Antioksidativni sustav jetre pilića vakciniranih protiv Marekove bolesti

Transcription

1 Znanstveni rad: Antioksidativni sustav jetre pilića vakciniranih protiv Marekove bolesti Marta Šurbek 1, Ana Župčić 1, Lana Vranković 2, Blanka Beer Ljubić 2, Željko Gottstein 3, Hrvoje Mazija 3, Zvonko Stojević 2 Biserka Zidar 4, Jasna Aladrović 2 1 Studentice Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, Zagreb 2 Zavod za fiziologiju i radiobiologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, Zagreb 3 Zavod za bolesti peradi s klinikom 4 Veterinarska stanica, Zabok, Zabok Dopisni autor: izv. prof. dr. sc. Jasna Aladrović, Zavod za fiziologiju i radiobiologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, Zagreb; jasna.aladrovic@vef.hr 1

2 SAŽETAK Marekova bolest izaziva velike gubitke prilikom uzgoja te je uspješna profilaksa od presudnog značenja za proizvodnju. Cilj rada bio je istražiti antioksidativni odgovor jetrenog tkiva pilića u tovu nakon cijepljenja primjenom cjepiva HVT soj FC-126 (Lyomarex, Merial, SAD). U istraživanju je korišteno 300 muških pilića lake pasmine podijeljenih u četiri skupine. Prva skupina cijepljena je postupkom nebulizacije (A), druga skupina subkutano (B), treća postupkom nebulizacije s fiziološkom otopinom (C) dok je četvrta skupina netretirana kontrola (D). Uzorci jetre nakon žrtvovanja uzeti su prije cijepljenja te 3, 5, 7, 10, 14 i 21 dan nakon cijepljenja. U homogenatima tkiva određene su aktivnosti ukupne superoksid dismutaze (SOD), katalaze (KAT) i glutation peroksidaze (GSH-Px) te koncentracija lipidskih peroksida (TBARS). Porast aktivnost ukupne SOD (14. dan) nakon cijepljenja u jetrenom tkivu utvrđen je u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi s netretiranom kontrolom. Utvrđen je porast aktivnosti KAT u pilića cijepljenih postupkom nebulizacije i parenteralno u usporedbi s kontrolom 14. i 21. dan nakon vakcinacije. U ovom istraživanju aktivnost GSH- Px bila je značajno viša u pilića cijepljenih postupkom nebulizacije u usporedbi s kontrolom 3., 10. i 14. dana nakon vakcinacije. Također je utvrđena i značajno viša aktivnost GSH-Px u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi s pilićima cijepljenima subkutano 3. dan nakon vakcinacije. U ovom istraživanju pilići cijepljeni nebulizacijom i parenteralno imali su viši omjer KAT/SOD u usporedbi s kontrolom 14. dana vakcinacije. Cijepljenje protiv Marekove bolesti postupkom nebulizacije dovelo je do intenzivnije antioksidativne obranom jetre pilića u kasnijim danima nakon cijepljenja. Ključne riječi: Marekova bolest, cijepljenje, nebulizacija, jetra, antioksidativni sustav UVOD Marekova bolest (MDV, engl. Marek's disease virus) je limfoproliferativna virusna bolest kokoši, najčešće pilića, karakterizirana mononuklearnom inflitracijom perifernih živaca i drugih organa te stvaranjem limfoma u unutarnjim organima (BACON i sur., 2010.). Iako su danas razvijena cjepiva protiv ove bolesti, u peradarskoj industriji i dalje postoji strah od izbijanja; bolest izbija naglo, a ekonomski gubici su veliki (PURCHASE, 1985.). Uzročnik Marekove bolesti je limfotropni Herpesvirus, koji je prema ICTV-u (International Committee on Taxonomy of Viruses) klasificiran u alfaherpesviruse. Za sada su poznata 3 serotipa, od kojih se jedino serotip 1 (Gallid herpesvirus) navodi kao uzročnik te se MDV odnosi upravo na serotip 1. Protiv Marekove bolesti koristi se nekoliko vakcina čiji je razvoj počeo kasnih 2

3 1960-ih godina, ubrzo nakon izolacije virusa. Profilaktička cjepiva dobivena su od atenuiranog patogenog MDV i nepatogenih serotipova 2 i 3, čija se kombinacija kao polivalentna vakcina pokazala najučinkovitijom (WITTER, 1982.). Reaktivni kisikovi spojevi (ROS), kao npr. superoksidni radikal, vodikov peroksid i hidroksilni radikal, su visokoreaktivni spojevi koji kroz reakcije s ugljikohidratima, nukleinskim kiselinama, lipidima i proteinima mogu narušiti strukturu bioloških spojeva te tako utjecati i na njihovu funkciju. Takvi spojevi nastaju kao posljedica UV i radioaktivnog zračenja, ksenobiotika i teških metala, ali i kao produkti fiziološke stanične funkcije. Stvaranje reaktivnih kisikovih spojeva (ROS) i reaktivnih dušikovih spojeva (RNS) u zdravih aerobnih organizama otprilike je u ravnoteži s antioksidativnim zaštitnim sustavom. Oksidativni stres definira se kao pomak u ravnoteži između nastajanja reaktivnih kisikovih spojeva i antioksidativnog sustava, u korist reaktivnih kisikovih spojeva. Jetra predstavlja glavni organ napadnut od strane ROS-a. Parenhimske stanice su primarne stanice podložne oksidativnom stresu kao posljedica oštećenja tkiva. Mitohondriji, mikrosomi i peroksisomi u parenhimskim stanicama najčešće stvaraju ROS (LI i sur., 2015.). Ove spojeve inaktiviraju antioksidativne molekule kao što su enzimi superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza, kao i neenzimske molekule albumini, glutation, laktoferin, mokraćna kiselina, vitamini E, A i C (MICHIELS i sur., 1994.) Superoksid-dismutaza (SOD, EC ) jest enzim koji katalizira reakciju razgradnje superoksidnog radikala do molekule kisika i vodikova peroksida. U organizmu su utvrđena tri izoenzima SOD: bakar cink SOD, manganska SOD i ekstracelularna SOD. Ovi enzimi imaju specifičnu raspodjelu i ulogu u organizmu. Manganska SOD u jetri čini oko 10% aktivnosti ukupne SOD (HALLIWELL i GUTTERIDGE, 1999.) Glutation peroksidaza (glutation H 2 O 2 oksidoreduktaza; EC , GSH-Px) izdvojena je iz svih tkiva sisavaca u kojima se zbivaju oksidativni procesi. Visoka aktivnost određena je u jetri i bubrezima (WEITZEL i sur., 1990.). Glutation-peroksidaza štiti stanice od oksidacijskih oštećenja, uklanjajući vodikov peroksid i lipidne hidroperokside uz oksidaciju reduciranog glutationa. Identificirano je najmanje sedam izoenzima GSH-Px, i to citoplazmatska (cgsh-px ili GSH-Px1), gastrointestinalna (GI GSHPx ili GSH-Px2), plazmatska (pgsh-px ili GSH-Px3), fosfolipid-hidroperoksidna (PH-GSH-Px ili GSH-Px4) te glutation-peroksidaze GSH-Px5 i GSH-Px6 (ČEPELAK, 2009.). 3

4 Katalaza (EC ) također je enzim koji uklanja vodikov peroksid. Najveću aktivnost katalaza očituje u jetri i bubrezima dok mozak, srce, skeletni mišići i vezivno tkivo imaju nižu aktivnost (YU i sur., 1998.), ali ona varira ovisno o vrsti stanice. Također, aktivnost katalaze raste s dobi životinja, pretranslacijskom i posttranslacijskom regulacijom sinteze (YU i sur., 1998.). Cilj ovog rada bio je utvrditi koji način aplikacije (nebulizacija i subkutano) liofiliziranog cjepiva HVT soj FC-126 u pilića uzrokuje promjene u antioksidacijskom sustavu praćenjem aktivnosti ukupne superoksid dismutaze, katalaze i glutation peroksidaze. Određivanjem koncentracije lipidskih peroksida cilj je bio dobiti uvid u intenzitet stvaranja proizvoda oksidacije fosfolipida i nezasićenih masnih kiselina jetrenog tkiva odnosno stupanj i pojavu oksidacijskog stresa potaknutog cijepljenjem. MATERIJAL I METODE Za pokus su korišteni komercijalni netom izleženi muški pilići hibrida lakih pasmina. Pilići su držani u kavezima u prostoru prilagođenom pokusnom držanju peradi, a hrana i voda su dostupni ad libitum. Cijepljenje pilića načinjeno je komercijalnim aktivnim liofiliziranim cjepivom protiv Marekove bolesti. Cjepivo sadrži virus HVT, soj FC-126 (Lyomarex, Merial, SAD). Pilići u prvoj skupini cijepljeni su postupkom nebulizacije tijekom jedne minute (A), druga skupina subkutano (B), treća postupkom nebulizacije s fiziološkom otopinom tijekom jedne minute (C) dok je četvrta skupina netretirana kontrola (D) Uzorci jetre uzimani su prije cijepljenja te 3., 5., , 14. i 21. dana pokusa. Pilići su prije uzorkovanja omamljeni i žrtvovani s 80% CO 2. Uzorci jetrenog tkiva nakon vaganja su pohranjeni na -196 o C u tekući dušik tijekom 24 sata, a nakon toga do analize na -76 o C. Uzorci tkiva su homogenizirani u 0,14 mol/l KCl s teflon - staklo Schüthomogen plus homogenizatorom (Schütt labortechnik, Njemačka) pri 2800 okr/min uz hlađenje. Odnos mase tkiva i volumena pufera iznosio je 1:5. Tkivo jetre homogenizirano je 60 sekundi (4x15 sekundi s intervalima hlađenja 5 sekundi). Homogenati tkiva su centrifugirani pri 20000xg tijekom 30 minuta pri 4 o C (Sigma 3 K 15, Sigma, Njemačka), a dobivenim supernatantima određene su aktivnosti: ukupne superoksid dismutaze (SOD), glutation peroksidaze (GSH-Px) i katalaze te koncentracija lipidskih peroksida (TBARS) i bjelančevina. Aktivnosti ukupne superoksid dismutaze i glutation peroksidaze određene su gotovim kompletima tvrtke "Randox" (Irska) na automatskom analizatoru SABA 18 (AMS, Italija). Aktivnost katalaze je određena po metodi JOHANSSONA i BORG (1988). Metoda se osniva 4

5 na reakciji enzima s metanolom u prisustvu optmalne koncentracije vodikovog peroksida. Produkt reakcije je formaldehid čija se koncentracija mjeri spektrofotometrijski (Thermospectronic Helios delta, Unicam, Cambridge, Velika Britanija) s 4-amino-3- hydrazino-5-mercapto 1,2,4-triazole (Purpald) kao kromogenom na 470 nm. Koncentracija lipidskih peroksida u tkivima određena je probom po TROTTA i sur. (1982.) na uređaju Thermospectronic Helios delta (Unicam, Cambridge, Velika Britanija). Ovom metodom pri 532 nm mjeri se koncentracija malondialdehida i drugih reaktivnih produkta tiobarbiturne kiseline (TBARS) stvorenih peroksidacijom nezasićenih masti slobodnim radikalima. Apsorbancijski koeficijent 1,5 x 10 5 po PLACERU i sur. (1966.) koristi se za preračunavanje apsorbancije u mol/l. Koncentracija lipidskih peroksida izražena je po gramu bjelančevina tkiva. Koncentracija bjelančevina određena je metodom po LOWRY i sur. (1951.) s goveđim albuminom kao standardom. Aktivnosti antioksidativnih enzima i koncentracija lipidskih peroksida izražene su po gramu bjelančevina jetrenog tkiva. Rezultati su prikazani kao aritmetička sredina i standardna devijacija (aritmetička sredina±sd). Nakon provjere nomalnosti distribucije, značajnost razlika među rezultatima provjerena je neperametrijskim Kruskall-Wallis testom korištenjem računalnog programa Statistica, verzija 10. (StatSoft, Inc., Tulsa, SAD). Razlike se smatraju statistički značajnim ako je p 0,05. REZULTATI Aktivnosti antioksidativnih enzima i njihovih omjera u jetrenom tkivu pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti prikazane su u tablicama 1-3 i 5-6, dok je intenzitet lipidske peroksidacije naveden u tablici 4. Aktivnost ukupne SOD u jetrenom tkivu pilića cijepljenih cjepivom HVT soj FC-126 postupkom nebulizacije bila je značajno veća 5. i 14. dan nakon vakcinacije u usporedbi aktivnošću prije cijepljenja (p<0,05; tablica 1). Također je aktivnost ukupne SOD u pilića cijepljenih nebilizacijom bila je najviša 14. dan po vakcinaciji u usporedbi s 3., 5. i 21. danom (p<0,05). Ukupna SOD u pilića cijepljenih parenteralno bila najviša 14. dana nakon cijepljenja u odnosu na 3., 5. i 10. dan (p<0,05). Aktivnost ukupne SOD bila je značajno viša u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi s netretiranom kontrolom 14. dan nakon vakcinacije (p<0,05). 5

6 Tablica 1. Aktivnost superoksid-dismutaze (SOD) tijekom ispitivanog razdoblja u jetri pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 Grupe A B C D Aktivnost SOD (mu/g bjelančevina) Dani nakon vakcinacije ,03± 1,92 9,75± 12,23± 11,61± 9,75± 14,30± 10,46± 3,13 a 2,88 a 7,05 ab 6,40 ab 2,31 b 2,60 a 8,15± 9,20± 9,98± 7,99± 11,40± 11,38± 2,77 a 1,11 a 2,94 ab 1,82 a 1,17 b 5,14 ab 10,31± 1,70 10,88± 3,89 12,27± 2,31 9,83± 4,40 9,22± 2,21 10,43± 3,32 8,71± 2,15 9,27± 2,72 9,87± 2,60 9,68± 2,51 7,41± 2,38 11,10± A-pilići cijepljeni postupkom nebulizacije; B-pilići cijepljeni parenteralno (sc); C-pilići tretirani fiziološkom otopinom postupkom nebulizacije; D-netretirani pilići, kontrola; vrijednosti u redovima označene različitim ab superskriptima statistički značajno se razlikuju p 0,05; vrijednosti u stupcima masno otisnute statistički značajno se razlikuju p 0,05 Također je aktivnost KAT 21. dan nakon vakcinacije u pilića cijepljenih nebulizacijom bila značajno viša u usporedbi sa 10. i 7. danom (p<0,05). U pilića cijepljenih parenteralno aktivnost KAT bila je značano viša 14. dan nakon vakcinacije u usporedbi s 10. danom (p>0,05). Aktivnost KAT bila je značajno viša u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi s netretiranom kontrolom 14. dan nakon vakcinacije (p<0,05). Također je aktivnost KAT bila značajno niža u pilića vakciniranih nebulizacijom u odnosu na kontrolne piliće 3. dan nakon vakcinacije (p<0,05) te značajno viša u jetri pilića cijepljenih nebilizacijom i parenteralno u usporedbi s kontrolnim pilićima 14. i 21. dan nakon vakcinacije (p<0,05). Utvrđena je i značajno viša aktivnost KAT u pilića cijepljenih nebulizacjom u usporedbi s pilićima cijepljenima parenteralno 7. dan nakon vakcinacije (p<0,05; tablica 2). 1,61 Tablica 2. Aktivnost katalaze (KAT) tijekom ispitivanog razdoblja u jetri pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 6

7 Grupe A Aktivnost KAT (U/g bjelančevina) Dani nakon vakcinacije ,49± ± 358,26± 328,85± 549,32± 843,31± 82,07 ac abc 224,63 bc 217,71 b 188,40 a 213,73 a B 1290,18± 592,45± 544,77± 298,87± 347,82± 611,43± 500,55± 169, bcd 232,38 bcd 158,71 acd 255,78 c 127,11 d 198,30 bcd C 773,55± D 809,61± ,99± 105,01 346,30± 193,33 348,80± 156,92 98,15± 77,67 298,17± 199,98 350,82± 253,07 480,91± 228,65 184,40± 108,68 284,03± 125,07 209,65± 130,24 A-pilići cijepljeni postupkom nebulizacije; B-pilići cijepljeni parenteralno (sc); C-pilići tretirani fiziološkom otopinom postupkom nebulizacije; D-netretirani pilići, kontrola; vrijednosti u redovima označene različitim ab superskriptima statistički značajno se razlikuju p 0,05; vrijednosti u stupcima masno otisnute statistički značajno se razlikuju p 0,05 U pilića cijepljenih nebulizacijom aktivnost GSH-Px bila je značajno viša 10. dan nakon vakcinacije u usporedbi s 3. i 21. danom (p<0,05). U pilića cijepljenih parenteralno aktivnost GSH-Px bila je značajno viša 5. dan u usporedbi s 10. i 14. danom (p<0,05; tablica 3). Aktivnost GSH-Px bila je značajno viša u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi sa kontrolom 14., 10. i 3. dan vakcijacije (p<0,05). Utvrđena je i značajno viša aktivnost GSH- Px u pilića cijepljenih nebulizacjom u usporedbi s pilićima cijepljenima parenteralno 3. dan nakon vakcinacije (p<0,05). Tablica 3. Aktivnost glutation peroksidaze (GSH-Px) tijekom ispitivanog razdoblja u jetri pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 Grupe A Aktivnost GSH-Px (U/g bjelančevina) Dani nakon vakcinacije C 80, ± 290,05± ± 378,01± 370,09± 163,81± 239,70± 57,02 c bc 120,98 b 200,06 b 27,39 bc 44,84 a B ± 280,72± 275,67± 206,36± 178,32± 224,89± 255,52± b 34,94 b 63,05 b 36,06 a 18,85 a 74,93 ab D ± ,90± 59,05 191,63± 46,04 334,10± 47,54 295,88± 62,92 194,96± 38,38 141,67± 30,86 152,30± 38,17 181,80± 38,99 184,47± 39,55 216,67± A-pilići cijepljeni postupkom nebulizacije; B-pilići cijepljeni parenteralno (sc); C-pilići tretirani fiziološkom otopinom postupkom nebulizacije; D-netretirani pilići, kontrola; vrijednosti u redovima označene različitim 37,80 7

8 ab superskriptima statistički značajno se razlikuju p 0,05; vrijednosti u stupcima masno otisnute statistički značajno se razlikuju p 0,05 Koncentracija TBARS u pilića cijepljenih nebulizacijom bila značajno niža 5. dan nakon vakcinacije u usporedbi s 7., 10. i 14. danom (p<0,05). U pilića cijepljenih parenteralno koncentracija TBARS bila je značajno viša 7., 10. i 14. dan nakon vakcinacije u usporedbi sa 3. i 21. danom (p<0,05; tablica 4). Tablica 4. Koncentracija lipidskih peroksida (TBARS) tijekom ispitivanog razdoblja u jetri pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 Grupe A Aktivnost TBARS (µmol/l) Dani nakon vakcinacije ,94±0,23 bc 0.70±0.15 a 1,28±0,20 c 1,55±0,32 bc 1,31±0,05 bc 0,61±0,27 abc B 1,71±0, ±0.09 a 0,85±0,29 ab 1,28±0,15 b 1,41±0,18 b 1,12±0,07b 0,67±0,18 a C 0.86±0.12 0,62±0,15 1,77±0,75 1,61±0,18 1,63±0,50 0,91±0,33 D 0.85±0.27 0,84±0,22 1,36±0,10 1,53±0,24 1,51±0,29 0,69±0,16 A-pilići cijepljeni postupkom nebulizacije; B-pilići cijepljeni parenteralno (sc); C-pilići tretirani fiziološkom otopinom postupkom nebulizacije; D-netretirani pilići, kontrola; vrijednosti u redovima označene različitim ab superskriptima statistički značajno se razlikuju p 0,05; vrijednosti u stupcima masno otisnute statistički značajno se razlikuju p 0,05 U pilića cijepljenih nebulizacijom omjer GSH-Px/SOD je bio značajno niži 14. dan nakon vakcinacije u usporedbi s 21. danom (p<0,05). U pilića cijepljenih parenteralno omjer GSH-Px/SOD je bio značajno niži 14. dan vakcijacije u usporedbi s 3., 5. i 7. danom (p<0,05). Pilići cijepljeni nebulizacijom imali su značajno niži omjer GSH-Px/SOD u usporedbi s kontrolom 14. dan nakon vakcinacije (p<0,05; tablica5). Tablica 5. Omjer glutation peroksidaze (GSH-Px) i superoksid-dismutaze (SOD) tijekom ispitivanog razdoblja u jetri pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 Grupe A Omjer GSH-Px/SOD Dani nakon vakcinacije B 0,03± 0,04± 0,03± ± 0,04± 0,05± ± ± ac ac ac 0,04 ac b c 0,03± 0,03± 0,03± ± ± b b b ab a ab C 0,03± ± ± ± ± 0,03± 8

9 D 0,03± 0,03± 0,03± A-pilići cijepljeni postupkom nebulizacije; B-pilići cijepljeni parenteralno (sc); C-pilići tretirani fiziološkom otopinom postupkom nebulizacije; D-netretirani pilići, kontrola; vrijednosti u redovima označene različitim ab superskriptima statistički značajno se razlikuju p 0,05; vrijednosti u stupcima masno otisnute statistički značajno se razlikuju p 0,05 ± ± ± Pilići cijepljeni nebulizacijom imali su značajno niži omjer KAT/SOD 14. dan nakon vakcinacije u usporedbi s 3., 7. i 21. danom (p<0,05). Pilići cijepljeni parenteralno imali su značajno viši omjer KAT/SOD 3. dan nakon vacinacije u usporedbi sa 7. i 10. danom (p<0,05). Pilići cijepljeni nebulizacijom i parenteralno imali su viši omjer KAT/SOD u usporedbi s kontrolom 14. dana vakcinacije (p<0,05). Također su pilići cijepljeni parenteralno imali viši omjer KAT/SOD u usporedbi s kontrolom 21. dan nakon vakcinacije (p<0,05; tablica 6). Tablica 6. Omjer katalaze (KAT) i superoksid-dismutaze (SOD) tijekom ispitivanog razdoblja u jetri pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 Grupe A Omjer KAT/SOD Dani nakon vakcinacije B 0,15± 0,08± C 0,08± 0,08± 0,06± 0,04± 0,05± 0,04± 0,08± 0,05 a abc c 0,05 abc b c 0,06± 0,03± 0,04± 0,05± 0,05± 0,03 a 0,03 ab b 0,03 b ab ab D 0,08± 0,03 0,04± 0,04± 0,03 A-pilići cijepljeni postupkom nebulizacije; B-pilići cijepljeni parenteralno (sc); C-pilići tretirani fiziološkom otopinom postupkom nebulizacije; D-netretirani pilići, kontrola; vrijednosti u redovima označene različitim ab superskriptima statistički značajno se razlikuju p 0,05; vrijednosti u stupcima masno otisnute statistički značajno se razlikuju p 0,05 RASPRAVA 0,04± ± 0,03± 0,04± 0,05± ± 0,04± ± Porast aktivnost ukupne SOD (14. dan), GSH-Px (5., 10. i 14. dan) i KAT (14. i 21. dan) u jetrenom tkivu u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi s netretiranom kontrolom mogao bi ukazivati na aktivnu ulogu stanica jetre u antioksidativnom odgovoru na unos virusa. Glavni antioksidativni enzim u tikvu jetre su bakar cink SOD i manganska SOD 9

10 (Cu/Zn SOD, Mn/SOD) koji se većinom nalaze u citoplazmi i mitohondrijima i važni su za smanjeno stvaranje ROS (UCAR i sur., 2013.). U ovom radu aktivnost ukupne SOD u pilića cijepljenih nebulizacijom i parenteralno bila je značajno viša 14. dan nakon vakcinacije u usporedbi s 3., 5. danom te je aktivnost ukupne SOD bila je značajno viša u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi s netretiranom kontrolom 14. dan nakon vakcinacije. Slično GSH-Px, i KAT kataliziraju razgradnju vodikovog peroksida, no za razliku od GSH-Px koji za katalizu treba koenzim glutation, KAT djeluje samostalno. Prilikom upalnih procesta dolazi do smanjenja aktivnost KAT što ukazuje na iscrpljivanje kompenzatornih mehanizama antioksidativne obrane (NORDBERG i sur., 2001.), dok je u našem istraživanju zabilježen porast aktivnosti KAT u pilića cijepljenih nebulizacijom i parenteralno u sporedbi s kontrolom 14. i 21. dan nakon vakcinacije kao rezultat aktivacije antioksidativnih mehanizama stanica jetre. Sljedeći važan antioksidativni enzim u tkivu jetre je GSH-Px (UCAR i sur., 2013.). U ovom istraživanju aktivnost GSH-Px bila je značajno viša u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi sa kontrolom 3. dan, 10. I 14., dan nakon vakcijacije. Sličan porast aktivnosti GSH- Px u tkivu pluća trećeg, 14 i 21. dana nakon cijepljenja postupkom nebulizacije protiv Marekove bolesti utvrdili su ALADROVIĆ i sur. (2009.). Također je utvrđena i značajno viša aktivnost GSH-Px u pilića cijepljenih nebulizacijom u usporedbi s pilićima cijepljenima parenteralno 3. dan nakon vakcinacije. Povećana aktivnost ovog enzima ukazuje na povećano stvaranje vidikova peroksida (YILMAZ i sur., 2004.). Povećana stimulacija antioksidativnog sustava dovodi do povećanja omjera GSH- Px/SOD te KAT/SOD, što štiti jetreno tkivo od oksidacije spriječavajući akumulaciju proizvoda lipidskih peroksida (RAMACHANDRAN i sur., 2002.). U ovom istraživanju pilići cijepljeni nebulizacijom i parenteralno imali su viši omjer KAT/SOD u usporedbi s kontrolom 14. dana nakon vakcinacije, iz čega proizlazi kako je u tome razdoblju došlo do jače stimulacije antioksidativnog sustava. Prema rezultatima ovoga istraživanja može se zaključiti kako primjena cjepiva HVT FC-126 različitim postupcima rezultira različitim antioksidativnim odgovorom te da postupak unošenja cjepiva protiv Marekove bolesti nebulizacijom dovodi do aktivacije antioksidativnog sustava jetre pilića i to naročito u kasnijim danima nakon cijepljenja. LITERATURA 10

11 ALADROVIĆ, J., S. MILINKOVIĆ-TUR, B. BEER LJUBIĆ, Ž. GOTTSTEIN, H. (2009): Učinak cijepljenja protiv Marekove bolesti na atioksidativni sustav pluća pilića. Zbornik II. simpozija peradarski dani s međunarodnim sudjelovanjem, , Poreč, Hrvatska, pp BACON, L.D., R.L.WITTER, R.F. SILVA (2010): Characterization and experimental reproduction of peripheral neuropathy in White Legghorn chickens. Avian Pathology 30, ČEPELAK, I. (2009): Slobodni radikali i antioksidansi. U: Čvorišćec, D., I. Čepelak: Štrausova medicinska biokemija. Medicinska naklada Zagreb, HALLIWELL, B., J. M. C. GUTTERIDGE (1999): Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press. Oxford. LI, S., H.Y. TAN, N. WANG, Z.J. ZHANG, L. LAO, C.W. WONG, Y. FENG (2015): The role of oxidative stress and antioxidants in liver diseases. International Journal of Molecular Sciences 16, JOHANSSON, L. H., L. A. H: BORG (1988): A spectrophotometric method for determination of catalase activity in small tissue samples. Anal. Biochem. 174, LOWRY, O. H., N. J. ROSEBROUGH, A. L. FARR, R. J. RENDAL (1951): Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, MICHIELS, C. M., M. RAES, O. TOUSSAINT, J. REMACLE (1994): Importance of Seglutathione peroxidase, catalase and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress. Free Rad. Biol. Med. 17, NORDBERG, J., E. S. J. ARNÉR (2001): Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Rad. Biol. Med. 11, PLACER, Z. A., L. L. CUSHMAN, B. CONNOR JOHNSON (1966): Estimation of product of lipid peroxidation (malonyl dialdehyde) in biochemical systems. Anal. Biochem. 16, PURCHASE, H.G. (1985): Clinical disease and its economic impact. In: Marek's Disease: Scientific Basis and Methods of Control, RAMACHANDRAN, H.D., K. NARASIMHAMURTHY, P.L. RAINA (2002.): Effect of oxidative stress on serum and antioxidant enzymes in liver and kidney of rats and their modulation through dietary factors. Indian Journal of Experimental Biology, 40,

12 TROTTA R. J., S.G. SULLIVAN, A. STERN (1982): Lipid peroxidation and hemoglobin degeneration in red blood cells exposed to t-butyl hydroperoxide. Biochem. J. 204, UCAR, F., S. SEZER, S. ERDOGAN, S. AKYOL, F. ARMUTCU, O. AKYOL (2013): The relationship between oxidative stress and non-alcoholic fatty liver disease: its effects on the development of non-alcoholic steatohepatitis. Redox Report, 18:4, WEITZEL, F., F. URSINI, A. WENDEL (1990): Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase in various mouse organs during selenium deficiency and repletion. Biochem. Bioph. Acta 1036, WITTER, R.L. (1982): Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strains of Marek s disease virus, Avian Pathology 11, YILMAZ, H.R., E. UZ, N. YUCEL, I. ALTUNTAS, N. OZCELIK (2004): Protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in diabetic rat liver. J. Biochem. Molecular Toxicology, 18:4, YU, X. X., J. K. DRACKLEY, J. ODLE (1998): Food Deprivation Changes Peroxisomal - Oxidation Activity but Not Catalase Activity during Postnatal Development in Pig Tissues. J. Nutr. 128, ABSTRACT Effect of vaccination against Marek s disease on liver antioxidative system in chickens Marek's disease causes great losses in breeding and a successful prophylaxis is of a crucial importance for production. The aim of study was to examine response of lung antioxidative system in chicken after vaccination with vaccine HVT FC 126 (Lyomarex, Merial, SAD). Trial was performed on 300 male chickens of light hybrids, separated in four groups. One group was vaccinated by means of nebulisation (A), second group was vaccinated subcutaneously (B), third group received saline solution by means of nebulisation (C) and fourth group was not treated (D). Samples of lung tissue were taken before vaccination and on day 3, 5, 7, 10, 14 and 21 days after vaccination. Activities of total superoxide dismutase (TSOD), catalase (KAT), glutathione peroxidise (GSH-Px) as well as concentration of lipid peroxides (LPO) was measured in tissue homogenates. Increased 12

13 activity of total SOD (day 14) in liver tissue of chicks vaccinated by nebulisation compared to untreated control was determined. Increase in KAT activity in chickens vaccinated by nebulisation and parenterally in comparison with control 14 th and 21 st day after vaccination was laso determined. In this study, GSH-Px activity was significantly higher in chickens vaccinated by nebulization compared to control on days 3, 10 and 14 of the day of vaccination. Significant higher activity of GSH-Px in chickens vaccinated by nebulization was also established compared with chickens vaccinated subcutaneously on 3rd day of vaccination. In this study, chickens vaccinated by nebulisation and subcutaneously had a higher ratio of KAT/SOD compared to the control on the 14 th day of vaccination. The method of introducing a vaccine against Marek's disease by nebulization resulted in more intensive antioxidative protection of chicken liver later during the trial. Key words: Marek's disease, vaccination, nebulization, liver, antioxidative system 13