UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO SAMO JAKOVAC

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO SAMO JAKOVAC SINTEZA TRIPTAMINSKIH DERIVATOV S PROTIMIKROBNIM DELOVANJEM IN Z ZAVIRALNIM DELOVANJEM NA BAKTERIJSKO GLIKOZILTRANSFERAZO SYNTHESIS OF TRYPTAMINE DERIVATIVES WITH ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND INHIBITORY EFFECT ON BACTERIAL GLYCOSYLTRANSFERASE DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana, 2014

2 Diplomsko delo sem opravil na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, pod mentorstvom izr. prof. dr. Marka Anderluha, mag. farm. Spektroskopske meritve so opravili na Fakulteti za farmacijo, Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo in na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani. Zahvala Iskreno se zahvaljujem mentorju izr. prof. Marku Anderluhu za pomoč, svetovanje in vso posredovano znanje pri izdelavi diplomske naloge. Zahvaljujem se tudi vsem prijateljem, družini in kolegom s Fakultete za farmacijo, ki me podpirajo in so mi vedno stali ob strani. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelal samostojno pod mentorstvom izr. prof. dr. Marka Anderluha, mag. farm. Ljubljana, 2014 Samo Jakovac Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Iztok Grabnar, mag. farm. Član diplomske komisije: izr. prof. dr. Marko Anderluh, mag. farm. Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak, mag. farm - I -

3 Kazalo vsebine 1. UVOD ANTIBIOTIKI ODPORNOST NA PROTIMIKROBNE UČINKOVINE BAKTERIJE Bakterijska celična stena Biosinteza peptidoglikana Po Gramu pozitivne bakterije Po Gramu negativne bakterije PENICILIN VEZOČI PROTEINI (PBP) REAKCIJA S TRANSPEPTIDAZO REAKCIJA Z GLIKOZILTRANSFERAZO Naravni zaviralci glikoziltransferaze Sintezni zaviralci glikoziltransferaze NAČRT DELA MATERIALI IN METODE EKSPERIMENTALNO DELO Reakcijske sheme: Sintezni postopki in rezultati analiz Sinteza 2-(2-(1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (1) Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (2) Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamid (3) Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamida (4) Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'- ((etoksikarbonil)oksi)benzimidamida (5) Sinteza 2-(2-(1-(4-(5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzil)-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3- diona (6) Sinteza 3-(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (7) Sinteza amino(4-((3-(2-aminoetil)-1h-indol-1-il)metil)fenil)metaniminijevega acetata (8) Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (9) Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (10) Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (11) Sinteza 2-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (12) Sinteza 2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (13) Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3- il)etil)gvanidina (14) Sinteza 1-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (15) Sinteza 2-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (16) Sinteza 2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (17) Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3- il)etil)gvanidina (18) Sinteza 1-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (19) II -

4 5. RAZPRAVA Zaščita primarne amino skupine v obliki ftalimida Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina Odstranitev ftalimidne zaščitne skupine stopenjska pretvorba nitrila preko amidoksima in 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4- oksadiazola do amidina s katalitskim hidrogeniranjem Sinteza bis-boc gvanidina na primarni amino skupini alkiliranega 5- metoksitriptamina Odstranitev Boc zaščitne skupine BIOLOŠKO TESTIRANJE Testiranje citotoksičnosti Protimikrobna učinkovitost: in vitro testiranje SKLEP LITERATURA III -

5 Kazalo slik Slika 1: Struktura prokariontske celice (povzeto po 14) 3 Slika 2: Trodimenzionalni pogled peptidoglikana pri Gram+ bakteriji Staphylococcus aureus (povzeto po 10) 4 Slika 3: Zadnje stopnje biosinteze peptidoglikana 5 Slika 4: Struktura Gram+ bakterije 6 Slika 5: Struktura Gram- bakterije 6 Slika 6: reakcija z glikoziltransferazo (povzeto po 6) 9 Slika 7: Moenomicin A z označenimi za vezavo na PBP pomembnimi strukturnimi elementi (povzeto po 17) 12 Slika 8 : Levo, strukturi spojin 5 in 5b; desno, računalniški model sidranja spojine 5b v rentgensko strukturo moenomicina vezanega na glikoziltransferazo iz S. aureus PBP2 14 Slika 9: Spojina vodnica 16 Slika 10: Spojina vodnica z vključenimi strukturnimi spremembami 16 Slika 11: Končne spojine za testiranje učinkovitosti zaviranja encima glikoziltransferaze in testiranja citotoksičnosti 18 Slika 12: Mehanizem zaščite primarne amino skupine v obliki ftalimida 48 Slika 13: Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina 49 Slika 14: Mehanizem odstranitve ftalimidne zaščitne skupine 50 Slika 15: Mehanizem sinteze bis-boc gvanidina na primarni amino skupini 52 Kazalo preglednic Preglednica 1: Rezultati testiranja citotoksičnosti na celičnih kulturah PBMC in HEK Preglednica 2: Rezultati in vitro testiranja (RA, IC50 in MIC vrednosti) končnih spojin Kazalo grafov Graf 1: Prikaz odstotka metabolne aktivnosti PBMC celične kulture po dodatku testiranih spojin IV -

6 Povzetek V današnjem času predstavljajo vedno večji problem rezistentne bakterije, ki resno ogrožajo zdravje ljudi. Razširjenost in neprimerna uporaba antibiotikov je ustvarila močan evolucijski pritisk na nastanek bakterij, ki so bodisi naravno odporne proti antibiotikom ali pa imajo možnost za pridobitev odpornosti. Bakterijske infekcije so v razvitem svetu še vedno velik vzrok umrljivosti, zato je nujno potreben napredek na področju sinteze novih protimikrobnih zdravil. V zadnjem času se odkrivajo nove učinkovine z drugačnimi mehanizmi delovanja, kot jih imajo spojine na tržišču. Razlog je predvsem v tem, ker bakterije postajajo multirezistentne. Kot zadnjo linijo obrambe na multirezistentne seve imamo trenutno na voljo le nekaj protimikrobnih učinkovin. Veliko pozornosti se posveča učinkovinam, ki neposredno vplivajo na sintezo celične stene. Peptidoglikan v celični steni predstavlja pomembno tarčo, saj lahko njegovo sintezo blokiramo z inhibicijo več različnih encimov. V zadnjih stopnjah sinteze peptidoglikana sodelujeta glikoziltransferazna in transpeptidazna domena penicilin vezočih proteinov. V okviru diplomskega dela smo načrtovali in sintetizirali inhibitorje bakterijske glikoziltransferaze. Encim glikoziltransferaza polimerizira glikansko verigo z uporabo substrata lipida II. Poznamo dve glavni skupini inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. V prvi so spojine, ki se vežejo na substrat in prepoznajo strukturne elemente v lipidu II in nastajajočem peptidoglikanu, v drugi pa spojine, ki se vežejo na glikoziltransferazo. Načrtovali in sintetizirali smo derivate triptamina in 5-metoksitriptamina, ki zavirajo glikoziltransferazo predvidoma z vezavo na lipid II. Za identifikacijo spojin smo uporabljali različne metode: npr. NMR, IR, in MS, za preverjanje čistosti spojin pa HPLC. Spojine smo poslali tudi na testiranje citotoksičnosti in protimikrobne učinkovitosti. Rezultati testiranj so pokazali, da imajo nekatere spojine dobro protimikrobno učinkovitost in nizko stopnjo citotoksičnosti. - V -

7 Abstract Nowadays resistant bacteria represents a growing problem which seriously affects human health. Prevalence and inappropriate use of antibiotics has created a strong evolutionary pressure on the emergence of bacteria that are either naturally resistant to antibiotics or have the possibility to acquire resistance. In the developed world bacterial infections are still a major cause of death. This is why the progress in the synthesis of new antimicrobial agents is urgently needed. Recently new active substances with different mechanisms of action are being discovered in comparison to the compounds on the market. The main reason is that bacteria are acquiring multidrug resistance. As a last line of defense for multidrug resistant strains, only a few antimicrobial agents are currently available. A lot of attention is devoted to agents that directly affects cell wall synthesis. Peptidoglycan in the cell wall is an important target, because it can be blocked by inhibiting the synthesis of several different enzymes. Glycosyltransferase and transpeptidase domain of penicillinbinding proteins participate in the final stages of peptidoglycan synthesis. Within the framework of the thesis, we planned and synthesized inhibitors of bacterial glycosyltransferase. Enzyme glycosyltransferase polymerizes the glycan chain using the lipid II substrate. There are two main groups of inhibitors of bacterial glycoslytransferase. In the first one are compounds which bind to the substrate by identifying the structural elements within lipid II and emerging peptidogylcan. In the second one are compounds which bind to glycosyltransferase. We planned and synthesized derivatives of tryptamine and 5-methoxytryptamine, which presumably inhibit glycosyltranferase by binding to lipid II. Various methods for identification such us NMR, IR and MS were used. The purity of the compounds was identified with HPLC. The compounds were also sent for testing cytotoxicity and antimicrobial effectiveness. The test results have shown that some of the compounds have good antimicrobial activity and a low level of cytotoxicity. - VI -

8 Seznam okrajšav AUC B Boc c CDCl3 CD3OD CFU CH2Cl2 CH3CN CF3COOH Cs2CO3 Ctrl d D-Ala dd ddd DKM D-Lac DMF DMSO DMSO-d6 DNK dt ekv. Et3N EtOH EtOAc FDA Ang. area under curve/ploščina pod krivuljo baza t-butiloksi karbonilna skupina koncentracija devteriran kloroform devteriran metanol Ang. colony forming units diklorometan acetonitril trifluoroocetna kislina cezijev karbonat kontrola dublet D-alanin dublet dubleta dublet dublet dubleta diklorometan D-laktoza N,N-dimetilformamid dimetilsulfoksid devteriran dimetilsulfoksid deoksiribonukleinska kislina dublet tripleta ekvivalent trietilamin etanol etilacetat Ang. Food and Drug Administration - VII -

9 FtsW GlcNAc Gram- Gram+ GlcNAc h HEK-293 HMW PBP HPLC HRMS IC50 IR J L-Ala Lipid I Lipid II LPS m M MeOH MF MIC MRSA MraY MS MurA MurB MurC MurD protein odgovoren za delitev bakterijske celice N-acetilglukozamin po Gramu negativne bakterije po Gramu pozitivne bakterije N-acetilglukozamin ura human embryonic kidney 293 cels/humane embriološke ledvične celice penicilin vezoči proteini z visoko molekulsko maso Angl. high presure liquid cromatography/tekočinska kromatografija visoke ločljivosti masna spektrometrija visoke ločljivosti koncentracija inhibitorja, ki zmanjša hitrost encimske reakcije na polovico infrardeča spektroskopija sklopitvena konstanta L-alanin undekaprenil-pirofosforil-murnac-pentapeptid undekaprenil-pirofosforil-murnac-(pentapeptid)-glcnac lipopolisaharidi multiplet molarnost (mol/l) metanol mobilna faza minimalna inhibitorna koncentracija na meticilin odporen Staphylococcus aureus UDP-N-acetilmuramoil-pentapeptid fosfotransferaza masna spektrometrija UDP-N-acetilglukozamin enolpiruviltransferaza UDP-N-acetilenolpiruvilglukozamin reduktaza UDP-N-acetilmuramat L-alanin ligaza UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamat ligaza - VIII -

10 MurE MurF MurG MGT MurNAc nm NMR PBMC PBP Pd/C PES RA Rf s t Ttal TEA TLC Tg TG TMS TP UDP VRE λ η UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamat-meso-diaminopimelat ligaza UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamoil-meso-diaminopimelat-Dalanin-D-alanin ligaza N-acetilglukozamin transferaza monofunkcionalna glikoziltransferaza N-acetilmuraminska kislina nanometer jedrska magnetna resonanca Ang. peripheral blood mononuclear cells/mononuklearne celice periferne krvi Ang. penicillin binding proteins/penicilin vezoči proteini paladij na ogljiku fenazin etosulfat rezidualna aktivnost retencijski faktor singlet triplet temperatura tališča trietilamin tankoplastna kromatografija temperatura steklastega prehoda transglikozilazni(a), npr. domena tetrametilsilan transpeptidazni(a), npr. domena uridin difosfat na vankomicin odporni enterokoki kemijski premik valovna dolžina izkoristek - IX -

11 1. UVOD 1.1. ANTIBIOTIKI Boj proti bakterijskim okužbam je zadnjih 70 let velika zgodba o uspehu farmacije, vendar ne vemo, koliko časa bo trajala. Bakterije, kot so npr. Staphylococcus aureus povzročajo strokovnjakom veliko skrbi, ker so sposobne pridobiti odpornost proti antibiotikom. Iskanje novih protimikrobnih učinkovin se zato nikoli ne konča. Bakterijske okužbe so v razvitem svetu še vedno velik vzrok smrtnosti (1). Antibiotiki so bakterijski metaboliti ali njihovi polsintezni analogi. Učinkujejo tako, da zavirajo rast in preživetje mikroorganizmov ter v optimalnem primeru niso toksični za gostitelja. Njihov ključni koncept je selektivna toksičnost. Antibiotiki so v današnjem času med najpogosteje predpisanimi zdravili, vendar je njihova učinkovitost ogrožena zaradi pogoste nepravilne uporabe ali zlorabe. V mnogih primerih je učinkovitost naravnih antibiotikov izboljšana s spreminjanjem prvotne kemijske strukture, kar vodi do širšega protimikrobnega spektra, večje jakosti, manjše toksičnosti in ugodnih farmakokinetičnih lastnosti. V skupino protimikrobnih učinkovin spadajo naravni in polsintezni antibiotiki ter kemoterapevtiki, ki so sinteznega izvora (2). Antibiotiki delujejo na različna mesta v bakterijski celici. Pogosto učinkujejo tako, da plazemska membrana postane bolj prepustna za ione in druge male molekule ali pa inhibirajo biosintezo celične stene. Ostali poznani mehanizmi so inhibicija celičnega metabolizma, zaviranje sinteze celičnih proteinov ali zaviranje prepisa in podvajanja nukleinski kislin. V vseh primerih je končni rezultat nepopravljiva poškodba bakterijskih celic, kar vodi v njihovo smrt (1, 3) ODPORNOST NA PROTIMIKROBNE UČINKOVINE Po sedmih desetletjih množične uporabe antibiotikov ugotavljamo, da bakterijski patogeni človeškega in živalskega izvora postajajo vedno bolj odporni na številne antibiotike (4). Odpornost mikroorganizmov je pojav, ko s protimikrobnimi učinkovinami ne moremo več ubiti ali inhibirati mikroorganizmov. Odpornost je lahko intrinzična (opazna že pred izpostavljenostjo antibiotiku) ali pridobljena (razvije se po izpostavljenosti antibiotiku). Odpornost bakterij na toksične učinke protimikrobnih učinkovin se razvije dokaj enostavno in predstavlja vse večjo nevarnost za javno zdravje (2). Razširjena in včasih neprimerna - 1 -

12 uporaba antibiotikov je ustvarila močan evolucijski pritisk na nastanek bakterij, ki so bodisi naravno odporne proti antibiotikom ali pa imajo možnost za pridobitev odpornosti (5). Odporni sevi bakterij se najprej pojavijo v bolnišnicah, kjer je selekcijski pritisk največji, nato pa se razširi v okolico (6). Mnogi izmed običajnih bakterijskih patogenov, kot so Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis in Streptococcus pneumoniae so postali odporni. Na meticilin odporni S. aureus, na vankomicin odporni E. faecalis in na penicilin odporni S. pneumoniae so danes poznani patogeni mikroorganizmi, ki jih je zelo težko učinkovito zdraviti. Tudi na vankomicin, ki je eden od zadnjih delujočih aktivnih antibiotikov proti S. aureus in drugim Gram+ bakterijam, že poznamo rezistentne seve bakterij. Kratkoročne strategije za reševanje problema odpornosti na antibiotike vključujejo kemijsko spremembo obstoječih antibiotikov, odkritje novih tarč in razvoj novih vrst antibiotikov (4). Dejstvo, da se v zadnjih desetletjih število na novo odkritih protimikrobnih učinkovin zmanjšuje, bi lahko imelo za posledico slabše obvladovanje javnega zdravja (6). Odpornost se je do danes pojavila že pri vseh razredih antibiotikov v klinični uporabi, prav tako pa je veliko patogenih mikroorganizmov pridobilo odpornost na več različnih antibiotikov (7). Mutacije, ki vodijo k odpornosti bakterij, nastanejo z delovanjem številnih mehanizmov. Ti so lahko posledica točkovnih mutacij, vstavljanja, brisanja, inverzije, podvajanja in prenosov segmentov genov ali s pridobitvijo tuje DNK od plazmidov, bakteriofagov in transpozicijskih genetskih elementov. Genetski material, ki kodira to obliko odpornosti, se pogosto prenaša preko kromosomskih elementov v majhnih krožnih DNK molekul, znanih kot plazmidi (2) BAKTERIJE Raznolikost mikroorganizmov kot jo poznamo danes, je rezultat skoraj 4 milijarde let evolucije. Bakterijsko raznolikost lahko opazujemo v mnogih pogledih, vključno z velikostjo celic, morfologijo, fiziologijo, gibljivostjo, mehanizma delitve celic, patogenosti in prilagajanja na ekstremne življenjske razmere (8). Prokarionti se razlikujejo od evkariontov v velikosti in celični strukturi. Večina prokariontov za razliko od evkariontov ne vsebuje zapletenih notranjih membranskih struktur (9). Prokarionti se razlikujejo po velikosti celic in so veliki od 0,2 µm do 700 µm v premeru (8). Na osnovi strukture celične stene bakterije razdelimo na Gram+ in Gram- bakterije. Če pogledamo obliko se bakterije najpogosteje nahajajo v obliki kokov, bacilov, spirilov, vibrijev ali spirohet. Prokariontske - 2 -

13 celice skoraj vedno obdaja kompleksna celična stena, v notranjosti stene pa se nahaja plazemska membrana (Slika 1). Le-ta služi za ključne metabolične procese, kot so dihanje, fotosinteza ter sinteza lipidov in drugih sestavin celične stene. Notranjost prokariontske celice se zdi preprosta, saj ne vsebujejo na membrano vezanih organelov. Genetski material se nahaja v obliki kromosoma, ki običajno od citoplazme ni ločen z membrano. Ribosomi in inkluzijska telesa so razpršena po celotnem citoplazemskem matriksu. Mnogi prokarionti za premikanje uporabljajo migetalke, poleg tega pa so pogosto obdani s kapsulo ali plastjo sluzi (9), ki celico varuje pred izsušitvijo, pomaga loviti hranila in veže Slika 1: Struktura prokariontske celice (povzeto po 14) bakterije v skupek (10) Bakterijska celična stena Bakterijske celice so obdane s precej zapleteno in togo celično steno in se bistveno razlikujejo od sesalskih celic, ki so obdane s fleksibilno membrano. Encimi, ki sodelujejo pri izgradnji celične stene nimajo neposredne povezave s sesalskimi celicami. To zagotavlja potencialno zanimive tarče za selektivno toksičnost proti bakterijskimi celicami (2). Celična stena je ena od najpomembnejših struktur bakterije, saj pomaga določiti obliko celic, zagotovi polprepustno membrano z okoljem, skozi katero lahko prehajajo le želene snovi in obvaruje celico pred osmolizo. Prepreči tudi prebavo z encimi gostitelja, zaščiti celice pred strupenimi snovmi in lahko prispeva k patogenosti (9) Biosinteza peptidoglikana Peptidoglikan ali murein je zamrežen polimer, ki popolnoma obdaja bakterijsko celico in preprečuje, da bi celica zaradi visokega znotrajceličnega tlaka počila (11). Ena od njegovih glavnih nalog je stabilizacija bakterijskih membran pred visokim notranjim osmoznim tlakom in s tem zagotavljanje preživetja bakterijske celice (7). Sestavljen je v dvo ali tridimenzionalno ureditev glikanskih sklopov in peptidnih verig, kar vodi v eno ali večplastno strukturo. Glikanski sklopi so sestavljeni iz linearnih polisaharidnih verig z zaporedjem N-acetilmuraminske kisline (MurNAc) in N-acetilglukozamina (GlcNAc), povezanih z β-1,4 glikozidno vezjo (Slika 2). Na D-mlečni kislini molekule MurNAc, se - 3 -

14 nahaja pentapeptid iz L-alanina, D-glutaminske kisline, diamino kisline in D-alanil-Dalanina (12). V večini Gram+ bakterij je diamino kislina L-lizin, v večini Gram- pa mezodiaminopimelinska kislina (10). D-izomerov aminokislin ne najdemo v evkariontskih proteinih. Prisotnost D-aminokislin ščiti bakterijsko steno pred razgradnjo z večino peptidaz, ki prepoznajo samo L-izomere aminokislin (9). Prečna povezava nastane s povezovanjem NH2 skupine na diamino kislini s karboksilno skupino na predzadnjem D- alaninu, zadnji D-alanin pa se odcepi (12). Slika 2: Tridimenzionalni pogled peptidoglikana pri Gram+ bakteriji Staphylococcus aureus (povzeto po 10) Biosinteza peptidoglikana je dvostopenjski proces. Prva stopnja poteka v citoplazmi, kjer vrsta specifičnih encimskih reakcij povzroči nastanek monomerne enote GlcNAc- MurNAc-pentapeptid, ki je povezana z lipidom undekaprenolom preko pirofosfatne skupine in ga lahko imenujemo predhodnik lipida II. Encimi, ki sodelujejo pri nastajanju peptidoglikana na citoplazemskem nivoju so MurA, MurB, MurC, MurD, MurE in MurF (12). Encim MraY je transmembranski protein, ki prenese fosfo-murnac-pentapeptid na undekaprenilpirofosfat, pri tem nastane lipid I. Encim MurG pa se nahaja na notranji strani membrane in katalizira reakcijo z GlcNAc, pri čemer nastane lipid II (6). Premestitev lipidnega intermediata preko membrane v zunajcelični prostor (Gram+ bakterije) ali periplazmo (Gram- bakterije) je katalizirana z encimom flipazo, le-ta še ni popolnoma raziskana, morda gre za protein odgovoren za celično delitev FtsW. Druga stopnja v biosintezi peptidoglikana vključuje polimerizacijo glikanske verige, ki jo katalizirajo encimi glikoziltransferaze, za prečno premreževanje pa skrbi encim transpeptidaza (Slika 3). Natančen mehanizem reakcije z glikoziltransferazo še ni znan (12). Sosednje glikanske - 4 -

15 verige so zamrežene s peptidnimi mostički, ki povezujejo amino skupino na stranski verigi diamino kisline ene peptidne enote s karboksilno skupino na terminalnem D-alaninu druge peptidne enote (Slika 2) (13). Struktura polipeptidne povezave v peptidoglikanu se od bakterije do bakterije spreminja, med tem ko vedno vsebuje tetrapeptidno stransko verigo, ki povezuje sklope polisaharidnih verig (14). Znanih je več kot 100 vrst peptidoglikanov, raznolikost se kaže predvsem v peptidnih mostičkih (8). Slika 3: Zadnje stopnje biosinteze peptidoglikana Po Gramu pozitivne bakterije Celična stena Gram+ bakterije sestoji iz enojne, nm debele homogene plasti peptidoglikana, ki se nahaja zunaj plazemske membrane. Prečne povezave s peptidnimi mostički v peptidoglikanu dajejo gosto premreženo strukturo, ki varujejo bakterijo pred zunanjimi vplivi (9). Stena vsebuje velike količine teihoične kisline, ki je sestavljena iz izmenično povezanih do 30 enot glicerola ali ribitola in fosfatnih skupin, na glicerolu/ribitolu pa je pripeta glukoza, D-alanin ali druge molekule (10). Teihoična kislina je kovalentno vezana na muraminsko kislino v peptidoglikanu (8), če pa je pripeta na lipide v plazemski membrani, se imenuje lipoteihoična kislina (Slika 4). Teihoična kislina je negativno nabita in sega do površine peptidoglikana, kar daje Gram+ celični steni - 5 -

16 negativni naboj. Funkcija teh molekul še ni popolnoma razjasnjena, vendar pa ima po eni strani pomembno vlogo pri ohranjanju strukture celične stene, po drugi strani pa verjetno služijo kot prehod za prenos Ca 2+ in Mg 2+ ionov v in iz celice (10, 14). Stafilokoki in večina drugih Gram+ bakterij vsebuje plast proteinov na površini celične stene peptidoglikana. Ti proteini so vključeni v medsebojno interakcijo z okoljem. Nekateri so nekovalentno vezani na peptidoglikan, teihoično kislino ali druge receptorje, nekateri pa tvorijo kovalentno povezavo. Primer kovalentne vezave encima je na primer M protein v patogenem streptokoku, ki ima vlogo adhezije na tkivu gostitelja ter se s tem vmeša in oteži gostiteljev obrambni mehanizem (9). Slika 4: Struktura Gram+ bakterije (povzeto po 9) Po Gramu negativne bakterije Celična stena Gram- bakterije sestoji iz 2-7 nm debele homogene plasti, ki jo pokriva 7-8 nm debela zunanja membrana. Zaradi tanjšega sloja peptidoglikana kot v Gram+ bakteriji so Gram- bakterije slabše odporne na osmotski tlak. Celična stena Gram- bakterije je bistveno bolj zapletena kot Gram+ bakterije. Tanek sloj peptidoglikana je omejen na obeh straneh s periplazmatskim prostorom in predstavlja največ 5-10% mase celične stene, medtem ko periplazmatski prostor predstavlja kar 20-40% celotnega volumna celice. Celična stena v E. coli je debela le 2 nm in vsebuje le Slika 5: Struktura Gram- bakterije (povzeto po 9) eno do dve plasti peptidoglikana (9)

17 Peptidoglikan ne vsebuje peptidnih mostičkov, kot v Gram+ bakteriji. Zunanja membrana se nahaja za plastjo peptidoglikana in je povezana s celico preko Braunovih lipoproteinov. (Slika 5) Ti majhni lipoproteini so kovalentno povezani s peptidoglikanom, s hidrofobnim delom pa so sidrani v peptidni dvosloj zunanje membrane. Najbolj nenavadna sestavina zunanje membrane so lipopolisaharidi (LPS). To so velike kompleksne molekule iz lipidov in polisaharidov. Lipidni del je sestavljen iz lipida A in je umeščen v membrano, središčni del in stranska veriga iz polisaharidov pa segata na površino zunanje membrane. LPS imajo številne pomembne funkcije. Središčni polisaharidi vsebujejo negativno nabite sladkorje in fosfatne skupine, kar daje celici negativni naboj. LPS prispevajo tudi k pritrditvi bakterije na podlago in tvorbo biofilma, medtem ko lipid A pomaga stabilizirati strukturo zunanje membrane. Glavna naloga LPS je preprečevanje prepustnosti žolčnih kislin, antibiotikov in drugih strupenih snovi, ki lahko ubijejo ali poškodujejo bakterijo. Stranska veriga se imenuje tudi antigen O, saj pri gostitelju sproži imunski odziv, to je tvorbo protiteles proti specifični obliki LPS (9). Običajni patogeni za ljudi in druge sesalce vključujejo vrste Salmonella, Shigella in Escherichia, ki povzročijo črevesne simptome, leti pa so poledica toksičnih zunanjih delov membrane (8). Mnoge bakterije lahko hitro spreminjajo antigensko naravo stranske verige in na ta način zmanjšajo učinkovitost obrambe gostitelja. Lipid A je endotoksin, ki se sprosti ob odmrtju bakterije. Za človeški organizem je toksičen in ga povezujemo s simptomi kot so vročina, razširitev krvnih žil in strjevanje krvi (14). Če bakterije ali njihovi antigeni zaidejo v krvni obtok, lahko povzročijo septični šok (9) PENICILIN VEZOČI PROTEINI (PBP) Penicilin vezoči proteini (PBP) so sestavni del bakterijske citoplazemske membrane, ki katalizirajo končne stopnje biosinteze peptidoglikana in lahko predstavljajo nove tarče za razvoj antibiotikov (15, 16). Omenjene stopnje vključujejo tri vrste encimskih reakcij z: glikoziltransferazo, ki polimerizira glikansko verigo z uporabo substrata lipida II, transpeptidazo, ki navzkrižno poveže glikanske verige in D-alaninkarboksipeptidaza, ki naj bi imela regulatorno vlogo. PBP lahko razdelimo v dve skupni glede na molekulsko maso in zaporedje aminokislin v proteinu. PBP z nizko molekulsko maso katalizirajo D- alaninkarboksipeptidazne reakcije, medtem ko PBP z visoko molekulsko maso katalizirajo reakcije z glikoziltransferazo in transpeptidazo (16). Slednji se delijo na razred A-PBP in razred B-PBP. Razred A je vedno sestavljen iz glikoziltransferazne (GT) in - 7 -

18 transpeptidazne (TP) domene, medtem ko razred B vsebuje zgolj transpeptidazno domeno. V nekaterih bakterijah se nahaja tudi nizkomolekularna monofunkcionalna glikoziltransferaza (MGT) (15, 17). Skupina bifunkcionalnih A-PBP z visoko molekulsko maso (HMW) je povezana z membrano in se nahaja tako v Gram+ kot Gram- bakterijah. HMW PBP so molekule z več domenami in so sestavljene iz kratke N-terminalne citoplazemske regije, transmembranske regije in C-terminalne periplazemske regije. N- terminalna domena vsebuje GT aktivnost, medtem ko C-terminalna domena vsebuje TP aktivnost (4, 18) REAKCIJA S TRANSPEPTIDAZO Raeakcija s transpeptidazo poteče na račun prekinitve D-alanil-D-alanil povezave v pentapeptidu. Nastane serinski ester med peptidom in encimom, sočasno se terminalni D- alanin sprosti s pentapeptida, to pa se doseže s prenosom stranske peptidne verige na amino skupino v diamino kislini drugega peptida. Ker reakcija vključuje prekinitev D- alanin-d-alanin povezave, je razvrščena v s skupino DD-transpeptidaz (13). β-laktamski antibiotiki, kot so penicilini, cefalosporini in karbapenemi so specifični inhibitorji transpeptidaze in D-alaninkarboksipeptidaze, saj vsebujejo strukturno podobnost s substratom. Tvorijo kovalentno povezavo z aktivnim mestom serinom v transpeptidazni domeni. To preprečuje premeževanje peptidnih verig v peptidoglikanu, kar vodi do celične smrti. Streptococcus pneumoniae, pomemben povzročitelj obolenja zgornjih dihalnih poti pri človeku, vsebuje kar šest PBP, med njimi so trije iz razreda A, dva iz razreda B in eden iz razreda nizkomolekularnih proteinov (6, 16) REAKCIJA Z GLIKOZILTRANSFERAZO Pojav odpornosti proti antibiotikom je spodbudilo prizadevanja raziskovalcev v smeri pridobivanja strukturnih informacij za encime v biosintezi peptidoglikana in odkrivanje novih inhibitorjev posameznega encima. Pomemben napredek je bil dosežen za večino znotrajceličnih encimov in več vrst zunajceličnih penicilin vezavnih proteinov. Za skupino encimov bakterijske glikoziltransferaze, ki katalizirajo polimerizacijo verig v peptidoglikanu, je napredek potekal izjemno počasi. Reakcija transglikozilacije tako ostaja»črna skrinjica«v na splošno dobro raziskani biosintezi bakterijskega peptidoglikana. Upamo, da bo natančno poznavanje pomembnih bakterijskih encimov in procesov sčasoma pripeljalo do odkritja novih antibiotikov (7)

19 Celovitost celične stene je bistvena za preživetje bakterije in je odvisna od pravilnega delovanje bakterijskih glikoziltransferaz. V biosintezi peptidoglikana se zdi glikoziltransferaza dobra tarča, saj ne poznamo humanih homologov teh encimov, poleg tega pa se nahajajo zunaj celične membrane (7). Hitro širjenje odpornosti na β-laktamske antibiotike in druge antibiotike, ki imajo tarčo v celični steni (kot so glikopeptidi), poziva k razvoju novih antibiotikov. Aktivnost glikoziltransferaze predstavlja zaradi pomembne vloge v biosintezi peptidoglikana novo terapevtsko tarčo, poleg tega pa je zaradi nahajanja izven celične membrane lahko dostopna majhnim molekulam (12). Zunajcelična lokacija ima prednost iz dveh razlogov: kot potencialne inhibitorje lahko testiramo večji nabor spojin, ker za učinkovitost ni potreben prodor v celico. Nadalje je za razvoj odpornosti možnih manj različnih mehanizmov (7). Neposredni predhodnik peptidoglikana je lipid II (undekaprenil-pirofosforil-murnac- (pentapeptid)-glcnac) (6). Gre za disaharid s peptidno skupino, ki je vezan na prenašalec undekaprenil lipid (C55H89) s pirofosfatnim mostom (13). Bakterijska glikoziltransferaza iz razreda glikoziltransferaz (EC 2.4) katalizira premik pirofosfatne skupine lipida II na 4- hidroksi skupino N-acetilglukozamina v rastoči glikanski verigi, pri čemer se prenašalec undekaprenil pirofosfat sprosti (13, 19). Tako lipid II kot rastoča peptidoglikanska veriga sta pritrjena na citoplazemsko membrano preko hidorfobnega dela (17) (Slika 6). Slika 6: Reakcija z glikoziltransferazo (povzeto po 6) Struktura glikoziltransferaze je sestavljena iz 9 alfa-vijačnic, ki sestavljajo dva režnja, med katerima se nahaja katalitična špranja (6). Le-ta lahko sprejme do šest sladkornih enot. Razdeljena je na dve podstrani, donorsko mesto za podaljševanje verige in akceptorsko mesto za vezavo substrata lipida II. Na obrobju encimske špranje se nahajata dva glutamata, ki sta za katalitično reakcijo izrednega pomena (20)

20 Raziskave o načinu delovanja glikoziltransferaze in razvoj učinkovite metode za njeno testiranje sta bili v preteklosti ovirani. Raziskave študija glikoziltransferaz ovira pridobivanje in ravnanje s substratom lipidom II. Metoda za izolacijo lipida II je zaradi njegove nizke vsebnosti v bakterijah in strukturne kompleksnosti izjemno težavna. Razvoj izboljšanih testnih sistemov za spremljanje transglikozilacije je zato v zadnjem času postal predmet številnih raziskav. Z razvojem kemijske in kemijsko-encimske sinteze prekurzorjev lipida II je omogočena vzpostavitev učinkovitih encimskih testov za spremljanje transglikozilacije (4) Naravni zaviralci glikoziltransferaze Obstajata dve glavni skupini naravnih inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. V prvi so spojine, ki se vežejo na substrat in prepoznajo strukturne elemente v lipidu II in nastajajočem peptidoglikanu, v drugi pa spojine, ki se vežejo na glikoziltransferazo (7) Naravni zaviralci, ki se vežejo na substrat Število in strukturna raznolikost znanih ali domnevnih spojin, ki se vežejo na substrat in s tem blokirajo glikoziltransferazo, je izredno velika, kar pomeni, da je vezava na substrat evolucijsko uspešna strategija za blokiranje tega koraka biosinteze peptidoglikana (7). Vankomicin je prvi odkriti primer spojine, ki uničuje bakterije s ciljanjem na lipid II. Izolirali so ga iz zemeljske bakterije Amycolatopsis orientalis leta Ugotovili so, da se veže na D-Ala-D-Ala v pentapeptidu preko 5 vodikovih vezi in s tem blokira biosintezo celične stene. Po enakem mehanizmu se na lipid II veže antibiotik teikoplanin (5). Negativna lastnost takšne vezave je le v spremembi specifičnega substrata za pojav odpornih sevov bakterij (17). V zadnjem času so dokazali, da je lipid II tarča tudi drugih naravnih spojin, vključno z lantobiotiki, manopeptimicini in ramoplaninom, ki delujejo z različnimi mehanizmi (5). Najstarejši in najbolj intenzivno raziskan policiklični peptidni lantibiotik je nisin. Proizvajajo ga nekateri sevi Lactococcus lactis. Sestavljen je iz 34 aminokislin in ima celokupno pozitivni naboj. Zaradi močnega baktericidnega učinka in nizke toksičnosti, se nisin uporablja kot naravni konzervans v prehranski industriji z oznako E234. Sprva so mislili, da se nisin podobno kot vankomicin veže na lipid II in zavira glikoziltransferazo, vendar so kasneje ugotovili, da uporablja lipid II kot»docking molekulo«in nato ciljano z

21 visoko učinkovitostjo tvori pore v celični steni. Pri mnogih sevih bakterij povzroči takojšnjo smrt že pri nanomolarnih koncentracijah (5, 17, 21). Ramoplanin je glikolipodepsipeptidni antibiotik, ki se uporablja za zdravljenje infekcij gastrointestinalnega trakta povzročenih z Clostridium difficile. FDA ga je odobril, vendar se lahko uporablja zgolj peroralno, saj je v plazmi nestabilen. Izredno je aktiven proti Gram+ bakterijam, vključno z MRSA in VRE. Odkrili so, da se na lipid II veže v obliki dimera (17, 22). Vezalci na substrat imajo številne prednosti pred tistimi spojinami, ki blokirajo encime. Značilno je, da blokirajo več stopenj v biosintezi peptidoglikana in/ali delujejo na več zaviralnih mehanizmov v molekuli. Tako lahko na primer vankomicin z vezavo na D-Ala- D-Ala blokira tako reakcijo z glikoziltransferazo kot sledečo reakcijo transpeptidacije. Poleg tega se nekateri analogi vankomicina vežejo tako na substrat kot na encim (7). Po 50 letih klinične uporabe vankomicina proti Gram+ bakterijam, odpornih na druge antibitotike, je ta dolgoletna uporaba npr. v enterokokih povzročila zamenjavo terminalnega D-Ala-D-Ala z D-Ala-D-Lac, kar je zmanjšalo jakost vezave vankomicina z njegovo osnovno tarčo za 1000 x. Omenjeno je močan razlog za iskanje alternativnih antibiotikov, ki bi jih uporabljali za zdravljenje življenjsko ogrožajočih infekcij (6). Vezalci na substrat imajo tudi nekatere pomanjkljivosti. So velike in relativno polarne molekule, kar pomeni, da so z izjemo ramoplanina peroralno neuporabne in ne morejo predreti zunanje membrane Gram- bakterije. Potrebno jih je aplicirati parenteralno, njihov spekter aktivnosti pa je omejen na Gram+ bakterije. Vseeno pa sta bila vankomicin in teikoplanin desetletja zelo pomembni učinkovini in sta še vedno v klinični uporabi (7) Naravni zaviralci, ki se vežejo na glikoziltransferazo Drugi način inhibicije procesa glikoziltransferaze je neposredna interakcija s TG domeno v več različnih PBP in MTG. Ciljanje TG encimov je zahteven pristop, saj njihova vloga in porazdelitev v različnih vrstah bakterij ni povsem pojasnjena (17). Edine znane naravne spojine, ki inhibirajo GT domeno pripadajo družini antibiotikov, imenovanih moenomicini. So naravni produkti iz družine fosfoglikolipidnih antibiotikov, ki jih proizvaja bakterija Streptomyces ghanaensis. Strukturno so si zelo podobni in se s skupnim imenom imenujejo Flavomicin (6). Najpomembnejši član te družine je moenomicin A, ki je izredno močan inhibitor. Njegovo delovanje proti Gram+ bakterijam je x močnejše od

22 vankomicina. Minimalna inhibitorna koncentracija je v območju od 0,01 do 0,1 µg/ml (7, 23). Moenomicin zavira rast bakterij z blokiranjem transglikozilazne aktivnosti razreda A PBP, ki so glavni sodelujoči encimi v biosintezi bakterijske celične stene (24). Klinična uporabnost moenomicina A je zaradi slabe biološke uporabnosti in visoke stopnje vezave na serumske proteine ovirana, zato se trenutno uporablja le kot pospeševalec rasti v krmi za živali (23, 24). Transglikozilacija je večinoma katalizirana z razredom A bifunkcionalnih PBP. Ugotovili so, da je za vezavo moenomicina A najbolj pomembna transmembranska domena bifunkcionalnih PBP (24). Moenomicin vsebuje tri strukturno različna področja: pentasaharid, fosfoglicerat in izoprenilno verigo s 25 C atomi, imenovano moenocinil, po katerem je moenomicin dobil tudi ime (Slika 7). Študije so pokazale, da je za vezavo na PBP potrebna tako hidrofobna veriga kot fosfogliceratni del (23). Prav tako pa so za aktivnost nujno potrebni trije moenomicinski obroči: C, E in F (17). Slika 7: Moenomicin A z označenimi za vezavo na PBP pomembnimi strukturnimi elementi (povzeto po 17) Kljub dolgotrajni uporabi odpornost nanj še ni opisana. Ugotovili so tudi, da zaradi odpravljanja patogenih Gram+ bakterij učinkovito prispeva k nadzorovanju širjenja odpornosti (6) Sintezni zaviralci glikoziltransferaze Opisanih je nekaj poskusov priprave sintetičnih in polsintetičnih inhibitorjev glikoziltransferaze. Tako kot naravni zaviralci, se sintetični prav tako delijo na spojine, ki se vežejo na substrat in na spojine, ki se vežejo direktno na encim (7)

23 Sintezni zaviralci, ki se vežejo na substrat Nekaj časa sta bila vankomicin in teikoplanin edina razpoložljiva antibiotika za zdravljenje okužb z MRSA. S pojavom na vankomicin odpornih mikroorganizmov, so bili sintetizirani novi hidrofobni glikopeptidni derivati: dalbavancin, oritavancin in telavancin, ki so trenutno v kliničnih študijah. Obstajajo dokazi, da lahko glikopeptidi s hidrofobno komponento poleg vezave na prekurzorje peptidoglikana vstopajo v interakcijo tudi z glikoziltransferazo (7, 17). Hidrofobni N-alkilirani glikopeptidi imajo močno antibakterijsko delovanje proti številnim na vankomicin rezistentnim sevom. Najmočnejši glikopeptid oritavancin je bil v fazi III kliničnega preizkušanja, vendar se je razvoj začasno ustavil zaradi težav v proizvodnem procesu (17). Nato ga je novembra leta 2013 FDA označil kot antibiotik za zdravljenje infekcijskih bolezni kože (25). Dalbavancin je bil od leta 2007 do 2013 v fazi III kliničnega preizkušanja za odrasle z zapletenimi kožnimi infekcijami, novembra leta 2013 pa je bil registriran (26, 27). Telavancin je dobil dovoljenje FDA v septembru 2009 za zdravljenje infekcijskih bolezni kože, v juniju 2013 pa za zdravljenje z bolnišnico povezane pljučnice (17, 28). Oritavancin in telavancin v primerjavi z vankomicinom vsebujeta dodatno hidrofobno verigo. Pojavilo se je vprašanje zakaj sta tako zelo učinkovita proti na vankomicin odpornim bakterijam. Prva hipoteza je, da imata sposobnost dimerizacije, kar izboljša vezavo na lipid II, druga pa da hidrofobna veriga deluje kot membransko sidro in približa molekulo v tesnejši stik z lipidom II. Ta dva učinka naj bi odpravila težavo s spremenjenim substratom D-Ala-D-Lac in izboljšala učinkovitost proti na vankomicin odpornim bakterijam (17). V zadnjem času so začeli z raziskovanjem majhnih molekul, ki se vežejo na lipid II in prišli do zanimivega odkritja triptaminskih derivatov. V članku je opisano odkritje novih inhibitorjev glikoziltransferaze s pomočjo virtualnega rešetanja majhnih molekul iz knjižnice National Cancer Institute. Izbranim spojinam so testirali sposobnost in vitro inhibicije glikoziltransferaze, izolirane iz Escherichie coli PBP1b v prisotnosti lipida II. Za odkritje aktivnega mesta in sidranje spojin iz knjižnice so uporabili program ehits 6.0 (20)

24 Virtualno rešetanje je temeljilo na strukturi S. aureus PBP2 v kompleksu z moenomicinom. Metodo so uporabili za določitev inhibitorjev GT, s tem so tudi zmanjšali število spojin, ki bi jim bilo potrebno neposredno določiti aktivnost z in vitro testom (20). S programom ehits so dobili 30 najvišje uvrščenih spojin, ki so jih biokemično testirali. Ugotovili so, da je 9 spojin netopnih, zato so le preostalih 21 testirali s flourescenčno metodo. Topne spojine so testirali in vitro pri koncentracijah 0,2 in 1 mm na glikoziltransferazi izolirani iz E. coli PBP1b (20). Spojine, ki so bile učinkovite pri flourescenčnem testu, so testirali tudi z radioaktivnim testom. Najučinkovitejše je glikoziltransferazo zavirala spojina 5 s kemijskim imenom 2- [1-[(2-klorofenil)metil]-2-metil-5-metilsulfanilindol-3-il]etanamin z IC50 59 mm. Nadaljevali so z iskanjem spojine z dvodimenzionalno podobnostjo spojini 5 in prišli do spojine 5b, ki je bila približno 2 krat močnejša od spojine 5 z IC50 29 mm (20). Program ehits je predvidel vezavo spojine 5b kot je prikazano na sliki 8. Model prikazuje, da spojina 5b delno prekriva obroča C in E kokristaliziranega moenomicina, zasidrana je celo globlje zaradi dodatne hidrofobne povezave. Moenomicin zaradi svojega hidrofilnega značaja ne tvori hidrofobnih interakcij (20). Slika 8 : Levo, strukturi spojin 5 in 5b; desno, računalniški model sidranja spojine 5b v rentgensko strukturo moenomicina vezanega na glikoziltransferazo iz S. aureus PBP2. Spojina 5b je turkizne barve, obroči moenomicina so vijolične barve. Z rumeno barvo so označene hidrofobne interakcije, s črtanima črtama pa vodikove vezi med 5b in Asp156 (povzeto po 20)

25 Dokazali so, da imata spojini 5 in 5b protimikrobno aktivnost proti več pomembnim Gram+ patogenom. Določanje MIC vrednosti proti različnim patogenom je pripeljalo do obetavnih rezultatov, saj je bil bila MIC npr. za kulturo MRSA zelo nizka (4-8 mg/ml), medtem ko sta bila inhibitorja proti Gram- bakterijam (npr. E. coli) manj učinkovita. Najverjetneje je to posledica vplivanja E. coli na črpanje inhibitorjev iz periplazme in slabša prepustnost zunanje plazemske membrane. S testom preživetja bakterij so dokazali, da deluje spojina 5b tudi baktericidno, saj so ob dodatku 4 kratne koncentracije MIC zaznali takojšen upad števila živih celic, po dveh urah pa je število živih celic močno upadlo (20). Ugotovili so, da je amino skupina na spojini 5b bistvena za inhibiranje glikoziltransferaze, saj domnevno vstopa v interakcijo s pirofosfatno skupino na lipidu II. Domnevajo, da ima spojina 5b dva različna mehanizma delovanja. Poleg zaviranja glikoziltransferaze preko vezave na lipid II, naj bi delovala tudi preko depolarizacije in motenj v delovanju plazemske membrane (20). Objava omenjenega članka je osnova za moje diplomsko delo, saj smo poskušali sintetizirati analoge spojine 5b s še boljšimi MIC in nizko stopnjo citotoksičnosti

26 2. NAČRT DELA V okviru diplomske naloge se bomo usmerili na načrtovanje, sintezo in biološko vrednotenje inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. Inhibitorje bomo načrtovali s pomočjo predhodno opisanega članka avtorjev Derouaux s sod. (20), v katerem je opisano, da se lahko ustrezno N-substituirani 3-metil-5-metiltiotriptamini vežejo na lipid II in s tem zaviralno učinkujejo na bakterijsko glikoziltransferazo, kar predstavlja osnovo njihovega protibakterijskega delovanja. Zaradi zmerne citotoksičnosti objavljenih spojin je bil naš načrt za zmanjšanje citotoksičnosti sprememba funkcionalnih skupin na spojini vodnici (Slika 9). Obenem smo želeli povečati ali vsaj ohraniti protimikrobno delovanje in zaviralno delovanje na bakterijsko glikoziltransferazo. Slika 9: Spojina vodnica Spojini vodnici bomo sistematično zamenjali funkcionalne skupine: Slika 10: Spojina vodnica z vključenimi strukturnimi spremembami

27 Na mestu R1 bomo SMe skupino zamenjali z OMe ali H. Prisotnost metiltio skupine sicer vodi do največje aktivnosti, ampak je njena slabost domnevna velika citotoksičnost. S stališča zmanjšanja citotoksičnosti bo predvidoma bolj primerna popolna odstranitev funkcionalne skupine z mesta R1 ali uvedba metoksi skupine, ki je bioizosterna zamenjava za metiltio skupino. Vpliv na citotoksičnost metoksi skupine do sedaj še ni bil raziskan. Na mestu R2 bomo poleg aminske skupine uvedli tudi gvanidinsko skupino. Ugotovili so namreč, da so bazične skupine na mestu R2 nujno potrebne za vezavo na lipid II. Na Katedri za farmacevtsko kemijo so tudi ugotovili, da so gvanidini primernejši od aminov. Iz predhodnih rezultatov testiranj predvidevajo, da je gvanidin boljši ligand za vezavo na fosfatno skupino lipida II, saj se z njim poveže preko treh dodatnih vodikovih vezi, kar prispeva k celotni vezavni entalpiji. Sintetizirali bomo aminske in gvanidinske derivate ter s tem poskušali potrditi omenjeno hipotezo o boljši primernosti gvanidinov. Metilno skupino na mestu R3 bomo odstranili. Raziskava vpliva odstranitve metilne skupine zaenkrat še ni znana. Na mestu R4 in R5 bomo poskušali raziskati vpliv različnih substituentov. Znano je, da halogeni na aromatskih obročih lahko prispevajo k citotoksičnosti, zato bomo namesto dikloro derivata uvedli difluoro derivat in 4-ciano derivat. Slednjega bomo nato z večstopenjsko sintezo preko nitrilne in amidoksimske skupine pretvorili v ciklični karbamat, le-tega pa razcepili do končne amidinske skupine. Vpliv teh skupin za vezavo na lipid II še ni bil raziskan. Obseg načrtovanega dela je bistveno bolj sistematičen in večji, kot je možno sklepati iz načrta dela diplomske naloge. Načrtovane spojine so del več diplomskih nalog in doktorskih disertacij. V mojo diplomsko nalogo je vključenih 8 končnih spojin. Šest spojin je aminskih, 2 pa gvanidinska derivata. Poleg tega so od 8 spojin 4 spojine dikloro in difluoro derivati, ostale pa imajo na R4 mestu naslednje skupine: nitrilno, amidoksimsko, amidinsko in 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazolni obroč. Sintentizirane spojine bomo poslali na testiranje inhibicije glikoziltransferaze. Določili bodo rezidualno aktivnost, to je preostali delež aktivnosti encima po učinkovanju inhibitorja ter v primeru močnega učinka tudi IC50. Protibakterijski učinek bomo vrednotili z minimalno inhibitorno koncentracijo (MIC), to je koncentracija, ki prepreči razvoj 99% ali več vseh bakterij (2). Testirali bomo tudi citotoksičnost končnih spojin. Ugotoviti

28 namreč želimo, če zamenjane funkcionalne skupine v spojini vodnici prispevajo k zmanjšanju citotoksičnosti. Slika 11: Končne spojine za testiranje učinkovitosti zaviranja encima glikoziltransferaze in testiranja citotoksičnosti

29 3. MATERIALI IN METODE reagenti in topila Uporabljali smo kemikalije in topila proizvajalcev Sigma-Aldrich, Merck, Fluka, in Acros Organics. programska oprema Za risanje struktur, reakcijskih shem in računanje stehiometrijskih razmerij smo uporabljali programski paket ChemBioDraw Ultra 13.0 ponudnika CambridgeSoft. kromatografske metode Za izvedbo tankoplastne kromatografije smo uporabljali plošče Kiselgel 60 F254 izdelovalca Merck z 0,20 mm nanosom silikagela na aluminjastem nosilcu in dodanim fluorescenčnim indikatorjem. Za detekcijo lis smo uporabljali UV svetilko (λ=254 nm) in orositveni reagent ninhidrin. Za čiščenje produktov s kolonsko kromatografijo smo uporabljali silikagel proizvajalca Merck velikosti 0,040 do 0,063 mm za kolonsko ''flash'' kromatografijo. Uporabljali smo tudi avtomatiziran preparativni kromatografski sistem Isolera TM One proizvajalca Biotage. jedrska magnetna resonanca NMR spektre so posneli na spektrometru Bruker Avance DPX 300 s TMS kot internim standardom na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo in Bruker Avance DPX 400 s TMS kot internim standardom na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Vzorce smo raztapljali v CDCl3, DMSO-d6, in CD3OD. Za procesiranje FID oblike spektrov smo uporabljali program MestReC proizvajalca MESTRECLAB RESEARCH SL in ACD/NMR Processor proizvajalca Advanced Chemistry Development. masna spektrometrija MS spektre so posneli na spektrometru Q-TOF Premier z ESI metodo ionizacije na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani. infrardeča spektroskopija IR spektre so posneli na spektrofotometrih Perkin Elmer 1600 FT-IR in Nicolet Nexus FT- IR na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani

30 določanje tališča Tališča smo določali na mikroskopu Leica z ogrevalno mizico in so nekorigirana. tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) HPLC analize so bile opravljene na instrumentu Agilent Technologies HP 1100 z G1365 UV-VIS detektorjem (220 in 254 nm) na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Uporabili smo kolono Luna C18 ( mm) pri pretoku 1mL/min. Elucijsko topilo je predstavljala mešanica 0,1% trifluoroocetne kisline v vodi (A) in acetonitrila ali metanola (B)

31 4. EKSPERIMENTALNO DELO 4.1. Reakcijske sheme: Sinteza 4-amidinofenilnega derivata triptamina Zaščita 5-metoksitriptamina s ftalanhidridom

32 Alkiliranje indolnega dušika 5-metoksitriptamina z različno substituiranimi benzilbromidi R1 R2 SPOJINA -H -CN 10 -Cl -Cl 12 -F -F 16 Odščita ftalimidne zaščite s hidrazinolizo R1 R2 SPOJINA -H -CN 11 -Cl -Cl 13 -F -F

33 Sinteza dveh različno substituiranih gvanidinov (nukleofilna substitucija med N,N'- di(tercbutoksikarbonil)-s-metilizotiosečnino in 5-metoksitriptaminom) R1 R2 SPOJINA -Cl -Cl 14 -F -F 18 Odščita Boc zaščite z acidolizo R1 R2 SPOJINA -Cl -Cl 15 -F -F

34 4.2. Sintezni postopki in rezultati analiz Sinteza 2-(2-(1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (1) Izhodno spojino 0 (6,08 g, 38 mmol) in ftalanhidrid (6,00 g, 40,4 mmol) raztopimo v 35 ml brezvodnega toluena in segrevamo čez noč pri temperaturi 115 C (ob refluksu). Toluen uparimo na rotavaporju in trden preostanek kristaliziramo iz mešanice topil etilacetat/heksan na naslednji način: trden preostanek raztopimo v 50 ml etilacaetata in 50 ml heksana. Bučko vpnemo v kaloto in počasi segrevamo, postopoma dodajamo etilacetat, dokler se ves ostanek v bučki raztopi (skupno 88 ml etilacetata). Po popolni raztopitvi vzorca dodamo par ml heksana oziroma do zatemnitve. Bučko postavimo v ledeno kopel, da se izločijo kristali spojine. Kristale odnučamo in matičnico uparimo na rotavaporju na polovico začetne količine. Ponovno postavimo v ledeno kopel in izpadle kristale še enkrat odnučamo. Opis: rumeni kristali η : 9,73 g (88,2%) Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,65 1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,19 (t, 2H, J = 7,8 Hz, -CH2CH2N-), 4,04 (t, 2H, J = 7,8 Hz, -CH2CH2N-), 7,11-7,17 (dt, 2H, J1 = 10,4 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(5)H-indol + C(6)Hindol), 7,18-7,24 (dt, 1H, J1 = 8,0 Hz, J2 = 1,3 Hz, C(7)H-indol) 7,37 (d, 1H, J = 8,0 Hz, C(2)H-indol), 7,69-7,73 (m, 2H, C(3)ftalimid + C(6)ftalimid), 7,76 (d, 1H, J = 8,0 Hz, C(4)H-indol), 7,84-7,87 (m, 2H, C(4)ftalimid + C(5)ftalimid), 8,06 (s, 1H, -NH) ppm

35 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ = 23.86, 38.19, 78.60, 78.93, 79.25, , , , , , , , , , , , ppm. IR ν(max) = 3354, 3056, 2945, 2919, 2860, 2363, 2344, 1769, 1706, 1617, 1457, 1428, 1396, 1358, 1341, 1328, 1288, 1234, 1188, 1169, 1105, 1087, 1056, 1009, 992, 868, 819, 790, 745, 714, 615, 599, 554, 543, 530, 505, 430 cm Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1- il)metil)benzonitrila (2) V suspenzijo NaH (0,37 g, 60% wt. v parafinskem olju, 9,42 mmol) v 20 ml brezvodnega DMF po kapljicah dodajamo raztopino izhodne spojine 0 (2,29 g, 7,85 mmol) v 20 ml brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi 30 minut oz. dokler ne zaznamo prehoda reakcijske zmesi iz rumene v temno rjavo barvo. Nato vanjo dodamo α-bromo-p-tolunitril (2,00 g, 10,20 mmol) raztopljen v 10 ml brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55 C čez noč. Za izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju, zaostanek pa raztopimo v 50 ml EtOAc. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s 3 x 20 ml destilirane vode, 1 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3 in 1 x 20 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Sledi prekristalizacija iz EtOH (105 ml). Preostanek surovega produkta iz matičnice čistimo s kolonsko kromatografijo na avtomatskem kromatografskem sistemu Isolera One z gradientom mobilne faze EtOAc/heksan (29)

36 Opis: rumena amorfna snov η : 2,70 g (84,9%) Rf : EtOAc/heksan = 1/2, 0,34 1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,20 (t, 2H, J = 7,6 Hz, -CH2CH2N-), 4,04 (t, 2H, J = 7,6 Hz, -CH2CH2N-), 5,34 (s, 2H, -NCH2C6H4C-), 7,03 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,12 (d, 2H, J = 8,4 Hz, C(2)H-C6H4-R + C(6)H-C6H4-R), 7,14-7,20 (m, 3H, C(5)H-indol + C(6)H-indol) + C(7)H-indol), 7,56 (d, 2H, J = 8,4 Hz, C(3)H-C6H4-R + C(5)H-C6H4-R), 7,73-7,75 (m, 2H, C(3)ftalimid + C(6)ftalimid), 7,76-7,78 (dd, 1H, J1 = 8,4 Hz, J2 = 1,2 Hz, C(4)H-indol), 7,83-7,85 (m, 2H, C(4)ftalimid + C(5)ftalimid) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ = 23.53, 38.16, 48.34, , , , , , , , , , , , , , , , , ppm. IR ν(max) = 3462, 3057, 2926, 2859, 2363, 2344, 2228, 1769, 1711, 1610, 1479, 1468, 1432, 1401, 1375, 1361, 1332, 1263, 1238, 1178, 1111, 1090, 1076, 1011, 994, 872, 851, 821, 789, 734, 727, 714, 687, 553, 530, 510, 426 cm Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'- hidroksibenzimidamid (3) V suho 50 ml bučko zatehtamo hidroksilamonijev klorid (NH2OHxHCl, 0,26 g, 3,70 mmol) in ga raztopimo v 35 ml brezvodnega etanola. Dodamo trietilamin (Et3N, 0,52 ml) in mešamo pri sobni temperaturi 15 minut oz. dokler se vse popolnoma raztopi. Dodamo

37 izhodno spojino 2 (0,50 g, 1,23 mmol) in mešamo čez noč pri 60 C pod refluksom. Za izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni pogoji, zato dodamo klorkalcijevo cevko. Reakcijsko zmes ohladimo na ledeni kopeli. Oborino odfiltriramo s pomočjo teflonskega filtra (velikost por 0,45 m) in presesalne erlenmajerice. Opis: svetlo rumena amorfna snov η : 0,43 g (80,0%) Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,14 1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,18 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 4,03 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 4,81 (s, 1H, -OH), 5,30 (s, 2H, -NCH2C6H4C-), 7,03 (s, 1H, C(2)Hindol), 7,09-7,16 (t, 3H, J = 8,0 Hz C(5)H-indol + C(6)H-indol + C(7)H-indol), 7,18-7,23 (t, 2H, J = 8,0 Hz C(2)H-C7H7N2O + C(6)H-C7H7N2O), 7,53-7,55 (d, 2H, J = 8,0 Hz, C(3)H-C7H7N2O + C(5)H-C7H7N2O), 7,70-7,73 (m, 2H, C(3)ftalimid + C(6)ftalimid), 7,74-7,77 (d, 1H, J = 8,3 Hz, C(4)H-indol), 7,83-7,86 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)Hftalimid) ppm Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamida (4) V 50 ml bučko zatehtamo izhodno spojino 3 (0,30 g, 0,68 mmol), dodamo 35 ml etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po kapljicah dodamo hidrazinhidrat (0,17 ml, 3,42 mmol) in segrevamo 12 ur pri 90 C pod refluksom

38 Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno temperaturo, z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno raztopino NaOH naalkalimo do ph Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 ml EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Spojino pretvorimo še v hidroklorid, zaostanek po zadnjem rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega EtOH, dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,3 ml) katero smo pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt dokler izpada bela oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu. Filtriramo s pomočjo teflonskega filtra in presesalne erlenmajerice ter na rotavaporju sušimo do suhega preostanka. Opis: bela amorfna snov η : 0,19 g (78,8%) Rf : DKM/MeOH = 9/1+1% TEA, 0,04 Ttal : C 1 H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ= 2,76-2,83 (m, 4H, -CH2CH2N-), 5,36 (s, 2H, - NCH2C6H4-), 5,73 (s, 2H, -CH2CH2NH2 -), 6,97-7,02 (dt, J1 = 7,2 Hz, J2 = 1,1 Hz, 1H, C(5)H-indol), 7,05-7,10 (dt, J1 = 7,2 Hz, J2 = 1,1 Hz,1H, C(6)H-indol), 7,17 (d, 2H, J = 8,1 Hz, C(2)H-C7H7N2O + C(6)H-C7H7N2O), 7,29 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,39 (d, 1H, J = 8,1 Hz, C(7)H-indol), 7,54 (d, 1H, J = 8,1 Hz, C(4)H-indol), 7,58 (d, 2H, J = 8,1 Hz, C(3)H-C7H7N2O + C(5)H-C7H7N2O), 9,57 (s, 2H, -Ph-C(=NOH)-NH2) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.88, 48.48, , , , , , , , , , , , , ppm. IR ν(max) = 3403, 3047, 1664, 1612, 1466, 1438, 1417, 1357, 1334, 1254, 1178, 1151, 1015, 943, 825, 780, 747, 670, 428 cm -1. MS m/z (TOF MS ES+): 309,2 (MH + ) HRMS: izračunano (za C18H21N4O) 309,1715; izmerjeno 309,1718 (1,0 ppm). HPLC: kolona Luna C18 ( mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ = 254 nm, AUC = 1079 mau*s, AUC [%] = 93,0-28 -

39 Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'- ((etoksikarbonil)oksi)benzimidamida (5) V 40 ml brezvodnega CH2Cl2 raztopimo izhodno spojino 3 (0,80 g, 1,82 mmol) in dodamo trietilamin (0,51 ml). Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in počasi dokapavamo etilkloroformat ter mešamo 40 minut. Reakcijsko zmes spiramo z 1 x 20 ml vode in 2 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, filtriramo in uparimo na rotavaporju. Opis: svetlo rumena amorfna snov η : 0,85 g (91,3%) Rf : DKM/MeOH= 20/1, 0,62 1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 1,38 (t, 3H, J = 7,2 Hz, -OCH2CH3), 3,18 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 4,03 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 4,34 (k, 2H, J = 7,2 Hz, - OCH2CH3), 5,05 (s, 2H, -Ph-C(=NOH)-NH2), 5,30 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,01 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,10-7,15 (m, 3H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(5)H-indol), 7,16-7,18 (m, 2H, C(6)H-indol + C(7)H-indol), 7,60 (d, 2H, J = 8,5 Hz, C(3)H-C6H4-R + C(5)H- C6H4R), 7,71-7,73 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,76 (d, 1H, J = 1,9 Hz, C(4)H-indol), 7,82-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid) ppm

40 Sinteza 2-(2-(1-(4-(5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzil)-1H-indol- 3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (6) Izhodno spojine 5 (0,85 g, 1,67 mmol) raztopimo v 35 ml brezvodnega toluena. Raztopino segrevamo 48 ur pri 110 C ob refluksu. Za izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Topilo uparimo na rotavaporju. Čistost produkta preverimo s TLC. Spojino 6 prekristaliziramo iz etanola. Produkt raztopimo v manjši količini etanola (27 ml) in segrevamo ob vrenju do popolne raztopitve. Raztopino ohlajamo na ledeni kopeli, dokler ne izpadejo kristali čiste spojine 6. Kristale odnučamo in posušimo. Opis: intenzivno rumeni kristali η : 0,64 g (82,1%) Rf : DKM/MeOH = 9/1, 0,53 1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,20 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 4,04 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 5,35 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,04 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,13-7,20 (m, 5H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(5)H-indol + (6)H-indol + C(7)H-indol), 7,65-7,76 (m, 5H, C6H4-ftalimid + C(4)H-indol), 7,83-7,86 (m, 2H, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R) ppm

41 Sinteza 3-(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)-1,2,4-oksadiazol- 5(4H)-ona (7) V 50 ml bučko zatehtamo izhodno spojino 6 (0,30 g, 0,65 mmol) in jo raztopimo v 35 ml etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse raztopi. Postopoma po kapljicah dodamo hidrazin hidrat (0,16 ml, 3,23 mmol) in segrevamo čez noč pri 90 C pod refluksom. Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno raztopino NaOH naalkalimo do ph Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 ml EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Ugotovimo da spojina 7 ni dobro topna v EtOAc, zato vodno fazo uparimo in izvedemo reverznofazno kolonsko kromatografijo Isolera One z mobilno fazo H2O + 0,1% CF3COOH/MeOH. Opis: svetlo rumeni kristali η : 0,18 g (81,0%) Rf : DKM/M = 4/1 + 1%TEA, 0,18 Mobilna faza za kolonsko kromatografijo: A: H2O + 0,1% CF3COOH B: MeOH (graduiran pretok 10% B/90% A 80% B/20% A) Ttal : C 1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,02 (t, 2H, J = 6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,11 (t, 2H, - CH2CH2N-), 5,48 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,07 (t, 1H, J = 7,4 Hz, C(5)H-indol), 7,14 (t, 1H,

42 J = 7,4 Hz, C(6)H-indol), 7,38 (d, 2H, J = 7,9 Hz, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R), 7,42 (m, 2H, C(2)H-indol + C(7)H-indol), 7,61 (d, 1H, J = 7,8 Hz, C(4)H-indol), 7,75 (d, 2H, J = 7,4 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,82 (s, 3H, NH3 + ), 12,97 (s, 1H, -NH) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 23.52, 49.10, , , , , , , , , , , , , , ppm. IR ν(max) = 3448, 3152, 3075, 2952, 2477, 2363, 2344, 1778, 1660, 1616, 1558, 1520, 1467, 1449, 1435, 1406, 1371, 1334, 1250, 1242, 1190, 1149, 1017, 986, 950, 892, 844, 803, 769, 737, 722, 700, 664, 564, 497, 429 cm -1. MS m/z (TOF MS ES+): 335,2 (MH + ) HRMS: izračunano (za C19H19N4O2) 335,1508; izmerjeno 335,1506 (-0,6 ppm). HPLC: kolona Luna C18 ( mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ = 254 nm, AUC = 2543 mau*s, AUC [%] = 99, Sinteza amino(4-((3-(2-aminoetil)-1h-indol-1-il)metil)fenil) metaniminijevega acetata (8) Izhodno spojino 7 (0,25 g, 7,47 mmol) raztopimo v 20 ml brezvodnega etanola in 8 ml brezvodne ocetne kisline. Iz dvovratne bučke z vodno črpalko izsesamo zrak in prepihamo z argonom. Dodamo približno 10% masnega deleža katalizatorja Pd/C (25 mg). Ponovno izsesamo zrak iz reakcijske zmesi in nastavimo reakcijsko zmes pod vodikovo atmosfero. Mešamo pri sobni temperaturi na magnetnem mešalu 4 ure oz. dokler ne zaznamo popolne pretvorbe izhodne spojine v končno spojino 8. Reakcijsko zmes nato filtriramo s pomočjo teflonskega filtra in presesalne erlenmajerice. Matičnici s produktom uparimo topilo na

43 rotavaporju. Preostanek po sušenju trituriramo z EtOEt dokler večina ocetne kisline preide v EtOEt. Topilo s kapalko previdno odstranimo, kristale pa posušimo na rotavaporju. Opis: svetlo sivi kristali η : 0,26 g (98,9%) Rf : MeOH : H2O : CH3CN = 1 : 1 : 3, 0,04 Ttal : C 1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,00 (d, 2H, J = 6,1 Hz, -CH2CH2N-), 3,06 (d, 2H, J = 6,1 Hz, -CH2CH2N-), 5,50 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,05 (t, 1H, J = 6,5 Hz, C(5)H-indol), 7,12 (t, 1H, J = 6,5 Hz, C(6)H-indol), 7,38 (d, 2H, J = 8,0 Hz,C(2)H-C6H4R + C(6)H- C6H4-R), 7,43 (s, 2H, C(2)H-indol + C(7)H-indol), 7,60 (d, 1H, J = 7,2 Hz, C(4)H-indol), 7,72 (d, 2H, J = 7,1 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 23.05, 24.28, 48.49, , , , , , , , , , , , , , ppm. IR ν(max) = 3338, 3102, 2346, 1671, 1617, 1560, 1498, 1466, 1438, 1413, 1250, 1189, 1133, 1014, 950, 926, 844, 797, 733, 687, 652, 518, 463, 424 cm -1. MS m/z (TOF MS ES+): 293,2 (MH + ) HRMS: izračunano (za C18H21N4) 293,1766; izmerjeno 293,1764 (-0,7 ppm). HPLC: kolona Luna C18 ( mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ = 254 nm, AUC = 1017 mau*s, AUC [%] = 96, Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (9)

44 Izhodno spojino 0.1 (1,06 g, 5,59 mmol) in ftalanhidrid (0,88 g, 6,01 mmol) raztopimo v 55 ml brezvodnega toluena in segrevamo čez noč pri temperaturi 115 C ob refluksu. Toluen uparimo na rotavaporju. Reakcija poteče kvantitativno, zato izoliramo čist produkt in ni potrebno izvajati kolonske kromatografije ali prekristalizacije iz mešanice topil etilacetat/heksan (29). Opis: rjava amorfna snov η : 1,78 g (99,5%) Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,57 1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3,15 (dt, 2H, J1 = 7,8 Hz, J2 = 0,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,89 (s, 3H, -OCH3) 4,02 (t, 2H, J = 7,8 Hz, -CH2CH2N-), 6,86 (ddd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,5 Hz, J3 = 0,5 Hz C(6)H-indol), 7,11 (dd, 1H, J1 = 2,5 Hz, J2 = 0,5 Hz, C(4)H-indol), 7,20 (d, 1H, J = 2,5 Hz, C(2)H-indol), 7,26 (dd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 0,5 Hz, C(7)H-indol), 7,72-7,74 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,85-7,87 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid), 7,95 (s, 1H, -NH) ppm Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-5-metoksi-1H-indol-1- il)metil)benzonitrila (10) V suspenzijo NaH (83 mg, 60% wt. v parafinskem olju, 2,06 mmol) v 7 ml brezvodnega DMF po kapljicah dodamo raztopino izhodne spojine 9 (0,55 g, 1,72 mmol) v 7 ml brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi 30 minut oz. dokler ne zaznamo prehoda reakcijske zmesi iz rumene v temno rjavo barvo. Nato vanjo

45 dodamo α-bromo-p-tolunitril (0,51 g, 2,58 mmol) raztopljen v 6 ml brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55 C čez noč. Za izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju, zaostanek pa raztopimo v 30 ml EtOAc. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s 3 x 20 ml destilirane vode, 1 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3 in 1 x 20 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One) z mobilno fazo toluen/etoac (graduirano 4-34% EtOAc) (29). Opis: rjava amorfna snov η : 0,62 g (83,5%) Rf : toluen/etoac = 5/1, 0,34 1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,03 (t, 2H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2N-), 3,71 (s, 3H, - OCH3), 3,87 (t, 2H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2N-), 5,41 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 6,70 (dd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 7,04 (dd, 1H, J1 = 12,6 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(7)H-indol), 7,16-7,22 (m, 3H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(4)H-indol), 7,28 (s, 1H, C(2)Hindol), 7,72 (d, 2H, J = 8,4 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,81-7,87 (m, 4H; C6H4- ftalimid) ppm Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (11) V 50 ml bučko zatehtamo izhodno spojino 10 (0,62 g, 1,43 mmol) in jo raztopimo v 35 ml etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po

46 kapljicah dodamo hidrazin hidrat (0,45 ml, 14,32 mmol) in segrevamo čez noč pri 90 C pod refluksom. Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno raztopino NaOH naalkalimo do ph Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 ml EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One, stacionarna faza KP-NH) z mobilno fazo DKM/MeOH (graduirano 0,5-4% MeOH). Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Očiščen produkt s kolonsko kromatografijo raztopimo v 7 ml absolutnega EtOH, po kapljicah dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,7 ml) katero smo predhodno pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt dokler izpada rjava oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu. Filtriramo s teflonskim filtrom in presesalno erlenmajerico ter na rotavaporju sušimo do suhega preostanka (29). Opis: siva amorfna spojina η : 0,11 g (23,5%) Rf : DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,32 Tg : C 1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 2,97 (t, 2H, J = 6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,07 (t, 2H, J = 6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (s, 3H, -OCH3), 5,46 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 6,77 (dd, 1H, J1 = 8,7 Hz, J2 = 2,5 Hz, C(6)H-indol), 7,11 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,27-7,31 (m, 3H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(7)H-indol), 7,37 (s, 1H, C(2)H-indol) 7,79 (d, 2H, J = 8,7 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,87 (s, 3H, -NH3 + ) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.96, 48.64, 55.43, , , , 110,92, , , , , , , , ppm. IR ν(max) = 3422, 2924, 2364, 2345, 2229, 1994, 1610, 1490, 1458, 1438, 1352, 1317, 1271, 1230, 1187, 1118, 1046, 950, 905, 819, 788, 646, 552 cm -1. MS m/z (TOF MS ES+): 306,2 (MH + ) HRMS: izračunano (za C19H20N3O) 306,1606; izmerjeno 306,1607 (0,3 ppm). HPLC: kolona Luna C18 ( mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ = 254 nm, AUC = 988 mau*s, AUC [%] = 100,

47 Sinteza 2-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin- 1,3-diona (12) V suspenzijo NaH (83 mg, 60% wt. v parafinskem olju, 2,06 mmol) v 7 ml brezvodnega DMF po kapljicah dodajamo raztopino izhodne spojine 9 (0,55 g, 1,72 mmol) v 7 ml brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi 30 minut oz. dokler ne zaznamo prehoda reakcijske zmesi iz rumene v temno rjavo barvo. Nato vanjo dodamo 3,4-diklorobenzilbromida (0,54 g, 2,23 mmol) raztopljenega v 6 ml brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55 C čez noč. Za izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju, zaostanek pa raztopimo v 30 ml EtOAc. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s 3 x 20 ml destilirane vode, 1 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3 in 1 x 20 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo Isolera One z mobilno fazo toluen/etoac (graduirano 4-34% EtOAc) (29). Opis: rumena amorfna spojina η : 0,63 g (76,3%) Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,71 1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3,15 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 3,87 (s, 3H, - OCH3), 4,02 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 5,19 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,84 (m, 2H,

48 C(6)H-indol + C(6)H-C6H3Cl2), 7,00 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,06 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C(7)Hindol), 7,18 (d, 1H, J = 2,1 Hz, C(4)H-indol), 7,22 (d, 1H, J = 2,0 Hz, C(2)H-C6H3Cl2), 7,34 (d, 1H, J = 8,4 Hz, C(5)H- C6H3Cl2), 7,72-7,74 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)Hftalimid), 7,83-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid) ppm Sinteza 2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (13) V 50 ml bučko zatehtamo izhodno spojino 12 (0,61 g, 1,28 mmol), dodamo 35 ml etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po kapljicah dodamo hidrazin hidrat (0,31 ml, 6,38 mmol) in segrevamo čez noč pri 90 C pod refluksom. Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno raztopino NaOH naalkalimo do ph Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 ml EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One, stacionarna faza KP-NH) z mobilno fazo DKM/MeOH (graduirano 0,5-3% MeOH). Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Očiščen produkt s kolonsko kromatografijo raztopimo v 7 ml absolutnega EtOH, po kapljicah dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,7 ml) katero smo predhodno pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt dokler izpada rjava oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu. Filtriramo s teflonskim filtrom in presesalno erlenmajerico ter na rotavaporju sušimo do suhega preostanka (29)

49 Opis: svetlo rjavi kristali η : 0,15 g (31,3%) Rf : DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,30 Ttal : C 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,73 (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH2CH2NH-), 2,81 (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH2CH2N-), 3,76 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,74 (dd, 1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 7,03 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C(2)H-C6H3Cl2), 7,09 (dd, 1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-C6H3Cl2), 7,29 (m, 2H, J = 9,4 Hz, C(2)H-indol + C(5)H-C6H3Cl2), 7,44 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C(4)H-indol), 7,56 (d, 1H, J = 8,5 Hz, C(7)Hindol) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.94, 47.85, 55.45, , , , , , , , , , , , , ppm. IR ν(max) = 3855, 3423, 2921, 2366, 2346, 1607, 1491, 1400, 1314, 1271, 1231, 1116, 1048, 1029, 830, 794, 670 cm -1. MS m/z (TOF MS ES+): 349,1 (MH + ) HRMS: izračunano (za C18H19N2OCl2) 349,0874; izmerjeno 349,0879 (1,4 ppm). HPLC: kolona Luna C18 ( mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ = 254 nm, AUC = 735 mau*s, AUC [%] = 96, Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5- metoksi-1h-indol-3-il)etil)gvanidina (14) V bučko natehtamo spojino 13 (0,10 g, 0,26 mmol) in jo raztopimo v 5 ml DMF. Dodamo ji N,N'-di-(terc-butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino (75 mg, 0,26 mmol), Et3N (0,11 ml,

50 0,78 mmol) in HgCl2 (71 mg, 0,26 mmol) v navedenem zaporedju. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Po poteku reakcije najprej s pomočjo presesalne erlenmajerice odfiltriramo neraztopljeno sol Hg(SMe)Cl, ki nastane pri reakciji. Filtratu na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko»flash«kromatografijo z mobilno fazo EtOAc/heksan=1/3 (29). Opis: svetlo rjava amorfna spojina η: 0,13 g (85,4%) Rf: EtOAc/heksan=1/3, 0,41 1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 1,47 (s, 9H, -NHCOOC(CH3)3, 1,53 (s, 9H, =NCOOC(CH3)3), 3,03 (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (k, 2H, J = 6,7 Hz, - CH2CH2NH-), 3,88 (s, 3H, -OCH3), 5,21 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,86 (dd, 1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-indol), 6,89 (dd, 1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-C6H3Cl2), 7,01 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,06-7,08 (m, 2H, C(2)H-C6H3Cl2 + C(5)H-C6H3Cl2), 7,26 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,35 (d, 1H, J = 8,5 Hz, C(7)H-indol), 8,46 (t, 1H, J = 4,5 Hz, -CH2CH2NH-), 11,51 (s, 1H, -NHBoc) ppm Sinteza 1-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (15) V bučko natehtamo spojino 14 (0,10 g, 0,17 mmol) in jo raztopimo v 5 ml brezvodnega DKM. Bučko zatesnimo s septumom ter prepihamo sistem z argonom. Z iglo previdno po kapljicah dodamo 1 ml 97% CF3COOH. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Ko reakcija poteče, odparimo topilo na rotavaporju. Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Zaostanek po rotavapiranju raztopimo v 3 ml absolutnega

51 EtOH, dodamo 3 ekv. 1M HCl/EtOH, katero smo predhodno pripravili in situ. Ponovno odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja trituriramo z 10 ml EtOEt dokler izpada rumena oborina, katero sušimo 1 h na membranski črpalki (29). Opis: rumena amorfna spojina η: 69 mg (94,9%) Rf: DKM/MeOH=20/1, 0,07 1 H NMR (400MHz, CD3OD): δ= 3,04 (t, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,53 (k, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2NH-), 3,85 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,83 (dd, 1H, J1 = 8,6 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-indol), 7,05 (dd, 1H, J1 = 8,3 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H- C6H3Cl2), 7,09 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(2)H-C6H3Cl2), 7,18-7,21 (m, 2H, C(2)H-indol + C(5)H-C6H3Cl2), 7,27 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,45 (d, 1H, J = 8,6 Hz, C(7)Hindol) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 16.10, 21.95, 62.66, 63.47, 67.08, 69.09, 76.03, 77.04, , 112,38, , , , , , , , , , ppm. MS m/z (TOF MS ES+): 391,1 (MH + ) HRMS: izračunano (za C19H21N4OCl2) 391,1092; izmerjeno 391,1107 (3,8 ppm)

52 Sinteza 2-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin- 1,3-diona (16) V bučko natehtamo izhodno spojino 9 (0,50 g, 1,56 mmol) ter Cs2CO3 (1,27 g, 3,91 mmol). Suspendiramo ju v 30 ml acetonitrila. Dodamo 1,2 ekv. 3,4-difluorobenzilbromida (0,24 ml, 1,87 mmol). Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55 C čez noč. Po poteku reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo in odfiltriramo neraztopljeno sol. Filtratu odparimo topilo na rotavaporju. Zaostanek raztopimo v 50 ml EtOEt. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s 3 x 25 ml destilirane vode, z 1 x 25 ml nasičene raztopine NaHCO3 in z 1 x 25 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Spojino 16 prekristaliziramo iz etanola. Produkt raztopimo v 50 ml etanola in segrevamo ob vrenju do popolne raztopitve. Raztopino ohlajamo na ledeni kopeli, dokler ne izpade oborina spojine 16. Oborino odnučamo in posušimo (29). Opis: bela amorfna spojina η: 0,49 g (67,7%) Rf : EtOAc/heksan = 1/2, 0,45 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3,15 (t, 2H, J = 7,3 Hz, -CH2CH2N-), 3,88 (s, 3H, - OCH3), 4,03 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 5,19 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,79-6,89 (m, 3H, C(6)H-indol + C(2)H-C6H3F2 + C(6)H-C6H3F2), 7,00 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,04-7,11 (m, 2H, C(4)-indol + C(5)H- C6H3F2), 7,18 (d, 1H, C(7)H-indol), 7,71-7,74 (m, 2H,

53 C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,83-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid) ppm. 13 C NMR (100MHz, CDCl3): δ= 24.33, 38.43, 49.17, 55.81, , , , , , , , , *, , , , , , , *, *, *, , ppm. * sklopitev z dvema F atomoma Sinteza 2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (17) V bučko natehtamo spojino 16 (0,40 g, 0,88 mmol) ter jo raztopimo v 30 ml EtOH. Postopoma po kapljicah dodamo 5 ekv. hidrazina (0,40 ml, 35% wt., 4,34 mmol). Reakcijsko zmes pustimo mešati čez noč pri 90 C pod refluksom. Po poteku reakcije vidimo, da nam izpade oborina. To previdno odfiltriramo s pomočjo teflonskega filtra in presesalne erlenmajerice. Naredimo TLC iz katerega vidimo, da se naša spojina nahaja v oborini, delno pa tudi v matičnici. Oborino sušimo na membranski črpalki, matičnici pa odparimo topilo z rotavaporjem. Združimo zaostanek produkta iz oborine z zaostankom produkta iz matičnice. Raztopimo ga v 50 ml EtOAc, prenesemo v lij ločnik in organsko fazo spiramo z 1 x 25 ml destilirane vode. Vodno fazo med ekstrakcijo večkrat naalkalimo z 1M NaOH dokler ne dosežemo ph vodne faze Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Spojino pretvorimo v sol s klorovodikovo kislino. Zaostanek po zadnjem rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega EtOH, dodamo 3 ekv. 1M HCl/EtOH, katero smo predhodno pripravili in situ. Ponovno

54 odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja, trituriramo z 10 ml EtOEt dokler izpada rumena oborina. Sušimo jo 1 h na membranski črpalki (29). Opis: rumeni kristali η: 0,25 g (83,0%) Rf: DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,36 Ttal : C 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,99 (t, 2H, J = 6,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,05 (t, 2H, J = 6,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,77 (dd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,4 Hz, C(6)H-indol), 7,02-7,05 (m, 1H, C(2)H-C6H3F2), 7,12 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,27-7,30 (m, 1H, C(6)H-C6H3F2), 7,33 (d, 1H, J = 8,8 Hz, C(7)Hindol), 7,36-7,41 (m, 2H, C(2)H-indol + C(5)H- C6H3F2), 8,08 (s, 3H, -NH3 + ) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.87, 48.03, 55.44, , , , , , , , , *, , , , *, *, *, ppm. * sklopitev z dvema F atomoma IR ν(max) = 3422, 3025, 2921, 2690, 2602, 2463, 2371, 2018, 1610, 1582, 1522, 1490, 1451, 1438, 1396, 1342, 1315, 1290, 1270, 1229, 1184, 1118, 1048, 981, 934, 862, 823, 796, 772, 711, 644, 590, 452, 427 cm -1. MS m/z (TOF MS ES+): 317,1 (MH + ) HRMS: izračunano (za C18H19N2OF2) 317,1465; izmerjeno 317,1468 (0,9 ppm). HPLC: kolona Luna C18 ( mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ = 254 nm, AUC = 740 mau*s, AUC [%] = 95, Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5- metoksi-1h-indol-3-il)etil)gvanidina (18)

55 V bučko natehtamo spojino 17 (0,14 g, 0,44 mmol) in jo raztopimo v 10 ml brezvodnega DMF. Dodamo ji N,N'-di-(terc-butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino (0,13 g, 0,44 mmol), Et3N (0,22 ml, 1,55 mmol) in HgCl2 (0,12 g, 0,44 mmol) v navedenem zaporedju. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Po poteku reakcije najprej s pomočjo presesalne erlenmajerice odfiltriramo neraztopljeno sol Hg(SMe)Cl, ki nastane pri reakciji. Filtratu na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko»flash«kromatografijo z mobilno fazo EtOAc/heksan=1/3 (29). Opis: svetlo rumena amorfna spojina η: 0,16 g (62,7%) Rf: EtOAc/heksan=1/3, 0,43 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,46 (s, 9H, -NHCOOC(CH3)3), 1,53 (s, 9H, =NCOOC(CH3)3), 3,02 (t, 2H, J = 6,6 Hz, -CH2CH2NH-), 3,78 (k, 2H, J = 6,6 Hz, - CH2CH2N-), 3,88 (s, 3H, -OCH3), 5,21 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,84 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(6)H-indol), 6,86 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(2)-C6H3F2), 6,90-6,95 (m, 1H, C(6)-C6H3F2), 7,01 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,05 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,06-7,13 (m, 2H, C(7)H-indol + C(5)H-C6H3F2), 8,46 (t, 1H, J = 4,6 Hz, -CH2CH2NH-), 11,52 (s, 1H, -NHBoc) ppm. 13 C NMR (100MHz, CDCl3): δ= 24.80, 28.00, 28.31, 40.99, 49.29, 55.86, 79.31, 82.98, , , , , , , , , *, , , , *, *, *, , , , ppm. * sklopitev z dvema F atomoma Sinteza 1-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (19)

56 V bučko natehtamo spojino 18 (0,15 g, 0,27 mmol) in jo raztopimo v 10 ml brezvodnega DKM. Bučko zatesnimo s septumom ter prepihamo sistem z argonom. Z iglo previdno po kapljicah dodamo 3 ml 97% CF3COOH. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Ko reakcija poteče, odparimo topilo na rotavaporju. Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Zaostanek po rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega EtOH, dodamo 3 ekv. 1M HCl/EtOH, katero smo predhodno pripravili in situ. Ponovno odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja, trituriramo z 10 ml EtOEt dokler izpada rumena oborina. Sušimo jo 1 h na membranski črpalki (29). Opis: rumeni kristali η: 0,11 g (95,3%) Rf: DKM/MeOH=4/1+1%TEA, 0,04 Ttal : C 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,89 (t, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,42 (t, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,77 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,77 (dd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 6,97-7,01 (m, 1H, C(2)H-C6H3F2), 7,06 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C(4)H-indol), 7,23-7,29 (m, 1H, C(6)H-C6H3F2), 7,33 (d, 2H, J = 8,8 Hz, C(7)Hindol + C(2)H-indol), 7,36-7,41 (m, 1H, + C(5)H- C6H3F2), 7,58 (t, 1H, J = 5,5 Hz, - CH2CH2NH-) ppm. 13 C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 24.29, 41.29, 47.94, 55.37, , , , , , , , *, , , , *, *, *, , ppm. * sklopitev z dvema F atomoma IR ν(max) = 3448, 3186, 3012, 2958, 2878, 2373, 1701, 1665, 1637, 1526, 1490, 1457, 1435, 1396, 1348, 1319, 1297, 1260, 1232, 1204, 1178, 1130, 1048, 1034, 974, 897, 872, 835, 803, 793, 721, 648, 598, 526 cm -1. MS m/z (TOF MS ES+): 359,2 (MH + ) HRMS: izračunano (za C19H21N4OF2) 359,1683; izmerjeno 359,1688 (1,4 ppm). HPLC: kolona Luna C18 ( mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ = 254 nm, AUC = 751 mau*s, AUC [%] = 98,

57 5. RAZPRAVA Sintetizirali smo 8 končnih spojin, ki smo jih dobili po dveh sinteznih poteh. V prvi smo na indolni dušik triptamina pripeli p-cianobenzilni fragment in ciano skupino z večstopenjsko sintezo pretvorili v amidinsko skupino. Reakcijska shema je vsebovala 6 stopenj. V drugi sintezni poti smo na indolni dušik 5-metoksitriptamina pripeli različno substituirane para benzilne fragmente, med njimi p-cianobenzilni, 3,4-diklorobenzilni in 3,4-difluorobenzilni fragment. Spojini s halogenima atomoma smo pretvorili iz aminskih še v gvanidinska derivata. Ta reakcijska shema je bila sestavljena iz 5 stopenj Zaščita primarne amino skupine v obliki ftalimida Primarno amino skupino triptamina/5-metoksitriptamina smo zaščitili v obliki imida z namenom, da reakcija alkiliranja z benzilbromidom poteče selektivno na indolnem dušiku triptamina. Za zaščito smo uporabili ftalanhidrid, nastala je tako imenovana ftalimidna zaščitna skupina. Potekla je dvojna reakcija nukleofine substitucije na karbonilno skupino (30). Primarno amino skupino bi lahko zaščitili tudi z drugimi zaščitnimi skupinami, med katerimi se najpogosteje uporabljajo karbamatne (terciarni butil karbamati, metil karbamati, benzil karbamati) in amidne zaščitne skupine (acetamidi, formamidi). Nobena od navedenih zaščitnih skupin ne zadošča pogoju selektivnosti reakcije s substituiranim benzilbromidom. Nastali karbamati ali amidi vsebujejo namreč šibko kisli proton na dušiku, ki se lahko odcepi pri reakciji z močno bazo. V tem primeru bi dobili namesto želenega še stranski produkt alkiliran primarni amin. V primeru zaščite s ftalimidom se temu izognemo, saj nastali imid ne vsebuje prostega protona, ki bi se lahko odcepil. Lastnosti dobre zaščitne skupine so, da se odstranjuje selektivno, enostavno in z dobrimi izkoristki pod zelo specifičnimi reakcijskimi pogoji (31). Izkoristek sinteze spojine 1 je dober (88%). Iz tankoplastne kromatografije smo razbrali, da je ostalo še nekaj nezreagirane izhodne spojine, ki smo jo odstranili s prekristalizacijo iz kombinacije topil etilacetat/heksan. Izkoristek sinteze spojine 9 je odličen (99%), reakcija je potekla kvantitativno, zato prekristalizacije ni bilo potrebno izvesti

58 Slika 12: Predviden mehanizem zaščite primarne amino skupine v obliki ftalimida 5.2. Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina Na indolnem dušikovem atomu z močno bazo najprej odcepimo proton. Zaščiteni triptamin postane s tem boljši nukleofil, ki tako lažje napade primarni C-atom benzilbromida. Poteče reakcija nukleofilne substitucije, saj gre za zamenjavo dveh nukleofilov. Ogljikov atom benzilbromida je dober elektrofil, saj ima vezan bromidni ion, ki velja za dobro izstopajočo skupino. Pri reakciji alkiliranja triptamina smo uporabili dve različni močni bazi in sicer natrijev hidrid raztopljen v DMF (spojine 2, 10, 12) in cezijev karbonat raztopljen v acetonitrilu (spojina 16). Pri sintezah spojin 2, 10 in 12 smo ves čas poteka reakcije zagotavljali brezvodne pogoje z izvajanjem reakcije pod argonovo atmosfero, saj bi nam v nasprotnem primeru reakcija lahko potekla z vodo. Dobili bi stranske neželene produkte (npr. primarni alkohol na benzilbromidu), saj je voda tudi nukleofil, ki bi lahko reagirala z ogljikovim atomom v benzilbromidu. Čeprav je popolnoma brezvodne pogoje težko doseči, je izkoristek sintez 2, 10 in 12 dober (76 85%). Iz tankoplastne kromatografije je bilo razvidno, da reakcija v vseh treh primerih ni potekla kvantitativno, ostalo je še nekaj nezreagiranih izhodnih spojin. Če smo opazili slab potek reakcije, smo dodali še 1 ekvivalent NaH, čeprav smo ga že na začetku dodali v prebitku. S tem principom smo zagotovili boljši izkoristek sinteze. Nečistot in kristalov NaBr se znebimo z ekstrakcijo z vodno raztopino NaHCO3 in prekristalizacijo iz etanola. Pri sintezi spojine 16 smo uporabili drugačno bazo cezijev karbonat. Le-ta je sicer šibkejša baza kot natrijev hidrid, vendar ima cezijev ion velik kationski radij, s tem pa imajo posledično cezijeve soli nižjo stopnjo solvatacije. To pomeni, da vežeta tako cezijev ion kot protiion manj molekul vode,

59 s tem pa se reaktivnost poveča (32). Čeprav v tem primeru ni potrebno zagotavljati brezvodnih pogojev, smo zabeležili nekoliko slabši izkoristek (68%). Slika 13: Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina 5.3. Odstranitev ftalimidne zaščitne skupine Ftalimidno zaščito na primarni amino skupini smo odstranili s hidrazinolizo. Reakcija je polarna nukleofilna adicija s sledečo eliminacijo (30). Zaščito lahko odstranimo tudi z alkoholno raztopino KOH, vendar je bolj selektivna odstranitev s hidrazinolizo. Reakcijski zmesi smo uparili topilo in z 1M vodno raztopino naalkalili do ph ter ekstrahirali z etilacetatom. S tem smo dosegli, da je stranski produkt ftalhidrazid ostal v bazični vodni fazi, odščitena spojina pa je prešla v organsko fazo. Izkoristki sintez 4, 7 in 17 so dobri (79-83%), sintez 11 in 13 pa precej slabši (24-31%). V slednjih dveh primerih smo iz TLC zabeležili nepopolno pretvorbo spojin v končno, obenem pa smo verjetno največ produkta izgubili pri čiščenju s kolonsko kromatografijo. Pri spojinah 4, 7 in 17 čiščenje ni bilo potrebno. Morda smo še nekoliko bolj povečali izgubo spojin pri pretvorbi v sol s klorovodikovo kislino. Pri trituraciji smo morda uporabili premajhno količino EtOEt in se spojini nista popolnoma izoborili ali pa je bila topnost spojin v etanolu prevelika. Izkoristek reakcij 11 in 13 bi lahko po TLC analizi povečali tudi z dodatkom dodatnih 5 ekvivalentov hidrazin hidrata

60 Slika 14: Predviden mehanizem odstranitve ftalimidne zaščitne skupine stopenjska pretvorba nitrila preko amidoksima in 5-okso-4,5- dihidro-1,2,4-oksadiazola do amidina s katalitskim hidrogeniranjem. Nitril smo najprej pretvorili v amidoksim s hidroksilamonijevim kloridom v bazičnem mediju. Gre za reakcijo nukleofilne adicije hidroksilamina na polarno ciano skupino. Hidroksilamin mora biti za zagotovitev dobre nukleofilnosti v neprotonirani obliki, zato reakcijo izvajamo v bazičnem mediju. (33) Iz TLC analize smo razbrali, da je reakcija potekla skoraj kvantitativno. Produkt amidoksim se iz matičnice izobarja, zato smo ga prefiltrirali skozi teflonski filter. Matičnici smo uparili topilo in ločevali na kolonski kromatografiji. Celokupni izkoristek reakcije je dober (80%). Amidoksim smo v dvostopenjski reakciji pretvorili v 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4- oksadiazolni derivat. Najprej smo pripeli etil kloroformat na hidroksilno skupino v amidoksimu. Za nastanek O-aciliranega derivata potrebujemo nizko temperaturo, zato smo reakcijo izvajali na ledeni kopeli in s tem usmerjali potek reakcije v smer O-aciliranega derivata. Nastane lahko stranski produkt N-aciliran derivat. Iz tankoplastne kromatografije

61 je razvidno, da je reakcija potekla kvantitativno že pri 0 C. V reakcijski zmesi smo imeli prebitni etil kloroformat in trietilamin, ki smo ju odstranili z ekstrakcijo z vodno raztopino NaHCO3. Ugotovili smo, da se spojina v etilacetatu slabo raztaplja, zato smo za razvijanje TLC raje uporabili mobilno fazo DKM/MeOH = 20/1. Spojino ni bilo potrebno prekristalizirati, saj smo že z ekstrakcijo odstranili večino izhodnih reagentov in stranskih produktov. Izkoristek te stopnje je bil zelo dober (91%). V naslednji stopnji smo amidoksim z etoksikarbonilnim fragmentom pretvorili v ciklični karbamat 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol. Gre za reakcijo ciklizacije in tvorbo heterocikličnega petčlenskega obroča. Iz TLC analize smo opazili, da je reakcija potekla skoraj kvantitativno. Produkt je vseboval še izhodne spojine, zato smo ga prekristalizirali iz etanola. Po raztapljanju v vrelem etanolu smo bučko postavili na led, nato pa še v zmrzovalnik, da smo še bolj znižali topnost kristalov sintetizirane spojine in s tem povečali izkoristek reakcije. Iz NMR spektra smo po prekristalizaciji ugotovili, da so kristali spojine čisti, izkoristek reakcije pa je prav tako dober (82,1%). V četrti stopnji smo ftalimidno zaščitno skupino odstranili po že opisanem postopku. V zadnji stopnji reakcije smo ciklični karbamat reducirali s katalitskim hidrogeniranjem. Uporabili smo katalizator paladij na aktivnem oglju. Lahko bi uporabili tudi druge kovinske katalizatorje platina, rutenij ali nikelj. Iz TLC analize smo po dveh urah izvajanja reakcije ugotovili, da je reakcija končana in začeli z izolacijo. Najprej smo se lotili filtracije, da smo odstranili katalizator paladij na aktivnem oglju, matičnico smo nato uparili pri znižanem tlaku. Produkt po sušenju ni bil popolnoma suh, zato smo izvedli trituriranje z EtOEt in mešali dokler se ni prebitna ocetna kislina raztopila v EtOEt, nato pa smo mešanici topil odstranili in produkt ponovno posušili. Sintetizirana spojina je namreč preveč polarna, da bi se raztopila v EtOEt. Redukcija je poteka kvantitativno že pri milih pogojih (nizek tlak), prav tako pa nismo dobili stranskih produktov. Izkoristek reakcije je odličen (99%)

62 5.5. Sinteza bis-boc gvanidina na primarni amino skupini alkiliranega 5-metoksitriptamina Bis-Boc gvanidinski derivat smo pripravili iz aminskega s pomočjo N,N'-di-(tercbutoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino in HgCl2. Gre za reakcijo nukleofine substitucije med MeS-, ki je dobra izstopajoča skupina, in primarno amino skupino na derivatu 5- metoksitriptamina. C-atom v bis-boc tiosečnini je elektrofil in reagira s primarno amino skupino, ki je dober nukleofil. V reakcijsko zmes dodamo tudi živosrebrov klorid, saj se Hg 2+ dobro veže z izstopajočo skupino MeS-, nastane sol Hg(SMe)Cl. Pri tvorbi omenjene soli se sproščajo kloridni ioni, ki reagirajo do nastanka klorovodikove kisline. To je pomembno, saj se lahko Boc zaščita pri znižanju ph odstrani, zato smo pri sintezi uporabili alkalni medij (topilo trietilamin), ki nevtralizira sproščanje HCl. Z znižanjem ph v kislo območje bi tudi povzročili, da bi amino skupina prešla v protonirano obliko in s tem močno zmanjšala svoje nukleofilne lastnosti. (33) Po končani reakciji smo s tankoplastno kromatografijo ugotovili, da je reakcija potekla skoraj kvantitativno. Pri reakciji je nastala netopna sol Hg(SMe)Cl, ki smo jo odstranili s filtracijo. Med potekom reakcije je nastalo nekaj stranskih produktov, zato smo matičnici uparili topilo in ločevali na kolonski kromatografiji. Izkoristek sintez spojin 14 in 18 je bil razmeroma dober (63-85%). Slika 15: Mehanizem sinteze bis-boc gvanidina na primarni amino skupini 5.6. Odstranitev Boc zaščitne skupine Zaščitno skupino v obliki terciarnih butil karbamatov lahko odstranjujemo na različne načine, odstraniti jo je mogoče s HCl ali HBr v ledocetu ali s CF3COOH. Boc zaščitna skupina je obstojna pri ph 4-12, neobstojna pa proti oksidantom, katalitskem hidrogeniraju in organokovinskim ionom. (30). Pri sintezi smo uporabili reagent CF3COOH, ki odstrani Boc zaščitno skupino in z gvanidinom tvori sol. Sol s trifluoroocetno kislino smo pretvorili v sol s klorovodikovo kislino, saj hidrokloridi bolje tvorijo kristale v trdni obliki in so s

63 tem bolj stabilni. Po rotavapiranju smo dobili olje, ki smo ga s trituracijo pretvorili v kristale. Z EtOEt smo odstranili morebitne nečistote, izhodne spojine in prebitek topila. Pri sintezah spojin 15 in 19 smo zabeležili odličen izkoristek (95%). 6. BIOLOŠKO TESTIRANJE 6.1. Testiranje citotoksičnosti Citotoksičnost določamo s testom sposobnosti preživetja celic. Gre za kolorimetrično metodo za določanje števila preživelih celic v kulturah PBMC in HEK-293 z merjenjem aktivnosti celičnih encimov. Barvilo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2h-tetrazol) se s z delovanjem celičnih encimov reducira v vijolično obarvani formazan. Le-ta absorbira svetlobo pri valovni dolžini 490 nm, kar merimo spektrofotometrično. V kombinaciji z MTS se uporablja reagent PES (fenazin etosulfat), ki omogoča boljšo kemijsko stabilnost raztopine MTS. Redukcija MTS-formazan poteče z encimom mitohondrijska reduktaza, ki je značilen za metabolno aktivne celice. Količino nastalega produkta izračunamo iz dobljene absorbance, to pa nam da podatek o metabolični aktivnosti encimov. Metabolična aktivnost je premosorazmerna s številom preživelih celic po obdelavi s testirano spojino. Podatki v tabeli so predstavljeni kot odstotek metabolne aktivnosti. (34, 35, 36) Test MTS so izvedli na dveh celičnih kulturah. Spojine 4, 7, 8, 11, 13, 17 in 19 so testirali na celični kulturi PBMC (mononuklearne celice periferne krvi), spojini 15 in 17, ki sta se v testiranju protimikrobne učinkovitosti izkazali za najbolj učinkoviti pa na celični kulturi

64 HEK-293 (humane embrionalne ledvične celice). Spojina 15 ni bila testirana na celični kulturi PBMC, saj je bila sintetizirana zadnja in še ni bila na voljo pred izvedbo testa. Testa se med seboj razlikujeta zgolj v izbiri celične kulture. Preglednica 1: Rezultati testiranja citotoksičnosti na celičnih kulturah PBMC in HEK-293 PMBC celična HEK-293 celična kultura kultura oznaka struktura % metabolne aktivnosti Ctrl DMSO Ctrl DMSO Ctrl kontrola 98,67 100,00 98,12 100,00 DMSO kontrola, da topilo ne vpliva na test 100,00 101,35 100,00 101, ,9 92,1 / / 7 117,1 118,7 / / 8 106,9 108,3 / / 11 92,6 93,9 / / 13 3,5 3,6 / / 15 / / 91,5 93,3-54 -

65 17 39,0 39,5 33,6 34, ,3 67,2 / / Iz grafa in tabele lahko razberemo, da sintetizirane spojine povzročajo različno stopnjo citotoksičnosti. Izredno toksične so spojine, ki izkazujejo % metabolne aktivnosti pod 40%. Na grafu je meja 40% metabolne aktivnosti predstavljena z rdečo črto. Za zmerno toksične veljajo spojine, pri katerih je % metabolne aktivnosti med 40 in 80% (na grafu med rdečo in modro črto). Spojine znotraj intervala 80-95% metabolne aktivnosti so razmeroma netoksične (na grafu med modro in zeleno črto). Za praktično netoksične pa se smatrajo tiste, pri katerih je rezultat nad 95% (na grafu nad zeleno črto). Upoštevati moramo 10% odstopanja, saj metoda ni dovolj občutljiva. Koncentracija testiranih spojin je bila 8 µg/ml, koncentracija DMSO pa 0,5%. Graf 1: Prikaz odstotka metabolne aktivnosti PBMC celične kulture po dodatku testiranih spojin