NEINVAZIVNO ODKRIVANJE HIPERBILIRUBINEMIJE NOVOROJENČKOV. Noninvasive determination of hyperbilirubinemia in newborns

Transcription

1 DARINKA OŠTIR MEVŽELJ NEINVAZIVNO ODKRIVANJE HIPERBILIRUBINEMIJE NOVOROJENČKOV Noninvasive determination of hyperbilirubinemia in newborns MAGISTRSKA NALOGA Magistrski študijski program laboratorijska biomedicina Ljubljana, 2012

2 Izjava Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorice zasl. prof. dr. Jane Lukač Bajalo, univ. dipl. kem., spec. med. biokem. in somentorice asis. dr. Danijele Furlan, univ. dipl. kem., spec. med. biokem. Zahvale Zahvaljujem se staršem novorojenčkov, da so bili pripravljeni sodelovati in so zavestno pristopili k sodelovanju svojih otrok v raziskavi. Za strokovno vodenje, pomoč in nasvete se zahvaljujem mentorici zasl. prof. dr. Jane Lukač Bajalo, univ. dipl. kem., spec. med. biokem. Iskrena hvala somentorici asis. dr. Danijele Furlan, univ. dipl. kem., spec. med. biokem. za skrbno in nesebično strokovno vodenje ter pripravljenost pomagati v vsakem trenutku. Zahvaljujem se tudi kolegicam Dušici, Katji in Marjeti za potrpežljivost, razumevanje, nemoteno ter strokovno delovanje laboratorija v času moje odsotnosti. Posebej se zahvaljujem moji ožji in širši družini za razumevanje in podporo v času študija. Darinka Oštir Mevželj Ljubljana, 2012 I

3 VSEBINA POVZETEK IV ABSTRACT... V KAZALO SLIK....VI KAZALO PREGLEDNIC.....VII SEZNAM OKRAJŠAV.... IX 1 UVOD BILIRUBIN LASTNOSTI IN PRESNOVA Molekulske oblike bilirubina HIPERBILIRUBINEMIJA Razvrstitev hiperbilirubinemij HIPERBILIRUBINEMIJA NOVOROJENČKOV Genetski vzroki za razvoj hiperbilirubinemije novorojenčkov DIAGNOSTIKA IN ZDRAVLJENJE HIPERBILIRUBINEMIJ Diagnostika hiperbilirubinemij Zdravljenje hiperbilirubinemij NAMEN DELA IN DELOVNE DOMNEVE NAMEN DELA DELOVNE DOMNEVE MATERIALI, METODE IN OPREMA PREISKOVANCI IN NJIHOVI VZORCI METODE DELA Izračun diagnostične občutljivosti rezultata neonatalnega bilirubina v popkovnični krvi Statistična analiza LABORATORIJSKE METODE Določanje koncentracij plazemskega bilirubina Določanje koncentracij transkutanega bilirubina OPREMA IN REAGENTI REZULTATI KLINIČNE ZNAČILNOSTI II

4 4.2 RAZVOJ PATOLOŠKE HIPERBILIRUBINEMIJE IN POVEZAVA S KONCENTRACIJAMI BILIRUBINA Vpliv fototerapije na koncentracije bilirubina Določitev mejne vrednosti BIL v popkovnični krvi in izračun diagnostične občutljivosti Prolongirana hiperbilirubinemija pri novorojenčkih po odpustu iz porodnišnice RAZPRAVA SKLEPI LITERATURA PRILOGE CELOTNA SKUPINA DONOŠENIH ZAPOREDNO ROJENIH NOVOROJENČKOV SKUPINA NOVOROJENČKOV S FIZIOLOŠKO HIPERBILIRUBINEMIJO SKUPINA NOVOROJENČKOV S PATOLOŠKO HIPERBILIRUBINEMIJO SKUPINA NOVOROJENČKOV S PROLONGIRANO HIPERBILIRUBINEMIJO III

5 POVZETEK Nekonjugirana neonatalna hiperbilirubinemija se pojavi v prvih dneh otrokovega življenja in zaradi visokih koncentracij bilirubina, ki je nevrotoksičen, lahko povzroči usodne možganske poškodbe. Odločitev za zdravljenje hiperbilirubinemij največkrat temelji na koncentraciji bilirubina v plazmi, za kar je potreben invaziven odvzem krvi. Z našo raziskavo smo nameravali dokazati, da z določanjem koncentracije bilirubina v neinvazivno odvzeti popkovnični krvi lahko napovemo razvoj patološke hiperbilirubinemije in s transkutanim merjenjem bilirubina nadomestimo plazemsko določitev bilirubina. V raziskavo je bilo vključenih 284 zdravih zaporedno rojenih donošenih novorojenčkov, katerim je bil odvzet vzorec popkovnične krvi takoj po porodu in vzorec kapilarne krvi 3. dan, istočasno je bil transkutano izmerjen tudi bilirubin. Patološko hiperbilirubinemijo je razvilo 2,8 krat več dečkov kot deklic, kar pomeni, da imajo dečki večje tveganje za razvoj patološke hiperbilirubinemije. Vse primerjane koncentracije bilirubina med fiziološko in patološko skupino hiperbilirubinemije so bile statistično značilno različne (p < 0,001). V vseh raziskovanih skupinah smo dokazali statistično značilno korelacijo med koncentracijo plazemskega bilirubina in transkutano meritvijo bilirubina, oboje določeno 3. dan starosti. S tem smo dokazali, da transkutana meritev bilirubina lahko nadomesti določitev plazemskega bilirubina in invaziven odvzem krvi ni potreben. Napoved tveganja za razvoj patološke hiperbilirubinemije novorojenčka pomeni tudi pravočasno zdravljenje. Ker je za presejalno metodo pomembna čim višja diagnostična občutljivost, smo izbrali mejno vrednost bilirubina v popkovnični krvi 28 μmol/l. S tem izpolnimo zahteve za visoko diagnostično občutljivost presejalnega testa, ker lahko z 98,8% diagnostično občutljivostjo napovemo tveganje za razvoj patološke hiperbilirubinemije, hkrati pa lahko s 100% diagnostično občutljivostjo trdimo, da fototerapija ne bo potrebna. Proučevali smo tudi razvoj prolongirane hiperbilirubinemije po odpustu novorojenčkov iz porodnišnice in ugotovili, da je izbrana mejna vrednost bilirubina 28 μmol/l v popkovnični krvi tudi napovednik za razvoj prolongirane hiperbilirubinemije. Rezultati naše študije potrjujejo postavljene domneve, da je koncentracija bilirubina v neinvazivno odvzeti popkovnični krvi novorojenčkov dober napovednik za razvoj patološke in prolongirane hiperbilirubinemije in bi se lahko uporabila kot presejalni test. Tudi dobra korelacija med koncentracijo bilirubina v kontrolnem vzorcu in transkutano meritvijo bilirubina kaže, da se invaziven odvzem krvi lahko nadomesti z neinvazivno transkutano meritvijo bilirubina, ko se hiperbilirubinemija že pojavi. IV

6 ABSTRACT An un-conjugated neonatal hyperbilirubinemia appears during first days of child s life. High concentrations of bilirubin, which is neurotoxic, can cause serious brain damages. A decision how to treat hyperbilirubinemia is usually based on the concentration of bilirubin in the plasma which we gain with an invasive blood sampling. In our research we wanted to prove that by measuring the concentration of bilirubin in the non-invasively taken sample of cord blood, we can predict the development of hyperbilirubinemia. Besides that, by transcutaneous measuring of bilirubin we can replace determination of bilirubin in the plasma. We included 284 healthy, consecutively born, fullterm newborns from whom a sample of cord blood was taken immediately after the birth, and a sample of capillary blood three days after. At the same time we measured concentrations of bilirubin transcutaneously. 2,8 times more boys than girls developed the pathological hyperbilirubinemia. The risk for developing the pathological hyperbilirubinemia is higher for boys. All compared concentrations of bilirubin between groups were statistically significant (p < 0,001). For all researched groups we proved statistically significant correlation between concentrations of transcutaneously measuring of bilirubin and bilirubin in plasma, both taken on the third day. The results show that transcutaneous measuring of bilirubin can replace the determination of bilirubin in plasma, and invasive taking of blood samples is not needed. Predicting the risk for development of pathological hyperbilirubinemia means also newborns can be treated on time. A high diagnostic sensibility is important for screening method. Therefore we chose 28 µmol/l as cut-off value of cord blood bilirubin. With this value we meet the requirements for screening test and we can predict the risk for pathological hyperbilirubinemia with 98,8% diagnostic sensibility. At the same time we can claim with 100% diagnostic sensibility that phototherapy will not be needed for newborns. We studied as well the development of prolonged hyperbilirubinemia after the release of babies from maternity hospital and found that the selected cut-off of cord blood bilirubin 28 µmol/l serves also as a predictor for the development of prolonged hyperbilirubinemia. Results confirm our assumption that the concentration of bilirubin in the non-invasively taken cord blood of newborns is a good predictor for the development of pathological and prolonged hyperbilirubinemia. It could be used as a screening test too. A correlation between concentration of bilirubin in the control sample and transcutaneous measuring of bilirubin shows that invasive way of taking blood sample can be replaced by non-invasive transcutaneous measuring of bilirubin when hyperbilirubinemia has already appeared. V

7 KAZALO SLIK Slika 1: Strukturna formula bilirubina Slika 2: Prikaz nastanka bilirubina Slika 3: Tridimenzionalna struktura bilirubina IX α Slika 4: Prikaz vezave bilirubina na albumin, njegova disociacija pred vstopom v hepatocit, konjugacija z glukuronsko kislino, nastanek bilirubin diglukuronida in bilirubin monoglukuronida in izločanje v žolč Slika 5: Prikaz presnove bilirubina do izločanja Slika 6: Molekulske oblike bilirubina izomeri VI

8 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica I: Klinične ugotovitve preiskovane skupine 20 Preglednica II: Izračuni statističnih značilnosti za porodno težo, koncentracijo BIL PK, BIL v kontrolnem vzorcu 3. dan in Tc BIL 3.dan glede na spol Preglednica III: Statistične značilnosti telesnih tež, koncentracij BIL PK, BIL 3. dan in Tc BIL 3. dan, v primerjanih skupinah (patološke in fiziološke hiperbilirubinemije) Preglednica IV: Prikaz koncentracij BIL PK, BIL v vzorcu 3. dan in Tc BIL 3. dan v skupini patološke hiperbilirubinemije združene z novorojenčki iz skupine s fiziološko hiperbilirubinemijo, ki so prejeli fototerapijo pred 3. dnem in v novonastali skupini novorojenčkov s fiziološko hiperbilirubinemijo Preglednica V: Prikaz korelacij med BIL PK, BIL 3. dan in Tc BIL 3. dan v skupinah vseh novorojenčkov ter v novonastalih skupinah s fiziološko in patološko hiperbilirubinemijo.25 Preglednica VI: Izračun diagnostične občutljivosti z upoštevanjem mejne vrednost BIL PK 32 μmol/l za napoved patološke hiperbilirubinemije (osnovna skupina novorojenčkov s patološko hiperbilirubinemijo) Preglednica VII: Izračun diagnostične občutljivosti z upoštevanjem mejne vrednost BIL PK 28 μmol/l Preglednica VIII: Izračun diagnostične občutljivosti z upoštevanjem mejne vrednost BIL PK 32 μmol/l, za napoved patološke hiperbilirubinemije (skupina novorojenčkov s patološko hiperbilirubinemijo, kateri smo dodali novorojenčke s fiziološko hiperbilirubinemijo, ki so prejeli fototerapijo pred 3. dnem Preglednica IX: Izračun diagnostične občutljivosti z upoštevanjem mejne vrednost BIL PK 28 μmol/l, za napoved patološke hiperbilirubinemije (skupina novorojenčkov s patološko hiperbilirubinemijo, kateri smo dodali novorojenčke s fiziološko hiperbilirubinemijo, ki so prejeli fototerapijo pred 3. dnem) Preglednica X: Prikaz primerjave koncentracij BIL v popkovnični krvi in transkutanega bilirubina (dečki / deklice) v skupinah celotne prolongirane hiperbilirubinemije, fiziološke in patološke prolongirane hiperbilirubinemije VII

9 Preglednica XI: Nova razporeditev (obsevani novorojenčki razvrščeni v skupino s patološko hiperbilirubinemijo) prikaza primerjave koncentracij BIL v popkovnični krvi in transkutanega bilirubina (dečki / deklice) v skupinah celotne prolongirane hiperbilirubinemije, fiziološke in patološke prolongirane hiperbilirubinemije..28 VIII

10 SEZNAM OKRAJŠAV AACC ATP Bc BDG BIL BIL PK BMG Bu BVD CE CN GS HPLC K 2 EDTA NADPH UGT1A1 RES Tc BIL δ-bil American Association for Clinical Chemistriy adenozintrifosfat konjugirani bilirubin bilirubin diglukuronid bilirubin bilirubin v popkovnični krvi bilirubin monoglukuronid nekonjugirani bilirubin biliverdin kapilarna elektroforeza Crigler Najjarov sindrom Gilbertov sindrom tekočinska kromatografija visoke ločljivosti di kalijeva sol EDTA nikotinamid adenin dinukleotid fosfat uridindifosfat glukuroniltransferaza 1A1 retikuloendotelijski sistem transkutano merjeni bilirubin delta-bilirubin IX

11 1 UVOD 1.1 BILIRUBIN LASTNOSTI IN PRESNOVA Bilirubin (BIL) (slika 1) je lipofilni pigment, ki nastane pri katabolizmu hema in je endogeni antioksidant v telesu sesalcev, vendar pa je v visokih koncentracijah nevrotoksičen, saj lahko povzroča bilirubinske encefalopatije in kernikterus, ki je v 10 % vzrok smrtnosti in tudi 70% obolevnosti novorojenčkov (1). Slika 1: Strukturna formula bilirubina V telesu novorojenčkov nastane bilirubina na kg telesne teže 2,5 krat več kot pri odraslem. Glavnina (80%), ga nastane iz odmirajočih eritrocitov, ostali vir (20%) pa so mioglobin, citokrom, katalaze, peroksidaze (2, 3). Hem, sproščen iz eritrocitov, se veže na glikoprotein hemopeksin in se prenese v retikuloendotelijski sistem (RES), predvsem vranice, jetrnih hepatocitov, makrofagov kostnega mozga in ledvic (2, 4). S cepitvijo metilenskega mosta med prvim in drugim pirolovim obročem se odpre porfirinski prstan, sprosti se železo, odstrani se ogljik v obliki CO (slika 2). 1

12 Slika 2: Prikaz nastanka bilirubina To reakcijo katalizira hem oksigenaza, ki se veže na specifično mesto (cepi obroč hema na α mestu), ob prisotnosti O 2 in NADPH 2 (3, 5, 6). Ker se cepitev lahko zgodi tudi na kateremkoli od štirih ogljikovih mostov, lahko nastanejo 4 različni strukturni izomeri biliverdina (BVD), IX α, IX β, IX γ in IX δ. Vsi se izločijo, le IX α tvori po redukciji lipofilni rubin (6). Tako se BVD postopoma reducira do bilirubina IX α, s pomočjo encima biliverdin reduktaze (3, 5, 6). Iz RES se molekula BIL, ki zaradi notranjih vodikovih vezi ni topna, reverzibilno, z veliko afiniteto veže na albumin in tako dospe po krvi do jeter. Imenujemo ga nekonjugirani BIL (Bu) (3, 5, 6). Na albumin vezan BIL ne prehaja preko možganske pregrade, razen, če je ta poškodovana. (1, 4, 6, 7). V plazmi pa se nahaja tudi zelo majhen delež prostega BIL (0,1% celokupnega BIL), ki lahko povzroči toksične posledice na možganih (kernikterus) (2, 6). Nativna oblika BIL ima konfiguracijo (4Z,15Z) in je označena tudi kot BIL IXα (slika 3). 2

13 Slika 3: Tridimenzionalna struktura bilirubina IX α Ta struktura vsebuje notranje vodikove vezi med polarnimi amino in karboksilnimi skupinami, kar ima za posledico kislost karboksilnih skupin. Tridimenzionalna struktura (4Z,15Z) BIL, je vzrok za nizko vodotopnost in večjo težnjo do hidrofobnih medijev pri fiziološkem ph. Ker so polarne skupine zaradi zvite strukture zaščitene, to tudi pojasnjuje lastnosti BIL, ki ni tipičen organski anion in zahteva za izločanje konjugacijo do bolj polarnih glukuronidov (8). BIL obdrži zvito strukturo tudi, ko se veže na albumin. Na albuminu je več vezalnih mest za vezavo BIL. Pomembni pa sta predvsem dve. Pri normalni koncentraciji albumina se lahko veže do 600 µmol/l BIL. Vezavo BIL lahko zmanjša acidoza. Prav tako se na albumin lahko kompetitivno vežejo nekatere druge snovi in tako zmanjšajo vezavo BIL ali pa se vežejo snovi nekompetitivno, s tem spremenijo konformacijsko strukturo BIL, rezultat pa je zmanjšana ali povečana sposobnost vezave BIL (6). Pred vstopom v jetrne celice se BIL sprosti iz albumina, membrano hepatocita prehaja s pomočjo anionskih membranskih prenašalcev. V hepatocitu se BIL reverzibilno veže na beljakovino ligandin (slika 4), ta ga pripelje do endoplazemskega retikuluma. Tako se prepreči izločanje BIL nazaj v krvni obtok in nespecifična difuzija BIL v predele hepatocita, v katerih bi lahko povzročil toksično delovanje (2, 6). V endoplazemskem retikulumu poteče konjugacija ene ali obeh karboksilnih skupin z 3

14 glukuronsko kislino do bilirubinmonoglukuronida (BMG) in bilirubin diglukuronida (BDG). To reakcijo katalizira encim uridindifosfat glukuroniltransferaze 1A1 (UGT1A1) (slika 4). Glukuronidacija povzroči razcep notranjih vodikovih vezi in s tem netopni BIL preide v topni BIL, ki ga imenujemo konjugirani BIL (Bc) (2, 5, 6). Bc je le rahlo vezan na albumin, ni toksičen za tkiva, pri zvišanih koncentracijah v krvi se lahko izloči z urinom, kar imenujemo bilirubinurija (2). Kljub temu, da Bc ni nevrotoksičen, se lahko kovalentno veže na albumin (δ BIL, ki ga je manj kot 2% celokupnega), tako tekmuje z Bu za vezalna mesta na albuminu. Zato je pri novorojenčkih z visoko koncentracijo Bc, ki je posledica hepatocelularnih bolezni ali drugih vzrokov, ta boljši pokazatelj tveganja za kernikterus, kot Bu (6). Po konjugaciji se BIL izloči z žolčem v prebavni trakt, kar je energetsko odvisen proces, saj poteka proti koncentracijskemu gradientu, s prenašalnimi proteini (2, 6). Slika 4: Prikaz vezave bilirubina na albumin, njegova disociacija pred vstopom v hepatocit, konjugacija z glukuronsko kislino, nastanek bilirubin diglukuronida in bilirubin monoglukuronida in izločanje v žolč. Pri odraslih se 95% vsega BIL izloči preko žolča v obliki BMG in BDG, ostalo pa so glukozidi in ksilozidi (6). Z žolčem BIL prispe v tanko črevo, kjer se pod vplivom bakterijske glukurunidaze osvobodi glukuronske kisline in tako nastane urobilinogen (slika 5). Večji del (80%) se ga oksidira v tri oranžnorjave pigmente sterkobilin, mezoglobin in urobilin, ki dajo blatu barvo in s katerim se tudi izločijo. 4

15 Do 20 % dnevno nastalega urobilinogena pa se resorbira ter vstopi v entrohepatični krvni obtok in nato v jetra ter se ponovno izloči z žolčem, nekaj malega pa se preko ledvic v obliki urobilinogena izloči z urinom (2, 5, 6). Slika 5: Prikaz presnove bilirubina do izločanja Zelo visoke koncentracije BIL v krvni plazmi lahko presežejo vezalno sposobnost albumina, zato se BIL v prosti obliki kopiči v krvnem obtoku (2, 6). Ta prosti Bu pa je nevrotoksičen saj prehaja hematoencefalno pregrado in se nalaga v bazalnih ganglijih, hipokampusu, malih možganih in drugih delih možganov. S tem BIL ihibira sintezo RNA in proteinov, metabolizem ogljikovih hidratov v možganih, moti ATP azno aktivnost mitohondrijev in inhibira encime, ki sodelujejo pri transportu elektrolitov. Tako nastanejo selektivne poškodbe živčnega sistema, kar se kaže v kernikterusu ali razvoju bilirubinske encefalopatije. Potek je lahko akuten ali kroničen (6) Molekulske oblike bilirubina Molekula BIL je sestavljena iz 4 pirolovih obročev. Zaradi prisotnih dveh dvojnih vezi se nahaja BIL lahko v štirih geometrijskih izomerih. To so 4Z,15Z bilirubin, 4Z,15E bilirubin, 4E,15Z bilirubin in 4E,15E bilirubin. V telesu je največ 4Z,15Z bilirubina (BIL IX α ). Na 5

16 svetlobi pa se spremeni v vodotopno obliko 4Z,15E bilirubin, ali Z lumirubin (slika 6) (6). Slika 6: Molekulske oblike bilirubina izomeri Vpliv svetlobe na spremembo molekulske oblike BIL se izkorišča pri zdravljenju novorojenčkov s fototerapijo, za zniževanje koncentracije BIL. Iz nekonjugiranega BIL 6

17 (4Z,15Z) se v večji količini tvorijo fotoizomeri (4E,15Z; 4Z,15E in 4E,15E), ki se izločijo iz telesa brez konjugacije (8, 9). V organizmu so pri fizioloških pogojih vse oblike BIL v dinamičnem ravnotežju, ob zvišanju koncentracije ene od oblik se vzpostavi novo ravnotežje. Te oblike BIL so: α-bilirubin: nekonjugirani BIL, ki je nekovalentno vezan na albumin, β-bilirubin in γ-bilirubin: konjugirani obliki BIL (BMG in BDG), δ-bilirubin: konjugirani BIL, ki je kovalentno vezan na albumin, prosti bilirubin: patološko stanje, če ga je več kot 0,1 % od celokupnega BIL, fotoizomeri: 4Z,15Z bilirubin, 4Z,15E bilirubin, 4E,15Z bilirubin, 4E,15E bilirubin in Z lumirubin (8, 9). 1.2 HIPERBILIRUBINEMIJA Hiperbilirubinemija je vedno stanje zvišane koncentracije BIL v krvi. To pomeni, kadar koncentracija BIL v krvi pri odraslih preseže 17 µmol/l, pri novorojenčkih pa 220 µmol/l govorimo o hiperbilirubinemiji. Zvišane vrednosti so lahko posledica motenj na katerikoli stopnji presnove BIL, kot je povečano nastajanje ali pomanjkljivo odstranjevanje BIL. Vzroki so lahko vrojeni, ali pa so posledica bolezenskih stanj (2, 5, 6). V takih primerih se BIL odlaga pod kožo, kar imenujemo zlatenica in v očesno sklero, to pa imenujemo ikterus (7). Klinično se odraža pri odraslih pri koncentraciji BIL višji od 43 µmol/l, pri novorojenčkih pa je ta mejna koncentracija BIL 120 µmol/l (4), nekateri avtorji navajajo, da je ta meja že pri 68 µmol/l (10) Razvrstitev hiperbilirubinemij Diferencialna diagnostika hiperbilirubinemije je zelo pomembna, saj se s tem pripomore k potrjevanju, spremljanju in zdravljenju bolezni. Glede na mesto okvare, ki privede do hiperbilirubinemije, jih razdelimo na prehepatične, hepatične in posthepatične, glede na molekulsko obliko BIL ki se kopiči, pa na konjugirano in nekonjugirano hiperbilirubinemijo. 1. Prehepatične hiperbilirubinemije nastanejo zaradi povečanega nastanka BIL, zaradi hemolize. Vzroki, ki do tega privedejo so: povečan razpad eritrocitov v krvnem obtoku hemoliza zaradi hemolitičnih reakcij antigen protitelo, hemolitičnih anemij, izpostavljenosti kemikalijam.., 7

18 povečana razgradnja nezrelih in deformiranih eritrocitov neučinkovita eritropoeza, povečan razpad ostalih hem proteinov, hematom. Ker je pri prehepatičnih hiperbilirubinemijah presežena konjugacijska sposobnost jeter, se pojavijo zvišane vrednosti Bu. Zaradi hemolize je zvečana stopnja vstopa koncentracije BIL v jetra, zato opazimo tudi zvišane koncentracije Bc. To pa povzroči povečan nastanek urobilinogenov. Ker je Bu vezan na albumin, v urin ne prehaja in ni vodotopen. Bc pa se lahko filtrira skozi ledvične glomerule, posledica tega sta temen urin in temno blato (4, 10, 11, 12). 2. Hepatične hiperbilirubinemije nastanejo zaradi okvare v hepatocitu in so lahko nekonjugiranega tipa: okvara membrane hepatocita, neučinkovitost anionskih membranskih prenašalcev ali motnje v delovanju encima UGT1A1 Gilbertov sindrom (GS) in Crigler Najjarov sindrom (CN). Zaradi okvarjene funkcije jeter se v črevesje izločijo manjše količine BIL kot je normalno, posledica tega je manjši nastanek urobilinogenov in s tem tudi manjša količina urobilinogena v blatu in urinu. To se izraža s svetlim blatom in urinom. in konjugiranega tipa: BIL se konjugira, moteno pa je izločanje Bc iz hepatocita, zaradi: intrahepatične obstrukcije, bolezni jeter, ki okvarijo transportni sistem (hepatitis) in vrojene presnovne motnje ( Dublin-Johnsonov in Rotorjev sindrom). V primeru konjugirane hiperbilirubinemije pa se pojavi povečana koncentracija Bc v urinu. Barva urina je temna, blato pa je svetlo (4, 10, 11, 12, 13). 3. Posthepatične hiperbilirubinemije, katerih vzrok je obstrukcija pretoka žolča v črevesje (žolčni kamni, tumor..) Ker je moteno izločanje Bc, se pojavijo zvišane koncentracije le tega v krvi, to vodi v hiprbilirubinemijo konjugiranega tipa. V urinu so prisotne velike količine Bc, zato je temne barve in se peni. Urobilinogenov pa je zaradi obstrukcije zelo malo, zato so urobilinogeni v urinu prisotni v majhnih količinah. Tudi blato vsebuje majhne količine urobilinogenov in zato je barva blata svetla (10, 12, 14). 8

19 1.3 HIPERBILIRUBINEMIJA NOVOROJENČKOV Hiperbilirubinemijo novorojenčkov klinično imenujemo neonatalna zlatenica. Otrokovi encimi, ki so potrebni za presnovo, so pred rojstvom prisotni še v majhnih količinah, zato je otrok odvisen od delovanja materinih jeter. V prvih dneh življenja novorojenčkov je delovanje antioksidantnega sistema še pomanjkljivo, zato prevzame to vlogo v zaščiti proti prostim radikalom BIL (12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Koncentracije BIL pa so v prvih dneh življenja novorojenčkov povečane. Fiziološka zlatenica (koncentracija BIL do 220 μmol/l) kot pojav zvišane koncentracije BIL je prisotna pri večini novorojenčkov (60 70 % ), zelo pogosto se pojavi pri donošenih novorojenčkih, še pogosteje pa pri nedonošenčkih (2, 22), nekateri avtorji ocenjujejo, da je ta odstotek celo 80% (22). Vzroki za fiziološko hiperbilirubinemijo: povečana ponudba BIL v hepatocitih (krajša življenjska doba eritrocitov, zvišani neeritrocitni hemproteini, enterohepatični obtok..), zmanjšan transport BIL iz plazme v hepatocite (pomanjkanje vezavnih proteinov v hepatocitih), zmanjšana konjugacija BIL v hepatocitih (pomanjkanje ali/in inhibicija UDP-GT z materinimi steroidi), zmanjšano izločanje Bc, vpliv jetrnega obtoka in vpliv spola (fantki imajo višje vrednosti BIL) (21, 22, 23). Fiziološka hiperbilirubinemija novorojenčkov, ki je posledica pogosto močno zvišanih vrednosti Bu v krvi, ni prisotna takoj ob rojstvu, temveč se razvije v prvih dneh življenja in ne traja več kot dva tedna. Vrednosti BIL v krvi pri fiziološki hiperbilirubinemiji ne presežejo 220 μmol/l, 90% BIL je nekonjugiranega (6, 7, 8, 9, 12, 15, 20). Pri novorojenčkih se koncentracije BIL dnevno spreminjajo in šele pri enem mesecu starosti dosežejo vrednosti odraslih (5) zaradi dveh glavnih vzrokov: povečanega obsega hemolize ob rojstvu (večje število in krajša življenjska doba neonatalnih eritrocitov, nepopolna hematopoeza, povečano nastajanje BIL iz ostalih hem proteinov, številne modrice, ki nastanejo ob porodu ali samega poroda, ki je v bistvu stres za novorojenčka) in novorojenčkovih še nezrelih jeter (pomanjkanje ligandina, premajhna aktivnost encimskega sistema za konjugacijo BIL) (12, 15, 17). 9

20 O patološki hiperbilirubinemiji oziroma patološki zlatenici govorimo takrat, kadar traja neonatalna nekonjugirana hiperbilirubinemija dlje kot dva tedna (prolongirana), ali pa vrednosti BIL presežejo 220 µmol/l. Neonatalna konjugirana hiperbilirubinemija je vedno patološka, o njej govorimo, kadar vrednosti Bc presežejo 20% celokupne vrednosti bilirubina (24). Za razvoj patološke nekonjugirane hiperbilirubinemije pri novorojenčkih vzroki najpogosteje niso znani. Predpostavljajo, da je patogeneza neonatalne hiperbilirubinemije zelo kompleksna, saj je kombinacija več dejavnikov kot so: prezgodnje rojstvo, nizka porodna teža. Dodatno jetra obremeni tudi povečana reabsorbcija Bu iz črevesja novorojenčka. Zvečana količina Bu se pojavi zaradi pomanjkanja intestinalnih bakterij, ki pomagajo pri pretvorbi BIL v urobilinogene (7, 13, 14). Prav tako ni zanemarljiv etnični vpliv, saj je pojavnost neonatalne hiperbilirubinemije pri azijskih novorojenčkih dvakrat večja kot pri kavkaških in štirikrat večja kot pri afriških novorojenčkih. Afriški novorojenčki imajo nižje in azijski višje serumske koncentracije BIL kot kavkaški novorojenčki. Domnevajo, da k razvoju neonatalne hiperbilirubinemije prispevajo številne mutacije v mnogih različnih genih, ki se razlikujejo od populacije do populacije (6) Genetski vzroki za razvoj hiperbilirubinemije novorojenčkov Odkrivanje genskih vzrokov je v zadnjem času v veliko pomoč pri diagnostiki neonatalnih hiperbilirubinemij. Genetska stanja pri katerih nastanejo povečane količine BIL so: Neskladnost krvnih skupin matere in novorojenčka: Rh in AB0 neskladnost privedeta do hemolize (6). Pomanjkanje encima glukoza-6-fosfat dehidrogenaze, ki ima pomembno vlogo pri stabilizaciji membrane eritrocita. Je del zaščitnega antioksidantnega mehanizma eritrocita, ki pretvori vodikov peroksid v vodo. Pomanjkanje glukoza-6-fosfat dehidrogenaze, izpostavi celico oksidativnemu stresu in lahko privede do hemolize. V genu za glukoza-6-fosfat dehidrogenazo, ki leži na kromosomu X, so odkrili mnogo mutacij, ki se razlikujejo med posameznimi etničnimi skupinami (6). Pomanjkanje encima piruvat-kinaze vodi v pomanjkanje adenozin-trifosfata za presnovo eritrocita in se lahko pokaže kot anemija, retikulocitoza in huda oblika hiperbilirubinemije. Pomanjkanje tega encima je dokaj redko stanje, povezujejo pa ga s štirimi mutacijami (6). 10

21 Hereditarna sferocitoza: napake v proteinih v membrani eritrocita zaradi posledično slabše osmotske stabilnosti eritrocita privedejo do poškodbe pri prehodu čez vranico in nastanka anemije ter hiperbilirubinemije. Hereditarno sferocitozo povzročajo mutacije na vsaj petih genih (6). Hem-oksigenaza: izražanje gena za izoencim hem-oksigenazo 1, ki omogoča pretvorbo hema v BVD, je pogojeno s številom GT ponovitev v regiji gena, na katero se vežejo transkripcijski faktorji (6). Privzem bilirubina v hepatocite: predvidevajo obstoj prenašalnih proteinov, ki bi lahko bili omejitveni dejavnik privzema BIL v hepatocit (6). Pomanjkanje ligandina v hepatocitih novorojenčkov bi lahko bil dejavnik povečanega izplavljanja BIL nazaj v krvni obtok. Čeprav so odkrili nekaj polimorfizmov, ki vplivajo na izražanje gena za ligandin, še ni znanih dokazov o povezavi med pomanjkanjem ligandina in patogenezo neonatalne hiperbilirubinemije (6). Crigler Najjar tip I se deduje avtosomno recesivno, vedno je smrtna. Aktivnost encim glukuronilna transferaza je popolnoma odsotna, smrt je posledica kernikterusa. Vrednosti Bu so > od 440 µmol/l (2, 6). Crigler Najjar tip II je zmerna nekonjugirana hiperbilirubinemija. Deduje se avtosomno dominantno. Encim glukuronilne transferaze je aktiven do 10% (2). Gilbertov sindrom se deduje avtosomno recesivno. Pojavi se zmerna ali nihajoča nekonjugirana hiperbilirubinemija. Vzrok je vrojena motnja pri kateri je encim UGT1A1 aktiven od 20 do 50%. Za novorojenčke je nevarna, zato jo je potrebno zdraviti (2, 4, 10, 13, 21, 23, 25). Dubin Johnson sindrom je hiperbilirubinemija, ki se deduje avtosomno recesivno, vzrok je v okvari kanalikularnega prenašalca, znižan je vstop BIL v hepatocit in oslabljeno izločanje z žolčem. Zvišane so vrednosti Bc (2). Rotorjev sindrom prištevamo k t.i. benigni konjugirani hiperbilirubinemiji. Deduje se avtosomno recesivno. Zmanjšan je vstop BIL v hepatocit. Zvišane so vrednosti Bc (2). 11

22 1.4 DIAGNOSTIKA IN ZDRAVLJENJE HIPERBILIRUBINEMIJ Diagnostika hiperbilirubinemij Stopenjsko diagnostiko hiperbilirubinemij sestavljajo koraki, s katerimi se ugotovi: ali je prisotna in kako visoka je koncentracija BIL ali je prisotna konjugirana ali / in nekonjugirana ali je prisotna nekonjugirana bilirubinemija in ima ta tudi povečano koncentracijo Bu ali je vzrok znan ali neznan če je vzrok znan, kakšni so izsledki predhodnih preiskav če je vzrok neznan, s katerimi preiskavami bomo skušali ugotoviti vzrok Za ugotavljanje prisotnosti hiperbilirubinemije uporabljamo presejalne in potrditvene teste. Presejalni testi nam dajo kvalitativen odgovor na prisotnost hiperbilirubinemije. Biti morajo diagnostično visoko občutljivi, zaželena je 100% občutljivost (26). Že kliničen pregled zdravnika lahko potrdi hiperbilirubinemijo (vizualna ocena). K presejalnim testom sodita še uporaba transkutanega ikterometra in bilirubinometra. Ugotavljanje hiperbilirubinemij s presejalnimi testi: Transkutani bilinometer ali ikterometer je neinvazivna uporaba instrumenta, ki vsebuje celoten spekter vidne svetlobe (od 360 do 780 nm), ki oddaja svetlobo na kožo in meri njen odboj pri 460 nm (absorbcijski maksimum nekonjugiranega BIL) in pri 550 nm zaradi korekcije vpliva hemoglobina. Inštrument daje nelinearne rezultate in tudi veliko je dejavnikov, ki vplivajo na rezultat (barva kože, hematomi, nagubanost kože). Bilinometer oziroma bilimeter je presejalna metoda kjer določamo celokupni serumski BIL z direktno spektrofotometrijo brez redčenja. Vzorec je kapilarna ali venozna kri, katero centrifugiramo, ločimo celice od plazme in merimo absorbanco pri valovni dolžini 575 nm, kjer absorbira hemoglobin in 455 nm, kjer ima BIL absorbcijski maksimum. Kljub temu, da se vzorec pridobi na invaziven način je metoda primerna za hiter vpogled v koncentracijo serumskega BIL in je tudi dovolj diagnostično občutljiva (8, 26). Ugotavljanje hiperbilirubinemij s potrditvenimi testi: Potrditveni testi morajo biti čim bolj specifični. Določanje BIL je precej zapleteno zaradi same narave BIL, saj obstaja v različnih oblikah, je netopen v vodi in občutljiv na svetlobo. 12

23 Vzorci morajo biti vzeti na tešče, brez hemolize (interferenca hemoglobina), hranjeni na temnem in pri 4 C so obstojni 3 dni (8, 26). Reakcija diazotiranja po Jendrassik-Grofu je najpogosteje uporabljena metoda v kliničnih laboratorijih za določanje BIL v serumu. Obstajajo številne modifikacije te metode, danes pa se uporablja diazo reakcija brez predhodne deproteinizacije. Za sproščanje Bu od proteinov se uporabljajo tako imenovani akceleratorji (Na benzoat, Na acetat, kofein, metanol, difilin). BIL reagira z diazo reagentom (Na nitrit, sulfanilna kislina) v alkalnem mediju, dodatki (npr. askorbinska kislina) pa prekinejo s prebitkom diazonijeve soli. To je direktna diazo reakcija oziroma direktni (konjugirani) BIL. Z direktno diazo reakcijo določamo topne oblike BIL, to so: o prosti bilirubin o Bc (mono in di-) o fotoizomere bilirubina Z dodanimi akceleratorji se sprosti Bu iz albumina, tako je tudi njemu omogočena reakcija diazotiniranja. To pa imenujemo indirektna diazo reakcija oziroma indirektni, (nekonjugirani) BIL. (8, 26). Celokupni BIL zajema vse oblike bilirubina: o nativni 4Z, 15Z bilirubin, BIL IX α, vezan na albumin (αbil) o prosti 4Z, 15Z bilirubin o bilirubin monoglukoronid in diglukoronid (β in γbil) o δ bilirubin (δbil) o fotoizomere bilirubina (8, 26). Encimska metoda: v prisotnosti encima bilirubin oksidaze se BIL oksidira v biliverdin. Merimo padec absorbance pri 425 ali 465 nm, ki je sorazmeren koncentraciji celokupnega BIL. Nastali BVD se oksidira v škrlatne produkte. Uporabnost te metode je omejena saj so opazne intrference hemoglobina. Reakcija na večslojni reagenčni ploščici, ki vsebuje reagente v trdni obliki in je sestavljena iz treh slojev: s to metodo na prvem sloju ločimo Bu od albuminov, drugi sloj zadrži proteine, na tretjemi pa določimo hkrati Bc in Bu. Po 5 min inkubacije se izmeri gostota odbite svetlobe pri določeni valovni dolžini, ta pa se matematično pretvori v koncentracijo BIL. (8). 13

24 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je specifična metoda, ki omogoča vpogled v molekulske oblike BIL. Je referenčna metoda, uporablja se tudi za sledenje fotoizomerizacijo BIL med fototerapijo. Z njo ločimo α-bu, β-in γ- mono in di glukuronid, δ BIL vezan na albumin in fotoizomer bilirubina (8, 26). Kapilarna elektroforeza(ce) je sodobna, specifična metoda, ki nam prav tako kot HPLC omogoča določitev molekulskih oblik BIL. Ločevanje frakcij poteka v kapilari, pod napetostjo. Uporabljamo jo predvsem za sledenje vezanega in prostega BIL in nastanka fotoizomerov med fototerapijo (26) Zdravljenje hiperbilirubinemij Hiperbilirubinemija je kliničen problem v zgodnjem obdobju življenja zaradi toksičnosti Bu za možgane, saj vrednosti BIL pri novorojenčkih včasih močno narastejo, jetra pa še niso sposobna presežene količine BIL odstraniti iz plazme. Zaradi lipofilnosti prostega BIL ta lahko prehaja krvno-možgansko pregrado in povzroči bilirubinsko encefalopatijo ter kernikterus. Za preprečitev kernikterusa je potrebno znižati serumsko koncentracijo BIL (4, 8). V ta namen se uporabljajo naslednji postopki: fototerapija: je neinvazivna in trenutno najbolj uporabljana metoda zdravljenja hiperbilirubinemije. To je postopek pri katerem se z vidno svetlobo valovne dolžine 460 nm BIL pretvori v bolj topne produkte, ki se lahko brez konjugacije izločijo iz telesa. Nastaneta geometrijski izomer 4Z,15E-bilirubin in strukturni izomer Z- lumirubin, (oba bolj polarna in manj toksična od BIL). izmenjalna transfuzija krvi se uporablja, kadar fototerapija ne zadostuje, ali pa je zaradi visokih vrednosti BIL prevelika nevarnost za pojav kernikterusa, infuzija fiziološke raztopine, glukoze in albumina, transplantacija jeter, genska terapija dednih hiperbilirubinemij postopoma nadomešča transplantacije jeter in nekatere druge terapevtske poskuse (gensko zdravljenje sindroma Crigler Najjar tip 1, kjer je encim glukorolna transferaza popolnoma odsoten) (7, 26, 27). Uporablja se več pristopov med njimi sta: o vstavljanje terapevtskega gena (UGT1A1) v izolirane hepatocite prejemnika izven telesa in nato transplantirajo gensko spremenjene hepatocite nazaj v prejemnika. 14

25 o prenos UGT1A1 gena v jetra podgan Gunn brez vektorjev ali z virusnimi vektorji 15

26 2 NAMEN DELA IN DELOVNE DOMNEVE 2.1 NAMEN DELA Za ločevanje med fiziološko in patološko hiperbilirubinemijo pri novorojenčkih se uporablja serumska koncentracija bilirubina 220 µmol/l. Kadar je ta koncentracija presežena, jo je potrebno znižati, kar se doseže s fototerapijo, infuzijo fiziološke raztopine ali zamenjavo krvi z izmenjevalno transfuzijo. Namen naše raziskave je določiti koncentracijo bilirubina v popkovnični krvi (BIL PK) novorojenčkov kot napovedni dejavnik za razvoj patološke hiperbilirubinemije. Namen dela je tudi ugotoviti povezavo med dvema metodama za določanje koncentracije BIL; presejalno (s transkutanim bilirubinometrom) in potrditveno (Jendrassik-Grof). Prav tako bi dobra povezava med obema metodama za določanje koncentracije BIL - serumska določitev BIL 3. dan starosti in transkutana določitev BIL 3. dan po porodu, lahko potrdila uporabnost neinvazivnega spremljanja razvoja patološke neonatalne hiperbilirubinemije skupaj z določitvijo BIL v neinvazivno odvzeti popkovnični krvi in tako prispevala k humanizaciji diagnostike pri novorojenčkih, saj so odvzemi krvi pri novorojenčkih težavnejši kot pri odraslih in omejeni glede volumna. 2.2 DELOVNE DOMNEVE V raziskavi bomo poskušali potrditi ali ovreči naslednje domneve Koncentracija bilirubina v popkovnični krvi je dober napovedni dejavnik za razvoj patološke hiperbilirubinemije. Obstaja korelacija med koncentracijo bilirubina v invazivno odvzeti krvi in neinvazivno transkutano meritvijo bilirubina, oboje določeno 3. dan starosti. Za preverjanje teh domnev bomo Ugotovili mejno vrednost neonatalnega bilirubina (Jendrassik Grof metoda) v plazmi popkovnične krvi, za zgodnjo napoved razvoja patološke hiperbilirubinemije. Ugotavljali primerljivost koncentracije BIL, v vzorcu, odvzetem 3.dan po porodu (Jendrassik Grof metoda) in transkutano izmerjeno koncentracijo BIL, prav tako 3. dan, (metodo merjenja kožne reflektance). Dobljene rezultate vseh preiskovanih skupin novorojenčkov bomo statistično obdelali in primerjali z rezultati v do sedaj objavljenih raziskavah. 16

27 3 MATERIALI, METODE IN OPREMA 3.1 PREISKOVANCI IN NJIHOVI VZORCI Raziskavo je odobrila Komisija za medicinsko etiko Republike Slovenije, številka dopisa 31/02/11. Starši novorojenčkov so bili z raziskavo seznanjeni in so tudi zavestno pristopili k sodelovanju svojih otrok v raziskavi. V raziskavo je bilo vključenih 293 zaporedno rojenih novorojenčkov, od teh 154 (53%) dečkov in 139 (47%) deklic. Izključili smo vse novorojenčke, katerim je bil ob kliničnem pregledu potrjena infekcija ali sum na infekcijo. Vsem novorojenčkom je bil odvzet vzorec popkovnične krvi (2 ml) takoj po porodu in kontrolni vzorec kapilarne krvi 3. dan (2 krat 0,5 ml), ki pa je bil odvzet hkrati z drugimi, rutinskimi preiskavami (presejalni testi na fenilketonurijo in hipotireozo). Vzorci krvi so bili odvzeti v vakuteinerske in mikroteinerske epruvete z dodatkom antikoagulanta K 2 EDTA. Vzorci so bili zaščiteni pred svetlobo in hranjeni v hladilniku na 4 C do določitve koncentracije BIL. Ob odpustu novorojenčka iz bolnišnice (3. dan) smo določili poleg koncentracije BIL tudi Tc BIL. Glede na klinične značilnosti in na osnovi koncentracije BIL 3. dan življenja novorojenčka, po potrditveni metodi (Jendrassik Grof) prisotne zlatenice, smo novorojenčke razdelili v 3 skupine in sicer: 1. novorojenčki s fiziološko hiperbilirubinemijo 2. novorojenčki s patološko hiperbilirubinemijo 3. novorojenčki s prolongirano hiperbilirubinemijo 3.2 METODE DELA Pri vseh novorojenčkih smo določili Koncentracijo neonatalnega bilirubina v plazmi popkovnične krvi in v kapilarni krvi 3. dan z Jendrassik Grofovo metodo in reflektometrično določitvijo obarvanega produkta. Mejno vrednost koncentracije neonatalnega bilirubina v popkovnični krvi in izračunali diagnostično občutljivost parametra. Transkutano merjenje bilirubina 3. dan smo izvedli z uporabo merilnika, ki oddaja svetlobo na kožo in meri njen odboj pri 460 nm (absorbcijski maksimum BIL) in pri 550 nm zaradi korekcije vpliva hemoglobina (bilirubinmeter Bilicheck). Statistična obdelava rezultatov je potekala s pomočjo programov IBM SPSS Statistics

28 3.2.1 Izračun diagnostične občutljivosti rezultata neonatalnega bilirubina v popkovnični krvi Diagnostična občutljivost parametra je verjetnost pozitivnega (patološkega) rezultata pri osebah, pri katerih je bolezen dejansko prisotna (Enačba 1). Za presejalno metodo naj bi bila (čim bliže) 100%, kar pomeni, da lažno negativnih rezultatov ne bi bilo in zajamemo vse bolne. Enačba 1: Izračun diagnostične občutljivosti: Diagnostična občutljivost (%) = število resnično pozitivnih število resnično pozitivnih + lažno negativnih X Statistična analiza Rezultate raziskave smo statistično obdelali in ovrednotili s pomočjo statističnega programa IBM SPSS Statistics 20. Izračunali smo srednje vrednosti in standardni odklon koncentracij bilirubina v popkovnični krvi, bilirubina v kontrolnih vzorcih 3. dan (kolorimetrična Jendrassik Grof metoda) in Tc BIL (metoda merjenja kožne reflektance). Ugotavljali smo normalnost porazdelitve spremenljivk s Kolmogorov Smirrnovim testom. Rezultate smo statistično ovrednotili z Mann Whitneyevim testom in Anovo, za statistično značilno smo upoštevali vrednost p < 0,05. Izračunali smo tudi diagnostično občutljivost, ki je pokazatelj za skupino tistih bolnikov s specifično boleznijo, ki jih preiskava pravilno predvidi (28). 3.3 LABORATORIJSKE METODE Vse preiskave so bile narejene v Diagnostičnem laboratoriju Splošne bolnišnice v Novem mestu. Medicinsko biokemični laboratorij dela skladno s prepisi, ki so določeni s Pravilnikom o pogojih, ki jih morajo izpolnjevati laboratoriji za izvajanje preiskav na področju laboratorijske medicine, po katerem si je pridobil dovoljenje za delo številka: MZ / Določanje koncentracij plazemskega bilirubina Koncentracijo neonatalnega bilirubina v popkovnični krvi (BIL PK) smo določali s kolorimetrično metodo (Jendrassik Grof), na anlizatorju Vitros Ektachem (Kodak). Analizator uporablja specifično metodo za določanje neonatalnega bilirubina in sicer tehnologijo večplastne reagenčne ploščice, ki je sestavljena iz treh slojev: 18

29 1. prvi sloj vsebuje kafein in Na benzoat za ločevanje nekonjugiranega bilirubina (Bu) od albumina 2. drugi sloj zadrži proteine 3. na tretjem sloju poteka reakcija Bu in Bc z reagenti. Nastane specifično obarvan produkt. Koncentracija Bu in Bc je sorazmerna odbiti svetlobi, ki smo jo merili pri 400nm (absorbcijski maksimum za Bu) in 460 nm (absorbcijski maksimum za Bc). Neonatalni bilirubin je vsota nekonjugiranega in konjugiranega bilirubina in je značilen za novorojenčke do starosti 14 dni (16, 24, 29) Določanje koncentracij transkutanega bilirubina Kot indirektna presejalna metoda določanja bilirubina je bila uporabljena metoda merjenja kožne reflektance. Uporabili smo transkutani bilirubinmeter Bilicheck. Ta izkorišča povezavo med rumeno obarvanostjo kože in koncentracijo serumskega BIL, na osnovi odbite in razpršene svetlobe pri 460 nm, kjer je absorbcijski vrh BIL ter 550 nm zaradi korelacijskega vpliva hemoglobina. Pravilnost meritev je zmanjšana zaradi morebitnih kožnih krvavitev, hematomov, neenakomerni porazdelitvi BIL v koži in etnične razlike v osnovni barvi kože. Meritve so bile opravljene vsem novorojenčkom na čelu in prsnici. 3.4 OPREMA IN REAGENTI 1 Odvzem krvi: vakuteinerske in mikroteinerske epruvete z dodatkom antikoagulanta K 2 EDTA. 2 Meritev koncentracije neonatalnega bilirubina: biokemični anlizator Vitros Ektachem (Kodak). 3 Transkutano merjenje bilirubina: transkutani bilirubinmeter Bilicheck. 4 Statistična obdelava podatkov: osebni računalnik s programom Excel in statističnim programom IBM SPSS Statistics

30 4 REZULTATI 4.1 KLINIČNE ZNAČILNOSTI Novorojenčke, ki so bili vključeni v raziskavo smo glede na porodno starost razdelili v dve skupini (donošeni in nedonošeni) in statistično obdelali njihove klinične podatke (gestacija, teža ob porodu in teža 3. dan, spol, koncentracija BIL, BIL PK, koncentracija BIL 3. dan in koncentracija transkutano merjenega bilirubina (Tc BIL) 3.dan (Preglednica I). Preglednica I: Klinične ugotovitve preiskovane skupine Klinične ugotovitve Vsi novorojenčki Donošeni novorojenčki Nedonošeni novorojenčki Število (N,%) (96,9%) 9 (3,1%) Gestacija ±SD (tedni) 39 ± 1,3 40 ± 1,0 35 ±0,7 Dečki (N, %) 154 (53%) 150 (51,2%) 4 (1,4%) Deklice (N, %) 139 (47%) 134 (45,7%) 5 (1,7%) Teža ob porodu ± SD (g) 3487 ± ± ± 405 Teža 3.dan ± SD (g) 3300 ± ± ± 360 BIL popkovnična kri ± SD (μmol/l) 34 ± 7,8 34 ± 7,7 35 ± 7,7 BIL kontrolni vzorec 3. dan ± SD (μmol/l) 167 ± 60,2 167 ± 60,2 170 ± 35,6 Tc BIL ± SD (μmol/l) 3. dan 175 ± 73,7 175 ± 74,4 186 ± 9,6 Med donošene smo uvrstili vse novorojenčke, ki so ob porodu dopolnili najmanj 37 tednov, novorojenčki s porodno starostjo od 33 do 36 tednov pa so sestavljali skupino nedonošenih. Donošenih je bilo 284 (96,9%) novorojenčkov, nedonošenih pa 9 (3,1%). S Kolmogorov Smirnovim testom smo ugotovili normalnost porazdelitve podatkov porodnih tež in teže 3. dan življenja. Po pričakovanju je bila porodna teža nedonošenih novorojenčkov (2513 ± 405 g) statistično značilno nižja od donošenih (3514 ± 429 g) (p < 0,001). Koncentracija BIL PK se med donošenimi in nedonošenimi novorojenčki skoraj ni razlikovala in sicer je bila pri donošenih 34 ± 7,7 μmol/l, pri nedonošenih pa 35 ± 7,7 μmol/l. Nekoliko večja razlika se je pokazala pri koncentraciji BIL izmerjenega v kontrolnem vzorcu 3. dan (donošeni 167 ± 60,2 μmol/l, nedonošeni 170 ± 35,6 μmol/l. Tudi koncentracije Tc BIL so bile (3.dan) pri nedonošenih nekoliko višje (186 ± 9,6 μmol/l), kot pri donošenih novorojenčkih (175 ± 74,4 μmol/l). 20

31 Zaradi objektivnejše primerjave naših rezultatov z rezultati drugih študij, smo iz nadaljnje statistične obravnave izključili nedonošene novorojenčke, tako je statistična obravnava potekala med 284 zdravimi zaporedno rojenimi donošenimi novorojenčki. Pri koncentracijah BIL PK, BIL 3. dan in Tc BIL (3. dan) smo ugotovili nenormalnost porazdelitve (Kolmogorov Smirnov test), zato smo za izračune uporabili neparametrične statistične metode. Normalno porazdeljene so bile samo koncentracije BIL PK pri deklicah. V preglednici II so prikazani izračuni statističnih značilnosti med spoloma za porodno težo, težo 3. dan, koncentracijo BIL PK, BIL v kontrolnem vzorcu 3. dan in Tc BIL (3.dan). Uporabili smo Mann Whitney test, ki se izvaja pri statističnem izračunu dveh neodvisnih vzorcev in ne normalno porazdeljenih podatkih. Preglednica II: Izračuni statističnih značilnosti za porodno težo, koncentracijo BIL PK, BIL v kontrolnem vzorcu 3. dan in Tc BIL 3. dan glede na spol Klinične ugotovitve N= 284 Dečki N = 150 Deklice N= 134 p Teža ob porodu ± SD (g) 3557 ± ±399 0,054 Teža 3. dan ± SD (g) 3368 ± ± 375 0,064 BIL popkovnična kri ± SD (μmol/l) 35 ± 7,9 34 ± 7,4 0,447 BIL kontrolni vzorec 3. dan ± SD (μmol/l) 181± 56,4 152± 60,1 < 0,001 Tc BIL 3. dan ± SD (μmol/l) 184± 54,4 165± 90,8 0,002 Ugotovili smo, da je bila porodna teža med spoloma mejno statistično značilna in sicer so bili dečki težji (3557 ± 449 g) od deklic (3465 ±399 g) (p=0,054). Prav tako ni bila dokazana statistično značilna razlika med spoloma v teži 3. dan (p=0,064) in tudi koncentracija BIL PK se med spoloma ni statistično značilno razlikovala (p=0,447) (Preglednica II). Statistično značilno pa so se med spoloma razlikovale koncentracije BIL 3. dan (p < 0,001) in tudi Tc BIL (3. dan) (p=0,002). Koncentracije BIL v vzorcih 3. dan so bile višje pri dečkih (181± 56,4 μmol/l) kot pri deklicah (152± 60,1 μmol/l). Prav tako smo statistično dokazali višje vrednosti Tc BIL 3. dan pri dečkih (181± 54,4 μmol/l), kot pri deklicah (165± 90,8 μmol/l) (p = 0,002). 21

32 4.2 RAZVOJ PATOLOŠKE HIPERBILIRUBINEMIJE IN POVEZAVA S KONCENTRACIJAMI BILIRUBINA Glede na klinične značilnosti prisotne hiperbilirubinemije smo zdrave donošene novorojenčke razdelili v skupino s fiziološko in patološko hiperbilirubinemijo (Preglednica III). Kot mejno koncentracijo med fiziološkim in patološkim območjem smo upoštevali koncentracijo BIL 220 μmol/l v kontrolnem vzorcu, ki je bil odvzet 3. dan življenja novorojenčka. Vsi že prej našteti parametri (telesna teža ob porodu, BIL PK, BIL 3. dan in Tc BIL 3. dan) so se statistično značilno razlikovali med skupinama s fiziološko in patološko hiperbilirubinemijo, le teža 3. dan življenja novorojenčkov se statistično ni razlikovala. Preglednica III: Statistične značilnosti telesnih tež, koncentracij BIL PK, BIL 3. dan in Tc BIL 3. dan, v primerjanih skupinah (patološke in fiziološke hiperbilirubinemije) Klinična značilnost skupine Fiziološka HBN* Patološka HBN** p (fiziološka / patološka HBN) Število (N) 234 (113 dečkov, 121 deklic) 82,4% 50 (37dečkov, 13 deklic) 17,6% Teža ob porodu ± SD g) 3479 ± ± 478 0,021 Teža 3. dan ± SD (g) 3300 ± ± 439 0,080 BIL popkovnična kri ± SD (μmol/l) 33 ± 7 38 ± 8 < 0,001 BIL kontrolni vzorec 3. dan ± SD (μmol/l) 152 ± ± 23 < 0,001 Tc BIL 3. dan ±SD (μmol/l) BIL 3.dan < 220 μmol/l * BIL 3. dan 220 μmol/l ** 163 ± ± 35 < 0,001 Od skupaj 284 novorojenčkov jih je 234 razvilo fiziološko hiperbilirubinemijo. Povprečna koncentracija BIL PK pri teh novorojenčkih je bila 33 ± 7 μmol/l, v vzorcu odvzetem 3. dan 152 ± 54 μmol/l in Tc BIL 3. dan 163 ± 75. V prvih treh dneh življenja je 50 novorojenčkov razvilo patološko hiperbilirubinemijo. Od teh je v bilo 2,8 krat več dečkov (37 (74%)), kot deklic (13 (26%)). Koncentracija BIL PK pri tej skupini je bila 38 ± 8 μmol/l, v vzorcu, odvzetem 3. dan, 239 ± 23 μmol/l in Tc BIL 3. dan 233 ± 35 μmol/l. Vse primerjane 22

33 koncentracije BIL med skupinama (fiziološka / patološka hiperbilirubinemija) so bile statistično značilno različne (p < 0,001) Vpliv fototerapije na koncentracije bilirubina Nekateri novorojenčki iz skupine s fiziološko hiperbilirubinemijo (N= 35, 15%), ki so v času hospitalizacije razvili klinične znake zlatenice, so prejeli fototerapijo pred odvzemom kontrolnega vzorca krvi 3. dan. Povprečna vrednost koncentracije BIL PK pri njih je bila 40 ± 9 μmol/l. Pričakovano so se koncentracije BIL v vzorcu 3. dan znižale zaradi izločitve topnih fotoizomerov, zato niso dosegle koncentracije 220 μmol/l in zato jih nismo razvrstili v skupino s patološko hiperbilirubinemijo. Tudi v skupini novorojenčkov, ki so razvili patološko hiperbilirubinemijo, je bilo 17 (34%) novorojenčkov obsevanih že pred 3. dnem. Povprečna vrednost koncentracije BIL PK pri njih je bila 42 ± 10 μmol/l. Z Mann Whitneyevim testom smo pri primerjavi koncentracij BIL v vzorcu, odvzetem 3. dan in Tc BIL 3. dan med obema skupinama (fiziološko in patološko hiperbilirubinemijo) dokazali statistično značilno razliko (p < 0,001). Koncentracija BIL PK se statistično ni razlikovala (p=0,332) med obsevanimi novorojenčki s fiziološko hiperbilirubinemijo (BIL PK 40 ± 9 μmol/l) in patološko hiperbilirubinemijo (BIL PK 42± 10 μmol/l). To pomeni, da bi novorojenčke, ki so bili uvrščeni v skupino s fiziološko hiperbilirubinemijo in so prejeli fototerapijo, dejansko morali uvrstiti v skupino s patološko hiperbilirubinemijo. Na podlagi tega izračuna smo naredili novo razporeditev in obsevane novorojenčke iz fiziološke skupine premestili v patološko skupino (Preglednica IV). 23