Krvno-moždana barijera

Transcription

1 Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 633 UDC 616.8:612:017.1 Krvno-moždana barijera Evica Dinčić*, Aco Jovičić*, Bratislav Magdić*, Petar Popović, Dragana Đorđević*, Ranko Raičević* Vojnomedicinska akademija, *Klinika za neurologiju, Institut za medicinska istraživanja, Beograd Ključ ne reč i : krvno-moždana barijera; endotel krvnih sudova; imunski sistem; zapaljenje, medijatori. K e y w o r d s : blood-brain barrier; endothelium, vascular; immune system; inflammation mediators. Da bi sa uspehom obavljao najsuptilniju i najsavršeniju ulogu koja mu je dodeljena u organizmu, priroda se pobrinula da mozak u izvestnoj meri postavi iznad dešavanja u ostatku organizma i formiravši, između ostalog, neku vrstu barijere između krvi i moždanog tkiva. Prema savremenom konceptu unutar centralnog nervnog sistema (CNS) postoje četiri barijere: 1. krvno-moždana barijera (krv - vanćelijski prostor); 2. krvno-likvorska barijera ( krv - likvorski prostor); 3. barijera membrane parenhimskih ćelija (vanćelijski - unutarćelijski prostor); 4. vanćelijska barijera (likvor-vanćelijski prostor) (1). Nemački istraživači su pre više od sto godina eksperimentalnim radovima u in vivo uslovima pokazali postojanje krvno-moždane barijere (2). Od tada neprestano traju napori sa ciljem razjašnjenja njene mikrostrukture i mehanizama funkcionisanja. Strukturno, krvno-moždana barijera (KMB) je jednoslojni niz specijalizovanih, nefenestriranih, mikrovaskularnih endotelnih ćelija (EĆ), koje su međusobno spojene čvrstim vezama i lišene transcelularnih pora (3). Oko ovog kontinuiranog sloja kapilara nalazi se bazalna membrana i sloj pericita. Periciti su kontraktilne ćelije (glatke mišićne ćelije) koje svojim produžecima obavijaju kapilare. Iako njihovo mesto u funkcionisanju KMB za sada nije razjašnjeno, zna se da ove ćelije produkuju i sekretuju brojne imunomodulatorne agense koji mogu da utiču na imunsku reakciju unutar CNS (4). Perivaskularne ćelije se, takođe, nalaze duž endotelnih ćelija moždanih kapilara i prema rezultatima studije Angelova i saradnika (5) imaju ulogu u imunskoj reakciji u CNS. Naime, pokazano je da su perivaskularne ćelije koje se nalaze u blizini bazalne lamine EĆ KMB, slično makrofagima, sposobne za fagocitozu i prezentaciju antigena (5). Usled toga moguće je da cerebralne perivaskularne ćelije predstavlju prvu liniju odbrane u CNS. U čvrstom kontaktu sa spoljašnjom površinom moždanog endotela nalazi se protoplazmatski tip astrocita. Astrociti imaju značajnu ulogu u razvoju KMB, a zatim aktivno učestvuju u obavljanju njenih funkcija koordinišući aktivnost mikrovaskularnih moždanih endotelnih ćelija (6). Ove ćelije učestvuju u održavanju jonske homeostaze, modulišu endokrinu funkciju endotela, učestvuju u proizvodnji azotnog oksida, oslobađaju hemokine (1). Na propustljivost KMB astrociti mogu uticati i preko modulacije ekspresije athezijskih molekula na endotelnim ćelijama barijere (7). Bez obzira na opisani položaj i značaj astrocita dokazano je da, za razliku od beskičmenjka, kod kičmenjaka astrociti ne čine sastavni deo KMB (8) (sl. 1). Endotelne ćelije KMB, fenotipski različite od perifernih (9), pokazuju dve karakteristične osobine: izuzetno mali broj endocitnih vezikula i postojanje čvrstih veza između ćelija, čime se limitira i transcelularni i paracelularni transport. Navedene osobine endotelnih ćelija KMB nezavisno su regulisane (sl. 2). Pod fiziološkim uslovima EĆ KMB imaju aktivna antiinflamatorna i antitrombotička svojstva (1), kao i sposobnost efikasnog ograničavanja ulaska jona, proteina i drugih polarnih molekula u CNS. Poznato je da mali i liposolubilni molekuli prolaze kroz KMB, dok mali i veliki hidrofilni molekuli zahtevaju aktivni transport (10). U slučaju esencijalnih hranljivih materija kao što je glukoza i pojedine aminokiseline, prolazak je posredovan specifič- Dinčić E, et al. Vojnosanit Pregl 2002; 59(6):

2 Страна 634 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6 Meningealne ćelije Bazalna membrana Kapilar Astrocit Astrocit Oligodendrocit Pukotinasti spoj Ranvijerovo suženje Telo nerva Mijelinski omotač Sinapsa Sl. 1 Astrocitna mreža u CNS-u Ependimske ćelije Čvrsta veza (1) (2) Pericit Interćelijska veza Pinocitozna vezikula Pora sa dijafragmom Mitohondrija Bazalna membrana LUMEN Mitohondrija Jedro Pinocitozne vezikule Jedro Astrocitni produžetak Sl. 2 Poprečni presek kapilara unutar CNS-a i na periferiji nim membranskim transportnim proteinima, koji su prisutni u visokoj koncentraciji u EĆ mozga. Aktivni transport za pojedine makromolekule može da bude posredovan i receptorima. Najbolje proučen od njih je receptor za transferin (CD 71) (11). Jedan od značajnih transportnih molekula, P-glikoprotein, prisutan je u visokoj koncentraciji u moždanim kapilarima sa specifičnom sposobnošću transporta liposolubilnih molekula nazad u cirkulaciju iz moždanog tkiva (12). Sa druge strane, permeabilnost ove membrane umnogome zavisi od stabilnosti međućelijskih veza, koje vrlo često bivaju modifokovane, kako u fiziološkim, a naročito patološkim okolnostima. S obzirom na to da čvrste veze predstavljaju, najverovatnije, glavnu funkcionalnu komponentu KMB, opravdan je interes za rasvetljavanje strukture i regulacije ovih veza. Kompleks interćelijskih veza EĆ KMB koji čine atherentne i čvrste veze uočava se sa izvesnim strukturnim razlikama i između epitelnih ćelija, koje u izvesnim karakteristikama pokazuju značajnu sličnost sa endotelnim ćelijama mozga. Pokazano je da se čvrste i atherentne veze međusobno razlikuju i strukturno i biohemijski. Same atherentne veze se, pak, ostvaruju kontaktom između ćelijskih membranskih molekula athezije, kadherina. Pretpostavlja se da proteini atherentnih veza utiču na proteine čvrste veze preko citoplazmatskih i citoskeletnih komponenata, ali i to da čvrste veze zavise od atherentnih veza. Tako su eksperimenti Gumbinera i Simonsa (13) pokazali da antitela prema E- kadherinu (epitelni athezijski molekul zavisan od kalcijuma) blokiraju formiranje čvrstih veza. Pored toga što atherentne veze prethode nastanku čvrstih veza, njihova intaktnost je potrebna i za održavanje čvrstih veza. Dok je kod nekih

3 Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 635 epitelnih ćelija kompleks koji čine čvrste veze jasno odvojen od atherentnih veza, dotle kod drugih tipova ćelija, uključujući i EĆ mozga, postoji izvesna prepletenost i međuzavisnost atherentnih i čvrstih veza (14). Korišćenjem monoklonskih antitela prema antigenima čvrstih veza prvi put su strukturno i funkcionalno okarakterisani proteini koji ulaze u njihov sastav. Prvi identifikovani protein, bio je tzv. protein ZO-1 (15) za koga je, kao i za nekoliko nakon toga otkrivenih proteina (ZO-2, 7H6 antigen i cingulin) (16), pokazano da se nalaze samo u citoplazmi i sami po sebi ne učestvuju u funkciji barijere. Tek kasnije je identifikovan protein čvrste veze, okludin (17), koji u svojoj strukturi ima i membranski i citoplazmatski deo. Svojim citoplazmatskim delom okludin formira kompleks sa prethodno pomenutim proteinima. Uprkos progresu u identifikaciji ovih proteina, njihova uloga u permeabilnosti nije još potpuno razjašnjena. Međućelijsku atheziju i formiranje atherentnih veza omogućavaju već pomenuti membranski proteini, kadherini. Klase kadherina, kao što su E, P i N, po strukturi su transmembranski glikoproteini koji ostvaruju homotipske veze u prisustvu jona kalcijuma (18). Njihov citoplazmatski deo spaja se sa kateninima, grupom proteina koji ih povezuju sa citoskeletom i drugim signalnim molekulima (19). Kadherini i katenini su lokalizovani u predelu međućelijskih veza EĆ mozga i čine deo sistema preko kojeg čvrste i atherentne veze komuniciraju. Pored navedenih, veliku ulogu u formiranju međućelijskih veza ima PECAM-1 (pleitelet endothelial cell athesion molecule-1). Većina pomenutih proteina čvrste i atherentne veze ne pokazuje razliku u gustini ispoljavanja na EĆ KMB i endotelu perifernih tkiva. Međutim, okludin je u znatno većoj meri prisutan na endotelnim ćelijama mozga (20), usled čega one više podsećaju na epitelne ćelije koje i same imaju sposobnost formiranja čvrstih veza. Međutim, pojačano ispoljavanje okludina pojavljuje se tek u završnoj fazi razvoja KMB kada je već uspostavljena njena funkcija visoko selektivne propustljivosti (20), što ukazuje da neki, do sada nepoznati, funkcionalni ekvivalent okludina postoji ispoljen na KMB još u njenim početnim fazama razvoja i, što je važnije, omogućava njenu funkciju visoko specijalizovane polupropustljive membrane. Takođe, iako nedvosmisleno pokazan značaj okludina u potpunom formiranju čvrstih veza, on nije dovoljan i za formiranje visoko rezistentne veze. Novija saznanja govore da je stepen fosforilacije proteina koji ulaze u sastav čvrste veze, bitan faktor koji može značajno da utiče na formiranje visoko rezistentne veze (21). Pokazano je da karakteristike ovih veza zavise i od stepena fosforilacije tirozina u proteinima atherentnih (međućelijskih) veza. Određene tirozin kinaze i tirozin fosfataze su udružene sa kadherin-katenin kompleksom (22). Postoje dokazi da inhibicijom tirozin fosfataza (suprimira se njihova funkcija defosforilacije) dolazi do povećanja nivoa tirozinske fosforilacije proteina koji ulaze u sastav veza, čime se slabi athezija veze. Skorašnji radovi pokazuju da se stepen tirozinske fosforilacije proteina veze smanjuje nakon kontakta između endotelnih ćelija i tokom sazrevanja veza (23). Mogući supstrat tirozinske fosforilacije su i proteini p-120 i p-100, povezani sa kadherin-katenin kompleksom (24). Stepen fosforilacije ovih proteina, kako na tirozinu, tako i na serinu i treoninu zavisi od različitih stimulusa za koje je pokazano da menjaju permeabilnost čvrstih veza (25). Pored ovih promena u ćelijskoj atheziji izazvanih fosforilacijom proteina adherentne veze i njihovim posrednim uticajem na čvrste veze, pokazano je da se i proteini čvrste veze uključujući i sam okludin fosforilišu (26). Strukturno vrlo složena, KMB svojom funkcijom zauzima bitno mesto u fiziologiji CNS, kao i u patofiziološkim procesima u okviru brojnih oboljenja koja zahvataju moždano tkivo. Međutim, i danas postoji neslaganje o vremenu nastanka, odnosno uzročno-posledičnoj vezi disfunkcije barijere i ostalih dešavanja (ulaska aktiviranih ćelija imunskog sistema u moždano tkivo) tokom različitih patoloških zbivanja unutar CNS. KMB je ranije smatrana statičkom barijerom, dok nove studije pokazuju da EĆ KMB formiraju dinamički prostor između krvi i moždanog tkiva na čiju se funkciju može uticati brojnim lekovima i endogenim faktorima kao što su bradikinin i citokini (27). Regulacija njenog funkcionisanja je vrlo složena i za sada nedovoljno jasna. Same EĆ su moćan endokrini sistem, sa sposobnoću sinteze i oslobađanja raznovrsnih bioaktivnih materija sa autokrinim i parakrinim delovanjima (1). Poseban značaj KMB ima u prometu ćelija iz krvi u moždano tkivo i obratno, što je proces koji je prisutan i u patološkim i fiziološkim okolnostima. Aktivirani limfociti i neke maligne ćelije prolaze kroz intaktnu KMB. Ove ćelije imaju sposobnost da prepoznaju i vežu se za EĆ mozga i da otpočnu proces otvaranja veza unutar KMB (21). Kada su u pitanju limfociti, vezivanje za endotelne ćelije je proučavano vrlo detaljno, bilo da se radi o normalnom prolasku limfocita kroz intaktnu KMB u sklopu procesa imunološkog nadzora CNS, ili da se radi o ulasku i proliferaciji aktiviranih limfocita specifičnih prema komponentama CNS-a, kao što je slučaj kod multiple skleroze. Ono što je najmanje poznato jeste sam mehanizam prolaska ćelija kroz KMB. Ima autora koji smatraju da se prolazak dešava transcelularno kroz same endotelne ćelije, dok su drugi mišljenja da se prolazak odvija paracelularno (po otvaranju čvrstih veza). Ostaje još uvek nejasno kako kroz intaktnu KMB pod fiziološkim okolnostima prolaze ćelije dok barijera i dalje ostaje nepropusna za male molekule. Smatra se da ćelije prolaze kroz KMB aktivirajući unutarćelijske signalne puteve koji kontrolišu stabilnost čvrstih veza. Na primer, leukociti imaju sposobnost aktiviranja tirozin kinaza, bilo direktno vezivanjem za EĆ mozga ili, pak, sekrecijom citokinima sličnih molekula. Jedan od signalnih glasnika verovatno je i kalcijum, s obzirom na to da je pokazano da neutrofili omogućavaju njegov ulazak u EĆ nakon athezije, što omogućava njihovu transmigraciju (28). Pretpostavlja se da su promene u permeabilnosti KMB, van uočljivih morfoloških promena i prisutnih oboljenja koja bi menjala svojstva KMB, posredovane aktivacijom

4 Страна 636 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6 kinaza i fosfataza vezanih za proteine veze endotelnih moždanih ćelija (21). U sklopu ovog koncepta, po kome centralno mesto zauzima nepermeabilnost KMB, treba pomenuti i drugu krajnost i postojanje delova moždanog tkiva bez KMB, tzv. cirkumventrikularni organi, u okviru kojih postoji regionalna regulacija permeabilnosti moždanih kapilara. Migracija kroz endotel Migracija leukocita kroz endotel kroz oštećenu KMB jedna je od glavnih karakteristika mnogih inflamatornih i imunološki posredovanih oboljenja CNS. Međutim, događaji koji regulišu ulazak ćelija iz krvi u moždano tkivo i na taj način utiču na progresiju neuroloških bolesti nisu potpuno rasvetljeni. Visok strukturni, kao i imunski integritet i specifičnost koju poseduje KMB ostvaren je zahvaljujući ograničenom ispoljavanju antigena u okviru molekula glavnog kompleksa tkivne podudarnosti na EĆ KMB, smanjenjem njihove sposobnosti da funkcionišu i kao antigen prezentujuće ćelije, kao i povećanjem lokalnih mehanizama imunosupresije. Sve zajedno CNS čini imunološki privilegovanom regijom. Pod normalnim homeostatskim okolnostima postoji značajno ograničenje ulaska leukocita u mozak (29), dok promene u funkcionisanju KMB, koje se uočavaju u mnogim oboljenjima CNS, rezultuju oštećenjem integriteta i povećanjem permeabilnosti KMB. Proces transendotelne migracije leukocita u CNS odvija se u više faza, a svaka faza regulisana je aktivnošću specifičnih membranskih molekula. Sam proces započinje usporavanjem kretanja, odnosno tzv. kotrljanjem leukocita uz zid barijere, što je posredovano athezionim molekulima tipa selektina. Naredna faza, jake athezije, posredovana je integrinima i molekulima koji pripadaju superfamiliji imunoglobulina, a predstavlja čvrsto vezivanje leukocita za površinu endotela i početak same migracije kroz endotele. Sposobnost T limfocita i makrofaga za migraciju kroz bazalnu mambranu KMB objašnjava se njihovom osobinom da produkuju proteolitičke enzime, matriksmetaloproteinaze (MMP). U eksperimentnom alergijskom encefalomijelitisu (EAE) inhibitorima MMP može se sprečiti prolazak inflamatornih ćelija kroz KMB (30). Za proces transendotelne migracije od velikog značaja su i hemoatraktanti, prisutni na zidu krvnog suda ili u njegovoj neposrednoj blizini. U prilog tome govore i novija istraživanja prema kojima je migracija monocita kroz KMB sekvencijalni proces, najverovatnije regulisan hemokinima i njihovim receptorima (31) (sl. 3). Endotelne ćelije Studije u kojima je za ispitivanje korišćena jednoslojna kultura moždanih mikrovaskularnih endotelnih ćelija pokazuju da je athezija limfocita i migracija kroz KMB zavisna od aktivacije limfocita i endotela i ispoljavanja molekula athezije na endotelnim ćelijama i odgovarajućih liganada na limfocitima (32). Pored toga, ovi rezultati govore u prilog činjenici da su athezija i migracija imunskih ćelija kroz moždani endotel definisani, barem delimično, sekretornim faktorima koji regulišu aktivaciju endotelnih ćelija. Vaskularne endotelne ćelije na mestu inflamacije pokazuju brojne morfološke i funkcionalne promene, uključujući povećanje permeabilnosti, hipertrofiju, akumulaciju unutarćelijskih organela i proliferaciju (33). Pod uticajem proinflamatornih medijatora, kao što su citokini, prostaglandini i bradikinini, EĆ krvnih sudova mozga se mogu aktivirati, što ima za posledicu ispoljavanje molekula glavnog kompleksa tkivne podudarnosti i athezijskih molekula, promenu citoskeleta, a zatim i promenu permeabilnosti KMB. Sposobnost endotelnih ćelija mozga da na svojoj membrani ispoljavaju LFA-3 molekul, (leukocite function associated molecule) koji može preneti sekundarni signal neophodan za proliferaciju T limfocita, upućuje na to da cerebralne EĆ mogu biti značajne u inicijaciji inflamatornog odgovora u humanom CNS (34). E-selektin (1) Kotrljanje А T sle x (2) Jaka athezija E T T TCR MHC klase II Aktivacija limfocita T; sekrecija citokina Oštećenje neurona demijelinizacija VLA-4 VCAM-1 (4) M (3) Dijapedeza T KMB А Neuron Sl. 3 Migracija limfocita kroz krvno-moždanu barijeru Aktivirane EĆ mozga u okviru sekundarne imunske reakcije produkuju i oslobađaju brojne modulatore. Kada se humane moždane endotelne ćelije izlože stimulisanim T limfocitima, luče IL-6 i IL-8 (interleukin-6 i interleukin-8) što ide u prilog pretpostavci da citokini koji oslobode aktivirane EĆ KMB predstavljaju modulatore sekundarne imunske reakcije (35). Oslobođeni citokini mogu da moduliraju aktivnost i samih EĆ, kao i drugih okolnih ćelija kao što su astrociti i ćelije glije. Drugi potencijalni modulatori

5 Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 637 imunske reakcije koje odgovaraju EĆ, su metaboliti arahidonske kiseline, prostaglandini i tromboksani. Interesantno je da se neposredno posle inicijalne aktivnosti EĆ KMB vraćaju u prethodno stanje mirovanja, dok se uočava odloženo pojačanje aktivnosti drugih ćelija unutar CNS koje se nalaze u neposrednoj blizini KMB (27). Endotelne ćelije KMB oslobađaju medijatore koji mogu da modifikuju imunsku reakciju utičući na ćelije unutar CNS, posebno na ćelije mikroglije, što je verovatno razlog hronološki odložene aktivacije ovih ćelija. Astrociti U in vitro modelima, u kojima postoji aktivna migracija monocita kroz KMB i direktni ćelijski kontakt monocita sa astrocitima, dolazi do značajnih ultrastrukturnih promena astrocita. Uzroci ovih promena morfologije astrocita su najverovatnije neki sekretorni produkti monocita ili endotelnih ćelija. Tako je pokazano da faktori koji mogu izazvati morfološke promene astrocita uključuju IL-1, IL-6, TNF-alfa (faktor-alfa nekroze tumora), IFN-gama (interferon-gama), poreklom iz mikroglije i adenozin trifosfat iz endotelnih ćelija (36). Prema novijim studijama aktivirani astrociti su značajan izvor beta- hemokina tokom različitih neuroinflamatornih bolesti (37). Na površini aktiviranih astrocita ispoljavaju se ICAM-1 (intercellular adhesion molecules) i VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule), što ubrzava transendotelnu migraciju leukocita (38). Athezijski molekuli Ključno mesto u razumevanju imunologije KMB je identifikacija mehanizama odgovornih za prelazak ćelija imunskog sistema u CNS. U tom svetlu akcenat je stavljen na athezijske molekule ispoljene na endotelnim ćelijama KMB. Pretpostavlja se da je selektivna permeabilnost KMB za leukocite u značajnoj meri uslovljena stepenom ispoljavanja različitih athezijskih molekula. Pokazano je da ispoljavanje athezijskih molekula na membrani EĆ mozga prethodi kliničkim simptomima eksperimentnog alergijskog encefalomijelitisa (EAE) (39), što može da ukazuje na njihovu ključnu ulogu u inicijaciji inflamacije CNS. Kako je već navedeno, višefazni proces transendotelne migracije ćelija imunskog sistema kroz KMB počinje uspostavljanjem reverzibilnog kontakta između leukocita i EĆ mozga, ostvarenog povezivanjem selektina i njihovih liganada. Podgrupa selektina, sa svojim značajem u početnoj fazi prolaza imunskih ćelija kroz KMB, predmet je intenzivnih ispitivanja s obzirom na to da se i sada dobijaju kontroverzni rezultati o stepenu njihovog ispoljavanja na konstitutivnim ćelijama KMB u različitim okolnostima inflamacije ili mirovanja. Egelhardt i saradnici (40) nisu u in vivo modelu pokazali značajan stepen prisustva E-selektina ili P-selektina ni konstitutivno ni posle indukcije u modelu EAE. Međutim, u kulturi humanih moždanih endotelnih ćelija pokazano je prisustvo E-selektina u stanju mirovanja, kao i na aktiviranim EĆ (35). E-selektin je identifikovan na mikrovaskularnim endotelnim ćelijama u lezijama obolelih od multiple skleroze (41). Nešto kasnije Wong i saradnici (42) su pokazali da tretman stimulisanih moždanih mikroendotelnih ćelija antitelima prema E-selektinu dovodi do redukcije migracije limfocita kroz KMB. Moguće je da postoji različita regulacija ovih molekula u in vivo i in vitro uslovima, što bi moglo objasniti ove oprečne rezultate (38). Studije na miševima koji ne poseduju gen za selektin (43) pokazale su da nedostatak P-selektina značajno smanjuje permeabilnost KMB za leukocite, dok u slučaju nedostatka oba molekula postoje gotovo kopmletna inhibicija permeabilnosti KMB za leukocite, što ide u prilog mišljenju da selektini imaju ulogu u transendotelnoj migraciji leukocita u stanjima inflamacije CNS. Sledeći korak u transendotelnoj migraciji, formiranje ireverzibilne athezije između leukocita i endotelnih ćelija mikrovaskulature mozga, ostvaruje se interakcijama integrina i athezijskih molekula iz superfamilije imunoglobulina. U tom smislu po svom značaju izdvajaju se interakcije između (very late antigen) VLA-4/VCAM-1 i (leukocyte function associated molecule) LFA-1/ICAM-1, kao i homotipski kontakt PECAM-1/PECAM-1. Ovi molekuli značajni su i za proces dijapedeze leukocita (38). Međutim, imunohistohemijskim studijama moždanog tkiva ne može se pokazati prisustvo navedenih athezijskih molekula na KMB. Tokom aktivacije imunskog odgovora unutar CNS, kao u slučaju multiple skleroze ili EAE, dolazi do značajnog ispoljavanja istih athezijskih molekula na ćelijama moždane mikrovaskulature (41). Studije na kulturi moždanih mikrovaskularnih endotelnih ćelija takođe pokazuju minimalno prisustvo ICAM-1 i VCAM-1 molekula pod normalnim okolnostima, dok u uslovima stimulacije proinflamatornim agensima ili aktiviranim T limfocitima dolazi do značajnog porasta gustine ispoljavanja pomenutih molekula (44). Navedeni rezultati govore da je povećanje prolaznosti KMB za monocite i T limfocite tokom aktivacije ili u okolnostima inflamacije CNS posledica povećanog prisustva athezijskih molekula iz superfamilije imunoglobulina na EĆ. U istom smislu studija Wonga i saradnika (42) u in vitro uslovima na kulturi moždanih mikrovaskularnih EĆ, korišćenjem antitela prema pojedinim athezijskim molekulima, jasno je pokazala da antitela prema ICAM-1 i VCAM-1 značajno, ali ne kompletno, inhibiraju vezivanje limfocita za aktivirane EĆ KMB, da VCAM-1 ne utiče na sam proces transendotelne migracije leukocita, kao i da se blokiranjem aktivnosti ICAM-1 blokiraju pokreti leukocita kroz aktivirani endotel. U EAE prisustvo antitela prema VLA-4 dovodi do blokiranja transendotelne migracije limfocita i monocita (45), dok rezultati Laschinger-a i Engelhardt-a (46) ukazuju da interakcija VLA4/VCAM-1 ne utiče na transendotelnu migraciju T limfocita kroz KMB, već ovaj kontakt omogućava prethodne korake u interakciji T ćelija i KMB. Sa druge strane, postoje rezultati koji govore da PECAM-1 utiče i na privlačenje i na migraciju leukocita kroz samu bazalnu la-

6 Страна 638 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6 minu. Prvi proces se ostvaruje preko homofilne interakcije između aminoterminalnih vanćelijskih domena PECAM-1 molekula na leukocitima i EĆ, a drugi uključuje heterofilnu interakciju između proksimalnog ekstraćelijskog domena PECAM-1 i nepoznatog liganda na subendotelnoj bazalnoj lamini (47). Gustina ispoljavanja pomenutih athezionih molekula na EĆ KMB značajno se uvećava posle stimulacije EĆ lipopolisaharidima ili citokinima. Stimulacija je maksimalna posle izlaganja ovih ćelija TNF-alfa ili IL-1, dok se minimalne promene dešavaju nakon dodavanja IFNgama. Povećanje gustine ispoljavanja molekula ICAM-1, VCAM-1 i E-selektina zavisi od količine TNF-alfa i IL-1 i dužine izloženosti, tako da se prvi značajan porast uočava posle 4 sata i održava se tokom sata nakon izlaganja citokinima. Athezija T limfocita se povećava 30 puta ukoliko su ćelije endotela prethodno izložene delovanju TNFalfa (48). Uporedo sa delovanjem athezijskih molekula odvija se i aktivnost hemokina, neophodna za privlačenje i aktivaciju leukocita i drugih ćelija na mesto inflamacije. Hemokini su sekretorni proteini, male molekulske mase (7-10kDa), strukturno podeljeni u četiri podfamilije. Hemokine sekretuju različite moždane ćelije delovanjem ćelija inflamatornog infiltrata u moždanom tkivu ili u uslovima oštećenja tkiva. Pokazano je na in vitro modelu (49) da je MCP-1 (macrophage chemotactic protein-1) primarni hemoatraktant za monocite, dok su astrociti, stimulisani proinflamatornim citokinima, glavni izvor ovog hemokina. U in vivo modelu (50) procenjivana je akumulacija leukocita posle ubrizgavanja rekombinantnih alfa- i beta-hemokina u hipokampus eksperimentalne životinje. Nađeno je da je MCP-1 najsnažniji hemoatraktant monocita u moždanom tkivu, dok IL-8 i MIP-2 (makrofage inflamatorn protein-2) dovode do značajnog privlačenja polimorfonuklearnih leukocita. Na transgenim miševima (51) pokazano je da su pre pojave inflamatornih ćelija brojni hemokini prisutni u obolelom delu moždanog tkiva, što ukazuje da oni imaju signalnu ulogu u migraciji leukocita. Sa druge strane, Glabinski (37) ukazuje na to da hemokini, koje uglavnom luče astrociti, mogu pojačati ali ne i započeti prelazak leukocita iz krvi u moždano tkivo tokom akutnog EAE. Buduće studije sa neutralizujućim antitelima ili antagonistima hemokinskih receptora pomoći će u određivanju mesta svakog od hemokina u procesu migracije leukocita i progresiji inflamacije u CNS. Poznat je fenomen da je inflamatorna reakcija u moždanom parenhimu gotovo uvek ograničena na mononukleusne fagocite i limfocite, dok su u navedeni proces retko uključeni neutrofili (48). U normalnim okolnostima, kada su u cirkulaciji prisutni samo neaktivirani limfociti sa minimalnom sposobnošću prolaska kroz KMB, u CNS se detektuje, takođe, minimalni broj limfocita. Međutim, aktivirani T limfociti poseduju sposobnost da prolaze kroz KMB (52), i to na način koji ne zavisi od antigena ili molekula glavnog kompleksa tkivne podudarnosti koji su doveli do njihove stimulacije, niti od fenotipskih karakteristika samih limfocita. Dakle, aktivirane ćelije imunskog sistema brzo prolaze kroz KMB. Međutim, ukoliko ne dođu u kontakt sa specifičnim, ciljnim antigenom, nakon 24 do 48 sati vraćaju se u krvotok (52). Ukoliko se, pak ostvari kontakt sa ciljnim antigenom, dolazi do pokretanja brojnih, ranije opisivanih promena, koje će usloviti akumulaciju ćelija imunskog sistema u moždanom tkivu. U jednom eksperimentu pokazano je da aktivirani T limfociti i neneuronske specifičnosti mogu da dovedu do oštećenja KMB. Naime, patogena antitela prema MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) uneta u cirkulaciju eksperimentne životinje, ostaju bez efekta ukoliko je KMB neoštećena. Međutim, dodatno prisustvo aktiviranih T limfocita neneuronske specifičnosti omogućilo je njihov ulazak u CNS, što je dovelo do formiranja velikih plakova koji nalikuju demijelinizovane regione (53). Wong i saradnici su u in vitro studijama (42) pokazali da limfociti prolaze kroz samu citoplazmu EĆ KMB, ali i preko čvrstih veza ostvarenih između njih. Penetracija limfocita dešava se bez ikakvog narušavanja integriteta ili promene permeabilnosti mikrovaskuilarnih moždanih endotelnih ćelija. U in vivo ispitivanjima prolaska limfocita u moždano tkivo uočeno je da proces pripajanja za endotel i sam prolazak kroz barijeru zavisi od stanja generalizovane aktivacije ćelija imunskog sistema i EĆ. Kada su u pitanju B limfociti, u više studija (54, 55) je dokazano da oni prelaze u CNS i ako KMB ostaje intaktna, kao i da unutar CNS postoji lokalna produkcija antitela. Monociti, za razliku od aktiviranih limfocita ne prolaze kroz intaktnu KMB i takođe, za razliku od limfocita, monociti za prelazak iz krvi u moždano tkivo zahtevaju obavezno prisustvo astrocita u okolini KMB (48). Pored toga, pokazano je da se strukturne promene u astrocitima dešavaju onda kada dolazi do aktivne migracije monocita i kada se ostvaruje direktan kontakt astrocita i monocita (56). U ovom zanimljivom međuinduktorskom odnosu astrocita i monocita činjenica da su astrociti značajni izvor betahemokina (MCP-1 je glavni hemoatraktant monocita) verovatno objašnjava neophodnost prisustva astrocita u modelima KMB, koji ostvaruju uspešnu transmigraciju monocita. U in vitro modelu KMB (kultura moždanih mikrovaskularnih endotelnih ćelija i astrocita) proučavana je transendotelna migracija monocita (57). Korišćen je podjednak broj nestimulisanih i aktiviranih humanih monocita, kao i HIV-1 inficiranih i neinficiranih monocita radi procene uticaja virusne infekcije na transendotelnu migraciju monocita. Prethodnom stimulacijom postiže se značajno (20 puta) povećanje broja monocita koji prelaze barijeru, dok virusna infekcija ne utiče na njihovu migraciju. Dodavanje aktiviranih monocita u kulturu endotelnih ćelija dovodi do progresivnih morfoloških promena EĆ i do ispoljavanja VCAM-1 na njima, dok istovremeno međućelijske veze između susednih EĆ ostaju sačuvane. Nameće se zaključak da interakcija EĆ sa monocitima, tokom koje dolazi do aktiviranja EĆ, ima značajnu ulogu u omogućavanju transmigracionih procesa. U ovom razmatranju ulaska monocita u CNS značajno je napomenuti da su Anderson i saradnici (58) pokazali da

7 Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 639 se broj makrofaga u mozgu smanjuje kada se smanji broj perifernih cirkulišućih monocita, što govori da su makrofagi u moždanom parenhimu u značajnom broju poreklom od monocita dospelih kroz KMB. Rezultati novijih istraživanja ukazuju na ulogu makrofaga i u neuroregeneraciji (59) i njihovu sposobnost da izlučuju neurotrofine, zbog čega je postavljena hipoteza o neuroprotektivnom delovanju makrofaga. Sve prethodno rečeno o strukturi i funkcionisanju KMB samo ukazuje na složenost ovog za CNS veoma važnog sistema i tek nagoveštava zakonitosti koje vladaju u procesima odbrane mozga od perifernih disbalansa, kao i u stanjima narušavanja integriteta same KMB u imunološki posredovanim oboljenjima, neurodegenerativnim oboljenjima, procesima inflamacije ili traume mozga. LITERATURA 1. Jovičić A. Cerebrokardijalni i kardiocerebralni sindromi. Beograd: Javno Preduzeće PTT saobraćaja Srbija ; Tatomirović Ž. Funkcionalno stanje hemato-likvorske barijere i intratekalna sinteza imunoglobulina u bolesnika sa sindromom akutnog seroznog meningitisa [doktorska disertacija]. Beograd: Vojnomedicinska akademija; Pardridge WM. Brain metabolism: a perspective from the blood-brain barrier. Physiol Rev 1983; 63(4): : Fabry Z, Fitzsimmons KM, Herlein JA, Moninger TO, Dobbs MB, Hart MN. Production of the cytokines interleukin 1 and 6 by murine brain microvessel endothelium and smooth muscle pericytes. J Neurimmunol 1993; 47(1): Angelov DN, Walther M, Streppel M, Guntinas- Lichius O, Neiss WF. The cerebral perivascular cells. Adv Anat Embryol Cell Biol 1998; 147: Meyer J, Rauh J, Galla HJ. The susceptibility of cerebral endothelial cells to astroglial induction of bloodbrain barrier enzymes depends on their proliferative state. J Neurochem 1991; 557(6): Engelhardt B, Vestweber D, Hallmann R, Schulz M. E- and P- selectin are not involved in the recruitment of inflammatory cells across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Blood 1997; 90: Abbott NJ, Pichon Y. The glial blood-brain barrier of crustacea and cephalopods: a review. J Physiol (Paris)1987; 82(4): Stewart PA, Wiley MJ. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail-chick transplantation chimeras. Dev Biol 1981; 84(1): : Rowland LP, Fink ME, Rubin LL. Cerebnrospinal fluid:blood-brain barrier, brain oedema and hydrocephalus. In: Kandel ER, Schwartz JH, Jessell T, editors. Principles of Neural Science. New York: Elsevier; p Pardridge WM. Drug delivery to the brain. J. Cereb Blood Flow Metab 1997; 17(7): Schinkel AH, Wagenaar E, Mol CA, van Deemter L. P- glycoprotein in the blood-brain barrier of mice influences the brain penetration and pharmacological activity of many drugs. J Clin Invest 1996; 97(11): Gumbiner B, Simons K. A functional assay for proteins involved in establishing an epithelial occluding barrier: identification of a uvomorulin-like polypeptide. J Cell Biol 1986; 102(2): Schulze C, Firth JA. Immunohistochemical localization of adherens junction components in blood-brain barrier microvessels of the rat. J Cell Sci 1993; 104(Pt 3): Stevenson BR, Siciliano JD, Mooseker MS, Goodenough DA. Identification of ZO-1: a high molecular weight polypeptide associated with the tight junction (zonula occludines) in a variety of epithelia. J Cell Biol 1986; 103(3): Citi S, Sabanay H, Jakes R, Geiger B, Kendrick-Jones J. Cingulin, a new peripheral component of tight junctions. Nature 1988; 333(6170): Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol 1993; 123(6 Pt 2): Takeichi M. Morphogenetic roles of classic cadherins. Curr Opin Cell Biol 1995; 7(5): Gumbiner BM. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell 1996; 84(3): Hirase T, Staddon JM, Saitou M, Ando-Akatsuka Y, Itoh M, Furuse M, et al. Occludin as a possible determinant of tight junction permeability in endothelial cells. J Cell Sci 1997; 110(Pt14): Rubin LL, Staddon JM. The cell biology of the bloodbrain barrier. Annu Rev Neurosci 1999; 22: Balsamo J, Leung T, Ernst H, Zanin MK, Hoffman S, Lilien J. Regulated binding of PTP 1B-like phosphatase to N-cadherin: control of cadherin-mediated adhesion by dephosphorylation of beta-catenin. J Cell Biol 1996; 134(3): Lampugnani MG, Corada M, Andriopoulou P, Esser S, Risau W, Dejana E. Cell confluence regulates tyro-

8 Страна 640 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6 sine phosphorylation of adherens junction components in endothelial cells. J Cell Sci 1997; 110(Pt 17): : Staddon JM, Smales C, Schulze C, Esch FS, Rubin LL. P 120, a p 120-related protein (p100), and the cadherin/catenin complex. J Cell Biol 1995; 130(2): Ratcliffe MJ, Rubin LL, Staddon JM. Dephosphorylation of the cadherin-associated p100/p120 proteins in response to activation of protein kinase C in epithelial cells. J Biol Chem 1997; 272(50): Sakakibara A, Furuse M, Saitou M, Ando-Akatsuka Y, Tsukita S. Possible involvement of phosphorylation of occluding in tight junction formation. J Cell Biol 1997; 137(6): Miller DW. Immunobiology of the blood-brain barrier. J Neurovirol 1999; 5(6): Huang AJ, Manning JE, Bandak TM, Ratau MC, Hanser KR, Silverstein SC. Endothelial cell cytosolic free calcium regulates neutrophil migration across monolayers of endothelial cells. J Cell Biol 1993; 120(6): : Carson MJ, Sutcliffe JG. Balancing function vs. self defense: the CNS as an active regulator of immune responses. J Neurosci Res 1999; 55(1): Clements JM, Cossins JA, Wells GM, Corkill DJ, Helfrich K, Wood LM, et al. Matrix metalloproteinase expression during experimental autoimmune encephalomyelitis and effects of a combined matrix metalloproteinase and tumor necrosis factor alpha inhibitor. J Neuroimmunol 1997; 74(1 2): Weber KS, van Hundelshausen P, Clark-Lewis I, Weber PC, Weber C. Differential immobilization and hierarchical involvement of chemokines in monocyte arrest and transmigration on inflamed endothelium in shear flow. Eur J Immunol 1999; 29(2): Greenwood J, Wang Y, Calder VL. Lymphocyte adhesion and transendothelial migration in the central nervous system: the role of LFA-1, ICAM-1, VLA-4 and VCAM-1. Immunology 1995; 86(3): Cavender DE, Edelbaum D, Ziff M. Endothelial cell activation induced by tumor necrosis factor and lymphotoxin. Am J Pathol 1989; 134(3): Omari KI, Dorovini-Zis K. Expression and function of lymphocyte function associated antigen-3 (LFA-3) at the blood-brain barrier. Cell Mol Biol 1999; 45(1): : Lou J, Dayer JM, Grau GE, Burger D. Direct cell/cell contact with stimulated T lymphocytes induces the expression of cell adhesion molecules and cytokines by human brain microvascular endothelial cells. Eur J Immunol 1996; 26(12): Norenberg MD. Astrocyte responses to CNS injury. J Neuropathol Exp Neurol 1994; 53(3): Glabinski AR, Ransohoff RM. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol 1999; 5(1): Lee SJ, Benveniste EN. Adhesion molecule expression and regulation on cells of the central nervous system. J Neuroimmunol 1999; 98(2): Dopp JM, Breneman SM, Olschowka JA. Expression of ICAM-1, VCAM-1, L-selectin, and leucosialin in the mouse central nervous system during the induction and remission stages of experimental allergic encephalomyelitis. J Neuroimmunol 1994; 54(1 2): Engelhardt B, Vestweber D, Hallmann R, Schulz M. E- and P-selectin are not involved in the recruitment of inflammatory cells across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Blood 1997; 90(11): Washington R, Burton J, Todd RF 3rd, Newman W, Dragovic L, Dore-Duffy P. Expression of immunologically relevant endothelial cell activation antigens on isolated central nervous system microvessels from patients with multiple sclerosis. Ann Neurol 1994; 35(1): Wong D, Prameya R, Dorovini-Zis K. In vitro adhesion and migration of T lymphocytes across monolayers of human brain microvessel endothelial cells: regulation by ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and PECAM-1. J Neuropathol Exp Neurol 1999; 58(2): : Tang T, Frenette PS, Hynes RO, Wagner DD, Mayadas TN. Cytocine-induced meningitis is dramatically attenuated in mice deficient in endothelial selectins. J Clin Invest 1996; 97(11): Gan X, Zhang L, Berger O, Stins MF, Way D, Taub DD, et al. Cocaine enhances brain endothelial adhesion molecules and leukocyte migration. Clin Immunol 1999; 91(1): Yednock TA, Cannon C, Fritz LC, Sanchez-Madrid F, Steinman L, Karin N. Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alfa4 beta1 integrin. Nature 1992; 356(6364): Laschinger M, Engelhardt B. Interaction of alpha4- integrin with VCAM-1 is involved in adhesion of encephalitogenic T cell blasts to brain endothelium but not in their transendothelial migration in vitro. J Neuroimmunol 2000;102(1): Muller WA, Randolph GJ. Migration of leukocytes across endothelium and beyond: molecules involved in the transmigration and fate of monocytes. J Leukoc Biol 1999; 66(5): Persidsky Y. Model systems for studies of leukocyte migration across the blood-brain barrier. J Neurovirol 1999; 5(6):

9 Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна Weiss JM, Downie SA, Lyman WD, Berman JW. Astrocyte-derived monocyte-chemoattractant protein-1 directs the transmigration of leukocytes across a model of the human blood-brain barrier. J Immunol 1998; 161(12): Bell MD, Taub DD, Perry VH. Overriding the brains intrinsic resistance to leukocyte recruitment with intraparenchymal injections of recombinant chemokines. Neuroscience 1996; 74(1): Stalder AK, Carson MJ, Pagenstecher A, Asensio VC, Kincaid C, Benedict M, et al. Late-onset chronic inflammatory encephalopathy in immune-competent and severe combined immune-deficient (SCID) mice with astrocyte-targeted expression of tumor necrosis factor. Am J Pathol 1998; 153(3): Hickey WF, Hsu BL, Kimura H. T-lymphocyte entry into the central nervous system. J Neurosci Res 1991; 28(2): Westland KW, Pollard JD, Sander S, Bonner JG, Linington C, McLeod JG. Activated non-neural specific T cells open the blood-brain barrier to circulating antibodies. Brain 1999; 122(Pt 7): : Hatalski CG, Hickey WF, Lipkin WI. Evolution of the immune response in the central nervous system following infection with Borna disease virus. J Neuroimmunol 1998; 90(2): Knopf PM, Harling-Berg CJ, Cserr HF, Basu D, Sirulnick EJ, Nolan SC, et al. Antigen-dependent intrathecal antibody synthesis in the normal rat brain: tissue entry and local retention of antigen-specific B cells. J Immunol 1998; 161(2): Norenberg MO. Astrocyte responses to CNS injury. J Neuropathol Exp Neurol 1994; 53(3): Persidsky Y, Stins M, Way D, Witte MH, Weinand M, Kim K, et al. A model for monocyte migration through the blood-brain barrier during HIV-1 encephalitis. J Immunol 1997; 158(7): Andersson PB, Perry VH, Gordon S. The acute inflammatory response to lipopolysaccharide in CNS parenchyma differs from that in other body tissues. Neuroscience 1992; 48(1): Zeev-Brann AB, Lazarov-Spiegler O, Brenner T, Schwartz M. Differential effects of central and peripheral nerves on macrophages and mikroglia. Glia 1998; 23(3): Rad je primljen 22. XI god.