Jure Krasić Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na oksidativni stres u mozgu štakora

Transcription

1 Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Jure Krasić Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na oksidativni stres u mozgu štakora Diplomski rad Zagreb, 2015.

2 Ovaj rad je izrađen na Zavodu za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom izv.prof.dr.sc. Domagoja Đikića, Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra eksperimentalne biologije.

3 TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na oksidativni stres u mozgu štakora Jure Krasić Rooseveltov trg 6, Zagreb, Hrvatska Prethodna toksikološka istraţivanja ukazuju da su krvno moţdana barijera i cirkulacija središnjeg ţivčanog sustava vrlo osjetljivi na učinke lijekova s vazodilatacijskim ili antikoagulativnim svojstvima. Na staničnoj razini, dobro su opisani štetni učinci oksidativnog stresa uzrokovanog lijekovima uobičajenima u domaćinstvu, koji se uzimaju bez recepta (acetilsalicilna kiselina) te biljnih lijekova i tableta (npr. ginko) ili lijekova na recept s antikoagulativnim svojstvima (varfarin). Mnogo manje se zna o međusobnim interakcijama navedenih tvari na razine oksidativnog stresa, osobito u mozgu. U okviru ovog rada štakori soja Y59 tretirani su dnevno s odgovarajućim preporučenim dozama kombinacija acetilsalicilne kiseline, ginka i varfarina, tijekom 15 dana. Razina oksidativnog stresa procijenjena je mjerenjem četiri markera oksidativnog stresa; superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT), glutationa (GSH) i malondialdehida (MDA) u različitim regijama mozga. Rezultati su pokazali promijenjene razine oksidacijskog stresa u prefrontalnom korteksu, kortikalnoj regiji i malom mozgu izloţenih ţivotinja. Ove promjene ukazuju na sinergistički toksični potencijal izazvan simultanim uzimanjem navedenih lijekova. (47 stranica, 4 tablice, 22 slike, 35 literaturna navoda, jezik izvornika: Hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici Ključne riječi: aspirin, varfarin, ginko (Ginkgo biloba), Centella asiatica, oksidativni stres, mozak Voditelj: izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić, Ocjenitelji: Rad prihvaćen:

4 University of Zagreb BASIC DOCUMENTATION CARD Faculty of Science Division of Biology Graduation Thesis The effects of vasodilators and anticoagulants on the oxidative stress levels of the rat brain Jure Krasić Rooseveltov trg 6, Zagreb, Croatia Previous toxicological research showed that blood brain barrier and brain vascular system are highly susceptible to the effects of pharmaceuticals with vasodilatation or anticoagulative properties. The adverse effects on cellular oxidative stress caused by over the counter (OTC) household drugs (acetylsalicylic acid), herbal remedies and pills (for example ginkgo) or prescription drugs (warfarin) are well described. Much less is known about mutual interaction between these substances on oxidative stress levels especially in the brain. Within this study Y59 rats were treated daily with corresponding recommended doses and combinations of acetylsalicylic acid, ginkgo and warfarine during 15 days. Four markers of oxidative stress were assessed; superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), gluthathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in various brain regions. The results have shown changes of oxidative stress levels in prefrontal cortex, cortical regions and cerebellum of exposed animals. These changes implicate synergistic and potentiated toxic potential of combinations of named drugs. (47 pages, 4 tables, 22 figures, 35 references, original in: Croatian) Thesis deposited in the Central Biological Library Key words: aspirin, warfarine, ginkgo (Ginkgo biloba), Centella asiatica, oxidative stress, brain Supervisor: Dr. Domagoj Đikić, Assoc. Prof. Reviewers: Thesis accepted:

5 Sadržaj: 1 Uvod 1.1 Oksidativni stres Superoksid dismutaza (SOD Katalaza Glutation peroksidaza (GPx) Mozak Klasični lijekovi Acetilsalicilna kiselina Varfarin Biljni pripravci Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji Ginko Gotu kola Borovnica Vulkan Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka Ginko i varfarin Ginko i acetilsalicilna kiselina Cilj istraţivanja 18 2 Materijali i metode Materijali Metode Tretman ţivotinja Izolacija organa i obrada tkiva Određivanje proteina metodom po Lowryju Količina ukupnog glutationa (GSH) Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze Mjerenje količine lipidne peroksidacije Statistička analiza podataka 25 3 Rezultati Aktivnost katalaze Aktivnost SOD Koncentracija GSH Koncentracija MDA Saţeti prikaz promjena u uzorcima 38 4 Rasprava 40 5 Zaključak 43 6 Popis literature 44

6 1. Uvod 1.1 Oksidativni stres Neravnoteţa između oksidansa i antioksidansa (u korist oksidansa) se naziva oksidativnim stresom. Oksidativni stres uzrokuje štetne događaje poput lipidne peroksidacije i oksidativnog oštećenja DNA, ali i regulira fiziološke procese i unutarstanični prijenos signala. Oksidansima nazivamo molekule i ione koji imaju nesparene elektrone pa su zbog toga reaktivniji i nestabilniji. Najčešći oksidansi su reaktivni kisikovi radikali (ROS) i reaktivni dušikovi radikali (RNS) (Yoshikawa i Naito 2002). Oksidansi nastaju endogenim metaboličkim reakcijama, kao posljedica ionizirajućeg zračenja, hiperoksije, izloţenosti ozonu i dimu te u reakcijama s teškim metalima (Birben i sur. 2012). Slika 1. Prikaz ravnoteţe i neravnoteţe sustava oksidativnog stresa (Preuzeto od oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20he alth.pdf ) ROS (eng. Reactive oxygen species) su najprisutniji izvor oksidativnog stresa u stanicama, a u njih ubrajamo superoksidni radikal (O - 2 ), hidroksilni radikal (. OH) koji je najreaktivniji, peroksilni radikal (R. O 2 ), alkoksilni radikal (RO. ), hipokloritnu kiselinu (HClO), ozon (O 3 ), singletni kisik ( 1 g O 2 ) i vodikov peroksid (H 2 O 2 ) (Slika 2.) (Birben i sur. 2012).

7 Slika 2. Najčešći kisikovi radikali i reakcije koje ih proizvode (Preuzeto s - ROS-ovi nastaju neezimatski, Fentonovom i Haberovom reakcijom (Slika 3.) i enzimatski (monoamin oksidazom u mitohondrijima u procesu nastanka ATP-a, NADPH oksidazom/oksidativnim praskom, ksantin oksidoreduktazom, mijeloperoksidazom u eozinofilima i neutrofilima, u procesu stvaranja hipoklorične kiseline itd.). Funkcija ROS-ova u stanicama je raznolika: posreduju fagocitozu, apoptozu, reakcije detoksifikacije, sudjeluju u inflamatornim procesima, uključeni su u signalne puteve odrţavanja stanične homeostaze itd. ROS-ovi reguliraju razne metaboličke i stanične procese uključujući proliferaciju i migraciju stanica, ekspresiju gena, imunost i zacjeljivanje. Glavna mjesta nastanka ROS-ova u stanicama su mitohondriji i endoplazmatski retikulum (Birben i sur. 2012). Slika 3. Fentonova i Haber-Weissova reakcija (Preuzeto s - Oksidativni stres je povezan s patogenezom brojnih bolesti poput astme (disfunckija mitohondrija), ateroskleroze (oksidativna modifikacija LDL-a), Alzheimerove i Parkinsonove bolesti (Noori 2012). Stanične membrane lako oksidiraju u prisutnosti reaktivnih radikala zbog velike koncentracije nezasićenih masnih kiselina u membranama. Reakcija reaktivnih radikala i lipidne membrane uzrokuje lipidnu peroksidaciju, koja rezultira formiranjem lipidnog hidroperoksida, koji se moţe dalje razgraditi u aldehid poput malonaldehida ili 4- hidroksi-nonenala. Posljedice lipidne peroksidacije su promijenjena membranska fluidnost, cross-linking membranskih proteina te nastajanje lipid-protein i lipid-dna udruţivanja koji mogu oteţavati funkcioniranje stanice. Proteini mogu biti direktno i indirektno oštećeni u interakciji s reaktivnim radikalima, što rezultira peroksidacijom, promjenama u tercijarnoj

8 strukturi, proteolitičkom degradacijom i fragmentacijama. DNA, unatoč tome što je stabilna i dobro zaštićena molekula, moţe doći u interakciju s reaktivnim radikalima i proći razna oštećenja, poput modifikacije DNA baza, jednolančanih i dvolančanih lomova DNA, gubitka purina, oštećenja na deoksiriboznim šećerima i oštećenja sustava popravka DNA. Posljedica oštećenja DNA je modifikacija genetskog materijala koja rezultira staničnom smrti, mutacijama, karcinogenezom i starenjem (Kunwar i Priyadarsini, 2011). Nekontrolirana proizvodnja reaktivnih radikala moţe dovesti do njihove akumulacije i uzrokovati oksidativni stres u stanicama. Zbog toga su stanice evolucijski stekle brojne obrambene mehanizme (Kunwar i Priyadarsini 2011). Prva linija obrane je prevencija stvaranja reaktivnih radikala, bilo izbjegavanjem sunčevog zračenja traţenjem zaklona ili pakiranjem DNA u kromatin da bi se zaštitio genetski materijal. Kelacija metala je bitan faktor u kontroli lipidne peroksidacije i fragmentacije DNA, tako da su metal-vezujući proteini (feritin, transferin itd.) bitni u prevenciji oštećenja. Također postoje i enzimatski sustavi, poput glutation-s-transferaze, koji sprječavaju formiranja reaktivnih radikala katalizom stvaranja tioetera iz tiola i glutationa djelovanjem citokroma P450. Druga linija obrane je presretanje postojećih reaktivnih radikala koje moţe biti posredovano neezimatskim antioksidansima ili enzimatskim antioksidansima. Neenzimatsko presretanje uključuje prijenos od osjetljivijih dijelova stanice do specijalnih kompartimenata gdje se reaktivni radikali prevode u nereaktivne i neradikalne metabolite - tu spadaju vitamini C i E, glutation itd.. Sve stanice eukariotskih organizama sadrţe jake antioksidativne enzime. Tri glavne skupine tih enzima su superoksid dismutaze (SOD), katalaze i glutation peroksidaze (GPx). Zadnji korak obrane je faza popravka staničnim mehanizmima (Slika 4.) (Sies 1997).

9 Slika 4. Shematski prikaz enzimatskog i neenzimatskog antioksidativnog sustava (Preuzeto s - ) Superoksid dismutaza (SOD) Superoksid dismutaza je najvaţniji antioksidativni enzim za sve tipove stanice jer je superoksid najčešći ROS proizveden iz raznih izvora. SOD ima tri oblika, CuZn-SOD, Mn- SOD i EC-SOD koji su široko rasprostranjeni u svim tkivima čovjeka. Mn-SOD je lokaliziran u mitohondrijskom matriksu. EC-SOD je primarno lokaliziran u ekstracelularnom matriksu, osobito u područjima koja sadrţe velike količine kolagenih vlakana tipa I i oko plućnih i sistemskih ţila. Općenito, CuZn-SOD i Mn-SOD se smatraju glavnim presretačima superoksidnih radikala. SOD prevodi superoksidne radikale nastale aerobnim metabolizmom u manje reaktivne vrste (kisik i vodikov peroksid) (Slika 5.), čija se redukcija dalje nastavlja s katalazom i glutation peroksidazom (Birben i sur., 2012).

10 Slika 5. Shema djelovanja SOD-a u mitohondrijima (Preuzeto s Katalaza Katalaza je tetramerni enzim koji se sastoji od četiri identične podjedinice, od kojih svaka sadrţi jednu hem grupu. Pri visokim koncentracijama vodikovog peroksida u stanici katalizira reakciju dvije molekule vodikovog peroksida u dvije molekule vode i molekularni kisik. Pri niskim koncentracijama vodikovog peroksida, uz prisutnost donora vodika, djeluje peroksidativno, uklanja vodikov peroksid uz oksidaciju supstrata (Slika 6.). Katalaza štiti stanice od endogeno proizvedenog vodikovog peroksida. Iako katalaza nije esencijalna za sve tipove stanica u standardnim uvjetima, igra vaţnu ulogu u stjecanju tolerancije na oksidatvni stres u adaptivnom odgovoru stanica. Stopa preţivljavanja štakora izloţenih 100% kisiku je povećana kad su se liposomi koji sadrţe SOD i katalazu ubrizgali intravenozno prije i za vrijeme izloţenosti 100% kisiku (Mates i sur. 1999). Katalaza veţe NADPH radi sprječavanja oksidativne inaktivacije vodikovim peroksidom dok ga reducira u vodu (Birben i sur., 2012).

11 Slika 6. Reakcije katalizirane katalazom (Preuzeto s Glutation peroksidaza (GPx) Glutation peroksidaza je glikoprotein koji sadrţi seleno-cisteinski ostatak u svakoj od svoje četiri podjedinice i esencijalan je za enzimsku aktivnost. Glutation peroksidaza katalizira redukciju hidroperoksida pomoću glutationa, štiteći time stanice sisavaca od oksidativnog oštećenja. Metabolizam glutationa je jedan od esencijalnih antioksidativnih obrambenih mehanizama. Kod sisavaca postoji pet izoenzima GPX, koji su prisutni u svim stanicama i tkivima i čija razina ovisi o tipu tkiva. Glutation peroksidaza reducira lipidne hidroperokside i vodikov peroksid u odgovarajuće alkohole i vodu, koristeći glutation kao donor elektrona koji se oksidira do glutationdisulfida (GSSG) (Slika 7.). Iako GPX i katalaza oboje kataliziraju redukciju vodikovog peroksida, samo GPX moţe reducirati lipidne i druge organske hidroperokside koji su glavni uzrok niskih razina oksidativnog stresa (Mates i sur. 1999). Slika 7. Shema djelovanja glutation peroksidaze (Preuzeto s -

12 1.2 Mozak Mozak je središnji organ ţivčanog sustava kod svih kraljeţnjaka i većine beskraljeţnjaka. Mozak se nalazi u glavi, smješten blizu primarnih senzoričkih organa i najkompleksniji je organ u kraljeţnjaka. Fiziološka funkcija mozga je ispoljavanje centralizirane kontrole nad organima tijela, što omogućuje brze i koordinirane odgovore na promjene u okolišu. Osnovni tipovi odgovora, poput refleksa, mogu biti posredovani leđnom moţdinom ili periferalnim ganglijima, ali sofisticirana usmjerena kontrola ponašanja, zasnovana na kompleksnim senzoričkim ulaznim signalima, zahtijeva sposobnosti integriranja informacija kakve ima centralizirani mozak (Pelvig i sur. 2008). Mozak se primarno sastoji od dvije skupine stanica - neurona i glija stanica. Glija stanice sluţe za strukturalnu potporu, metaboličke funkcije, izolaciju, obranu, usmjeravanje razvoja i popravak, dok neuroni imaju jedinstvenu sposobnost slanja signala specifičnim stanicama preko velikih udaljenosti. Signali putuju preko aksona (mijelinizirano tanko protoplazmičko vlakno neurona) u obliku elektrokemijskih izboja (akcijskog potencijala), a podraţuju druge neurone preko sinapsi (specijalizirane pukotine). Akcijski potencijal putuje niz akson, dolazi do sinapse, potiče lučenje neurotransmitera u sinapsu, koji se veţu na receptorne molekule u membrani ciljne stanice (Kandel i sur. 2000). Eksperimentalno, studijama oksidativne ravnoteţe se pristupa na dva načina: genetskom eliminacijom antioksidativnog mehanizma i augmentacijom antioksidativne obrane. Prvim načinom je pokazano kako je utišavanje Cu/Zn SOD u miševa povezano s povećanom stopom neuronalnih oštećenja i smrti. Eliminacija mitohondrijskog SOD-a je pokazala drastičnije učinke, koji su letalni u neonatalnom periodu. Miševi bez ekspresije Mn-SOD, uz zatajenje srca, pate od poremećaja u CNS-u poput mitohondrijske vakuolizacije i oksidacije lipidnih zaliha. Miševi s niskim razinama glutation peroksidaze su osjetljiviji na ishemiju i neurotoksine. Miševi deficijentni u transportnom proteinu vitamina E razvijaju ataksiju i neurodegenerativne bolesti, dok je povećan unos vitamina E pokazao da usporava progresiju Alzheimerove bolesti (Browne i sur. 1999). Povećana koncentracija metala (poput bakra i cinka) ubrzava nakupljanje amiloida. Za redoks aktivne metale (poput bakra i ţeljeza) se pretpostavlja da sudjeluju u raznim oksidativnim procesima, poput oksidacije proteina inducirane Aβ peptidom i inaktivacije antioksidativnih mehanizama poput hem oksigenaze. Kelacija bakra Clioquinolom je pokazala da usporava nakupljanje amiloidnih naslaga u Alzheimereovoj bolesti kod miševa (Huang i sur. 1999).

13 Genetski i biokemijski pristupi poboljšavanju antioksidativne obrane idu u prilog teoriji kako je oksidativni stres kritičan mehanizam u neurodegeneracijskim putevima. Prekomjerna ekspersija Cu/Zn SOD-a kod transgeničnih miševa i štakora pruţa značajnu zaštitu od ishemije, hladnog edema i neurotoksina i promiče preţivljavanje neurona u kulturi stanica i nakon transplantacije. Genetski inducirana povećana ekspresija Tn-SOD-a djeluje protektivno na mitohondrije i stanice od oksidativnog stresa. Povećana ekspresija vanstaničnog SOD-a ili glutation peroksidaze je pokazala protektivan učinak od raznih neurotoksina na CNS. Studije na mušicama i gujavicama su pokazale da povećana ekspresija SOD-a i katalaze značajno produţuje njihov ţivotni vijek. Kod knockout mušica, moţe se povećati ţivotni vijek do 60% ţivotnog vijeka divljeg tipa ekspresijom SOD-a u motornim neuronima. Nova saznanja impliciraju da antioksidativni enzimi i mali antioksidansi (vitamin E i C, kelacija metala) igraju vaţnu ulogu u zaštiti CNS-a (Ischiropoulos i Beckman 2003). Slobodne radikale mogu proizvesti sve stanice mozga, npr. NADPH oksidazu (enzim koji katalizira produkciju superoksida kod fagocita) ne eksprimiraju samo mikroglija stanice, već i neuroni i astroglija. Superoksid ni vodikov peroksid nisu osobito toksični, dok se hidroksilni radikal često navodi kao jedan od najtoksičnijih slobodnih radikala in vivo. Proizvodnja hidroksilnog radikala Haber-Weissovom ili Fentonovom reakcijom je prespora i prenespecifično je reaktivan da bi bio značajno toksičan. Da bi se u kulturi stanica primijetila toksičnost vodikovog peroksida, njegova koncentracija mora biti veća od koncentracije kisika u mediju (Tammariello i sur. 2000). Dva su moguća puta povećanja toksičnosti djelomično reduciranih kisikovih radikala. Upalne stanice uvelike povećavaju toksičnost vodikovog peroksida lučenjem peroksida i produkcijom hipokloraste kiseline i drugih hipohalogenih kiselina. Stanice mogu povećati toksičnost superoksida produkcijom dušikovog monoksida, koji zajedno reagiraju i proizvode peroksinitrit, najbrţom reakcijom poznatoj biologiji. U prisutnosti ugljikovog dioksida, peroksinitrit modificira proteine u nitrotirozine. Nitrotirozini mogu biti formirani peroksidaznom oksidacijom nitrita (nusprodukta metabolizma dušikovog monoksida) i vodikovog peroksida (Slika 8.). Doprinos dušikovog monoksida neuralnim oštećenjima je pokazan uporabom inhibitora sintaze dušikovog monoksida (NOS) na sojevima miševa deficijentnim za neuralnu izoformu NOS-a (NOS1). Miševi deficijentni u NOS1 imalisu manju incidenciju moţdanog udara, veću otpornost na neurotoksičnost N-metil-D-aspartatom i 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom. Uz NOS1, studije su pokazale i učinak NOS2 (inducibilna forma NOS-a, primarno nađena u glija stanicama) na neuralna oštećenja. Plakovi

14 pacijenata oboljelih od multiple skleroze su pokazali povećanu imunoreaktivnost na NOS2 i nitrotirozin. Nitracija je povezana s kompromitiranjem integriteta krvno moţdane barijere kod multiple skleroze. Kod ţivotinjskih modela multiple skleroze i moţdanog udara, urična kiselina se pokazala inhibitorom nitracije tirozina i pokazala je protektivan učinak na krvno moţdanu barijeru. Blokada aktivacije NOS2 i mikroglija je pokazala neuroprotektivan učinak kod Parkinsonove i Alzheimerove bolesti. Aktivacija mikroglija stanica (koja dovodi do formiranja peroksinitrita) je povezana s Aβ peptidom uzrokovanom neurotoksičnosti (Ischiropoulos i Beckman 2003). Slika 8. Shema reakcija kisikovih radikala i dušikovog monoksida (Preuzeto s Klasični lijekovi Acetilsalicilna kiselina Acetilsalicilna kiselina (aspirin) je trenutno nakorišteniji lijek na planeti, on je nesteroidni antiinflammatorni lijek antipiretičkog i analgetičkog učinka. Glavni mehanizam njegovog djelovanja je sprječavanje biosinteze prostaglandina preko inhibicije ciklooksigenaznih enzima (Vane i Botting 2003). Aspirin interferira s biosintezom cikličnih prostanoida (tromboksana A2 TXA2 i prostaciklina) i drugih prostaglandina (PGE2 i PGI2). Prostanoidi nastaju enzimski kataliziranom oksidacijom arahidonske kiseline (iz membranskim fosfolipida). Prostaglandin

15 H-sintetaza metabolizira arahidonsku kiselinu u PGG2 i PGH2 zbog svog ciklooksigenaznog i peroksidaznog učinka (Slika 9.). PGG2 dalje modificiraju specifične sintetaze do TXA2 i prostaciklina. Prostaglandin H-sintetaza (COX) postoji u dvije izoforme koje imaju velik postotak homologije u aminokiselinskoj sekvenci. Prva izoforma (COX-1) je eksprimirana u endoplazmatskom retikulumu većine stanica i sintetizira homeostatske prostaglandine zasluţne za obavljanje normalnih staničnih funkcija, poput zaštite ţeluca mukoznim sekretom, odrţavanja normalnog bubreţnog optoka krvi i regulacije aktivnosti i agregacije trombocita. Druga izoforma (COX-2) se ne nalazi aktivna u većini stanica sisavaca, ali je brzo induciraju inflamatorni signali i faktori rasta, što rezultira u sintezi prostaglandina koji doprinose upalnom odgovoru. Slika 9. Shema sinteze prostaglandina iz arahidonske kiseline (Preuzeto s - Aspirin ima značajan antitrombotičan učinak koji ostvaruje preko inhibicije PGH-sintaze (COX) ireverzibilnom actilacijom Ser530 (u COX-1 izoformi) ili Ser516 (u COX-2 izoformi). Aspirin potpuno inaktivira COX-1, dok COX-2 ne inaktivira potpuno, već mu mijenja djelovanje tako da arahidoničnu kiselinu ne metabolizira u PGH2, već u 15-R-HETE. Kako

16 prisustvo aspirina onemogućuje produkciju PGH2, kod obje izoforme (nuţan korak u produkciji prostanoida) dolazi do smanjene produkcije prostaglandina i tromboksana, što je odgovorno za pozitivne i negativne učinke aspirina. Aspirin također štiti LDL od oksidativnih modifikacija te tako sprječava ili usporava aterosklerozu (Awtry i Loscalzo 2000). Aspirin smanjuje razinu vaskularne produkcije O 2- aktivnosti (Tauseef i sur. 2008). smanjivanjem NAD(P)H oksidazne Predloţeno je nekoliko mehanizama antioksidativnog učinka aspirina. Salicilat je inhibitor indukcije ovisne o citokinu genske ekspresije NOS-II preko mehanizma koji uključuje aktivaciju NF-kB, što dovodi do smanjenja oksidativnog stresa koji prati produkciju citokina. Aspirin redukcijom hidroksilnih radikala prelazi u derivate 2,3- i 2,5-dihidroksibenzoata, koji sluţe kao markeri oksidativnog stresa i smanjuju protok oksidativnih radikala. Aspirin moţe acetilirati lizinske nastavke proteina što sprječava njihovu oksidaciju, što je bitan faktor u antioksidativnoj zaštiti lipoproteina i fibrinogena (Awtry i Loscalzo 2000). Nedavna istraţivanja na ljudskim HepG2 stanicama raka su pokazala da aspirin pokreće apoptozu kod stanica raka. Aspirin u stanicama raka povećava produkciju slobodnih radikala, smanjuje dostupnost staničnog glutationa i inhibira aktivnost kompleks respiratornih mitohondrijskih enzima, NADH-ubiquinon oksidoreduktaze (kompleks 1), citokrom c oksidaze (kompleks 4) enzim mitohondrijskog matriksa, akonitazu. Apoptozu pokreće promjena u mitohondrijskoj permeabilnosti, inhibicija sinteze ATP-a, smanjena ekspresija antiapoptotičkog proteina Bcl-2, oslobađanje citokroma c i aktivacija proapoptotičke kaspaze- 3 i enzima popravka DNA PARP (Raza i sur. 2010) Varfarin Varfarin je derivat kumarina s antikoagulativnim učinkom, kojeg ostvaruje interferiranjem u interkonverziji vitamina K i njegovog 2,3-epoksida. Vitamin K je kofaktor za karboksilaciju glutamatnih nastavaka do γ-karboksiglutamata na N-terminalnim regijama vitamin K ovisnih proteina (među njima su koagulacijski faktori 2, 7, 9 i 10). Inhibicijom interkonverzijskog ciklusa vitamina K, varfarin inducira jetrenu produkciju djelomično dekarboksiliranih proteina s reduciranom koagulantskom aktivnosti.

17 Karboksilacija potiče vezanje vitamin K ovisnih koagulacijskih faktora na fosfolipidne površine (što ubrzava koagulaciju krvi). Za γ-karboksilaciju je potreban reducirani oblik vitamina K (vitamin KH2). Kumarin sprječava formiranje vitamina KH2 inhibicijom enzima vitamin K epoksid reduktaze i time ograničava γ-karboksilaciju Vitamin K ovisnih koagulacijskih proteina (Slika 10.). Uz to, antagonisti vitamina K inhibiraju karboksilaciju regulatornih antikoagulacijskih proteina C i S. Antikoagulativne efekte kurmarina moguće je nadvladati niskim dozama vitamina K1 jer vitamin K1 zaobilazi vitamin K epoksid reduktazu.varfarin također interferira u karboksilaciji Gla proteina sintetiziranih u kostima. Slika 10. Prikaz djelovanja varfarina na ciklus vitamina K (Preuzeto s - Varfarin je racemična mješavina dva optički aktivna izomera, R i S forme, u otprilike jednakim odnosima. Brzo se upija kroz probavni sustav, ima visoku biodostupnost te doseţe najvišu koncentraciju u krvi za 90 minuta nakon oralnog uzimanja. Racemični varfarin ima poluţivot između 36 i 42 sata, cirkulira vezan za proteine plazme (najčešće albumine) i nakuplja se u jetri gdje dva izomera prolaze različite metaboličke puteve (Hirsh i sur. 2003). S-varfarin se metabolizira u neaktivne metabolite (S-7 hidroksivarfarin) izoenzimom CYP2C9, dok se R-varfarin metabolizira izoenzimima CYP1A2, CYP2C19 i CYP3A4 u 6-, 8- i 10-hidroksivarfarin. Neaktivni metaboliti se izlučuju urinom i fecesom (Teles i sur. 2012).

18 Odnos između doze varfarina i njegovog odgovora je uvjetovan genetskim i okolišnim faktorima. Bitni genetski faktori su učestale mutacije u genu za kodiranje citokroma P450, jetrenog enzima odgovornog za metabolizam S izomera varfarina. Opisano je nekoliko genetskih polimorfizama za enzim, koji su povezani uz niţe potrebne doze i veću stopu nuspojava krvarenja u odnosu na divlji tip enzima CYP2C9 i VKORC1. Uz brojne genetske i okolišne faktore, na odgovor varfarina utječu drugi lijekovi, prehrana i brojne bolesti (Hirsh i sur. 2003). Interakcije varfarina s drugim supstancama se dijele u dvije kategorije: farmakokinetske i farmakodinamičke efekte. Interakcije koje modificiraju farmakokinetiku varfarina uključuju promjene u apsorpciji (koja smanjuje antikoagulacijski efekt), metabolizmu (induciranjem izoenzima CYP2C9 što smanjuje antikoagulativan učinak, enzimskom inhibicijom CYP2C9 koja povećava antikoagulativan učinak) i transportu (spojevi koji se veţu na proteine plazme, osobito albumin, dislociraju vezani varfarin što povećava koncentraciju slobodnog varfarina u krvi i antikoagulativan učinak). Interakcije koje modificiraju farmakodinamiku varfarina uključuju sinergizme (djelovanje na hemostazu i smanjivanje sinteze koagulacijskih faktora), kompetitivni antagonizam (vitamin K) i promjene u fiziološkoj kontroli ciklusa vitamina K (nasljedna otpornost na oralne antikoagulante) (Teles i sur. 2012). 1.4 Biljni pripravci Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji Od početaka ljudske civilizacije, biljni pripravci su se koristili za liječenje raznih bolesti i poboljšanje zdravlja. Prema procjenama Svjetske zdravstvene organizacije 80% svjetske populacije koristi biljne pripravke u nekom obliku iz zdravstvenih razloga. Veliki razlog njihove popularnosti leţi u njihovoj lakoj dostupnosti i u tome što se smatraju zdravima, jer su prirodni. Unatoč tome, mnogi od njih imaju ozbiljne nuspojave, bilo zbog direktnog toksičnog učinka biljke, alergijskih reakcija, utjecaja kontaminanata, bilo zbog prisutnosti teških metala, interakcije s klasičnim lijekovima ili nenavedenih farmaceutskih spojeva, namjerno i ilegalno dodanih da bi se postigao ţeljeni učinak (Dulger, 2012.).

19 U skladu s europskim zakonodavstvom, da bi medicinski pripravci koji sadrţe biljne supstance/preparate mogli biti pušteni na trţište, moraju spadati u jednu od tri navedene kategorije: 1.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju medicinski tradicionalne upotrebe. Mora postojati dovoljno informacija o njegovoj sigurnosti i njegova učinkovitost mora biti uvjerljiva. 2.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju utemeljene upotrebe za medicinske svrhe. Kriterij za to je znanstvena literatura koja potvrđuje da se aktivne supstance proizvoda utemeljeno koriste u medicinske svrhe unutar Unije bar deset godina, s utvrđenom učinkovitošću i prihvaćenom razinom sigurnosti. 3.) Proizvod se moţe odobriti nakon provjere prijave za puštanje na trţište koja se sastoji od podataka o sigurnosti i učinkovitosti iz firme proizvođača (samostojeća studija) ili kombinacije vlastitih podataka firme i postojećih bibliografskih podataka (mješovita aplikacija). (DIRECTIVE 2001/83/EC) Ginko Ginko (Ginkgo biloba) je jedini ţivući član porodice Ginkgoaceae i spada u žive fosile (najduţe ţivuće vrste na planeti), budući da postoje fosilni nalazi stari 150 milijuna godina. Lišće i plodovi ginka su često korišteni u tradicionalnoj kineskoj medicini za liječenje plućnih, srčanih i mokraćnih problema te koţnih bolesti. Prije dvadesetak godina standardiziran je ekstrakt lista ginka, Egb761, i najčešće se koristi kao suplement za kognitivne probleme. Standardizirani ekstrakt lista ginka Egb 761 sadrţi 24 % flavonoidnih glikozida, 6 % terpenskih laktona, i manje od 5 ppm ginkolične kiseline (Droy-Lefaix, 2005). Glavni farmakološki aktivni spojevi u ekstraktu lista ginka su flavonoidi i terpenoidi. Flavonoidi prisutni u ekstraktu lista ginka su flavoni, flavonoli, tanini, biflavoni i vezani glikozidi kvercitina i kamferola na 3-ramnozidima i p-kumarinskim esterima. Oni djeluju kao antioksidansi, inhibitori enzima i kelatori kationa. Flavonoidni sastav listova ginka varira između sezona. Biodostupnost flavonoida je relativno niska zbog ograničene apsorpcije i brze eliminacije. Glikozidni oblik flavonoida se slabo apsorbira u crijevu, samo aglikonični oblik se moţe direktno apsorbirati. Neapsorbirane flavonoide koji dospiju u debelo crijevo

20 metaboliziraju bakterije a nakon toga se apsorbiraju u crijevu. Apsorbirani flavonoidi dospijevaju do jetre, ondje se metaboliziraju u konjugirane derivate čija biološka aktivnost nije uvijek ista kao u originalnih spojeva. Dva su tipa terpenoida prisutna u ekstraktu lista ginka: ginkolidi i bilobalid (Bilia, 2002). Ekstrakt lista ginka je pokazao pozitivne učinke u liječenju neurodegenerativnih bolesti poput Alzheimerove, kardiovaskularnih bolesti, raka, stresa, gubitka pamćenja, tinitusa, bolesti vezanih uz starenje i psihijatrijskih poremećaja poput šizofrenije. Ti učinci se objašnjavaju s više mehanizama, poput antioksidativnog učinka, antiagregacijskog učinka (za srčane i krvnomoţdane bolesti), inhibicije agregacije beta amiloidnih peptida (za usporavanje progresije Alzheimerove) i smanjene ekspresije perifernih benzodiazepinskih receptora (za olakšanje stresa i poboljšanje cirkulacije) (McKenna i sur. 2001). Smatra se da je glavni mehanizam terapeutskog učinka ekstrakta lista ginka na kronične bolesti (neurodegenerativne i kardiovaskularne bolesti i rak) njegovo antioksidativno djelovanje. Dva su predloţena mehanizma njegovog djelovanja: vezanja slobodnih radikala i indirektna inhibicija formiranja slobodnih radikala. Ekstrakt lista ginka moţe vezati kisikove radikale poput hidroksilnih radikala, peroksidne radikale, superoksidnog aniona, NO-, vodikovog peroksida i ţeljezne ione. Ekstrakt lista ginka moţe pojačati aktivnost antioksidativnih enzima poput superoksid dismutaze, glutation peroksidaze katalaze i hemoksigenaze-1 i tako indirektno djelovati kao antioksidant. Studije također pokazuju da ekstrakt lista ginka povećava ekspresiju mitohondrijskih enzima poput NADH dehidrogenaze, što utječe na stvaranje kisikovih radikala u mitohondrijima, jer djeluje izravno na oksidativnu fosforilaciju, što povećava razinu ATP-a i regulaciju energetskog metabolizma. U usporedbi s drugim antioksidansima, ekstrakt lista ginka je regulativan i adaptivan, moţe dilatirati i kontrahirati krvne ţile i kontrolirati neurokemikalije i neuroendokrine indikatore ovisno o situaciji. Glavne aktivne tvari tih mehanizama su flavonoidi (kvercetin kempferol) i terpenoidi (ginkolidi i bilobalid), koji doprinose antioksidativnom učinku na različite načine. Flavonoidi djeluju preko inhibicije enzima ciklooksienaze 2 (COX2), koja je dio ciklusa sinteze prostaglandina. Bilobalid povećava aktivnost antioksidativnih enzima (SOD-a i katalaze) i poboljšava vijabilnost stanica. Proantocijanidini prisutni u ekstraktu lista ginka se veţu na proteine i inaktiviraju antioksidativne enzime (katalazu, glutation peroksidazu i laktat dehidrogenazu), tako da

21 njihova prisutnost u ekstraktu moţe smanjivati antioksidativni učinak ginka (Mahadevan i Park, 2008) Gotu kola Gotu kola (Centella asiatica) je penjačica koja spada u porodicu Apiaceae, a nalazi se u tropskom i suptropskom području Indije, Pakistana, Šri Lanke, Madagaskara, Juţne Afrike i Istočne Europe. Cijela biljka se koristila za medicinske svrhe u tradicionalnoj indijskoj i kineskoj medicini, za liječenje visokog tlaka, revitalizaciju moţdanih stanica i ţivaca, emocionalne poremećaje i koţne bolesti (Gohil i sur. 2010). Farmakološki aktivni spojevi gotu kole su triterpenski saponini (triterpenoidi) podnazivom aziatikozidi od kojih su najpoznatiji madekasozid i madazijatska kiselina. Ti triterpeni saponini i njihovi sapogenini se smatraju odgovornima za zaliječivanje rana i vaskualrno djelovanje produkcijom kolagena na mjestu rane. Drugi spojevi izolirani iz gotu kole, poput brahmozida i brahminozida, mogu biti odgovorni za djelovanje na CNS i relaksantno djelovanje, ali njihovo djelovanje još nije klinički potvrđeno. Ekstrakti gotu kole sadrţe glikozide koji su pokazali antifertilni učinak kod miševa. Centelozid i njegovi derivati su se pokazali efikasnima u tretmanima venske hipertenzije. Među ekstraktima gotu kole se nalaze biljni steroli, flavonoidi i spojevi za koje se ne zna farmakološka aktivnost (tanini, esencijalne kiseline, fitosteroli, slobodne aminokiseline, flavonoidi, alkaloidi i masne kiseline) (Srivastava i sur. 1997). Gotu kola revitalizira mozak i ţivčani sustav, povećava koncentraciju i usporava starenje. Studija na štakorima je pokazala antioksidativan učinak i kognitivno stimulirajući učinak. Štakori tretirani s gotu kolom pokazuju dozno ovisan napredak kognitivnog ponašanja u testovima pasivnog izbjegavanja i labirintskim testovima. Značajno smanjenje razine MDA i povećanje razine katalaze i SOD-a je primijećeno kod štakora tretiranih visokim dozama gotu kole (Hussin i sur. 2005). Također je dokazana povećana razina fosforilacije CREB-a (cyclic AMP response element binding proteina) u kulturi stanica neuroblastoma i embrijskim kortikalnim stanicama štakora tretiranih ekstraktom gotu kole. Pretpostavlja se da je za to djelovanje odgovoran signalni puterk/rsk (extra cellular signal-regulated kinase-ribosomal S6 kinaza). Studija na miševima, koji su oralno uzimali ekstrakt gotu kole 14 dana, pokazala je povećanje razine antioksidativnih enzima (SOD-a, katalaze i glutation peroksidaze). Derivati azijatske kiseline povećavaju razine antioksidativnih enzima u kulturi kortikalnih stanica pa se pretpostavlja da štite stanice od oksidativne štete nastale zbog izloţenosti višim

22 razinama glutamata u ţivčanim stanicama. Azijatikozidni derivati su djelovali protektivno na beta-amiloid neurotoksičnost u kulturi B103 stanica. Tri azijatikozidna derivata pokazuju inhibiciju apoptoze uzrokovane beta-amiloidima i slobodnim radikalima (Gohil i sur. 2010) Borovnica Borovnica (Vaccinium myrtillus) je nisko rastući grm čiji plodovi su bogati antocijaninima i daju im karakterističnu plavu boju. Apsorpcija antocijana je brza, ali imaju slabu biodostupnost (11-22 %). Antocijani su se, mehanizmima vezanja slobodnih radikala i keliranjem metalnih iona, pokazali kao dobri antioksidansi. Štakori tretirani ekstraktom plodova borovnica su pokazali smanjenu lipidnu peroksidaciju u serumu i povećanu razinu glutationa u stanicama srčanog mišića (Chu i sur. 2011) Vulkan Vulkan je dodatak prehrani za poboljšanje muške potencije. Sastav vulkana, po navodima proizvođača, trebalibi biti samo biljni ekstrakti: ekstrakt lista ginka, matičnjaka (Melissa officinalis), hmelja (Humulus lupulus) i origana (Origanum vulgare). Ekstrakt matičnjaka je pokazao niz neuroprotektivnih i antioksidativnih učinaka mehanizmima inhibicije MAO-A i vezanja vodikovog peroksida (López i sur. 2009). Ekstrakt hmelja sadrţi brojne polifenole koji sprječavaju oksidativna oštećenja DNA vezanjem hidroksilnih radikala i superoksidnih radikala (Wang i sur. 2014). Fenoli nađeni u ekstraktu origana pokazuju antioksidativan učinak vezanjem slobodnih radikala i u studijama su pokazali značajan učinak u smanjenju lipidne peroksidacije (Aranha i Jorge. 2012). 1.5 Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka Rastuća globalna popularnost alternativne medicine rezultirala je povećanim interesom za posljedice interakcije biljnih pripravaka i klasičnih lijekova, osobito za lijekove uskog sigurnosnog raspona doze.

23 Studija provedena je pokazala kako 15% pacijenata tretiranih klasičnom farmakoterapijom uzima biljne pripravke. Kod njih 40% su primijećene moguće interakcije klasičnih lijekova s biljnim suplementima, ali je često teško odrediti točan uzrok interakcije, osobito kod onih čija terapija uključuje više lijekova (Dulger, 2012.) Ginko i varfarin Studije rađene in vitro i na štakorima su pokazale da ginko utječe na enzime CYP2C9, CYP2D6 i CYP2E1, dok su rezultati utjecaja na CYP3A4 nejasni ili su pokazali da utjecaj ginka nije klinički značajan. Farmakološke studije na pacijentima i zdravim volonterima nisu pokazale interakciju između ginka i varfarina. Prijavljena su krvarenja kod zajedničkog uzimanja, ali nema dokaza koji bi objasnio mehanizam ni pokazao da je to rezultat interakcije (Beikang i sur. 2014) Ginko i acetilsalicilna kiselina Zabiljeţena su krvarenja kod pacijenata koji su uzimali ekstrakt lista ginka uz acetilsalicilnu kiselinu, što bi moglo biti rezultat interakcije inhibicijskog utjecaja flavonoida i terpenoida prisutnih u ekstraktu lista ginka na zgrušavanje krvi. (Abebe, 2002) 1.6 Cilj istraţivanja Cilj ovog rada je istraţiti kakva je interakcija između lijekova (čiji su učinci na oksidativni stres dobro poznati) i biljnih pripravaka na oksidativni stres mozga. Mjerenjem markera oksidativnog stresa kod grupa koje primaju pojedinačne supstance i grupa koje dobivaju kombinacije supstanci usporedit će se razina oksidativnog stresa na tri regije mozga.

24 2. Materijali i metode 2.1 Materijali Priloţen je tablični prikaz otopina korištenih u istraţivanju. Tablica 1. Priprema pokusnih otopina Otopina Otopina D (određivanje proteina prema Lowryu) Otopina E (određivanje proteina prema Lowryu) 0,81% TBA (određivanje MDA) Reagens A (određivanje MDA) 0,5 M pufer PBS (Phosphate Buffered Saline) - određivanje GSH Priprema otopine Pomiješati otopine u omjeru A:B:C=48:1:1 A: 2% (w/v) Na 2 CO 3 u 0,1 mm NaOH B: 1% (w/v) natrij-kalij tartarat u dh 2 O C: 0,5% (w/v) CuSO 4 5H 2 O u dh 2 O Pomiješati Folin & Ciocalteu's phenol reagent i dh 2 O u omjeru 2:1 Otopiti 0,8 g TBA u 40 ml dh 2 O uz lagano zagrijavanje. Dodati 500 μl 5M NaOH te nadopuniti s dh 2 O do 100 ml. Pomiješati 100 μl 8,1% SDS sa 750 μl 20% octene kiseline namještene na ph=3,5 i 750 μl 0,81% TBA Pomiješati 17 ml 1 M Na 2 HPO 4 2 H 2 O (otopiti 3 g Na 2 HPO 4 2H 2 O u dh 2 O i nadoliti dh 2 O do 17 ml) i 183 ml 1 M Na 2 HPO 4 12 H 2 O (otopiti 65,5 g Na 2 HPO 4 12 H 2 O u dh 2 O i nadoliti dh 2 O do 183 ml) 0,5 M EDTA (određivanje GSH) Otopiti 37,2 g EDTA u dh 2 O i nadoliti dh 2 O do 200 0,25 M pufer PBS s 0,25 M EDTA (određivanje GSH) ml Pomiješati 200 ml 0,5 M pufer PBS i 200 ml 0,5 M EDTA 0,035 M HCl (određivanje GSH) Pomiješati 7 ml 0,1M HCl s 193 ml dh 2 O Ellmanov reagens (određivanje GSH) Otopiti 20 mg DTNB (ditionitrobenzoična kiselina) u 5 ml 0,5M pufer PBS s 0,25 M EDTA 0,8 mm NADPH (određivanje GSH) Otopiti 6,67 mg NADPH s 10 ml 0,5M pufer PBS s 0,25 M EDTA 50 mm PBS (određivanje SOD) Pomiješati 17 ml (otopiti 1,56 g NaH 2 PO 4 2H 2 O u 50 ml dh 2 O) i 183 ml ( otopiti 5,678 g Na 2 HPO 4 u

25 200 ml dh 2 O), namjestiti ph=7,8 te nadopuniti do 800 ml s d H 2 O 50 mm PBS s 0,1 mm EDTA Otopiti 3,72 mg EDTA u 100 ml 50 mm PBS (određivanje SOD) Reakcijska otopina A (određivanje Pomiješati 190 ml 0,05 mm citokroma c (otopiti 29 SOD) mg citokroma c u 190 ml 50 mm PBS s 0,1 mm EDTA ) i 19 ml 1 mm ksantina ( uz lagano zagrijavanje otopiti 3 mg ksantina u 19,74 ml 1 mm NaOH) 10 mm H 2 O 2 (određivanje katalaze) 100 μl 30% H 2 O 2 pomiješati sa 100 ml dh 2 O Otopina B enzima ksantin oksidaze Pomiješati 40 μl ksantin oksidaze i 960 μl dh 2 O (aktivnost 0,8 U/mL) (određivanje SOD) 2.2 Metode Tretman ţivotinja Za potrebe istraţivanja korišteno je 48 štakora soja Y59, podijeljenih u osam grupa po pet štakora i dvije grupe po četiri štakora (Tablica 2.). Devet grupa je bilo dnevno tretirano odgovarajućim preporučenim dozama (mg/kg) od strane proizvođača (referentne doze od strane proizvođača, korekcija na bazi mase ţivotinja) acetilsalicilne kiseline, ginka, varfarina, vulkana, goji bobica, gotu kole i borovnica i njihovim kombinacijama, dok je kontrolna grupa bila tretirana fiziološkom otopinom. Tretiranje se provodilo 15 dana po standardnom OECD protokolu 407 za ispitivanje subkronične toksičnosti.

26 Tablica 2. Pokusne skupine i doziranje preparata Oznaka skupine Sastav pokusne otopine Doziranje 0.KONTROLA Fiziološka otopina 2 ml svaki dan 1.GINKO Komercijalni pripravak ginka Ginkgo 5,71 mg preparata/kg biloba (GINKOCEL Dietpharm)- 400 svaki dan mg preparata sadrţi 120 mg ginka 2.VULKAN Komercijalni pripravak mješavine 23,5 mg preparata/kg različitih biljaka: hmelj, matičnjak, svaki dan ekstrakt origana i Ginkgo biloba (VULKAN Avala pharma) mg preparata sadrţi 150 mg ginka 3.ACETILSALICILNA Otopina 0,86 mg acetilsalicilne 4,2 mg/kg svaki dan KISELINA kiseline na 1 ml vode 4.VARFARIN Otopina varfarina Kroz 12 dana fiziološka otopina,a zadnja 3 dana varfarin u dozi 0,4 mg/ml 5.VULKAN+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 2. Kroz 12 dana otopina Vulkan i 4. varfarin 2.Vulkan, nakon 13. dana u tretiranje je uključena i otopina 4.Varfarin 6.VULKAN+ACETILSA Kombinacija otopina skupina 2. Kroz 12 dana otopina LICILNA KISELINA Vulkana i 3. Acetilsalicilna kiselina 2.Vulkan, nakon 13. dana u tretiranje je uključena i otopina 3. Acetilsalicilna kiselina 7.GINKO+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 1. Kroz 12 dana otopina 1. Ginko i 4.Varfarin Ginko, nakon 13. dana u tretiranje je uključena i otopina 4. Varfarin 8.GINKO+ACETILSALI Kombinacija otopina skupina 1. Kroz 12 dana otopina 1.

27 CILNA KISELINA Ginko i 3. Acetilsalicilna kiselina Ginko, nakon 13. dana u tretiranje uključena i otopina 3. Acetilsalicilna kiselina 9.GINKALERT Komercijalni pripravak Ginko biloba i mješavine biljnih pripravaka: Gota Kola (Centella asiatica) s 10% triterpena i borovnica s 36% antocijanozida (GINKALERT Solaray) 720 mg preparata sadrţi 120 mg ginka 10,2 mg preparata/kg Izolacija organa i obrada tkiva Nakon 15 dana tretmana, ţivotinje su anestezirane mješavinom Xilapana i Narketana, i.p. 25 mg/kg) i ţrtvovane, zatim su im izolirani mozgovi. Sa svakog mozga je izoliran i izvagan dio korteksa, prefrontalnog korteksa i malog mozga te stavljen u Eppendorf-epruvetu s fosfatnim puferom u volumenu 10 većim od mase uzorka. Uzorci su homogenizirani ultrazvučnim homogenizatorom i zatim centrifugirani 15 minuta na g i pri 6 0 C. Nakon centrifugiranja je odvojen supernatant i pohranjen u hladnjaku na C do početka testiranja Određivanje proteina metodom po Lowryju Metoda određivanja proteina po Lowryju (1951.) je biokemijski test za određivanje ukupne koncentracije proteina u otopini, a temelji se na biuretskoj reakciji, promjeni boje otopine zbog oksidacije aromatskih aminokiselina u njoj. U biuretskoj reakciji ioni bakra reagiraju s peptidnim vezama proteina u luţnatom mediju, pri čemu dolazi do njihove redukcije u Cu +. Nakon toga se u reakcijsku smjesu dodaje fenolni reagens koji reagira sa Cu + proteinskim kompleksom i bočnim ograncima aromatskih aminokiselina, prilikom čega uzrokuje njihovu oksidaciju i svoju redukciju, što dovodi do nastanka plavog obojenja. Promjena apsorbancije uslijed obojenja mjeri se pomoću spektrofotometra. Metodom po Lowryju određene su razine proteini u štakorima. Uzorci mozgova razrijeđeni su

28 10 puta u PBS-u. U epruvete je dodano po 100 μl razrijeđenog uzorka i 2 ml otopine D (Tablica 1) i inkubirano 10 min na sobnoj temperaturi. Sve je rađeno u duplikatima. Zatim je dodano 200 μl otopine E (Tablica 1), nakon čega je snaţno vorteksirano i inkubirano 30 min na sobnoj temperaturi. Količina proteina određena je na spektrofotometru mjerenjem apsorbancije na valnoj duljini od 600 nm. Kao standard, upotrijebljen je albumin goveđeg seruma (eng. Bovine serum albumin, BSA) u koncentracijama od 2 mg/ml prema manjim koncentracijama (2; 1; 0,25; 0,125 i 0 mg/ml). Iz standardne krivulje ovisnosti apsorbancije o koncentraciji BSA, određen je nagib pravca. Preko nagiba pravca izračunata je koncentracija proteina u uzorcima. Koncentracija proteina izraţena je kao mg/ml Količina ukupnog glutationa (GSH) Koncentracija ukupnog glutationa u mozgu štakora određena je prema modificiranoj metodi koju je opisao Tietze (1969). Metoda se temelji na reakciji tiolnog reagensa 5,5-ditiobis-2- nitrobenzoične kiseline (DTNB, Ellmanov reagens) s GSH, pri čemu se stvara kromofor 5- tionitrobenzoična kiselina (TNB) koja se moţe fotometrijski očitati na 412 nm. Uz TNB, stvara se i GS-TNB koji se reducira pomoću GSH reduktaze (GR) i NADPH, pri čemu se otpušta druga molekula TNB i reciklira GSH. Brzina nastanka TNB proporcionalna je recilirajućoj reakciji, koja je proporcionalna koncentraciji glutationa u uzorku. Pri ovoj metodi, sav oksidirani GSH (disulfid GSSG) prisutan u reakcijskoj smjesi ili nastao iz miješanog disulfida GSH s GS-TNB, brzo se reducira do GSH. Konačan rezultat koji se dobije odgovara ukupnoj koncentraciji reduciranog i oksidiranog GSH u uzorku. Koncentracija ukupnog GSH mjeri se u mikrotitarskoj pločici. U jednu jaţicu dodaje se 20 μl uzorka, 40 μl 0,035 M HCl i 40 μl 10 mm DTNB te se mjeri apsorbancija na valnoj duljini od 415 nm. Zatim se dodaje 100 μl otopina GR i NADPH i mjeri se apsorbancija tijekom 5 min. Priprema navedenih otopina prikazana je u Tablici 2. Kao slijepa proba korišten je PBS u reakcijskoj smjesi. Za standard korištene su koncentracije reduciranog GSH (5-100 μm). Nacrtani su pravci za sve standarde, kao promjena apsorbancije u vremenu. Očitani su nagibi pravaca, nacrtan je pravac kao ovisnost nagiba pravca o koncentraciji GSH. Konačno, taj dobiveni pravac korišten je za dobivanje koncentracije ukupnog GSH u uzorku prema formuli (nagib pravca uzorak nagib pravca slijepa proba )/nagib pravca standard. Koncentracija ukupnog GSH prikazuje se kao μg GSH po mg proteina.

29 2.2.5 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze provedeno je prema posrednoj metodi po Flohé i Ötting (1984.) koja se temelji na inhibiciji redukcije citokroma C u sustavu ksantin/ksantin oksidaza. U ovoj metodi korištene su dvije slijepe probe. Prva slijepa proba sastojala se samo od otopine A (Tablica 1) te je apsorbancija u spektrofotometru mjerena na 550 nm tijekom 3 min. Druga slijepa proba sluţila je za namještanje aktivnosti ksantin oksidaze (XOD). U epruvetu Eppendorf- je stavljeno 1,45 ml otopine A, 25 μl dh2o i μl XOD (0,8 U/mL) (Tablica 1). Odmah nakon dodavanja enzima i brzog miješanja, reakcijska smjesa prelivena je u kivetu i mjerena je promjena apsorbancije, odnosno aktivnost enzima ksantin oksidaze tijekom 3 min na 550 nm. Aktivnost XOD mora biti oko 0,025 U/min. U ovom slučaju, odgovarajući volumen XOD bio je 25 μl. Nakon što se postigla optimalna aktivnost SOD, analizirani su uzorci. U svaku reakcijsku smjesu, umjesto dh 2 O, dodano je 25 μl uzorka te odgovarajući volumen XOD (30 μl) i odmah nakon toga mjerena je apsorbancija u spektrofotometru. Enzimska aktivnost mjerena je kao postotak inhibicije aktivnosti XOD te izraţena kao % inhibicije =100-(ΔA uzorka /ΔA slijepa proba ) Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze Aktivnost katalaze određena je spektrofotometrijskom metodom po Aebiju (1984). Prema toj metodi, aktivnost katalaze određuje se kao količina potrošenog H 2 O 2. U reakcijsku smjesu u kivetu dodano je 980 μl10 mm H 2 O 2 (Tablica 1), a ostatak do ukupnog volumena od 1 ml bio je nerazrijeđeni uzorak. Nakon toga je na spektrofotometru mjereno smanjenje količine H 2 O 2 pri 240 nm tijekom jedne minute. Aktivnost katalaze izraţena je preko ekstinkcijskog koeficijenta H 2 O 2 (ε= 39,4 mm 1 cm 1 ) kao U/mg proteina, što odgovara μmol razgrađenog H 2 O 2 po minuti po miligramu proteina Mjerenje količine lipidne peroksidacije Količina lipidne peroksidacije određivana je modificiranom metodom koju su opisali Lamsal i sur Metoda nalaţe mjerenje koncentracije malondialdehida (MDA), jednog od glavnih produkata lipidne peroksidacije. Temelji se na reakciji MDA s tiobarbiturnom kiselinom, pri čemu se stvara kromogen koji je moguće mjeriti spektrofotometrijski.

30 U eppendorf-epruvetu je dodano 100 μl 8,1%-tni SDS, 750 μl 20%-tne octene kiseline (ph=3,5), 750 μl 0,8%-tne TBA (Tablica 1) i 100 μl homogenog uzorka. Otopina je zatim stavljena u vodenu kupelj na 100 C na 60 minuta. Nakon toga je naglo ohlađena na ledu i zatim centrifugirana 15 min na 5000 rpm pri 4 6 C. Supernatant je odvojen i izmjerena je apsorbancija pri 532 nm iz koje je putem Beer-Lambertovog zakona izračunata ukupna koncentracija MDA, izraţena kao nmol MDA po mg proteina Statistička analiza podataka Softverski program "Statistica" korišten je za statističku analizu istraţivanjem dobivenih podataka. Provedena je analiza varijance (ANOVA) koja je dala pregled u podudarnostima i razlikama između pojedinih pokusnih grupa, a razlike između grupa potvrđene su LSD post hoc testom. Određena je vrijednost medijana i standardne devijacije pokusnih ţivotinja u grupama. Dobiveni podatci korišteni su u daljnjoj analizi podudarnosti i razlika između pojedinih varijabli koje su mjerene u ovome istraţivanju.

31 3. Rezultati 3.1 Aktivnost katalaze Mjerenje aktivnosti katalaze u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom pokazuju smanjenu stopu aktivnosti u usporedbi s kontrolnom grupom, grupa tretirana vulkanom pokazuje višu stopu aktivnosti, a grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju sličnu stopu aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 11.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 11. Aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga (P CAT). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

32 Mjerenje aktivnosti katalaze u kortikalnoj regiji je pokazalo da grupe tretirane ginkom, varfarinom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom pokazuju niţu stopu aktivnosti od kontrolne grupe, dok grupe tretirane vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju sličnu stopu aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 12.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 12. Aktivnost katalaze u kortikalnoj regiji mozga (C CAT). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

33 Mjerenje aktivnosti katalaze u regiji malog mozga je pokazalo da grupe tretirane ginkom, vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti od kontrolne grupe, grupa tretirana ginkom i acetilsalicilnom kiselinom ima povećanu stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupa tretirana varfarinom ima sličnu stopu aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 13.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 13. Aktivnost katalaze u regiji malog mozga (CI CAT). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

34 3.2 Aktivnost SOD Mjerenje aktivnosti SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju višu stopu aktivnosti od kontrolne grupe, grupa tretirana ginkalertom ima manju stopu aktivnosti, a grupe tretirane ginkom te ginkom i varfarinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Porast aktivnosti je statistički značajan kod grupe tretirane vulkanom i varfarinom.(slika 14.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 14. Aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga (P SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

35 Mjerenje aktivnosti SOD-a u kortikalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom, acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane vulkanom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan kod grupe tretirane ginkalertom. (Slika 15.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 15. Aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji mozga (C SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

36 Mjerenje aktivnosti SOD-a u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, ginkom i varfarinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan kod grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 16.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 16. Aktivnost SOD-a u regiji malog mozga ( CI SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

37 3.3 Koncentracija GSH Mjernje koncentracije GSH u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom imaju koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 17.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 17. Koncentracija glutationa u prefrontalnoj regiji mozga (PGSH). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

38 Mjerenje koncentracije GSH u kortikalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom imaju manju koncentraciju GSH u odnosu na kontrolnu grupu. Porast koncentracije je statistički značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 18.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču Slika 18. Koncentracija glutationa u kortikalnoj regiji mozga (C GSH). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

39 Mjerenje koncentracije GSH u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane vulkanom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu koncentracije GSH u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom imaju koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 19.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 19. Koncentracija glutationa u regiji malog mozga (CI GSH). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

40 3.4 Koncentracija MDA (malondialdehid) Mjerenje koncentracije MDA u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju MDA u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom te vulkanom i varfarinom imaju koncentraciju MDA poput kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je statistički značajan kod grupa tretiranih varfarinom, ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 20.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 20. Koncentracija malondialdehida u prefrontalnoj regiji mozga (P MDA). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

41 Mjerenje koncentracije MDA u kortikalnoj regiji pokazalo je da sve grupe imaju manju koncentraciju MDA od kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je statistčki značajan kod grupa tretiranih s acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 21.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 21. Koncentracija MDA u kortikalnoj regiji mozga (C MDA). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.

42 Mjerenje koncentracije MDA u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom i vulkanom imaju višu koncentraciju MDA od kontrolne grupe, dok grupe tretirane varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju MDA od kontrolne grupe, a grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i varfarinom imaju koncentraciju MDA poput kontrolne grupe. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 22.) srednja vrijednost standardna devijacija vrijednosti koje odskaču ekstremi Slika 22. Koncentracija MDA u regiji malog mozga (CI MDA). C: kontrolna grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+w: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+s: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.