SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU ODJEL ZA BIOLOGIJU. Diplomski nastavnički studij biologije i kemije. Ivana Ćavar

Transcription

1 SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU ODJEL ZA BIOLOGIJU Diplomski nastavnički studij biologije i kemije Ivana Ćavar UTJECAJ POZITIVNE NISKE TEMPERATURE NA ANTIOKSIDATIVNI ODGOVOR LISTA STEVIJE (Stevia rebaudiana Bert.) Diplomski rad OSIJEK,

2 TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku Odjel za biologiju Diplomski nastavnički studij biologije i kemije Znanstveno područje: Prirodne znanosti Znanstveno polje: Biologija Diplomski rad UTJECAJ POZITIVNE NISKE TEMPERATURE NA ANTIOKSIDATIVNI ODGOVOR Rad je izrađen: Odjel za biologiju, Osijek Mentor: Dr. sc. Ljiljana Krstin, doc. Komentor: Dr. sc. Ivna Štolfa, doc. LISTA STEVIJE (Stevia rebaudiana Bert.) Ivana Ćavar Sažetak: Stevija (Stevia rebaudiana Bert.) je dobar izvor prirodnih antioksidansa. Kako se zbog pozitivnog djelovanja stevije na ljudsko zdravlje proširuju njeni uzgojni areali i na kontinentalna područja Hrvatske, potrebno je istražiti antioksidativni odgovor u listu stevije na pozitivnu nisku temperaturu. U skladu s tim spoznajama, istraživan je utjecaj pozitivno niske temperature (4 o C) na ukupnu antioksidativnu aktivnost, aktivnost enzima katalaze i gvajakol peroksidaze te na koncentraciju H 2 O 2, koncentraciju produkata lipidne peroksidacije i koncentraciju ukupnih fenola u listovima stevije. Kratkotrajno izlaganje niskoj temperaturi dovelo je do povećanja aktivnosti antioksidativnih enzima (katalaze i gvajakol peroksidaze) te istovremenog smanjenja koncentracije H 2 O 2 i koncentracije produkata lipidne peroksidacije. Nasuprot tome, dugotrajno izlaganje niskoj temperaturi, uzrokovalo je oksidativni stres što se očitovalo u povećanim koncentracijama H 2 O 2 i produkata lipidne peroksidacije. Kratkotrajno izlaganje stevije pozitivnoj niskoj temperaturi moglo bi imati pozitivan učinak na razvoj otpornosti biljaka na različite nepovoljne abiotičke i biotičke čimbenike. Broj stranica: 45 Broj slika: 13 Broj literaturnih navoda: 83 Jezik izvornika: hrvatski Ključne riječi: Stevia rebaudiana, oksidativni stres, antioksidativni odgovor, stres uzrokovan pozitivnim niskim temperaturama Datum obrane: Stručno povjerenstvo: 1. Dr.sc. Elizabeta Has Schön, izv.prof 2. Dr.sc. Ljiljana Krstin, doc. 3. Dr.sc. Ivna Štolfa, doc. 4. Dr.sc. Enrih Merdić, izv.prof. Red je pohranjen u: knjižnici Odjela za biologiju Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku. 2

3 BASIC DOCUMENTATION CARD University Josip Juraj Stossmayer in Osijek Department of Biology Graduate Study of Biology and Chemistry in Education Scinetific Area: Natural science Scientific Field: Biology MS thesis IMPACT OF CHILLING STRESS ON ANTIOXIDATIVE RESPONSE IN LEAVES OF Stevia rebaudiana Bert. Ivana Ćavar Thesis performed at: Department of Biology, Osijek Supervisor: Dr. sc. Ljiljana Krstin, assistant prof. Co-supervisor: Dr. sc. Ivna Štolfa, assistant prof. Short abstract: Stevia (Stevia rebaudiana Bert.) is a very good source of natural antioxidants. Nevertheless, because of its positive effects on human health, it would be useful to expand stevia breeding areas to temperate regions of Croatia. So, it is necessary to investigate the antioxidative response of stevia leaves to the low temperature treatment. In accordance with these findings, the effects of a positive temperature (4 o C) on the total antioxidant activity, catalase and guaiacol peroxidase activity and the total concentration of H 2 O 2, lipid peroxidation products and total phenols in leaves of Stevia were investigated. The short-term low temperature exposure led to increased activity of antioxidant enzymes (catalase and guaiacol peroxidase) and reduced H 2 O 2 concentration and the concentration of lipid peroxidation products. In contrast, during prolonged exposure to low temperature, the oxidative stress occurred as reflected in increased concentrations of H 2 O 2 and lipid peroxidation products. Short-term low temperature exposure of stevia could have a positive effect on the plant resistance development to various adverse abiotic and biotic factors. Number of pages: 45 Number of figures: 13 Number of references: 83 Original in: Croatian Key words: Stevia rebaudiana, oxidative stress, antioxidative response, chilling stress Date of the thesis defence: Reviewers: 1. Dr.sc. Elizabeta Has Schön, associate prof. 2. Dr.sc. Ljiljana Krstin, assistant prof. 3. Dr.sc. Ivna Štolfa, assistant prof. 4. Dr.sc. Enrih Merdić, associate prof. 3

4 Thesis deposited in: Library of Department of Biology, Univesity of Josip Juraj Strossmayer in Osijek. SADRŽAJ 1. UVOD Stevija (Stevia rebaudiana Bert.) Povijest stevije Narodna medicina, djelovanje i upotreba Oksidativni stres Katalaze Peroksidaze Fenoli Učinci niskih temperatura na biljne stanice Cilj rada MATERIJALI I METODE Biljni materijal i tretman niskim temperaturama Određivanje sadržaja ukupnih fenola Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti Određivanje koncentracije vodikovog peroksida Određivanje ukupne aktivnosti katalaze (CAT) Određivanje ukupne aktivnosti gvajakol peroksidaze (GPOD) Određivanje koncentracije produkata lipidne peroksidacije Statistička obrada podataka REZULTATI Utjecaj pozitivno niske temperature na koncentraciju fenola Utjecaj pozitivno niske temperature na ukupnu antioksidativnu aktivnost Utjecaj pozitivno niske temperature na koncentraciju vodikovog peroksida (H 2 O 2 ) Utjecaj pozitivno niske temperature na ukupnu aktivnost katalaze (CAT) Utjecaj pozitivno niske temperature na ukupnu aktivnost gvajakol 4

5 peroksidaze (GPOD) Utjecaj pozitivno niske temperature na koncentraciju produkata lipidne peroksidacije RASPRAVA ZAKLJUČCI METODIČKI DIO LITERATURA

6 Najiskrenije zahvaljujem mojoj mentorici doc. dr. sc. Ljiljani Krstin za svaku pomoć prilikom izrade ovoga rada te na prilici da doprinesem znanosti na kvalitetan način. Posebno zahvaljujem komentorici doc. dr. sc. Ivni Štolfa na svoj pruženoj pomoći, svakom savjetu te strpljenju što mi je uvelike olakšalo izradu rada. Također, zahvaljujem svima neimenovanima koji su na bilo koji način doprinijeli izradi ovog rada. Zahvaljujem mojoj obitelji i svima voljenima na velikoj potpori i razumijevanju. 6

7 1. UVOD 1.1. Stevija (Stevia rebaudiana Bert.) Rod Stevia obuhvaća oko 240 vrsta biljaka iz porodice glavočika (Asteraceae) porijeklom iz subtropskih i tropskih područja Južne Amerike (Mishra i sur., 2010). Pojedine vrste iz roda Stevia narastu od 70 do 100 cm visine i imaju 2 do 3 cm duge listove. Slika 1. Stevija (foto: I.Ćavar) Sistematika vrste Stevia rebaudiana Bert.: Carstvo: Plantae (biljke) Podcarstvo: Angiospermae (Cvjetnjače) Koljeno: Asterales Razred: Asteroideae Porodica: Asteraceae (Glavočike) Rod: Stevia Vrsta: Stevia rebaudiana Bert. Stevia rebaudiana ili stevija (Slika 1) je višegodišnja biljka. Poznata je i pod nazivom "slatki list", a sve se više koristi kao sladilo i zamjena za šećer. Biljku je moguće kvalitetno 7

8 uzgajati oko tri godine, nakon čega je potrebno obnoviti nasad. U mediteranskom području biljka može prezimiti u vanjskim uvjetima ako se temperatura ne spušta ispod -5 C duži vremenski period. Međutim, u posljednje vrijeme steviju sve više uzgajaju i u kontinentalnom dijelu Hrvatske, no kad se zimi temperature spuste ispod nule potrebno je biljke dodatno zaštititi od nepovoljnog djelovanja niskih temperatura. Stevija se razmnožava sjemenom (sjeme - presadnica - sadnja) ili reznicama. Otporna je prema tipu tla, ali najbolji rezultati uzgoja postižu se na pjeskovito-ilovastim tlima Stevia podnosi kiselost tla od ph 4,5 do 7,5 i ne raste dobro na zaslanjenim tlima. Berba listova započinje u kolovozu neposredno prije cvatnje i završava prije pojave prvih mrazova. Može se brati višekratno u razmaku od 7 do 10 dana ili odjednom (ručno ili strojno). Prinosi se, ovisno o tehnologiji uzgoja, kreću od g suhog lišća po biljci. Glavna komponenta koja listovima stevije daje slatkoću je steviol glikozid. Slatki ekstrakti iz lista stevije imaju pozitivne učinke na ljudsko zdravlje (Shukla i sur., 2010). Do sada su u tkivu stevije pronađena četiri steviol glikozida (Gupta i sur., 2010): 5-10% steviozidi 2-4% rebaudiozidi A 1-2% rebaudiozidi C 0,5-1 % dulkozida A. Steviozid je diterpen glikozida (C 38 H 60 O 18 ) te prvi izdvojeni glikozid iz lista stevije. Poznat je po svojoj intenzivnoj slatkoći ( puta slađi od saharoze) zahvaljujući kojoj se koristi kao nekalorijsko sladilo, a ima važnu ulogu, kao i ostali steviol glikozidi, u liječenju šećerne bolesti, gojaznosti, raznih upala i liječenju tumora (Kim i sur., 2010)., Rebaudiozid (C 44 H 70 O 23 ) je izoliran godine, a 480 puta je slađi od običnog šećera. Steviozid se razlikuje od rebaudiozida po tome što u svojoj formuli ima jednu molekulu glukoze manje (Slika 2). Steviol glikozidi su korišteni kao hrana i lijek u Japanu i Južnoj Americi mnogo godina, dok su u Sjedinjenim Američkim Državama dozvoljeni u prodaji samo kao dodatak prehrani. Prema JEFCA (The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) prihvatljivi dnevni unos steviol glikozida iznosi 0-2 mg/kg tjelesne težine (Kobylewski i Eckhert, 2008). 8

9 Slika 2. Strukture steviol glikozida (Kobylewski i Eckhert, 2008). Listovi stevije su prirodni izvori antioksidansa jer imaju visok sadržaj fenolnih spojeva i flavonoida te folne kiseline i vitamina C (Kim i sur., 2010). Prirodni antioksidansi imaju važnu ulogu u zaštiti ljudskog tijela od slobodnih radikala, a konzumiranje hrane bogate antioksidansima sprječava pojavu kardiovaskularnih oboljenja i tumora (Abou-Arab i Abu- Salem, 2010) Povijest stevije Biljke su tijekom povijesti korištene u različite svrhe: u medicini, prehrani, za dobivanje raznih aroma i pića. Od prapovijesti, osnova su za gotovo sve ljekovite terapije, a razvoj sintetičkih lijekova počeo se razvijati u devetnaestom stoljeću (Wang, 2003). Steviju je prvi istraživao španjolski botaničar i liječnik Petrus Jacobus Stevus (Pedro Jaime Esteve), od čijeg prezimena potječe latinizirani naziv Stevia. Godine 1899., švicarski botaničar Moises Santiago Bertoni, tijekom istraživanja u istočnom Paragvaju, prvi je detaljno opisao sladak okus stevije. Istraživanja na tu temu provođena su do godine kada su dva francuska kemičara izolirali glikozide koji steviji daju slatki okus. Ovi spojevi nazvani su steviol 9

10 glikozidi. Točna struktura glikozida objavljena je godine. Stevia rebaudiana bila je korištena kao sladilo u pićima i drugim namirnicama (Kim i sur., 2010). U ranim 1970-im, u Japanu je počeo uzgoj stevije kao umjetnog sladila. Lišće biljaka, odnosno vodeni ekstrakt lišća i pročišćeni steviol glikozidi korišteni su kao zaslađivači. Danas se stevija uzgaja i koristi kao prehrambeni dodatak i drugdje u istočnoj Aziji, uključujući Kinu (od 1984.), Koreju, Tajvan, Tajland i Maleziju. Također se upotrebljava u pojedinim dijelovima Južne Amerike (Brazil, Kolumbija, Peru, Paragvaj i Urugvaj) te u Izraelu. Dostupnost ove biljke varira od zemlje do zemlje. Sjedinjene Američke Države zabranile su steviju u ranim im, osim ako je označena kao dodatak prehrani. Međutim, tijekom godina, broj zemalja u kojima je stevija dostupna kao sladilo je u porastu. Iako je već početkom 16. stoljeća dovezena u Europu, Hrvatska je jedna od rijetkih zemalja u kojoj je stevija priznata kao ljekovita biljka (od godine) Narodna medicina, djelovanje i upotreba Uporaba prirodnih proizvoda s ljekovitim svojstvima imaju dugu povijest; biljke, životinje te mineralni proizvodi bili su glavni izvor lijekova. Tako su stoljećima južnoamerički domorci, Guarani narodi, u Paragvaju koristili steviju u ljekovitim čajevima. Oni su je nazivali "slatka biljka" ili "list slatkog meda", a pomagala im je u liječenju žgaravice i drugih bolesti. Stevija ima zanemariv učinak na glukozu u krvi, a može čak i povećati toleranciju na glukozu. Korisna je kao prirodni zaslađivač za dijabetičare i u drugim dijetama koje kontroliraju ugljikohidrate jer nakon upotrebe ne izaziva nikakve štetne promjene i ne povećava količinu ugljikohidrata u krvi. Ljekovito djelovanje stevije: odlična je za dijabetičare jer redovito uzimanje stevije stimulira rad gušterače (stvara se više inzulina; posušeno lišće stevije se može koristiti kao zaslađivač i dodatak u različitim mješavinama čajeva, kave, mlijeka, kakaa, voćnim sokovima i ostalim pićima); osušeno lišće stevije kao dodatak hrani poboljšava probavu i ima važnu ulogu u odvijanju niza metaboličkih procesa u ljudskom organizmu; redovitim korištenjem stevije pospješuje se aktivacija enzima u cijelom organizmu, smanjuje se razina "lošeg" kolesterola (LDL-a) i glukoze u krvi; stevija je bez kalorija, glikemijski indeks (GI) = 0; 10

11 učestalim korištenjem stevije smanjuje se visoki krvni tlak, pospješuje se prokrvljenost u cijelom tijelu; ima antiseptičko, antialergijsko i antimikrobno djelovanje (zbog antimikrobnog djelovanja stevija se koristi kao dodatak pastama za zube i guma za žvakanje); jača regeneracijske procese u organizmu; neutralizira toksine i pospješuje njihovo izlučivanje iz organizma (uključujući i radionuklide); usklađuje rad endokrinih žlijezda; stimulira digestivne i urinarne procese u organizmu; ekstrakt stevije povoljno djeluje na mnoge bolesti kože; korištenjem stevije reducira se ovisnost o alkoholu i pušenju Oksidativni stres Oksidativni stres nastaje kada produkcija slobodnih radikala nadvlada sposobnost stanice da ih neutralizira, odnosno eliminira. Time se narušava funkcioniranje i struktura stanica, odnosno živih organizama u cjelini. Glavnu ulogu u izazivanju oksidativnog stresa u stanicama imaju reaktivne kisikove jedinke (engl. "Reactive Oxygen Species"- ROS) kao što su superoksidni anion ( O - 2 ), vodikov peroksid (H 2 O 2 ), hidroksilni radikal (OH ) i singletni kisik ( 1 O 2 ) (Halliwell, 2006). Reaktivne kisikove jedinke su prirodni nusprodukti normalnog metabolizma kisika i imaju važnu ulogu u staničnoj signalizaciji i održavanju homeostaze (Dat i sur., 2000; Apel i Hirt, 2004). Ipak, djelovanje različitih ekoloških čimbenika, biotičkih ili abiotičkih, može uzrokovati značajno povećanje ROS-a te dovesti do oštećenja staničnih struktura (Ahmad i sur., 2009). Stanične strukture posebno osjetljive na slobodne radikale su lipidi, proteini, ugljikohidrati i nukleinske kiseline (Ali i Alqurainy, 2006; Gill i Tuteja, 2010). ROS su vrlo reaktivne te mogu izazvati inaktivaciju enzima, peroksidaciju lipida, degradaciju proteina i oštećenja molekula DNA koje u konačnici mogu uzrokovati mutacije. Glavnina proizvodnje ROS-a događa se tijekom svjetlosnih reakcija u fotosustavima I i II u kloroplastima te tijekom prijenosa elektrona u mitohondrijima (Mittler, 2002; Navrot i sur., 2007). Kako bi neutralizirale suvišak ROS-a, biljne stanice su razvile složen antioksidativni sustav koji obuhvaća antioksidativne enzime (superoksid dismutaze, katalaze, peroksidaze i dr.) i ne-enzimatske antioksidanse (askorbinska kiselina, tokoferoli, karotenoidi, polifenoli, glutation i dr. (Blokhina i sur., 2003; Ashraf, 2009). Budući da su biljke sesilni 11

12 organizmi i stoga uvijek vezane za svoj okoliš, mogućnost uklanjanja toksičnih spojeva je važna odrednica njihove otpornosti na razne nepovoljne okolišne čimbenike Katalaze Glavnu ulogu u kontroli koncentracije H 2 O 2 u biljnim stanicama ima enzim katalaza (engl. catalase - CAT; EC ) koja katalizira razgradnju vodikovog peroksida u vodu i kisik: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2. Do pojačanog stvaranja H 2 O 2 dolazi kada je biljka izložena jakom ili negativnom djelovanju različitih okolišnih čimbenika (Foyer i sur., 1997). Smatra se da H 2 O 2 ima ulogu signalne molekule zbog relativno dugog vremena poluživota i visoke propusnosti kroz membranu (Kuźniak i Urbanek, 2000; Gechev i sur., 2002). Kao signalna molekula posreduje u otpornosti biljaka na biotički i abiotički stres, ali također i u procesima rasta i razvoja biljke (Bhattacharjee, 2005; Ślesak i sur., 2007). Prekomjerno stvaranje H 2 O 2 u biljnim stanicama povezano je s povećanjem koncentracije kalcijevih iona u citoplazmi. Kalcijevi ioni tada se vežu za kalmodulin koji aktivira katalaze (Yang i Poovaiah, 2001). Katalaza je po svom kemijskom sastavu protein izgrađen od 4 polipeptidna lanca (Slika 3), a pojavljuje se u većem broju izoenzima. Slika 3. Struktura tetramernog enzima katalaze (web 1). 12

13 Izoenzimi katalaze nalaze se uglavnom u peroksisomima i glioksisomima, iako specifične izoenzime nalazimo i u mitohondrijima. Na aktivnost katalaza utječu brojni ekološki čimbenici, kao što su niske temperature, svjetlost, biljni hormoni, ozon, suša i stoga imaju važnu zaštitnu ulogu u odgovoru na oksidativni stres uzrokovan upravo tim čimbenicima (Guan i Scandalios, 2000; Guo i sur., 2006; Nair i sur., 2008) Peroksidaze Peroksidaze su enzimi koji kataliziraju reakcije između vodikovog peroksida i različitih reducensa kao što su fenoli, prekurzori lignina, auksina i sl. (Hiraga i sur., 2001) prema jednadžbi: RH 2 + H 2 O 2 R + 2 H 2 O. Uključene su u mnoge fiziološke procese u biljnim stanicama: katabolizam auksina, sekundarne promjene stanične stijenke (lignifikacija, suberinizacija), zacjeljivanje rana, biosintezu etilena te antioksidativni odgovor (Passardi i sur., 2005). Peroksidaze, kao što su askorbat peroksidaza (engl. ascorbate peroxidase - APX; EC ) i gvajakol peroksidaza (engl. guaiacol peroxidase - GPOX; EC ), su važni za uklanjanje H 2 O 2. APX je lokalizirana u kloroplastima te dijelom u citosolu (Jiménez i sur., 1997), dok je GPOX lokalizirana u vakuolama, staničnoj stijenci te citosolu (Passardi i sur., 2004). Gvajakol peroksidaza uklanja vodikov peroksid uz pomoć fenolnih supstrata te im se aktivnost tijekom različitih stresnih uvjeta povećava (Siegel i Galston, 1967) Fenoli Fenoli su skupina spojeva kod kojih su hidroksilne skupine (-OH) izravno vezane na aromatski ugljikovodik (Rice-Evans i sur., 1997; Slika 4). Prema osnovnoj kemijskoj strukturi dijele se na fenolne kiseline i flavonoide. Fenolne kiseline su biljni metaboliti, rašireni u cijelom biljnom carstvu (Dai i Mumper, 2010). Dvije najvažnije fenolne kiseline su hidroksibenzojeva kiselina i hidroksicimetna kiselina. 13

14 Slika 4. Struktura fenola (web 2). Flavonoidi predstavljaju široku skupinu fenola koje se najčešće nalaze u biljkama i uglavnom se pojavljuju u obliku glikozida. Razlikujemo više skupina flavonoida: flavone, izoflavone, derivate flavana i protocijanida te antocijanida (Lila, 2004). Flavonoidi se sintetiziraju iz prekurzora nastalih putem šikiminske kiseline ili acetat-malonatnim putem (Rice-Evans i sur., 1997). Flavonoidi u biljkama imaju mnoge funkcije, a najvažnija je antioksidativna aktivnost koja se očituje u adsorbiranju i neutraliziranju slobodnih radikala (Wang, 2003), uklanjanju singletnog i tripletnog kisika te uklanjanju peroksida (Pennycooke i sur., 2005). U laticama i plodovima biljaka imaju važnu ekološku ulogu u privlačenju oprašivača i ostalih životinja koje rasprostranjuju plodove. Biljkama su jednostavni fenoli važni za normalan rast i razvoj te obranu od infekcija i ozljeda Učinci niskih temperatura na biljne stanice Niska temperatura je jedan od nepovoljnih ekoloških čimbenika koji ograničava rast, razvoj i prinos biljaka. Niske temperature djeluju prvo na nadzemne dijelove biljke, odnosno na one dijelove koji su izravno izloženi promjenama temperature zraka. Posebno su osjetljivi listovi jer su ostali biljni organi jače zaštićeni. Otpornost biljaka na niske temperature može se svrstati u dvije kategorije: otpornost koja se odnosi na temperature iznad 0 C niske pozitivne temperature (engl. chilling stres), i otpornost koja se odnosi na temperature ispod 0 C negativne temperature (engl. freezing stress). Izloženost biljaka niskim temperaturama ima negativan učinak na biljni razvoj, morfologiju i fiziologiju, čak i ako je njihova izloženost niskim temperaturama bila kratkotrajna. Prvi simptomi uzrokovani pozitivno niskim temperaturama su promjene 14

15 struktura u stanicama, kao što su dezorganizacija kloroplasta i mitohondrija, smanjenje sadržaja škroba i nakupljanje lipida unutar stanica (Wise i sur., 1983; Kratsch i Wise, 2000). Na metaboličkoj razini, dolazi do smanjenja intenziteta fotosinteze i smanjenja rasipanja suviška apsorbirane energije u obliku topline (Öquist, 1983; Cavender-Bares i sur., 1999). Kada temperatura zraka padne ispod 0 o C, unutar stanica se počinju stvarati kristali leda koji mogu uzrokovati mehanička oštećenja i u konačnici pucanje stanica. Niske temperature također uzrokuju pojavu fiziološke suše što dodatno štetno djeluje na biljne stanice (DaMatta i Ramalho, 2006). Ozljede biljaka uzrokovane niskim temperaturama mogu se podijeliti na primarne i sekundarne. Primarne ozljede su privremeni poremećaji biljnog metabolizma i obično su reverzibilne. Kod biljaka koje nemaju sposobnost oporavka od privremenih poremećaja, dolazi do razvoja nepovratnih, sekundarnih ozljeda. Većina vrsta u umjerenim klimatskim regijama su otporne na niske temperature. Taj proces je poznat kao aklimatizacija, a rezultat je brojnih fizioloških i biokemijskih promjena koje poboljšavaju otpornost na niske temperature (Baruah i sur., 2011). Glavni proces u aklimatizaciji biljnih stanica na niske temperature je promjena u sastavu membranskih lipida. Osim toga, metabolizam ugljikohidrata je također važan čimbenik koji je uključen u zaštitu stanica od posljedica niskih temperatura. Ostale prilagodbe uključuju promjene u ravnoteži hormona, ubrzanu izmjenu tvari kroz sustav membrana i promjene u aktivnosti antoksidativnih enzima (Mahajan i Tuteja, 2005). Stres uzrokovan niskim pozitivnim temperaturama inducira povećanje aktivnosti superoksid dismutaze, askorbat peroksidaze, glutation reduktaze i gvajakol peroksidaze te smanjenje aktivnosti katalaze (Ali i Alqurainy, 2006). Ukoliko antioksidativni sustav biljaka nije u mogućnosti uspješno ukloniti ROS dolazi do njihovog povećanog nakupljanja u biljnim stanicama (Lukatkin, 2005). Visoka koncentracija H 2 O 2 u kombinaciji s drugim ROS uzrokuje lipidnu peroksidaciju te brojne druge štetne procese u stanici (Prasad i sur., 1994; Lukatkin, 2002). Lipidna peroksidacija uzrokuje oštećenje staničnih membrana te remeti fiziološke funkcije biljke (Lukatkin, 2002). Intenzivna lipidna peroksidacija u biološkim membranama može dovesti do gubitka fluidnosti, opadanja vrijednosti membranskoga potencijala, povećanja permeabilnosti prema H + i drugim ionima te do mogućeg raspadanja stanice i otpuštanja njezina sadržaja. Koliki će biti intenzitet peroksidacije lipida ovisi o dužini trajanja izloženosti biljke niskim 15

16 temperaturama. Metaboličke promjene postanu trajne samo ako je izloženost niskim temperaturama dovoljno duga, dok kratki hladni intervali ne usporavaju metabolizam trajno Cilj rada Cilj rada je razjasniti mogući mehanizam antioksidativnog odgovora u listovima stevije (Stevia rebaudiana) na stres uzrokovan niskim temperaturama te moguću ulogu vodikovog peroksida kao signalne molekule u povećanju antioksidativne aktivnosti. Cilj je doprinijeti saznanjima o mogućnosti korištenja kratkoročnog izlaganja sadnica stevije pozitivnoj niskoj temperaturi u svrhu povećanja otpornosti biljaka na nepovoljne abiotičke uvjete. 16

17 2. MATERIJALI I METODE 2.1. Biljni materijal i tretman niskim temperaturama Pokusi su provedeni na listovima dvomjesečnih sadnica biljke Stevia rebaudiana Bert. (Slika 5). Slika 5. Stevija (Stevia rebaudiana Bert.; foto: I. Ćavar). Biljke stevije bile su izložene pozitivnoj niskoj temperaturi (4 C) u mraku u trajanju od 3, 6, 9, 24 i 36 h te je nakon toga praćen oporavak biljaka nakon 24 h (REC). U isto vrijeme su kontrolne biljke bile smještene u uzgojnoj komori u kontroliranim uvjetima na 25 C i 50 µmol fotona m -2 s Određivanje koncentracije ukupnih fenola Nakon homogenizacije tkiva u tekućem dušiku, odvagano je oko 100 mg praha. Tkivo je dobro promiješano u 1 ml 96%-tnog etanola. Fenoli su iz tkiva ekstrahirani 24 h na -20 C. Nakon centrifugiranja tijekom 20 min pri rcf, na 20 µl etanolnog ekstrakta listova stevije dodano je 1,58 ml dh 2 O i 100 µl Folin-Ciocalteu reagensa. Dobivena otopina je promiješana i nakon najmanje 30 s, a najviše 8 min u nju je dodano 300 µl zasićene otopine natrijeva karbonata. Reakcijska smjesa je inkubirana u vodenoj kupelji 1 h na 37 C. Ukupni fenoli određeni su spektrofotometrijskom metodom po Folin-Ciocalteu (Singleton i Rossi, 1965) koja se temelji na oksidaciji fenolnih grupa dodatkom Folin-Ciocalteu reagensa uz nastajanje obojenog produkta. Fenolne grupe oksidiraju do kinona dodatkom smjese 17

18 molibdofosfatnih i volframofosfatnih aniona koji se reduciraju i daju plavo obojenje. Nereducirani Folin-Ciocalteu reagens je žute boje, dok reducirani ima stabilnu plavu boju. Intenzitet obojenja mjeren je određivanjem apsorbancije pri 765 nm. Rezultati su izraženi u ekvivalentima galne kiseline koja je korištena kao standard Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti Nakon homogenizacije tkiva u tekućem dušiku, odvagano je 100 mg tkiva i dodano 1 ml 96%-tnog etanola. Nakon 24 h ekstrakcije na -20 C, ukupna antioksidativna aktivnost etanolnih ekstrakata listova stevije određena je metodom po Brand-Williamsu (Brand- Williams i sur., 1995). Metoda se zasniva na redukciji DPPH (2,2-difenil-2-pikrilhidrazil) radikala. Otopina DPPH je ljubičaste boje, a neutralizacijom postaje bezbojna ili blijedožuta (Slika 6). Slika 6. Redukcija stabilnog DPPH radikala (web 3). U mikroepruvete dodano je 5 µl etanolnog ekstrakta i dopunjeno do volumena od 1 ml 0,094 mm otopinom DPPH. Slijepa proba priređena je na isti način samo što je umjesto uzorka dodan čisti etanol. Reakcija se odvijala u čvrsto zatvorenim mikroepruvetama uz lagano miješanje pri 20 C tijekom 15 min. Apsorbancija etanolnih ekstrakata određena je pri 515 nm, a ukupna antioksidativna aktivnost etanolnih ekstrakata izračunata je iz baždarnog pravca u kojem je Trolox korišten kao standard i izražena je u ekvivalentima Troloxa Određivanje koncentracije vodikovog peroksida Nakon homogenizacije biljnog materijala listova stevije u tekućem dušiku, odvagan je 0,1 g biljnog praha u mikroepruvetu te je dodan 1 ml hladnog acetona. Slijepa proba je bila čisti aceton, a svi su daljni koraci provedeni i na biljnom materijalu i slijepoj probi. Sadržaj ili možda rekacijska smjesa je promješana i potom centrifugirana 3 min na 4 C pri 1000 rcf. Nakon centrifugiranja, u odvojeni supernatant dodano je 400 µl titan-sulfata i 500 µl 18

19 koncentriranog amonijevog hidroksida. Zbog jako egzotermne reakcije tijekom dodavanja kemikalija, supernatant je držan na ledu. Uzorci su ponovno dobro promiješani i centrifugirani 10 min na 4 C pri rcf. Nakon centrifugiranja, dobiveni supernatant je odvojen, a talog otopljen u 1 ml 2M H 2 SO 4. Nakon otapanja, uzorak je centrifugiran 10 minuta na 4 C pri rcf, a bistri dio je mikropipetom prebačen u plastičnu kivetu sa suženim dnom. Koncentracija H 2 O 2 određena je metodom po Mukherjee i Choudhouri (1983). Mjerenje apsorbancije vršeno je spektrofotometrijski pri 415 nm Određivanje ukupne aktivnosti katalaze (CAT) Listovi stevije su narezani u porculanski tarionik, posipani polivinilpirolidonom i usitnjeni u tekućem dušiku u fini prah. Oko 0,5 g tako usitnjenog tkiva prebačeno je u prethodno izvaganu kivetu te zatim izvagano i ekstrahirano na ledu s 1 ml ekstrakcijskog pufera (0,1 M K 2 HPO 4, 0,1 M KH 2 PO 4 i 1 mm EDTA ; ph 7,0) u trajanju od 15 minuta. Homogenat je centrifugiran 15 minuta pri rcf na 4 C. Supernatant je korišteni kao sirovi ekstrakt za spektrofotometrijsko određivanje ukupne aktivnosti CAT. Ukupna aktivnost CAT određena je prema Aebi (1984). Reakcijska smjesa (ph 7,0) sadržavala je 0,05 M KH 2 PO 4, 0,05 M K 2 HPO 4 te 0,01 M H 2 O 2. Na 1980 μl reakcijske smjese dodano je 20 μl sirovog ekstrakta proteina i pri valnoj duljini od 240 nm mjereno je smanjenje apsorbancije svakih deset sekundi tijekom dvije minute. Ukupna aktivnost CAT izražena je kao promjena apsorbancije po minuti po gramu svježeg tkiva Određivanje ukupne aktivnosti gvajakol peroksidaze (GPOD) Sirovi proteinski ekstrakti pripremljeni za određivanje ukupne aktivnosti CAT korišteni su i za određivanje ukupne aktivnosti GPOD. Ukupna aktivnost GPOD određena je prema Siegel i Galston (1967). Reakcijska smjesa (ph 5,8) sadržavala je 5 mm gvajakola, 0,2 M KH 2 PO 4, 0,2 M Na 2 PO 4 x 12 H 2 O, te 5 mm H 2 O 2 koji je dodan neposredno prije mjerenja. Na 800 μl reakcijske smjese dodano je 200 μl ekstrakta proteina lista te je povećanje apsorbancije mjereno pri valnoj duljini od 470 nm svake sekunde tijekom dvije minute. Ukupna aktivnost GPOD izražena je kao promjena apsorbancije po minuti po gramu svježeg tkiva. 19

20 2.7. Određivanje koncentracije produkata lipidne peroksidacije Biljni materijal je homogeniziran u tekućem dušiku. U 0,2 g homogeniziranog biljnog tkiva dodan je 1 ml 0,1% trikloroctene kiseline (TCA). Reakcijska smjesa je centrifugirana 5 min na 4 C pri rcf, a u 0,5 ml izdvojenog supernatanta dodano je 1 ml 0,5% tiobarbiturna kiselina u 20% TCA. Ista otopina također je služila kao slijepa proba. Reakcijska smjesa je promješana, a zatim zagrijavana 30 min u vodenoj kupelji na 95 C. Nakon hlađenja, reakcijska je smjesa centrifugirana 15 minuta pri rcf, na 4 C. Supernatant je presipan u plastičnu kivetu sa suženim dnom, a koncentracija produkata lipidne peroksidacije određena je metodom po Heath i Packer L (1968). Ovom se metodom izražava količina produkata lipidne peroksidacije kao reaktanata koji stvaraju obojane spojeve s TBA (engl. thiobarbituric acid reactive substances TBARS). Mjerenje apsorbancije vršeno je spektrofotometrijski pri 532 i 600 nm Statistička obrada podataka U okviru statističke obrade podataka napravljena je analiza varijance (ANOVA) uz post hoc LSD (eng. least significant difference) test na razini značajnosti 5% (p<0,05) korištenjem statističkog paketa Statistica 8. 20

21 3. REZULTATI 3.1. Utjecaj pozitivne niske temperature na koncentraciju fenola Tijekom izlaganja biljaka pozitivno niskim temperaturama u trajanju od 3, 6, 9 i 24h koncentracije fenola u listovima tretiranih biljaka nisu se značajno mijenjale te sukladno tome nisu utvrđene statistički značajne razlike između koncentracija fenola u listovima kontrolnih i biljaka izloženih niskim temperaturama. Nakon izlaganja u trajanju od 24 h utvrđeno je statistički značajno smanjenje koncentracije fenola u listovima kontrolnih biljaka u odnosu na koncentracije utvrđene na početku pokusa, Nakon 36 h izlaganja niskoj temperaturi koncentracija fenola u listovima stevije se povećala za 31,56%, ali se nakon perioda oporavka (24 h) koncentracije fenola u listovima nisu statistički razlikovale od koncentracija utvrđenih na početku pokusa. U listovima kontrolnih biljaka nije bilo značajnih promjena u koncentracijama fenola nakon 36 h izlaganja niskim temperaturama kao i u periodu oporavka (Slika 7). Slika 7. Utjecaj pozitivne niske temperature na koncentraciju fenola u listovima stevije (Stevia rebaudiana). Prosječne vrijednosti označene istim slovom (a,b,c) se ne razlikuju prema LSD testu; p<0,05. REC - faza oporavka. 21

22 3.2. Utjecaj pozitivne niske temperature na ukupnu antioksidativnu aktivnost Ukupna antioksidativna aktivnost u listovima kontrolnih biljaka stevije nije se značajno mijenjala do 36 h od početka pokusa. Nakon 36 h antioksidativna aktivnost se značajno smanjila i ostala je nepromijenjena nakon perioda oporavka. U listovima biljaka izloženih niskoj temperaturi nakon 3 h došlo je do značajnog povećanja antioksidativne aktivnosti u odnosu na vrijednosti na početku pokusa iako se aktivnost nije statistički značajno razlikovala od aktivnosti u listovima kontrolnih biljaka. U tretiranim biljkama ukupna antioksidativna aktivnost je opadala sve do 24 h izlaganja niskim temperaturama, a značajno povećanje utvrđeno je nakon 36 h. Nakon perioda oporavka vrijednosti ukupne antioksidativne aktivnosti se nisu značajno razlikovale između tretiranih i kontrolnih biljaka te su bile značajno manje u odnosu na vrijednosti izmjerene na početku pokusa (Slika 8). Slika 8. Utjecaj pozitivne niske temperature na ukupnu antioksidativnu aktivnost u listovima stevije (Stevia rebaudiana). Prosječne vrijednosti označene istim slovom (a,b,c) se ne razlikuju prema LSD testu; p<0,05. REC - faza oporavka. 22

23 3.3. Utjecaj pozitivno niske temperature na koncentraciju vodikovog peroksida (H 2 O 2 ) U listovima kontrolnih biljaka koncentracija H 2 O 2 se značajno smanjivala u odnosu na koncentracije izmjerene na početku pokusa, dok se u listovima biljaka izloženim niskim temperaturama koncentracija H 2 O 2 nije značajno mijenjala. Kod tretiranih biljaka koncentracija H 2 O 2 je opadala sve do 36 h kada je utvrđeno značajno veća koncentracija (47,87%) u odnosu na kontrolne biljke. Nakon razdoblja oporavka,koncentracija H 2 O 2 u listovima tretiranih biljaka nije se značajno promijenila. U listovima kontrolnih biljaka nakon 24 h koncentracija H 2 O 2 je ponovno dostigla vrijednosti utvrđene na početku pokusa, ali se nakon 36 h i nakon perioda oporavka značajno smanjivala (Slika 9). Slika 9. Utjecaj pozitivne niske temperature na koncentraciju H 2 O 2 u listovima stevije (Stevia rebaudiana). Prosječne vrijednosti označene istim slovom (a,b,c) se ne razlikuju prema LSD testu; p<0,05. REC - faza oporavka. 23

24 3.4. Utjecaj pozitivne niske temperature na ukupnu aktivnost katalaze (CAT) Ukupna aktivnost CAT nakon 3 h izlaganja niskoj temperaturi povećala se za 64,3% u odnosu na aktivnost utvrđenu na početku pokusa, dok se kod kontrolnih biljaka aktivnost nije značajno mijenjala sve do 24 h. Nakon 6 h izlaganja, ukupna aktivnost CAT značajno se smanjivala te je nakon 9 h ponovno aktivnost u listovima kontrolnih biljaka i biljaka izloženih niskim temperaturama bila ujednačena. Nakon 24 h tretmana ukupna aktivnost CAT povećala se u listovima i kontrolnih i tretiranih biljaka. Dok u listovima tretiranih biljaka aktivnost ostaje nepromijenjena nakon 36 h, u listovima kontrolnih biljaka se značajno smanjila. Nakon perioda oporavka aktivnost CAT u listovima kontrolnih biljaka i biljaka izloženih niskim temperaturama nisu se statistički značajno razlikovale (Slika 10). Slika 10. Utjecaj pozitivne niske temperature na ukupnu aktivnost CAT u listovima stevije (Stevia rebaudiana). Prosječne vrijednosti označene istim slovom (a,b,c) se ne razlikuju prema LSD testu; p<0,05. REC - faza oporavka. 24

25 3.5. Utjecaj pozitivne niske temperature na ukupnu aktivnost gvajakol peroksidaze (GPOD) Ukupna aktivnost GPOD bila je 60,76% veća u listovima biljaka izloženim niskim temperaturama nakon 6 h tretmana u odnosu na aktivnost utvrđenu na početaku pokusa (Slika 11). Nakon značajnog smanjenja aktivnosti utvrđenog nakon 9 h izlaganja biljaka niskim temperaturama, aktivnost se nije značajno mijenjala. Povećanje aktivnosti za 77,57% u odnosu na aktivnosti na početku pokusa utvrđeno je nakon 36 h tretmana. Aktivnosti GPOD u listovima kontrolnih biljaka nisu se statistički razlikovale od aktivnosti utvrđenih u listovima tretiranih biljaka samo na početku pokusa te nakon razdoblja oporavka. Slika 11. Utjecaj pozitivne niske temperature na ukupnu aktivnost GPOD u listovima stevije (Stevia rebaudiana). Prosječne vrijednosti označene istim slovom (a,b,c) se ne razlikuju prema LSD testu; p<0,05. REC - faza oporavka. 25

26 3.6. Utjecaj pozitivne niske temperature na koncentraciju produkata lipidne peroksidacije Koncentracija produkata lipidne peroksidacije u listovma stevije nakon 3 h izlaganja pozitivnoj niskoj temperaturi se smanjila u odnosu na koncentracije utvrđene u listovima na početku pokusa, kao i u listovima kontrolnih biljaka. Nakon 6 h koncentracija produkata lipidne peroksidacije se značajno povećavala u listovima tretiranih biljaka, a najviše su koncentracije utvrđene nakon 24 h. Nakon 36 h izlaganja niskim temepraturama koncentracija produkata lipidne peroksidacije se smanjila i nije se značajno promijenila nakon razdoblja oporavka. U listovima kontrolnih biljaka koncentracija produkata lipidne peroksidacije bila je značajno viša u odnosu na koncentracije u listovima biljaka izloženih 3 i 6 h niskim temparaturama. Nakon 9 h i sve do kraja pokusa koncentracije su u listovima tretiranih biljaka bile statistički značajno veće u odnosu na koncentracije u listovima kontrolnih biljkama (Slika 12). Pojava smeđih mrlja na listovima biljaka stevije nakon 36 h tretmana niskom temperaturom ukazuje na oštećenja biljnog tkiva uslijed štetnog djelovanja ROS-a (Slika 13). Slika 12. Utjecaj pozitivne niske temperature na koncentraciju produkata lipidne peroksidacije u listovima stevije (Stevia rebaudiana). Prosječne vrijednosti označene istim slovom (a,b,c) se ne razlikuju prema LSD testu; p<0,05. REC - faza oporavka. 26

27 Slika 13. Biljka stevije nakon 36 h izlaganja niskoj pozitivnoj temperaturi. Strelica označava pojavu smeđih mrlja kao posljedice oštećenja biljnog tkiva (foto: I.Ćavar). 27

28 4. RASPRAVA Kratkotrajna izlaganja niskim temperaturama (do 12 h) bila su provedeni u mraku kako bi se isključio mogući utjecaj fotoinhibicije, stoga su sve reaktivne kisikove jedinke (ROS) proizvedene u reakcijama transporta elektrona izvan kloroplasta. Dugotrajna izlaganja (24 i 36 h) su bili provedena s međuperiodom 12 h svjetla pri temperaturi od 25 C. Poznato je da niske temperature rezultiraju produkcijom superoksidnih radikala i/ili H 2 O 2 u mitohondrijima (Purvis i Shewfelt, 1993; Prasad i sur., 1995). Prasad i sur. (1995) su utvrdili da se uslijed tretmana niskim temperaturama aktivnosti mitohondrijske ATP-aze i citokrom oksidaze II smanjuju što u konačnici može rezultirati povećanom produkcijom ROS-a, uključujući i H 2 O 2. Upravo zato se mitohondriji smatraju organelima koji su glavni izvor ROS-a tijekom djelovanja niskih temperatura u mraku, dok su tijekom djelovanja niskih temperatura na svjetlu glavni proizvođač ROS-a kloroplasti (Allen i Ort, 2001). Dosadašnja istraživanja pokazuju da se uslijed tretmana niskim temperaturama kod biljaka osjetljivih na hladnoću povećava koncentracija H 2 O 2 u listovima (Okuda i sur., 1991; Hariyadi i Parkin, 1993) što dovodi do povećanja peroksidacije lipida, jednog od glavnih pokazatelja oksidativnog stresa. Tijekom perioda prilagodbe biljaka na niske temperature vrlo brzo dolazi do nakupljanja H 2 O 2 koji inducira aktivnost antioksidacijskih enzima, dok se kod neprilagođenih biljaka H 2 O 2 nakuplja do koncentracija koje mogu imati štetne posljedice za biljna tkiva, vjerojatno zbog niske aktivnosti antioksidacijskih enzima (Prasad, 1996). Ta činjenica ukazuje na moguću dvostruku ulogu H 2 O 2 u odgovoru biljaka na niske temperature: u malim koncentracijama može imati ulogu signalne molekule i sekundarnog glasnika, dok velike koncentracije mogu imati toksičan učinak na biljnu stanicu (Prasad i sur., 1994; Suzuki i Mittler, 2006). U ovom istraživanju koncentracija H 2 O 2 počinje opadati nakon 6 h izlaganja niskoj temperaturi sve do nakon 24 h izlaganja kad je utvrđeno povećanje. Nakon 36 h izlaganja utvrđena je maksimalna koncentracija H 2 O 2 koja i nakon perioda oporavka ostala nepromijenjena (Slika 9). Smanjenje koncentracija H 2 O 2 u listovima stevije tijekom kratkotrajnog izlaganja niskim temperaturama podudara se s povećanjem aktivnosti CAT i GPOD te s nižim vrijednostima peroksidacije lipida (Slike 10, 11 i 12). Katalaze su, zajedno s peroksidazama, glavni enzimi koji sudjeluju u uklanjanju vodikovog peroksida nastalog tijekom različitih procesa u biljnim stanicama. Iako je prisutnost katalaza ograničena na 28

29 peroksisome i glioksisome, one igraju važnu ulogu u uklanjanju vodikovog peroksida koji kao plinovita molekula lako prolazi kroz membranske sustave (Bowler i sur., 1992). Od svih nepovoljnih okolišnih činitelja, manjak svjetlosti i temperaturne promjene najznačajnije utječu na aktivnost katalaza. (Volk i Feirabend, 1989; Willekens i sur., 1997; Matsumura i sur., 2002; Sairam i sur., 2002). Aktivnost CAT se u listovima stevije vrlo brzo inducira (nakon 3h tretmana niskom temperaturom, te nakon 6h tretmana počinje opadati (Slika 10). Dosadašnja istraživanja ukazala su na važnost CAT3 prisutne u mitohondrijima u odgovoru na niske temperature u mraku koja se inducira kod aklimatiziranih klijanaca kukuruza, dok kod neaklimatiziranih klijanaca i tijekom perioda oporavka njena aktivnost opada uslijed gubitka izoenzima (Prasad i sur., 1996; Anderson i sur., 1995). Upravo zbog toga, Prasad (1997) smatra katalazu iz mitohondrija ključnim čimbenikom otpornosti biljaka na niske temperature u uvjetima mraka. Brojna istraživanja ukazuju na smanjenje aktivnosti katalaze uslijed tretmana niskim temperaturama uz jako svjetlo kao rezultat oksidativne inaktivacije (Volk i Feierabend, 1989; Feierabend i sur., 1992; Mishra i sur., 1993; Gechev i sur., 2000). Anderson i sur. (1995) su pokazali da su CAT1 i u manjoj mjeri CAT3 podložne oksidativnoj inaktivaciji in vitro. S druge strane, poznato je da niske temperature uz svjetlost ubrzavaju degradaciju CAT i uzrokuju neučinkovit mehanizam popravka (Hertwig i sur., 1992). Uslijed smanjenja aktivnosti CAT u biljnim stanicama vrlo brzo dolazi do akumulacije ROS-a, prvenstveno H 2 O 2. Upravo zbog osjetljivosti katalaze na niske temperature važna je kompenzacijska uloga peroksidaza u antioksidativnom odgovoru (Scebba i sur., 1998). Štoviše, simultano povećanje nekoliko komponenti antioksidativnog sustava potrebno je kako bi se razvila otpornost na određeni tip stresa (Foyer i sur., 1994). Iako nakon dužeg izlaganja niskim temperaturama (36 h) dolazi do značajnog povećanja aktivnosti GPOD, one nisu spriječile pojavu oksidativnog stresa što dokazuju veće vrijednosti produkata peroksidacije lipida i koncentracije H 2 O 2 u tretiranim biljkama stevije u odnosu na kontrolne biljke u tom periodu (Slike 9, 11 i 12). Anderson i sur. (1995) su pokazali da se u klijancima prilagođenim na niske temperature inducira najmanje 9 izoenzima peroksidaza, od toga dvije u staničnoj stijenci, što ukazuje na njihovu ulogu u otpornosti na niske temperature. Prasad i sur. (1995) utvrdili su ulogu peroksidaza iz mitohondrija u održavanju niske koncentracije H 2 O 2. Osim što sudjeluju u antioksidativnom odgovoru, gvajakol peroksidaze su heterogena skupina enzima koji imaju važnu ulogu u velikom broju fizioloških procesa kao što su lignifikacija staničnih stijenki, 29

30 rast i razvoj biljaka, senescenca te u odgovoru na patogene i ozljede (Passardi i sur., 2005). Peroksidaze oksidiraju slobodne fenole u kinone, a zatim kondenzirane tanine u smeđe polimere koji nastaju kao posljedica ozljeda biljnog tkiva (Richard i Gauillard, 1997). U enzimskoj reakciji troše H 2 O 2 te na taj način sudjeluju u regulacije njegove koncentracije u biljnim stanicama. U ovom istraživanju najveća aktivnost GPOD podudarala se s najvećom koncentracijom ukupnih fenola nakon 36 h izlaganja niskoj temperaturi (Slike 7 i 11), a ujedno i s pojavom smeđeg obojenja na tkivu lista. Stoga je vjerojatno povećanje aktivnosti GPOD povezano s pojavom smeđih mrlja na tkivu lista uslijed dugotrajnog izlaganja niskoj temperaturi. Luo i sur. (2012) utvrdili su značajnu pozitivnu vezu između indeksa smeđenja tkiva bambusa i aktivnosti peroksidaza tijekom perioda skladištenja pri niskim temperaturama. Nguyen i sur. (2003) su smeđenje tkiva banane tijekom skladištenja povezali s povećanim aktivnostima fenil amonij lijaze (PAL), ključnog enzima u biosintezi fenola, i sadržaja slobodnih fenola. Fenoli, osim što su važni antioksidansi u prehrani čovjeka, također u biljnim stanicama imaju važnu ulogu u uklanjanju ROS-a. Njihova antioksidativna aktivnost određena je njihovom sposobnošću doniranja elektrona ili vodika te stabilizacije i delokalizacije nesparenih elektrona, ali i reaktivnošću s ostalim antioksidansima te potencijalom za kelatiranje metala (Rice-Evans i sur., 1997). Uslijed djelovanja različitih nepovoljnih ekoloških činitelja dolazi do akumulacije fenolnih sekundarnih metabolita u biljnim stanicama (Khan i sur., 2011). Rivero i sur. (2001) su pokazali da temperaturni stres (niske i visoke temperature) uzrokuju akumulaciju fenola kod rajčice i lubenice aktivacijom njihove sinteze i sprečavanjem njihove oksidacije. Također, akumulaciju fenola, a i povećanu antioksidativnu aktivnost utvrdili su Pennycooke i sur. (2005) u listovima petunije tijekom aklimatizacije na nisku pozitivnu temperaturu (5 C). U ovom istraživanju utvrđena je značajna pozitivna korelacija između ukupne antioksidativne aktivnosti i koncentracije fenola u listovima stevije (r=0,2883; p=0,038). Wojdyło i sur. (2007) utvrdili su značajnu povezanost fenola i ukupne antioksidativne aktivnosti kod porodice Compositae (R= 0,67-0,96). Neki su autori dosada utvrdili linearnu korelaciju između sadržaja fenola i ukupne antioksidativne aktivnosti (Cai i sur., 2004; Katsube i sur., 2004; Djeridane i sur., 2006; Pourmorad i sur., 2006; Katalinic i sur., 2006, 30

31 Nickavar i sur., 2008), dok su drugi utvrdili slabu korelaciju (Czapecka i sur., 2005; Wong i sur., 2006). Osim fenola, na antioksidativnu aktivnost također djeluju i ostali ne-fenolni antioksidativnih komponenti te ona može biti rezultat njihovog sinergijskog efekta (Nickavar i sur., 2008). 31

32 5. ZAKLJUČCI Kratkotrajno izlaganje niskoj temperaturi inducira antioksidativni odgovor u listovima stevije što pokazuju povećane ukupne aktivnosti CAT i GPOD te smanjene koncentracije H 2 O 2 i koncentracije produkata lipidne peroksidacije. Dugotrajno izlaganje niskoj temperaturi smanjuje efikasnost enzimskog antioksidativnog sustava u listovima stevije što uzrokuje povećanje koncentracije H 2 O 2 i koncentracije produkata lipidne peroksidacije glavnog pokazatelja oksidativnog stresa. Dugotrajno izlaganje niskoj temperaturi uzrokuje povećanje ukupne antioksidativne aktivnosti, aktivnosti GPOD i povećanje koncentracije fenola koji nisu značajno utjecali na smanjenje oksidativnog stresa u listovima stevije. Kratkotrajno izlaganje stevije pozitivnoj niskoj temperaturi moglo bi imati pozitivan učinak na razvoj otpornosti biljaka kako na niske temperature, tako i na ostale nepovoljne abiotičke i biotičke čimbenike. Međutim, kako bi se utvrdili pozitivni učinci ovog postupka, potrebno je detaljnije istražiti ostale enzime i ne-enzimatske komponente uključene u antioksidativni odgovor. 32

33 6. METODIČKI DIO U ovom dijelu prikazana je priprema za nastavnu temu "Djelovanje okolišnih čimbenika na rast i razvitak biljaka" koja se obrađuje u trećem razredu gimnazije. Priprema prikazuje uobičajen tijek sata na navedenu nastavnu temu u kojoj je jasno definiran cilj i postignuća, te na kraju pitanja predviđena da se njima ispita jesu li zadani cilj i definirana postignuća ostvarena. Nadalje, priprema sadrži i sve planirane aktivnosti za učenike i nastavnike, kao i oblike i metode rada za pojedini dio sata (uvodni dio, središnji dio i ponavljanje). Prikazana priprema dobar je pokazatelj plana za ostvarenje motivacije, konceptualnog znanja, stupnja uključivanja učenika u nastavu putem korištenja i kombiniranja različitih metoda i oblika rada, te postavljanjem raznolikih pitanja kojima se provjerava znanje na različitim stupnjevima kognitivnog ponašanja. Prema planiranim aktivnostima može se prepoznati kvaliteta komunikacije između nastavnika i učenika, ali i između samih učenika, dok je originalnost u izradi pripreme jedan od pokazatelja osobnosti nastavnika. PLAN NASTAVNOG SATA Predmet: BIOLOGIJA Razred: 3. Školska godina: 2011./2012. Nastavna cjelina: Životni procesi u biljkama Nastavna tema (jedinica): Djelovanje okolišnih čimbenika na rast i razvoj biljaka Ključni pojmovi: dormancija, vernalizacija, cirkadijani ritmovi, biljke kratkog i dugog dana Osnovni koncept: dormancija, vernalizacija Kompetencije učenika: Učenik će znati nabrojati čimbenike koji utječu na rast i razvoj biljke, definirati dormanciju, opisati ulogu cirkadijanih ritmova i definirati vernalizaciju. Učenik će razviti pozitivan stav prema uzgoju biljaka i paziti na floru u svojoj okolini. Cilj nastavnog sata: Objasniti djelovanje ekoloških čimbenika (temperature, intenziteta i trajanja svjetlosti) na rast i razvoj biljaka. Definirati i na primjerima opisati dormanciju u biljaka. Definirati i opisati vernalizaciju. 33

34 Postignuća (ishodi): 1. Upoznati biljku steviju Razrada: a) Opisati koji su povoljni uvjeti potrebni biljkama za razvoj Razina: 3. b) Definirati dijelove biljke Razina: 1. c) Istaknuti ljekovito djelovanje stevije Razina: 2. d) Navesti utjecaj stevije na razinu glukoze u krvi Razina: Objasniti utjecaj okolišnih čimbenika na rast i razvoj biljke Razrada: a) Shvatiti da osim gena na rast i razvoj biljaka utječu i čimbenici iz okoliša Razina: 3. b) Spoznati da su najvažniji okolišni čimbenici temperatura i svjetlost Razina: 2. c) Naučiti da svjetlost utječe na razvoj biljke svojim intenzitetom i trajanjem Razina: 1. d) Nabrojati fenološke pojave koje se pojavljuju kod biljke tijekom godine Razina: Spoznati utjecaj svjetlosti na rast i razvoj biljke Razrada: a) Objasniti koje razvojne promjene uzrokuje svjetlost Razina: 3. b) Definirati cirkadijane ritmove Razina: 1. c) Uočiti promjene na biljkama u zamračenom prostoru, bez svjetlosti Razina: 2. d) Nabrojati podjelu biljaka s obzirom na duljinu dnevne osvjetljenosti Razina: Spoznati utjecaj temperature na rast i razvoj biljke Razrada: a) Istaknuti kakav utjecaj imaju različite temperature na rast i razvoj biljaka Razina: 2. b) Definirati pojam dormancije ili razdoblja mirovanja Razina: 1. c) Objasniti stratifikaciju ili prekid dormancije Razina: 3. d) Definirati razvojni proces vernalizacija Razina: Navesti karakteristike biljaka dugoga dana i kratkoga dana Razrada: a) Objasniti razliku između biljaka dugog dana i biljaka kratkog dana Razina: 3. b) Navesti primjer biljaka dugog dana Razina: 1. c) Navesti primjer biljaka kratkog dana Razina: 1. d) Objasniti karakteristike dnevno neutralnih biljaka Razina: 3. Tip nastavnog sata: sat obrade novog nastavnog sadržaja Oblici rada: frontalno, grupno, individualno Za nastavu pripremiti: udžbenik, križaljku, sjemenke stevije, slika biljke stevije Literatura: stručna: Ž. Lukša, S. Mikulić, Život 3, udžbenik biologije za 3. razred gimnazije, Školska knjiga, Zagreb didaktičko- metodička: Ž. Lukša, S. Mikulić, Život 3, priručnik za profesore biologije za 3. razred gimnazije, Školska knjiga, Zagreb 34