UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO DAVID HAJŠEK DIPLOMSKA NALOGA. Univerzitetni študij farmacije

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO DAVID HAJŠEK DIPLOMSKA NALOGA Univerzitetni študij farmacije LJUBLJANA, 2012

2 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO DAVID HAJŠEK TESTNI SISTEM ZA DOLOČANJE AFINITETE ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN IN VITRO ASSAY FOR DETERMINING AFFINITY OF DC-SIGN ANTAGONISTS IN VITRO DIPLOMSKA NALOGA Univerzitetni študij farmacije LJUBLJANA, 2012

3 Diplomsko delo sem opravljal na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Marka Anderluha, mag. farm. Zahvala Zahvaljujem se mentorju izr. prof. dr. Marku Anderluhu za vsestransko pomoč, razumevanje in spodbujanje pri laboratorijskem delu ter za strokovne nasvete pri pisanju diplomske naloge, doc. dr. Tihomirju Tomašiću za pomoč in nasvete pri molekulskem sidranju ter članoma komisije za pregled diplomske naloge. Posebna zahvala gre mojim staršem, ki so me ves čas študija podpirali in mi potrpežljivo stali ob strani. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom izr. prof. dr. Marka Anderluha, mag. farm. David Hajšek Predsednik diplomske komisije: prof. dr. Janko Kos, univ. dipl. kem. Član diplomske komisije: doc. dr. Mitja Kos, mag. farm.

4 VSEBINA POVZETEK... I ABSTRACT... II SEZNAM OKRAJŠAV... III 1. UVOD LEKTINI TIPA C TERMINOLOGIJA SPLOŠNA STRUKTURA LEKTINOV TIPA C DELITEV IN VLOGA LEKTINOV TIPA C DC-SIGN VLOGA STRUKTURA LIGANDI DC-SIGN KOT TERAPEVTSKA TARČA NAMEN DELA MATERIALI IN METODE MATERIALI REAGENTI IN TOPILA OPREMA APARATURE METODE IMUNOKEMIJSKE METODE TESTNI SISTEM ZA DOLOČANJE AFINITETE ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN IN VITRO KONJUGACIJA Z BIOTINOM (BIOTINILACIJA) KONJUGACIJA S FITC ENCIMSKO KATALIZIRANA REAKCIJA KEMILUMINISCENCE STATISTIČNE METODE MOLEKULSKO SIDRANJE EKSPERIMENTALNO DELO SPLOŠNI POSTOPKI PRIPRAVA PUFROV PRIPRAVA BIOTINILIRANEGA GP PRIPRAVA GP120 KONJUGIRANEGA S FITC SPIRANJE MIKROTITRSKIH PLOŠČIC VEZAVA ECD RECEPTORJA DC-SIGN NA MIKROTITRSKE PLOŠČICE BLOKIRANJE PROSTIH VEZAVNIH MEST NA MIKROTITRSKIH PLOŠČICAH PRIPRAVA IN NANOS RAZTOPIN POTENCIALNIH ANTAGONISTOV IN OZNAČENEGA NARAVNEGA LIGANDA PRIPRAVA IN NANOS PROTITELES, KONJUGIRANIH S PEROKSIDAZO PRIPRAVA IN NANOS KEMILUMINISCENČNEGA REAGENTA TER MERJENJE KEMILUMINISCENCE NAČRTOVANJE IN OPTIMIZACIJA TESTNEGA SISTEMA TESTNI SISTEM TESTNI SISTEM TESTNI SISTEM TESTNI SISTEM

5 4.3 DOLOČANJE AFINITETE POTENCIALNIH ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN MOLEKULSKO SIDRANJE REZULTATI IN RAZPRAVA NAČRTOVANJE IN OPTIMIZACIJA TESTNEGA SISTEMA TESTNI SISTEM TESTNI SISTEM TESTNI SISTEM TESTNI SISTEM DOLOČANJE AFINITETE POTENCIALNIH ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN MOLEKULSKO SIDRANJE ZAKLJUČEK LITERATURA PRILOGA 1: Testni sistem za določanje afinitete antagonistov receptorja DC-SIGN in vitro PRILOGA 2: Rezultati testiranj potencialnih antagonistov DC-SIGN PRILOGA 3: Rezultati molekulskega sidranja... 77

6 POVZETEK DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-grabbing non-integrin) je lektin tipa C iz skupine II. Deluje kot adhezijska molekula na dendritičnih celicah (DC). Omogoča nekatere funkcije DC, kot so migracija, prepoznava patogenov, internalizacija in procesiranje ter vezava na T-celice. HIV-1 lahko vstopi v DC preko vezave na DC-SIGN in s tem pobegne običajni litični poti v endosomih DC in zato obrambnemu mehanizmu imunskega sistema. Podoben mehanizem preživetja je bil opažen tudi pri nekaterih drugih patogenih organizmih. Zaradi tega je DC-SIGN zanimiv kot tarča za nove zdravilne učinkovine (antagoniste), ki bi preprečile interakcijo patogen-dc-sign ter s tem blokirale prvi korak pri okužbi. Za potencialne antagoniste je pomembno, da imajo visoko afiniteto do receptorja DC-SIGN, saj je njihov pričakovan mehanizem delovanja kompetitivno zaviranje vezave antigenov, ki jih najdemo na površini patogenov (npr. gp120 na virusu HIV-1), na DC-SIGN. V tem diplomskem delu smo razvili in optimizirali zanesljiv, ponovljiv in tudi ekonomsko dostopen testni sistem in vitro, ki nam omogoča določanje afinitete potencialnih antagonistov receptorja DC-SIGN. Preizkusili smo različne izvedbe testnega sistema; različne možnosti označevanja naravnega liganda, zasnove testnega sistema in metode detekcije ter mikrotitrske ploščice različnih proizvajalcev. Testni sistem smo ovrednotili z vidika ustrezne odzivnosti metode, robustnosti in ponovljivosti.vpeljali smo ga kot rutinski test za določanje vrednosti IC 50 spojinam sintetiziranim na Katedri za farmacevtsko kemijo. Te vrednosti uporabljamo kot kvantitativno merilo afinitete spojin do DC-SIGN. Z molekulskim sidranjem smo napovedali konformacije in orientacijo testiranih potencialnih antagonistov v vezavnem mestu ter skušali opredeliti odnos med strukturo in afiniteto potencialnih antagonistov receptorja DC-SIGN. I

7 ABSTRACT DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-grabbing non-integrin) is a type II C-type lectin. It functions as an adhesion molecule on dendritic cells (DC). It enables some of the functions of DCs, including migration, pathogen recognition, internalization, and processing, and their binding to T cells. HIV-1 has been reported to enter DCs by binding to DC-SIGN, escaping the normal lytic pathway in DC's endosomes and avoiding the immune system defence system. A very similar mechanism of survival has been observed for some other pathogens. This makes DC-SIGN a receptor of interest in the design of distinctive anti-infectives that would inhibit DC-SIGN-pathogen interaction by blocking the very first step in pathogen infection. To achieve this, potential antagonists should have high affinity for DC-SIGN as they have to compete for binding on DC-SIGN with antigens found on the surface of pathogens (eg. gp120 on HIV-1). In this thesis we have developed and optimized a reliable, reproducible and economically accessible in vitro assay for determining affinity of DC-SIGN antagonists. We have evaluated different versions of the assay; different natural ligand labelling, different designs of the assay and methods of detection, microtiter plates from different manufacturers. The assay was evaluated in terms of the response, robustness and reproducibility. We have introduced it as a routine test for determination of IC 50 of antagonists synthesized at the Department of Pharmaceutical Chemistry at Faculty of Pharmacy. These values are quantitative measure for compound's affinity. Molecular docking studies were performed to predict conformation and orientation of tested potential antagonists in the binding site and to try to define the relationship between structure and affinity of potential DC-SIGN antagonists. II

8 SEZNAM OKRAJŠAV ANOVA test analize varianc (analysis of variance) APC antigen-predstavitvene celice CLR lektinski receptor tipa C (C-type lectin receptor) CMV Citomegalovirus CRD domena za prepoznavanje ogljikovih hidratov (carbohydrate recognition domain) CSPG hondroitinsulfat proteoglikan (chondroitin sulphate proteoglycan) CTLD domena lektina tipa C (C-type lectin domain) DC dendritične celice DC-SIGN "dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-grabbing non-integrin" ELISA encimski imunski test na trdnem nosilcu (enzyme-linked immunosorbent assays) FITC fluorescein izotiocianat gp120 plaščni glikoprotein, ki se nahaja na površini virusa HIV HIV virus humane imunske pomanjkljivosti (human immunodeficiency virus) HRP peroksidaza navadnega hrena (horseradish peroxidase) ICAM medcelična adhezijska molekula (intercellular adhesion molecule) LDL lipoproteini nizke gostote (low density lipoprotein) NHS N-hidroksisukcinimid PHK poglavitni histokompatibilnostni kompleks PRR receptor, ki prepoznava različne patogene molekularne vzorce (pattern recognition receptor) SIV opičji virus imunske pomanjkljivosti (simian immunodeficiency virus) TLR Toll-u podobni receptor (Toll-like receptor) III

9 1. UVOD 1.1 LEKTINI TIPA C Genom sesalcev kodira številne različne molekule, ki so sposobne prepoznave in vezave ogljikovih hidratov, poznane pod skupnim imenom lektini. Zelo raznoliko in dobro raziskano skupino znotraj lektinov predstavljajo lektini tipa C. Od ostalih se razlikujejo po tem, da v vezavnem mestu za ogljikove hidrate vsebujejo Ca 2+ ione. Vključeni so v prepoznavo ogljikovih hidratov na površinah celic, na glikoproteinih v plazmi in tudi tistih na površini patogenih organizmov. Posledično sodelujejo pri raznolikih procesih v organizmu in igrajo pomembno vlogo pri nespecifičnem imunskem odzivu. (3,4) TERMINOLOGIJA Izraz lektin tipa C je bil uveden za razlikovanje med lektini, katerih delovanje je odvisno od Ca 2+ ionov in ostalimi lektini. Kasneje, ko je bila odkrita struktura lektinov tipa C in definirana vloga posameznih domen, so odkrili, da pri vezavi ogljikovih hidratov posreduje domena za prepoznavanje ogljikovih hidratov (CRD), ki je prisotna v vseh od Ca 2+ odvisnih lektinih. Kristalografske študije so pokazale, da ima ta domena kompaktno globularno strukturo, ki ni podobna nobenemu znanemu zvitju proteinov, zaradi česar je dobila ime CRD tipa C ali domena lektinov tipa C (CTLD). Z naraščanjem števila proteinov z določenim zaporedjem je postalo jasno, da vsi proteini z aminokislinskim zaporedjem, ki ustreza zaporedju CTLD, ne vežejo ogljikovih hidratov ali Ca 2+. Za rešitev tega protislovja, je bil uveden izraz domena podobna CRD domeni lektinov tipa C. Prav tako so odkrili proteine, ki sicer niso izkazovali podobnosti v aminokislinskem zaporedju z lektini tipa C, so pa izkazovali podobno zvitje, kar doda dodaten pomen izrazu CTLD. (1) 1

10 1.1.2 SPLOŠNA STRUKTURA LEKTINOV TIPA C CTLD je sestavljena iz približno 150 aminokislin, ki so pomembne za pravilno zvitje domene in koordinacijo Ca 2+ ionov, ki so bistveni za vezavo ogljikovih hidratov. Klasične CTLD lahko razdelimo na dve skupini; na tiste, ki vežejo ogljikove hidrate manoznega tipa in tiste, ki vežejo ogljikove hidrate galaktoznega tipa. (4) Pri tem velja omeniti, da je specifičnost za ligande v veliki meri odvisna od položaja hidroksilnih skupin na ogljikovih hidratih. To pomeni, da se bodo ligandi s hidroksilnimi skupinami na enakem položaju kot sta ekvatorialni OH skupini na mestih tri in štiri v manozi (npr. fukoza), vezali na CTLD manoznega tipa. (5) Vijačnica, v katero se zvije CTLD, ima strukturo dvojne zanke (Slika 1). Zunanja domena je zanka, v kateri N- in C-terminalna β-trakova (β1, β5) tvorita antiparalelno β-ploskev. Druga zanka, ki se imenuje področje dolge zanke, leži znotraj domene; v jedro domene vstopi na istem mestu, kot izstopi. Štirje cisteini (C1-C4) tvorijo disulfidne mostove na začetku zank; C1 in C4 povezujeta β5 Slika 1: Slikovna predstavitev tipične CTLD strukture. Področje dolge zanke je prikazano z vijolično barvo. Cisteinski mostovi ter v njih udeleženi aminokislinski ostanki so prikazani s svetlo zelenimi paličicami. (3) in α1, C2 in C3 pa β3 in β5. Preostanek verige tvori dva bočna α-heliksa (α1 in α2) in drugo (zgornjo) β-ploskev sestavljeno iz trakov β2, β3 in β4. Strukturno lahko CTLD-je razdelimo v dve skupini; kanonske CTLD-je (imajo področje dolge zanke) in kompaktne CTLD-je (brez področja dolge zanke). Druga skupina vsebuje t.i. "link" domeno ali domeno proteinske tandemske ponovitve. V CTLD-jih lahko najdemo štiri vezavna mesta za Ca 2+ ione (glej sliko 2). Njihova zasedenost je odvisna od posameznega CTLD zaporedja in pogojev kristalizacije; v znanih strukturah so zasedena eno, dve ali tri vezavna mesta. Mesta 1, 2 in 3 so locirana na zgornjem loku strukture, mesto 4 pa je vključeno v formaciji solnega mostička med α2 in β1/β5 ploskvama. (1) Slikovno predstavitev tipične CTLD strukture prikazuje slika 1. 2

11 Slika 2: Slikovni prikaz vezavnih mest za Ca 2+ v CTLD-ju. Ca 2+ ioni so označeni kot rdeči krogi. Številke vezavnih mest omenjene v tekstu so navedene ob puščicah. (3) DELITEV IN VLOGA LEKTINOV TIPA C Slika 3: Zgradba domen CTLD-jev iz različnih skupin pri vretenčarjih. Številka skupine je navedena ob diagramu zgradbe. (1) Odkritje CTLD-ja je omogočilo karakterizacijo ostalih sorodnih proteinov, ki so prav tako izkazovali odvisnost od Ca 2+ ionov. Pri človeku je bilo odkritih mnogo različnih proteinov, ki vsebujejo CTLD, prav tako pa so odkrili njihove homologe pri drugih vretenčarjih in nevretenčarjih. Tako so na primer pri določanju zaporedja genoma gliste Caenorhabditis elegans identificirali približno 150 genov, ki so kodirali lektine tipa C. Zaradi številnosti predstavnikov jih je bilo potrebno razvrstiti v različne podtipe na podlagi strukturnih lastnosti, vloge v organizmu ali njihove specifične lokacije. (3) Drickamer je kot prvi leta 1993 do takrat znane CTLD-je na podlagi 3

12 zgradbe njihovih domen razvrstil v sedem skupin (I-VII). Pokazal je, da taka razvrstitev sovpada z rezultati filogenetskih analiz zaporedij in da zajema funkcionalne podobnosti med proteini. (1, 6) Leta 2002 je bila ta razvrstitev ponovno pregledana in dopolnjena. Dodanih je bilo sedem novih skupin (VIII-XIV). (1, 7) V letu 2005 so bile v razvrstitev dodane še tri skupine (XV-XVII) za razvrstitev proteinov, ki so jih odkrili pri proučevanju CTLD-jev ribe napihovalke Fugu rubripes. (1, 8) Razvrstitev CTLD-jev vretenčarjev in njihovo zgradbo prikazujeta slika 3 in preglednica I. Preglednica I: Pregled skupin CTLD-jev vretenčarjev in njihovih vlog v organizmu. (1) Skupina Ime Vloga I Lektikani Adhezija celic, integracija tkiva. Receptor za Prepoznavanje in internalizacija oligosaharidov z asialoglikoproteine galaktoznim koncem desializiranih glikoproteinov. Podskupina DC-SIGN Glej poglavje (stran 6) Receptorji makrofagov Njihova vloga je slabo opredeljena. II Langerin povezujejo z Birbeckovimi telesi, receptor Langerin in Kupfferjeve Kupfferjevih celic pa deluje kot endocitični receptor za celice glikoproteine s fukoznim koncem. Čistilni receptor s CTLD Vezava po Gramu negativnih in pozitivnih bakterij, kvasovk in oksidiranih LDL. III Kolektini Prepoznavanje ogljikovih hidratov na patogenih, aktivacija fagocitoze. IV Selektini Adhezija celic. Vpleteni v prvi korak in sledeče premike pri rekrutiranju levkocitov iz krvnega obtoka na mesto vnetja in v limfatična tkiva. V Receptorji NK celic Povezani z aktivacijo in inhibicijo NK (natural killer) celic. VI Multi-CTLD endocitotski receptorji Recikliranje endocitotskih receptorjev. VII Reg skupina Vpleteni v mnoge fiziološke in patološke procese, vendar mehanizem delovanja ni poznan. VIII Hondrolektin, lajilin Lajilin lahko deluje kot endocitotski receptor ali kot adhezijska molekula. IX Tetranektin Izražen v razvijajočih se tkivih, vpleten v remodeliranje tkiva in aktivacijo plazminogena. X Policistin 1 Identificiran kot eden izmed dveh genov, katerih mutacija sproži avtosomalno dominantno policistično bolezen ledvic. XI Atraktin Pri miših povezan z mutacijo, ki vpliva na melanokortin signalno pot. XII Eozinofilni glavni bazični Citotoksično delovanje na parazite. protein (EMBP) XIII DGCR2 Vloga neznana. XIV Trombomodulin Pomembna vloga pri koagulaciji. XV Bimlec Vloga neznana. XVI SEEC Vloga neznana. XVII CBCP/Frem1/QBRICK Domnevno deluje kot posrednik pri adheziji bazalne membrane. 4

13 1.2 DC-SIGN DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-grabbing non-integrin) je lektin tipa C iz skupine II. Najdemo ga na najbolj specializiranih antigen predstavitvenih celicah (APC) dendritičnih celicah (DC). Poleg tega, da je adhezijska molekula (pomembna zlasti za vezavo ICAM-2 in ICAM-3), ima pomembno vlogo tudi pri prepoznavanju mnogih endogenih in eksogenih antigenov. Zaradi svoje vpletenosti v mnoge procese v imunskem odgovoru je zadnja leta deležen povečane pozornosti. Zanimiv je zlasti kot tarča za nove zdravilne učinkovine, ki bi preprečile interakcijo patogen-dc-sign ter s tem blokirale prvi korak pri okužbi. (9, 10) VLOGA VPLETENOST V RAZLIČNE FUNKCIJE DC DC igrajo pomembno vlogo pri imunskem odgovoru na infektivne organizme. Zaradi kombinacije edinstvenih lastnosti so ključne APC vpletene v aktivacijo T-celic. (11) Te lastnosti vključujejo sposobnost prepoznave antigenov v okuženem tkivu, diferenciacije in migracije v sekundarne limfne organe. (12) DC-SIGN ima pri tem vlogo receptorja, ki prepoznava različne patogene molekularne vzorce (PRR). (13) Prepoznava antigenov v okuženem tkivu: primarna funkcija CLR-ja (lektinski receptor tipa C) DC-SIGN je internalizacija antigenov za razgradnjo, s čimer se izboljša njihovo procesiranje in predstavitev T-celicam s pomočjo PHK (poglavitni histokompatibilnostni kompleks) molekul. (14) DC-SIGN ob vezavi liganda inducira internalizacijo iz celične površine. (15) Kompleksi DC-SIGN-ligand so usmerjeni proti predelom poznih endosomov ali lizosomov, kjer se ligand procesira in preko PHK molekul razreda II predstavi T-celicam. To nakazuje na pomembno vlogo DC-SIGN-a kot receptorja za antigene. (10) Diferenciacija: DC-SIGN močno vpliva na diferenciacijo DC iz monocitov, ki jo usmerja z avtokrinim izločanjem IL-4. Ugotovljena je bila povezava med signaliziranjem 5

14 DC-SIGN-a in IL-4, s poudarkom na njuni neločljivi vlogi za diferenciacijo DC. DC-SIGN verjetno igra pomembno vlogo tudi pri vzdrževanju homeostaze DC in pravilnem delovanju imunskega sistema. (10) Migracija: zmožnost migracije in izvajanja nenehnega nadzora predstavljata temelj delovanja DC. Po prepoznavi in procesiranju antigenov DC migrirajo v sekundarne limfne organe, kjer sprožijo imunski odgovor. DC-SIGN sodeluje pri premikanju vzdolž površin z izraženim ICAM-2 in pripenjanju nanje. Prav tako sodeluje pri adheziji DC na žilni endotelij in njihovi kasnejši migraciji. (16) Aktivacija T-celic: DC-SIGN z vezavo ICAM-3 posreduje pri prehodni adheziji DC na T-celice, kar omogoča vzorčenje PHK-peptid kompleksov. S tem omogoča zgodnji, antigen nespecifični stik med T-celicami in DC ter stabilizira območje njunega kontakta, kar je pomembno za učinkovit prenos na PHK pripetega antigena na T-celice. (17) VEZAVA RAZLIČNIH LIGANDOV IN SIGNALIZIRANJE DC-SIGN je odgovoren za prepoznavo in internalizacijo mnogih pomembnih patogenov. Sposoben je prepoznave glikanov, ki vsebujejo manozo ali fukozo. Le-ti so izraženi pri mnogih bakterijah, parazitih in virusih. (18-20) Poleg tega inducira intracelularne signalne poti neodvisno od drugih PRR-jev ali pa z modulacijo njihovih odzivov, s čimer narekuje proces zorenja DC po vezavi antigena. (10) MODULACIJA IMUNSKEGA ODZIVA DC so razvile edinstvene poti, s katerimi regulirajo imunski sistem in doprinašajo k toleranci. DC-SIGN ne deluje zgolj kot neodvisni PRR, pač pa je vpleten tudi v imunoregulacijo DC. Nedavno je bil prepoznan kot ključni akter pri indukciji imunskega sistema z uravnavanjem aktivacije DC, sprožene preko TLR-jev. Od vrste patogena, ki se veže na DC-SIGN, je odvisno ali bo prišlo do inhibicije ali promocije polarizacije celic T pomagalk tipa 1 (Th1), odziva Th2 in/ali indukcije diferenciacije regulatornih celic T (glej sliko 4). (10) 6

15 Slika 4: V odvisnosti od prepoznanega patogena naivne T-celice diferencirajo v Th1, ki izločajo interferon γ (IFN-γ) ali v Th2, ki proizvajajo interlevkin 4 (IL-4) (21) DC-SIGN KOT MEHANIZEM ZA POBEG IMUNSKEMU NADZORU Idealen primer virusa, ki izkorišča naravno funkcijo DC-SIGN-a za okužbo, je HIV-1 (virus humane imunske pomanjkljivosti). Za temeljito diseminirano okužbo mora HIV-1 iz površin sluznic doseči limfna tkiva, kjer okuži celice T CD4 +. DC so idealni gostitelj za to nalogo, saj se jih mnogo nahaja na sluznicah, med zorenjem pa migrirajo v limfna tkiva. HIV-1 se najprej veže na DC z interakcijo med plaščnim glikoproteinom gp120 in DC-SIGN-om. (10) Preko vdolbin prekritih s klatrinom se kompleks HIV-1-DC-SIGN hitro internalizira v endosome DC (22), kjer kislo endosomalno okolje povzroči disociacijo ligandov iz DC-SIGN-a. Prosti DC-SIGN se nato vrne na površje DC, vezani ligand pa se razgradi in procesira. (23) Velik delež HIV-1, ki vstopi v DC, je uničen po tem mehanizmu, vendar pa zaradi presenetljivo močne vezave HIV-1 na DC-SIGN majhen del HIV-1 ostane zaščiten pred gostiteljevim imunskim sistemom ter obdrži svojo infektivnost. (24, 25) HIV-1 nato ostane v DC v visoko infektivnem stanju več dni, skrit v multivezikularnih telesih. (26) Alternativno interakciji HIV-1 z DC-SIGN-om lahko sledi lateralni prenos virusa do receptorjev CD4/CCR5 izraženih na nezrelih DC. Zatem pride do zlitja virusne ovojnice s celično membrano in infekcije DC. (27) V obeh primerih HIV-1 izkoristi DC kot trojanskega konja za pobeg pred gostiteljevim imunskim sistemom. (21) 7

16 Po migraciji okuženih DC v limfna tkiva, DC tvorijo virusno sinapso s T-celicami, preko katere je omogočen učinkovit prenos virusa na gostiteljeve celice T DC4 +. (28) Pri tem aktivno sodeluje DC-SIGN, ki s svojim signaliziranjem (induciranim s HIV-1) inhibira zorenje DC in sodeluje pri tvorbi virusne sinapse. HIV-1 protein Nef inducira up-regulacijo DC-SIGN-a v okuženih DC, kar izrazito poveča stik med DC-SIGN-om in T-celicami ter pospeši prenos in diseminacijo HIV-1. Nef lahko vpliva tudi na down-regulacijo izražanja CD4 in PHK razreda 1, kar olajša izogibanje imunskemu sistemu. (29) Na koncu se obe poti (cis in trans) predstavljeni na sliki 5 združita v okužbi celic T CD4 +, pri čemer ima DC-SIGN pomembno vlogo. (24) DC-SIGN torej narekuje način okužbe s HIV-1 vse od vdora v DC ali okužbe DC in modulacije imunskega sistema do prenosa in diseminacije HIV-1. Ostali patogeni, ki prav tako izkoriščajo DC-SIGN za pobeg imunskemu nadzoru, najbrž delijo podoben mehanizem okužbe gostitelja. Iz tega vidika je inhibicija interakcije med patogenom in DC-SIGN-om zanimiv koncept za nove anti-infekcijske učinkovine, ki bi preprečevali ne samo lokalizirano okužbo DC, ampak tudi diseminacijo patogenov. (10) Slika 5: Interakcija HIV-1 z DC-SIGN-om in sledeči dogodki (10) 8

17 1.2.2 STRUKTURA DC-SIGN (glej sliko 6) je transmembranski protein in sodi med lektine tipa C (CLR). Vsebuje en CTLD (glej sliko 7), ki se nahaja v ekstracelularni domeni. Gre za globularno strukturo, sestavljeno iz 12-ih β-trakov, dveh α-vijačnic in treh disulfidnih mostov. Del proteina tvori zanko, ki štrli iz površine in tvori del dveh vezavnih mest za Ca 2+. Eno izmed teh mest je odgovorno za konformacijo CTLD-ja, drugo pa za tvorbo koordinacijskih vezi z ogljikohidratnimi strukturami. Interakcije s Ca 2+ v tem vezavnem mestu tvorijo tudi štirje aminokislinski ostanki (Glu347, Asn349, Glu354 in Asn365) in narekujejo prepoznavo specifičnih ogljikohidratnih struktur. (9, 30, 31) V ekstracelularni domeni najdemo tudi vrat, ki je sestavljen iz štirih povezanih verig, zgrajenih iz sedmih popolnih in ene nepopolne tandemske ponovitve. Vratu sledi transmembranska regija (TR), tej pa citoplazemska domena oziroma rep, ki vsebuje motive za recikliranje, internalizacijo in intracelularno signaliziranje - di-levcinski (LL) motiv, tri-kislinske (EEE) skupke in nepopolni ITAM ("immune receptor tyrosine-based activation motif") motiv. (9, 20) Slika 6: Struktura DC-SIGN-a (20) Tetramerizacija DC-SIGN-a, ki se pojavi z združitvijo domen vratu, ima odločilen vpliv na afiniteto vezave. (32) Oligomerizacija je odvisna od števila ponovitev vijačnice v vsakem delu vratu; za tetramerizacijo je potrebnih najmanj 6 ponovitev. (33) Monomerna in tetramerna oblika sta v ravnovesju, ki je odvisno od ph medija. Vrat, ki omogoča prehajanje med tema oblikama, ima torej vlogo ph-senzorja. (34) To pomeni, da se afiniteta do ogljikovih hidratov znatno spreminja s spreminjanjem ph-ja, kar omogoča sprostitev vezanih patogenov v kislem endosomalnem okolju in posledično njihovo razgradnjo. (9) 9

18 Vezavno mesto DC-SIGN-a ponuja 6 koordinacijskih vezi za Ca 2+ ione in dve dodatni koordinacijski vezi, ki jih tvorijo ogljikohidratni ostanki. (2, 32) DC-SIGN v svoji CTLD vsebuje zaporedje Glu347- Pro348-Asn349-Asn350, zaradi česar izkazuje nagnjenost k vezavi monosaharidov s hidroksilnima skupinama na mestih 3 in 4 v ekvatorialni legi. (35) Ta isti motiv napove tudi specifičnost na ogljikove hidrate, ki vsebujejo manozo. (32) Slika 7: CTLD DC-SIGN-a (kristalna struktura) (2). Trije Ca2+ ioni so predstavljeni kot zelene krogle, peptidno ogrodje je predstavljeno kot trak, aminokislinski ostanki pa so predstavljeni kot paličice LIGANDI DC-SIGN veže mnogo različnih ligandov, ta vezava pa je visoko regulirana. Kot že omenjeno, DC-SIGN posreduje pri kontaktu med DC in T-celicami z vezavo na ICAM-3 (17), pri migraciji DC z vezavo na ICAM-2 (24) in prepoznava različne mikroorganizme (viruse, bakterije, glive in nekatere parazite) (10). DC-SIGN je bil odkrit ob ugotovitvi, da DC vežejo ICAM-3 z zelo visoko afiniteto. ICAM-3 je N-glikoziliran z manoziliranimi oligosaharidi in Lewis-x ostanki. (36) DC-SIGN prav tako veže ICAM-2, ne pa tudi ICAM-1. Encimska odstranitev ogljikovih hidratov vezanih preko dušika, popolnoma prepreči vezavo na DC-SIGN. (31) Kljub temu, da interakciji izkazujeta podobne lastnosti, DC-SIGN z ICAM-2 interagira drugače kot z ICAM-3. Način interakcije najverjetneje določa ogljikohidratna struktura in/ali velikost molekule. (30) DC-SIGN je sposoben vezave plaščnega glikoproteina gp120 virusa HIV-1. Mestnospecifična mutageneza je pokazala, da je vezava gp120 in ICAM-3 odvisna od prisotnosti Ca 2+ na mestu 2 in od bližnjih aminokislinskih ostankov ter da je interakcija s HIV-1, ICAM-2 in ICAM-3 blokirana ob prisotnosti manana. Ne glede na to pa je vezava 10

19 gp120 drugačna kot vezava ICAM-3, saj ima DC-SIGN posebno vezavno mesto za gp120. (10) DC-SIGN interagira z visoko manoziliranimi oligosaharidi, če pa je na voljo samo en terminalen manozni ostanek, potem do interakcije ne pride ali pa je ta zelo šibka in kratkotrajna. (17, 32) DC-SIGN prepoznava strukture z vsaj tremi manoznimi ostanki, lociranimi v notranjosti glikanske strukture. (2) Zunanji saharidi in terminalne di-manoze prav tako interagirajo s površino DC-SIGN-a. Ta ima višjo afiniteto do kompleksnejših manoznih ostankov s specifično razporeditvijo (30-32), pri čemer je prepoznava posameznih ogljikohidratnih struktur najverjetneje odvisna od njihovih razmikov na glikoproteinu (32). Poleg interakcij z mnogimi manj kompleksnimi oligosaharidi (npr. z manozo in α1 3, α1 6 manotriozo) DC-SIGN izkazuje visoko afiniteto za antigene Lewis krvne skupine, ki vsebujejo fukozne ostanke. CTLD bogata s cisteinom prepozna nesializirane oblike Lewis-x (Le x ), Lewis-y (Le y ), Lewis-a (Le a ) in Lewis-b (Le b ). (2, 37) Kristalna struktura DC-SIGN-a je razkrila, da se ti dve različni skupini ligandov (strukture s fukoznimi oz. manoznimi fragmenti) vežeta v isti žepek, ki je hkrati tudi primarno vezavno mesto za Ca 2+. Kljub skupnemu začetnemu vezavnemu žepku pa se strukture po vezavi usmerijo v nasprotne smeri, kar potrjuje obstoj dveh različnih vezavnih mest za fukozilirane oz. manozilirane oligosaharide (2). DC-SIGN interagira z mnogimi različnimi patogeni, in sicer preko glikanov, ki vsebujejo manozo ali fukozo. Pregled patogenov in njihovih antigenov je zbran v preglednici II. Preglednica II: Patogeni, ki jih veže DC-SIGN (20) Patogen Antigen Ostali CLR-ji Virusi HIV-1 gp120 (visoko manoziliran) Manozni receptor in langerin HIV-2 gp120 SIV-1 gp120 Ebola glikoprotein (visoko manoziliran) Citomegalovirus glikoprotein B Hepatitis C E1/E2 Denga glikoprotein E Bakterije Helicobacter pylori lipopolisaharid (Lewis-x) Mycobacteria tuberculosis ManLAM (di-manoza, tri-manoza) Manozni receptor 11

20 Preglednica II: (Nadaljevanje) Glive Candida albicans? Manozni receptor Paraziti Leshmania pifanoi lipofosfoglikan (visoko manoziliran) Schistosoma mansoni "Soluble egg antigen" (Lewis-x) DC-SIGN KOT TERAPEVTSKA TARČA Vloga DC-SIGN-a pri okužbi s patogeni nakazuje, da je inhibicija interakcije med patogeni in DC-SIGN-om zanimiv pristop k razvoju zdravilnih učinkovin, ki bi lahko preprečile tako lokalizirano okužbo DC kot tudi diseminacijo patogenov. Zaenkrat še ni bila predstavljena nobena klinično dokazana terapija, vendar pa se v literaturi pojavlja veliko prispevkov, ki se ukvarjajo z DC-SIGN-om kot morebitno tarčo za protiinfekcijske učinkovine. Pri tem se omenja več različnih pristopov (9): inhibicija vezave patogena na DC-SIGN z zanj specifičnimi ligandi majhne molekule (antagonisti DC-SIGN-a) ali monoklonska protitelesa proti DC-SIGN-u (38-40), inhibicija vezave patogena na DC-SIGN z ligandi s specifično ogljikohidratno strukturo (41), inhibicija vezave patogena na DC-SIGN z ligandi/protitelesi s specifičnim PAMP (38), uporaba specifičnih vektorjev, ki kodirajo proteine patogena, s čimer povzročimo imunizacijo (42). Med naštetimi strategijami za najpreprostejšo in najobetavnejšo velja uporaba majhnih molekul antagonistov DC-SIGN-a. Kot tarča je DC-SIGN do danes bil potrjen le v in vitro eksperimentih, a je njegov potencial kljub temu nedvomen. (39, 41, 43, 44) Ligandi/atagonisti z visoko afiniteto bi omogočili potrditev DC-SIGN-a kot tarče tudi in vivo ter pomagali raziskati vse fiziološke funkcije tega lektina. Na žalost je afiniteta do monosaharidov nizka oziroma skromna, saj namesto običajnih nano- ali mikromolarnih koncentracij klasičnih terapevtsko uporabnih spojin pri interakcijah med monosaharidi in lektini tipa C govorimo o milimolarnih koncentracijah. V obzir je potrebno vzeti tudi polarnost morebitnih ogljikohidratnih učinkovin, zaradi česar imajo le-te slabe 12

21 farmakokinetične lastnosti. Glede na to, da pri spolnem odnosu do prvega kontakta med HIV-1 in DC-SIGN-om pride na sluznici, bi lahko antagoniste aplicirali topikalno, s čimer bi se izognili peroralni aplikaciji. (45) Tudi če famakokinetične lastnosti ne bi predstavljale težav, pa je načrtovanje terapevtsko uporabnih učinkovin še vedno velik izziv. Pri načrtovanju selektivnih antagonistov z visoko afiniteto so se uveljavili trije glavni pristopi (9): 1. načrtovanje monovalentnih glikomimetikov na osnovi oligosaharidov, ki jih veže DC-SIGN (glej sliko 8), Slika 8: Primera monovalentnih antagonistov na osnovi fukoze in manoze (46,47) 2. multimerna predstavitev monosaharidov, oligosaharidov in glikomimetikov (glej sliko 9), Slika 9: Primer polivalentnih antagonistov na osnovi dendronov (39) 13

22 3. virtualno rešetanje knjižnjic spojin, za iskanje antagonistov DC-SIGN-a, ki ne vsebujejo ogljikohidratnih struktur (glej sliko 10). Slika 10: Primeri antagonistov brez ogljikohidratnih struktur (48) Večina do sedaj v literaturi opisanih antagonistov DC-SIGN-a so molekule z ogljikohidratno strukturo. Ogljikovi hidrati so bili v znanstvenih krogih dolgo podcenjeni (49), vendar so nedavno pridobili veliko pozornosti, pri čemer je področje antagonistov DC-SIGN-a odličen primer renesanse v glikokemiji. 14

23 2. NAMEN DELA Namen našega dela je razviti, optimizirati in ovrednotiti popolnoma nov in vitro testni sistem za določanje afinitete antagonistov receptorja DC-SIGN. Testni sistem bo temeljil na tehniki modificiranega kompetitivnega encimskega imunskega testa. Preizkusili bomo različne izvedbe testnega sistema; različne možnosti označevanja naravnega liganda, zasnove testnega sistema in metode detekcije ter mikrotitrske ploščice različnih proizvajalcev. Testni sistem bomo ovrednotili z vidika ustrezne odzivnosti metode, robustnosti in ponovljivosti. Po optimizaciji vseh parametrov bomo razvit testni sistem uporabili za določevanje IC 50 potencialnih antagonistov, ki so bili sintetizirani na Fakulteti za farmacijo na Katedri za farmacevtsko kemijo in na oddelku za organsko in industrijsko kemijo Univerze v Milanu. Na koncu bomo testirane spojine še računalniško sidrali v vezavno mesto na receptorju DC-SIGN in tako napovedali konformacije potencialnih antagonistov in njihovo orientacijo v vezavnem mestu. S tem bomo želeli ne le ovrednotiti dobljene rezultate, temveč tudi postaviti racionalno osnovo za načrtovanje novih, močnejših antagonistov receptorja DC-SIGN. 15

24 3. MATERIALI IN METODE 3.1 MATERIALI REAGENTI IN TOPILA ANORGANSKI IN ORGANSKI REAGENTI CaCl 2 2H 2 O: kalcijev klorid dihidrat, M = 147,02 g/mol, proizvajalec Acros Organics, Belgium NaCl: natrijev klorid, M = 58,44 g/mol, proizvajalec Fisher Scientific, ZDA NaHCO 3 : natrijev hidrogenkarbonat, M = 84,01 g/mol, proizvajalec Merck KGaA, Nemčija Tris: tris (hidroksimetil)aminoetan, (CH 2 OH) 3 CNH 2, M = 121,14 g/mol, proizvajalec Fisher Scientific, ZDA Tween 20: polioksietilen-(20)-sorbitanmonolavrat, M = g/mol, proizvajalec Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija Vse zgoraj navedene reagente shranjujemo pri sobni temperaturi. FITC: fluorescein izotiocianat, izomer I, primeren za označevanje proteinov, M = 389,38 g/mol, proizvajalec Merck KGaA, Nemčija Shranjujemo pri 2-8 C. BIOKEMIJSKI REAGENTI Anti-biotin kozja poliklonska protitelesa konjugirana s hrenovo peroksidazo: protitelesa proti biotinu konjugirana s hrenovo peroksidazo, c = 0,5 mg/ml, proizvajalec Merck KGaA, Nemčija Shranjujemo pri 2-8 C. BSA: goveji serumski albumin, frakcija V, liofiliziran prašek, proizvajalec Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija Shranjujemo pri 2-8 C. DC-SIGN: DC-SIGN ECD, očiščen protein, vsebnost 100 µg, proizvedeno v laboratoriju dr. Francka Fieschi-a, Institut de Biologie Structurale (IBS), Francija 16

25 Shranjujemo v pufru 25 mm Tris (ph = 8), 150 mm NaCl, 4 mm Ca 2+ pri -70 C. DC-SIGN je pri omenjeni temperaturi stabilen, izogibati pa se moramo večkratnemu odmrzovanju in zamrzovanju, zato na začetku protein razdelimo na manjše alikvote in nato uporabljamo le-te. gp120-fitc: rekombinantni plaščni glikoprotein 120 virusa HIV-1, ekspresijski sistem: Baculovirus, konjugiran s FITC, c = 0,5 mg/l, proizvajalec American Research Products Inc. Tm, ZDA. Shranjujemo pri 2-8 C. gp120-hrp: rekombinantni plaščni glikoprotein 120 virusa HIV-1, ekspresijski sistem: Baculovirus, konjugiran s HRP, c = 0,5 mg/l, proizvajalec American Research Products Inc. Tm, ZDA. Shranjujemo pri 2-8 C. gp120: rekombinantni plaščni glikoprotein 120 virusa HIV-1, ekspresijski sistem: človeške celice, proizvajalec Sino Biological Inc., Kitajska Shranjujemo pri -70 C. NHS-biotin: biotin N-hidroksisukcinimid ester (C 14 H 19 N 3 O 5 S), M = 341,4 g/mol, proizvajalec Merck KgaA, Nemčija Shranjujemo pri 2-8 C. Reagent za kemiluminiscenco: BM kemiluminiscenčni ELISA substrat (POD), sestavljen iz reagenta A (pufrna raztopina, ki vsebuje luminol in 4-jodofenol) ter reagenta B (pufrna raztopina, ki vsebuje stabilizirano obliko H 2 O 2 ), proizvajalec Roche Diagnostics GmbH, Nemčija Shranjujemo pri 2-8 C. TOPILA Bidestilirana (Milli Q) voda: pripravljena s sistemom za čiščenje vode Milli-Q Advantage A10 (Millipore, ZDA) DMF: dimetilfomamid (C 3 H 7 NO), M = 73,10 g/mol, proizvajalec Carlo Erba Reagenti SpA, Italija DMSO: dimetulsulfoksid, (C 2 H 6 OS), M = 78,13 g/mol, proizvajalec Acros Organics, Belgija Vsa topila shranjujemo pri sobni temperaturi. 17

26 POTENCIALNI ANTAGONISTI DC-SIGN-A Za testiranja smo uporabljali potencialne antagoniste DC-SIGN-a sintetizirane na: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko kemijo: AAG-11, AAG-12, AAG-13, AAG-14, AAG-21, AAG-22, AAG-23, AKM-6, MP-1, TSZ-07, TSZ-15, TSZ-19, TSZ-20, TTD-09 Laboratoriji prof. dr. Anne Bernardi, Universita degli Studi di Milano, Dipartimento di Chimica Organica e Industriale, Milano, Italija: Man001, Man030 Pregled potencialnih antagonistov je zbran v preglednici III. Preglednica III: Testirani potencialni antagonisti DC-SIGN-a Oznaka Struktura M (g/mol) Oznaka Struktura M (g/mol) AAG ,17 AKM-6 AKM-6 AAG ,70 MP-1 MP-1 AAG ,59 TSZ-15 TSZ-15 AAG ,53 TSZ-19 TSZ-19 18

27 AAG ,19 TSZ-20 TSZ-20 AAG ,43 TTD-09 TTD-09 AAG ,53 Man001 Man001 TSZ ,48 Man030 Man OPREMA Mikropipete: 0,5-10 µl, µl in µl, proizvajalec Biohit Deutschland GmbH, Nemčija Elektronske mikropipete: 0,2-10 µl in µl, proizvajalec Biohit Deutschland GmbH, Nemčija Elektronske multipipete: µl, µl in µl, proizvajalec Biohit Deutschland GmbH, Nemčija Nastavki za pipetiranje: 10 µl, 350 µl, 1000 µl in 1200 µl, proizvajalec Biohit Deutschland GmbH, Nemčija 19

28 Mikrotitrske ploščice: - Nunc ploščice s 96 vdolbinicami za fluorescenco: PolySorp, 96 vdolbinic, polisteren (črne barve), proizvajalec Nunc GmbH & Co. KG, Nemčija - Nunc ploščice s 96 vdolbinicami za luminiscenco: PolySorp, 96 vdolbinic, polistiren (bele barve), proizvajalec Nunc GmbH & Co. KG, Nemčija - FLUOTRAC TM 600: 96 vdolbinic, polistiren (črne barve), za merjenje fluorescence, proizvajalec Greiner bio-one GmbH, Nemčija - LUMITRAC TM 600: 96 vdolbinic, polistiren (bele barve), za merjenje luminiscence, proizvajalec Greiner bio-one GmbH, Nemčija Graduirane plastične epruvete z zamaški: 5, 15 in 50 ml, proizvajalec TPP, Švica Bio-Pure kadičke za nanos z multipipeto: 25 in 50 ml, proizvajalec Diversified Biotech, ZDA Epice: 0,5 in 1,5 ml, proizvajalcev Eppendorf AG, Nemčija in Brand GmbH & Co.KG, Nemčija Plastične epruvetke z zamaški in stojalo zanje: 1 ml, prozvajalec Brand GmbH & Co.KG, Nemčija Dializni kit: - dializno črevo širine 25 mm, debeline 20 µm, MWCO: Nominal dializni kit ZelluTrans - proizvajalec Carl Roth, GmbH & Co., Nemčija Rokavice: vinilne rokavice brez smukca, prozvajalec Kimberly-Clark, ZDA Steklovina: erlenmajerice, čaše in steklenice različnih velikosti, kapalka z mešičkom APARATURE Analitska tehtnica: Mettler Toledo AG245 Avtoklav Bidestilator: Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System 20

29 Hibridni čitalec mikrotitrskih ploščic: Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader Hladilnik Magnetno mešalo Mešalo vorteks: Vibromix 10 Mini centrifuga: GMC-060 ph meter: Mettler Toledo MP220 Stresalnik Tehtnica: Mettler Toledo PB403-S Ultrazvočna kadička: Sonis 4 Zamrzovalnik 3.2 METODE IMUNOKEMIJSKE METODE Imunokemija ponuja enostavne, hitre, robustne a hkrati občutljive metode uporabne za rutinsko testiranje. V večini primerov je možna tudi avtomatizacija. Imunokemijske metode navadno ne zahtevajo obsežne in destruktivne predpriprave vzorca ter dragih aparatur. Večina metod temelji na enostavni foto-, fluoro- ali luminometrični detekciji. V zadnjem času pospešeno izpodrivajo kromatografske tehnike v klinični diagnostiki, saj ponujajo hitro detekcijo protiteles ali antigenov specifičnih za bakterijske, virusne ali parazitske okužbe, uporabne pa so tudi za diagnozo avtoimunskih bolezni. Testni sistemi temeljijo na visoko specifični vezavi med antigeni in protitelesi. Lahko se uporabljajo za kvantitativno ali kvalitativno analizo. (50) ENCIMSKO IMUNSKI TEST (ELISA) ELISA je diagnostično orodje, ki ga lahko uporabimo za detekcijo antigenov ali antigen-specifičnih protiteles v biološkem vzorcu. Običajno se uporablja v laboratorijih kot dodatek diagnostiki bakterijskih, virusnih in parazitskih okužb. Pri najpreprostejši obliki imobiliziramo antigene na mikrotitrsko ploščico. Zatem dodamo protitelesa, ki se vežejo 21

30 na antigene. Po spiranju nevezanih protiteles dodamo ligand, konjugiran z encimom, ki omogoči detekcijo. Po spiranju liganda, označenega z encimom, dodamo encimski substrat, zaradi katerega pride do vidne barvne spremembe. Intenziteta barve je neposredno odvisna od koncentracije antigena. Novejše oblike uporabljajo s fluoroforom ali encimom konjugirana protitelesa, s čimer se izboljša občutljivost testnega sistema. Različne izvedbe ELISA testa vključujejo indirektni in "sendvič" testni sistem. Pri indirektnem testnem sistemu na trdni nosilec imobiliziramo antigene, ki jih inkubiramo skupaj z neoznačenimi primarnimi protitelesi. Po spiranju nevezanih protiteles dodamo z encimom označena sekundarna protitelesa, ki se vežejo na primarna protitelesa. Ob dodatku encimskega substrata vidimo barvno spremembo. Pri "sendvič" ELISI pa na trdni nosilec imobiliziramo protitelesa, na katera se vežejo antigeni. Na te antigene se nato vežejo protitelesa konjugirana z encimom. Ob dodatku encimskega substrata vidimo barvno spremembo. (51) TESTNI SISTEM ZA DOLOČANJE AFINITETE ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN IN VITRO Za vzpostavitev testnega sistema za določanje afinitete antagonistov receptorja DC-SIGN uporabimo metodo, ki spada med ELISA testu podobne metode. Poteče na enak način kot ELISA test, razlika pa je v tem, da namesto protiteles uporabimo receptor, namesto antigenov pa ligand. Preizkusili smo štiri različne možnosti (predstavljene na sliki 11): 1. kot naravni ligand uporabimo s FITC označen gp120, 2. kot naravni ligand uporabimo s HRP označen gp120, 3. kot naravni ligand uporabimo gp120, ki ga sami konjugiramo s FITC, 4. kot naravni ligand uporabimo gp120, ki ga sami konjugiramo z biotinom. V vseh primerih kot trdni nosilec uporabimo mikrotitrsko ploščico, nanjo pa imobiliziramo receptor DC-SIGN. V fazi vzpostavitve sistema nato na ploščico po blokadi prostih vezavnih mest nanesemo raztopino naravnega liganda. V prvem in tretjem primeru po določeni inkubacijski dobi ploščico speremo, tako da na njej ostane le vezan ligand in s pomočjo fluorospektrometra izmerimo intenziteto fluorescence, ki korelira z jakostjo vezave označenega gp120 na DC-SIGN. V drugem primeru po spiranju dodamo substrat za peroksidazo kemiluminiscenčni reagent. Pri tem poteče reakcija razgradnje reagenta, ob 22

31 kateri se sprošča "hladna svetloba", ki jo lahko detektiramo z luminometrom. V četrtem primeru po spiranju na ploščico nanesemo protitelesa proti biotinu označena s peroksidazo. Po določeni inkubacijski dobi ploščico ponovno speremo, tako da na njej ostanejo le vezana protitelesa in dodamo kemiluminiscenčni reagent. Enako kot v drugem primeru tudi tukaj poteče reakcija razgradnje reagenta, ob kateri se sprošča "hladna svetloba", ki jo lahko detektiramo z luminometrom. V fazi določanja afinitete potencialnih antagonistov DC-SIGN-a, so skoraj vsi koraki enaki kot pri fazi vzpostavitve sistema. Edina razlika je pri nanosu raztopine naravnega liganda, kateremu v tej fazi dodamo volumsko enako količino potencialnega antagonista. Iz odziva nato določimo odstotek vezave naravnega liganda. Slika 11: Sheme potekov določanja afinitete vezave potencialnih antagonistov na DC-SIGN; a) shema možnosti 4, b) shema možnosti 2, c) shema možnosti 1 in 3. 23

32 3.2.3 KONJUGACIJA Z BIOTINOM (BIOTINILACIJA) Biotinilacija je proces pripenjanja biotina na proteine in druge makromolekule (glej sliko 12). Na voljo so različni reagenti za pripajanje biotina na določene funkcionalne skupine. V našem primeru uporabimo NHS-biotin, s katerim ciljamo amine, ki so najpogosteje ciljana funkcionalna skupina zaradi obilice prisotnih N-terminalnih α-aminov in ɛ-aminov na lizinu v stranskih verigah v večini proteinov. Pri konjugaciji se tvori amidna vez med z N-hidroksisukcinimidom (NHS) aktivirano karboksilno kislino biotina in amino skupino na proteinu, pri čemer izstopi NHS. (52) Slika 12: Biotinilacija proteina gp KONJUGACIJA S FITC Fluorescenca je oblika fotoluminiscence, ki se pojavi kot odziv fluorofora na absorbirano svetlobo, ki povzroči njegov prehod v višje energijsko stanje. Del absorbirane energije se porazgubi ob spremembah rotacijskih in vibracijskih stanj, del pa se je sprosti ob prehodu molekule nazaj v osnovno energijsko stanje, pri čemer emitira svetloba. Ker se nekaj absorbirane energije porazgubi, ima emitirana svetloba daljšo valovno dolžino in nižjo energijo od ekscitacijske. (53) Fluorescein izotiocianat je splošno uporabljan za pripenjanje fluorofora (fluoresceina) na proteine preko amino skupin. FITC reagira s terminalnimi in primarnimi amini v proteinih. Zaradi lažje izolacije v čisti obliki in posledično nižje cene za reakcijo uporabimo izomer I, ki ima izotiocianatno skupino na četrtem C-atomu v benzenovem obroču. (54) Shema reakcije je prikazana na sliki

33 Slika 13: Konjugacija proteina gp120 s FITC ENCIMSKO KATALIZIRANA REAKCIJA KEMILUMINISCENCE Peroksidaza navadnega hrena (HRP) v prisotnosti vodikovega peroksida katalizira oksidacijo diacilhidrazidov, kot je luminol (5-amino-2,3-dihidro-ftalazin-1,4-dion). Produkt reakcije (5-aminoftalat) je v višjem energijskem stanju in pri prehodu v osnovno energijsko stanje oddaja svetlobo (glej sliko 14). Oddajanje svetlobe lahko okrepimo z dodatkom ojačevalcev, kot je 4-jodofenol, ki deluje kot radikalski prenašalec med nastalim kisikovim radikalom in luminolom. (55) Slika 14: Encimsko katalizirana reakcija kemiluminiscence STATISTIČNE METODE VREDNOTENJE TESTNEGA SISTEMA Parametra, ki se običajno uporabljata za oceno ustreznosti testnega sistema: razmerje med odzivom in šumom (S/N razmerje) ter razmerje med odzivom in ozadjem (S/B razmerje), ne podata dovolj informacij za dejansko oceno ustreznosti. S/N razmerje nakazuje zgolj 25

34 stopnjo zaupanja, s katero lahko določen signal označimo kot odziv, ki ni posledica šuma, S/B razmerje pa ne vsebuje nobenih informacij o variabilnosti podatkov. Z'-faktor je statistični parameter, ki upošteva variabilnost podatkov, odziv ozadja in tudi dinamični razpon signala. Uporablja se za oceno ustreznosti testnega sistema pri njegovi postavitvi in optimizaciji. Izračunamo ga iz samih kontrolnih podatkov (pozitivna in negativna kontrola) po enačbi 1. Enačba 1 σ c+ - standardna deviacija odziva pozitivnih kontrol σ c- - standardna deviacija odziva negativnih kontrol µ c+ - povprečna vrednost odziva pozitivnih kontrol µ c- - povprečna vrednost odziva negativnih kontrol Želimo si, da je Z' vrednost med 0,5 in 1. Če je Z' vrednost majhna (negativna ali blizu ničle), nakazuje na to, da pogoji v testnem sistemu niso optimizirani, oziroma da testni sistem v dani obliki ni zmožen dajati uporabnih rezultatov. (56) INTERPRETACIJA REZULTATOV Rezultate meritev računalniško obdelamo in določimo vrednost IC 50 (koncentracija potencialnega antagonista, ki povzroči 50 % inhibicijo vezave naravnega agonista na receptor). Dobljene rezultate najprej obdelamo z računalniškim programom Microsoft Excel. Izračunamo povprečno vrednost meritev odziva za vsako koncentracijo potencialnega antagonista, standardno deviacijo meritev in standardno napako aritmetične sredine (SEM). Nato od dobljene povprečne vrednosti odštejemo povprečno vrednost odziva ozadja. Izračunamo še relativne vrednosti povprečnega odziva, pri čemer za 100 % določimo povprečno vrednost odziva pozitivne kontrole (označen naravni ligand z dodanim pufrom za ploščice brez antagonista). Podatke o relativni vrednosti odziva ob dodatku potencialnega antagonista za vse testirane koncentracije in izračunane SEM nato prenesemo v računalniški program Origin 8.0 (OriginLab Corporation). Najprej izdelamo graf, v katerem so koncentracije potencialnega antagonista predstavljene na abscisni osi, ki ima vrednosti predstavljene z logaritemsko skalo, relativna vrednost odziva pa je predstavljena na ordinatni osi. Program 26

35 nato izriše sigmoidno krivuljo, ki se podatkom najbolje prilega (za prileganje sigmoidne krivulje smo uporabljali logistično funkcijo brez obtežitve podatkov) eksperimentalno določenim vrednostim in izračuna, pri kateri koncentraciji potencialnega antagonista se nahaja prevoj krivulje, kar nam poda vrednost IC 50 ter determinacijski koeficient (R 2 ), ki nam pove kako dobro se izrisana sigmoidna krivulja prilega eksperimentalnim podatkom. T-TEST Za primerjavo dveh rezultatov enakega vzorca uporabimo t-test dveh neodvisnih vzorcev. Izvajamo ga z računalniškim programom Origin 8.0 (OriginLab Corporation). Tako analiziramo ali sta vrednosti dveh neodvisnih meritev enaki. Varianci med tema meritvama sta lahko enaki ali različni. Program nam poda p-vrednost za oba primera, kar tabelarično predstavimo tako, da najprej navedemo p-vrednost za primer, ko je privzeta enakost varianc, nato pa še s poševnim tekstom p-vrednost za primer, ko enakost varianc ni privzeta. ANOVA Za izračun meddnevne ponovljivosti uporabimo test analize variance (ANOVA). Uporabimo enoparametrično ANOVO, ki analizira ali so rezultati meritev dveh ali več vzorcev enaki. Za primerjavo vrednosti uporabimo Tukey-ev test, za izračun enakosti varianc pa Levene-ov test. Privzeta je normalna porazdelitev ter enakost varianc. Kot rezultat nam program poda p-vrednost. Kadar z ANOVO primerjamo samo dve meritvi, dobimo enake rezultate kot pri t-testu dveh neodvisnih vzorcev MOLEKULSKO SIDRANJE Proces molekulskega sidranja (angl. molecular docking) vključuje napoved konformacije liganda in njegovo orientacijo v vezavnem mestu. V splošnem obstajata dva cilja molekulskega sidranja: strukturno modeliranje in ocena afinitete ligandov. Identifikacija molekulskih lastnosti, ki so odgovorne za specifično biološko prepoznavo in napoved modifikacij, ki bi izboljšale to prepoznavo, sta kompleksna problema, ki sta pogosto 27

36 zahtevna za razumevanje in računalniško simulacijo. Zaradi tega sidranje poteka v več korakih. (57) Proces se prične z uporabo algoritmov za sidranje, ki umestijo različne konformacije iste majhne molekule v aktivno mesto. Ker tudi relativno enostavne organske molekule posedujejo mnogo konformacijskih prostostnih stopenj, že ta prvi korak predstavlja izziv, saj npr. vsaka prosto vrtljiva vez v molekuli pomeni eksponentno rast števila možnih konformacij. Identifikacija konformacije, ki se najbolje prilega strukturi receptorja, mora zato potekati dovolj hitro, da nam omogoča vrednotenje tisočerih različnih spojin, ki so na voljo ob posameznem sidranju. Algoritme dopolnjujejo cenilne funkcije, ki so zasnovane tako, da napovejo energijo interakcij z receptorjem (afiniteto) in od tod vrednost inhibicijskih konstant z vrednotenjem interakcij med spojinami in potencialnimi tarčami. (58) Cenilne funkcije lahko razdelimo na: cenilne funkcije, ki temeljijo na polju sil (force field-based): običajno upoštevajo prispevek energije interakcije med ligandom in receptorjem (van der Waalsove interakcije in elektrostatske interakcije) ter notranjo energijo liganda. Njihova pomanjkljivost je, da ne upoštevajo entropijskih in solvatacijskih prispevkov. Poleg tega te cenilne funkcije temeljijo na računanju potencialov na osnovi molekulske mehanike, kar je le približek kvantne mehanike, omogoča pa hiter izračun; empirične cenilne funkcije (empirical): temeljijo na eksperimentalno določenih kompleksih protein-ligand. Vezavno energijo liganda ocenjujejo kot uravnoteženo vsoto medsebojno nepovezanih členov (prispevki za vodikove vezi, hidrofobne interakcije). Njihova pomanjkljivost je vprašljiva robustnost in neupoštevanje entropijskih in solvatacijskih prispevkov; cenilne funkcije dobljene s pomočjo statistične mehanike (knowledge-based): poskušajo posnemati eksperimentalno določene strukture kompleksov protein-ligand. Pri tem izhajajo iz dejstva, da so razdalje med atomi v eksperimentalno določenih strukturah najugodnejše. Njihova slabost je to, da so izpeljane iz omejenega števila 3D struktur, vendar naraščanje števila le-teh omogoča njihovo nenehno izboljševanje. Težave pri molekulskem sidranju poleg slabosti cenilnih funkcij predstavljajo favoriziranje molekul z veliko molekulsko maso, neupoštevanje konformacijskih sprememb proteina, do katerih pride ob vezavi liganda v aktivno mesto in slaba ločljivost kristalnih struktur. (58, 59) 28

37 4. EKSPERIMENTALNO DELO Naše eksperimentalno delo lahko razdelimo na tri vsebinske sklope. Prvi sklop obsega načrtovanje in optimizacijo testnega sistema za določanje afinitete antagonistov receptorja DC-SIGN in vitro, drugi sklop zajema uporabo razvitega testnega sistema pri določanju jakosti novih potencialnih antagonistov DC-SIGN, v tretjem sklopu pa smo izvedli molekulsko sidranje ("molecular docking") testiranih potencialnih antagonistov. 4.1 SPLOŠNI POSTOPKI V tem poglavju so opisani postopki, ki smo jih potrebovali tako pri načrtovanju in optimizaciji kot tudi pri uporabi že razvitega testnega sistema. To vključuje postopke potrebne za pripravo izhodnih materialov in pa postopke, ki smo jih uporabljali med samo izvedbo testa PRIPRAVA PUFROV Pri eksperimentalnem delu smo uporabljali štiri vrste pufrov: pufer za ploščice, pufer za redčenje, pufer za spiranje in dializni pufer. Vsi pufri so vsebovali tris (c = 25 mm), natrijev klorid (c = 150 mm) in kalcijev klorid (c = 4 mm). Pufru za spiranje ploščic smo dodali še Tween 20, katerega končna V/V koncentracija je znašala 0,1 %. Potrebne količine posameznih sestavin smo izračunali glede na željen končni volumen pufra (V) po enačbi 2, volumen potrebnega Tweena 20 za dodatek pufru za spiranje pa po enačbi 3. Enačba 2 Enačba 3 Pufre smo pripravili tako, da smo izračunane količine reagentov natehtali v ustrezen vsebnik ter dopolnili z bidestilirano vodo do približno 90 % končnega volumna. Zaradi enostavnejše natehte smo si pred pripravo manjših količin pufrov pripravili raztopino Ca 2+ ionov z višjo koncentracijo in nato v pufer dodali ustrezno količino pripravljene raztopine. Ob mešanju z magnetnim mešalom smo nato s pomočjo razredčene raztopine 29

38 klorovodikove kisline ph pufra uravnali na 7,4. Za pripravo manjših količin pufrov smo uporabili 1 M HCl, za pripravo večjih količin pufrov pa 3 M HCl. Pufer smo po uravnavi ph-ja dopolnili do končnega volumna z bidestilirano vodo. PRIMERI IZRAČUNOV POTREBNIH KOLIČIN REAGENTOV ZA POSAMEZNE PUFRE (preglednice IV-VII) Preglednica IV: Izračun potrebnih količin reagentov za pripravo 45 ml pufra za ploščice oz. redčenje Reagent M (g/mol) c (mm) Masa (g) Tris 121, ,136 NaCl 58, ,394 CaCl 2 2H 2 O 147,02 4 (Ca 2+ ) 0,026 Preglednica V: Izračun potrebnih količin reagentov za pripravo 150 ml pufra za ploščice oz. redčenje Reagent M (g/mol) c (mm) Masa (g) Tris 121, ,454 NaCl 58, ,315 CaCl 2 2H 2 O 147,02 4 (Ca 2+ ) 0,088 Preglednica VI: Izračun potrebnih količin reagentov za pripravo 500 ml pufra za spiranje Reagent M (g/mol) Končna koncentracija Količina Tris 121,14 25 mm 1,514 g NaCl 58, mm 4,383 g CaCl 2 2H 2 O 147,02 4 mm (Ca 2+ ) 0,294 g Tween ,1 % (V/V) 0,5 ml Preglednica VII: Izračun potrebnih količin reagentov za pripravo 1000 ml dializnega pufra Reagent M (g/mol) c (mm) Masa (g) Tris 121, ,028 NaCl 58, ,766 CaCl 2 2H 2 O 147,02 4 (Ca 2+ ) 0, PRIPRAVA BIOTINILIRANEGA GP120 Naravni ligand plaščni glikoprotein 120 humanega virusa HIV-1 (gp120) smo biotinilirali ter tako ustvarili specifičen antigen za protitelesa proti biotinu konjugirana s hrenovo peroksidazo, ki katalizira kemiluminiscenčno reakcijo. Biotinilacijo smo izvajali po sledečem protokolu. 30

39 1. Priprava raztopine proteina gp120 v 0,05 M NaCl: pripravili smo 0,05 M raztopino NaCl; natehtali smo 0,146 g NaCl in ga raztopili v 50 ml bidestilirane vode. Natehtali smo 100 µg proteina gp120 in ga raztopili v 300 µl pripravljene raztopine. 2. Priprava raztopine NHS-biotina v DMF: natehtali smo 1 mg NHS-biotina in ga raztopili v 1 ml DMF-a. 3. Priprava reakcijske zmesi za biotinilacijo: najprej smo pripravili 1 M raztopino NaHCO 3 ; natehtali smo 2,1 g NaHCO 3 in ga raztopili v 25 ml bidestilirane vode. Nato smo pripravili reakcijsko zmes. Pri tem je bil pomemben vrstni red dodajanja reagentov: - najprej smo v bučko dodali 600 µl bidestilirane vode, - nato smo dodali 100 µl 1 M raztopine NaHCO 3, - zatem smo dodali 300 µl pripravljene raztopine gp120 v 0,05 M raztopini NaCl, - in na koncu še 100 µl pripravljene raztopine NHS-biotina v DMF. 4. Biotinilacija: Zmes smo ob rahlem mešanju inkubirali na vodni kopeli pri 30 C 1,5 h. 5. Dializa: dializa je bila namenjena ločevanju biotiniliranega gp120 od preostalega nevezanega NHS-biotina. Ta pri dializi zaradi koncentracijskega gradienta difundira skozi pore dializnega črevesa v dializni pufer. Najprej smo pripravili dializno črevo, tako da smo ga za nekaj minut namočili v dializni pufer. Nato smo črevo nataknili na plastični nastavek, ga zaprli na dnu (s stiščkom) in napolnili z raztopino biotiniliranega gp120. Napolnjeno dializno črevo smo potopili v 1 l erlenmajerico, napolnjeno z dializnim pufrom. Pufer smo rahlo mešali z magnetnim mešalom (črevo se ni smelo zvijati). Dializo smo izvajali 1 h. Postopek smo ponovili 3, vsakič s svežim dializnim pufrom. Po treh dializah smo dializno raztopino s stekleno kapalko prenesli v 15 ml plastično epruveto ter dopolnili s pufrom za redčenje do 5 ml. S tem smo dobili osnovno raztopino biotiniliranega gp120 z vsebnostjo izhodnega proteina 20 µg/ml. 6. Shranjevanje: Pripravljeno raztopino biotiniliranega gp120 smo hranili v hladilniku (2-8 C) PRIPRAVA GP120 KONJUGIRANEGA S FITC Naravni ligand plaščni glikoprotein 120 virusa HIV smo konjugirali s FITC ter tako ustvarili označen specifičen ligand za receptor DC-SIGN, kar nam je omogočilo 31

40 neposredno detekcijo gp120, ki se je vezal na receptor. Konjugacijo s FITC smo izvajali po sledečem protokolu: 1. Priprava pufra za redčenje: konjugacija proteina s FITC poteka v bazičnem okolju, zaradi česar smo ph pripravljenega pufra za redčenje za potrebe priprave konjugiranega gp120 uravnali na Priprava raztopine FITC v DMSO: tik pred uporabo smo pripravili raztopino s koncentracijo 0,5 mg/ml; natehtali smo 2,8 mg FITC in ga raztopili v 6,6 ml DMSO. 3. Priprava raztopine proteina gp120: 50 µg plaščnega glikoproteina 120 smo raztopili v 100 µl pripravljenega pufra za redčenje (ph = 9). 4. Priprava reakcijske zmesi za konjugacijo: raztopini gp120 smo ob mešanju postopoma dodali 10 µl pripravljene raztopine FITC. S tem smo v reakcijski zmesi dosegli razmerje FITC:gp120 = 1: Konjugacija: reakcijsko zmes smo zaščitili pred svetlobo (produkt reakcije je fotolabilen) in jo ob rahlem mešanju inkubirali na vodni kopeli pri 30 C 1,5 h. 6. Dializa: dializa je namenjena ločevanju gp120 konjugiranega s fluoresceinom od preostalega nevezanega FITC. Ta pri dializi zaradi koncentracijskega gradienta difundira skozi pore dializnega črevesa v dializni pufer. Pred dializo smo raztopino konjugiranega gp120 razredčili na 1 ml z uporabo pufra za redčenje (ph = 7,4). Pripravili smo dializno črevo, tako da smo ga za nekaj minut namočili v dializni pufer. Nato smo črevo nataknili na plastični nastavek, ga zaprli na dnu (s stiščkom) in napolnili z raztopino konjugiranega gp120. Napolnjeno dializno črevo smo potopili v 1 l erlenmajerico napolnjeno z dializnim pufrom in zaščiteno pred svetlobo. Pufer smo rahlo mešali z magnetnim mešalom (črevo se ni smelo zvijati). Dializo smo izvajali 1 h. Postopek smo ponovili 3, vsakič s svežim dializnim pufrom. Po treh dializah smo dializno raztopino s stekleno kapalko prenesli v 15 ml plastično epruveto. S tem smo dobili osnovno raztopino konjugiranega gp120 z vsebnostjo izhodnega proteina 50 µg/ml. 7. Shranjevanje: pripravljeno raztopino konjugiranega gp120 smo hranili zaščiteno pred svetlobo v hladilniku (2-8 C). 32

41 4.1.4 SPIRANJE MIKROTITRSKIH PLOŠČIC Po vsakem koraku v postopku načrtovanja in optimizacije testnega sistema ter določanja afinitete potencialnih antagonistov receptorja DC-SIGN smo mikrotitrske ploščice spirali. S tem smo odstranili zaostale reagente. Po inkubaciji smo najprej izlili raztopino iz vdolbinic tako, da smo ploščico sunkovito obrnili in z ostrimi zamahi iztresli zaostalo raztopino. Nato smo v vdolbinice odpipetirali po 300 µl pufra za spiranje in ploščico stresali 5 min. Postopek smo ponovili 3, vsakič s svežim pufrom za spiranje. Po zadnjem spiranju smo ploščico tik pred nadaljnjo uporabo dodobra osušili s sunkovitimi zamahi VEZAVA ECD RECEPTORJA DC-SIGN NA MIKROTITRSKE PLOŠČICE ECD receptor DC-SIGN smo hranili v zamrzovalniku pri -70 C. Predhodno smo protein razdelili na manjše alikvote (4 µg v vsako Eppendorfovo epruveto) in nato uporabljali le-te. Tako smo se izognili večkratnemu odmrzovanju in zamrzovanju proteina. Željeno količino ECD receptorja DC-SIGN smo segreli na sobno temperaturo, ga kvantitativno prenesli v 15 ml plastično epruveto, dopolnili s pufrom za redčenje do 10,2 ml in raztopino previdno premešali. V vdolbinice na mikrotitrski ploščici smo s pomočjo elektronske multipipete nanesli po 100 µl pripravljene raztopine. Ploščico smo rahlo potresli, s čimer smo se znebili morebitnih zračnih mehurčkov v vdolbinicah, nato pa smo jo čez noč (12-24 h) inkubirali v hladilniku (2-8 C), pri čemer je potekla vezava receptorja na ploščico BLOKIRANJE PROSTIH VEZAVNIH MEST NA MIKROTITRSKIH PLOŠČICAH Za eno mikrotitrsko ploščico smo si pripravili 25 ml raztopine BSA s koncentracijo 0,01 g/ml (1 %). V 50 ml plastično graduirano epruveto z zamaškom smo natehtali 250 mg 33

42 BSA in dopolnili s pufrom za redčenje do 25 ml. Raztopino smo previdno premešali, saj bi se ob intenzivnem mešanju preveč spenila. Na ploščico smo nanesli po 200 µl pripravljene raztopine na vdolbinico in inkubirali na stresalniku pri sobni temperaturi 1 h. Pri tem se je BSA vezal na preostala prosta vezavna mesta na ploščici in s tem preprečil kovalentno vezavo naravnega liganda na mikrotitrsko ploščico. Na ta način smo izboljšali občutljivost metode PRIPRAVA IN NANOS RAZTOPIN POTENCIALNIH ANTAGONISTOV IN OZNAČENEGA NARAVNEGA LIGANDA V fazi načrtovanja in optimizacije testnega sistema smo v vdolbinice na mikrotitrski ploščici nanašali po 50 µl pufra za ploščice. Temu smo dodali 50 µl pripravljene raztopine označenega naravnega liganda in nato ploščico inkubirali na stresalniku pri sobnih pogojih 2 h. Pri določanju afinitete potencialnih antagonistov smo v vdolbinice na mikrotitrski ploščici nanašali po 50 µl pripravljenih raztopin potencialnih antagonistov. V čim krajšem časovnem razmiku smo nato na ploščico nanesli še po 50 µl pripravljene raztopine označenega liganda in nato tako kot v prvem primeru ploščico inkubirali na stresalniku pri sobnih pogojih 2 h PRIPRAVA IN NANOS PROTITELES, KONJUGIRANIH S PEROKSIDAZO Pred pripravo raztopine protiteles, konjugiranih s peroksidazo, smo sterilizirali nastavke za pipete v avtoklavu (30 min, 121 C). S tem smo preprečili kontaminacijo izvorne raztopine protiteles. V 15 ml plastično epruveto smo odpipetirali 1,2 ml predhodno pripravljene 1 % raztopine BSA in dopolnili do 12 ml s pufrom za redčenje. S tem smo dobili 0,1 % raztopino BSA. S sterilnim nastavkom za pipete smo raztopini BSA dodali 20 µl anti-biotin kozjih poliklonskih protiteles konjugiranih s peroksidazo. V vsako vdolbinico na mikrotitrski 34

43 ploščici smo odpipetirali po 100 µl tako pripravljene raztopine. Ploščico smo nato inkubirali na stresalniku pri sobnih pogojih 1 h PRIPRAVA IN NANOS KEMILUMINISCENČNEGA REAGENTA TER MERJENJE KEMILUMINISCENCE Med spiranjem ploščice smo pripravili kemiluminiscenčni reagent. Za eno ploščico smo v plastično epruveto odpipetirali 6 ml reagenta A (pufrna raztopina, ki vsebuje luminol in 4-jodofenol) ter 60 µl reagenta B (pufrna raztopina, ki vsebuje stabilizirano obliko H 2 O 2 ). Epruveto smo zaščitili pred svetlobo in raztopino mešali z magnetnim mešalom 15 min. V vsako vdolbinico na mikrotitrski ploščici smo nanesli po 50 µl pripravljenega reagenta. Zatem smo ploščico še nekaj časa rahlo stresali, dokler se ni vzpostavilo stacionarno stanje kemiluminiscenčne reakcije ter nato opravili meritev. Kemiluminiscenco smo merili s hibridnim čitalcem mikrotitrskih ploščic BioTek Synergy H4. Pred prvo meritvijo smo v programu Gen5 TM definirali protokol, po katerem se je meritev izvajala. Za vsako ploščico smo izvedli tri meritve v časovnih razmikih 5 min, kot rezultat pa upoštevali njihovo povprečje. Meritve so morale biti izvedene znotraj 30 min po nanosu reagenta. 4.2 NAČRTOVANJE IN OPTIMIZACIJA TESTNEGA SISTEMA Načrtovanja testnega sistema smo se lotili sistematično. Preizkusili smo mikrotitrske ploščice različnih proizvajalcev, različne možnosti označevanja naravnega liganda, zasnove testnega sistema in metode detekcije. Preizkusili smo štiri testne sisteme: 5. TESTNI SISTEM 1: kot naravni ligand smo uporabili s FITC označen gp120, 6. TESTNI SISTEM 2: kot naravni ligand smo uporabili s HRP označen gp120, 7. TESTNI SISTEM 3: kot naravni ligand smo uporabili gp120, ki smo ga sami konjugirali s FITC, 8. TESTNI SISTEM 4: kot naravni ligand smo uporabili gp120, ki smo ga sami konjugirali z biotinom. 35

44 Postavljene testne sisteme smo preizkusili v praksi, jih ovrednotili z vidika ustrezne odzivnosti metode, robustnosti, natančnosti in ponovljivosti ter rezultate primerjali med seboj TESTNI SISTEM 1 V testnem sistemu 1 smo kot naravni ligand uporabili s fluoresceinom označen gp120 (ekspresijski sistem: Baculovirus) proizvajalca American Research Products Inc. Tm (ZDA). Zasnovo testnega sistema prikazuje slika 11c. Postopek vrednotenja je vseboval naslednje stopnje: priprava pufrov za ploščice, redčenje in spiranje, priprava mikrotitrskih ploščic z vezano ECD receptorja DC-SIGN: preizkusili smo ploščici proizvajalcev Nunc GmbH & Co. KG (Nemčija) in Greiner bio-one GmbH (Nemčija). Testni sistem smo ovrednotili pri dveh različnih koncentracijah ECD receptorja DC-SIGN, in sicer 2 µg/10,2 ml (v stolpcih 1, 2 in 3) ter 4 µg/10,2 ml (v stolpcih 4, 5 in 6); blokiranje prostih vezavnih mest na mikrotitrskih ploščicah, priprava in nanos raztopin označenega naravnega liganda: 5 µl osnovne raztopine s fluoresceinom konjugiranega gp120 (c = 0,5 mg/ml) smo razredčili na 1,25 ml ter tako dobili prvo raztopino za nanos na ploščici (c = 2 µg/ml). Na ploščici smo nanesli padajoče koncentracije označenega liganda; v vsaki naslednji vrstici je bila koncentracija liganda za polovico manjša kot v prejšnji (glej sliko 15). Vsako koncentracijo smo nanesli v treh paralelkah. Ker smo pred tem v vsako vdolbinico nanesli po 50 µl pufra za ploščice je končna koncentracija označenega naravnega liganda na ploščicah za polovico manjša od nanesene. V vrstici H se je nahajala negativna kontrola, kar pomeni, da smo v vdolbinice nanesli samo pufer za ploščice; merjenje fluorescence: pred samim merjenjem fluorescence smo na ploščici v vsako vdolbinico nanesli po 50 µl pufra za ploščice. Nato smo fluorescenco merili s hibridnim čitalcem mikrotitrskih ploščic Synergy H4. Pri meritvi smo uporabili ekscitacijsko svetlobo valovne dolžine 495 nm, emitirano svetlobo pa smo detektirali pri valovni dolžini 525 nm. V primeru ploščice Nunc smo meritve 36

45 izvajali v načinu "high" (kot referenčno vrednost smo fiksirali odziv vdolbinic, pri katerih smo pričakovali najvišji odziv), v primeru ploščice Greiner pa v načinu "low" (kot referenčno vrednost smo fiksirali odziv negativne kontrole) A gp120-fitc (1 µg/ml) gp120-fitc (1 µg/ml) B gp120-fitc (0,5 µg/ml) gp120-fitc (0,5 µg/ml) C gp120-fitc (0,25 µg/ml) gp120-fitc (0,25 µg/ml) D gp120-fitc (0,125 µg/ml) gp120-fitc (0,125 µg/ml) E gp120-fitc (0,063 µg/ml) gp120-fitc (0,063 µg/ml) F gp120-fitc (0,031 µg/ml) gp120-fitc (0,031 µg/ml) G gp120-fitc (0,016 µg/ml) gp120-fitc (0,016 µg/ml) H NEGATIVNA KONTROLA NEGATIVNA KONTROLA Slika 15: Shema mikrotitrske ploščice po nanosu pufra za ploščice in gp120 konjugiranega s fluoresceinom TESTNI SISTEM 2 V testnem sistemu 2 smo kot naravni ligand uporabili gp120 (ekspresijski sistem: Baculovirus) konjugiran s peroksidazo navadnega hrena proizvajalca American Research Products Inc. Tm (ZDA). Zasnovo testnega sistema prikazuje slika 11b. Postopek vrednotenja je vseboval naslednje stopnje: priprava pufrov za ploščice, redčenje in spiranje, priprava mikrotitrskih ploščic z vezano ECD receptorja DC-SIGN: preizkusili smo ploščici proizvajalcev Nunc GmbH & Co. KG (Nemčija) in Greiner bio-one GmbH (Nemčija). Testni sistem smo ovrednotili pri dveh različnih koncentracijah nanesene (po 50 µl na vdolbinico) raztopine ECD receptorja DC-SIGN, in sicer 2 µg/10,2 ml (v stolpcih 1, 2 in 3) ter 4 µg/10,2 ml (v stolpcih 4, 5 in 6); blokiranje prostih vezavnih mest na mikrotitrskih ploščicah, priprava in nanos raztopin označenega naravnega liganda: 4 µl osnovne raztopine s HRP konjugiranega gp120 (c = 0,5 mg/ml) smo razredčili na 1 ml ter tako dobili prvo raztopino za nanos na ploščici (c = 2 µg/ml). Na ploščici smo nanesli padajoče koncentracije označenega liganda; v vsaki naslednji vrstici je bila koncentracija liganda za polovico manjša kot v prejšnji (glej sliko 16). Vsako koncentracijo smo nanesli v treh paralelkah. Ker smo pred tem v vsako vdolbinico 37

46 nanesli po 50 µl pufra za ploščice je končna koncentracija označenega naravnega liganda na ploščicah za polovico manjša od nanesene. V vrstici H se je nahajala negativna kontrola, kar pomeni, da smo v vdolbinice nanesli samo pufer za ploščice; priprava in nanos kemiluminiscenčnega reagenta ter merjenje kemiluminiscence A gp120-hrp (1 µg/ml) gp120-hrp (1 µg/ml) B gp120-hrp (0,5 µg/ml) gp120-hrp (0,5 µg/ml) C gp120-hrp (0,25 µg/ml) gp120-hrp (0,25 µg/ml) D gp120-hrp (0,125 µg/ml) gp120-hrp (0,125 µg/ml) E gp120-hrp (0,063 µg/ml) gp120-hrp (0,063 µg/ml) F gp120-hrp (0,031 µg/ml) gp120-hrp (0,031 µg/ml) G gp120-hrp (0,016 µg/ml) gp120-hrp (0,016 µg/ml) H NEGATIVNA KONTROLA NEGATIVNA KONTROLA Slika 16: Shema mikrotitrske ploščice po nanosu pufra za ploščice in gp120 konjugiranega s HRP TESTNI SISTEM 3 V testnem sistemu 3 smo kot naravni ligand uporabili gp120 (ekspresijski sistem: človeške celice) proizvajalca Sino Biological Inc. (Kitajska), ki smo ga sami konjugirali s FITC. Zasnovo testnega sistema prikazuje slika 11c. Postopek vrednotenja je vseboval naslednje stopnje: priprava pufrov za ploščice, redčenje in spiranje, priprava mikrotitrske ploščice z vezano ECD receptorja DC-SIGN: za vrednotenje testnega sistema 3 smo uporabili mikrotitrsko ploščico proizvajalca Greiner bio-one GmbH (Nemčija). V vse vdolbinice na ploščici smo nanesli po 100 µl raztopine receptorja ECD DC-SIGN s koncentracijo 4 µg/ml; blokiranje prostih vezavnih mest na mikrotitrskih ploščicah, priprava in nanos raztopin označenega naravnega liganda: v 5 ml plastično epruveto smo odpipetirali 120 µl osnovne raztopine s fluoresceinom označenega gp120 ter dopolnili s pufrom za redčenje do 2,4 ml. S tem smo dobili raztopino s koncentracijo izhodnega proteina 2,5 µg/ml. To raztopino smo nato redčili 2 in 38

47 postopek ponovili še enkrat. S tem smo dobili raztopini s koncentracijama izhodnega proteina 1,25 µg/ml in 0,625 µg/ml. Pripravljene raztopine smo nanesli na ploščico (po 50 µl na vdolbinico); prvo raztopino v stolpce 1, 2 in 3; drugo raztopino v stolpce 4, 5 in 6; tretjo raztopino v stolpce 7, 8 in 9; stolpci 10, 11 in 12 so služili kot negativna kontrola (vanje smo nanesli pufer za ploščice). Ker smo pred tem v vsako vdolbinico nanesli po 50 µl pufra za ploščice, je končna koncentracija označenega naravnega liganda na ploščicah za polovico manjša od nanesene (glej sliko 17); merjenje fluorescence: pred samim merjenjem fluorescence smo na ploščici v vsako vdolbinico nanesli po 50 µl pufra za ploščice. Nato smo fluorescenco merili s hibridnim čitalcem mikrotitrskih ploščic Synergy H4. Pri meritvi smo uporabili ekscitacijsko svetlobo valovne dolžine 495 nm, emitirano svetlobo pa smo detektirali pri valovni dolžini 525 nm. A B C D E F G H gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA gp120-fitc (1,25 ug/ml) gp120-fitc (0,625 ug/ml) gp120-fitc (0,312 ug/ml) NEGATIVNA KONTROLA Slika 17: Shema mikrotitrske ploščice po nanosu pufra za ploščice in gp120 konjugiranega s fluoresceinom TESTNI SISTEM 4 V testnem sistemu 4 smo kot naravni ligand uporabili gp120 (ekspresijski sistem: človeške celice) proizvajalca Sino Biological Inc. (Kitajska), ki smo ga sami konjugirali z NHS-biotinom. Zasnovo testnega sistema prikazuje slika 11a. Postopek vrednotenja je vedno vseboval naslednje stopnje: priprava pufrov za ploščice, redčenje in spiranje, priprava mikrotitrske ploščice z vezano ECD receptorja DC-SIGN, blokiranje prostih vezavnih mest na mikrotitrskih ploščicah, 39

48 priprava in nanos raztopin označenega naravnega liganda oziroma priprava in nanos raztopin potencialnih antagonistov in označenega naravnega liganda, priprava in nanos protiteles konjugiranih s peroksidazo, priprava in nanos kemiluminiscenčnega reagenta ter merjenje kemiluminiscence. OPTIMIZACIJA TESTNEGA SISTEMA Za optimizacijo testnega sistema 4 smo uporabili mikrotitrsko ploščico LUMITRAC TM 600 (bele barve) proizvajalca Greiner bio-one GmbH (Nemčija). V vdolbinice smo nanesli po 100 µl raztopine ECD receptorja DC-SIGN, in sicer: - v stolpce 1, 2 in 3 s koncentracijo 8 µg/10,2 ml, - v stolpce 4, 5 in 6 s koncentracijo 4 µg/10,2 ml, - v stolpce 7, 8 in 9 s koncentracijo 2 µg/10,2 ml. V stolpce 10, 11 in 12 smo nanesli pufer za ploščice tako smo ocenili odstotek nespecifične vezave naravnega liganda na ploščico. Kot prvo raztopino za nanos na ploščico smo uporabili osnovno raztopino z biotinom označenega gp120 s koncentracijo izhodnega gp µg/ml. Na ploščico smo nanesli padajoče koncentracije označenega liganda; v vsaki naslednji vrstici je bila koncentracija liganda za polovico manjša kot v prejšnji (glej sliko 18). Vsako koncentracijo smo nanesli v treh paralelkah. Ker smo pred tem v vsako vdolbinico nanesli po 50 µl pufra za ploščice, je končna koncentracija označenega naravnega liganda na ploščicah za polovico manjša od nanesene. V vrstici H se je nahajala negativna kontrola, kar pomeni, da smo v vdolbinice nanesli samo pufer za ploščice A gp120-biotin (10 ug/ml) gp120-biotin (10 ug/ml) gp120-biotin (10 ug/ml) gp120-biotin (10 ug/ml) B gp120-biotin (5 ug/ml) gp120-biotin (5 ug/ml) gp120-biotin (5 ug/ml) gp120-biotin (5 ug/ml) C gp120-biotin (2,5 ug/ml) gp120-biotin (2,5 ug/ml) gp120-biotin (2,5 ug/ml) gp120-biotin (2,5 ug/ml) D gp120-biotin (1,25 ug/ml) gp120-biotin (1,25 ug/ml) gp120-biotin (1,25 ug/ml) gp120-biotin (1,25 ug/ml) E gp120-biotin (0,625 ug/ml) gp120-biotin (0,625 ug/ml) gp120-biotin (0,625 ug/ml) gp120-biotin (0,625 ug/ml) F gp120-biotin (0,312 ug/ml) gp120-biotin (0,312 ug/ml) gp120-biotin (0,312 ug/ml) gp120-biotin (0,312 ug/ml) G gp120-biotin (0,156 ug/ml) gp120-biotin (0,156 ug/ml) gp120-biotin (0,156 ug/ml) gp120-biotin (0,156 ug/ml) H NEGATIVNA KONTROLA NEGATIVNA KONTROLA NEGATIVNA KONTROLA NEGATIVNA KONTROLA Slika 18: Shema mikrotitrske ploščice po nanosu pufra za ploščice in gp120 označenega z biotinom 40

49 PRIMERNOST TESTNEGA SISTEMA 4 ZA DOLOČANJE AFINITETE POTENCIALNIH ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN Po določitvi najustreznejših koncentracij biotiniliranega gp120 za nanos na ploščico, smo s tema koncentracijama ocenili primernost testnega sistema za določanje afinitete antagonistom. V ta namen smo uporabili znan antagonist receptorja DC-SIGN fukozo. Mikrotitrsko ploščico smo prevlekli z raztopino ECD receptorja DC-SIGN s koncentracijo 8 µg/ml. Za nanos na ploščico smo pripravili raztopini biotiniliranega gp120 s koncentracijama 2,5 µg/ml (za stolpce 1-6) in 1,25 µg/ml (za stolpce 7-12) ter osnovni raztopini fukoze s koncentracijama 200 mm (nanos v prvo vrstico) in 60 mm (nanos v drugo vrstico). Na ploščico smo nanesli padajoče koncentracije raztopin fukoze (po 50 µl na vdolbinico), pri čemer smo osnovni raztopini za vsak naslednji nanos redčili 10. Končne koncentracije po dodatku 50 µl pripravljenih raztopin biotiniliranega gp120, ki smo ju dodali v čim krajšem časovnem razmiku po nanosu raztopin fukoze, prikazuje slika 19. Vdolbinice H1-H3 in H7-H9 so služile kot pozitivna kontrola (vanje smo nanesli 50 µl raztopine biotiniliranega gp120 in 50 µl pufra za ploščice), vdolbinice A4-A6 in A10-A12 pa kot negativna kontrola (vanje smo nanesli samo 100 µl pufra za ploščice) A Fukoza (100 Mm) NEGATIVNA KONTROLA Fukoza (100 Mm) NEGATIVNA KONTROLA B Fukoza (30 Mm) Fukoza (100 Mm) Fukoza (30 Mm) Fukoza (100 Mm) C Fukoza (10 Mm) Fukoza (30 Mm) Fukoza (10 Mm) Fukoza (30 Mm) D Fukoza (3 Mm) Fukoza (10 Mm) Fukoza (3 Mm) Fukoza (10 Mm) E Fukoza (1 Mm) Fukoza (3 Mm) Fukoza (1 Mm) Fukoza (3 Mm) F Fukoza (0,3 Mm) Fukoza (1 Mm) Fukoza (0,3 Mm) Fukoza (1 Mm) G Fukoza (0,1 Mm) Fukoza (0,3 Mm) Fukoza (0,1 Mm) Fukoza (0,3 Mm) H POZITIVNA KONTROLA Fukoza (0,1 Mm) POZITIVNA KONTROLA Fukoza (0,1 Mm) Slika 19: Shema mikrotitrske ploščice po nanosu raztopin fukoze, biotiniliranega gp120 in pufra za ploščice VPLIV TWEEN-a 20 NA DOLOČANJE IC 50 Pripravljeno osnovno raztopino biotiniliranega gp120 lahko stabiliziramo z dodatkom površinsko aktivne snovi. Zaradi tega smo ovrednotili vpliv površinsko aktivne snovi TWEEN 20 na določen IC 50. To smo storili tako, da smo pripravili ploščico proizvajalca 41

50 Greiner bio-one GmbH (Nemčija) s postavitvijo, kot jo prikazuje slika 20. V stolpcih 1-6 smo uporabili raztopino biotiniliranega gp120 stabilizirano s TWEEN-om 20, v stolpcih 7-12 pa nestabilizirano raztopino biotiniliranega gp A NEGATIVNA KONTROLA NEGATIVNA KONTROLA B FUKOZA (100 Mm) FUKOZA (100 Mm) C FUKOZA (30 Mm) FUKOZA (30 Mm) D FUKOZA (10 Mm) FUKOZA (10 Mm) E FUKOZA (3 Mm) FUKOZA (3 Mm) F FUKOZA (1 Mm) FUKOZA (1 Mm) G FUKOZA (0,3 Mm) FUKOZA (0,3 Mm) H FUKOZA (0,1 Mm) POZITIVNA KONTROLA FUKOZA (0,1 Mm) POZITIVNA KONTROLA Slika 20: Shema mikrotitrske ploščice pri vrednotenju vpliva TWEEN-a 20 Koncentracija raztopine ECD receptorja DC-SIGN, s katero smo prevlekli ploščico, je bila 4 µg/10,2 ml, koncentracija raztopine uporabljenega naravnega liganda pa je bila 1,25 µg/ml. Kot antagonist receptorja DC-SIGN smo uporabili fukozo. Vdolbinice A1-A3 in A7-A9 so služile kot negativna kontrola, vdolbinice H4-H6 in H10-H12 pa kot pozitivna kontrola. VPLIV DMSO NA DOLOČANJE IC 50 Osnovne raztopine potencialnih antagonistov (t.i. "stock solution") smo pripravljali v DMSO. Koncentracija le-tega v raztopini, ki smo jo nanesli na ploščico, je odvisna od redčitev osnovne raztopine. Zaradi tega smo ovrednotili, kako koncentracija DMSO vpliva na določen IC 50. Na ploščico smo v tri stolpce v vsako vdolbinico nanesli po 50 µl 10 mm raztopine fukoze v pufru za redčenje, nato pa smo nanesli še naraščajoče koncentracije DMSO (po 50 µl v vsako vdolbinico v vrstici). Končne koncentracije DMSO na ploščici prikazuje slika 21. Koncentracija raztopine receptorja DC-SIGN, s katero smo prevlekli ploščico, je bila 4 µg/10,2 ml, koncentracija raztopine uporabljenega naravnega liganda pa je bila 1,25 µg/ml. Vdolbinice A1-A3 so služile kot negativna kontrola, vdolbinice H4-H6 pa kot pozitivna kontrola. 42

51 A NEGATIVNA KONTROLA B 0 % DMSO C 7,5 % DMSO D 15 % DMSO E 22,5 % DMSO F 30 % DMSO G 40 % DMSO H 50 % DMSO POZITIVNA KONTROLA Slika 21: Shema mikrotitrske ploščice pri vrednotenju vpliva DMSO 4.3 DOLOČANJE AFINITETE POTENCIALNIH ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN Glede na rezultate pri načrtovanju in optimizaciji testnega sistema, smo se odločili, da za določanje afinitete potencialnih antagonistov uporabimo testni sistem 4. Določanje IC 50 potencialnih antagonistov smo izvajali v dveh stopnjah; najprej smo izvedli presejalni test, nato pa še test za točno določitev IC 50. PRESEJALNI TEST Pri presejalnem testu smo na ploščico v treh paralelkah nanesli potencialne antagoniste receptorja DC-SIGN v dveh različnih koncentracijah; 5 in 0,5 mm. Na ploščico smo kot referenco v treh paralelkah nanesli tudi raztopino fukoze s koncentracijo 3 mm. Kot negativno kontrolo smo v vdolbinice nanesli 100 µl pufra za ploščice, kot pozitivno kontrolo pa 50 µl pufra za ploščice in 50 µl raztopine biotiniliranega gp120. Za izvajanje presejalnih testov smo uporabljali raztopino ECD receptorja DC-SIGN s koncentracijo 4 µg/ml in raztopino biotiniliranega gp120 s koncentracijo 1,25 µg/ml. S presejalnimi testi smo za vsak potencialni antagonist določili približno koncentracijsko območje, v katerem se je nahajal njegov IC 50 in na podlagi teh rezultatov izvajali nadaljnje testiranje. 43

52 Začetna raztopina Redčitev 1 Redčitev 2 Redčitev 3 Redčitev 4 Redčitev 5 Redčitev 6 David Hajšek DOLOČANJE AFINITETE POTENCIALNIH ANTAGONISTOV Po presejalnem testu smo se lotili določanja točnega IC 50 potencialnih antagonistov. Ploščico smo prevlekli z raztopino ECD receptorja DC-SIGN s koncentracijo 4 µg/10,2 ml. Nato smo pripravili raztopine potencialnih antagonistov in fukoze za nanos na ploščico. Postopek redčenja osnovnih raztopin prikazuje slika redčitev 10 redčitev 10 redčitev 3,33 redčitev 10 redčitev 10 redčitev Slika 22: Shema priprave raztopin potencialnih antagonistov za nanos na ploščico V primeru slabe topnosti spojin smo se priprave raztopin za nanos na ploščico lotili nekoliko drugače. Tako začetno raztopino kot tudi redčitve (do koncentracije, pri katerih se je spojina raztopila), smo pripravljali tako, da smo osnovno raztopino (50 mm v DMSO) redčili s pufrom za redčenje do želenih koncentracij. Če spojina ni bila topna pri želeni koncentraciji, smo kot začetno koncentracijo izbrali tisto, pri kateri se je spojina raztopila. Koncentracije začetnih raztopin potencialnih antagonistov so bile odvisne od rezultatov presejalnega testa, koncentracija osnovne raztopine fukoze pa je bila vedno 200 mm. Na mikrotitrsko ploščico smo v treh paralelkah nanesli po 50 µl pripravljenih raztopin na vdolbinico. Na eni ploščici smo imeli dovolj prostora za določanje afinitete treh potencialnih antagonistov (v stolpcih 1-9), v zadnje tri stolpce pa smo kot referenco za določen IC 50 vedno nanašali raztopine fukoze. Shema ploščice po nanosu raztopin potencialnih antagonistov in fukoze je prikazana na sliki 23. Nato smo v čim krajšem časovnem razmiku v vdolbinice na ploščici nanesli še po 50 µl raztopine biotiniliranega gp120 s koncentracijo 1,25 µg/ml. Vdolbinice A1-A3 in A7-A9 so služile kot negativna kontrola (vanje smo nanesli samo 100 µl pufra za ploščice), vdolbinice H4-H6 in H10-H12 44

53 pa kot pozitivna kontrola (vanje smo nanesli 50 µl raztopine biotiniliranega gp120 in 50 µl pufra za ploščice) A NEGATIVNA KONTROLA Osnovna raztopina 2 NEGATIVNA KONTROLA FUKOZA (200 Mm) B Osnovna raztopina 1 Redčitev 1 Osnovna raztopina 3 FUKOZA (60 Mm) C Redčitev 1 Redčitev 2 Redčitev 1 FUKOZA (20 Mm) D Redčitev 2 Redčitev 3 Redčitev 2 FUKOZA (6 Mm) E Redčitev 3 Redčitev 4 Redčitev 3 FUKOZA (2 Mm) F Redčitev 4 Redčitev 5 Redčitev 4 FUKOZA (0,6 Mm) G Redčitev 5 Redčitev 6 Redčitev 5 FUKOZA (0,2 Mm) H Redčitev 6 POZITIVNA KONTROLA Redčitev 6 POZITIVNA KONTROLA Slika 23: Shema ploščice po nanosu raztopin potencialnih antagonistov in fukoze 4.4 MOLEKULSKO SIDRANJE Za virtualno molekulsko sidranje moramo poznati 3D strukturo tarče. To smo poiskali na spletni strani "RCSB Protein Data Bank" ( Na voljo je bilo več zadetkov. Iskanje smo omejili na tiste, pri katerih je bila struktura pridobljena z rentgensko kristalografijo s čim boljšo ločljivostjo. Za molekulsko sidranje smo uporabili kristalno strukturo 1SL4 kompleks CRD-ja receptorja DC-SIGN s tetramanozidom (glej sliko 24). Slika 24: Kristalna struktura CRD-ja receptorja DC-SIGN s tetramanozidom v aktivnem mestu (PDB koda: 1SL4): a) prikaz receptorja s sekundarnimi strukturami, tetramanozid je predstavljen z zelenimi in rdečimi paličicami, Ca 2+ pa z zeleno kroglo; b) prikaz receptorja s površino, tetramanozid je predstavljen z zelenimi in rdečimi paličicami. (2) 45

54 3D strukturo CRD-ja smo pred sidranjem obdelali. Določili smo vezavno mesto, kamor se potencialni antagonisti vežejo (radij 10 Å okoli vezavnega mesta za tetramanozid), iz njega izbrisali prisotni ligand, dodali vodikove atome in energijsko minimalizirali njihov položaj ter izbrali območje in dele proteina, s katerimi lahko spojine tvorijo interakcije. Vrednoteni potencialni antagonisti DC-SIGN so bili načrtovani tako, da lahko tvorijo π-π interakcije s Phe313, ki je tako eden najpomembnejših aminokislinskih ostankov v določenem vezavnem mestu. Vanj je bil vključen tudi kalcijev ion, ki tvori koordinativne vezi z eno od manoz tetramanozida v kristalni strukturi in predpostavljamo tudi z manozo vrednotenih ligandov. Strukture potencialnih antagonistov smo pred molekulskim sidranjem energijsko minimalizirali. Molekulsko sidranje smo izvajali z računalniškim programom GOLD. Izvedli smo 100 ponovitev genetskega algoritma za vsak ligand, da smo dobili reprezentativen nabor izračunanih poz (konformacij in orientacij). Program je napovedal položaj, orientacijo in konformacijo testiranih antagonistov v vezavnem mestu in nato s pomočjo cenilne funkcije GOLDscore napovedal njihovo vezavno energijo. Vizualizirali smo konformacijo in orientacijo liganda z najboljšo vrednostjo cenilne funkcije. 46

55 Odziv Odziv David Hajšek 5. REZULTATI IN RAZPRAVA 5.1 NAČRTOVANJE IN OPTIMIZACIJA TESTNEGA SISTEMA TESTNI SISTEM 1 MIKROTITRSKA PLOŠČICA NUNC ZA FLUORESCENCO Kot lahko vidimo iz grafov 1 in 2, se testni sistem 1 ob uporabi mikrotitrske ploščice Nunc s 96 vdolbinicami za fluorescenco (proizvajalec Nunc GmbH & Co. KG, Nemčija) ni obnesel najbolje. Ob uporabi raztopine ECD receptorja DC-SIGN s koncentracijo 2 µg/10,2 ml sistem ni izkazoval odvisnosti odziva od koncentracije uporabljenega gp120 označenega s fluoresceinom, prav tako pa so izračunane vrednosti Z'-faktorja, ki jih prikazuje preglednica VIII, prenizke za uporabo testnega sistema v praksi. Ob uporabi raztopine ECD receptorja DC-SIGN s koncentracijo 4 µg/10,2 ml koncentracijsko odvisnost sicer lahko opazimo, vendar pa vrednosti Z'-faktorja še vedno pričajo o neustreznosti testnega sistema ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 1: Odziv v odvisnosti od koncentracije s fluoresceinom označenega gp120; c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 2: Odziv v odvisnosti od koncentracije s fluoresceinom označenega gp120; c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml 47

56 Odziv Odziv David Hajšek Preglednica VIII: Izračunan Z'-faktor za posamezne koncentracije s fluoresceinom označenega gp120 c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml c (gp120-fluorescein) (µg/ml) Z'-faktor c (gp120-fluorescein) (µg/ml) Z'-faktor 1-8,26 1-5,36 0,5-0,29 0,5-3,91 0,25-11,11 0,25-3,14 0,125-1,56 0,125-7,74 0, ,45 0,063-6,16 0,031-43,28 0,031-11,73 0, ,40 0,016-24,52 MIKROTITRSKA PLOŠČICA FLUOTRAC TM 600 Testni sistem 1 se je ob uporabi mikrotitrske ploščice FLUOTRAC TM 600 (proizvajalec Greiner bio-one GmbH, Nemčija) obnesel nekoliko bolje. Iz grafov 3 in 4 lahko vidimo, da je koncentracijska odvisnost odziva od koncentracije gp120, označenega s fluoresceinom, prisotna tako ob uporabi raztopin ECD receptorja DC-SIGN s koncentracijo 2 µg/10,2 ml kot tudi 4 µg/10,2 ml. Kljub tej koncentracijski odvisnosti pa Z'-faktor ostaja prenizek, da bi tak sistem lahko prenesli v rutinsko uporabo ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 3: Odziv v odvisnosti od koncentracije s fluoresceinom označenega gp120; c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 4: Odziv v odvisnosti od koncentracije s fluoresceinom označenega gp120; c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml 48

57 Preglednica IX: Izračunan Z'-faktor za posamezne koncentracije s fluoresceinom označenega gp120 c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml c (gp120-fluorescein) (µg/ml) Z'-faktor c (gp120-fluorescein) (µg/ml) Z'-faktor 1-0,53 1-0,21 0,5-0,60 0,5-0,52 0,25-66,68 0,25-1,55 0,125-12,55 0,125-6,11 0, ,46 0,063-23,14 0,031-12,35 0,031-11,10 0,016-14,65 0,016-21,86 Do razlike med ploščicama je najverjetneje prišlo zaradi večjega števila vezavnih mest, ki so na razpolago za vezavo ECD receptorja DC-SIGN na mikrotitrski ploščici FLUOTRAC TM 600 (proizvajalec Greiner bio-one GmbH, Nemčija). Prav tako lahko iz rezultatov zaključimo, da je ustreznost testnega sistema odvisna tudi od koncentracije uporabljene raztopine ECD receptorja DC-SIGN, pri čemer boljše rezultate pričakovano daje uporaba raztopine z višjo koncentracijo TESTNI SISTEM 2 MIKROTITRSKA PLOŠČICA NUNC ZA LUMINISCENCO Testni sistem 2 je ob uporabi mikrotitrske ploščice proizvajalca Nunc GmbH & Co. KG, Nemčija (Nunc s 96 vdolbinicami za luminiscenco) dajal nekoliko boljše rezultate. V obeh primerih (c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml in c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml) lahko vidimo (grafa 5 in 6), da je prisotna odvisnost odziva od uporabljene koncentracije označenega naravnega liganda. Žal pa tudi tukaj ne dosegamo želenih vrednosti Z'-faktorja. Kljub temu, da smo pri koncentraciji s HRP konjugiranega gp120 1 µg/ml v obeh primerih dosegli pozitivne vrednosti Z'-faktorja, so le-te še vedno prenizke za nadaljnjo optimizacijo tega testnega sistema. 49

58 Odziv Odziv David Hajšek ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 5: Odziv v odvisnosti od koncentracije s HRP označenega gp120; c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 6: Odziv v odvisnosti od koncentracije s HRP označenega gp120; c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml Preglednica X: Izračunan Z'-faktor za posamezne koncentracije s HRP označenega gp120 c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml c (gp120-hrp) (µg/ml) Z'-faktor c (gp120-hrp) (µg/ml) Z'-faktor 1 0,21 1 0,32 0,5-0,53 0,5 0,08 0,25-5,09 0,25-0,21 0,125-4,83 0,125-2,29 0,063-6,19 0,063-0,70 0,031-2,86 0,031-1,33 0,016-7,09 0,016-5,04 MIKROTITRSKA PLOŠČICA LUMITRAC TM 600 Tako kot pri preizkušanju testnega sistema 1 se je tudi tukaj izkazalo, da je mikrtotirska ploščica proizvajalca Greiner bio-one GmbH, Nemčija (LUMITRAC TM 600) ustreznejša. Pri obeh koncentracijah nanesenega ECD receptorja DC-SIGN lahko vidimo koncentracijsko odvisnost odziva. Pri uporabi višje koncentracije (4 µg/10,2 ml) dobimo nekoliko boljše odzive in vrednosti Z'-faktorja (glej preglednico XI). Te se v obeh primerih povzpnejo na pozitivne vrednosti že ob uporabi koncentracije označenega naravnega liganda 0,5 µg/ml, ob uporabi 1 µg/ml pa se že nahajajo v intervalu, v katerem lahko trdimo, da je testni sistem dober (0,5-1). Tudi tokrat smo opazili občutno razliko med ploščicama različnih proizvajalcev. Za boljšo se je ponovno izkazala mikrtotirska ploščica proizvajalca Greiner bio-one GmbH, Nemčija 50

59 Odziv Odziv David Hajšek (LUMITRAC TM 600), kar lahko zopet pripišemo manjšemu številu vezavnih mest na mikrotitrski ploščici proizvajalca Nunc GmbH & Co. KG, Nemčija (Nunc ploščica s 96 vdolbinicami za luminiscenco) ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 7: Odziv v odvisnosti od koncentracije s HRP označenega gp120; c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml 400 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c (µg/ml) Graf 8: Odziv v odvisnosti od koncentracije s HRP označenega gp120; c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml Preglednica XI: Izračunan Z'-faktor za posamezne koncentracije s HRP označenega gp120 c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml c (gp120-hrp) (µg/ml) Z'-faktor c (gp120-hrp) (µg/ml) Z'-faktor 1 0,61 1 0,76 0,5 0,09 0,5 0,21 0,25-10,09 0,25-0,28 0,125-8,94 0,125-7,44 0,063-2,82 0,063-6,72 0,031-8,63 0,031-58,43 0,016-2,74 0,016-3, TESTNI SISTEM 3 Rezultati testnega sistema 3 so pokazali, da tako kot testni sistem 1 tudi ta ni primeren za nadaljnjo optimizacijo. Iz grafa 7 lahko vidimo, da je rahlo naraščanje odziva s koncentracijo uporabljenega gp120, označenega s fluoresceinom, sicer prisotno, vendar pa ni statistično značilno. Razlika med odzivom negativne kontrole in raztopine gp120-fluorescein s koncentracijo 1,25 µg/ml je zelo majhna, ob upoštevanju standardne 51

60 Odziv David Hajšek deviacije, pa se odziva celo prekrivata. Vrednosti Z'-faktorja so za vse preizkušene koncentracije negativne (glej preglednico XII), zaradi česar nadaljnje optimizacije nismo izvajali ,25 µg/ml 0,625 µg/ml 0,312 µg/ml Negativna kontrola Koncentracija gp120-fluorescin Graf 9: Odziv v odvisnosti od koncentracije s fluoresceinom označenega gp120 Preglednica XII: Izračunan Z'-faktor za posamezne koncentracije s fluoresceinom označenega gp120 C (gp120-fluorescein) (µg/ml) 1,25 0,625 0,312 Z'-faktor -8,32-8,99-19,46 Razlogov za tako slabe rezultate je lahko več. Majhne razlike v odzivu med negativno kontrolo in raztopinami gp120, konjugiranega s fluoresceinom, bi lahko pričakovali v primeru, da: - je bila količina FITC, ki se je vezala na gp120 izredno majhna, - konjugacija s FITC zaradi prisotnosti trisa v reakcijski zmesi ni potekla, - se je FITC vezal tudi na hidroksilne skupine manoznih ostankov v proteinu, s čimer je bila preprečena vezava gp120 na DC-SIGN TESTNI SISTEM 4 Iz grafa 10 lahko vidimo odvisnost odziva tako od koncentracije, s katero smo prevlekli ploščico, kot tudi od koncentracije uporabljenega biotiniliranega gp120. V obeh primerih višja koncentracija daje višji odziv. 52

61 Odziv David Hajšek DC-SIGN (8 µg/10,2 ml) DC-SIGN (4 µg/10,2 ml) DC-SIGN (2 µg/10,2 ml) , c (gp120-biotin) Graf 10: Odziv v odvisnosti od koncentracije z biotinom označenega gp120 in količine ECD receptorja DC-SIGN Izračun Z'-faktorja je pokazal, da se testni sistem 4 obnese dobro v praktično vseh preizkušanih kombinacijah (glej preglednico XIII). Ob uporabi 2 in 4 µg/10,2 ml ECD receptorja DC-SIGN so vrednosti Z'-faktorja pri želenih vrednostih nad koncentracijami 0,313 µg/ml biotiniliranega gp120, ob uporabi 8 µg/10,2 ml pa je Z'-faktor ugoden pri vseh preizkušanih koncentracijah označenega naravnega liganda. Preglednica XIII: Izračunan Z'-faktor za posamezne koncentracije z biotinom označenega gp120 c (DC-SIGN) = 2 µg/10,2 ml c (DC-SIGN) = 4 µg/10,2 ml c (DC-SIGN) = 8 µg/10,2 ml c (gp120-biotin) (µg/ml) Z'-faktor % NV c (gp120-biotin) (µg/ml) Z'-faktor % NV c (gp120-biotin) (µg/ml) Z'-faktor % NV 10 0,97 70, ,94 25, ,87 6,29 5 0,97 64,47 5 0,95 22,99 5 0,99 4,63 2,5 0,80 60,14 2,5 0,93 22,62 2,5 0,91 4,02 1,25 0,91 56,91 1,25 0,97 21,77 1,25 0,95 3,81 0,625 0,71 57,27 0,625 0,93 21,70 0,625 0,94 3,47 0,313 0,64 45,49 0,313 0,89 17,55 0,313 0,95 2,80 0,156 0,39 42,20 0,156 0,47 15,09 0,156 0,82 2,53 % NV. Odstotek nespecifične vezave 53

62 Odstotek vezve (gp120-biotin) Odstotek vezve (gp120-biotin) David Hajšek PRIMERNOST TESTNEGA SISTEMA 4 ZA DOLOČANJE AFINITETE POTENCIALNIH ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN Na osnovi rezultatov testiranja testnega sistema 4 smo se njegovo primernost za določanje afinitete potencialnih antagonistov odločili ovrednotiti pri koncentraciji ECD receptorja DC-SIGN 8 µg/10,2 ml in pri koncentracijah označenega naravnega liganda 0,313 in 0,625 µg/ml. Kot lahko vidimo iz grafov 11 in 12, daje testni sistem 4 ponovljive rezultate. Pri meritvi 2 je prišlo do eksperimentalne napake, zato smo v grafu dobili dve vrednosti, ki sta odstopali od pričakovanih. To smo rešili tako, da smo ti dve vrednosti zamaskirali in za prileganje podatkov sigmoidni krivulji fiksirali končno vrednost. Meritvi sta dali podobne rezultate pri obeh koncentracijah biotiniliranega gp120. Kot lahko vidimo iz preglednice XIV, razlike v določenih vrednostih IC 50 v obeh primerih niso bile statistično značilne (zaradi majhnega vzorca je pri interpretaciji rezultatov t-testa potrebna določena mera previdnosti), izračunan Z'-faktor pa je bil visok Meritev 1 Meritev Meritev 1 Meritev , , c(fukoza) c(fukoza) Graf 11: Odstotek vezave z biotinom označenega gp120 v odvisnosti od koncentracije fukoze Graf 12: Odstotek vezave z biotinom označenega gp120 v odvisnosti od koncentracije fukoze Preglednica XIV: Izračunane vrednosti IC 50, R 2, Z'-faktorja in p-vrednosti c (gp120-biotin) = 0,313 µg/ml c (gp120-biotin) = 0,625 µg/ml IC 50 (mm) R 2 p-vrednosti Z'-faktor IC 50 (mm) R 2 p-vrednosti Z'-faktor Meritev 1 5,46 ± 0,39 0, ,10 ± 0,54 0, ,87 Meritev 2 4,97 ± 0,15 0, ,95 ± 0,32 0, H 0 : IC 50(meritev 1) - IC 50(meritev 2) = 0 H a : IC 50(meritev 1) - IC 50(meritev 2) < > 0 0,90 54

63 Odstotek vezve (gp120-biotin) David Hajšek VPLIV TWEEN-a 20 NA DOLOČANJE IC 50 Prisotnost TWEEN-a 20 ni bistveno vplivala na določanje IC 50 fukoze. Razlike v določeni vrednosti niso bile statistično značilne (zaradi majhnega vzorca je pri interpretaciji rezultatov t-testa potrebna določena mera previdnosti), Z'-faktor pa je bil v obeh primerih visok (glej graf 13 in preglednico XV) s Tweenom brez Tweena c (fukoza) Graf 13: Odziv v odvisnosti od prisotnosti TWEEN-a 20 Preglednica XV: Izračunane vrednosti IC 50, R 2, Z'-faktorja in p-vrednosti s TWEEN-om brez TWEEN-a p-vrednosti IC 50 (mm) R 2 Z'-faktor IC 50 (mm) R 2 Z'-faktor 2,91 ± 0,24 0,9958 0,87 2,63 ± 0,18 0,9968 0,95 0,17 0,18 H 0 : IC 50(meritev 1) - IC 50(meritev 2) = 0 H a : IC 50(meritev 1) - IC 50(meritev 2) < > 0 VPLIV DMSO NA DOLOČANJE IC 50 Pri načrtovanju testnega sistema je treba upoštevati tudi morebiten vpliv topil na določanje IC 50. V našem primeru, ko smo osnovne raztopine pripravljali v DMSO, smo torej ovrednotili vpliv le-tega. Kot lahko vidimo na grafu 13, prisotnost DMSO v raztopini vpliva na določanje IC 50 tako, da prepreči vezavo antagonista v vezavno mesto, s čimer je preprečen antagonizem. Ta vpliv se pri 10 mm fukozi začne pojavljati pri cca. 25 % 55

64 Odstotek vezave (gp120-biotin) David Hajšek DMSO, močneje pa se izrazi nad 30 %. Ker prisotnost DMSO ovira hidrofobne interakcije, velja omeniti tudi, da njegovega vpliva ne moremo posplošiti na vse potencialne antagoniste, saj nekateri tvorijo z receptorjem več hidrofobnih interakcij kot drugi % (DMSO) Graf 14: Antagonizem 10 mm fukoze v odvisnosti od % DMSO v raztopini v vdolbinici MEDDNEVNA PONOVLJIVOST V sklopu testiranj smo preverili meddnevno ponovljivost. To smo storili tako, da smo med seboj primerjali IC 50 vrednosti določene za fukozo. Rezultati enofaktorske ANOVE so zbrani v preglednici XVI. Preglednica XVI: Rezultati enofaktorske ANOVE IC 50 (mm) Standardna napaka p-vrednost Meritev 1 3,51 0,49 Meritev 2 3,22 0,17 0,48116 Meritev 3 2,71 0,48 Meritev 4 2,95 0,14 H 0 : Določene vrednosti IC 50 vseh meritev so enake. H a : Določene vrednosti IC 50 ene ali večih meritev so različne. Kot lahko vidimo, je p-vrednost večja od stopnje tveganja α (0,05), kar pomeni, da H 0 ne moremo zavreči. Razlike v določenih IC50 niso statistično značilne, meddnevna ponovljivost je dobra (zaradi majhnega vzorca je pri interpretaciji rezultatov ANOVE potrebna določena mera previdnosti). 56

65 Odstotek vezave (gp120-biotin) David Hajšek 5.2 DOLOČANJE AFINITETE POTENCIALNIH ANTAGONISTOV RECEPTORJA DC-SIGN Po presejalnem testu in izvedbi testa za določanje afinitete potencialnih antagonistov receptorja DC-SIGN smo dobljene podatke računalniško obdelali s programoma Microsoft Excel in Origin 8.0. Po obdelavi smo dobili graf s sigmoidno krivuljo, ki se je prilegala podatkom ter podatke o začetni in končni vrednosti, vrednosti v točki prevoja (IC 50 ) in njihovih standardnih napakah ter determinacijski koeficient. Graf 15 in preglednica XVII predstavljata primer dobljenih rezultatov. Preglednica XVII: Podatki o začetni in končni vrednosti, vrednost v točki prevoja (IC 50 ) in njihovih standardnih napakah ter determinacijski koeficient za spojino TSZ-20 Vrednost Standardna napaka Začetna vrednost ( %) 110,13 2,69 Končna vrednost ( %) 32,41 3,07 IC 50 (mm) 0,05 0,01 R 2 0, E-3 0,01 0,1 1 c (TSZ-20) [mm] Graf 15: Prileganje sigmoidne krivulje eksperimentalnim podatkom za spojino TSZ-20 57

66 Grafi za ostale spojine so v prilogi 2. Rezultati testiranj vseh spojin so zbrani v preglednici XVIII. Preglednica XVIII: Rezultati določanja afinitete potencialnim antagonistom receptorja DC-SIGN Potencialni antagonist IC 50 (mm) R 2 Z'-faktor testnega sistema Referenčna vrednost IC 50 fukoza (mm) AAG-11 4,37 ± 0,24 0,9952 0,90 ** AAG-12 0,42 ± 0,02 0,9961 0,94 2,95 ± 0,24 AAG-13 1,34 ± 0,08 0,9963 0,90 ** AAG-14 3,89 ± 0,18 0,9966 0,98 2,95 ± 0,24 AAG-21 6,49 ± 0,10 0,9996 0,86 *** AAG-22 13,25 ± 0,28 0,9991 0,88 *** AAG-23 14,94 ± 2,26 0,9740 0,94 2,95 ± 0,24 AKM-6 8,79 ± 0,81 0,9853 0,88 *** Man001* 2,76 ± 0,34 0,9850 0,93 7,53 ± 0,05 Man030* 0,42 ± 0,07 0,9806 0,93 7,53 ± 0,05 MP-1 3,10 ± 0,43 0,9901 0,90 3,22 ± 0,29 TSZ-07 3,59 ± 0,21 0,9970 0,86 *** TSZ-15 0,04 ± 0,03 0,9893 0,90 3,22 ± 0,29 TSZ-19 2,41 ± 0,15 0,9962 0,94 2,71 ± 0,84 TSZ-20 0,05 ± 0,01 0,9968 0,90 3,22 ± 0,29 TTD-09 1,01 ± 0,19 0,9837 0,94 2,71 ± 0,84 *Določanje v neoptimiziranem testnem sistemu. Pri določanju IC 50 je opazen tudi vpliv DMSO **Kot referenca nanesena manoza. Rezultat manoze v tem sistemu; IC 50 = 14,56 ± 0,18 ***Ploščica brez nanesene reference. Rezultat AAG-23 v tem sistemu; IC 50 = 14,58 ± 1,26 Pri izvajanju testov nam je največje preglavice povzročala slaba topnost spojin. Gre za znano težavo pri bioloških testih. Posledica slabe topnosti testiranih spojin so pojavljanje agregatov, lažno višje določene vrednosti IC 50 (zaradi nižjih koncentracij pripravljenih raztopin od predvidenih), slabi rezultati testov in posledično zmoten SAR spojin. Slabo topnost bi lahko reševali z dodatkom DMSO, vendar pa koncentracija le-tega vpliva na določanje IC 50. Zaradi tega smo se pri mnogih spojinah znašli v zadregi, saj nismo mogli pripraviti raztopin z dovolj visokimi koncentracijami, da bi dosegli popoln antagonizem. Zaradi tega je pri interpretaciji zgoraj prikazanih rezultatov potrebna dobršna mera previdnosti. Ugotovili smo tudi, da je, kljub dobri ponovljivosti rezultatov, na vsako mikrotitrsko ploščico priporočljivo nanašati referenčne raztopine fukoze, saj le tako lahko z gotovostjo ovrednotimo rezultate testiranih spojin. Do razlik v določeni vrednosti IC 50 fukoze lahko prihaja zaradi razlik v izhodnih reagentih ter eksperimentalnih napak pri redčenju in nanosu le-teh. 58

67 Nedvomno lahko iz rezultatov vidimo, da imamo med testiranimi spojinami nekaj takšnih, ki izkazujejo visoko afiniteto do receptorja DC-SIGN (IC 50 v mikromolarnih koncentracijah). Seveda bi si želeli dosegati še nižje vrednosti IC 50, vendar se je potrebno zavedati, da je razvoj potencialnih antagonistov receptorja DC-SIGN šele v začetnih fazah ter da z monomernimi antagonisti težko dosežemo višjo afiniteto. 5.3 MOLEKULSKO SIDRANJE Molekulsko sidranje smo opravili za vse preizkušene potencialne antagoniste receptorja DC-SIGN. Na sliki 25 je predstavljen rezultat molekulskega sidranja za spojino TSZ-20, na sliki 26a za spojino AAG-12 ter na sliki 26b za spojino AAG-23. Rezultati za ostale spojine se nahajajo v prilogi 3. Slika 25: Molekulsko sidranje spojine TSZ-20; a) spojina TSZ-20 v vezavnem mestu tvorba vodikovih vezi (Ca 2+ je označen z zeleno kroglo, aminokislinski ostanki Phe313, Lys373, Asn344 in Arg345 pa s sivimi, modrimi in rdečimi paličicami); b) spojina TSZ-20 v vezavnem mestu (Ca 2+ je označen z zeleno kroglo, aminokislinski ostanek Phe313 pa z oranžnimi paličicami); c) spojina TSZ-20 v vezavnem mestu mrežasti prikaz (Ca 2+ je označen z zeleno kroglo, aminokislinski ostanek Phe313 pa s sivimi paličicami); d) spojina TSZ-20 v vezavnem mestu prikaz površine 59

68 Ker smo vezavno mesto za manozo določili sami, je bila naloga programa izračunati najugodnejšo konformacijo in orientacijo antagonista po vezavi na to mesto. Na sliki 25b vidimo kalcijev ion (zelena krogla), ki je pomemben za vezavo naše spojine ter predvideno hidrofobno interakcijo ene izmed stranskih verig spojine TSZ-20 z aminokislinskim ostankom Phe313 na CRD-ju receptorja DC-SIGN. Sliki 25c in 25d nam ponudita dodatne informacije o prostorski orientaciji antagonista v vezavnem mestu. Druga stranska veriga antagonista je od prve obrnjena v nasprotno smer, kjer površina receptorja tvori neke vrste žepek. Takšna orientacija je najverjetneje ugodna zaradi možnih hidrofobnih interakcij med naftilom in receptorjem ter zaradi možnosti tvorbe vodikove vezi med kisikom v metoksi skupini in aminokislinskima ostankoma Asn344 in Arg345 podobno kot med metoksi skupino prve stranske verige in aminokislinskim ostankom Lys373 (slika 25a). Rezultati določanja afinitete z razvitim testnim sistemom potrjujejo ugotovitve, da TSZ-20 tvori najtesnejše kontakte z receptorsko površino TSZ-20 je med spojinami z najnižjimi vrednostmi določenih IC 50. Slika 26: Molekulsko sidranje spojin a) AAG-12 in b) AAG-23. Prikaz spojin v vezavnem mestu (receptor DC-SIGN je predstavljen s površino, Ca 2+ kot del zelene krogle, spojini pa z zelenimi, modrimi in rdečimi paličicami) Tudi spojina AAG-12 sodi med potencialne antagoniste, ki so na testiranju dosegali najnižje vrednosti IC 50. Iz molekulskega sidranja lahko sklepamo, da tako kot spojina TSZ-20 tvori hidrofobne interakcije z aminokislinskim ostankom Phe313. Poleg tega je iz slike 26a razvidno, da se etilni fragment zasidra v žepek na proteinu, kjer najverjetneje tvori hidrofobne interakcije z njim. Na drugi strani pa lahko na sliki 26b vidimo, da spojina AAG-23 ne uspe vzpostaviti močne hidrofobne interakcije z aminokislinskim ostankom Phe313 (fenilni obroč spojine je 60

69 postavljen praktično pravokotno na fenilni obroč iz Phe313). Tudi za ostale dele spojine ne moremo trditi, da s proteinom tvorijo močne interakcije, kar se odraža v enem izmed najslabših rezultatov pri določevanju IC 50. Program nam je potencialne antagoniste razvrstil glede na vrednosti cenilne funkcije. Žal je ta razvrstitev neuporabna, saj cenilna funkcija slabo ovrednoti prispevek hidrofobnih interakcij, ki pa so za afiniteto testiranih spojin zelo pomembne. Kljub temu lahko rezultate sidranja uporabimo za kvalitativno vrednotenje in predvidevanj ustreznosti novih antagonistov DC-SIGN. 61

70 6. ZAKLJUČEK Uspešno smo razvili in optimizirali testni sistem za določanje afinitete antagonistov receptorja DC-SIGN. Dosegli smo dobro odzivnost metode in ponovljivost rezultatov. Razviti testni sistem smo uspešno prenesli v rutinsko uporabo za določanje vrednosti IC 50 potencialnim antagonistom, sintetiziranim na Katedri za farmacevtsko kemijo in na Oddelku za industrijsko in organsko kemijo Univerze v Milanu. Ugotovili smo, da obstaja bistvena razlika med mikrotitrskimi ploščicami različnih proizvajalcev. Pri našem delu so se najbolje obnesle mikrotitrske ploščice proizvajalca Greiner bio-one GmbH (Nemčija). Pri tem velja omeniti, da smo uporabljali ploščice z visoko kapaciteto vezave (model 600). Primerjava med preizkušanima metodama detekcije je pokazala, da dosti boljšo občutljivost dosežemo z uporabo kemiluminiscence (v primerjavi s fluorescenco). To je razumljivo, saj pri kemiluminiscenci uporabljamo ojačevalce emitirane svetlobe, s čimer lahko le-to ojačamo tudi do 1000-krat. Na podlagi te ugotovitve smo prišli do zaključka, da je za naš testni sistem najbolje, da kot naravni ligand uporabljamo gp120 konjugiran s HRP ali z biotinom. Ugotovili smo, da se gp120, konjugiran s HRP, ki je bil pridobljen v ekspresijskem sistemu Baculovirus, na DC-SIGN veže dosti slabše kot gp120 pridobljen v ekspresijskem sistemu človeških celic, katerega smo biotinilirali sami. Iz tega sledi, da je ekspresijski sistem odločilen za vezavo gp120 na DC-SIGN, saj gre pri različnih ekspresijskih sistemih za bistvene razlike v posttranslacijski glikozilaciji proteinov. Ker so ogljikohidratne strukture v gp120 tiste, ki tvorijo interakcije z DC-SIGN, so pričakovano najboljši ekspresijski sistem ravno humane celične linije. Zaradi tega smo se odločili, da je slednji optimalnejša izbira za naš testni sistem. Biotinilacija proteina je tudi ena ključnih točk za to, da dobimo ustrezne rezultate. Pomembno je, da med reakcijo biotinilacije vzdržujemo konstantno temperaturo, da ne pride do denaturacije proteina. Glede na dobljene rezultate lahko sklepamo, da je bilo označevanje gp120 z biotinom uspešno. Ugotovili smo, da na odzivnost metode vplivajo koncentracije uporabljenih reagentov. Dokazali smo, da obstaja odvisnost odziva tako od koncentracije ECD receptorja DC-SIGN, s katerim prevlečemo ploščico, kot tudi od koncentracije biotiniliranega gp120, 62

71 ki ga uporabimo kot naravni ligand. Optimalna koncentracija ECD receptorja DC-SIGN za nanos na ploščico je 4 µg/10,2 ml, biotiniliranega gp120 pa 1,25 µg/ml. Ovrednotili smo tudi vpliv TWEEN-a 20 in DMSO. V prvem primeru smo ugotovili, da dodatek TWEEN-a 20 nima statistično značilnega vpliva na določanje IC 50, za DMSO pa se je izkazalo, da tudi v koncentracijah, manjših od 30 %, močno vpliva na določanje IC 50 fukoze ter da je ta vpliv odvisen od interakcij, ki jih potencialni antagonist tvori z receptorjem (DMSO moti predvsem hidrofobne interakcije). Na verodostojnost rezultatov vplivajo vse stopnje v izvedbi testa. Ključnega pomena je spiranje ploščic med inkubacijami, saj lahko zaostali reagenti močno vplivajo na dobljene rezultate. Potrebno je striktno upoštevanje razvitega protokola. Odstopanja v količinah in koncentracijah nanesenih reagentov, času inkubacije ter seveda zaporedju korakov vodijo do neuporabnih rezultatov. Za pipetiranje je najbolje uporabljati avtomatske mikropipete, saj se tako izognemo eksperimentalni napaki zaradi nenatančnega ročnega pipetiranja ter dosežemo boljšo ponovljivost. Rezultati testiranj in molekulskega sidranja so pokazali, da so nekatere izmed testiranih spojin dosegale spodbudne rezultate. Na podlagi dobljenih rezultatov smo prišli do naslednjih ugotovitev: ključnega pomena za afiniteto potencialnih antagonistov in njihovo vezavo na receptor DC-SIGN je hidrofobna interakcija z aminokislinskim ostankom Phe313. Spojina mora v stranski verigi vsebovati hidrofobni del, ki se nahaja na ravno pravšnji oddaljenosti od osnovne ogljikohidratne enote, da lahko interagira s Phe313; prisotnost funkcionalnih skupin na stranski verigi, ki lahko z aminokislinskimi ostanki na proteinu tvorijo vodikove vezi ali hidrofobne interakcije, zniža vrednost IC 50. Tudi te morajo biti od osnovne ogljikohidratne enote oddaljene ravno prav, da lahko dosežejo dele na proteinu, ki so sposobni takšnih interakcij; enega izmed glavnih izzivov pri načrtovanju novih potencialnih antagonistov receptorja DC-SIGN bo predstavljala izbira distančnikov, ki bodo prave dolžine in dovolj fleksibilni, da bodo omogočali učinkovite interakcije vseh funkcionalnih skupin v stranskih verigah potencialnih antagonistov z receptorjem DC-SIGN. Predmet prihodnjega dela je predvsem razvoj in optimizacija protokola za raztapljanje novih potencialnih antagonistov. S tem bi se izognili napačnim rezultatom ter izboljšali verodostojnost rezultatov, dobljenih z razvitim testnim sistemom. 63

72 7. LITERATURA 1. Zelensky AN, Gready JE: The C-type lectin-like domain superfamily. FEBS J 2005; 272: Guo Y, Feinberg H, Conroy E, Mitchell DA, Alvarez R, Blixt O, Taylor ME, Weis WI, Drickamer K: Structural basis for distinct ligand-binding and targeting properties of the receptors DC-SIGN and DC-SIGNR. Nat Struct Mol Biol 2004; 11: Varki A, Cummings R, Esko J, et al.: Essentials of Glycobiology. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1999; Chapter McGreal EP, Martinez-Pomares L, Gordon S: Divergent roles for C-type lectins expressed by cells of the innate immune system. Mol Immunol 2004; 41: Ng KK, Drickamer K, Weis WI: Structural analysis of monosaccharide recognition by rat liver mannose-binding protein. J Biol Chem 1996; 271: Drickamer K: Evolution of Ca(2+)-dependent animal lectins. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1993; 45: Drickamer K, Fadden AJ: Genomic analysis of C-type lectins. Biochem Soc Symp 2002; Zelensky AN, Gready JE: C-type lectin-like domains in Fugu rubripes. BMC Genomics 2004; 5: Anderluh M, Jug G, Svajger U, Obermajer N: DC-SIGN antagonists, a potential new class of anti-infectives. Curr Med Chem 2012; 19: Svajger U, Anderluh M, Jeras M, Obermajer N: C-type lectin DC-SIGN: an adhesion, signalling and antigen-uptake molecule that guides dendritic cells in immunity. Cell Signal 2010; 22: Banchereau J, Steinman RM: Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392: Carbone FR, Heath WR: The role of dendritic cell subsets in immunity to viruses. Curr Opin Immunol 2003; 15: Janeway CA, Jr., Medzhitov R: Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 2002; 20: Figdor CG, Van KY, Adema GJ: C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2002; 2:

73 15. Engering A, van Vliet SJ, Geijtenbeek TB, Van KY: Subset of DC-SIGN(+) dendritic cells in human blood transmits HIV-1 to T lymphocytes. Blood 2002; 100: Geijtenbeek TB, Krooshoop DJ, Bleijs DA, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Grabovsky V, Alon R, Figdor CG, Van KY: DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 2000; 1: Geijtenbeek TB, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Adema GJ, Van KY, Figdor CG: Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 2000; 100: Appelmelk BJ, van D, I, van Vliet SJ, Vandenbroucke-Grauls CM, Geijtenbeek TB, Van KY: Cutting edge: carbohydrate profiling identifies new pathogens that interact with dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin on dendritic cells. J Immunol 2003; 170: Feinberg H, Mitchell DA, Drickamer K, Weis WI: Structural basis for selective recognition of oligosaccharides by DC-SIGN and DC-SIGNR. Science 2001; 294: Van KY, Geijtenbeek TB: DC-SIGN: escape mechanism for pathogens. Nat Rev Immunol 2003; 3: Van KY, Appelmelk B, Geijtenbeek TB: A fatal attraction: Mycobacterium tuberculosis and HIV-1 target DC-SIGN to escape immune surveillance. Trends Mol Med 2003; 9: Cambi A, Beeren I, Joosten B, Fransen JA, Figdor CG: The C-type lectin DC-SIGN internalizes soluble antigens and HIV-1 virions via a clathrin-dependent mechanism. Eur J Immunol 2009; 39: Bernhard OK, Lai J, Wilkinson J, Sheil MM, Cunningham AL: Proteomic analysis of DC-SIGN on dendritic cells detects tetramers required for ligand binding but no association with CD4. J Biol Chem 2004; 279: Geijtenbeek TB, Kwon DS, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Middel J, Cornelissen IL, Nottet HS, KewalRamani VN, Littman DR, Figdor CG, Van KY: DC- SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell 2000; 100: Kwon DS, Gregorio G, Bitton N, Hendrickson WA, Littman DR: DC-SIGN-mediated internalization of HIV is required for trans-enhancement of T cell infection. Immunity 2002; 16:

74 26. Trumpfheller C, Park CG, Finke J, Steinman RM, Granelli-Piperno A: Cell typedependent retention and transmission of HIV-1 by DC-SIGN. Int Immunol 2003; 15: Sodhi A, Montaner S, Gutkind JS: Viral hijacking of G-protein-coupled-receptor signalling networks. Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: Hodges A, Sharrocks K, Edelmann M, Baban D, Moris A, Schwartz O, Drakesmith H, Davies K, Kessler B, McMichael A, Simmons A: Activation of the lectin DC-SIGN induces an immature dendritic cell phenotype triggering Rho-GTPase activity required for HIV-1 replication. Nat Immunol 2007; 8: Sol-Foulon N, Moris A, Nobile C, Boccaccio C, Engering A, Abastado JP, Heard JM, Van KY, Schwartz O: HIV-1 Nef-induced upregulation of DC-SIGN in dendritic cells promotes lymphocyte clustering and viral spread. Immunity 2002; 16: Feinberg H, Mitchell DA, Drickamer K, Weis WI: Structural basis for selective recognition of oligosaccharides by DC-SIGN and DC-SIGNR. Science 2001; 294: Geijtenbeek TB, van Duijnhoven GC, van Vliet SJ, Krieger E, Vriend G, Figdor CG, Van KY: Identification of different binding sites in the dendritic cell-specific receptor DC-SIGN for intercellular adhesion molecule 3 and HIV-1. J Biol Chem 2002; 277: Mitchell DA, Fadden AJ, Drickamer K: A novel mechanism of carbohydrate recognition by the C-type lectins DC-SIGN and DC-SIGNR. Subunit organization and binding to multivalent ligands. J Biol Chem 2001; 276: Feinberg H, Guo Y, Mitchell DA, Drickamer K, Weis WI: Extended neck regions stabilize tetramers of the receptors DC-SIGN and DC-SIGNR. J Biol Chem 2005; 280: Tabarani G, Thepaut M, Stroebel D, Ebel C, Vives C, Vachette P, Durand D, Fieschi F: DC-SIGN neck domain is a ph-sensor controlling oligomerization: SAXS and hydrodynamic studies of extracellular domain. J Biol Chem 2009; 284: Weis WI, Drickamer K, Hendrickson WA: Structure of a C-type mannose-binding protein complexed with an oligosaccharide. Nature 1992; 360: Bogoevska V, Nollau P, Lucka L, Grunow D, Klampe B, Uotila LM, Samsen A, Gahmberg CG, Wagener C: DC-SIGN binds ICAM-3 isolated from peripheral human leukocytes through Lewis x residues. Glycobiology 2007; 17:

75 37. Appelmelk BJ, van D, I, van Vliet SJ, Vandenbroucke-Grauls CM, Geijtenbeek TB, Van KY: Cutting edge: carbohydrate profiling identifies new pathogens that interact with dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin on dendritic cells. J Immunol 2003; 170: Geijtenbeek TB, van Vliet SJ, Koppel EA, Sanchez-Hernandez M, Vandenbroucke- Grauls CM, Appelmelk B, Van KY: Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 2003; 197: Sattin S, Daghetti A, Thepaut M, Berzi A, Sanchez-Navarro M, Tabarani G, Rojo J, Fieschi F, Clerici M, Bernardi A: Inhibition of DC-SIGN-mediated HIV infection by a linear trimannoside mimic in a tetravalent presentation. ACS Chem Biol 2010; 5: Requena M, Bouhlal H, Nasreddine N, Saidi H, Gody JC, Aubry S, Gresenguet G, Kazatchkine MD, Sekaly RP, Belec L, Hocini H: Inhibition of HIV-1 transmission in trans from dendritic cells to CD4+ T lymphocytes by natural antibodies to the CRD domain of DC-SIGN purified from breast milk and intravenous immunoglobulins. Immunology 2008; 123: Alen MM, Kaptein SJ, De BT, Balzarini J, Neyts J, Schols D: Antiviral activity of carbohydrate-binding agents and the role of DC-SIGN in dengue virus infection. Virology 2009; 387: Yang L, Yang H, Rideout K, Cho T, Joo KI, Ziegler L, Elliot A, Walls A, Yu D, Baltimore D, Wang P: Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nat Biotechnol 2008; 26: Balzarini J, Van HY, Vermeire K, Vanham G, Schols D: Carbohydrate-binding agents efficiently prevent dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN)-directed HIV-1 transmission to T lymphocytes. Mol Pharmacol 2007; 71: van MT, Eggink D, Boot M, Tuen M, Hioe CE, Berkhout B, Sanders RW: HIV-1 N- glycan composition governs a balance between dendritic cell-mediated viral transmission and antigen presentation. J Immunol 2011; 187: Lederman MM, Offord RE, Hartley O: Microbicides and other topical strategies to prevent vaginal transmission of HIV. Nat Rev Immunol 2006; 6:

76 46. Reina JJ, Maldonado OS, Tabarani G, Fieschi F, Rojo J: Mannose glycoconjugates functionalized at positions 1 and 6. Binding analysis to DC-SIGN using biosensors. Bioconjug Chem 2007; 18: Timpano G, Tabarani G, Anderluh M, Invernizzi D, Vasile F, Potenza D, Nieto PM, Rojo J, Fieschi F, Bernardi A: Synthesis of novel DC-SIGN ligands with an alphafucosylamide anchor. Chembiochem 2008; 9: Borrok MJ, Kiessling LL: Non-carbohydrate inhibitors of the lectin DC-SIGN. J Am Chem Soc 2007; 129: Finkelstein J: Glycochemistry & Glycobiology. Nature 2007; 446: Koivunen ME, Krogsrud RL: Principles of Immunochemical Techniques Used in Clinical Laboratories. Lab Medicine 2006; 37: Flaherty D: Immunology for Pharmacy. Elsevier/Mosby, Strokovni priročnik: dostopano Javois LC: Immunocytochemical Methods and Protocols. Humana Press, Informacije o izdelku: 250pis_Par_0001_File tmp/f7250pis.pdf; dostopano Navodilo za uporabo: dostopano Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR: A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen 1999; 4: Brooijmans N, Kuntz ID: Molecular recognition and docking algorithms. Annu Rev Biophys Biomol Struct 2003; 32: Kitchen DB, Decornez H, Furr JR, Bajorath J: Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nat Rev Drug Discov 2004; 3: Tomašić T: Računalniško podprto načrtovanje in sinteza novih heterocikličnih zaviralcev ligaz Mur. Ljubljana,

77 PRILOGA 1: Testni sistem za določanje afinitete antagonistov receptorja DC-SIGN in vitro Materiali: Anti-biotin kozja poliklonska protitelesa konjugirana s hrenovo peroksidazo, Bidestilirana voda, Biotiniliran gp120, BSA: goveji serumski albumin, CaCl 2 2H 2 O: kalcijev klorid dihidrat, M = 147,02 g/mol, DC-SIGN ECD, Mikrotitrske ploščice LUMITRAC TM 600: 96 vdolbinic, polistiren (bele barve), za merjenje fluorescence, proizvajalec Greiner bio-one GmbH, Nemčija, NaCl: natrijev klorid, M = 58,44 g/mol, Reagent za kemiluminiscenco: BM kemiluminiscenčni ELISA substrat (POD), sestavljen iz reagenta A (pufrna raztopina, ki vsebuje luminol in 4-jodofenol) ter reagenta B (pufrna raztopina, ki vsebuje stabilizirano obliko H 2 O 2 ), Tris: tris (hidroksimetil)aminoetan, (CH 2 OH) 3 CNH 2, M = 121,14 g/mol, Tween 20: polioksietilen-(20)-sorbitanmonolavrat, M = g/mol. 1. Priprava pufrov: najprej pripravimo pufre, ki jih bomo potrebovali pri izvedbi testa. Za pripravo uporabimo bidestilirano vodo. Pufer za redčenje (V = 150 ml, ph = 7,4) Reagent M (g/mol) Masa (g) c (mm) Tris 121,14 0, NaCl 58,44 1, CaCl 2 2H 2 O 147,02 0,088 4 (Ca 2+ ) Pri pripravi pufra za redčenje si lahko najprej zaradi enostavnejše natehte pripravimo raztopino Ca 2+ ionov z višjo koncentracijo in nato v pufer dodamo ustrezno količino pripravljene raztopine. ph pufra uravnamo z raztopino klorovodikove kisline (c = 1 M) na 7,4. 69

78 Pufer za spiranje (V = 500 ml, ph = 7,4) Reagent M (g/mol) Količina Končna koncentracija Tris 121,14 1,514 g 25 mm NaCl 58,44 4,383 g 150 mm CaCl 2 2H 2 O 147,02 0,294 g 4 mm (Ca 2+ ) Tween ,5 ml 0,1% (V/V) ph pufra uravnamo z raztopino klorovodikove kisline (c = 3 M) na 7,4. 2. Priprava mikrotitrskih ploščic z vezano ECD receptorja DC-SIGN: pripravimo raztopino proteina DC-SIGN s koncentracijo 4 µg/10,2 ml. Protein raztopimo v pufru za redčenje. Raztopino ECD DC-SIGN-a nanesemo na mikrotitrsko ploščico, 100 µl raztopine na vdolbinico. Ploščico inkubiramo čez noč (cca. 24h) v hladilniku (2-8 C). 3. Spiranje mikrotitrske ploščice: po inkubiranju ploščico spiramo s pufrom za spiranje. V vsako vdolbinico nanesemo 300 µl pufra in spiramo 5 min. Postopek ponovimo Blokiranje prostih vezavnih mest na mikrotitrskih ploščicah: pripravimo raztopino BSA. 250 mg BSA raztopimo v 25 ml pufra za redčenje. Raztopino nanesemo na mikrotitrsko ploščico, 200 µl na vdolbinico. Ploščico inkubiramo 1 h pri sobni T. 5. Spiranje mikrotitrske ploščice: po inkubiranju ploščico spiramo s pufrom za spiranje. V vsako vdolbinico nanesemo 300 µl pufra in spiramo 5 min. Postopek ponovimo Kompetitivna vezava: na ploščico v vsako vdolbinico v čim krajšem časovnem razmiku nanesemo po 50 µl pripravljenih raztopin potencialnih antagonistov in po 50 µl raztopine biotiniliranega gp120 (kot naravni ligand) s koncentracijo 1,25 µg/ml. V zadnje tri stolpce vedno nanesemo raztopine fukoze, kot referenco za določen IC

79 Začetna raztopina Redčitev 1 Redčitev 2 Redčitev 3 Redčitev 4 Redčitev 5 Redčitev 6 David Hajšek Shema ploščice A NEGATIVNA KONTROLA Osnovna raztopina 2 NEGATIVNA KONTROLA FUKOZA (200 Mm) B Osnovna raztopina 1 Redčitev 1 Osnovna raztopina 3 FUKOZA (60 Mm) C Redčitev 1 Redčitev 2 Redčitev 1 FUKOZA (20 Mm) D Redčitev 2 Redčitev 3 Redčitev 2 FUKOZA (6 Mm) E Redčitev 3 Redčitev 4 Redčitev 3 FUKOZA (2 Mm) F Redčitev 4 Redčitev 5 Redčitev 4 FUKOZA (0,6 Mm) G Redčitev 5 Redčitev 6 Redčitev 5 FUKOZA (0,2 Mm) H Redčitev 6 POZITIVNA KONTROLA Redčitev 6 POZITIVNA KONTROLA POZITIVNA KONTROLA 50 µl biotiniliranega gp µl pufra za ploščice NEGATIVNA KONTROLA 100 µl pufra za ploščice Potencialne antagoniste za nanos na ploščico redčimo po naslednji shemi: 10 redčitev 10 redčitev 10 redčitev 3,33 redčitev 10 redčitev 10 redčitev Po nanosu ploščico inkubiramo 2 h pri sobni T. 7. Spiranje mikrotitrske ploščice: po inkubiranju ploščico spiramo s pufrom za spiranje. V vsako vdolbinico nanesemo 300 µl pufra in spiramo 5 min. Postopek ponovimo Priprava in nanos protiteles konjugiranih s peroksidazo: iz že pripravljene raztopine BSA (250 mg/25 ml) odpipetiramo 1,2 ml in dopolnimo do 12 ml s pufrom za redčenje, da dobimo 0,1 % raztopino BSA. S sterilnim nastavkom za pipete (nastavek steriliziramo v avtoklavu 30 min pri 121 C) dodamo 20 µl protiteles proti biotinu konjugiranih s peroksidazo. Raztopino nanesemo na mikrotitrsko ploščico, 100 µl na vdolbinico. Ploščico inkubiramo 1 h pri sobni T. 71

80 9. Spiranje mikrotitrske ploščice: po inkubiranju ploščico spiramo s pufrom za spiranje. V vsako vdolbinico nanesemo 300 µl pufra in spiramo 5 min. Postopek ponovimo Priprava in nanos kemiluminiscenčnega reagenta: Na ploščico nanesemo predhodno pripravljen kemiluminiscenčni reagent, 50 µl na vdolbinico. Kemiluminiscenčni reagent pripravimo tik pred nanosom tako, da v graduirani plastični vsebnik odpipetiramo 6 ml reagenta A in 60 µl reagenta B, vsebnik zaščitimo pred svetlobo in pustimo mešati 15 min. 11. Merjenje kemiluminiscence: z luminometrom pomerimo luminescenco. Iz odziva lahko določimo, koliko odstotkov naravnega liganda se je vezalo na ploščico pri določeni koncentraciji potencialnega antagonista in na podlagi tega določimo IC

81 PRILOGA 2: Rezultati testiranj potencialnih antagonistov DC-SIGN REZULTATI REFERENČNIH VREDNOSTI: Fukoza, meritev 1: Fukoza, meritev 2: Fukoza, meritev 3: Fukoza, meritev 4: 73

82 Fukoza, neoptimiziran sistem: Manoza, neoptimiziran sistem: REZULTATI TESTIRANJ POTENCIALNIH ANTAGONISTOV AAG-11: AAG-12: AAG-13: AAG-14: 74

83 AAG-21: AAG-22: AAG-23: AKM-6: Man001: Man030 75

84 MP-1: TSZ-07: TSZ-15: TSZ-19: TSZ-20: TTD-09: 76

85 PRILOGA 3: Rezultati molekulskega sidranja V prilogi 3 so zbrani rezultati molekulskega sidranja za vse testirane potenicalne antagoniste receptorja DC-SIGN. Na slikah so prikazane konformacije in orientacije potencialnih antagonistov v vezavnem mestu z najboljšo vrednostjo cenilne funkcije. Potencialni antagonisti so prikazani z zelenimi, modrimi, rdečimi in sivimi paličicami, Ca 2+ je prikazan kot del zelene krogle, receptor DC-SIGN pa je prikazan s površino. AAG-11: AAG-12: AAG-13: AAG-14: 77

86 AAG-21: AAG-22: AAG-23: AKM-6: Man001: Man030: 78

87 MP-1: TSZ-07: TSZ-15: TSZ-19: TSZ-20: TTD-09 (R-enantiomer): 79

88 TTD-09 (S-enantiomer): 80