. Količina nastalog svjetla je direktno proporcionalna količini analita tj. NT-proBNP-u u uzorku. Rezultati se dobivaju usporedbom s kalibracijskom krivuljom. 23
3.5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE GALEKTINA-3 3.5.1. Priprema uzorka Prikupljeni uzorci dostavljeni su u obliku zamrznutog alikvota odvojenog od stanica centrifugiranog seruma, na lokaciju Kliničkog zavoda za kemiju, KBC Sestre milosrdnice. Prije početka same analize dostavljeni uzorci su odmrznuti stajanjem na sobnoj temperaturi, nakon čega su homogenizirani na tresalici ili ručno. Analiza se provela na komercijalnom dostupnom ELISA (engl. Enzyme-linked Immunosorbent Assay) kitu za kvantitativnu detekciju ljudskog galektina-3. 3.5.2. Reagensi Korišten je komercijalno dostupan paket reagensa za kvantitativno određivanje humanog galektina-3, ELISA BMS279/4, ebioscience, SAD. Mikrotitarska pločica obložena s monoklonalnim protutijelima na humani galektin-3 (96 jažica) HRP konjugat Liofilizirani standard humanog galektina-3 (60 ng/l) Otapalo za uzorke, Sample Diluent Koncentrat pufera za test, Assay Buffer ( PBS sa 1% Tween 20 i 10 % BSA) Koncentrat pufera za ispiranje, Wash Buffer ( PBS sa 1% Tween 20) Otopina supstrata ( tetrametil.benzidin) Prekidačka (stop) otopina (1 M fosforna kiselina) Adhezivni film 3.5.3. Postupak određivanja koncentracije galektina-3 3.5.3.1. Načelo metode Enzimoimunokemijska metoda, ELISA je metoda kojom se ispituje nazočnost određenih antigena u uzorku. Reakcija se odvija na mikrotitarskoj pločici koja može biti obložena antigenima ili protutijelima. Reakcija se zasniva na formiranju kompleksa antigenprotutijelo i stvaranju obojenja. Vezno protutijelo je ono koje veže antigen za čvrstu podlogu, dok je detekcijsko protutijelo ono koje je obilježeno enzimom. Dodatkom supstrata dolazi do 24
reakcije i stvaranja obojenog produkta. Najčešće korišten enzim je peroksidaza iz hrena (engl. horseradish peroxidase, HRP) koja katalizira redukciju vodikovog peroksida. Nakon stvaranja produkta, potrebno je zaustaviti enzimsku reakciju te očitati apsorbanciju na definiranoj valnoj duljini. Usporedbom signala uzorka s poznatim vrijednostima iz baždarne krivulje izračunavaju se kvantitativni rezultati (Dodig, 2015). Na mikrotitarsku pločicu adsorbirana su protutijela, anti-humana galektin-3 protutijela. Galektin-3 iz uzorka ili standarda veže se na protutijela adsorbirana na miktotitarske pločicu. Nakon prve inkubacije slijedi pranje puferom kako bi se isprale nevezane biološke komponente. Zatim se dodaje HRP konjugat, anti-galektin-3 antitijelo koje se veže na galektin-3 koji je vezan na prvo protutijelo. Slijedi ponovno ispiranje puferom te dodavanje otopine supstrata koja reagira s HRP-om. Taj korak je treća inkubacija. Reakcijom enzima i supstrata nastaje obojani produkt (Slika 5.). Intenzitet obojenja jažice proporcionalan je koncentraciji galektina-3 u jažici. Reakcija se zaustavlja dodavanjem kiseline i mjeri se apsorbancija na 450 nm. Kalibracijska (baždarna) krivulja radi se iz 7 točaka otopina standarda galektina-3. Na temelju kalibracijske krivulje očitavaju se rezultati, tj. koncentracije galektina-3. 3.5.3.2. Postupak određivanja galektina-3 Koncentrat otopine za ispiranje (Wash Buffer) volumena 50 destiliranom vodom do volumena 1000 ml ml razrijediti s Koncentrat otopine Assay Buffer volumena 5 ml razrijediti s destiliranom vodom do volumena 100 ml Pripremiti standardne otopine (S1-S7) tako da u svih 7 epruveta dodamo 225 µl Sample Diluent otopine, te u prvu epruvetu pipetiramo 225 µl rekonstruiranog standarda, aspiriramo i prenosimo 225 µl u sljedeću epruvetu. Taj postupak ponovimo za svih 7 epruveta, tako dobijemo serijsko razrjeđenje, 7 koncentracija za konstruiranje standardne krivulje. Koncentracija rekonstruiranog standarda je 60 ng/ml, a raspon standarda 30 0,47 ng/ml Uzorke seruma termostatirati na sobnu temperaturu Odrediti broj mikrotitarskih jažica potrebnih za uzorke, slijepe probe i standarde Isprati mikrotitarsku pločicu dva puta po 400 ml Wash Buffer-a Pipetirati 100 µl Sample Diluenta u duplikatu u jažice koje predstavljaju slijepe probe 25
Pipetrirati 100 µl svakog standarda (S1-S7) u duplikatu Dodati 50 µl Sample Diluent otopine u sve ostale jažice Dodati 50 µl uzorka u svaku jažicu Pokriti mikrotitarsku pločicu adhezivnom folijom te inkubirati 1 h na tresalici za mikrotitarske pločice Koncentrat HRP-konjugata razrijediti s Assay Buffer-om, u omjeru 1:100 Ukloniti adhezivnu foliju i isprazniti pločicu te oprati jažice 4 puta s 400 µl otopine Wash Buffer Dodati 100 µl razrijeđenog HRP-konjugata u sve jažice Pokriti mikrotitarsku pločicu adhezivnom folijom te inkubirati 1 h na tresalici za mikrotitarske pločice Ukloniti adhezivnu foliju i isprazniti pločicu te oprati jažice 4 puta s 400 µl otopine Wash Buffer Pipetirati 100 µl TMB supstrata u sve jažice Inkubirati mikrotitarsku pločicu na sobnoj temperaturi u tamnom otprilike 30 minuta Preporučljivo je dodati 100 µl stop otopine u sve jažice kada standard s najvećom koncentracijom razvije tamnoplavu boju Očitati apsorbanciju reakcijske otopine u jažicama unutar 1 h koristeći čitač mikrotitarskih pločica na valnoj duljini 450 nm 3.5.3.3. Izračunavanje koncentracije galektina-3 Nakon očitavanja apsorbancije standarda konstruira se baždarna krivulja sa poznatim apsorbancijama na ordinati i koncentracijama humanog galektina-3 na apscisi. Za određivanje koncentracije humanog galektina-3 iz uzorka, potrebno je na ordinati pronaći dobivenu apsorbanciju za uzorak i povući horizontalnu crtu te na presjecištu sa standardnom krivuljom povući okomicu na apscisu i očitati koncentraciju za određeni uzorak. Tijekom samog ELISA postupka, uzorci su bili razrijeđeni 1:2, stoga se koncentracije očitane iz standardne krivulje moraju pomnožiti sa faktorom razrjeđenja (x 2). 26
Slika 5. Koraci ELISA metode određivanja galektina-3 (preuzeto iz uputa unutar kutije reagensa, Package insert, dostupan na www.ebioscience.com ) 3.6. STATISTIČKE METODE Za prikaz rezultata i statističku obradu podataka korišteni su računalni programi Excel 2010, Microsoft Office (Microsoft USA) i MedCalc v.10.1.2. (MedCalc Software, Mariakerke, Belgija). Korištenjem deskriptivne statistike prikazani su dobiveni podaci, a skupovi podataka ispitani su D'Agostino-Pearsonovim statističkim testom na normalnost raspodjele. Ukoliko distribucija podataka ne slijedi Gaussovu raspodjelu koristit ćemo neparametrijske testove koji su analogni parnom t-testu. Za ispitivanje varijabli i njihove sukladnosti i povezanosti korišten je statistički parametar izračunavanja korelacije, kojim se dobiva Pearsonov (r) ili Spearmanov (ρ) koeficijent korelacije ovisno o raspodjeli podataka koje koreliramo te njihova statistička značajnost P koja ukazuje koliko je korelacija statistički utemeljena. Vrijednosti P <0,05 smatraju se statistički značajne. Koeficijenti korelacije tumače se prema Coltonu (Tablica 1.). Za utvrđivanje postotka podudarnosti izmjerenih veličina s regresijskim modelom izračunat je i koeficijent determinacije (R 2 ). Rezultati su prikazani grafičkim prikazom histograma kojim se zaključuje o raspodjeli podataka, zatim pravcem regresije s jednadžbom y= a + bx, gdje a predstavlja odsječak na 27
osi y u kojem pravac siječe ordinatu, a b nagib pravca, tj. porast na osi y za jedinični porast na osi x, uz naznačene granice pouzdanosti od 95 % i granice predviđenih vrijednosti od 95 %. Grafički su prikazane i raščlambe ostataka tj. reziduali koji predstavljaju mjeru rasipanja rezultata oko pravca regresije. Prikaz reziduala omogućava i vizualnu evaluaciju dobivenih podataka te lakše uočavanje potencijalnih vrijednosti koje jako odudaraju od ostalih, tzv. outliers. Metodom multiple regresije postavljen je matematički model za procjenu stadija srčanog zatajenja u skladu s NYHA kriterijem, na temelju 3 nezavisne varijable (NT-proBNP, CA125 i galektin-3) na razini značajnosti P<0,05. Za usporedu klinički određenih i imatematičkim modelom izračunatih NYHA stadija prema regresijskom modelu korišten je Wilcoxonov test također na razini značajnosti P<0,05. Tablica 1. Tumačenje koeficijenta korelacije r prema Coltonu KOEFICIJENT KORELACIJE (r) POVEZANOST 0 do ± 0,25 nema povezanosti ± 0,26 do ± 0,50 slaba povezanost ± 0,51 do ± 0,75 umjereno do dobra povezanost ± 0,76 do ± 1 dobra do izvrsna povezanost Tablica 2. Prikaz referentnih intervala, odnosno graničnih vrijednosti za zdravu populaciju VARIJABLA Galektin-3 NT-proBNP CA 125 GRANIČNA VRIJEDNOST (CUT-OFF) < 17,7 ng/ml < 125 ng/l < 35 U/ml U Tablici 2. navedene su vrijednosti varijabli koje predstavljaju referentne intervale ili cut-off vrijednosti dobivene iz literature ili prakse. Za NT-proBNP mnogi autori predlažu više vrijednosti, < 300 ng/l (Januzzi i sur., 2005). 28
4.REZULTATI I RASPRAVA 4.1.REZULTATI 4.1.1 Prikaz rezultata kroz deskriptivnu statistiku U istraživanju je sudjelovalo 65 bolesnika koji boluju od kardiomiopatije. Na njihovim uzorcima provedena su mjerenja CA 125, NT-proBNP i galektina-3. Slika 6. Grafički prikaza histograma koji prikazuju raspodjelu podataka mjerenja Iz prikaza histograma učestalosti na Slici 4. vidi se da podaci za CA 125 i NT-proBNP ne slijede normalnu raspodjelu. Krivulje su nagnute u desnu stranu. Podaci za galektin-3 slijede normalnu razdiobu. 29