ZÁVISLOSŤ MEDZI DĹŽKOVOU VARIABILITOU JAČMEŇA

Transcription

1 Nova Biotechnologica (2004) 245 ZÁVISLOSŤ MEDZI DĹŽKOVOU VARIABILITOU GÉNU β-amy1 A AKTIVITOU β-amylázy JAČMEŇA PETER ONDRÍK a, DANIELA MIKULÍKOVÁ b, JÁN KRAIC a,b a Univerzita sv. Cyrila a Metoda, Fakulta prírodných vied, Katedra biotechnológií, Nám. J. Herdu 2, Trnava b Výskumný ústav rastlinnej výroby, Divízia aplikovanej genetiky a šľachtenia, Bratislavská cesta 122, Piešťany Súhrn: Zistili sme, že v analyzovanom súbore genotypov, ktorý tvorili hlavne naše staré a súčasné odrody jačmeňa, sa vyskytujú dva typy dĺžkových variantov intrónu III, charakteristické pre odrody Haruna Nijo a Adorra. Dĺžkový variant intrónu III identický s odrodou Haruna Nijo má 515 bp a dĺžkový variant typu odrody Adorra má 641 bp. Podľa ERKKILÄ (1999) sú tieto dva typy sú zodpovedné za vysoké, resp. nízke aktivity β-amylázy. Potvrdili sme štatisticky významnú závislosť (P>0,05) medzi dĺžkovou variabilitou intrónu III génu β-amy1 a aktivitou β-amylázy. Analýzami DNA markera, ktorý by mal byť zodpovedný za termostabilitu β-amyláz, sme zistili 3 dĺžkové varianty intrónu III génu β-amy1-748 bp, 874 bp, 1075 bp a 1201 bp. Dva dĺžkové varianty (874 bp, 1201 bp) sú charakteristické pre odrody Harrington a Schooner. Mali by byť zodpovedné za vyššiu, resp. nižšiu termostabilitu β-amylázy v jačmeni. Dĺžkový variant charakteristický pre odrodu Haruna Nijo sa v testovaných jačmeňoch nenachádzal, čiže detekovali sme iba variant zodpovedný za nižšiu termostabilitu β-amyláz. Metódami použitými v tejto práci možno selektovať genotypy jačmeňa, ktoré majú vysoké aktivity a pravdepodobne aj termostabilitu β-amyláz a mali by spĺňať požiadavky pre sladovanie. Kľúčové slová: jačmeň, β-amyláza, aktivita, termostabilita 1. Úvod Značná časť produkcie jačmeňa smeruje do výroby sladu a následne piva. Hodnotenie sladovníckej kvality jačmenného zrna spočíva na hodnotení viacerých parametrov - obsahu dusíkatých látok (po prepočte obsahu bielkovín), obsahu extraktu, relatívneho extraktu, Kolbachovho čísla, diastatickej mohutnosti, stupňa prekvasenia, friability a obsahu β-glukánov v sladine (HUBÍK a MAREČEK, 2002). Modifikácia sledovaného zrna je proces, pri ktorom sa vplyvom proteolytických a cytolytických enzýmov degradujú bunkové steny endospermu. Vplyvom amylolytických enzýmov sa zase škrob rozkladá na cukry - maltózu a dextrín. Enzým β-amyláza (α-1,4 glukánmaltohydroláza, EC ) patrí do skupiny exohydroláz, ktoré uvoľňujú β-maltózu z neredukujúceho konca α-1,4 glykozidických väzieb poly- a oligoglukánov. β-amyláza v jačmeni má významný podiel na diastatickej mohutnosti sladu, t.j. celkovej aktivite α-amyláz, β-amyláz, α- glukozidázy a limitnej dextrinázy (GUNKEL, a kol., 2002). Obilné β-amylázy našli uplatnenie aj v produkcii maltózy, maltózových sirupov a sladidiel (GIBSON a kol., 1995). Nachádzajú sa vo všetkých obilninách. Využiteľnosť obilnín ako zdrojov β-

2 246 Ondrík, P. et al. amylázových aktivít v sladovníctve a ostatných biotechnologických výrobách závisí predovšetkým od 3 faktorov - od množstva prítomného enzýmu v zrne, od aktivity, ktorú enzým vyvinie počas klíčenia a od termostability enzýmu (GRIME a BRIGGS, 1995). Celková aktivita a termostabilita β-amyláz, obsiahnutých v slade, je veľmi významná, pretože inaktivácia týchto enzýmov teplotným zásahom je závažným problémom pre produkciu sladiny v pivovarníctve (KIHARA a kol., 1999). ERKKILÄ (1999) zistil, že za β-amylázovú aktivitu by mali byť zodpovedné tri odlišné typy alel (génov) označované spoločným názvom β-amy1. Tieto by mali byť hlavnými indikátormi na predbežné určenie β-amylázovej aktivity. Boli identifikované pomocou PCR v odrodách Haruna Nijo, Adora a genotype Hordeum spontaneum PI Podľa ERKKILÄ a kol. (1999) by mala byť alela z odrody Adora zodpovedná za nízku aktivitu, alela z Haruna Nijo zodpovedná za vysokú aktivitu a alela z genotypu Hordeum spontaneum PI zodpovedná za veľmi vysokú β- amylázovú aktivitu. Tieto alely lokusu β amy1 obsahujú aj intrón III a práve v sekvencii nukleotidov v tomto mieste sa tieto tri typy alel vzájomne dĺžkovo odlišujú. Majú aj rozdielnu aminokyselinovú sekvenciu a dĺžková variabilita je spôsobená inzerciou, resp. deléciou palindrómovej sekvencie dlhej 126 bp. Celý gén je zložený zo 7 exónov prerušovaných 6 intrónmi (I VI). KANEKO a kol. (2000), tiež pomocou PCR metódy, sledovali rôzne odrody jačmeňa a navrhli 3 STS primery pre amplifikovanie častí β-amylázového, štrukturálneho génu. Pomocou nich našli 4 odlišné dĺžkové varianty v odrodách Haruna Nijo, Harrington a Schooner, pričom v odrode Schooner sa nachádzali dva dĺžkové varianty. Po stanovení termostability β-amylázy, odroda Haruna Nijo vykazovala najvyššiu (typ A), odroda Harrington stredne vysokú (typ B) a odroda Schooner najnižšiu termostabilitu (typ C) (KANEKO a kol., 2001). Po sekvenovaní β- amylázového, štrukturálneho génu, v každej odrode sa zistili rozdiely v nukleotidovej aj aminokyselinovej sekvencii. V exónovej oblasti bola vysoká homológia, medzi odrodami Haruna Nijo a Harrington bolo odlišných iba 11 nukleotidov a 5 aminokyselín, medzi odrodami Haruna Nijo a Schooner iba 6 nukleotidov a 3 aminokyseliny. V intrónovej oblasti boli dosť veľké odlišnosti a to práve v odrode Schooner, ktorá obsahovala 126 bp inzerciu v intróne III. Práve tieto rozdiely pokladajú KANEKO a kol. (2001) za hlavnú príčinu odlišnej termostability a následne aj aktivity β-amylázy. Takýmto spôsobom by PCR mala slúžiť na predikciu aktivity a termostability β-amylázy jačmeňa. Cieľmi tejto práce bolo analyzovať dĺžkovú variabilitu amplifikovanej časti intrónu III génu β-amy1 v súbore genotypov jačmeňa; analyzovať aktivitu β-amylázy vo vybratom súbore genotypov jačmeňa; vyhodnotiť vzťah medzi aktivitou β-amylázy a dĺžkovou variabilitou v intróne III génu β-amy1; analyzovať DNA marker viazaný na termostabilitu β-amylázy. 2. Materiál a metódy Analyzovaných bolo 170 genotypov jarného jačmeňa. Všetky analyzované genotypy jačmeňov boli vypestované v jedinej lokalite (Piešťany), v roku 2003.

3 Nova Biotechnologica (2004) 247 Na stanovenie aktivity β-amylázy bol použitý jačmenný šrot pripravený na mlyne Perten Laboratory Mill DNA bola izolovaná metódou podľa DELLAPORTA a kol. (1983) z mladých listov. Intrón III, jeho špecifická sekvencia z genómovej DNA bola amplifikovaná pomocou PCR. Amplifikácia prebiehala pomocou primerov: 5 - GATGGTCGTTCCCAGGCATC-3 a 5 -AGGGAACCGCACGTGTGGGGTCAAT- GA-3. Reakčná PCR zmes obsahovala 1,5 mmol.l -1 MgCl 2, 1 µmol.l -1 oboch primerov, 200 µmol.l -1 každého z dntp, 0,8 U Taq-DNA polymerázy, 25 ng templátovej DNA a vodu. Celkový objem reakčnej zmesi bol 20 µl. PCR reakcia prebiehala pri týchto krokoch: po úvodnej denaturácii 2 min, 95 C nasledovalo 30 cyklov: 1 min. pri 94 C, 30 sek. pri 55 C, 1 min. pri 72 C a záverečná syntéza 10 min. pri 72 C. Na druhý typ PCR boli pripravené 3 STS primery podľa KANEKO a kol. (2000). 5 primer BMN1 bol syntetizovaný na základe sekvencie z prednej časti exónu III. Jeho sekvencia bola: 5 -GTGTTATCGTCGACATTGAA-3. Ostatné dva 3 primery boli pripravené podľa sekvencie strednej a koncovej časti intrónu III : HAC1880: 3 - GGGGAAAGGTGGGCTATGC-5 a HRC2192: 3 -CTCGTACTTAACTGTTT- GAACTAATAGTAC-5. Reakčná zmes obsahovala 1,5 mmol.l -1 MgCl 2, 1 U Taq- DNA polymerázy, 1 µmol.l -1 primerov, 250 µmol.l -1 dntp, 100 ng templátovej DNA. PCR prebiehala 30 cyklov: 1 min. pri 94 C, 2 min. pri 55 C, 3 min. pri 72 C a záverečná syntéza 5 min. pri 72 C. PCR fragmenty boli separované elektroforeticky v 1,5% agarózových géloch a vizualizované etídium bromidom. Enzýmová aktivita bola stanovovaná pomocou kitu Beta-amylase (Megazyme Ireland Ltd.). Pre hodnotenie závislosti medzi aktivitou β-amylázy a dĺžkovou variabilitou v intróne III génu β-amy1 bola použitá metóda lineárnej regresie pomocou programu Microsoft Excel Výsledky a diskusia 3.1 Detekcia dvoch typov dĺžkového variantu intrónu III Výsledky, ktoré publikoval ERKKILÄ (1999) ukazujú, že za aktivitu β-amylázy by mali byť zodpovedné tri odlišné dĺžkové varianty v intróne III génu β-amy1, identifikované v genotypoch Haruna Nijo, Adorra a Hordeum spontaneum PI PCR analýzami sme zistili, že všetky analyzované odrody jačmeňa, v našom 170- člennom súbore, obsahujú dva odlišné dĺžkové varianty v rámci intrónu III génu β- amy1 (Obr. 1). Prvý je identický s variantom, ktorý vlastní japonský jačmeň Haruna Nijo. Odrody s týmto typom sú zaraďované do skupiny A. Druhý je identický s fragmentom amplifikovaným v odrode Adorra a všetky genotypy s týmto fragmentom sú zaraďované do skupiny B. Amplifikovaný dĺžkový variant intrónu III, identický s odrodou Haruna Nijo, má 515 bp a dĺžkový variant identický s odrodou Adorra je dlhý 641 bp. Dĺžková variabilita, po amplifikovaní tými istými primermi, v rámci intrónu III vzniká v dôsledku 126 bp inzercie v genotype Adorra. Variant C

4 248 Ondrík, P. et al. sme medzi 170 jačmeňmi nenašli, čo sme aj predpokladali, keďže je takmer vylúčené, aby sa alela β-amy1, identická s alelou genotypu Hordeum spontaneum PI , bežne vyskytovala. Dvadsaťjeden, t.j. 12,4% z analyzovaných odrôd, bolo heterozygótnych, malo alelu A aj B a obsahujú teda dĺžkové varianty intrónu III charakteristické pre odrodu Haruna Nijo aj Adorra a sú heterozygótne v tomto lokuse. Rozsah genetickej variability v skušaných odrodách jačmeňa, je v tomto lokuse teda limitovaný na dve alely. Výsledky ERKKILÄ (1999) naznačujú, že všetky odrody zaradené do skupiny A, teda vlastniace amplifikovaný úsek dlhý 515 bp, by mali vykazovať vysokú aktivitu β-amylázy a vysoká aktivity β-amylázy by mohla mať následne vplyv aj na termostabilitu enzýmu (EGLINTON a kol., 1998) a sladovnícku kvalitu jačmeňa (EVANS a kol., 1997). Odrôd s alelou A sme v našom súbore našli 69, t.j. 40,6%. Tieto by teda mali vykazovať vysokú aktivitu β-amylázy. Možno predpokladať, že zvyšných 80 odrôd, t.j. 47% patriacich do skupiny B, nebudú vykazovať vysokú aktivitu. Typ B (Adorra) Typ A (Haruna Nijo) Obr. 1: Dva typy dĺžkových variantov v rámci intrónu III génu β-amy1 3.2 Závislosť aktivity β-amylázy od dĺžkovej variability v intróne III Keďže všetky jačmene boli dopestované v jednej lokalite a jednom roku (2003), eliminovali sme vplyv lokality a ročníka na aktivitu enzýmu, a rozdiely by mali ukazovať na rozdiely genotypové. Obr. 2 ukazuje zastúpenie jednotlivých odrôd s rôznymi aktivitami β-amylázy. Celkový počet skúmaných odrôd jačmeňa bol 93. Minimálna dosiahnutá aktivita β-amylázy bola 582 U.g -1 šrotu (odroda Donum) a maximálna dosahnutá aktivita bola 1189 U.g -1 šrotu (Krystal). Najfrekventovanejšie boli zastúpené genotypy jačmeňa s aktivitou v rozmedzí U.g -1. Nasledovali skupiny odrôd jačmeňa s aktivitami U.g -1, U.g -1 a U.g -1. Ostatné odrody, vykazujúce nižšie či vyššie hodnoty aktivity β-amylázy, boli menej frekventované. Najnižšiu frekvenciu mali genotypy s aktivitami vyššími ako 1000 U.g - 1. Priemerná hodnota aktivity β-amylázy v celom súbore genotypov jačmeňa bola 840 U.g -1. Žiadna z analyzovaných odrôd nevykazovala veľmi vysokú aktivitu, teda nad 1200 U.g -1. Odrody, ktoré sme zaradili do skupiny A, na základe dĺžkového variantu intrónu III, analyzovaného pomocou PCR, vykazovali prevažne vysoké hodnoty aktivít β-

5 Nova Biotechnologica (2004) 249 amylázy, v rozmedzí od U.g -1. Odrody zaradené do skupiny B vykazovali prevažne nízke hodnoty aktivít β-amyláz, nižšie ako 780 U.g -1. Odrody heterozygótne, teda zaradené do skupiny A+B, mali hodnoty aktivít β-amyláz U.g -1. Všetky genotypy, ktoré majú aktivity menšie ako 780 U.g -1 sme zaradili medzi genotypy s nízkou aktivitou, genotypy s aktivitami vyššími ako 880 U.g -1, medzi genotypy s vysokou aktivitou. Genotypy s aktivitou β-amylázy v rozmedzí U.g -1 sme zaradili medzi genotypy so strednou aktivitou. V skupine genotypov s dĺžkovým variantom A (t.j. amplifikovaným fragmentom dlhým 515 bp) bola minimálna aktivita 582 U.g -1 a maximálna 1081 U.g -1. Priemerná aktivity β-amyláz bola 865 U.g -1. V skupine dĺžkového variantu B (t.j. 641 bp) bola minimálna aktivita 587 U.g -1, maximálna 1189 U.g -1 a priemerná 805 U.g -1. V skupine A+B (t.j. genotypy heterozygótne v tomto lokuse) bola minimálna aktivita 645 U.g -1, maximálna 1078 U.g -1 a priemerná aktivita 863 U.g -1. Po štatistickom zhodnotení vzťahu medzi hodnotami aktivít β-amylázy a dĺžkovými variantmi v intróne III (stanovenými podľa ERKKILÄ, 1999), sme zistili štatisticky významnú koreláciu (r = 0,206; P>0,05) medzi nimi, teda namerané aktivity β-amyláz, pri väčšine genotypov jačmeňa, sú spojené s dĺžkovou variabilitou v intróne III génu, β-amy1, aj keď v niektorých jačmeňoch sme našli výnimky nepotvrdzujúce túto závislosť. Príkladom je odroda Bohatýr, ktorá vykazuje dosť vysokú aktivitu β- amylázy (876.g -1 ), ale na základe identifikácie dĺžkového variantu intrónu III je zaradená do skupiny B. Odroda Ekonom má tiež vysokú aktivitu (921 U/g), ale je zaradená tiež do skupiny B. Takto výrazne sa odlišujú aj odrody Kompakt a Bonus. Na základe získaných výsledkov môžeme konštatovať, že dĺžková variabilita v intróne III, génu β amy1, ovpyvňuje aktivity β amylázy, tak ako to publikoval ERKKILÄ ( 1999) Fre kve nci a 2 Std. Dev = 134,18 Mean = 840,1 0 N = 93,00 600,0 700,0 800,0 900,0 1000,0 1100,0 1200,0 650,0 750,0 850,0 950,0 1050,0 1150,0 Aktivita β-amylázy (U.g -1 ) Obr. 2: Frekvencia genotypov jačmeňa podľa aktivity ich β-amylázy

6 250 Ondrík, P. et al. 3.3 Predikcia termostability β-amylázy pomocou DNA markera V tejto časti práce sme amplifikovali časť štrukturálneho, β-amylázového génu, dlhšiu časť intrónu III (KANEKO a kol., 2000). Oproti postupu podľa ERKKILÄ (1999) analyzované dĺžkové varianty by mali mať súvislosť s termostabilitou enzýmu β-amyláza. Ďalší rozdiel je aj v počte použitých primerov. Tu sme na amplifikáciu génu použili tri primery, zostavené do dvoch párov. KANEKO a kol. (2000) dokázali, že najvyššiu termostabilitu má β-amyláza z odrody Haruna Nijo. β-amyláza z odrody Harrington má strednú a z odrody Schooner nízku termostabilitu (KANEKO a kol., 2000). Haruna Nijo je teda zaradený do skupiny A, s najvyššou termostabilitou, Harrington do skupiny B, so strednou, a Schooner do skupiny C, s najnižšou termostabilitou β-amylázy. Všetky analyzované genotypy, spolu s dĺžkovými variantmi, sme zaradili do jednotlivých skupín. Na Obr. 3 sú zobrazené jednotlivé dĺžkové varianty analyzovaných genotypov. Dĺžkový variant intrónu III identický s odrodou Haruna Nijo je dlhý 748 bp, s odrodou Harrington 1075 bp. Dva DNA fragmenty amplifikované z DNA genotypu Schooner, vďaka 126 bp inzercii, sú dlhé 874 bp a 1201 bp. Všetky skúmané odrody sme takto zaradili do skupín A, B, C, A+B alebo B+C, na základe amplifikovaného úseku intrónu III β- amylázového génu. Všetky odrody patriace do skupiny A by, podľa KANEKO a kol. (2000), mali vykazovať najvyššiu termostabilitu β-amylázy. Z nášho analyzovaného súboru jačmeňov má tento dĺžkový variant v homozygótnom stave iba odroda Haruna Nijo. Ďalšie 3 genotypy (Aramis, CI 4702, CI 9440) sú heterozygótne A+B. Ostatné boli zaradené do skupín B, C alebo B+C a mali by vykazovať strednú až nízku termostabilitu β-amyláz. Novšie práce potvrdzujú, že za aktivitu β-amylázy je zodpovedný nielen dĺžkový variant intrónu III génu β-amy1 (CLARK a kol., 2003). Nebola testovaná iba oblasť intrónu III génu β-amy1, ale hlavne primárna štruktúra tohto génu, v sladovníckych aj kŕmnych jačmeňoch. Aminokyselinová sekvencia bola určená z cdna génu β-amy1. Medzi sladovníckymi a kŕmnymi genotypmi jačmeňa boli zistené odlišnosti v aminokyselinách, v pozíciách 115, 165, 430 a 177, teda aj v sekvencii DNA prislúchajúcich týmto aminokyselinám. Sladovnícke genotypy jačmeňa mali v pozíciách 115 cysteín, 165 kyselinu glutámovú a v pozícii 430 alanín. Kŕmne genotypy jačmeňa mali v pozíciách 115 arginín, 165 kyselinu aspartámovú a v pozícii 430 valín. Pri ostatných dvoch pozíciách autori neuvádzajú jednotlivé aminokyseliny. Stanovením aktivity β-amyláz sa zistilo, že sladovnícke genotypy jačmeňa vykazovali približne o 67% vyššiu aktivitu ako genotypy kŕmnych jačmeňov. Po aktivite bola testovaná aj termostabilita β-amyláz. Výrazné rozdiely v termostabilite medzi jednotlivými genotypmi jačmeňa boli pozorované pri teplote 60 C, pri ktorej strácali β-amylázy polovicu svojej aktivity. Všeobecne boli sladovnícke genotypy jačmeňa o 7% termostabilnejšie než kŕmne genotypy jačmeňa. Za takéto rozdiely zodpovedajú odišnosti v aminokyselinovej zostave v pozíciách 115, 165 a 430 (CLARK a kol., 2003). Zvážením všetkých týchto tvrdení vyplýva, že za aktivitu β-amyláz nie sú zodpovedné iba štrukturálne zmeny v dĺžkovom variante intrónu III, ale dôležitejšiu úlohu zohrávajú aminokyseliny v pozíciách 115, 165 a 430,

7 Nova Biotechnologica (2004) 251 teda mimo intrónu III. Ďalšia súvislosť sa potvrdila aj medzi aktivitou β-amylázy a sladovníckou kvalitou. Podľa CLARK a kol. (2003) a ERKKILÄ (1999) vykazujú vyššiu β-amylázovú aktivitu sladovnícke genotypy jačmeňa. Ďalšie testovania β- amylázoveho génu (PARIS a kol., 2002) potvrdzujú predchádzajúce tvrdenie, že za β- amylázovú aktivitu sú zodpovedné zmeny aminokyselín v uvedených pozíciách. PARIS a kol. (2002) však uvádzajú iba dve pozície a 233. Zistili, že β-amylázy existujú v jačmeni v štyroch alelických izoformách. Sú označené ako Sd2L, Sd1, Sd2H a Sd3. Tieto izoformy vykazujú odlišnosti v aktivite ale aj v termostabilite, ktorá bola tiež testovaná. Izoforma Sd2L obsahuje kyselinu aspartámovú v pozícii 165 a valín v pozícii 233, Sd1 glutámovú kyselinu v pozícii 165 a valín v pozícii 233, Sd2H má v pozícii 165 kyselinu aspartámovú A v 233 pozícii alanín a Sd3 má v pozícii 165 glutámovú kyselinu a v pozícii 233 alanín. Alelické izoformy Sd1, Sd2L a Sd2H boli objavené v genofonde Hordeum vulgare L. a iba alela Sd3 sa vyskytuje v genofonde divorastúcich jačmeňov Hordeum spontaneum. Genotypy majúce alelu typu Sd2L vykazovali najnižšiu β-amylázovú aktivitu, odrody s alelou typu Sd1 mali strednú aktivitu, odrody s alelou Sd2H vykazovali vysokú aktivitu a odrody s alelou typu Sd3 mali najvyššiu β-amylázovú aktivitu. Toto potvrdzuje aj ERKKILÄ (1999), pretože genotyp H. spontaneum PI vykazoval tiež najvyššiu aktivitu β-amylázy. Testovaná bola aj termostabilita, kde genotypy s alelou typu Sd2L strácali polovicu svojej aktivity už pri teplote 56,8 C, genotypy s alelou Sd1 pri 58,5 C a genotypy s alelou Sd3 strácali polovicu svojej aktivity pri 60,8 C. Teplota, pri ktorej stratili polovicu svojej aktivity odrody s alelou Sd2H sa neuvádza. Tiež bolo potvrdené, že sladovnícke genotypy jačmeňa vykazovali vyššie aktivity β-amyláz. 748bp 1075 bp 874 bp 1201 bp Obr. 3: Dĺžkové varianty intrónu III génu β-amy1 v analyzovaných jačmeňoch. Skupina B: Akcent (2;17), CI 7584 (6;21). Skupina C: Amos (3; 18), CI 1615 (4;19), CI 5809 (5;20), Diamant (7;22), Diabas (8;23), Calypso (12;27), CI 9820 (14;29), CI 9825 (15;30). Skupina B+C: Diosecký springer (9;24), Dobrovický staročeský (10;25), Bučiansky kneifel (11;26), CI 9819 (13;28). Skupina A+B: Aramis (1;16). Poďakovanie Práca bola vykonaná v rámci projektu číslo 2003SP27/0280D01/0280D01. Za poskytnutie vzoriek jačmeňa ďakujeme Ing. Michaele Benkovej, kurátorke kolekcie genetických zdrojov jačmeňa.

8 252 Ondrík, P. et al. Literatúra CLARK, S.E., HAYES, P.M., HENSON, C.A.: Effects of single nucleotide polymorphisms in β-amylase1 alleles from barley on functional properties of the enzymes. Plant Physiol. Biochem., 41, 2003, s DELLAPORTA, S.F., WOOD, J., HICKS, J.B.: A plant DNA minipreparation, version two. Plant Mol. Biol. Rep., 1, 1983, s EGLINTON, J.K., LANGRIDGE, P., EVANS, D.E.: Thermostability variation in alleles of barley beta-amylase. J. Cereal Sci., 28, 1998, s ERKKILÄ, M.J.: Intron III specific markers for screening of β-amylase alleles in barley cultivars. Plant Mol. Biol. Rep., 17, 1999, s ERKKILÄ, M.J., LEAH, R., AHOKAS, H., CAMERON MILLS, V.: Alleledependent barley grain β-amylase activity. J. Plant Physiol., 117, 1999, s EVANS, D.E., WALLACE, W., LANCE, R.C.M., MACLEOD, L.D.: Measurement of beta-amylase in malting barley (Hordeum vulgare L.). J. Cereal Sci., 26, 1997, s GIBSON, T.S., SOLAH, V., HOLMES, M.R., TAYLOR, H.R.: Diastatic power in malted barley: Contributions of malt parameters to its development and the potential of barley grain beta-amylase to predict malt diastatic power. J. Inst. Brew., 101, 1995, s GRIME, K.H., BRIGGS, D.E.: Release and activation of barley β-amylase. J. Inst. Brew., 101, 1995, s GUNKEL, J., VOETZ, M., RATH, F.: Effect of the malting barley variety on fermentability. J. Inst. Brew., 108, 2002, s HUBÍK, K., MAREČEK, J. Kvalita ječmene. Farmář, 13, 2002, s KANEKO, T., KIHARA, M., ITO, K.: Genetic analysis of beta-amylase thermostability to develop a DNA marker for malt fermentability improvement in barley, Hordeum vulgare. Plant Breed., 119, 2000, s KANEKO, T., ZAHNG, W.S., ITO, K., TAKEDA, K.: Worldwide distribution of β- amylase thermostability in barley. Euphytica, 121, 2001, s KIHARA, M., KANEKO, T., ITO, K., AIDA, Y., TAKEDA, K.: Geographical variation of β-amylase thermostability among varieties of barley (Hordeum vulgare) and β-amylase deficiency. Plant Breed., 118, 1999, s PARIS M., Jones, M.G.K., Eglinton, J.K.: Genotyping single nucleotide polymorphisms for selection of barley β-amylase alleles. Plant Mol. Biol. Rep., 20, 2002, s Relation Between Lenght Variation of β-amy1 gene and Activity of β-amylase in Barley Abstract: Two length variants in intron III, specific for cultivars Haruna Nijo and Adorra have been detected within analyzed old and modern barley cultivars. Length variant of intron III identical with that has cultivar Haruna Nijo was 515 bp and that has cultivar Adorra was 641 bp. According to ERKKILÄ (1999) these two types are responsible for high and low activity of β-amylase, respectively. We confirmed

9 Nova Biotechnologica (2004) 253 statistically significant (P>0,05) relation between length variation of intron III of the gene β-amy1 and activity of β-amylase. Analysis of DNA marker, which should be responsible for thermostability of β-amylase, we detected 3 length variants in intron III bp, 874 bp, 1075 bp, and 1201 bp. Two of them (874 bp, 1201 bp) are specific for cultivars Harrington and Schooner. They should be responsible for higher or lower thermostability of β-amylase in barley. Length variant characteristic for cultivar Haruna Nijo was not identified within a set of tested barleys, i.e. only variant corresponding to lower thermostability of β- amylase was detected. Above mentioned analyse should help to select barley genotypes possessing high activity and probable also thermostability of β-amylase. Key Words: barley, β-amylase, activity, thermostability