NEGATIVAN UTJECAJ POVIŠENIH KONCENTRACIJA ŽELJEZA NA FOSFAT- AKUMULIRAJUĆU BAKTERIJU Acinetobacter junii U OBRADI OTPADNIH VODA

Transcription

1 Izvorni znanstveni članak Original Scientific Paper UDK : Primljeno (Received): ; Prihvaćeno (Accepted): NEGATIVAN UTJECAJ POVIŠENIH KONCENTRACIJA ŽELJEZA NA FOSFAT- AKUMULIRAJUĆU BAKTERIJU Acinetobacter junii U OBRADI OTPADNIH VODA Tomislav Ivanković, dipl. ing. biol. Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu Rooseveltov trg 6, Zagreb Prof. dr. sc. Jasna Hrenović, dipl. ing. biol. Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu Rooseveltov trg 6, Zagreb jasna.hrenovic@biol.pmf.hr Povećane količine željeza mogu ući u uređaje za biološko pročišćavanje s industrijskim i procijednim otpadnim vodama ili korištenjem željeznih soli za precipitaciju fosfata u tercijarnom stupnju pročišćavanja. U ovom radu istražen je utjecaj dodatka željeza u obliku FeSO 4 na rast i metabolizam čiste kulture fosfatakumulirajuće bakterije Acinetobacter junii. Pokazalo se da je za uspješan rast i metabolizam A. junii dovoljna prisutnost Fe 2+ u tragovima ( 0,02 mg L -1 ). U otpadnoj vodi koncentracije Fe 2+ od 1,31 mg L -1 pokazuju negativan utjecaj na rast i metabolizam bakterija, a koncentracije veće od 24,16 mg L -1 uzrokuju odumiranje bakterijske biomase. Postoji opasnost da povišene koncentracije Fe 2+ djeluju toksično prema fosfat-akumulirajućim bakterijama i drugim mikroorganizmima u aktivnom mulju i tako dugoročno naruše sposobnost uređaja za tercijarno pročišćavanje da uspješno uklanjaju fosfate iz otpadnih voda. Ključne riječi: Acinetobacter junii, fosfat, otpadna voda, toksičnost, željezo 23

2 1. Uvod Provedbom Akcijskog plana za dunavsku regiju bit će potrebno poštivati granične vrijednosti za ispust hranjivih tvari (ukupni fosfor i ukupni dušik) u rijeke dunavskog sliva te će se morati dograditi postojeći sustavi za obradu otpadnih voda na tercijarni stupanj pročišćavanja (Krmek i Drmić, 2011.; Biondić i Barbalić, 2011.). Kao jedna od najisplativijih metoda uklanjanja hranjivih tvari navodi se poboljšano biološko uklanjanje fosfora poznatije kao EBPR (engl. Enhanced Biological Phosphorus Removal). Ovaj postupak se temelji na sposobnosti fosfat (P)-akumulirajućih bakterija koje se nalaze u aktivnom mulju (slika 1) da u izmjeničnom anaerobno-aerobnom režimu rada uređaja (tercijarni stupanj) uklanjanju više P iz otpadne vode nego što se uklanja pomoću konvencionalnog aktivnog mulja u sekundarnom biološkom stupnju pročišćavanja (Ivanković i Hrenović, a.). Slika 1: Fosfat-akumulirajuće bakterije u aktivnom mulju. Nakupljeni fosfati su vidljivi kao tamno plava zrnca polifosfata unutar bakterijskih stanica kada se preparat aktivnog mulja oboji metodom po Neisseru (Eikelboom i van Buijsen 1983.). Iako je režim rada uređaja kojim se postiže sposobnost mulja da provodi postupak EBPR relativno poznat, često se dogodi da uređaji podbace u radu jer su mikroorganizmi uključeni u ovaj postupak jako osjetljivi na različite ekološke čimbenike (Osborne i sur., 1986.; Lötter 1991; Seviour i sur., 2003.; Thomas i sur., 2003.). Zbog toga je često vrlo teško postići tražene granične vrijednosti od < 1 mg P L -1 u efluentu (Pravilnik o graničnim vrijednostima emisija otpadnih voda NN 87/10). Kao jedan od načina da se ispune traženi standardi nameće se kombinirani kemijsko-biološki postupak uklanjanja P gdje se uklanjanje pomoću aktivnog mulja nadopunjuje precipitacijom P pomoću kemikalija, najčešće željeznih i aluminijevih soli. Iako postoji puno primjera gdje se dodavanjem kemikalija (kao što su FeCl 3 i FeSO 4 ) izravno u bazene s aktivnim muljem uspješno uklanjaju P do koncentracije < 1 mg P L -1 (de Haas i sur., 2000.) istraživanja mnogih autora dokazuju da dodane kemikalije mogu djelovati negativno na biološke procese vezane uz uklanjanje P (Wuhrmann 1968.; Lötter 1991.; Clark i Stephenson, 1998.; de Haas i sur., 2000.). Razumljivo je da bi se ekonomska dobit od korištenja kemikalija izgubila ako to dovodi do inhibicije biološkog postupka uklanjanja P i prestanka rada uređaja za EBPR. U ovom radu istražen je utjecaj dodatka željeza u obliku FeSO 4 na rast i metabolizam čiste kulture P-akumulirajuće bakterije Acinetobacter junii koja se koristi kao modelni organizam za EBPR (Hrenović, 2011.). 2. Materijali i metode 2.1. Bakterija U radu je korištena čista kultura bakterije Acinetobacter junii DSM 1532 nabavljena iz banke mikroorganizama Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH. Kultura bakterije je izolirana iz aktivnog mulja s karakteristikama poboljšanog biološkog uklanjanja P te je opisana kao P-akumulirajuća bakterija (United States Patent 3,980,557) Otpadna voda U radu je korištena kemijski definirana otopina koja zadovoljavajuće simulira realnu otpadnu vodu. Sastav otopine je bio: Na-propionat 300 mg, pepton 100 mg, kvaščev ekstrakt 20 mg, MgSO 4 10 mg, CaCl 2 6 mg, KCl 30 mg, KH 2 PO 4 88 mg, destilirana voda 1000 ml. U boce s pripremljenom otpadnom vodom dodavano je željezo u obliku željeznog sulfata (FeSO 4 ) u koncentracijama od 5, 50, 100, 500, 1000 i 5000 mg L -1. U kontrolnoj boci željezo nije dodavano. Vrijednost ph otpadne vode namještena je na 7,0 s 1M NaOH ili 1M HCl, a voda je prije pokusa sterilizirana metodom autoklaviranja (121 C/20 min) Izvedba pokusa Čista kultura A. junii koja je prethodno uzgojena na pločama s hranjivim agarom (Biolife, Italija) kroz 16 h na 30 C suspendirana je u sterilnoj 0,3% otopini NaCl-a. Po 1 ml suspenzije A. junii (koncentracije bakterija od ~10 8 vijabilnih stanica ml -1 ) dodavan je u Schottove boce koje su sadržavale 100 ml otpadne vode. Boce su zatim stavljene u vodenu kupelj (30 C) na aerobnu inkubaciju (sterilni zrak 1 L min -1 ) u trajanju od 24 h. Broj bakterija A. junii određivan je kao broj jedinica koje formiraju kolonije (u daljnjem tekstu CFU engl. Colony Forming Units) na početku i nakon inkubacije metodom decimalnih razrjeđenja i razmazivanjem uzoraka na hranjivu podlogu (Hrenović i sur., 2009.). Koncentracije Fe 2+ i P u otpadnoj vodi određene su spektrofotometrijski na HACH DR2500 spektrofotometru po Hach metodi 8008 (Fe 2+ ) i 8114 (P- 3- PO 4 ). Prije određivanja koncentracije obaju parametara uzorci su profiltrirani preko Sartorius nitroceluloznih filtara promjera pora 0,2 μm. 24

3 3. Rezultati i diskusija U kontrolnom reaktoru sa sintetskom otpadnom vodom bez dodatka željeza i čistom kulturom A. junii početne koncentracije od 15± CFU L -1, bakterija je normalno rasla i uklanjala P iz otpadne vode tijekom 24 h inkubacije (tablica 1). Broj bakterija nakon 24 h bio je znatno veći nego na početku, a stopa uklanjanja P od 2, mg P CFU -1 odgovara metabolizmu P- akumulirajuće bakterije (Sidat i sur., 1999.). Možemo zaključiti da je za bakteriju A. junii dovoljna prisutnost Fe 2+ kao mikronutrijenta u tragovima. U tragovima se željezo nalazi u peptonu i kvaščevom ekstraktu te u destiliranoj vodi. Dodavanjem željeza nije postignuto poboljšanje uklanjanja P bakterijom A. junii. Naprotiv, nakon inkubacije broj bakterija u reaktoru s koncentracijom Fe 2+ od 1,31 mg L -1 bio je za 9 % manji nego u kontrolnom reaktoru (tablica 1). Fe 2+ u koncentraciji od 24,16 mg L-1 djelovalo je toksično prema bakteriji; broj bakterija nakon 24 h inkubacije bio je manji za 11,9 % nego na početku pokusa, što ukazuje da je započela faza odumiranja bakterijske biomase. Pri koncentraciji Fe 2+ od 108,82 mg L -1 odumiranje biomase bilo je potpuno i na kraju inkubacije nije bilo vijabilnih bakterija u reaktorima (slika 2). Pri koncentracijama FeSO 4 od 50 mg L -1 i višim dolazi do kemijske precipitacije Fe 2+ sa P otopljenim u vodi. Tako pri koncentracijama Fe 2+ višim od 108,82 mg L -1 uopće nema slobodnih P u otpadnoj vodi, nego je sav P precipitirao u obliku P-Fe čestica (slika 2). Kad su koncentracije FeSO 4 bile 500 mg L -1 i više P su precipitirali već na početku pokusa, pri samom procesu pripreme otpadne vode i autoklaviranja. Praćenje koncentracije Fe 2+ na početku i na kraju pokusa potvrđuje precipitaciju (tablica 1). Do znatnije razlike dolazi u reaktorima s dodatkom 100 mg L -1 FeSO 4, gdje je razlika oko 15 mg L -1. Ovdje uz značajnu precipitaciju počinje odumiranje bakterijske biomase (slika 2). U reaktorima s višim koncentracijama dodanog FeSO 4, razlika u koncentraciji Fe 2+ prije i poslije inkubacije je iznimno velika, što korelira s potpunim uklanjanjem P iz vode (slika 2). Treba napomenuti i da je zbog aeracije dio Fe 2+ vjerojatno oksidirao do Fe 3+ iona. Nedostatak P, koji je kemijski precipitirao, bi mogao biti razlog za odumiranje bakterijske biomase u reaktorima s povišenim koncentracijama Fe, no to je malo vjerojatno. Naime, do odumiranja dolazi već u reaktoru s 100 mg FeSO 4 L -1, gdje ima sasvim dovoljno P. Također, bakterije za metabolizam i rast mogu koristiti i organski fosfor koji se nalazi u peptonu i kvaščevom ekstraktu, tako da se odumiranje bakterija može pripisati velikim koncentracijama Fe 2+. Slika 2: Broj bakterija A. junii i ukupno uklanjanje P u kontrolnom reaktoru (0 mg FeSO 4 L -1 ) i reaktorima s dodatkom FeSO 4 ( mg L -1 ) nakon 24 h inkubacije. U literaturi (He i sur, 1996.) je navedeno kako se čestice P-Fe precipitata u aktivnom mulju najvjerojatnije vežu u mrežu ekstracelularnih tvari nastalih bakterijskom aktivnošću (flokula mulja) ili izravno na bakterijsku stanicu. Predloženo je da ovakvo vezivanje može doprinijeti boljem slijeganju P-Fe čestica u sekundarnom taložniku te da na ovaj način biomasa doprinosi boljem obaranju P u obradi vode. Suprotan zaključak se može izvesti iz pokusa u našem sustavu gdje je bila čista kultura bakterije pa je vjerojatno došlo do vezivanja P-Fe precipitata na bakterijsku stanicu, što je dovelo do odumiranja bakterija. Čestice ve- Tablica 1: Utjecaj iona željeza na rast i metabolizam A. junii. * Broj bakterija u kontrolnom reaktoru (log CFU L -1 ) nakon 24 h inkubacije uzet je kao maksimalni broj, a inhibicija rasta bakterija u reaktorima s dodatkom željeza izračunata je kao postotak smanjenja broja bakterija u odnosu na kontrolni reaktor. Start Kontrola Dodatak FeSO 4 Dodano FeSO 4 (mg L -1 ) ph 7,0±0,2 P-PO 4 (mg L -1 ) 19,9±0,6 CFU (L -1 ) 15±2, Fe 2+ (mg L -1 ) < 0,02 1,31 11,45 24,16 108,82 199,3 1230,0 24 h inkubacije ph 7,45 5,75 6,88 5,94 5,44 5,18 5,15 P-PO 4 (mg L -1 ) 17,7 18,0 15,6 13,2 0,1 0,0 0,0 CFU (L -1 ) 1, , , Fe 2+ (mg L -1 ) < 0,02 1,09 8,53 9,86 32,46 99,7 1052,8 Ukupno uklonjeno P (%) 14,1 10,5 20,8 30, *Inhibicija CFU (%)

4 Slika 3: Mikroorganizmi u aktivnom mulju; Rotifera (a, b) i Ciliophora (c, d), (Foissner i Berger, 1996). zanog Fe ili P-Fe mogu spriječiti normalnu izmjenu nutrijenata bakterije s okolnim medijem ili djelovati inhibitorno na enzimske reakcije u bakterijskoj stanici. U tablici 1 su vidljive razlike u ph vrijednosti medija u kontrolnom reaktoru i reaktorima s dodanim FeSO 4 nakon 24 h inkubacije. U kontrolnom reaktoru ph vrijednost je ostala u području od neutralnog do blago lužnatog koje bakteriji najviše odgovara za rast (Garrity i sur., 2003.). U reaktorima s dodanim FeSO 4, vrijednost ph se mijenja u kiselo i postaje ograničavajući faktor rasta za bakteriju A. junii koja odumire ispod ph 6 (Ivanković i Hrenović b.). Valjano je pretpostaviti da je niska vrijednost ph jedan od čimbenika koji su doveli do slabog rasta i odumiranja bakterijske biomase u slučajevima dodavanja FeSO 4. Dio iona Fe 2+ koji se otpuste iz FeSO 4 u otpadnoj vodi stupaju u reakciju hidrolize što kao posljedicu ima smanjenje alkalnosti medija te snižavanje ph (de Haas i sur., 2000.). Zbog precipitacije P također se smanjuje puferska sposobnost otopine, odnosno otpadne vode (Caravelli i sur., 2010.). U studiji gdje se testirala precipitacija P u laboratorijskom sustavu s aktivnim muljem došlo je do pada vrijednosti ph otpadne vode ispod 3 (početna vrijednost je bila 7,0) kad je dodan željezni klorid. Tako niska vrijednost ph nije bila u skladu s biološkim potrebama aktivnog mulja te se puferska sposobnost sustava morala namještati dodavanjem NaHCO 3 (Caravelli i sur., 2010.). Bliss i sur. (1994.) su također predložili da je snižavanje ph vrijednosti uslijed dodatka željeznih soli najvjerojatnije odgovorno za primijećeni negativan učinak na biološko pročišćavanje. I drugi istraživači (Barth i Ettinger 1967.; Eberhardt i Nesbit, 1968.; Wuhrmann, 1968.) su naveli kako dodavanje kemikalija snižava vrijednost ph reaktora s aktivnim muljem i do 5,5-6,5. U ovom radu opisan je utjecaj Fe 2+ na fosfat-akumulirajuću bakteriju, no valjano je pretpostaviti da se negativan utjecaj Fe 2+ može ispoljiti i na druge mikroorganizme prisutne u aktivnom mulju. Tako je nađeno da željezne (Fe 2+ ) soli i željezo-organski kompleksi djeluju inhibitorno na rast bakterija iz roda Sphaerotilus koje su također stanovnici aktivnog mulja (Chang i sur., 1979.). Dokazano je i da je dodavanje željeznog klorida dovelo do gotovo potpunog nestanka praživotinja (Protozoa) u aktivnom mulju. Kako su praživotinje iznimno bitne za održavanje stabilnog mulja, ovo je dovelo do narušavanja kvalitete i slabog slijeganja mulja (Wuhrmann, 1968.). Treba uzeti u obzir da željezo, osim na fosfat-akumulirajuće bakterije u tercijarnom stupnju pročišćavanja, može negativno djelovati i na mikroorganizme u sekundarnom stupnju biološkog pročišćavanja (slika 3) osobito u slučaju ulijevanja industrijskih ili procijednih otpadnih voda s visokim koncentracijama željeza. 4. Zaključak Rezultati ukazuju da je za uspješan rast i metabolizam A. junii dovoljna prisutnost Fe 2+ u tragovima. Visoke koncentracije Fe 2+ u otpadnoj vodi djeluju toksično prema bakteriji. Najvjerojatniji razlog toksičnosti je snižavanje vrijednosti ph uslijed dodavanja FeSO 4, što je dopunjeno s vezivanjem Fe-P precipitata na bakterijsku stanicu. Postoji opasnost da povišene koncentracije željeza iz industrijskih i procijednih otpadnih voda te iz kombiniranog kemijsko-biološkog postupka uklanjanja P djeluju toksično prema fosfat-akumulirajućim bakterijama, ali i drugim mikroorganizmima u aktivnom mulju. Tako se mogu dugoročno narušiti svojstva poboljšanog biološkog uklanjanja P postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda. LITERATURA Barth E.F., Ettinger M.B. (1967.): Mineral controlled phosphorus removal in activated sludge process. J. WPCF 39, Biondić D., Barbalić S. (2011.): Nacrt plana upravljanja vodnim područjima. 5. hrvatska konferencija o vodama, Opatija svibnja, zbornik radova, Bliss P.J., Ostarcevic E.R., Potter A.A. (1994.): Process optimization for simultaneous biological nitrification and chemical phosphorus removal. Water. Sci. Technol. 29, Caravelli A.H., Contreras E.M., Zaritzky N.E. (2010.): Phosphorus removal in batch systems using ferric chloride in the presence of activated sludges. J. Haz. Mat. 177, Chang Y., Pfeffer Y.T., Chian E.S. (1979.): Comparative study of different iron compounds in inhibition of Sphaerotilus growth. Appl. Environ. Microbiol. 38,

5 Clark T., Stephenson T. (1998.): Effects of chemical addition on aerobic biological treatment of municipal wastewater. Environ. Technol. 19, de Haas D.W., Wentzel M.C., Ekama G.A. (2000.). The use of simultaneous chemical precipitation in modified activated sludge systems exhibiting biological excess phosphate removal Part 1: Literature review. Water SA 26, Eberhardt W.A., Nesbitt J.B. (1968.): Chemical precipitation of phosphorus in a high-rate activated sludge system. J. WPCF 40, Eikelboom D.H., van Buijsen H.J.J. (1983.): Microscopic sludge investigation manual. (2nd edn.) TNO Research Institute of Environmental Hygiene, Delft. Foissner W., Berger H. (1996.): A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology 35, Garrity G.M., Bell J.A., Lilburn T.G. (2003.): Bergey s manual of systematic bacteriology. Springer-Verlag, New York. He Q.H., Leppard G.G., Paige C.R., Snodgrass W.J. (1996.): Transmission electron microscopy of a phosphate effect on the colloid structure of iron hydroxide. Water Res. 30, Hrenović J., Ivanković T., Tibljaš D. (2009.): The effect of mineral carrier composition on phosphate-accumulating bacteria immobilization. J. Haz. Mat. 166, Hrenović J. (2011): Bakterije odgovorne za biološko uklanjanje fosfata iz otpadnih voda. Hrvatske vode 77, Ivanković T., Hrenović J. (2011.a): Biološko uklanjanje fosfata iz otpadnih voda pregled dosadašnjih istraživanja. 5. hrvatska konferencija o vodama, Opatija svibnja, zbornik radova, Ivanković T., Hrenović J. (2011.b): Bacteria immobilized on natural zeolitized tuff are able to survive in the conditions of extreme ph. 4 th Slovenian-Croatian Symposium on Zeolites, Ljubljanja October, Proceedings, Krmek Z., Drmić R. (2011.): Vodno gospodarstvo pred izazovom provedbe vodnog acquisa. 5. hrvatska konferencija o vodama, Opatija svibnja, zbornik radova, Lötter L.H. (1991.): Combined chemical and biological removal in activated sludge plants. Water. Sci. Technol. 23, Osborne D.W., Lötter L.H., Pitman A.R., Nicholls H.A. (1986.): Enhancement of biological phosphate removal by altering feed composition. WRC Report No. 137/1/86, Water Research Comission, PO Box 824, Pretoria 0001, South Africa. Seviour R.J., Mino T., Onuki M. (2003.): The microbiology of biological phosphorus removal in activated sludge systems. FEMS Microbiol. Rev. 27, Sidat M., Bux F., Kasan H.C. (1999.): Phosphate accumulation by bacteria isolated from activated sludge. Water SA 25, Thomas M., Wright P., Blackall L., Urbain V., Keller J. (2003.): Optimisation of Noosa BNR plant of improve performance and reduce operating costs. Water Sci. Technol. 47, Wuhrmann K. (1968.): Objective, technology and results of nitrogen and phosphorus removal processes. Adv. Water Quality Improvement, Univ. of Texas Press.,

6 Negative impact of increased iron concentrations on the phosphateaccumulating bacteria Acinetobacter junii in wastewater treatment Abstract. Increased iron concentrations may enter biological treatment plants through industrial and seepage wastewater or use of iron salts for phosphate precipitation in tertiary treatment. This paper investigated the impact of iron addition in the form of FeSO4 on the growth and metabolism of the pure culture of phosphate-accumulating bacteria Acinetobacter junii. It was determined that the presence of Fe2+ in traces ( 0.02 mg L-1) was sufficient for successful growth and metabolism of A. junii. In wastewater, concentrations of Fe2+ starting from 1.31 mg L-1 adversely impact the growth and metabolism of the bacteria, whereas concentrations over mg L-1 cause dying off of bacterial biomass. There is a danger that increased Fe2+ concentrations will have a toxic impact on phosphateaccumulating bacteria and other microorganisms in active sludge, with consequential long-term reduction of the tertiary treatment plant's ability to successfully remove phosphates from wastewater. Key words: Acinetobacter junii, phosphate, wastewater, toxicity, iron Negativer Einfluss erhöhter Eisenkonzentrationen auf das phosphatspeichernde Bakterium Acinetobacter junii in der Abwasserbehandlung Zusammenfassung. Hohe Eisenmengen können mit Industrieabwasser und Deponie-Sickerwasser oder bei der Nutzung von Eisensalzen für die Präzipitation von Phosphat in der terziären Klärungsstufe in die Abwasserreinigungsanlagen für die biologische Behandlung gelangen. In dieser Arbeit wird der Einfluss des Eisenzusatzes in Form von FeSO4 auf das Wachstum und den Stoffwechsel der Reinkultur des phosphatspeichernden Bakteriums Acinetobacter junii untersucht. Es hat sich gezeigt, dass für ein erfolgreiches Wachstum und einen gesunden Stoffwechsel von A. junii die Anwesenheit von Fe2+-Spuren ( 0,02 mg L-1) ausreicht. Im Abwasser zeigen die Fe2+-Konzentrationen von 1,31 mg L-1 einen negativen Einfluss auf Wachstum und Stoffwechsel von Bakterien, und die Konzentrationen, die höher als 24,16 mg L-1 sind, führen zum Absterben der Bakterienbiomasse. Es besteht die Gefahr, dass höhere Fe2+-Konzentrationen toxisch auf phosphatspeichernde Bakterien und andere Mikroorganismen im belebten Schlamm wirken und auf diese Weise die Fähigkeit von Abwasserreinigungsanlagen für terziäre Klärung gefährden, Phosphate aus Abwasser zu entfernen. Schlüsselwörter: Acinetobacter junii, Phosphat, Abwasser, Toxizität, Eisen 28