Kesan Mononatrium Glutamat (MSG) Terhadap Penghasilan Lipid oleh Aurantiochytrium sp. SW1 Menggunakan Fermentasi Kultur Suap-Kelompok

Transcription

1 Undergraduate Research Journal for Biomolecular Sciences and Biotechnology ISSN Kesan Mononatrium Glutamat (MSG) Terhadap Penghasilan Lipid oleh Aurantiochytrium sp. SW1 Menggunakan Fermentasi Kultur Suap-Kelompok Yong Jin Tung, Vidyah Manikan, Aidil Abdul Hamid & Herryawan Ryadi Eziwar Dyari* Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Selangor, Malaysia * mel-e pengarang rujukan: herry@ukm.edu.my Abstrak: Aurantiochytrium sp. SW1 merupakan mikroorganisma oleaginus yang berpotensi menghasilkan asid lemak poli tidak tepu (PUFA) sehingga 50% dari berat keseluruhan di mana 90% daripada kandungannya adalah asid dokosaheksanoik (DHA). Mononatrium glutamat atau MSG ialah garam natrium berasaskan asid glutamik di mana formula struktur umum ialah C 5H 8NO 4Na. Dari segi penyelidikan dan pembangunan, MSG merupakan sumber nitrogen yang memainkan peranan kritikal dalam pertumbuhan dan pengumpulan biojisim mikroalga di mana MSG membantu dalam pembentukan asid amino dan proliferasi sel. Dalam penyelidikan ini, fermentasi kultur kelompok digunakan untuk menentukan kepekatan MSG yang optimum bagi pertumbuhan dan pengumpulan lipid oleh Aurantiochytrium sp. SW1. Seterusnya, keberkesanan kultur kelompok dan kultur suap-kelompok juga dibandingkan. Pengkulturan dijalankan dalam kelalang Erlenmeyer 250 ml yang mengandungi 200 ml kultur pembenihan, dieram dan digoncang dengan kelajuan 200 rpm pada suhu 30 C selama 5 hari. Penyediaan kultur penghasilan adalah sama dengan kultur pembenihan dalam fermentasi kultur kelompok kecuali kepekatan MSG yang dimasukkan berbeza iaitu 4 gl -1, 8 gl -1, 12 gl -1 dan 16 gl -1. Kepekatan MSG yang mempunyai produktiviti lipid terbaik dalam kultur kelompok akan dipilih untuk diaplikasikan dalam fermentasi kultur suap-kelompok. Kajian ini telah menunjukkan bahawa penggunaan 8 gl -1 MSG dalam fermentasi kultur kelompok menghasilkan produktiviti lipid yang paling tinggi dan seragam di mana 45.47% lipid dikumpulkan. Bagi fermentasi kultur suap-kelompok, penyuapan MSG pada jam ke-60 telah mendorong penghasilan biojisim yang lebih tinggi dan secara berterusan sehingga hari kelima pengkulturan. Namun bagi profil produktiviti lipid, penurunan berlaku di mana peratus lipid tertinggi yang dikumpulkan adalah 33.66% sahaja pada masa tuaian 96 jam (t=4). Kajian ini telah menunjukkan penyuapan MSG di dalam fermentasi kultur suap kelompok telah mengehadkan penghasilan lipid dalam kultur Aurantiochytrium sp. SW1. Kata kunci: Mononatrum glutamat, lipid, Aurantiochytrium sp. SW1, kultur suap-kelompok Abstract: Aurantiochytrium sp. SW1 is an oleaginous microorganism that can generate up to 50% polyunsaturated fatty acids (PUFA) intracellularly, where 90% of it is Docosahexaenoic acid (DHA). Monosodium glutamate or MSG is known as sodium salt of glutamic acid where the general structural formula is C 5H 8NO 4Na. In terms of research and development, MSG is a source of nitrogen that plays a critical role in the growth and accumulation of microalgae biomass where MSG helps the formation of amino acids and cell proliferation. In this research, the batch culture fermentation was used to determine the optimal concentration of MSG for the growth and lipid productivity by Aurantiochytrium sp. SW1. The effectiveness of batch culture and fed-batch culture were also compared. Cultivation was carried out using batch culture in a 250 ml Erlenmeyer flask containing 200 ml of seedling culture and incubated at 30 C with 200 rpm agitation for 5 days. The preparation of the production culture and the seedling culture only differed in the concentration of MSG in which 4 gl -1, 8 gl -1, 12 gl -1 and 16 gl -1 of MSG were applied and the optimum MSG concentration was investigated via fed-batch culture fermentation. This study showed that the use of 8 gl -1 of MSG in batch culture had the highest and most uniform lipid productivity, in which gl -1 biomass and 45.47% of lipid had been accumulated. For fed-batch culture fermentation, the feeding of MSG at the 60 th 100

2 hour increased the biomass up to the fifth day of cultivation with gl -1 produced. However, for lipid productivity, the percentage of lipid produced dropped sharply in which the highest percentage of lipid collected was only 33.66% on the 4 th day of the cultivation. This study has shown that the feeding of MSG at its optimal concentration in fed-batch culture has restricted the lipid accumulation of Aurantiochytrium sp. SW1. Keywords: Monosodium glutamate, lipid, Aurantiochytrium sp. SW1, fed-batch culture 1. Pengenalan Aurantiochytrium sp. SW1 merupakan mikroorganisma oleaginus yang berpotensi menghasilkan asid lemak poli tidak tepu (PUFA) sehingga 50% dari berat keseluruhan di mana 90% daripadanya adalah kandungan asid dokosaheksanoik (DHA) (Manikan et al. 2015). Mikroalga merupakan sumber asid lemak utama dalam jaringan makanan hidupan laut di mana ia mampu menghasilkan beberapa jenis lipid termasuk lipid neutral, sterol serta hidrokarbon seperti asid lemak dan terbitan prenil. Ia dikenali sebagai sumber komersial yang mampu menghasilkan bahan kimia bernilai tinggi seperti β-karotena (Borowitzka 2010), asid lemak poli tidak tepu berantai panjang (PUFA) (Mendes et al 2009) dan kanji (Singh et al 2005). Kepelbagaian evolusi dan filogenetik mikroalga bermakna kepelbagaian dalam komposisi kimia organisma ini di mana faktor tersebut telah menjadikan mereka amat sesuai untuk dieksploitasi sebagai sumber biomolekul secara komersial (Stephens et al. 2010). Pengkulturan mikroorganisma seperti mikroalga untuk mengumpulkan minyak yang kaya dengan omega-3 asid lemak ditakrifkan sebagai Bioteknologi Omega-3 (Gupta et al. 2012). Minyak sel tunggal (SCO) merupakan lipid penyimpanan intrasel yang kebanyakannya terdiri daripada triasigliserol (TAG). SCO yang dihasilkan oleh mikroorganisma oleaginus adalah antara 20% hingga 80% bagi setiap biojisim kering di bawah keadaan nutrien terhad. Profil asid lemak (SCO) yang berbeza telah ditubuhkan di mana mikroorganisma berlemak ini akan disesuaikan dan diaplikasikan ke dalam sektor industri (Ochsenreither et al. 2016). Perkembangan terkini telah menunjukkan kepentingan omega-3 asid lemak poli tidak tepu sebagai pengawalaturan biologi utama dalam mengawal metabolisme dan fungsi normal tubuh. Ia mempunyai beberapa peranan penting seperti dalam pembentukan lipid membran, sebagai ligan untuk reseptor dan pelopor untuk asid eikosapentanoik (EPA), menjalankan interaksi langsung dengan protein serta mengawal pengekspresan gen (Innis 2008). Pengubahsuaian komponen medium dan keadaan kultur merupakan teknik pilihan untuk meningkatkan pengumpulan lipid dan penghasilan DHA. Mikroalga menggunakan sumber karbon dan nitrogen untuk pertumbuhan, di mana sumber nitrogen yang terhad digunakan untuk proliferasi sel dan sintesis asid amino, manakala sumber karbon yang berlebihan akan diasimilasikan kepada lipid melalui proses biosintesis (Ratledge 2004). Kehadiran karbon dan nitrogen serta saling interaksi di antaranya merupakan faktor penting dalam pengawalaturan pertumbuhan sel bagi penghasilan biojisim, lipid dan DHA. Mononatrium glutamat atau MSG ialah garam natrium berasaskan asid glutamik. MSG merupakan sumber nitrogen yang memainkan peranan kritikal dalam pertumbuhan dan pengumpulan biojisim mikroalga di mana MSG membantu dalam pembentukan asid amino dan proliferasi sel. Kultur kelompok dan kultur suap-kelompok adalah dua kaedah fermentasi yang boleh digunakan untuk menghasilkan lipid daripada mikroalga. Penggunaan kultur kelompok akan mengehadkan proliferasi sel dan pertumbuhan mikroalga secara berterusan disebabkan kehabisan nutrien yang dibekalkan dalam medium. Kultur suap-kelompok mempunyai pembekalan sumber karbon atau sumber nitrogen pada masa tertentu mampu meningkatkan produktiviti, mengurangkan kos dan tenaga kerja (Reinehr & Costa 2006). Dalam penyelidikan ini, fermentasi kultur kelompok digunakan untuk menentukan kepekatan mononatrium glutamat (MSG) yang optimum bagi produktiviti lipid oleh Aurantiochytrium sp. SW1. Seterusnya, keberkesanan kultur kelompok dan kultur suap-kelompok juga dibandingkan. 101

3 2. Bahan dan Kaedah 2.1 Penyediaan kultur stok Pencilan Aurantiochytrium sp. SW1 diperoleh daripada kultur simpanan Makmal Teknologi Mikrob II Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia. Medium agar garam laut tiruan (SNA) yang terdiri daripada komposisi seperti berikut disediakan: 17.5 gl -1 NaCl, 28 gl -1 agar nutrien (NA) dan 1 L air suling. Pencilan Aurantiochytrium sp. SW1 diinokulasikan di atas piring agar SNA melalui kaedah aseptik dan dieram pada suhu 30 C selama dua hari. 2.2 Penyediaan kultur pembenihan Kultur pembenihan mengandungi medium basal yang terdiri daripada 60 gl -1 glukosa, 6 gl -1 garam laut, 2 gl -1 ekstrak yis dan 8gL -1 mononatrium glutamat (MSG). Potongan agar yang mengandungi lebih kurang 20 koloni Aurantiochytrium sp. SW1 yang bersaiz seragam dipotong daripada piring kultur dan dipindahkan secara aseptik ke dalam kelalang Erlenmeyer yang mengandungi 200 ml kultur pembenihan, dieram dan digoncang pada suhu 30 C dengan goncangan 200 rpm selama 48 jam. 2.3 Penyediaan kultur penghasilan Kaedah fermentasi kultur kelompok Sebanyak 10% (i/i) kultur pembenihan 48 jam diinokulatkan ke dalam kelalang Erlenmeyer 250 ml yang mengandungi 200 ml kultur pembenihan. Bagi penyediaan kultur penghasilan, kandungannya adalah sama dengan kultur pembenihan kecuali kepekatan MSG yang dimasukkan. Kepekatan MSG adalah berbeza bagi setiap kelalang Erlenmeyer iaitu 4 gl -1, 8 gl -1, 12 gl -1 and 16 gl -1 masingmasing. Setiap kelalang dieram dan digoncang dengan kelajuan 200 rpm pada suhu 30 C serta dituai pada selang masa yang berbeza iaitu 24 jam, 48 jam, 72 jam, 96 jam dan 120 jam Kaedah fermentasi kultur suap- kelompok Kultur penghasilan disediakan dan diproses seperti yang ditunjukkan dalam kaedah Berdasarkan graf profil pertumbuhan dan penghasilan lipid yang diperoleh semasa kultur kelompok dijalankan, penyuapan sumber nitrogen iaitu MSG dijalankan pada jam ke-60. Sebanyak 8 g MSG dilarutkan di dalam 2 ml air suling untuk digunakan semasa penyuapan bagi piawai medium. Larutan tersebut disediakan di dalam botol universal dan diautoklaf. 2.4 Penentuan biojisim kering Selepas tempoh pengkulturan, setiap kultur dituai melalui pengemparan pada 4,000 rpm selama 10 minit di bawah suhu 4 C. Pelet yang terhasil dibilas dengan menggunakan 25 ml air suling steril dan diempar sekali lagi pada 4,000 rpm selama 5 minit pada suhu 4 C. Pelet ini diletakkan di dalam ketuhar bersuhu 62 C dan dibiarkan kering semalaman. Biojisim yang diperoleh ditimbang dan diekspreskan sebagai berat kering-beku di dalam gram per liter (g/l) medium pertumbuhan. 102

4 2.5 Pengekstrakan lipid Kaedah pengekstrakan lipid ini menggunakan kaedah Folch et al. (1957). Residu yang terdapat di dalam kelalang dilarutkan dengan pelarut dietil ester serta dimasukkan ke dalam vial yang telah ditimbang dan direkodkan terlebih dahulu. Kemudian, dietil eter dibiarkan meruap dan sampel lipid yang terhasil diletakkan dalam pengering hampagas selama 24 jam sebelum ditentukan beratnya (g/l). Peratus lipid direkodkan sebagai % g lipid per g biojisim. 3. Hasil dan Perbincangan 3.1 Profil pertumbuhan bagi Aurantiochytrium sp. SW1 dengan menggunakan kepekatan MSG yang berbeza melalui fermentasi kultur kelompok Rajah 1 menunjukkan pertumbuhan sel mula memasuki fasa eksponen di mana pengkulturan yang menggunakan medium piawai yang mengandungi 8 gl -1 menghasilkan 9.55 gl -1 biojisim pada hari kedua pengkulturan (t = 2). Proses proliferasi dan pembahagian sel berlaku secara aktif. Persaingan sel terhadap MSG yang semakin berkurang menyebabkan pertumbuhan sel juga berkurang. Penurunan kepekatan biojisim telah membuktikan sel menghadapi masalah kekurangan nutrien untuk pertumbuhan secara berterusan dan mula memasuki fasa kematian. Kepekatan biojisim tertinggi ialah pada hari keempat pengkulturan (t=4) di mana gl -1 dihasilkan. Manakala penambahan 4 gl -1 MSG dalam kultur telah melambatkan dan mengehadkan pertumbuhan sel di mana kultur telah menggunakan masa yang lebih lama untuk memasuki fasa eksponen dan fasa pegun. Kepekatan MSG yang rendah tidak mampu merangsang pertumbuhan sel secara aktif. Kepekatan biojisim yang paling banyak dihasilkan adalah pada hari terakhir pengkulturan (t=5) iaitu gl -1. Bagi penggunaan 12 gl -1 MSG dalam kultur, kultur telah memasuki fasa eksponen lebih awal. Kepekatan biojisim telah meningkat secara mendadak ke gl -1 pada hari ketiga pengkulturan (t=3). Peningkatan ini telah menunjukkan bahawa Aurantiochytrium sp. SW1 aktif menggunakan sumber nitrogen yang sedia ada dan berlebihan secara optimum untuk menjalankan sintesis asid amino dan proliferasi sel. Bermula pada hari keempat pengkulturan (t=4), kultur telah memasuki fasa kematian berdasarkan penurunan biojisim yang ditunjukkan. Hal ini berkemungkinan besar disebabkan penghasilan biojisim telah mencapai maksimum di mana pengkulturan yang seterusnya tidak akan memberi kesan yang signifikan terhadap hasil biojisim walaupun sumber nitrogen masih berada dalam kadar optimum. Hal ini disebabkan kepekatan biojisim yang terlalu tinggi dalam medium telah mengurangkan kadar oksigen yang terdapat dalam medium dan seterusnya menjejaskan tahap keasidan medium tersebut. Kadar metabolit yang terlalu tinggi dalam medium juga telah mendorong kematian kultur. Kehadiran 16 gl -1 MSG di dalam medium pula boleh dikatakan terlalu tinggi bagi kultur di mana ia tidak mampu merangsang proliferasi sel dan sebaliknya telah menghalang pertumbuhan kultur. Hal ini dapat ditunjukkan dalam Rajah 1 di mana kepekatan biojisim yang paling banyak dihasilkan hanyalah 4.62 gl -1 iaitu pada hari kedua pengkulturan (t=2). Hasil biojisim telah menunjukkan tiada fasa-fasa pertumbuhan yang spesifik dicapai oleh Aurantiochytrium sp. SW1 disebabkan tiada penambahan atau penurunan kepekatan biojisim yang ketara. Hal ini telah menunjukkan bahawa MSG berkemungkinan besar telah menjadi sumber toksik bagi kultur di mana kultur sel tidak mampu mengendalikan sumber nitrogen yang terlalu banyak dalam medium untuk metabolisme (Vidyah et al. 2014).. 103

5 Kepekatan biojisim (g/l) Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech. 1, Masa (jam) 4 g/l MSG 8 g/l MSG 12 g/l MSG 16 g/l MSG Rajah 1. Profil pertumbuhan bagi Aurantiochytrium sp. SW1 sepanjang 120 jam pengkulturan secara fermentasi kultur kelompok dengan menggunakan kepekatan MSG pada 4 gl -1, 8 gl -1, 12 gl -1 dan 16 gl -1 dan dijalankan secara triplikat. 3.2 Profil pengumpulan lipid bagi Aurantiochytrium sp. SW1 dengan menggunakan kepekatan MSG yang berbeza melalui fermentasi kultur kelompok Daripada hasil yang telah diperoleh (Rajah 2), penggunan 8 gl -1 MSG telah membolehkan pengumpulan lipid berlaku secara aktif semasa sel mula memasuki fasa awal pegun iaitu selepas hari ketiga pengkulturan (t = 3). Aurantiochytrium sp. SW1 telah mula mensintesis metabolit sekunder iaitu lipid dengan menggunakan sumber karbon yang sedia ada bagi membolehkan mikroorganisma ini bermandiri. Selepas jam ke-96, sumber karbon yang dibekalkan semakin berkurangan menyebabkan penghasilan lipid juga berkurang. Menurut Hu et al. (2008), pertukaran metabolisme lipid berlaku antara sintesis lipid membran dan penyimpanan. Lipid intrasel yang tersimpan mungkin akan digunakan oleh sesetengah mikroorganisma oleaginus sebagai sumber tenaga. Bagi penggunaan 4 gl -1 MSG dalam medium kultur, disebabkan fasa pegun kultur telah dilewatkan, masa yang digunakan oleh kultur untuk mengumpulkan lipid juga dilewatkan. Peratus lipid yang rendah ini jika dibandingkan dengan piawai profil pertumbuhan telah menunjukkan bahawa pertumbuhan dan proliferasi sel belum lagi optimum untuk memasuki fasa pengumpulan lipid. Bagi masa tuaian 96 jam, peratus lipid yang terkumpul adalah tertinggi iaitu 41.77% lipid. Hal ini telah menunjukkan kekurangan sumber nitrogen dalam medium dan kultur mula menggunakan sumber karbon untuk mensintesis lipid. Tetapi, selepas masa tuaian 96 jam, penurunan hasil pengumpulan lipid dapat dikaitkan dengan metabolisme kultur di mana sel telah menjadi kurang aktif untuk lipid sintesis selepas 5 hari pengkulturan. Manakala bagi penggunaan 12 gl -1 MSG dalam medium pengkulturan, profil pengumpulan lipid (Rajah 2) telah menunjukkan peratus lipid tertinggi yang diperoleh adalah pada masa tuaian 48 jam iaitu 29.79%. Kepekatan biojisim yang tinggi tidak mendorong kepada peningkatan peratus lipid mungkin disebabkan kepekatan sumber nitrogen, MSG yang masih tinggi di dalam medium telah menghalang kultur mengambil sumber karbon untuk penghasilan lipid. Hal ini telah membuktikan bahawa Aurantiochytrium sp. SW1 hanya akan menggunakan sumber karbon untuk lipid sintesis dalam keadaan kehausan nitrogen (Vidyah et al. 2014). Penggunaan kepekatan MSG pada 16 gl -1 tidak menggalakkan pengumpulan lipid seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2. Peratus lipid yang tertinggi diperoleh pada hari kedua pengkulturan (t=2) di mana hanya 20.18% telah diekstrakkan. Kepekatan sumber nitrogen yang tinggi dalam medium telah menghalang kultur sel menggunakan sumber karbon untuk mensintesis lipid. Pertumbuhan sel yang terhad kemungkinan besar telah menyebabkan sintesis asid amino dan enzim penting juga diganggu di mana sel-sel yang dihasilkan mungkin terencat (Vidyah et al. 2014). 104

6 Produktiviti (g/l/j) Lipid (% g/g) Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech. 1, Masa (jam) 4 g/l MSG 8 g/l MSG 12 g/l MSG 16 g/l MSG Rajah 2. Profil pengumpulan lipid bagi Aurantiochytrium sp. SW1 sepanjang 120 jam pengkulturan secara fermentasi kultur kelompok dengan menggunakan kepekatan MSG pada 4 gl -1, 8 gl -1, 12 gl -1 dan 16 gl -1 dan dijalankan secara triplikat. 3.3 Kepekatan MSG yang berbeza terhadap produktiviti lipid Aurantiochytrium sp. SW1 melalui kultur kelompok Dalam kajian ini, kepekatan MSG yang paling sesuai untuk mengoptimumkan penghasilan lipid ialah 8 gl -1 MSG di mana ia menunjukkan produktiviti lipid yang paling tinggi dan seragam. Aspek produktiviti lipid diambil kira kerana ia akan menunjukkan ciri penting pengkulturan optimum di mana sel berada dalam pertumbuhan yang aktif bagi penghasilan lipid dalam masa tertentu. Berdasarkan Rajah 3, hasil kajian ini menunjukkan produktiviti lipid tertinggi sel Aurantiochytrium sp. SW1 adalah semasa jam ke-48 sehingga jam ke-72 pengkulturan. Namun, sekiranya dilihat semula profil pertumbuhan (Rajah 1), kultur 72 jam tidak sesuai digunakan kerana pertumbuhan sel yang hampir terhenti dan kurang aktif berdasarkan maklumat kepekatan biojisim tanpa lipid yang diperoleh. Hal ini demikian kerana penyuapan sumber nitrogen bagi fermentasi kultur suap-kelompok dijalankan pada jam ke-60 sebelum kultur memasuki fasa pegun. Penyuapan MSG mampu merangsang semula kitaran sel dalam penghasilan biojisim dan seterusnya membantu dalam pengumpulan lipid Masa (jam) 4 g/l MSG 8 g/l MSG 12 g/l MSG 16 g/l MSG Rajah 3. Kesan kepekatan MSG yang berbeza terhadap produktiviti lipid Aurantiochytrium sp. SW1 melalui kultur kelompok dan dijalankan secara triplikat. 105

7 Kepekatan (g/l) Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech. 1, Perbandingan kaedah pengkulturan secara fermentasi kultur kelompok dan kultur suapkelompok dengan menggunakan kepekatan MSG yang optimum Bagi fermentasi kultur suap-kelompok (Rajah 4), penyuapan MSG pada jam ke-60 telah mendorong penghasilan biojisim yang lebih tinggi dan secara berterusan sehingga hari kelima pengkulturan iaitu sebanyak gl -1 telah dihasilkan. Bagi profil pengumpulan lipid, peratus lipid yang dihasilkan telah menurun dengan mendadak di mana hanya 33.26% lipid diekstrakkan jika dibandingkan dengan 43.58% lipid yang dikumpulkan dalam fermentasi kultur kelompok selepas penyuapan MSG (t=3). Peratus lipid tertinggi yang dikumpulkan adalah 36.66% sahaja pada masa tuaian 96 jam Rajah 4. Perbandingan kaedah pengkulturan secara fermentasi kultur kelompok dan kultur suap-kelompok terhadap profil pengumpulan lipid Aurantiochytrium sp. SW1 sepanjang- 120-jam-pengkulturan-dan-dijalankan-secara-triplikat. 4. Kesimpulan Kajian ini menunjukkan bahawa kepekatan MSG yang paling optimum untuk produktiviti lipid oleh Aurantiochytrium sp. SW1 ialah 8 gl -1. Penggunaan fermentasi kultur suap-kelompok untuk membolehkan penyuapan sumber nitrogen pada masa tertentu bagi mewujudkan kitaran penghasilan biojisim-lipid tidak dapat menandingi produktiviti lipid fermentasi kultur kelompok. Penghargaan Penghargaan diberikan kepada geran penyelidikan dari Kementerian Sains, Teknologi dan Inovasi Malaysia (ScienceFund SF1279), Kementerian Pendidikan Tinggi Malaysia, dan Universiti Kebangsaan Malaysia (GGPM ) kerana menaja kajian ini. Rujukan Kultur Kelompok Biojisim Lipid Masa (jam) Kultur Suap-kelompok Biojisim Lipid Borowitzka, M.A High-value products from microalgae-their development and commercialisation. Journal of Applied Phycology 25(3): Folch, J., Lees, M. & Sloane-Stanley, G.H Simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry 226: Gupta, A., Barrow, C., and Puri, M Omega-3 biotechnology: Thraustochytrids as a novel source of omega-3 oils. Biotechnology Advance 30:

8 Hu, Q., Sommerfeld, M., Jarvis, E., Ghirardi, M., Posewitz, M., Seibert, M. & Darzins, A Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal 54(4): Innis, S.M Dietary omega 3 fatty acids and the developing brain. Brain research 1237: Jiang, L.Q., Pei, H.Y., Hu, W.R., Ji, Y., Han, L. & Ma, G.X The feasibility of using complex wastewater from a monosodium glutamate factory to cultivate Spirulina subsalsa and accumulate biochemical composition. Bioresource Technology 180: Manikan, V., Mohd Sahaid, K., Mohd Hafez, M.I. & Aidil, A.M Improved prediction for medium optimization using factorial screening for docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp. SW1. American Journal of Applied Sciences 11(3): Mendes, A., Reis, A., Vasconcelos, R., Guerra, P. & Lopes, T Crypthecodinium cohnii with emphasis on DHA production: a review. Journal of Applied Phycology 21: Ochsenreither, K., Glück, C., Stressler, T., Fischer, L. & Syldatk, C Production strategies and applications of microbial single cell oils. Frontiers in Microbiology 7: Ratledge, C Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production. Biochimie 86(11): Reinehr, C.O. & Costa, J.A.V Repeated batch cultivation of the microalgae Spirullina platensis. World Journal of Microbiology and Biotechnology 22: Singh, S., Kate, B.N. & Banerjee, U.C Bioactive compounds from cyanobacteria and microalgae: an overview. Critical Reviews in Biotechnology 25: Stephens, E., Rossi I.L., King, Z., Mussgnug, J.H., Kruse, O., Posten, C., Borowitzka, M.A. & Hankamer, B An economic and technical evaluation of microalgal biofuels. Nature Biotechnology 28: