Središnja medicinska knjižnica

Središnja medicinska knjižnica Samardžija, Marina (2005) Povezanost polimorfizma CYP2C9 s dozom i komplikacijama terapije oralnim antikoagulansom varfarinom [Association between CYP2C9 polymorphism and warfarin anticoagulant therapy dose and complications ]. Doktorska disertacija, Sveučilište u Zagrebu. http://medlib.mef.hr/183 University of Zagreb Medical School Repository http://medlib.mef.hr/

Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet Marina Samardžija POVEZANOST POLIMORFIZMA CYP2C9 S DOZOM I KOMPLIKACIJAMA TERAPIJE ORALNIM ANTIKOAGULANSOM VARFARINOM Doktorski rad Zagreb, rujan 2005.

Ovaj rad, izrađen u Zavodu za transfuzijsku medicinu Kliničke bolnice Osijek i Kliničkom zavodu za kemiju Kliničke bolnice Sestre milosrdnice pod vodstvom prof. dr. sci. Elizabete Topić, predan je na ocjenu Medicinskom fakultetu sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja znanstvenog stupnja doktora medicinskih znanosti.

Zahvaljujem se prof. dr. sc. Elizabeti Topić na pomoći i savjetima tijekom izvođenja ispitivanja i pisanja rada. Hvala prof. dr. sc. Branku Vitaleu koji me je potaknuo da upišem poslijediplomski studij, dr. sc. Mariu Štefanoviću na izvođenju molekulskih analiza i mr. sc. dr Ladi Zibar na pomoći pri statističkoj obradi podataka, kao i svim kolegama koji su mi svojim znanjem i iskustvom pomogli u pisanju rada. Hvala mojoj prijateljici dr. Ivanki Bosanac i drugim prijateljima na nesebičnoj podršci i razumijevanju. Hvala mojoj obitelji na potpori i strpljenju.

SADRŽAJ stranica I Sažetak 1 II Abstract 3 1. UVOD 5 1.1 Enzimi odgovorni za metabolizam lijekova 8 1.2 Fenotipizacija/genotipizacija 19 1.3 Oralni antikoagulansi 20 2. CILJEVI RADA 29 3. SVRHA RADA 30 4. ISPITANICI I POSTUPCI 31 5. REZULTATI 38 6. RASPRAVA 61 7. ZAKLJUČCI 78 8. LITERATURA 79 9. DODATAK 88 9.1 Popis oznaka i kratica 88 9.2 Popis tablica i slika 89 10. ŽIVOTOPIS 91

Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet Poslijediplomski doktorski studij Doktorski rad POVEZANOST POLIMORFIZMA CYP2C9 S DOZOM I KOMPLIKACIJAMA TERAPIJE ORALNIM ANTIKOAGULANSOM VARFARINOM Marina Samardžija Zavod za transfuzijsku medicinu Kliničke bolnice Osijek SAŽETAK In vitro istraživanja pokazuju da su aleli CYP2C9 *2 i *3 povezani sa značajno smanjenim metabolizmom različitih supstrata CYP2C9 u odnosu na divlji tip. Među oralnim antikoagulansima lijek izbora je varfarin koji je supstrat CYP2C9. Cilj ovog ispitivanja je bio utvrditi povezanost polimorfizma CYP2C9 s dozom i komplikacijama terapije oralnim antikoagulansom varfarinom. U ispitivanje je bilo uključeno 102 žene i 79 muškaraca u skupini bolesnika na terapiji varfarinom, te 26 žena i 160 muškaraca u kontrolnoj skupini. Genotipizacija CYP2C9 je rađena metodom PCR-RFLP iz uzoraka krvi. Bolesnicima je određivano protrombinsko vrijeme (PV) 72 sata po uvođenju lijeka, a učestalost praćenja je ovisila o stabilnosti PV-a. Terapijski optimum je iznosio 2,0-3,0 INR-a. Bolesnici su podijeljeni u podskupine prema slijedećim karakteristikama: dobi ( 65 godina, >65 godina), spolu, optimalnoj dnevnoj dozi varfarina ( 1,5 mg, >1,5 mg), INR-u u indukciji ( 3,5, 3,6-5,0, >5,0), pojavi i jačini krvarena (bez krvarenja, beznačajna i značajna krvarenja), dijagnozama, genotipu i alelima CYP2C9. Učestalost alela CYP2C9 *1 naše populacije u skupini zdravih ispitanika iznosi 84.1%, alela *2 11.5% i alela*3 4.0%. Naši rezultati za alele CYP2C9 u zdravoj populaciji u skladu su s 1

podacima iz literature za bijelu populaciju. Genotipovi CYP2C9 se statistički značajno ne razlikuju između skupine bolesnika na dozi varfarina >1.5 mg i skupine bolesnika na dozi varfarina 1.5 mg, iako je razlika na granici značajnosti (χ²=11.006, p=0.051). Optimalna dnevna doza varfarina u 2C9*2 heterozigota iznosi 92% optimalne dnevne doze u odnosu na divlji tip, 74% u 2C9*3 heterozigota, 61% u 2C9*2 homozigota, 34% u 2C9*3 homozigota i 63% u 2C9*2 i *3 heterozigota. Naši podaci podudaraju se s podacima iz literature. Statistički značajno niža optimalna dnevna doza varfarina je u bolesnika s genotipom *1/*3 u odnosu na divlji tip (p=0.022). Optimalna doza varfarina je niža u žena u odnosu na muškarce i u osoba starijih od 65 godina u odnosu na mlađe od 65 godina. Pojava krvarenja ne ovisi o prisutnosti alela CYP2C9*2 i *3, genotipu CYP2C9, dobi bolesnika niti dijagnozama. Pojava krvarenja je češća u osoba s INR-om >5.0. Čini se prihvatljivo da genotipizacija može biti indicirana u svakom slučaju kad je lijek izbora supstrat za polimorfni enzim. ( 91 stranica, 6 slika, 18 tablica, 102 literaturna navoda, jezik izvornika hrvatski) Ključne riječi: CYP2C9, polimorfizam, varfarin, doza, krvarenja Voditelj rada: prof.dr.sc.elizabeta Topić 2

Universitiy of Zagreb Medical School Postgraduate Studies PhD Thesis ASSOCIATION BETWEEN CYP2C9 POLYMORPHISM AND WARFARIN ANTICOAGULANT THERAPY DOSE AND COMPLICATIONS Marina Samardžija Institute of Transfusion Medicine, University Hospital Osijek ABSTRACT In vitro studies show association between alleles CYP2C9 *2, *3 and significantly reduced metabolism of various CYP2C9 substrates in comparison with the wild type. Warfarin is drug of choice among oral anticoagulant agents, and it is substrate for CYP2C9. The aim of the study was to determine kind and significance of the association between CYP2C9 polymorphism and warfarin anticoagulant therapy dose and complications. Study included the experimental group of patients receiving chronic oral anticoagulation therapy, 102 women, 79 men, and the control group of healthy persons, 26 women, 160 men. They underwent genotyping of CYP2C9 by PCR-RFLP using blood samples. The patients were determined prothrombin time (PT) 72 hours following induction of warfarin therapy, and repeatedly depending on the stability of PT. The required therapeutic level was considered INR 2.0-3.0. The patients were divided into the subgroups according to the following criteria: age (younger and equal to 65 years, older than 65 years), gender, maintenance daily warfarin dose (less or equal to 1.5 mg, more than 1.5 mg), INR by induction (less or equal to 3.5, between 3.6 and 5.0, more than 5.0), occurrence and severity of bleeding complications (without bleeding, minor 3

bleeding, significant bleeding), underlying illness, CYP2C9 genotype and allelic variants. Frequencies of alleles in the healthy group of examinees were 84.1% for allele *1, 11.5% for allele *2, and 4.0% for allele *3. CYP2C9 allele distribution in healthy population is concordant to other authors for caucasian. The groups of patients with the higher and the lower warfarin dose were not significantly different regarding the CYP2C9 genotypes (Pearson Chi-square=11.006, p=0.051), despite marginal significance of differences. In comparison with the optimal daily warfarin dose for those bearing the wild type genotype (100%), optimal daily warfarin dose in 2C9*2 heterozygotes was 92%, 74% in 2C9*3 heterozygotes, 61% in 2C9*2 homozygotes, 34% in 2C9*3 homozygotes and 63% in 2C9*2 and 2C9*3 heterozygotes. Our findings are concordant to other authors. The optimal daily doses were significantly different between the wild type and genotype *1/*3 (p=0.022). However, the age and gender related subgroups were significantly different in the optimal daily warfarin dose. The older subgroup and female received lower warfarin doses. The bleeding complications were not depend to CYP2C9*2, *3 alleles and genotypes, age and the underlying illness for chronic anticoagulation therapy. Bleeding was more often in those with INR greater than 5.0. Genotyping seems to be justified in the case of administration of a drug that is substrate for polymorphic enzyme. (91 pages, 6 figures, 18 tables, 102 cited references, original language Croatian) Key words: CYP2C9, polymorphism, warfarin, dose, bleeding Study leader: Elizabeta Topić, Ph.D., Prof. 4

1. UVOD Sve do nedavno farmakološke znanosti temeljile su se na spoznajama o farmakokinetici i farmakodinamici. Farmakogenetika je novija grana farmakoloških znanosti koja proučava vezu između genetske predispozicije neke osobe i njezine sposobnosti da metabolizira farmakološki aktivne tvari. Farmakogenetika zajedno sa farmakokinetikom i farmakodinamikom danas zatvara tzv. "farmakološki trokut", a u svojim istraživanjima povezuje saznanja iz farmakologije, genetike i biokemije. Povijest farmakogenetike bilježi se od 1950. godine kada su istraživači pretpostavili da bi nuspojave lijekova mogle biti posljedica genetski uzrokovanih varijacija u enzimskoj aktivnosti. Nuspojave antiaritmika sparteina (nauzeja, diplopija) i antihipertenziva debrisokina (ortostatska hipotenzija) dovele su do otkrića genetskog polimorfizma citokroma P450 2D6 (CYP2D6). Genetski polimorfizam je otkriven uslijed zapažanja incidenata koji su se javljali u bolesnika nakon primjene standardnih doza lijekova. Dok farmakokinetika pruža spoznaje o kretanju lijekova unutar biološkog sustava i ovisi o preuzimanju (uptake), vezanju, biotransformaciji, distribuciji i klirensu lijeka, a farmakodinamika daje saznanje o fiziološkom odgovoru ovisnom o receptoru na određeni lijek, farmakogenetika zapravo predstavlja molekularnu osnovu za metabolizam lijeka o kojoj ovise kinetika i dinamka određenog lijeka (1-3). Osnovni zadatak farmakogenetike je identificirati utjecaj gena na individualne varijacije u odgovoru na egzogene supstancije. Ove razlike u metabolizmu pri primjeni standardne doze lijeka mogu dovesti do izražene toksičnosti ili terapijskog neuspjeha zbog promijenjenog odnosa doze i koncentracije farmakološki aktivne tvari (4). Potencijalni rizični čimbenici za nedjelotvornost lijeka ili njegovu toksičnost jesu: 1. Nasljedni čimbenici, 2. Interakcije lijekova, 3. Dob bolesnika, 4. Funkcija jetre i bubrega, 5. Životne navike kao pušenje i uzimanje alkohola. 5

Od ovih čimbenika najznačajnije je nasljeđe odnosno genetske varijacije u genima za enzime koji metaboliziraju lijekove, receptore za lijekove, transportere lijekova. Ponekad je teško razlučiti utjecaj čimbenika okoline i genetskih čimbenika. Glavna razlika u varijacijama je što je nasljeđena mutacija ili značajka prisutna tijekom cijeloga života i određuje se samo jednom, dok se utjecaji okoline stalno mijenjaju. Za gen kažemo da je polimorfan ako varijacija gena postoji u normalnoj populaciji u frekvenciji većoj od 1%. Geni su funkcionalno polimorfni kada su alelne varijante postojane u populaciji, jedna ili više, i mijenjaju aktivnost kodiranog proteina u odnosu na divlji (normalni) tip. Genetski polimorfizam objašnjava zašto je jedan dio populacije pod većim rizikom od nedjelotvornosti odnosno toksičnosti lijeka (3,5-7). Farmakogenetika pomaže razumijevanju: 1. Zašto neke osobe odgovaraju na lijekove, a druge ne, 2. Zašto neke osobe trebaju više ili niže doze lijeka za postizanje optimalnog terapijskog odgovora, 3. Što određuje individualni rizik nastajanja nuspojava, 4. Koliko se od farmakološke varijabilnosti može predvidjeti 5. Koliko se nuspojava može prevenirati, odnosno može upozoriti liječnika na bolesnika koji će imati toksične nuspojave liječenja. Većina ksenobiotika, uključujući i farmakološke agense, metabolizira se u organizmu. Metabolizam rezultira detoksikacijom i uklanjanjem lijeka iz organizma ili aktiviranjem pro-lijeka u biloški aktivno terapijsko sredstvo ili toksin. U slučaju kada je farmakološka aktivnost lijeka ili toksina vezana uz katalitičku aktivnost određenog enzima, čimbenici koji utječu na aktivnost enzima odredit će klinički odgovor na agens. Enzimi odgovorni za aktivaciju i metabolizam lijekova i drugih spojeva u ljudi pokazuju široke interindividualne varijacije u ekspresiji proteina ili katalitičkoj aktivnosti što rezultira različitim fenotipovima (1,2,8). Te varijacije mogu nastati zbog prolaznih uzroka kao što su inhibicija ili indukcija enzima ili trajnih uzroka kao što su mutacije ili delecije gena. U farmakogenetskim istraživanjima provodi se genotipizacija polimorfnih alela koji kodiraju enzime za metabolizam lijekova. Na taj se način može odrediti metabolički fenotip za svakog pojedinca. Genetski polimorfizam određuje nekoliko kategorije fenotipova obzirom na intenzitet metabolizma lijekova. (Slika 1.) 6

Slika 1. Posljedice fenotipova PM, EM i UEM na bioraspoloživost lijeka/metabolita u cirkulaciji. Crveni oblici predstavljaju neaktivan prolijek odnosno njegov neaktivni metabolit, dok zelena boja predstavlja lijek ili metabolit u aktivnom obliku; veličina oblika označava relativnu veličinu doze lijeka, odnosno količinu nastalih metabolita. 7

Fenotip ekstenzivnog metabolizma (od engl. extensive metabolism, EM) lijeka je očekivana osobina normalne populacije, proizlazi iz genotipa s oba potpuno funkcionalna alela. Fenotip srednjeg metabolizma (od engl. intermediate metabolism, IEM) označuje slučaj kada metabolizam u osobe može biti normalan ili smanjen. Nalazimo ga kod heterozigota za inaktivirajuću mutaciju samo je jedan alel funkcionalan, te kod osoba s oba alela smanjene aktivnosti, a prenosi se autosomno recesivno. Fenotip slabog metabolizma (od engl. poor metabolism, PM) dovodi do nagomilavanja specifičnih lijekova-supstrata u organizmu i tipično je autosomno recesivno svojstvo nastalo mutacijom i/ili delecijom oba alela odgovorna za fenotipsku ekspresiju. Fenotip izrazito pojačanog metabolizma (od engl. ultraextensive metabolism, UEM) rezultira povećanim metabolizmom lijeka i to je autosomno dominantno svojstvo koje proizlazi iz amplifikacije gena (1,2,8). Za neke skupine terapijskih sredstava, toksikanata i kancerogenih spojeva iz okoliša dokazano je da genetski polimorfizam enzima koji ih metaboliziraju ima značajnu ulogu u izazivanju štetnih nuspojava ili incidenciji karcinoma. Stoga određivanje pojedinog genotipa koji ukazuje na metabolički fenotip može biti od kliničke važnosti u predviđanju nuspojava ili nezadovoljavajućeg odgovora na određene lijekove, te u predviđanju povećanog rizika za pojavu toksičnih učinaka i malignih oboljenja zbog utjecaja različitih toksikanata i karcinogenih spojeva iz okoliša ili na radnom mjestu. 1.1 ENZIMI ODGOVORNI ZA METABOLIZAM LIJEKOVA Enzimi uključeni u metabolizam lijekova klasificirani su kao enzimi faze I (oksidacijski) ili faze II (konjugacijski). Ova su dva tipa reakcija često međusobno komplementarna po svojoj funkciji. Enzimi faze I i II smješteni su najvećim dijelom u jetri. Kroz katalitičko djelovanje u reakcijama oksigenacije, oksidacije, redukcije i hidrolize enzimi faze I stvaraju funkcionalne grupe koje služe kao konjugacijska mjesta za glukuronsku kiselinu, sulfate ili glutation, katalizirane enzimima II. faze. Između 1950. i 1970. godine enzimi koji metaboliziraju lijekove (od engl. drug-metabolizing enzymes, DMEs) obično su bili opisivani kao jetreni 8

detoksifikacijski sistem. Ova dogma je još uvijek široko raprostranjena iako detoksifikacija predstavlja vjerojatno manje od 1% svih njihovih funkcija. Naime, enzimi koji metaboliziraju lijekove imaju endogene spojeve kao svoje prirodne supstrate, uključeni su u sintezu i razgradnju svakog do sada poznatog nepeptida koji sudjeluju u ligand moduliranima transkripcijskim procesima (rast,diferencijacija, apoptoza, homeostaza i neuroendokrine funkcije). Nekoliko ovih enzima je postojalo u evoluciji prije divergencije eubakterija iz eukariota, sugerirajući da su ovi enzimi bili odgovorni za važne životne funkcije - balans elektrolita i kalcijevih iona, dijeljenje stanice itd., a neki od njih se nalaze u svakoj eukariotskoj stanici. Stoga neki autori predlažu da bi za ove enzime prikladniji naziv bio efektorni metabolizirajući enzimi (od engl. effector-metabolizing enzymes) (9). Tablica 1. Glavni jetreni enzimi koji sudjeluju u metabolizmu lijekova i drugih ksenobiotika (1). Faza I CYP1A2 CYP2A6 CYP2B CYP2C19 CYP2C9 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A NADPH kinon - oksidoreduktaze Faza II Glutation S transferaza N acetiltransferaza UDP glukouroniltransferaza Sulfotransferaza Enzimi faze I-Devedeset posto njihove funkcije obavlja sustav citokroma P450 (CYP), dok preostalih deset posto čine svi ostali enzimi (dehidrogenaze, peroksidaze, flavin-adenin-dinukleotid monooksigenaze, i dr.). Enzimi faze II- dodatno modificiraju strukturu lijeka i time pojačavaju njegovu topivost. 9

ENZIMI FAZE I METABOLIZMA LIJEKOVA - ENZIMSKA PORODICA CITOKROMA P 450 (SUSTAV CYP) Najvažniji oksidativni enzimski sustav uključen u metabolizam lijekova je enzimska superporodica citokroma P450 (CYP ). Naziv citokrom P450 proizašao je iz spektralnih karakteristika enzima, a podrazumijeva skupinu hem proteina koji u reduciranom obliku (Fe +2 oksidacijski stupanj) imaju visok afinitet prema ugljičnom monoksidu (CO). Nastali kompleks reducirani citokrom P450-CO ima u diferencijalnom spektru apsorpcijski maksimum kod 450 nm, minimum kod 405 nm (Soretova vrpca). Do danas je u čovjeka otkriveno više od tridesetak izoenzima koji pokazuju različitu katalitičku aktivnost i jedinstveno djelovanje. Također je poznato najmanje 481 CYP gena i 22 pseudogena u svih vrsta živih bića. Iako mnogi od ovih izoenzima pokazuju genetski polimorfizam, za samo neke od njih poznata je molekulska osnova promjene polimorfizma. Zbog lakšeg snalaženja u ovoj vrlo raznolikoj skupini hem-tiolatnih proteina i uvođenja novih članova, razrađena je nomenklatura koja se temelji na slijedu sekvenci (Nelson, 1993). Primjerice, CYP2D6 je izoforma 6 podporodice D uključene u porodicu 2CYP. Gen koji kodira ovaj enzim označen je kao CYP2D6. Pripadnost porodici i podporodici temelji se na podudarnosti aminokiselinskih sekvenci. Do sada poznatih 35 humanih CYP gena klasificirani su u porodice 1,2,3,4,5,7,8,11,17,19,21,24,27 i 51 (1,2,10). Enzimi P450 su po enzimskom djelovanju tipične monooksigenaze, mogu djelovati kao oksidaze i peroksidaze, a kataliziraju i reduktivne reakcije.već se iz ovih značajki može pretpostaviti da mehanizam katalitičkog djelovanja ovih enzima mora zadovoljiti potrebe različitih kemijskih reakcija. Značenje ovih enzima u ukupnosti biološkog sistema osobito je naglašeno ako znamo da od oko 250 000 sintetiziranih kemijskih tvari koje se pojavljuju u okolišu gotovo svaka može biti supstrat, induktor i/ili inhibitor jednog ili više enzima iz ove skupine. Danas se smatra da se više od 70% svih kemijskih tvari različitih strukturnih značajki pretežito lipofilnih svojstava (uključujući lijekove) metabolizira oksidativnim procesima u stanicama. Kao produkti ovih enzimskih reakcija, koje su katalizirane pretežito (gotovo 90% od svih oksidativnih reakcija) enzimima citokrom P450, nastaju većim dijelom netoksični alkoholi i fenoli reakcijama hidroksilacije ili monooksigenacije. Uz oksidativne procese citokrom P450 može katalizirati i reduktivne procese, pri čemu moraju biti zadovoljeni određeni uvjeti 10

kao što su anaerobni odnosno hipoksični uvjeti, odgovarajući redoks potencijal lijeka- supstrata, prisutnost odgovarajućeg donora elektrona (NADPH, NADH) i dr. (Slika 2.) Slika 2. Ciklus reakcija na citokromu P450: (1) vezanje lijeka/supstrata (RH), (2) reduktaza I daje 1. elektron iz NADPH (Fe³ + Fe² + ) (3) redukcija u anaerobnim uvjetima ciklus ovdje prestaje, (4) vezanje O2 na hem, (5) oksidacija hema (Fe² + Fe³ + ); kisikov slobodni radikal, (6) reduktaza II daje još jedan elektron sa NADH; kisikov peroksid radikal, (7) peroksid radikal se protonira I odlazi kao H2O; na hemu ostaje aktivni atomski kisik, (8) premještanjem kisikovih elektrona stabiliziranih na atomu željeza kisik se prenosi na supstrat (terminalna oksidacija), (9) vraćanje Fe³ + u početno stanje novi ciklus. Fiziološko značenje enzima citokroma P450 je u njihovom katalitičkom djelovanju kod reakcija biosinteze i metaboličke razgradnje niza fiziološki važnih endogenih tvari (kolesterol, žučne kiseline, steroidni hormoni, kortikosteroidi, prostaglandini, masne kiseline, leukotrieni), te metaboličke razgradnje (biotransformacije) strukturno različitih lijekova i drugih tvari stranih organizmu (ksenobiotika) kao što su lijekovi, masti, pesticidi/herbicidi, različite industrijske kemikalije i druge tvari iz okoliša. Strukturne promjene u molekuli lijeka zbivaju se na funkcionalnim skupinama koje sadržavaju atome ugljika, dušika, kisika, sumpora i 11

fosfora. Reakcije monooksigenacije zbivaju se uvođenjem tzv. aktivnog kisika, odnosno aktiviranog oblika kisika koji potječe iz molekularnog kisika iz zraka. Citokrome P450 nalazimo u bakterijama, kvascima, biljkama, insektima, ribama i drugim višim organizmima. U stanicama sisavaca nalazi se pretežito u endoplazmatskom retikulumu i u mitohondrijima. Premda su enzimi citokrom P450 nađeni u većini organa i tkiva, najdetaljnije su istraženi enzimi u jetrenim stanicama. Upravo visok sadržaj citokroma P450 je jedna od značajki stanica jetre. Citokrom P450 čini integralni dio membranskih proteina i sastavni dio strukture membrane mitohondrija i endoplazmatskog retikuluma. Katalitička svojstva enzima ovise o kemijskim značajkama posebice fosfolipidnog dijela membrane. Također fluidnost i naboj membrane mogu značajno utjecati na katalitička svojstva enzima budući da o ovim čimbenicima ovisi pokretljivost proteinskih dijelova u membrani i interakcije s ionskim skupinama u molekulama proteina. Lipofilna svojstva membrane utjecat će na izbor supstrata, a membrana može poslužiti i kao svojevrsni spremnik za lijekove lipofilnih svojstava. Smatra se da superporodica gena koji kodiraju citokrome P450 postoji više od milijardu godina, neki dijelovi strukture enzima ostali su očuvani tijekom evolucije. To se posebice odnosi na mjesto na kojem je smještena hemska skupina i mjesto vezanja molekularnog kisika na enzimu ( tzv. džep za kisik ). Prema definiciji International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC): Citokromi P450 jesu skupina hem proteina čijom biosintezom upravlja superporodica gena. Ovi proteini čine skupinu enzima koji kataliziraju reakcije monooksigenacije velikog broja egzogenih i endogenih tvari. Prema tome pod pojmom citokroma P450 (CYP) podrazumijevamo proteine, članove superporodice hem proteina, koji kataliziraju oksidativne i reduktivne reakcije biotransformacije lipofilnih supstrata u polarnije metabolite (11). ENZIMI CITOKROMA P450 (CYP) Udio pojedinih izoenzima CYP-a u humanoj jetri je vrlo različit. (Slika 3) Najviše ih pripada skupini porodica 3A (40%) i 2C (25%), nakon kojih slijede porodice 1A (17%) i 2E (9%) izoenzima. Istraživanja 315 različitih lijekova pokazala su da se 12

56% lijekova primarno metabolizira enzimima CYP-a i to CYP-om 3A4 50%, 2D6 20%, 2C9 i 2C19 15%, dok se ostali metaboliziraju s 2E1, 2A6, 1A2 i još uvijek nepoznatim enzimima. Geni koji kodiraju CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19 i CYP2D6 su funkcionalno polimorfni, iz čega slijedi da se 40% metabolizma lijekova ovisnih o citokromu P450 odvija preko polimorfnih enzima (1,7). CYP ENZIMI CYP2E*1 Etanol, mišićni relaksansi, kofein, benzen, kloroform, cigaretni dim P453A; 40,0% P4501A2; 17,6% P4502E; 9,2% P4502D6; 2,1% CYP2D*6 Antidepresivi, antihipertenzivi, antiaritmici, opioidni analgetici, antidijabetici, beta blokatori, neuroleptici P4502C; 25,3% P4502A6; 5,6% P4502B6; 0,3% CYP2C*9 Nesteroidni anti-inflamatorni lijekovi, antiepileptici, o-antikoagulansi CYP2C*19 Antidepresivi, benzodiazepini, beta blokatori, lijekovi za liječenje peptičkog ulkusa Slika 3. Udio pojedinih CYP izoenzima u humanoj jetri i njihovi supstrati CYP2D6 Izoenzim CYP2D6, unatoč činjenici da je zastupljen u količini od oko 2.6% u jetri, ima vrlo važnu ulogu u metabolizmu lijekova jer se gotovo pedesetak najčešće propisivanih lijekova metabolizira upravo pomoću tog enzima. Smatra se čak da bi mogao biti uključen u metabolizam otprilike 25% lijekova (12, 13). To je daleko najbolje opisani enzim porodice citokroma P450 koji pokazuje polimorfnu ekspresiju u 13

ljudi (14). Prva otkrića o polimorfizmu zabilježena su za vrijeme kliničkog pokusa vezanog za antihipertenzivni lijek debrisokin. Polimorfizam CYP2D6 je od osobite kliničke važnosti, posebice zbog metabolizma tricikličkih antidepresiva, određenih neuroleptika, antiaritmika te beta blokatora (15-20). Gen CYP2D6 nalazi se u skupini gena CYP2D6-8 na 22. kromosomu, udružen s pseudogenima CYP2D7P i CYP2D8P. Sastoji s od devet eksona i osam introna, koji kodiraju protein-enzim CYP2D6. Opisano je čak 48 nukleotidnih varijacija koje stvaraju 53 različita alela. Dosada je opisano ukupno šest nultih alela tj. djelomično ili potpuno nefunkcionalnih alela koji nemaju aktivnog proteinskog produkta (*3, *4, *5, *7, *11,* 6), te dodatne dvije varijante koje kodiraju proteinske produkte sa smanjenom katalitičkom aktivnošću (CYP2D6*7 i *10). Najčešći nulti alel je CYP2D6*4 koji predstavlja 29% svih CYP2D6 alela. Osim interindividualnih, postoje i interetničke razlike u zastupljenosti pojedinih genotipova (21-25). U bijelaca je uz divlji tip gena otkriveno još petnaestak različitih alela CYP2D6 koji su povezani s nedostatnom, smanjenom, normalnom ili pojačanom enzimskom aktivnosti. Potpuni izostanak aktivnosti CYP2D6 zbog nasljeđa dva mutantna nul alela se nalazi u 5 10 % populacije. Nekoliko epidemioloških studija povezuje različite alele CYP2D6 s toksičnošću i povećanom incidencijom maligniteta jetre, ždrijela, želuca i posebice pluća povezanog s pušenjem-em fenotip (26). PM fenotip je povezan s povećanim rizikom nastanka Parkinsonove bolesti i smanjenom tolerancijom kronične boli (1,2,8,9,27). CYP2C19 Drugi dobro opisani polimorfizam CYP-a je polimorfizam izoenzima CYP2C19, koji je odgovoran za hidroksilaciju antikonvulzivnog lijeka mefenitoina, diazepama, omeprazola i citaloprama (28). Specifične mutacije gena koji kodira S- mefenitoin hidroksilazu dovode do PM fenotipa. Za razliku od polimorfizma debrisokina, za ovaj polimorfni enzim nije dokazan UEM fenotip. PM fenotip CYP2C19 enzima se nalazi u 2-5 % bijele populacije, dok je uočena incidencija u istočnjačkoj popualaciji 18-23 %. Glavni genetski poremećaj u PM fenotipu je GA mutacija u eksonu 5 što ima za posljedicu stvaranje inaktivnog proteina. Ovaj CYP2C19 nul alel označava se oznakom m1 i zastupljen je u 75% PM genotipa 14

bijelaca. U japanskoj i kineskoj populaciji otkrivena je mutacija G636A, označena kao CYP2C19m2. U ovim populacijama prevalecija PM genotipa iznosi i do 10%. Dosada nije definiran stav o kliničkoj važnosti CYP2C19 polimorfizma, iako prema nekim istraživanjima genotipizacija CYP2C19 bi predviđala učinke liječenja infekcije s H. pylori i peptičkog ulkusa u bolesnika koji su na terapiji omeprazolom i amokscilinom (1,2,29, 30, 31). CYP2C9 CYP2C9 je jedan od četiri člana CYP2C podporodice u ljudi (ostali su CYP2C8, CYP2C18, CYP2C19, CYP2C10 danas se smatra varijantom CYP2C9), iako genske analize sugeriraju vjerojatno postojanje još tri CYP2C enzima. Citokromi P450 2C8, 2C9, 2C18 i 2C19 imaju identičan aminokiselinski slijed u više od 82%, ali izoforme pokazuju malo preklapanje u supstratnoj specifičnosti. Gen koji kodira protein CYP2C9 u ljudi smješten je na kromosomu 10q24.2 i veći je od 55 kb. Otkriće šest različitih sekvenci cdna CYP2C9 potaknulo je mnoga istraživanja njegove metaboličke aktivnosti i distribucije u populaciji. Najučestaliji alel Arg144/Ile359 (CYP2C9*1) smatra se divljim tipom. Zamjena citozina u timin (C>T ) na nukleotidu 430 stvara Cys144/Ile359 (CYP2C9*2) alelnu varijantu, zamjena adenina u citozin (A>C) na nukleotidu 1075 stvara Arg144/Leu359 (CYP2C9*3) alelnu varijantu. T>C na 1076 kodira Arg144/Thr359 (CYP2C9*4) alelnu varijantu, C>G na 1080 kodira Arg144/Asp360 (CYP2C9*5) i zadnji otkriveni nul polimorfizam (CYP2C9*6) ima adeninsku deleciju na nukleotidu 818. (Slika 4.) Budući su CYP2C9*1, 2 i 3 aleli otkriveni prvi, njihova in vitro i in vivo aktivnost je i najbolje proučena. Ovi aleli stvaraju šest različitih genotipova: *1/*1 (divlji tip), *1/*2, *1/*3, *2/*2, *2/*3 i *3 /*3. In vitro i in vivo istraživanja pokazuju da su CYP2C9 *2 i *3 aleli povezani sa značajno smanjenim metabolizmom različitih supstrata CYP2C9 u odnosu na divlji tip (2,10,32,33). Ubrzo nakon otkrića alela CYP2C9*2 i CYP2C9*3 rađene su studije genotipizacije populacija obzirom na etničku pripadnost. Među ispitivanim bijelcima i turskoj populaciji dvije trećine osoba su imale divlji tip, jedna trećina genotip *1/*2 ili *1/*3, a manje od 2.5 % ispitanika genotip *2/ *2, * 2 /*3 i *3/*3. U ispitivanoj afričko- 15

američkoj, japanskoj, kineskoj i koreanskoj populaciji 95% osoba imalo je genotip divljeg tip. U talijanskoj populaciji učestalost alela CYP2C9*1 iznosi 80%, alela*2 11% i alela *3 3.9%, dok je učestalost alela *2 i *3 u španjolskoj populaciji nešto viša (14.3% za alel *2 i 16.2% za alel *3) (32). Citokrom P450 CYP2C9 metabolizira klinički važne lijekove i pripada među najvažnije enzime koji metaboliziraju lijekove u ljudi. Supstrati za CYP2C9 su fluoksetin, losartan, fenitoin, tolbutamid, torsemid, S- varfarin i nesteroidni anti-inflamatorni lijekovi. Aktivnost CYP2C9 in vivo može se inducirati rifampicinom, a varijabilno karbamazepinom, etanolom, fenobarbitonom. Klinički značajna inhibicija CYP2C9 može nastati kod istovremenog davanja amiodarona, flukonazola, fenilbutazona, sulfinpirazona, sulfafenazola, a vjerojatno i drugih sulfonamida. Intenzivno se proučava povezanost između in vitro enzimske aktivnosti CYP2C9 cdna varijanti i in vivo raspodjele varfarina. Gotovo svi lijekovisupstrati za CYP2C9 su slabe kiseline s pka vrijednostima 3.8-8.1, a elektrostatske interakcije potječu od elektronegativnih grupa na supstratu i elektropozitivnih grupa na enzimu (1,10, 34, 35). Citokrom P450 CYP2C9 metabolizira klinički važne lijekove i pripada među najvažnije enzime koji metaboliziraju lijekove u ljudi. Supstrati za CYP2C9 su fluoksetin, losartan, fenitoin, tolbutamid, torsemid, S-varfarin i nesteroidni antiinflamatorni lijekovi. Aktivnost CYP2C9 in vivo može se inducirati rifampicinom, a varijabilno karbamazepinom, etanolom, fenobarbitonom. Klinički značajna inhibicija CYP2C9 može nastati kod istovremenog davanja amiodarona, flukonazola, fenilbutazona, sulfinpirazona, sulfafenazola, a vjerojatno i drugih sulfonamida. Intenzivno se proučava povezanost između in vitro enzimske aktivnosti CYP2C9 cdna varijanti i in vivo raspodjele varfarina. Gotovo svi lijekovi-supstrati za CYP2C9 su slabe kiseline s pka vrijednostima 3.8-8.1, a elektrostatske interakcije potječu od elektronegativnih grupa na supstratu i elektropozitivnih grupa na enzimu (1,10, 34, 35). 16

Kromosom 10q24,2 Nukleotid # 430 E C G T ATT GAC *1 alel Ekson 3 Ekson 7 Arg Ile Asp aminokiselina # 144 359 360 430 1075 1076 1080 E TGT ATT GAC *2 alel Ekson 3 Ekson 7 Cis Ile Asp 144 359 360 430 1075 1076 1080 E C G T CTT GAC *3 alel Ekson 3 Ekson 7 Arg Leu Asp 144 359 360 430 1075 1076 1080 E C G T ACT GAC *4 alel Ekson 3 Ekson 7 Asp Thr Asp 144 359 360 430 1075 1076 1080 E C G T ATT GAG *5 alel Ekson 3 Ekson 7 Arg Ile Glu 359 360 Slika 4. Polimorfizam CYP2C9 17

CYP2E1 Izoenzim CYP2E1 odgovoran je za metabolizam i bioaktiviranje mnogih prokarcinogena, određenih lijekova (paracetamol) i predstavlja glavni alternativni sustav kojim se metabolizira etanol. Kodiran je jednim genom smještenim na 10 kromosomu, a do sada su poznata dva alela u ljudi C i c2. Iako postoje dokazi o genetskom polimorfizmu CYP2E1 u ljudi, točna molekularna osnova i njegova klinička značajnost nisu još utvrđene. CYP3A Podporodica CYP3A sadrži izoenzime 3A3, 3A4 i 3A5 u odraslih, te izoenzim 3A7 u fetalnoj jetri. Prevladavajući izoenzim 3A u jetri odraslih ljudi je izoenzim 3A4, koji čini 20-40 % ukupnog jetrenog citokroma P450. Iako je uočena velika interindividualna varijabilnost ovog enzima i genetska osnova još nije razjašnjena, zna se da sudjeluje u metabolizmu mnogih antitumorskih lijekova (1,2). ENZIMI FAZE II METABOLIZMA LIJEKOVA N-acetil transferaza 2 (NAT2) Acetilacijski polimorfizam najstariji je poznati enzimski polimorfizam, otkriven je prije više od 40 godina kada je u liječenju tuberkuloze ispitivan lijek izoniazid. Fenotipski se razlikuju brzi (u genotipu imaju bar jedan normalan alel divljeg tipa) i spori acetilatori (homozigoti za recesivan, mutirani gen), ovisno o tome metabolizira li osoba lijekove ovisne o NAT2 brzo ili sporo. U ovu kategoriju lijekova ubrajaju se arilaminski i hidrazinski lijekovi (izoniazid, sulfadiazin, aminoglutetimid, kofein, sulfametazin, klonazepam, sulfapiridin, dapson, sulfadoksin, sulfametoksazol, hidralazin, prokainamid i drugi ), ali i neki karcinogeni spojevi. Između 40-70% Europljana i Amerikanaca, te 10-30% populacije istočne Azije (Japan, Kina, Koreja, Tajvan) pripada skupini sporih acetilatora. Spori acetilatori slabo metaboliziraju lijekove koji se pregrađuju ovim metabličkim putem, te imaju povećanu 18

sklonost karcinogenezi odnosno sklonost nastajanju karcinoma mokraćnog mjehura, debelog crijeva i dr. (5). Glutation S transferaza Enzim ima pet genetski različitih klasa. Ovo su također konjugacijski enzimi koji svoje supstrate konjugiraju s glutationom. Metaboliziraju epokside ugljikovodika i neke karcinogene amine (npr. aflatoksin B1 epoksid). Ukoliko je ovaj enzim oštećen (npr. zbog inaktivirajuće mutacije) povećana je mogućnost nastanka raznih tumora (5). Osim navedenih postoje i drugi važni enzimi faze II metabolizma lijekova. (Tablica 1) 1.2. FENOTIPIZACIJA/GENOTIPIZACIJA Specifičan metabolički profil osobe može se utvrditi fenotipizacijskim ili genotipizacijskim pristupom. Fenotipizacija se provodi davanjem ispitivanoga lijeka (za metabolizam kojega se zna da ovisi isključivo o funkciji specifičnog enzima), nakon čega se mjeri metabolički omjer (od engl. metabolic ratio MR) koji se definira kao omjer doze lijeka ili nepromijenjenog lijeka i metabolita izmjerenog u serumu ili urinu. Određivanjem fenotipa u odnosu na referentni supstrat omogućava se predviđanje fenotipa za druge supstrate. Genotipizacija uključuje određivanje specifičnih genetskih mutacija kojih je rezultat specifični fenotip. Ove mutacije uključuju genske promjene koje dovode do prekomjerne ekspresije (dupliciranje gena), odsutnosti aktivnog proteinskog produkta (nul-aleli) ili stvaranja funkcionalno promijenjenog proteina sa smanjenom katalitičkom sposobnošću (inaktivirajući aleli). U određivanju genotipa za metabolizam lijekova primjenjuju se sve metode razvijene u laboratorijima za molekularnu dijagnostiku. Osnovna metoda je umnažanja ulomka DNA od interesa za koju je Mullis 1993. godine dobio Nobelovu nagradu. Lančana reakcija sinteze DNA pomoću DNA polimeraze je relativno nova metoda sinteze nukleinskih kiselina in vitro kojom se specifični odsječak DNA može umnožiti u velikom broju kopija. Iz uzorka krvi izvađenog uz antikoagulans EDTA izolira se DNA, 19

a specifična regija ispitivanoga gena amplificira se pomoću oligonukleotidnih DNA odsječaka (klica, početnica) komplementarnih s graničnim dijelovima poznate DNA koje se umnaža (ciljna DNA). Na produkt PCR amplifikacije nastavljaju se daljne reakcije kojima se identificira poznata odnosno nepoznata mutacija ili delecija (RFLP, SSCP, multiplex PCR, alel specifična PCR, itd.). U farmakokinetskim ispitivanjima fenotipizacija ima prednost pred genotipizacijom utoliko što otkriva interakcije lijek-lijek ili poremećaje u sveukupnom procesu metabolizma lijekova. Međutim, kompleksni protokoli testiranja, opasnost od nepoželjnih reakcija na lijekove, problemi netočne dodjele određenog fenotipa uslijed istodobnog davanja više lijekova ili učinci same bolesti koji mogu dovesti do zabune predstavljaju ozbiljne nedostatke fenotipizacijskom pristupu. Metode genotipizacije zahtijevaju male količine krvi ili tkiva, na njih ne utječe osnovna bolest ni lijekovi što ih bolesnik uzima, a rezultate daju unutar 48-72 sata, što omogućava brzu intervenciju (1,2,8). 1.3. ORALNI ANTIKOAGULANSI Povijest U Sjevernoj Dakoti je 1920. godine stoka, koja je jela slabo prosušeno sijeno dobiveno od djeteline, krvarila (37). Tijekom 1930. godine bishidroksikumarin (dikumoral) je izoliran kao uzrok krvarenja. Daljnja istraživanja 1940 tih godina potvrdila su djelotvornost dikumorala u izazivanju hipokoagulabilnog stanja, te je sintetizirano više dikumoralu sličnih supstancija. Supstancija broj 42 nazvana je varfarin, dokazana je njena visoka djelotvornost kao otrova za štakore koji izaziva smrtonosno krvarenje. Tek otkrićem da je vitamin K djelotvoran u liječenju krvarenja kao komplikacije terapije varfarina, varfarin se počinje široko primjenjivati i danas je lijek izbora među oralnim antikoagulansima (37). Mehanizam djelovanja i farmakodinamika Oralni antikoagulansi su antagonisti vitamina K. Vitamin K je bitan koenzim u posttranslacijskoj karboksilaciji glutaminskih ostataka u gamakarboksiglutaminske 20

ostatke (Gla) na N terminalnim krajevima proteina ovisnih o vitaminu K (faktori zgrušavanja II, VII, IX, X, protein C i S). Karboksilacija faktora zgrušavanja ovisnih o vitaminu K je katalizirana jetrenim enzimom karboksilazom, a pod utjecajem reduciranog oblika vitamina K (vitamin KH2), kisika i ugljičnog dioksida. Tijekom reakcije vitamin KH2 se oksidira u vitamin K epoksid koji se reciklira u vitamin K pomoću K epoksid reduktaze, zatim se ponovo reducira u vitamin KH2 pomoću vitamin K reduktaze. Faktori zgrušavanja u procesu gamakarboksilacije doživljavaju konformacijske promjene u prisutnosti Ca iona što je bitan preduvjet stvaranja kompleksa čimbenika zgrušavanja ovisnih o vitaminu K i njihovih kofaktora na fosfolipidnoj površini kao i za njihovu biološku aktivnost. Antagonisti vitamina K djeluju antikoagulantno inhibirajući vitamin K epoksid reduktaze i vjerojatno vitamin K reduktaze. Rezistencija na varfarin vjerojatno nastaje zbog promijenjenih reduktaznih enzima koji smanjuju afinitet za varfarin. Blokiranjem reakcije karboksilacije proteinima plazme nedostaju glutaminski ostaci. Izostaje interakcija s fosfolipidima koja je nužna je u tijeku fiziološke aktivacije koagulacije. Ove reakcije se kontinuirano odvijaju u jetri, jedna molekula vitamina K reciklira se nekoliko stotina puta prije kataboliziranja u inaktivni produkt. Oralni antikoagulansi inhibirajući cikličku konverziju vitamina K dovode do jetrene produkcije i sekrecije parcijalno karboksiliranih i dekarboksiliranih proteina. Smanjenje broja Gla ostataka na protrombinskoj molekuli od normalnih 10 na 9 Gla ostataka rezultira smanjenjem koagulantne aktivnosti za 30%, dok smanjenje na manje od 6 ostataka rezultira gubitkom više od 95% koagulantne aktivnosti. Dva glavna izvora vitamina K u prirodi su filokinon (vitamin K1) i menakinon (vitamin K2). Vitamin K1 isključivo je biljnog podrijetla, a menakinon je grupni naziv za nekoliko srodnih produkata bakterijskog podrijetla (37-39). Farmakokinetika Najpoznatiji oralni antikoagulansi su derivati hidroksikumarina i indandiona. Derivatima hidroksikumarina pripadaju varfarin (Marivarin, Coumadin), etilbiskumacetat (Pelentan), acenokumarol (Syncumar, Sintrom, Nicoumalone, Sinthrome), fenprokumon (Marcoumar). Lijek izbora je varfarin. U kliničkoj uporabi 21

varfarin se nalazi u jednakim količinama u dva optička izomera. Lijevo rotirani (S) varfarin četiri puta je potentniji od desno rotiranog (R) varfarina. Dva izomera varfarina metaboliziraju se mikrosomalnim enzimima u jetri različitim putovima. (S)- varfarin se metabolizira mnogo brže, ali moguće su značajne interindividualne razlike zbog genskih varijacija u mikrosomalnim enzimima (polimorfizam CYP-a) i vanjskih čimbenika koji mogu utjecati na enzimsku aktivnost. (S)-varfarin jedini je pripravak koji se može primjenjivati parenteralno, no gotovo uvijek se daje peroralno. Poluvrijeme raspada (t ½) varfarina je 36-42 sata, cirkulira vezan za proteine plazme (uglavnom za albumin) i nakuplja se u mikrosomima jetre. Izlučuje se primarno bubrezima u obliku metabolita. Početak djelovanja oralnih antikoagulansa ovisi o t ½ čimbenika zgrušavanja: najkraće ima F VII:4-6 sati, F II tri dana, F IX 18-30 sati i F X dva dana. Zato je za nastup potpunog antikoagulantnog djelovanja potrebno 48-72 sata, prema nekim podacima 5 7 dana (37-40). Varfarin se brzo apsorbira iz gastrointenstinalnog trakta i doseže maksimalnu koncentraciju u krvi u zdravih dobrovoljaca za 90 min. Indikacije i doziranje Varfarin je indiciran u liječenju i prevenciji tromboembolijskih incidenata. Rabi se u liječenju venskih tromboza, plućne embolije i arterijskih tromboza. Profilaktički se daje kako bi spriječili nastajanje tromba u bolesnika s umjetnim srčanim zaliscima, bolesnicima koji imaju ugrađene stentove u krvnim žilama, bolesnicima s fibrilacijom atrija, prirođenim greškama srčanih valvula, bolesnicima koji u anamnezi imaju tromboembolijski incident i koji imaju povećani rizik od nastanka novog uslijed imobilizacije ili operacije, bolesnicima kod kojih je dijagnosticirano hiperkoagulabilno stanje (antifosfolipidni sindrom, nedostatak proteina C, nedostatak proteina S, nedostatak antitrombina, mutacija faktora V Leiden, mutacija faktora II). Kontraindikacije su brojne, ali su često više relativne nego apsolutne, stoga je potrebno u svakog bolesnika razmotriti potrebu i rizik od antikoagulantne terapije. Krvarenje je apsolutna kontraindikacija, zatim teška hipertenzija, ulkusna bolest s anamnezom krvarenja, perikarditis, endokarditis lente, epiduralna anestezija u trudnica koje su na heparinu, teška oštećenja jetre i bubrega, heparinom inducirana 22

trombocitemija i aktivna tuberkuloza. Također se ne smije uzimati tijekom trudnoće jer je teratogen. Dva su pristupa u doziranju oralnih antikoagulansa: 1. U slučaju hitne potrebe za antikoagulantnom terapijom primjenjuju se heparin (ili niskomolekularni heparin) i varfarin zajedno. Bolesnicima koji su u hiperkoagulabilnim stanjima varfarin se ne smije davati u liječenju ili profilaktički bez pokrića heparinom. Početno varfarin snižava razinu proteina C prije nego se nivo F X ili F II dovoljno snizi da bi imao antikoagulantni učinak. Učinak sniženja proteina C, koji ima poluživot 6 sati i štiti od tromboze, može biti trombotički incident. Varfarin se daje u dozi od 6-15 mg prva dva dana. Heparin se prekida kada je protrombinsko vrijeme kojim se prati učinak terapije varfarina u terapijskoj širini, za većinu indikacija 2,0-3,0 INR, osim mehaničkih srčanih valvula, ponovljenih miokardijalnih infarkta i antifosfolipidnog sindroma 2,5-3,5 INR (37). 2. Postupno uvođenje antikoagulantne terapije dozom varfarina od 3 mg dnevno dok se ne postigne učinak za 5-6 dana.varfarin se može dati bez heparina bolesnicima koji nemaju u anamnezi trombozu, ali treba izbjegavati visoke doze zbog snižavanja razine proteina C (većina bolesnika s fibrilacijom atrija). Postoji određena fleksibilnost u odabiru doze kojom se započinje liječenje. Neki kliničari radije daju više doze (po nekim preporukama 6-15 mg u jednokratnoj dozi dnevno), dok doze niže od 3 mg mogu biti prikladnije za starije osobe i za bolesnike koji imaju viši rizik od krvarenja (37, 38, 39, 41, 42). Doza održavanja varfarina za većinu bolesnika je 3 12 mg dnevno (41). Duljina uzimanja varfarina je za većinu bolesnika s nekompliciranim tromboembolijskim incidentom 3 6 mjeseci od prestanka čimbenika rizika. U bolesnika s umjetnim mehaničkim valvulama antikoagulantna terapija se provodi doživotno zbog opasnosti od okluzije valvule ili tromboembolijskih komplikacija (39, 42). Praćenje terapije Za praćenje oralne antikoagulantne terapije najčešće se koristi jednostupanjski test protrombinskog vremena (PV) koji se izvodi dodavanjem kalcija i tromboplastina u citratnu plazmu. Svi tromboplastini moraju biti označeni internacionalnim indeksom osjetljivosti (ISI) koji kvantificira njihov odgovor na djelovanje antikoagulansa obzirom na primarni referentni pripravak SZO čija je vrijednost 1.0. To se izražava kao 23

internacionalni normalizirani omjer (INR). PV se kontrolira svakog dana u prvih pet dana terapije, zatim dva puta tjedno tijekom dva tjedna (učestalost praćenja ovisi o stabilnosti PV), te jedanput mjesečno kod bolesnika sa stabilnim PV (37-39). Nuspojave liječenja Jedan od uvjeta za racionalnu primjenu lijekova je poznavanje njihovih nuspojava i potencijalnih interakcija. Gotovo svaki lijek može izazvati nuspojave. Nuspojavom (od engl. adverse reaction) smatramo svaku štetnu neželjenu reakciju na lijek koji je primijenjen u pravoj indikaciji u terapijskoj dozi. Neočekivana nuspojava (od engl. unexpected adverse reaction) je svaka do sada nepoznata nuspojava, a štetan događaj (od engl. adverse event) bilo koji medicinski događaj koji se javlja tijekom primjene lijeka, ali ne mora biti s njime u uzročnoj vezi. Signal je do sada nepoznata ili nedovoljno dokumentirana informacija o mogućoj uzročnoj povezanosti lijeka i nuspojave. Učestalost nuspojava iznosi 10-20 %, hospitalizacije zbog nuspojava 2.5-8.4%, a učestalost smrtnog ishoda od nuspojava 0.01-0.1% (41). Kao predisponirajući faktori za nastanak nuspojava navode se metabolički čimbenici, spol (češće kod žena), dob (veća učestalost u starijoj životnoj dobi), oštećenje funkcije bubrega ili jetre. Prema mehanizmu nastanka nuspojave lijekova se dijele na dvije osnovne skupine: Tip A-kao posljedica pretjeranog farmakološkog učinka primjenjenog lijeka (predvidive) i tip B neovisne o osnovnom farmakološkom učinku (neočekivane). Najčešća nuspojava terapije varfarinom je krvarenje bilo zbog predoziranja, neke od interakcija s drugim lijekovima ili zbog određenog stanja bolesnika. Bolesti koje povećavaju rizik od krvarenja su anamneza gastrointestinalnog krvarenja, cerebrovaskularne bolesti, urođene srčane greške, hipertenzija, fibrilacija atrija, infarkt miokarda, bolesti bubrega, disfunkcija jetre i anemija. Začuđuje da peptički ulkus nije povezan sa krvarenjima kod varfarinske terapije. Promjene u ishrani (smanjen unos K vitamina) te lijekovi koji interferiraju s metabolizmom varfarina i kao takvi su jaki čimbenici rizika za krvarenje (37). 24

Potencijalno fatalna nekroza kože javlja se 2 10 dana nakon početka terapije oralnim antikoagulansima, češća je u žena i osoba s nasljednim nedostatkom proteina C. Ostale blaže nuspojave su mučnina, povraćanje, proljev, kožni osip i ispadanje kose (37,39,41). Interakcije lijekova Interakcijom označavamo promjenu, pojačanje ili smanjanje očekivanog učinka stanovitog lijeka zbog uzajamnog djelovanja dvaju ili više terapijskih agensa (41). Interakcije mogu biti: 1. Farmakodinamske Ove interakcije pojavljuju se kod primjene onih lijekova koji imaju isti ili antagonistički farmakološki učinak ili nuspojave koje nastaju zbog kompeticije za ista receptorska mjesta ili zbog djelovanja na isti fiziološki sustav. Ovakve interakcije se najčešće mogu predvidjeti na temelju poznavanja farmakodinamike određenog lijeka, a očituju se u manjoj ili većoj mjeri u većine bolesnika koji uzimaju ovakvu kombinaciju lijekova. 2. Farmakokinetske Farmakokinetske interakcije nastaju onda kada jedan lijek utječe na apsorpciju drugog, na njegovu distribuciju, metabolizam ili ekskreciju, te time mijenja aktivnost lijeka (jače ili slabije djelovanje). Ovakve interakcije nije lako predvidjeti, a mnoge zahvaćaju samo dio bolesnika koji uzimaju određenu kombinaciju lijekova. Utjecaj na apsorpciju uzimanjem dva ili više lijekova (u nekim slučajevima i hrane) može doći do odlaganja apsorpcije ili smanjenja apsorpcije ukupne doze uzetog lijeka. Odlaganje apsorpcije je rijetko od kliničkog značenja. Smanjenje ukupne apsorbirane doze lijeka svakako može rezultirati nedostatnom terapijom. 25

Promjena vezivanja za proteine plazme najveći broj lijekova je nestabilno vezan za proteine plazme, a mjesta vezivanja su nespecifična, te lijekovi mogu jedni druge istisnuti s tih mjesta i time dovesti do porasta udjela u plazmi slobodnog lijeka koji je aktivan. Klinički značajno to postaje onda kada je zahvaćen lijek koji se veže više od 90% za proteine plazme, a i onda možemo očekivati samo prolazno povećanje aktivnosti lijeka jer se istovremeno povećava i eliminacija lijeka. Ova interakcija je važna kod bolesnika koji uzimaju varfarin, a uz njega npr. fenilbutazon, sulfonamide ili tolbutamin. Kod ove kombinacije lijekova inhibira se i metabolizam varfarina koji dovodi do još većeg porasta koncentracije varfarina u plazmi i time pojačane aktivnosti lijeka. Utjecaj na metabolizam mnogi lijekovi se metaboliziraju u jetri. Indukcija hepatičkih mikrosomalnih enzima jednim lijekom može promijeniti metabolizam drugog, odnosno rezultira smanjenom koncentracijom lijeka u plazmi i time smanjenom aktivnosti zahvaćenog lijeka u uobičajenoj dozi. Kod naglog prekida uzimanja lijeka koji je induktor mikrosomalnih enzima može doći do porasta koncentracije drugog lijeka do toksičnih razina u plazmi i time do značajnih kliničkih posljedica. Kada lijek inhibira metabolizam drugog lijeka dovodi do povišenja koncentracije lijeka u plazmi koja može narasti i do toksične. Utjecaj na renalnu ekskreciju lijekovi se izlučuju i putem glomerularne filtracije i aktivnom tubularnom sekrecijom. Kompeticija nastaje kod onih lijekova koji dijele aktivni transport u proksimalnom tubulu. Mnoge interakcije lijekova su beznačajne i neopasne, ali postoje i one koje su potencijalno opasne i pojavljuju se u manjeg broja bolesnika. Lijekovi s uskom terapijskom širinom i oni kojima je potrebna česta kontrola koncentracije lijeka u plazmi (oralni antikoagulansi) najčešće stupaju u interakcije. Bolesnici iznad 65 godina imaju povećan rizik od interakcija lijekova jer češće uzimaju više lijekova nego mlađi bolesnici i zato što postoji utjecaj fizioloških promjena u starenju kao što je smanjenje renalnog klirensa do 35%. Lijekovi koji povećavaju antikoagulantni učinak: - alkohol (velike količine), - alopurinol (moguće), 26

- anabolički steroidi, - analgetici (diklofenak, ibuprofen, meloksikam, piroksikam i drugi nesteroidni antireumatici, dugotrajna primjena paracetamola, parenteralni diklofenak), - anionski izmjenjivači (kolestiramin može povisiti ili sniziti antikoagulantni učinak), - antiaritmici (amiodaron i propafenon), - antibiotici (kloramfenikol, ciprofloksacin, makrolidi, ralidiksična kiselina, neomicin, norfloksacin, tetraciklin i trimetroprim mogu povisiti; INR može biti promijenjen nakon primjene antibiotika širokog spektra kao što je ampicilin i neomicin), - antidepresivi (moguće povećanje učinka), - antidijabetici, - antiepileptici (moguće povećanje učinka uz valproat; uz fenitoin moguće povećanje ili sniženje učinka), - antimikotici (ketokonazol), - antitrombocitni lijekovi (aspirin i dipiridamol povećavaju rizik krvarenja), - antiulkusni lijekovi (cimetidin i omeprazol), - antivirotici (ritonavir moguće), - barbiturati, cisaprid moguće, - citotoksični lijekovi (ifosfamid), - disulfiram, - hipolipemici (klofibrat i simvastatin), - hormonski antagonisti (danazol; flutamid; tamoksifen i moguće bikalutamid), - vakcine (influenca vakcina), - heparin, - tiroksin. Lijekovi koji smanjuju antikoagulantni učinak: - antibiotici (rifampicin), - antiepileptici (karbamazepin; fenobarbiton i primidon), - antimikotici (grizofulvin), - antiulkusni lijekovi (sukralfat moguće), - barbiturati, - estrogeni i progesteroni (oralni kontraceptivi), 27

- hormonski antagonisti (aminoglutetimid), - retinoidi (acitretin moguće), - vitamini (vitamin K) (2, 5). 28

2. CILJEVI RADA 1. Ispitati učestalost alela CYP2C9*1, CYP2C9*2 i CYP2C9*3 i genotipova CYP2C9 u skupini zdravih ispitanika (dobrovoljnih davatelja krvi). 2. Ispitati učestalost alela CYP2C9*1, CYP2C9*2 i CYP2C9*3 i genotipova CYP2C9 u bolesnika na terapiji varfarinom. 3. Ispitati učestalost alela CYP2C9*1, CYP2C9*2 i CYP2C9*3 i genotipova CYP2C9 u skupini bolesnika na niskim dozama varfarina (1,5 mg i manje). 4. Ispitati učestalost alela CYP2C9*1, CYP2C9*2 i CYP2C9*3 i genotipova CYP2C9 u skupini bolesnika na dozama varfarina višim od 1,5 mg. 5. Ispitati povezanost farmakogenetskog polimorfizma s nuspojavom krvarenja u bolesnika na terapiji varfarinom. 6. Ispitati učestalost krvarenja u skupini bolesnika na dozama varfarina 1,5 mg i manje, te skupini bolesnika na dozama varfarina višim od 1,5 mg. 7. Ispitati učestalost krvarenja u starijoj životnoj dobi (>65 god). 29

3. SVRHA RADA Dosadašnje iskustvo u liječenju bolesnika s tromboembolijskim komplikacijama je pokazalo da postoje objektivne poteškoće u titriranju terapije varfarina prilikom uvođenja lijeka (praćenje protrombinskog vremena). Farmakogenetske studije na tim bolesnicima pokazuju da su krvarenja kao najozbiljnija komplikacija uzimanja varfarina u uobičajenim dozama (>3mg) povezana s polimorfizmom CYP2C9 odnosno s alelnim varijantama CYP2C9*2 i CYP2C9*3, koje imaju 12% odnosno 5% aktivnosti divljeg tipa CYP2C9*1 (20-23). Za određenu skupinu bolesnika neophodna je terapija s izrazito niskim dozama varfarina ( 1.5 mg). Stoga je za pretpostaviti da ova skupina bolesnika ima veću učestalost alelnih varijanti CYP2C9*2 i CYP2C9*3 u odnosu na skupinu bolesnika na dozama varfarina većim od 1,5 mg i skupinu zdravih kontrola, te da nema razlike u frekvenciji alelnih varijanti CYP2C9 između skupine bolesnika na dozama varfarina većim od 1,5 mg i skupine zdravih kontrola. 30

4. ISPITANICI I POSTUPCI Ispitivanje je obuhvatilo ukupno 367 ispitanika oba spola, od toga 181 bolesnika na terapiji varfarinom najmanje mjesec dana i 186 zdravih kontrola koju su činili dobrovoljni davatelji krvi s područja Osječko-baranjske županije. Ispitivanje je provedeno u Zavodu za transfuzijsku medicinu Kliničke bolnice Osijek i Kliničkom zavodu za kemiju Kliničke bolnice Sestre milosrdnice Zagreb gdje je rađena genotipizacija CYP2C9. Bolesnici su pregledani u polikliničko-konzilijarnoj službi Zavoda za transfuzijsku medicinu (Ambulanta za poremećaje hemostaze i trombozu) i dežurnoj službi za odjelne bolesnike. Etičko povjerenstvo KB Osijek odobrilo je ispitivanje, a svi ispitanici su potpisali informirani pristanak. Ispitivanje je bilo dizajnirano kao retrospektivno-prospektivno, a retrospektivni dio podataka se dobio uvidom u povijest bolesti. Iz ispitivanja su bili isključeni bolesnici koji uzimaju lijekove za koje je poznato da induciraju ili inhibiraju eliminaciju supstrata CYP2C9 (barbiturati, rifampicin, amiodaron, sulfonamidi, flukonazol), te bolesnici s mehaničkim srčanim valvulama, ponovljenim miokardijalnim infarktom i antifosfolipidnim sindromom, klinički značajnim krvarenjima u anamnezi (gastrointestinalnim, intrakranijalnim, krvarenjima uz traumu) i disfunkcijom jetre. Bolesnici su prema dozi varfarina podijeljeni u dvije skupine: 1.bolesnici na dozama varfarina manje ili jednako 1.5 mg (n=24) 2.bolesnici na dozama varfarina većim od 1.5 mg (n=157) Obilježja koja su praćena za skupinu bolesnika: 1. dob 2. spol 3. glavna dijagnoza (MBK) 4. druge dijagnoze 5. doza varfarina pri uvođenju lijeka 6. protrombinsko vrijeme (PV ) nakon 72 sata 7. optimalna doza varfarina 8. PV terapijski optimum 9. vrijeme postizanja terapijskog optimuma 31

10. učestalost kontrola 11. dužina uzimanja lijeka 12. drugi lijekovi 13 krvarenje kao komplikacija terapije: bez krvarenja, beznačajna i značajna krvarenja 14. terapija krvarenja: K vitamin, svježe smrznuta plazma, koncentrati eritrocita 15. hospitalizacija zbog liječenja krvarenja 16. genotip CYP2C9 Obilježja za zdrave kontrole: 1. dob 2. spol 3. genotip CYP2C9 Praćenje oralne antikoagulantne terapije Rađen je jednostupanjski test protrombinskog vremena (PV) Dade Innovin Behring. PV se kontroliralo 72 sata po uvođenju lijeka, zatim dva puta tjedno tijekom dva tjedna (učestalost praćenja ovisila je o stabilnosti PV-a), te jedanput mjesečno kod bolesnika sa stabilnim PV (39). Test je osjetljiv na sniženje faktora II, VII, i X. Izvodi se dodavanjem kalcija i tromboplastina u citratnu plazmu. Tromboplastin je fosfolipidni protein koji sadržava tkivni faktor i fosfolipid koji su nužni za aktivaciju faktora X s faktorom VII. Tijekom prvih dana varfarinske terapije PV odražava primarno sniženje faktora VII. Budući da su iz ovog ispitivanja isključeni bolesnici s umjetnim srčanim valvulama, antifosfolipidnim sindromom i ponovljenim miokardijalnim infarktom, terapijski optimum je iznosio 2.0-3.0 INR-a. Farmakogenotipizacija Genotipizacija citokroma P450 CYP2C9 (aleli *1, *2 i *3) rađena je metodom određivanja polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata (od engl. restiction fragment lenght polymorphism RFLP). Određivanjem polimorfizma dužine restrikcijskih fragmenata nakon digestije PCR-produkta pomoću restrikcijskih endonukleaza (AvaII, NsiI, KpnI) identificirani su genotipovi CYP2C9 *1/*1, *1/*2, *1/*3, *2/*2, *2/*3 i *3/*3. 32

Lančana reakcija polimerazom (PCR) brza je enzimska tehnika kojom se male količine DNA in vitro selektivno uvišestruče (amplificiraju), čak milijun puta, na količinu potrebnu za daljnju analizu (elektroforeza, hibridizacija, kloniranje). PCR se temelji na ponavljajućim ciklusima tri reakcije mjenjajući temperaturu i vrijeme: 1. denaturacije DNA 2. vezanje klica na određenu regiju gena ili genoma 3. sinteza novog lanca DNA Ispitanicima se uzimala krv u dvije epruvete s Na-EDTA ( a 3 ml; Becton Dickinson, Meylen Cedex, Francuska). Uzorak se do trenutka izolacije DNA čuvao na 20º C, ne dulje od mjesec dana. Leukocitna DNA se izdvajala standardnom fenol/kloroform ekstrakcijom i precipitirala etanolom (2). Genomska DNA se umnažala u tri lančane reakcije polimeraze (PCR-A, PCR- B i PCR-C) s pomoću tri seta klica: PCR-A: klice C9AvaF i C9AvaR PCR-B: klice C9KpnF i C9KpnR PCR-C: klice C9NsiF i C9KpnR Klice: C9AvaF 5 -GTATTTTGGCCTGAAACCCATA-3 C9AvaR 5 -GGCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3 C9KpnF 5 -TGCAGAGGTCCAGAGGTAC-3 C9KpnR 5 -ACAAACTTACCTTGGGAATGAGA-3 C9NsiF 5 -TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3 Kemijski i fizikalni uvjeti za PCR-A, B i C su bili isti. Kemijski uvjeti: Fizikalni uvjeti: 95 C 5 min 30µL 1X pufer 94 C 45 s 200µg/mL DNA 10X 66 C 60 S 200µM dntp 72 C 2 min 250 nm primer 1.50 mm Mg 94 C 30s 4U/100µL Taq 35X 64 C 90s 72 C 30s 72 C 10 min 33

PCR produkti su se zatim enzimski cijepali restrikcijskim endonukleazama: PCR-A s AvaII (G GWTC) 10 J/µL, PCR-B s KpnI (GGTAC C) 10J/µL i PCR-C s NsiI(ATGCA T) 10J/µL. Uvjeti RFLP reakcije: RFLP reakcija A Volumen Ava II (50/µL) 2.0µl H 2 O -µl PCR 10µL 10x Buffer 1.33µL Ukupni volumen 13.33 µl RFLP reakcija B Priprema 100µL radnog pufera: 50g/L BSA (Molecular biology grade, Sigma); (KpnI 10x pufer) 98µL+ (50 g/l BSA) 2 µl Kpn I (40 U/µL) 0.25 µl H 2 O -µl PCR 10 µl Radni pufer 1.14 µl Ukupni volumen 11.39µL RFLP reakcija C Nsi I (40U/µL) 0.25 µl H 2 O - µl PCR 10 µl 10 x Buffer 1.14µL Ukupni volumen 11.39 µl 34

Kontrolni materijal i analitička kontrola: uz svaku reakciju umnažanja paralelno se umnažaju pozitivne i negativne kontrole. Po završetku reakcije slijedila je elektroforetska analiza produkata cijepanja na 12% PolyNat gelu (Elchrom Scientific, Cham, Švicarska). Gel je bojan 30 minuta bojom SYBR Gold (Molecular Probes, Eugene, Oregon, SAD), zatim je stavljan na UV transiluminator (254 nm) i fotografiran Polaroid kamerom, te su analizirani genotipovi uzoraka: C9AvaF AvaII:454=397+57 (*1 ili *3) C9AvaR C9KpnF KpnI:105=85+20 (*3) C9KpnR C9NsiF NsiI:105=84+21 (*1 ili*2) C9KpnR Načinjeni su restrikcijski obrasci nakon elektroforeze pocijepanih PCR produkata na kojima je za svaki PCR (A, B, C) prikazana pozicija i veličina fragmenata ovisno o alelu koji se određuje (alel *1, *2 ili *3). Samo ukoliko je pojedini alel detektiran uz pomoć sva tri restrikcijska obrasca (pocijepan je sa sva tri restrikcijska enzima) osoba je bila nositelj tog alela. (Slika 5.) U slučaju nejasnog rezultata postupak je ponovljen. 35

Slika 5. PCR RFLP CYP2C9 36