立命館大学審査博士論文 持久性スポーツ競技者における運動 栄養介入がヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響. (Effect of exercise and nutritional intervention on hepcidin levels in endurance athletes)

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1 立命館大学審査博士論文 持久性スポーツ競技者における運動 栄養介入がヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 (Effect of exercise and nutritional intervention on hepcidin levels in endurance athletes) 2018 年 3 月 March 2018 立命館大学大学院スポーツ健康科学研究科スポーツ健康科学専攻博士課程後期課程 Doctoral Program in Sport and Health Science Graduate School of Sport and Health Science Ritsumeikan University 石橋彩 ISHIBASHI Aya 研究指導教員 : 後藤一成教授 Supervisor: Professor GOTO Kazushige

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3 次 原著論 の 覧表のタイトル 覧図のタイトル 覧略語の 覧 Ⅰ. 緒 1 Ⅱ. 的および研究課題 13 Ⅲ. 陸上 距離選 における鉄代謝の様相 : 般 との 較 ( 研究課題 1) 緒 2. 法 3. 結果 4. 考察 5. 結論 Ⅳ. 陸上 距離選 におけるトレーニング量の相違がヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 ( 研究課題 2) 緒 2. 法 3. 結果 4. 考察 5. 結論 Ⅴ. 1 2 回の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 ( 研究課題 3) 緒 2. 法 3. 結果 4. 考察 5. 結論

4 Ⅳ. 短期間の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 : 鉄サプリメント摂取の影響 ( 研究課題 4) 緒 2. 法 3. 結果 4. 考察 5. 結論 Ⅶ. 短期間の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 :Energy availability の相違の影響 ( 研究課題 5) 緒 2. 法 3. 結果 4. 考察 5. 結論 Ⅷ. 総合討論 76 Ⅸ. 総括 87 Ⅹ. 結論 89 参考 献 90

5 原著論 の 覧 本博 論 は 以下の副論 をまとめたものである 副論 1. Ishibashi A, Maeda N, Sumi D, Goto K. Elevated serum hepcidin levels during an intensified training period in well-trained female long-distance runners. Nutrients 2017, 14, 9, 3, E Ishibashi A, Maeda N, Kamei A, Goto K. Iron supplementation during three consecutive days of endurance training augmented hepcidin levels. Nutrients 2017, 30, 9, 8, E820.

6 表のタイトル 覧 Table 1. Comparisons of physical characteristics between the two groups. Table 2. Comparisons of blood variables between the two groups. Table 3. Comparisons of dietary intake between the two groups. Table 4. Comparisons of physical characteristics between the two different training periods. Table 5. Comparisons of blood variables between the two different training periods. Table 6. Comparisons of energy and macronutrient intakes during three days training period. Table 7. Characteristics of body composition. Table 8. Changes in scores of fatigue before exercise and during post-exercise period. Table 9. Changes in hematological variables during before exercise and during post-exercise period. Table 10. Changes in iron and inflammatory variables before exercise and during post-exercise period. Table 11. Energy, macronutrients and iron intake on a measurement day. Table 12. Running distances and HR during training period. Table 13. Serum ferritin, iron levels, TSAT during Days 1-4. Table 14. Score of fatigue and muscle soreness during training period. Table 15. Total energy and macronutrients intakes during training period. Table 16. Total energy and macronutrients intake during training period.

7 Table 17. Running distance and heart rate during training period. Table 18. Body weight, lean body mass, skeletal muscle and fat mass during training period. Table 19. Hemoglobin, MCV, MCH and MCHC during training period Table 20. Serum ferritin, iron and TIBC levels during training period.

8 図のタイトル 覧 Figure 1. Regulation of body iron homeostasis mediated by hepcidin (modified from Tandara et al. 2012). Figure 2. Effect of endurance exercise on plasma IL-6, urine hepcidin, and serum iron levels (modified from Peeling et al. 2009a). Figure 3. Pre and post exercise (3h after exericse) hepcidin levels in elite race walkers for all subjects (ALL) and for the respective groups separated by baseline serum ferritin levels; [lower 50th percentile (LOW) upper 50 th percentile (HIGH)] (modified from Peeling et al. 2017). Figure 4. Comparisons of serum hepcidin levels between the two groups. Figure 5. Experimental design during LOW and INT. Figure 6. Comparison of serum hepcidin levels between the two different training periods. Figure 7. Correlation between serum hepcidin and ferritin levels. Figure 8. Time schedule for mesurements. Figure 9. Changes in serum hepcidin levels during post exercise period. Figure 10. Correlation between serum leptin and hepcidin levels. Figure 11. Serum myoglobin (A), CK (B) and hscrp (C) levels during Days 1-4.

9 Figure 12. Plasma IL-6 levels before and after exercise on Day1(A) and resting levels during Days 1-4(B). Figure 13. Serum hepcidin levels before and after exercise on Day 1(A), and resting levels on Days 1-4(B). Figure 14. Experimental design during training period. Figure 15. Scores of fatigue(a) and muscle soreness(b) during training period. Figure 16. Serum hepcidin levels at rest on days 1-4(A, B) and before and after exercise on Day3 (C, D). Figure 17. Plasma IL-6 levels during before and after exercise on Day 3. Figure 18. Correlation between plasma IL-6 and serum hepcidin levels imidiately after exercise on Day 3. Figure 19. Muscle glycogen levels on Days 1-4. Figure 20. Correlation of serum hepcidin levels between ELISA and LC-MS/MS.

10 AEVE 略語の 覧 AUC BMP BW CK CHO EA EE EI ELISA ES FFM FiOR2 Hb Hct hscrp HCP-1 IL-6 LC-MS MCH MCHC MCV RED-S RET-He SF TIBC TP VAS AOR2max Area under the curve Bone morphogenetic protein Body weight Creatine kinase Carbohydrate Energy availability Energy expenditure Energy intake Enzyme linked immunosorbent assay Effect size Fat free mass Fraction of inspiratory oxygen Hemoglobin Hematocrit High sensitive C-reactive protein Heme carrier protein-1 Interleukin-6 Liquid chromatography-mass spectrometry Mean corpuscular hemoglobin Mean corpuscular hemoglobin concentration Mean corpuscular volume Relative energy deficirncy in sports Reticulocyte hemoglobin equivalent Serum ferritin Total iron binding capacity Total protein Visual analog scale Maximal oxgen uptake

11 Ⅰ. 緒 1. スポーツ競技者における鉄 乏の現状体内の鉄の総量は 3 4 g であり 部分は 球に含まれるヘモグロビン鉄として利 されている (2,400 mg) また 部は ミオグロビン(350 mg) 電 伝達系および代謝酵素の補 分 でのヘム鉄として利 されている その他の鉄は 髄 (150 mg) や網内系細胞 (500 mg) フェリチンとして肝臓(400 mg) に貯蔵されている (Hershko et al. 1978) 鉄は 2 つの経路を介して鉄代謝を調節している 指腸では 事から 1 2 mg/ の鉄を吸収し マクロファージでは 化した 球から mg/ の鉄を取り込む (Andrews 1999; Ludwig et al. 2015) 鉄は ヘモグロビンとして酸素運搬に関わるほか ミトコンドリアにおいて酸化還元反応を うシトクロムに含まれ酸素との反応を中 としたエネルギー産 の中核的な役割を担う また リボヌクレオチドの還元酵素としても働くため 鉄がなければ DNA の合成は不可能となる このように 鉄は体内において必須の微量栄養素である 液中のヘモグロビン濃度や 清フェリチン濃度が極端に低い状態を す内科的疾患として 鉄 乏性貧 ( 中ヘモグロビン濃度 12 g/dl 以下の状態 ) または鉄 乏 ( 清フェリチン濃度 12 ng/ml 以下の状態 ) が挙げられる 鉄 乏性貧 および鉄 乏は 最も 般的な内科的疾患である (DeMaeyer and Adiels-Tegman 1985) 世界保健機構(WHO) の報告によると 全世界の のうち 20 億 超が 鉄 乏性貧 または鉄 乏に罹患している (McLean et al. 2009) また 常的にトレーニングを うスポーツ競技者を対象とした横断研究では 鉄 乏性貧 や鉄 乏の発症リスクは増加することを報告している (Shaskey and Green 2000; Rodenberg and Gustafson 2007) 学 スポーツ競技者 1,460 名 ( 性 1,059 名 男性 411 名 ) を対象とした研究では 性スポーツ競技者の 2.2 % が鉄 乏性貧 30.9 % が鉄 乏を し 男性スポーツ競技者の 1.2 % が鉄 乏性貧 2.9 % が鉄 乏に該当することが認められた (Parks et al. 2017) その他の研究でも 男性スポーツ競技者では約 10 % 性スポーツ競技者では % の割合で鉄 乏のみられることが されている (Magnusson et al. 1984; Gropper et al. 2006) 1

12 持久性スポーツ競技者では 持久性パフォーマンスを向上させることを 的に 強度 容量のトレーニングを実施することが求められる 特に トップレベルの陸上 距離選 では 時間のトレーニングを 1 に複数回にわたり実施し 1 ヵ あたりの 距離が 600 km を超えることも珍しくない 鉄 乏性貧 および鉄 乏の状態でトレーニングを 々繰り返すことは ヘモグロビンの減少により 拍出量を増加させ パフォーマンスを低下させる 実際に 持久性スポーツ競技者における鉄 乏性貧 や鉄 乏の状態では 持久性パフォーマンスは最 30 % 程度減退することも報告されている (Davies et al. 1982; Brownlie et al. 2002; DellaValle and Haas 2011) 以前から スポーツ競技者における鉄 乏性貧 および鉄 乏の主な要因として ランニング時の 底部への機械的刺激による溶 (Miller et al. 1988a) トレーニング時の発汗(Brune et al. 1986) 強度運動に伴う消化管からの出 (Stewart et al. 1984) および 事からの鉄の摂取不 (King et al. 1993; Samuelson et al. 1996) などが指摘されてきた これらの要因に加えて スポーツ競技者における鉄代謝に対するヘプシジンの影響が注 されている 2. 体内における鉄代謝とヘプシジンヘプシジンは 肝臓で産 されるペプチドホルモンである ヒトでのヘプシジン遺伝 は 3 つのエクソンから転写された第 19 番染 体 (19q13) に位置しており (Park et al. 2001) 前駆体のプロヘプシジンは 84 個のアミノ酸からなる また 活性型ヘプシジンは 25 個のアミノ酸残基からなり そのうち 8 個のシステインをもち 4 個の S-S 結合を階段状に有したヘアピン構造をとっている (Ganz and Nemeth 2012) ヘプシジンは 肝臓以外では胃 肝臓 肺 臓および脂肪組織において発現するが 肝実質細胞における発現が顕著であるために (Pigeon et al. 2001) 中のヘプシジン濃度は基本的に肝臓における発現を反映しているものと考えられる 事中の鉄は ヘム鉄およびヘム鉄を含む 2 つの形態で存在する ヘム鉄は植物性 品に由来し 通常の 事で吸収される鉄の約 80 % を占める (Craig 1994) 残りの約 20 % は 主に動物性 品に由来するヘム鉄で構成されている ヘム鉄は ヘム鉄に べ 吸収率が く他の 物の影響を受けにくい (Beard and Tobin 2000) 事から摂取された鉄は 指腸 2

13 において吸収が われる 事中の ヘム鉄は 細胞表膜に発現する 属トランスポーターである divalent metalt ransporter-1(dmt-1) により (Gunshin et al. 1997) ヘム鉄は heme carrier protein-1(hcp-1) により腸上 細胞内に取り込まれる (Donovan et al. 2000) 取り込まれた鉄は共通の排出たんぱく質であるフェロポーチンによって 管腔側に排出され マクロファージ由来の鉄と同様にトランスフェリンにより 髄をはじめとした利 器官に運搬される フェロポーチンは腸上 細胞やマクロファージにおける共通の鉄排出たんぱく質であることから この発現量を調節することにより 体の鉄の吸収および再利 を 元的に制御することが可能となる ヘプシジンは フェロポーチンの発現調節を介して 体の鉄吸収 利 を制御する 具体的には フェロポーチンと結合し 細胞内リソゾームへと誘導することによりフェロポーチンを分解へと導く作 を有する したがって 体内でのヘプシジンの発現が増加すると 腸上 細胞やマクロファージにおけるフェロポーチンの発現は低下する (Nemeth et al. 2004b) その結果 これらの細胞からの 液中へ鉄の排出が抑制され 事由来の鉄の吸収が減少する 通常 細胞内に取り込まれて余剰に じた鉄は フェリチンと結合して安定化する しかしながら 鉄は過剰になるとフェントン反応を介して 脂質膜 たんぱく質 DNA などの細胞構成成分を酸化し 毒性の強い活性酸素種であるヒドロキシラジカルを産 することで細胞障害を引き起こす (Takami and Sakaida 2011) したがって 肝臓における適度なヘプシジンの発現は 体内での鉄代謝を維持する上で重要な役割を果たしている ヘプシジンの発現を制限する 理的要因としては 体内での貯蔵鉄の増加 炎症反応 球新 の 3 つが挙げられている (Hentze et al. 2010)(Fig. 1) 経 投与または静脈への投与による鉄の過剰負荷はヘプシジンの産 を亢進させ 鉄の取り込みを抑制する トランスフェリンと結合した 清鉄は トランスフェリン受容体 1(Tfr1) を介して細胞内に取り込まれるが 同じファミリーの Tfr2 は鉄飽和トランスフェリンのセンサーとして反応し ヘプシジンの分泌を刺激して 清鉄濃度をコントロールしていると考えられている また 鉄負荷によるヘプシジンの発現は 形成因 (bone morphogenetic protein; BMP) シグナル伝達系により Smad を介して発現することが想定されている 2 つ の要因としては 炎症反応によるヘプシジンの発現が挙げられる 培養肝細胞を炎症性サイトカインで亢進する培養肝細 3

14 胞を炎症性サイトカインであるインターロイキン 6 (interleukin-6; IL-6) によって刺激すると ヘプシジン産 は顕著に亢進する 同様の反応はヒトに対して IL-6 を静脈投与した場合にも認められ ヘプシジン産 の著しい上昇とともに鉄やトランスフェリン飽和度が低下する (Nemeth et al. 2004a) IL-6 のノックアウトマウスでは 炎症の誘発に伴うヘプシジンの発現亢進や 清鉄の低下は確認されず 炎症 (IL-6 の増加 ) がヘプシジンの産 を刺激し フェロポーチン鉄輸送作 を抑制することで 中への鉄の供給が低下することが 唆されている (Andrews 2004) これら炎症に伴う IL-6 産 を介したヘプシジン発現は signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) のシグナル伝達系に依存している (Wrighting and Andrews 2006) 3 つ の要因として 球新 が挙げられる Lee et al.(2005) は X 線照射で 髄造 機能を抑制させるとヘプシジン発現が急速に増加したことから 造 反応がヘプシジン発現に影響を及ぼすことを明らかにしている (Lee et al. 2005) Figure 1. Regulation of body iron homeostasis mediated by hepcidin (modified from Tandara et al. 2012). 4

15 3. 運動 トレーニングとヘプシジン (1) 様々な運動 トレーニングに伴うヘプシジンの分泌応答 Roecker et al. (2005) は 14 名の 性陸上 距離選 を対象にフルマラソンの前 運動直後 1 後 3 後に尿中ヘプシジン濃度の変化を検討した その結果 運動翌 の尿ヘプシジン濃度は運動実施前 の値に 較して有意に 値を した (Roecker et al. 2005) また Peeling et al. (2009) の研究では 60 分間のランニング条件 ( 最 拍数の % に相当する強度で 15 分間の運動 + 最 拍数の % に相当する強度で 45 分間 ) と安静条件の間で尿ヘプシジン濃度を 較した結果 ランニング条件では 運動終了直後に 漿 IL-6 濃度が 運動後 3 時間には 尿ヘプシジン濃度が安静条件と 較してそれぞれ有意に上昇した また ランニング条件では 運動後 24 時間の時点で 清鉄濃度が減少していた (Fig. 2)(Peeling et al. 2009a) Figure 2. Effect of endurance exercise on plasma IL-6, urine hepcidin, and serum iron levels (modified from Peeling et al. 2009a). Peeling et al. (2014) は 54 名の 性陸上 距離選 およびトライアスロン選 を運動前における 清フェリチン (Serum ferritin; SF) 濃度によって 4 群 {SF < 30 群 (30 µg/l) SF 群 (30-50µg/L) SF 群 (50-100μg/L) SF > 100 群 (> 100 μg/l)} に分類し 運動後のヘプシジンの分泌応答を 較している (Peeling et al. 2014) その結果 運動直後の 漿 IL-6 濃度は いずれの群においても運動前に 較して有意に上昇した また 運動 3 時間後に 清ヘプシジン濃度は SF < 30 群以外の 3 群においていずれも有意に上昇した このことは 5

16 運動に対するヘプシジンの分泌応答の程度が運動前の貯蔵鉄量に影響され 貯蔵鉄が低下した状態では運動に伴うヘプシジンの分泌増 は減弱することを すものである また Peeling et al. (2017) は 24 名の男性競歩選 に対して 25 km のレースを想定した運動テストを実施した結果 運動 3 時間後にヘプシジンの上昇を認めている (Fig. 3) さらに 清フェリチン濃度の中央値をもとに対象者を 2 群 (HIGH 群 LOW 群 ) に分類した場合 LOW 群 ( 清フェリチン濃度 :58.0 ± 7.8 µg/ L) でのみ運動後に 清ヘプシジン濃度の有意な上昇が認められた このことは 清フェリチン濃度が約 μg/ L の範囲の選 では 運動 3 時間後にかけてヘプシジンの分泌が増 することを 唆している また 重回帰分析を った結果 3 時間後のヘプシジンの分泌増 を 清フェリチン濃度 運動前の 清鉄濃度と運動直後の 漿 IL-6 濃度の 3 変数から 77.4 % は説明できることを指摘している (Peeling et al. 2017) Serum hepcidin level (nm) * * Pre-exercise 3h-post exercise All(n = 24) LOW(n = 12) High (n = 12) Figure 3. Pre and post exercise (3h after exericse) hepcidin-25 levels in elite race walkers for all subjects (ALL) and for the respective groups separated by baseline serum ferritin levels; [lower 50th percentile (LOW) upper 50th percentile (HIGH)]. (modified from Peeling et al. 2017). Value are means ± SD. *; p < 0.05 (vs. HIGH), P P; p < 0.05 vs. (Pre-Exercise) 6

17 多くの先 研究では 運動による 中ヘプシジン濃度の上昇は 運動後 3 6 時間にかけてみられることが されている (Peeling 2010) 先述したように 運動に伴うヘプシジンの分泌増 には IL-6 の影響が 唆されている 時間の運動は 格筋から IL-6 の分泌を顕著に亢進させる (Pedersen et al. 2001; Keller et al. 2001) Banzet et al.(2012) の研究では カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリン A (CsA) で処置したラット (CsA 群 ) または無処置のラット ( 対照群 ) に対してランニング運動を負荷した結果 CsA 群では運動後の 漿 IL- 6 濃度の上昇が 50 % 抑制された さらに 肝臓でのヘプシジンの mrna の発現は対照群と べて有意に軽減された (Banzet et al. 2012) このことから IL-6 が運動誘発性のヘプシジンの遺伝 発現に関与しているものと推察される そのほか ガン患者に対する 6 週間の組み換えヒト IL-6 の投与は 鉄 乏性貧 を引き起こす (Nieken et al. 1995) 運動に伴うヘプシジンの分泌増 の程度は 運動様式や負荷様式に強く影響される Peeling et al. (2009) は 強度のトレーニングを実施している男性持久性スポーツ競技者 10 名を対象に 芝 上で 10 km を実施する条件 (GRASS 条件 ) 路 上で 10 km を実施す る条件 (ROAD 条件 ) 75 % 80 % AEVE AO 2peakRに相当する運動強度で 1 km 10 セットのインタ ーバルトレーニングを芝 上で実施する条件 (INT 条件 ) を設け 運動後におけるヘプシジンの分泌応答を 較している その結果 INT 条件では運動直後の 漿 IL-6 濃度が 値を 清ハプトグロビン濃度 ( 溶 の間接指標 ) は低値を した 清ヘプシジン濃度はいずれの条件においても運動 3 時間後に有意に増加したが 条件間で有意差は認められなかった (Peeling et al. 2009c) Sim et al. (2013) は 男性持久性スポーツ競技者を対象に 運動様式や 運動強度の異なる 4 条件 {165 %AEVE AOR2peakRに相当する強度で 40 分間のランニング (L-R 条件 ) 285 %AEVE AOR2peakR に相当する強度で 40 分間の 強度インターバルランニング運動 (H-R 条件 ) 365 %AEVE AOR2peakRで 40 分間のサイクリング運動 (L-C 条件 ) 485 %AEVE AOR2peakRで 40 分間の 強度 インターバルサイクリング運動 (H-C 条件 )} での運動に対する 漿 IL-6 および 清ヘプシジン濃度の変化を 較している その結果 運動後における 漿 IL-6 濃度は H-R 条件が L-R 条件に 較して有意に 値を した しかし 清ヘプシジン濃度の増加の程度には 条件間で有意差がみられなかった (Sim et al. 2013) で Newlin et al. (2012) の研究では 活動的な 性 12 名を対象に 65 %AEVE AO₂RmaxRに相当する運動強度で 60 分間 (SHORT 条件 ) ま 7

18 EVE たは 120 分間 (LONG 条件 ) の運動 ( ランニング ) に対する 清ヘプシジン濃度の変化を 較している その結果 いずれの条件においても 漿 IL-6 濃度は運動直後に有意に増加し 運動 9 時間後に 清鉄濃度が有意に減少した また 運動時間が い LONG 条件では SHORT 条件と 較して運動 3 時間後の 清ヘプシジン濃度が有意に 値を した (Newlin et al. 2012) このことから 時間の運動はヘプシジンの分泌をより 層亢進させるものと考えられる 運動誘発性の炎症以外にヘプシジンの発現に影響する要因として 球の新 が挙げられる (Mastrogiannaki et al. 2012; Liu et al. 2012) 球の新 には鉄を必要とするため 体内における貯蔵鉄量の減少はヘモグロビン合成能を低下させ 鉄 乏性貧 や鉄 乏を誘引する で 低酸素刺激は 球の新 を刺激することから 低酸素環境への曝露はヘ プシジンの分泌を抑制するかもしれない この点に関して Badenhorst et al. (2014) は 85 %A AO₂RmaxR に相当する運動強度でのインターバルトレーニング後の 3 時間にわたる低酸素曝露 {Fraction of inspiratory oxygen; (FiOR2R):15.1 %} が 清ヘプシジン濃度の分泌応答を減弱さ せたことを明らかにした (Badenhorst et al. 2014) これに対して 持久性運動時 (90 %AEVE AO₂RmaxR で 4 分間のランニング 5 回 ) における低酸素曝露 (FiOR2R:14.5 %) は 運動後の 清ヘプシジン濃度の上昇に影響しなかった (Govus et al. 2014) また Goto ら (2017) は 10 名の男性陸上短距離選 に対して異なる 2 条件の酸素環境下 { 通常酸素条件 (FiOR2R:20.9 %) または低酸素条件 (FiOR2R:14.5 %)} で 6 秒 5 回の全 ペダリング ( 休憩時間 :30 秒 セット間の休憩時間 :10 分 ) を 3 セット実施し 運動後 3 時間まで通常酸素または低酸素環境に曝露をした その結果 運動 3 時間後の時点で 清エリスロポエチン濃度は 低酸素条件が通常酸素条件に 較して有意に 値を したが 清ヘプシジン濃度の上昇に条件間での有意差は認められなかった (Goto et al. 2017a) さらに 男性持久性スポーツ競技者を対象に 異なる 2 条件の酸素環境下 [ 通常酸素条件 (FiOR2R:20.9 %) または低酸素条件 (FiOR2R:14.5 %)] での持久性トレーニング (95 %AEVE AO₂RmaxRに相当する運動強度で 3 分 10 セット 10 分間の 休憩の後に 85 %AEVE AO₂RmaxRに相当する運動強度で 30 分間のランニング運動 : 合計 79 分間 ) を 実施した研究では 運動 2 時間後における 清ヘプシジン濃度に条件間での有意差は認められなかった (Goto et al. 2017b) 8

19 これまでの知 を踏まえると 運動に伴いヘプシジンの分泌応答は 運動の様式や強度に関係なく亢進することが されている で 運動時間の 短はヘプシジンの分泌応答の程度に影響し 時間の持久性運動ではヘプシジンの分泌応答が特に亢進するものと推察される また 運動終了後における低酸素曝露は ヘプシジンの分泌増 を抑制する可能性があると考えられる (2) 運動 トレーニング時の栄養介 に対するヘプシジンの分泌応答運動 トレーニング時における栄養介 が ヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響を検討した先 研究もみられる (Hennigar et al. 2017) Skarpańska Stejnborn et al. (2014) は 19 名の男性ボート選 を対象に 抗酸化作 を有するチョークベリージュース ( チョークベリージュース 150 ml アントシアニン 24 mg/ml) の 8 週間にわたる摂取が 2000 m タイムトライアル後のヘプシジンの分泌応答や炎症反応に及ぼす影響を検討している その結果 栄養介 期間後には 運動後における 清壊死腫瘍因 (Tumor necrosis factor; TNF) -α 濃度の上昇が有意に抑制されたが 運動後の 漿 IL-6 および 清ヘプシジン濃度の変化に影響はみられなかった (Skarpańska-Stejnborn et al. 2014) 同様に 16 名の男性ボート選 を対象に 6 週間のクランベリーエキス (1200 mg) りのサプリメントを摂取させた研究では 抗酸化能 (Total antioxidant capacity; TAC) の改善にも関わらず 運動後における IL-6 およびヘプシジンの分泌応答に影響はみられなかった (Skarpańska - Stejnborn et al. 2017) また Diaz et al.(2015) は 男性陸上 距離選 に対して 抗酸化サプリメント ( ビタミン C:500 mg/ ビタミン E:400 IU/ ) を 28 間摂取させ 介 期間前後で運動テスト (75 % AEVE AOR2maxR に相当する強度 で 90 分間の運動 ) を実施した その結果 運動後に 漿 IL-6 および 清鉄濃度が上昇し それに伴い 清ヘプシジン濃度も増加したが プラセボ条件との間に有意差はみられなかった (Díaz et al. 2015) これらの知 を踏まえると 抗酸化作 を有するサプリメントや 品の摂取が運動に伴うヘプシジンの分泌増 を抑制する可能性は低いと考えられる で 持久性スポーツ競技者においては コンディションの維持や改善をねらいとして鉄サプリメントを利 することが多い これまでに 容量の鉄サプリメントの摂取 ( mg/ ) は安静時の 清ヘプシジン濃度を増加させ それに伴い鉄の吸収率は % まで低 9

20 下することが明らかとなっている (Morettie et al. 2015) しかしながら 持久性トレーニング期間中における中程度の鉄サプリメントの摂取の併 がヘプシジンの分泌応答に与える影響は不明である 持久性運動に伴うヘプシジンの分泌増 には 格筋由来の IL-6 の産 が関与すること (Banzet et al. 2012) また 絶 時や 格筋グリコーゲン量 ( 筋グリコーゲン量 ) が低下した状態では IL-6 の産 は亢進すること (Keller et al. 2001; Steensberg et al. 2001) を考慮すると 炭 化物の摂取はヘプシジンの分泌増 に対して抑 的に作 するかもしれない 実際に 運動前や運動中における炭 化物溶液 ( 炭 化物濃度 6 %) の摂取は IL-6 を含めた運動誘発性の炎症を軽減する (Nieman et al. 1998) また 運動時は外因性 ( 経 摂取 ) の炭 化物利 が優先されることから 炭 化物の 分な摂取は運動時における筋グリコーゲン利 の節約に貢献する (Pedersen et al. 2001; Hennigar et al. 2017) したがって 炭 化物の摂取が IL-6 の産 を軽減することで運動後のヘプシジン分泌応答を抑制する可能性は 分に考えられる またこの点から 事に含まれる炭 化物量の異なる条件下での持久性トレーニングに対するヘプシジンの分泌応答を検討することは有意義である 性スポーツ競技者における減量などを 的とした不適切な 事制限は Female Athlete Triad (FAT) を誘発する (Torstveit and Sundgot-Borgen 2005) FAT には Low Energy Availability (LEA) 視床下部性無 経 粗鬆症 が含まれ 性スポーツ競技者にとって重要な問題として近年注 されている 2017 年に発表されたレビューでは LEA と鉄 乏は密接に関与することが指摘されている (Petkus et al. 2017) さらに 2014 年には国際オリンピック委員会より 相対的エネルギー不 (Relative Energy Deficiency in Sport ; RED-S) の概念が提唱された (Mountjoy et al. 2015; Statuta et al. 2017) ここでは 性スポーツ競技者に限らず男性スポーツ競技者においても 相対的エネルギー不 での 々のトレーニングは 免疫 代謝などの 理的機能に悪影響を及ぼし 貧 や疲労 折などを誘発することが述べられている すなわち RED-S は FAT の要因でもあり スポーツ競技者のパフォーマンスに強く影響を及ぼす (Mountjoy et al. 2015) Woods et al. (2017) の研究では ボート選 に対する 4 週間の強化トレーニングが体重および体脂肪量を有意に減少させ 疲労および気分障害を増 10

21 加させた この要因として著者らは強化トレーニング期間中のエネルギー摂取量がエネルギー消費量を下回ったこと (EAの低下) を 唆している (Woods et al. 2017) このようなエネルギー摂取量とエネルギー消費量との不均衡を反映する指標として 中レプチン濃度の推移が知られている レプチンは脂肪細胞から分泌され 体格指数 (BMI) 体脂肪率および体脂肪量とよく相関する また 絶 や 事制限などエネルギー摂取量の急激な変化に対して鋭敏に応答する特性があり 事摂取制限に伴う体重や体脂肪の減少に先 して 清レプチン濃度は低下する (Kolaczynski et al. 1996) したがって レプチンはスポーツ競技者におけるエネルギー指標として有 であるが ヘプシジンや鉄代謝関連指標との関連は明らかでない 仮に 清レプチン濃度の変化が 清ヘプシジン濃度の上昇に先 するのであれば エネルギー摂取量とエネルギー消費量の不均衡や鉄 乏を未然に防ぐ上で有 な指標になると期待できる 持久性スポーツ競技者における LEA は 炭 化物の摂取不 に依る部分の きいことがが指摘されている (Loucks 2004) LEA や炭 化物摂取量の不 は 筋グリコーゲン量の慢性的な低下を助 する したがって 炭 化物摂取量の不 に伴う LEA の状態 ( 筋グリコーゲン量が減少した状態 ) での 々のトレーニングは筋グリコーゲン量を減少させ IL-6 およびヘプシジンの増加を介して鉄 乏を引き起すことが推察される また 持久性スポーツ競技者では早朝に朝 を 分に摂取しない状況で 時間のトレーニング ( 早朝練習 ) を実施し 数時間後に再び 時間のトレーニングを繰り返すことが多い このような 1 に複数回トレーニングを実施する際には 2 回 以降のトレーニングは筋グリコーゲン量が完全に補填されていない状態で実施される可能性が い このことが 持久性スポーツ競技者における鉄 乏の発症に影響している可能性も考えられる ヘプシジンの分泌応答に注視した研究の多くは慢性炎症患者などを対象にした臨床医学研究であり 持久性スポーツ競技者を対象とした研究はきわめて少数である また 持久性スポーツ競技者を対象にした研究の多くは 単回 (1 1 回 ) のトレーニングに対するヘプシジンの分泌応答を検討したものであり これは持久性スポーツ競技者における典型的なトレーニング形態 (1 複数のトレーニング) を反映したものではない そのために 持久性スポーツ競技者におけるヘプシジンを中 とした鉄代謝の特性 1 に複数回実施をする 11

22 トレーニングに対するヘプシジンの分泌応答 や ヘプシジンの産 を抑 するための 策 は明らかにされていない 12

23 Ⅱ. 的および研究課題 運動と鉄代謝 に関わる先 研究を精査した結果 以下の諸点が今後検討すべき問題 点として考えられた 1. 持久性スポーツ競技者を対象に 習慣的なトレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響には不明な点が多いこと 2. 持久性スポーツ競技者において いられる 1 複数回の持久性トレーニングが ヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響は明らかにされていないこと 3. 常のトレーニング時における栄養摂取状況の相違が ヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響は 分に検討されていないこと 特に 持久性スポーツ競技者で頻発する鉄サプリメントの摂取や LEA 状態がヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響は 明らかにされていないこと そこで 本博 論 では 持久性スポーツ競技者における運動 栄養介 がヘプシジン の分泌応答に及ぼす影響を検討することを 的とした この 的を達成するために以下の 5 つの研究課題を設定した 研究課題 1 持久性スポーツ競技者における鉄代謝の様相: 般 との 較 研究課題 2 陸上 距離選 におけるトレーニング量の相違がヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 研究課題 回の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 研究課題 4 短期間の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 : 鉄サプリメント摂取の影響 研究課題 5 短期間の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 :Energy availability の相違の影響 13

24 本研究から得られる知 は 持久性スポーツ競技者における持久性トレーニングがヘプシジンを中 とした鉄代謝に及ぼす影響を明 するものと考えられる また ヘプシジンの分泌増 を引き起こす要因の解明に繋がることに加えて ヘプシジンの分泌や鉄 乏を予防するための具体的な栄養処 の提案にも貢献すると期待できる 14

25 Ⅲ. 持久性スポーツ競技者における鉄代謝の様相 : 般 との 較 ( 研究課題 1) 1. 背景持久性スポーツ競技者では 鉄 乏の発 頻度が いことはこれまでにも指摘されている また フェリチンが低値を す潜在性の鉄 乏は 般 と 較して スポーツ競技者で発 する頻度が いことが報告されている (Rodenberg and Gustafson 2007) 男性スポーツ競技者では約 10 % 性スポーツ競技者では % の割合で鉄 乏のみられることが されている (Magnusson et al. 1984; Gropper et al. 2006) 以前から スポーツ競技者における鉄 乏性貧 および鉄 乏の主な要因として ランニング時の 底部への機械的刺激による溶 (Miller et al. 1988) トレーニング時の発汗 (Brune et al. 1986) 強度運動に伴う消化管からの出 (Stewart et al. 1984) および 事からの鉄の摂取不 (King et al. 1993; Samuelson et al. 1996) などが指摘されてきた これに加えて 運動に伴うヘプシジンの慢性的な上昇が考えられる (Peeling et al. 2014) 実際 多くの先 研究では 運動による 中ヘプシジン濃度の上昇は 運動後 3 6 時間にかけてみられることが されている (Peeling 2010) また 試合期におけるテニス選 では 清ヘプシジン濃度が上昇したことを した先 研究や (Ziemann et al. 2013) 7 間連続のトレーニングでは尿中ヘプシジン濃度が有意に上昇したことを した先 研究 (Sim et al. 2014) など スポーツ競技者においては安静時の値が上昇することも報告されている これらの研究の多くでは 対象者における栄養摂取量の調査がされていない 事 特に 鉄の摂取量はヘプシジンの分泌に影響することが指摘されている (Moretti et al. 2015) したがって スポーツ競技者におけるヘプシジンの分泌応答の特徴を明 する上では 常における栄養摂取量との関係にも注視することが必要である これらの諸点を解決するためには 持久性スポーツ競技者におけるヘプシジンを中 とした鉄代謝を 同年代の 般 と 較することが有効であると考えられる そこで 研究課題 1では 陸上 距離選 を対象に ヘプシジンやその他の鉄 乏 15

26 に関わる 液指標を同年代の 般 と 較することを 的とした また 3 間の 事調査を実施し 栄養摂取量が鉄代謝に及ぼす影響も検討した 本研究では 陸上 距離選 は 般 に 較して 安静時における 清フェリチン濃度が低値を 清ヘプシジン濃度が 値を すという仮説を設けた 2. 法 (1) 被験者 学 陸上 距離選 ( 距離選 群 )20 名 (21.0 ± 0.2 yrs) および運動習慣のない 般 学 ( 般群 )15 名 (22.0 ± 0.2 yrs) を対象とした 研究を開始するにあたり すべての対象者に対し 研究の 的 測定内容および参加に伴う危険性について 分に説明し 書 にて協 への同意が得られた者のみを対象とした なお 本研究は 命館 学に帰属する倫理委員会の承認を得て実施した (BKC-IRB ) (2) 実験デザインすべての被験者に対して 早朝空腹時に 体計測および 液検査を実施した また 事摂取量を評価するために 3 間の 事調査を実施した 得られた結果から 鉄代謝および栄養摂取状況を両群間で 較した (3) 測定項 体計測 計 (ST-2M 株式会社ヤガミ 愛知) を いて を測定した また 多周波インピーダンス測定機 (Inbody 720, Biospace, Seoul, Korea) を いて 体重 体脂肪量および 格筋量を 0.1 kg 単位で測定した 液検査 早朝空腹時に前腕静脈より採 を った 得られた 液から 末梢 液の 般項 として 中ヘモグロビン (Hb) 濃度 平均 球体積 (MCV) 平均 球ヘモグロビン (MCH) 平 16

27 均 球ヘモグロビン濃度 (MCHC) を測定した これらの測定は 臨床検査会社に委託をした ( 株式会社ファルコバイオシステムズ 京都 ) それ以外の 液は rpm で 10 分間遠 分離し 清および 漿を得た 得られた 清および 漿は解析までの間 80 の超低温冷凍庫で保存した 後 清鉄 フェリチン 総たんぱく (Total protein; TP) 総鉄結合能 (Total iron binding capacity; TIBC) クレアチンキナーゼ (Creatine kinase; CK) 濃度を測定した これらの測定は 臨床検査会社に委託をした ( 株式会社エスアールエル 東京 ) また 清鉄濃度と TIBC を いて トランスフェリン飽和度 (Transferrin saturation; TSAT) を算出した {TSAT(%)= 清鉄 /TIBC 100} 清ヘプシジンおよび 漿 IL-6 濃度は 酵素免疫測定法 (Enzyme linked immunosolvent assay; ELISA) 法を いて解析した また ELISA 法での測定には 市販のキットを使 した (R&D systems, Inc., USA) ELISA 法による解析に伴う 間変動の変動係数 (Coefficient of variation;cv) は 2.3 % (IL-6) 3.5 % ( ヘプシジン ) であった 栄養摂取状況 記 式の 事記録法 ( 秤量法と 安量法の併 ) による 事調査を実施し 栄養摂取状況を調査した 調査期間は 3 間 ( 平 2 休 1 ) とし 体計測などの測定の 1 週間前に実施した 本来 事調査 数の設定は 活リズムが週を単位にしていることから連続した 7 間が理想とされている で 7 間にも及ぶと 事記録はその煩雑さから記録の質が低下する可能性がある このことから 村上ら (2010) は 個 の習慣的な摂取量を把握するための 事調査 の設定として休 を含めた不連続な 2 間以上を提案し 連続した 7 間での調査結果と正の相関が得られ その測定値が妥当であることを報告している ( 村上 2010) そのため 本研究課題における 事調査の 数として 3 間を採 した 事調査では 摂取した時間 料理名 ( 市販 品についてはその名称 ) 材料名 重量を記 するように依頼した また 事前後の写真の撮影を依頼した 品の重量は可能な限り秤量し 秤量が困難な場合のみ 安量を記 した 事記録 紙の回収時に写真と 事記録 紙との内容を管理栄養 が対象者に照合し 事記録内容の確認を った 栄養素および 17

28 品群別の摂取量は 5 訂増補 本 品標準成分表に準拠した栄養計算ソフト ( エクセル栄 養君 Ver. 4.5 株式会社建帛社 東京 ) を いて算出した また サプリメントの利 があ った場合には サプリメントからの栄養摂取量も本研究の結果に含めた (4) 統計解析すべての測定値は 平均値 ± 標準誤差 (Means ± SE) を いて した 解析に先 ち Kolmogorov-Smirnov 検定を いて各変数の正規分布を評価した 距離選 群と 般群との平均値の差の検定には Mann-Whitney の U 検定を いた データの解析には 統計解析ソフト IBM SPSS Software ver (International Business Machines Co., USA) を い 有意 準は危険率 5 % 未満に設定した 3. 結果 (1) 体組成 Table 1 には 両群における体組成を した は 距離選 群が 般群に 較して有意に 値を したが 体重には群間での有意差は認められなかった 体脂肪量および体脂肪率は 距離選 群が 般群に 較してそれぞれ有意に低値を した (p < 0.001) Table 1. Comparisons of physical characteristics between the two groups. Runner Normal P Height (cm) ± ± Weight (kg) 49.7± ± 1.8 N.S. Skeltal muscle (kg) 22.5 ± ± 0.8 N.S. Body fat (kg) 8.0 ± ± 1.2 < Percentage of body fat (%) 15.9 ± ± 1.1 < Value are means ± SE. N.S.: Not significant. 18

29 (2) 液指標 Table 2 には 両群における 液指標の結果を した 中ヘモグロビン濃度には 両群間で有意差が認められなかった 距離選 群は 般群に 較して 清鉄濃度および TSAT がいずれも有意に低値を した 清フェリチン濃度には 両群間での有意差は認められなかった 筋損傷の間接指標である 清 CK 濃度は 距離選 群において 値傾向を したが (p = 0.07) 漿 IL-6 濃度には両群間での有意差はみられなかった Table 2. Comparisons of blood variables between the two groups. Runner Normal p Hb (g/dl) 13.0 ± ± 0.2 N.S. Hct (%) 40.1 ± ± 0.5 N.S. MCV (fl) 93.2 ± ± MCH (pg) 30.6 ± ± 0.4 N.S. MCHC (g/dl) 32.3 ± ± 0.2 N.S. Ferritin (ng/ml) 35.1 ± ± 4.4 N.S. Total Protein (g/dl) 7.2 ± ± Fe (μg/dl) 62.7 ± ± TIBC (μg/dl) 337 ± ± 9 N.S. CK (IU/L) 353 ± ± TSAT (%) 19.1 ± ± 5.3 <0.001 IL-6 (pg/dl) 0.35 ± ± 0.1 N.S. Value are means ± SE. N.S.: Not significant. 19

30 Figure 4 には 清ヘプシジン濃度の結果を した 清ヘプシジン濃度は 距離選 群が 般群に 較して 値を した (p = 0.09) (ng/ml) 12 p = Runner Normal Figure 4. Comparisons of serum hepcidin levels between the two groups. Value are means ± SE. 20

31 (3) 栄養摂取状況 Table 3 には 事調査を実施した 3 間における栄養摂取状況を した 炭 化物摂取量を除くすべての項 において 距離選 群が 般群に 較して有意に 値を した (p < 0.05) Table 3. Comparisons of dietary intake between the two groups. Runner Normal P Energy (kcal) 2,125 ± 26 1,731 ± 95 < Protein (g) ± ± 3.4 < % Protein (%) 21.5 ± ± 0.5 < Fat (g) 63.5 ± ± % Fat (%) 26.9 ± ± 1.3 N.S. Carbohydrate (g) ± ± 16.4 N.S. % Carbohydrate (%) 51.6 ± ± 1.7 < Calcium (mg) 840 ± ± 31 < Fe (mg) 14.5 ± ± 0.4 < Zn (mg) 14.5 ± ± 0.4 < Vitamin C (mg) 230 ± ± 8 < Fiber (g) 24.8 ± ± 1.0 < Value are means ± SE. N.S,: Not significant. 21

32 4. 考察研究課題 1 では 陸上 距離選 におけるヘプシジンを中 とした鉄代謝の様相を 般 と 較することを 的とした また 体組成 液指標状態 事摂取量においても 両群間での 較を った その結果 清ヘプシジン濃度は 距離選 群が 般群に 較して 値傾向を した 清鉄濃度および TSAT は 距離選 群が低値を した 体重には両群間で有意差はみられなかった で 体脂肪量および体脂肪率はいずれも 距離選 群が有意に低値を した 事摂取量に関わる各項 は 炭 化物の摂取量を除く全ての項 において 距離選 群が有意に 値を した これまで 過性の運動終了 3 6 時間後にかけて 中ヘプシジン濃度が きく上昇すること また 中ヘプシジン濃度の上昇は運動 24 時間後においてみられることもあることが報告されている (Peeling et al a, b, c) で 慢性的なトレーニングが安静時のヘプシジン濃度に及ぼす影響は 分に検討されていない 本研究の結果 陸上 距離選 では 清ヘプシジン濃度が 般 と 較して 値傾向を 清鉄濃度および TSAT は低値を すことが明らかとなった Sandstrom et al. (2017) は 若年 選 ( 球技 瞬発系種 ) および 般 を対象に安静時のヘプシジン濃度を 較したところ 若年 選 において有意に 値を したことを認めている また 中ヘモグロビンや 清フェリチン濃度には両群間で差はみられなかったが 清鉄濃度および TSAT はいずれも若年 選 が有意に低値を した (Sandström et al. 2017) この結果は 本研究の結果とも 致するものである で Ma et al. (2013) は クロスカントリー選 と 般 の間での安静時の 清ヘプシジン濃度に有意差のみられなかったことを している (Ma et al. 2013) その 因として 著者らは対象者の競技レベルが くなかったことを挙げている しかし 7 間連続の持久性トレーニングを実施した研究では トレーニング期間の終了翌 に安静時でのヘプシジンの上昇が認められた (McClung et al. 2013; Sim et al. 2014) これらの知 を踏まえると スポーツ競技者においては 強度 容量でのトレーニングを連 繰り返すことにより慢性的に体内の炎症が亢進し ヘプシジン濃度の上昇が誘発される可能性が考えられる 実際に 本研究に参加した 選 は 常的に 強度 時間のトレーニングを継続していた また 距離選 群において 清鉄および TSAT が低値を した理由としては ヘプシジン濃 22

33 度の慢性的な上昇に伴い網内系細胞からの鉄の排出障害が起こり 結果的に 清鉄の減少が じた機序が推察される 栄養摂取量は 距離選 群が 般群と 較して 炭 化物を除く項 で有意に 値を した 本 の 事摂取基準 2015 年版によると 本研究の被験者と同年代の 性における推定エネルギー必要量は 1 あたり 1,950 kcal となる (18 29 歳 性 体活動レベルⅡ) 本研究の 般 群のエネルギー摂取量は この値を約 200 kcal 程度下回った スポーツ競技者では その のエネルギー消費量が kcal と推定される場合 2,400 2,500 kcal のエネルギー摂取量が望ましいと考えられている ( 体重 50 kg と仮定した場合 ) このことから 本研究の 距離選 群のエネルギー摂取量は 推奨量を約 400 kcal 程度下回っていたと考えられる また 事からの鉄の摂取量は 般 と 較して 選 で 値を した しかしながら 中ヘモグロビンや 清フェリチン濃度には両群間で有意差が認められなかった 炭 化物の摂取量には 両群間で有意差がみられなかった また 体重当たりの炭 化物量を換算すると 距離選 群では 体重当たり約 5.5g/ の炭 化物量であった 筋グリコーゲン量が減少した状態での運動は 肝臓からの糖新 を促進させるため IL-6 の増加を助 させる また 運動によるヘプシジン産 は 主に IL-6 の分泌が亢進することにより増加する (Keller et al. 2001; Steensberg et al. 2001a) Badenhorst et al. (2015) の報告によると 筋グリコーゲン量を枯渇させるような運動を った後に低炭 化物 (3 g/ kg ) を摂取した条件は 炭 化物 (8 g/ kg ) を摂取した条件に 較して 翌 に実施した 過性の運動直後の IL-6 および運動 3 時間後のヘプシジン濃度が有意に 値を した (Badenhorst et al. 2015a) 本研究での 距離選 群における炭 化物の摂取量は 上述の研究で いられた摂取量 (3 g/ kg ) を上回っていたが 連 にわたり 時間のトレーニング (3 時間 / ) を実施していたことを考慮すると 炭 化物の摂取量は必ずしも 分でなかった可能性は否めない このことから 本研究で対象としたような持久性スポーツ競技者における慢性的なヘプシジン濃度の上昇を抑制する 策の つとして エネルギー消費量に 合った炭 化物の摂取が挙げられるかもしれない 本研究は 2 3 に実施したが 研究対象者 ( 距離群 ) の年間のスケジュールの 23

34 中では オフトレーニング期 ( 準備期 ) に相当していた したがって トレーニング量 ( 間 距離 ) が増加するトレーニング期 ( 鍛錬期 ) においては 本研究の 2 群間で認められた差がさらに きくなる可能性も考えられる したがって 今後は同 の集団を対象に トレーニング量の変化に伴うヘプシジンを中 とした鉄代謝の応答を改めて検討する必要があろう 5. 結論 陸上 距離選 における安静時の 清ヘプシジン濃度は 同年代の 般 に 較して 値傾向を した また 陸上 距離選 は 事からの鉄の摂取量が有意に 値を した で 清鉄濃度および TSAT は有意に低値を した 24

35 Ⅳ. 陸上 距離選 におけるトレーニング量の相違が ヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 ( 研究課題 2) 1. 緒 研究課題 1 では 常的に 時間のトレーニングを実施している 陸上 距離選 における鉄代謝や栄養摂取状況を 同年代の 般 と 較をした その結果 陸上 距離選 における安静時の 清ヘプシジン濃度は 同年代の 般 に 較して 値傾向を した 研究課題 1 での 距離選 群における炭 化物の摂取量は 体重当たり約 5.5g/ であった 連 にわたり 時間のトレーニングを実施していたことを考慮すると 炭 化物の摂取量は必ずしも 分でなかった可能性は否めない 負のエネルギーバランスと鉄 乏の発症が関連していることも報告されていることから (Petkus et al. 2017) 炭 化物を中 としたエネルギー摂取量の不 がヘプシジンの分泌亢進と関連している可能性が考えられる 研究課題 1 では 陸上 距離選 と 般 の鉄代謝を 較する横断調査であったた で スポーツ競技者は年間を通して同 内容のトレーニングを実施するわけではなく 標とする競技会の実施時期を踏まえ 年間のトレーニング内容を数週間 数ヶ 単位で変化させる ( ピリオダイゼーション ) ことが多い 研究課題 1 では トレーニング量が 較的少ない準備期 ( オフトレーニング期 ) にデータの収集をしたが 複数の合宿などを い 間でのトレーニング量が 幅に増加する鍛錬期 ( トレーニング期 ) においてはコンディション不良を訴え トレーニングから離脱する選 が増えることは持久性スポーツ競技の現場ではよく知られた事実である また実際に Nickerson et al. (1985) は 陸上 距離選 のトレーニング期ではオフトレーニング期と 較して鉄 乏の罹患率が増加したことを報告している (Nickerson et al. 1985) したがって オフトレーニング期からトレーニング期への移 に伴うトレーニング量の増加は ヘプシジンの分泌増 を亢進させ鉄代謝の抑制を引き起こすかもしれない そこで 研究課題 2 では 陸上 距離選 を対象に トレーニング量 ( 間 距離 ) の変化が 清ヘプシジン濃度を中 とした鉄代謝関連指標に及ぼす影響を検討することを 25

36 的とした また トレーニング量の増加は 清ヘプシジン濃度を上昇させるという仮説を 設けた 2. 法 (1) 被験者国内トップレベルの 陸上 距離競技者 16 名 (20.5 ± 1.0 yrs) を対象とした 被験者は 全員が同 チームに所属し 1 2 回 ( 早朝 ) の練習を週 6 の頻度で継続していた ( 早朝のトレーニングは約 1 時間 のトレーニングは約 2 時間 ) すべての対象者に対し 研究の 的 測定内容および参加に伴う危険性について 分に説明し 書 にて協 への同意が得られた者のみを対象とした なお 本研究は 命館 学に帰属する倫理委員会の承認を得て実施した (BKC-IRB ) (2) 実験デザイントレーニング内容の相違が鉄代謝関連指標に及ぼす影響を検討するために オフトレーニング期 (LOW: 2015 年 2 中旬 ) およびトレーニング期 (INT: 2015 年 8 下旬 ) の 2 回にわたり採 および 事調査を った (Fig.5) LOW は年間スケジュールの中で 準備期 に該当し トレーニング量は 較的少ない時期であり 事は主に寮で提供される これに対して INT は 鍛錬期 に該当し 10 に開催される全 本レベルの 会に向け合宿を含んだ 時間の練習を連 実施し トレーニング量は年間の中でも最も増加する (8 9 ) 点が特徴として挙げられる また 事は主に遠征先で提供される 間 距離は 被験者 が記録している 誌をもとに評価した LOW INT のいずれにおいても 体組成 液指標および栄養摂取状況を評価した また 直近 1 ヶ 以内のサプリメントの摂取状況および 経周期の状態を確認した 体組成の測定および採 は 早朝空腹時 (6 時 8 時半 ) に実施した 26

37 Middle of February Late of August Body composition assessment Body composition assessment LOW Blood sampling Dietary Survey INT Blood sampling Dietary Survey February August Figure 5. Experimental design during LOW and INT. (3) 測定項 体組成 計 (ST-2M 株式会社ヤガミ 愛知) を いて を測定した また 多周波インピーダンス測定機 (Inbody 720, Biospace, Seoul, Korea) を いて 体重 体脂肪量および 格筋量を 0.1 kg 単位で測定した (Demura et al. 2004) 液指標早朝空腹時に前腕静脈より採 を った 中ヘモグロビン (Hb) 濃度の測定は 臨床検査会社に委託をした ( 株式会社ファルコバイオシステムズ 京都 ) それ以外の 液は rpm で 10 分間遠 分離し 清および 漿を得た 得られた 清および 漿は解析までの間 80 の超低温冷凍庫で保存した 後 清鉄 フェリチン 総たんぱく (TP) およびクレアチンキナーゼ (CK) 濃度を測定した これらの測定は 臨床検査会社に委託をした ( 株式会社 SRL 東京) また 清鉄濃度と TIBC を いて トランスフェリン飽和度 (Transferrin saturation; TSAT) を算出した {TSAT (%) = 清鉄 / TIBC 100} 清ヘプシジンおよび 漿 IL-6 濃度は ELISA 法を いて解析した また ELISA 法での測定には 市販のキットを使 した (R&D systems, Inc., USA) ELISA 法による解析に伴う CV 値は 2.3 % (IL-6) 3.1 % ( ヘプシジン ) であった 27

38 栄養摂取状況 記 式の 事記録法 ( 秤量法と 安量法の併 ) による 事調査を実施し 栄養摂取状況を調査した 調査期間は 3 間 ( 平 2 休 1 ) とし 体計測などの測定の 1 週間前に実施した 事調査では 摂取した時間 料理名 ( 市販 品についてはその名称 ) 材料名 重量を記 するように依頼した また 事前後の写真の撮影を依頼した 品の重量は可能な限り秤量し 秤量が困難な場合のみ 安量を記 した 事記録 紙の回収時に写真と 事記録 紙との内容を管理栄養 が対象者に照合し 事記録内容の確認を った 栄養素および 品群別の摂取量は 5 訂増補 本 品標準成分表に準拠した栄養計算ソフト ( エクセル栄養君 Ver. 4.5 株式会社建帛社 東京 ) を いて算出した また サプリメントの利 があった場合には サプリメントからの栄養素摂取量も本研究の結果に含めた (4) 統計解析すべての実験データは 平均値 ± 標準誤差 (Means ± SE) を いて した Kolmogorov- Smirnov 検定を いて各変数の正規分布を評価した LOW と INT との間の平均値の差の検定には 対応のある t 検定を使 した 統計解析は SPSS software ver (International Business Machines Co., USA) を い 有意 準は危険率 5 % 未満に設定した 28

39 3. 結果 (1) 間 距離および 経の状況 間 距離は INT (622 ± 94 km/ ) が LOW (499 ± 106 km/ ) に 較して有意に 値を した (p = 0.029) また LOW ではいずれの被験者も鉄サプリメントを使 していなかった で INT においては被験者の 44 % (INT) が鉄サプリメントを使 していた 鉄サプリメントの使 期間は被験者によって異なり INT の開始 2 週間 4 週間前から使 していた これらの期間中 その他のサプリメントを使 した被験者はいなかった 規則的な 経がある (28 ± 2 ) と申告した被験者は LOW では 25 % INT では 19 % であった また いずれの時期においても 2 名の被験者が無 経を申告した (2) 体組成 Table 4 には 体組成の結果を した 体重および除脂肪体重には LOW と INT の間で有意差は認められなかった 体脂肪量と体脂肪率は INT が LOW に 較してそれぞれ有意に低値を した Table 4. Comparisons of physical characteristics between the two different training periods. Variables LOW INT p Height (cm) ± Body weight (kg) 49.7 ± ± 1.0 N.S. Lean body mass (kg) 41.4 ± ± 0.8 N.S. Body fat (kg) 8.0 ± ± % Body fat (%) 15.8 ± ± Values are means ± SE. N.S.: No significant. 29

40 (3) 液指標 Table 5 には 液指標の結果を した 中 Hb MCV MCH MCHC 清フェリチン TP 鉄 TIBC 濃度および TSAT には LOW と INT の間で有意差はみられなかった (p > 0.05) 清 CK 濃度は INT が LOW に 較して 値傾向を した (p = 0.09) 漿 IL- 6 濃度には LOW と INT の間で有意差はみられなかった いずれの被験者も鉄 乏性貧 ( 中 Hb 濃度 < 12.0 g/dl) には該当しなかった しかし LOW では 31 % INT では 37 % の被験者が 鉄 乏 ( 清フェリチン濃度 < 20 ng/ml) に該当していた (Reinke et al. 2012) Table 5. Comparisons of blood variables between the two different training periods. Variables LOW INT p Hb (g/dl) 12.9 ± ± 0.3 N.S. MCV (μm³) 90.0 ± ± 0.8 N.S. MCH (pg) 30.6 ± ± 0.2 N.S. MCHC (g/dl) 32.1 ± ± 0.2 N.S. Ferritin (ng/ml) 30.9 ± ± 2.8 N.S. TP (g/dl) 7.2 ± ± 0.1 N.S. Fe (μg/dl) 55 ± 6 65 ± 8 N.S. TIBC (μg/dl) ± ± 6.9 N.S. TSAT (%) 16.4 ± ± 2.4 N.S. CK (IU) 227 ± ± IL-6 (pg/ml) 0.35 ± ± 0.06 N.S. Values are means ± SE. N.S.: No significant. 30

41 (4) 清ヘプシジン濃度 Figure 6 には 清ヘプシジン濃度の結果を した 清ヘプシジン濃度は INT が LOW と 較して有意に 値を した (LOW; 8.8 ± 6.1 ng/ml, INT; 16.3 ± 6.5 ng/ml, p = 0.027) また いずれの時期においても 清ヘプシジン濃度と 清フェリチン濃度との間に有意な正の相関関係 (LOW:= p = INT:r = p = 0.027) が認められた (Fig. 7) 鉄サプリメントの使 の有無が 清ヘプシジン濃度に及ぼす影響を検討したところ 鉄サプリメントの利 者と 利 者では 清ヘプシジン濃度に有意差がみられなかった (p = 0.10) Figure 6. Comparison of serum hepcidin levels between the two different training periods. Values are means ± SE. * p < 0.05 between the periods. Ferritin(ng/mL) LOW INT Hepcidin (ng/ml) Figure 7. Correlation between serum hepcidin and ferritin levels. 31

42 (5) 栄養摂取状況 Table 6 には 3 間のエネルギーおよび栄養摂取状況を した 事からの炭 化物および鉄の摂取量は いずれも INT が有意に 値を した ( 炭 化物 : p = 0.002, 鉄 :p = 0.047) また 鉄サプリメントを利 していた被験者 (n = 7) において 鉄サプリメントからの鉄の平均摂取量は 9.5 ± 3.0 mg であった エネルギー摂取量は INT が LOW に 較して 値を す傾向がみられた (p = 0.052) で たんぱく質および脂質の摂取量は INT において有意に低下した ( たんぱく質 : p = 0.002, 脂質 : p = 0.010) Table 6. Comparisons of energy and macronutrient intakes during three days training period. Variables LOW INT p Energy (kcal) 2,140 ± 32 2,318 ± (kcal/bwkg) 44 ± 2 48 ± Protein % Protein (g) ± ± (%) 21.7 ± ± 0.4 <0.001 Fat (g) 64.2 ± ± % Fat (%) 27.0 ± ± 0.7 <0.001 Carbohydrate % Carbohydrate (g) ± ± (%) 51.3 ± ± 1.1 <0.001 (g/bwkg) 5.6 ± ± 0.4 <0.001 Iron (mg) 14.4 ± ± Vitamin C (mg) 228 ± ± 24 N.S. Values are means ± SE. N.S.: No significant. 32

43 4. 考察研究課題 2 における主要な知 としては 陸上 距離選 では 間でのトレーニング量 ( 間 距離 ) の増加に伴い 清ヘプシジン濃度が有意に上昇したことが挙げられる この結果は 清ヘプシジン濃度の上昇がトレーニング量の増加と関連することを 唆するものである また 試合期におけるテニス選 では 清ヘプシジン濃度が上昇したことを した先 研究や (Ziemann et al. 2013) 7 間連続のトレーニングでは尿中ヘプシジン濃度が有意に上昇したことを した先 研究 (Sim et al. 2014) の結果とも 致する これらの結果を踏まえると スポーツ競技者におけるトレーニング量の増加は 安静時におけるヘプシジン濃度の上昇を誘発する可能性が いと推察される 本研究で対象とした 陸上 距離選 ( 本の 学陸上選 の中で最上位レベル ) は 1 2 回のトレーニング ( 合計 3 時間 ) を定期的に実施していた 特に 持久性スポーツ種 における競技者では 1 に複数回の練習を うことは珍しくない したがって 本研究から得られた知 は 陸上競技以外のスポーツ競技者に対しても 分に応 できるものと考えられる 細胞培養 (Nemeth 2003; Kemna 2005) および動物 (Banzet et al. 2012) を いた先 研究において IL-6 はヘプシジン産 を刺激することが明らかにされている また Pedersen et al. (2001) は ヒトにおける 時間の運動は 格筋での IL-6 の産 を顕著に刺激することを指摘している (Pedersen et al. 2001) 過性の運動に対するヘプシジンの分泌応答に着 した研究では 時間の運動は運動直後に IL-6 を増加させ 次いで 運動 3 時間後にヘプシジン濃度を上昇させることが認められている (Peeling et al a, b, c; Sim et al. 2012) 本研究では 漿 IL-6 濃度に LOW と INT の間で有意差がみられなかった したがって INT における安静時の 清ヘプシジン濃度の上昇に IL-6 の増加は直接的に関与していないものと考えられる しかし 本研究では運動直後における IL-6 やヘプシジンの分泌応答は検討していないために この点については注意が必要である LOW では被験者の 31 % INT では 37 % が鉄 乏 ( 清フェリチン濃度 < 20 ng/ml) と分類された 性陸上 距離選 (Nickerson et al. 1985) およびプロサッカー選 (Heisterberg et al. 2013) を対象にした研究では トレーニング期にフェリチン濃度が低下したことが報告されている で 本研究では 清フェリチン濃度に有意な変化はみられなかった しか 33

44 し LOW および INT のいずれにおいても 清ヘプシジンとフェリチン濃度との間に有意な正の相関関係が認められた この結果は プロバスケットボール選 のシーズン前において 清ヘプシジン濃度と 清フェリチン濃度の間に正の相関関係を した Dzedze et al. (2016) の報告とも 致する (Dzedzej et al. 2016) 清フェリチン濃度は 体内での貯蔵鉄量を反映する で 慢性的な炎症の亢進はフェリチン濃度を上昇させる したがって 本研究においても 連 のトレーニングによる慢性的な炎症が亢進することで 清フェリチン濃度の上昇が じたのかもしれない (Borrione et al.2012) 本研究の特筆すべき点としては 事調査を実施していることが挙げられる スポーツ競技者の鉄代謝に着 した先 研究では 々の栄養素の摂取状況に関する詳細な情報は検討されていない Nuviala et al. (1997) によると 鉄 乏 ( 清フェリチン値 < 20 ng/ml) を有する 性スポーツ競技者のエネルギー摂取量は 2,176 ± 530 kcal/ であり (Nuviala and Lapieza 1997) 本研究の LOW および INT ではそれぞれ 2,140 ± 130 kcal/ (LOW) 2,318 ± 343 kcal/ (INT) であった 残念ながら 本研究ではトレーニング中のエネルギー消費量に関するデータを実測することができなかったために エネルギー消費量と摂取量のバランスにまで 及することができない また 本研究では 鉄サプリメントを利 していた被験者では 清ヘプシジン濃度が 値を す傾向がみられた なお 被験者の鉄摂取量の平均値は 14.4 ± 0.4 mg/ (LOW) および 17.3 ± 1.3 mg/ (INT) であった これらの値は 以前に報告された値 ( 例 :14 mg/ ) を上回るか またはそれに近い値であった (Samuelson et al. 1996) 本研究では 性を対象としたため 経による影響も考慮すべきである 実際に 経 ( 失 ) は鉄 乏に影響し 般 性を対象とした研究では 経 による鉄の減少によってヘプシジン濃度の低下が確認されている しかしながら 研究課題 2 で対象とした 陸上 距離選 は測定対象となった期間中 その他のサプリメントを使 した被験者はいなかった 規則的な 経がある (28 ± 2 ) と申告した被験者は LOW では 25 % INT では 19 % に過ぎず 経を有する被験者と正常の 経周期の者との間でも 清ヘプシジン濃度に有意差はみられなかった このことから 経周期が本研究の結果に影響している可能性は低いと予想される 34

45 本研究の限界点として トレーニング中のエネルギー消費量が評価できなかったことが挙げられる Pasiakos et al. (2016) の研究では 4 間にわたる軍隊でのトレーニング後にみられたヘプシジンの増加は エネルギーバランス ( エネルギー摂取量と消費量から評価 ) と負の相関関係を した (Pasiakos et al. 2016) したがって 今後はトレーニング期間中におけるエネルギーバランスの変化がヘプシジンの分泌に及ぼす影響を検討する必要があろう また トレーニング期間中におけるヘプシジンの上昇や鉄 乏のリスクを減少させるための栄養処 ( 炭 化物摂取量の増加 適切なエネルギーバランスなど ) を検討することも有意義な課題であると考えられる 5. 結論 陸上 距離選 において トレーニング量 ( 間 距離 ) の増加に伴い安静時の 清ヘプシジン濃度は増加することが明らかとなった 35

46 Ⅴ. 1 2 回の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 ( 研究課題 3) 1. 緒 研究課題 2 では 陸上 距離選 において トレーニング量 ( 間 距離 ) の増加に伴い 安静時の 清ヘプシジン濃度は上昇することが明らかとなった しかしながら 研究課題 2 ではトレーニング中のエネルギー消費量に関するデータを実測することができなかったために エネルギー消費量と摂取量のバランスがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響を明 することはできなかった アメリカスポーツ医学会から 性競技者の三主徴に関する Position Stand が発表されている 性競技者の三主徴には 利 可能エネルギー不 (Low energy availability;lea) 無 経 粗鬆症が含まれる また これらは 継続的な激しい運動トレーニングが原因として挙げられ それぞれの発症が相互に関連することが指摘されている さらに近年 Petkus et al. (2017) は 性競技者の三主徴と鉄 乏が相互に関連することを認めている (Petkus et al. 2017) この点に関して Pasiakos et al. (2016) は トレーニング実施に伴う負のエネルギーバランス ( 摂取エネルギーと消費エネルギーの差 ) がヘプシジン濃度の上昇と負の相関関係を したことを報告している (Pasiakos et al. 2016) したがって 消費エネルギー量に対する摂取エネルギーの不 がヘプシジンの分泌増 を助 している可能性は 分に考えられる 特に 持久性スポーツ種 のトレーニング現場では 1 に複数回練習を っていることが多く このことは LEA やヘプシジンの分泌増 を引き起こすものと予想される しかし これまでに実施された研究の多くは (Roecker et al. 2005; Peeling et al. 2009a, b, c) 単回 (1 1 回 ) の運動後数時間 (3 時間程度 ) におけるヘプシジンの分泌応答を検討したものである レプチンは 脂肪細胞から分泌され 体格指数 (BMI) 体脂肪率 および体脂肪量(Considine et al. 1996) と関連することから 体脂肪の蓄積の状態を すとされている (Maffei et al. 1995) また 絶 (Kolaczynski et al.1996) 事制限(Weigle et al. 1997) などエネルギーの摂取量の制限によって体脂肪の減少が じる前に 中レプチン濃度は低下することが知られている このことから 中レプチン濃度は エネルギー摂取量と消費量のバランス 特に炭 化物摂 36

47 取量の変動を鋭敏に反映する指標である (Jenkins et al. 1997) そこで研究課題 3 では 陸上 距離選 における 1 2 回のトレーニングに対するヘプシジンの分泌応答を 中レ プチン濃度の変化と関連付けて 明らかにすることを 的とした 2. 法 (1) 被験者国内トップレベルの 学 陸上 距離競技者 13 名 (20.7 ± 0.4 yrs) を対象とした これらの対象者の中に投薬中の者 または既往歴のある者は含まれていなかった 研究を開始するにあたり すべての対象者に対し 研究の 的 事 運動 測定内容および参加に伴う危険性について 分に説明し 書 にて協 への同意が得られた者のみを対象とした なお 本研究は 国 スポーツ科学センターに帰属する倫理委員会の承認を得て実施した (IRB ) (2) 実験デザイン本研究は 1 2 回のトレーニングに対する鉄代謝の動態を翌朝まで経時的に検討した トレーニングは 午前 (7 時 8 時 ) および午後 (15 時 17 時 ) の 2 回から構成され 早朝空腹時 (6 時, Pre) 午後の練習直前 (14 時, P7) 午後の練習 3 時間後 (20 時, P14) および翌 の早朝空腹時 (6 時, P24) の合計 4 回 採 を った また Visual analog scale (VAS) を いて 主観的疲労度および筋痛を調査した これらに加えて 測定 の 事調査および体組成の測定を実施した (Fig.8) Exercise 1h Exercise 8:00 12:00 18:00 2h Meal Blood sample 6:00 14:00 20:00 6:00 Pre P7 P14 P24 Figure 8. Time schedule for mesurements. 37

48 (3) 測定項 体組成 計 (ST-2M 株式会社ヤガミ 愛知) を いて を測定した また 多周波インピーダンス測定機 (Inbody 720, Biospace, Seoul, Korea) を いて 体重 体脂肪量および 格筋量を 0.1 kg 単位で測定した (Demura et al. 2004) 液指標 Pre P7 P14 および P24 の合計 4 ポイントにおいて前腕静脈から採 を実施した Pre および P24 の得られた 液から 末梢 液検査の 般項 として 中ヘモグロビン (Hb) 濃度を測定した ( 株式会社ファルコバイオシステムズ 京都 ) それ以外の 液は rpm で 10 分間遠 分離し 清および 漿を得た 得られた 清および 漿は解析までの間 80 の超低温冷凍庫で保存した 後 清鉄 フェリチン濃度 TIBC および 清 CK 濃度を測定した ( 株式会社 SRL 東京 ) 清鉄濃度と TIBC を いて トランスフェリン飽和度 (Transferrin Saturation; TSAT) を算出した {TSAT (%)= 清鉄 /TIBC 100} 漿 IL-6 清ヘプシジンおよびレプチン濃度の測定には 市販のキット (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) を いて ELISA 法によって解析した ELISA 法を いた解析では 全てのサンプルを 2 回分析し その平均値を算出した ELISA 法の解析に伴う CV 値は 5.0 % (IL-6) 4.4 % ( ヘプシジン ) であった 主観的疲労度主観的疲労度および筋 痛は VAS を いて評価した VAS の 評価スコアは 100 mm の線分とし 左端 (0) には 全く疲れていない 右端 (100) には とても疲れている 状態と表記し 今の状態のレベルがどこに位置するかその線分上に印を記 させた 38

49 栄養摂取状況 記 式の 事記録法 ( 秤量法と 安量法の併 ) による 事調査を実施し 栄養摂取状況を調査した 栄養摂取状況の調査は トレーニング前 および当 に実施した 事調査では 摂取した時間 料理名 ( 市販 品はその名称 ) 材料名 重量を記 するように依頼した また 事前後の写真の撮影を依頼した 品の重量は可能な限り秤量し 秤量が困難な場合のみ 安量を記 した 事記録 紙の回収時に写真と 事記録 紙との内容を管理栄養 が対象者に照合し 事記録内容の確認を った 栄養素および 品群別の摂取量は 5 訂増補 本 品標準成分表に準拠した栄養計算ソフト ( エクセル栄養君 Ver. 4.5 株式会社建帛社 東京 ) を いて算出した また サプリメントの利 があった場合には サプリメントからの栄養摂取量も本研究の結果に含めた (4) 統計解析すべての測定値は 平均値 ± 標準誤差 (Means ± SE) で した トレーニング前後 (Pre P7 P14 P24) における各変数の平均値の差の検定には 元配置の分散分析 (one-way ANOVA) を い 主効果の有無を検定した 元配置の分散分析においては正規分布の有無を Shapiro-Wilk 検定で確認した 元配置分散分析を った後 Levene の検定で等分散性が仮定される変数については Tukey HSD 法を 等分散性が仮定されない変数については Games-Howell 法を いた また Pre と P24 の早朝空腹時における変数の 較には 対応のある t 検定を いた 2 変数の関連性の検討には Pearson の積率相関係数を求めた 統計解析には SPSS software ver (International Business Machines Co., USA) を いて 有意 準は危険率 5 % 未満に設定した 39

50 3. 結果 (1) 体組成 Table 7 には 体組成の結果を した Table 7. Characteristics of body composition. Height (cm) ± 0.9 Weight (kg) 47.5 ± 0.7 Body fat (%) 7.4 ± 0.5 Fat free mass (kg) 40.1 ± 0.5 The values are means ± SE. (n = 13) (2) 距離 トレーニング時における総 距離は 22.1 ± 0.9 km (2 回のトレーニング時における合計 値 ) であった (3) 主観的疲労度 Table 8 には トレーニング前後における主観的疲労度の変化を した 有意な時間の主 効果が認められ Pre と 較して P7 P14 および P24 で 値を した (p < 0.05) Table 8. Changes in scores of fatigue before exercise and during post-exercise period. Pre P7 P14 P24 Fatigue (mm) 9 ± 2 69 ± 5* 68 ± 5* 67 ± 5* The values are means ± SE. Main effect for time: p = 0.045, *; p < 0.05 (vs. Pre) 40

51 (4) 液指標鉄関連指標 Table 9 には 末梢 液 般項 の結果を した 鉄 乏性貧 ( 中ヘモグロビン濃度 12 g/dl 以下 ) に該当するものはみられなかった いずれの項 においても Pre と P24 の間に有意な変化は認められなかった Table 9. Changes in hematological variables before exercise and during post-exercise period. Pre P7 P14 P24 Hb (g/dl) 12.7 ± ± 0.1 Hct (%) 39.3 ± ± 0.4 MCV (fl) 95.3 ± ± 1.3 MCH (pg) 30.8 ± ± 0.5 MCHC (%) 32.3 ± ± 0.1 The values are means ± SE. Table 10 には 清フェリチン 鉄濃度 TSAT 濃度 ハプトグロビン CK レプチン 濃度および 漿 IL-6 濃度の結果を した いずれの項 においても有意な時間の主効果は 認められなかった Table 10. Changes in iron and inflammatory variables before exercise and during post-exercise period. Pre P7 P14 P24 Ferritin (ng/ml) 24.3 ± ± 5.8 Iron (μg/dl) 94.3 ± ± ± ± 13.1 TSAT (%) 26.1 ± ± 3.2 Haptoglobin (ng/ml) 44 ± ± ± ± 10 CK (IU) 622 ± ± 125 IL-6 (pg/ml) 0.5 ± ± 0.2 Leptin (ng/ml) 2.5 ± ± 0.2 The values are means ± SE. 41

52 清ヘプシジン濃度 Figure 9 には 清ヘプシジン濃度の変化を した 清ヘプシジン濃度は P7 P14 お よび P24 において Pre と 較して有意な上昇が認められた (p < 0.05) (ng/ml) * * * Pre P7 P14 P24 Figure 9. Changes in serum hepcidin levels before exercise and during post exercise period. The values are means ± SE. Main effect for time: p = 0.025, *; p < 0.05 (vs. Pre) Figure 10 には P24 における 清レプチン濃度と 清ヘプシジン濃度の関係を した 両 者の間には 有意な負の相関関係が認められた Serum hepcidin level (P24) (ng/ml) r=0.58, r = 0.58, p = 0.03 p= (ng/ml) Serum leptin level (P24) Figure 10. Correlation between serum leptin and hepcidin levels. 42

53 (5) 栄養摂取状況 Table 11 には トレーニング前 および当 における栄養摂取状況を した Table 11. Energy, macronutrients and iron intake on measurement day. On the previouse day before exercise On the day of exercise Energy kcal 2177 ± 55 2,153 ± 98 Protein g ± ± 5.1 % Protein % 18.6 ± ± 0.5 Fat g 83.6 ± ± 4.0 % Fat % 34.6 ± ± 1.3 Carbohydrate g ± ± 17.3 % Carbohydrate % 46.8 ± ± 1.7 CHO/BW g/kg 5.3 ± ± 0.4 Iron mg 15.6 ± ± 0.65 The values are means ± SE. 43

54 4. 考察研究課題 3 では 陸上 距離選 の 1 2 回の持久性トレーニングに対する 清ヘプシジン濃度の分泌応答を検討した 本研究から得られた主な知 としては 1 2 回の運動によって 1 回 の運動後から翌朝にかけて 清ヘプシジン濃度の有意な上昇が認められたことが挙げられる さらに トレーニング翌朝の 清ヘプシジン濃度とレプチン濃度との間には 有意な負の相関関係が認められた 7 間連続の持久性トレーニングを いた先 研究では トレーニング終了翌 に安静時における 清ヘプシジン濃度の上昇が認められた (McClung et al. 2013; Sim et al. 2014) 本研究では 清ヘプシジン濃度が 2 回 ( 午後 ) の持久性トレーニング終了 3 時間後に 幅に上昇した 残念ながら 運動前後における 漿 IL-6 濃度の変化を評価することはできなかったが 時間の運動に伴い 格筋での IL-6 の産 が増加し その後に 清ヘプシジンの分泌応答が増加したものと考えられる IOC による糖質摂取のガイドラインでは 本研究で実施したような運動強度 (1 3 時間の中 強度運動 ) では 体重あたり 6 10 g の糖質摂取が推奨されている (Thomas et al. 2016) 本研究の被験者では体重 1 kg あたり約 6 g の炭 化物を摂取していたが 1 2 回のトレーニングにより 清ヘプシジン濃度の 幅な上昇がみられた このことから 1 2 回にわたり 時間のトレーニングを実施するという状況下では 体重当たり約 6 g という炭 化物の摂取量は 分ではなかった可能性が考えられる 本研究では 運動翌 の 清ヘプシジン濃度および 清鉄と 清レプチン濃度に負の相関関係が認められた 健常な成 男 (513 名 ) を対象とした研究では 安静時のレプチンとヘプシジン濃度には負の相関関係が認められた (McClung et al. 2016) また ヘプシジンの産 は絶 に伴い亢進すること (Vecchi et al. 2014) 過性のトレーニング時の負のエネルギー収 バランスは ヘプシジンの分泌増加と関連すること ( Pasiakos et al. 2016) がこれまでに報告されている 本研究で着 したレプチンは主に脂肪組織から産 され 体脂肪と正の相関関係を す (Rosenbaum and Leibel 2014) また エネルギー消費量に対してエネルギー摂取量が低値を す際に その 中濃度は低下する特性を有する (Jürimäe and Jürimäe 2004) ヒトを対象に 事制限を実施した研究では 2 % の体重減少に先 して 中レプチン濃度は 50 % 低下したことが報告されている この際の体重減少の要因としては 体内の貯蔵グリ 44

55 コーゲン量の減少が考えられることから レプチンは 事中の炭 化物の減少に 例して減少する指標としても有効であるものと推察される (Jenkins et al. 1997) 本研究では トレーニングによる実際のエネルギー消費量を算出することはできなかったが 清 ら (2005) が提唱しているエネルギー消費量の推定式を いて算出すると 2,857 ± 36 kcal であった ( 清 ら 2005) トレーニング当 の平均エネルギー摂取量が 2,153 kcal であったことを考慮すると 本研究の被験者ではエネルギー消費量がエネルギー摂取量を慢性的に上回っていた可能性が い このことから トレーニングに伴うヘプシジンの増加を抑 するためにはエネルギー消費量に 合ったエネルギー摂取量を摂取することが重要であるかもしれない ヘプシジンは 内変動を有し その 中濃度は早朝に低下を夜間に 値を す Peeling et al. (2009) は 運動条件と安静条件における尿ヘプシジン濃度の推移を検討したところ 安静条件において尿ヘプシジン濃度は にかけて上昇するという 内変動を した しかし 運動条件では運動 3 時間後にヘプシジンの上昇が有意に亢進し この値は安静条件での同 時刻の尿ヘプシジン濃度を きく上回っていた (Peeling et al. 2009a) 本研究では 安静条件を設定することはできなかったが 1 回 2 回 の運動 3 時間後のヘプシジンはいずれも 幅に増加していたため 内変動の影響が結果に及ぼした可能性は少ないものと考えられる 本研究の限界としては 運動時のエネルギー消費量およびエネルギー摂取量を統 することができなかったことが挙げられる また このようなエネルギー収 バランスにおける個 差がヘプシジンやレプチンの分泌応答に影響した可能性が考えられる 今後は トレーニング時のエネルギー摂取量やエネルギー消費量をコントロールした上で 持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響を検討することが必要であろう 5. 結論 陸上 距離選 における 1 2 回の持久性トレーニングの結果 清ヘプシジン濃度は翌朝まで有意に上昇することが明らかとなった さらに 翌朝の 清ヘプシジン濃度の上昇とレプチン濃度の間には 有意な負の相関関係が認められた 45

56 Ⅳ. 短期間のトレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 : 鉄サプリメント摂取の影響 ( 研究課題 4) 1. 緒 研究課題 3 では 陸上 距離選 を対象に 1 2 回のトレーニングに対するヘプシジンの分泌応答を検討した その結果 清ヘプシジン濃度は 1 回 のトレーニング後から翌朝まで有意に上昇することが認められた また 翌朝の 清ヘプシジン濃度の上昇がレプチン濃度と負の相関関係を したことから エネルギーバランスの変化がヘプシジンの分泌増 に関与している可能性が考えられた このことから 1 に複数回の持久性トレーニングを連 にわたり実施した場合には ヘプシジン濃度の上昇が じる可能性が考えられる 先 研究においても 7 間連続でのトレーニングの結果 安静時の 清ヘプシジン濃度の有意な増加が認められている (McClung et al. 2013; Sim et al. 2014) しかし 持久性スポーツ競技において 般的に取り れられている 1 に複数回の持久性トレーニング を連 にわたり実施した場合のヘプシジンの分泌応答は依然として明らかになっていない 持久性スポーツ競技者においては コンディションの維持や改善をねらいとして鉄サプリメントを利 することが多い (Deugnier et al. 2002; Zotter et al. 2004) 実際に 研究課題 2 では トレーニング量の増加したトレーニング期 ( 鍛錬期 ) においては 被験者のうち 44 % が鉄を含有するサプリメントを利 していた その結果 鉄の摂取量はトレーニング期がオフトレーニング期 ( 準備期 ) に 較して有意に 値を し このこともトレーニング期における 清ヘプシジン濃度の上昇に影響している可能性が考えられる 容量の鉄サプリメントの摂取 ( mg/ ) は 清ヘプシジン濃度を増加させ それに伴い鉄の吸収率は % まで低下する (Moretti et al. 2015) しかしながら 持久性トレーニング期間中の中程度の鉄サプリメントの摂取がヘプシジンの分泌応答を変化させるか否かは不明である そこで研究課題 4 では 3 間連続で実施する 1 2 回の持久性トレーニングが 清ヘプシジン濃度に及ぼす影響を検討した また その際に鉄サプリメント摂取の有無の影響も検 46

57 に基づき 討した ここでは 3 間の持久性トレーニングが 清ヘプシジン濃度を増加させること 持久性トレーニング期間中の鉄サプリメントの摂取は 清ヘプシジン濃度の増加を亢進さ せるという 2 つの仮説を設けた 2. 法 (1) 被験者男 学 持久性競技者 ( 陸上競技 距離選 およびトライアスロン選 )14 名を対象と した { 年齢 :19-22 yrs, :168 ± 1 cm, 体重 :55.9 ± 1.1kg, 最 酸素摂取量 (AEVE AOR2maxR):59.6 ± 0.8mL/kg/ 分 } 実験に参加したすべての被験者は健康であり 週 4 以上定期的にトレーニングを実施していた すべての対象者に対し 研究の 的 測定内容および参加に伴う危険性について 分に説明し 書 にて協 への同意が得られた者のみを対象とした なお 本研究は 命館 学に帰属する倫理委員会の承認を得て実施した (BKC-IRB ) (2) 実験デザイン 14 名の被験者を鉄サプリメント群 (Fe 群 ; n = 7) またはプラセボ群 (CON 群 ; n = 7) のい ずれかに分類した なお 各群への分類は事前に測定をした AEVE 群において AEVE AOR2maxR の平均値が同様になるように配慮した AOR2max R Fe 群と CON 各群における被験者は 事前に測定した AEVE AOR2maxRの 75 % に相当する 速度で 75 分間のラ ンニングを 1 2 回 (150 分 ) 3 間連続で実施した この際 Fe 群では 1 回 のトレーニング前およびトレーニング直後に鉄のサプリメント (12 mg/ 回, ピロリン酸鉄 ) を溶かしたドリンク (100 ml) を摂取した (1 あたり 24 mg)(rietjens et al. 2002) CON 群では 味付きのドリンク (100 ml) を摂取した 提供されたドリンクの種類は 被験者に開 しなかった ( シングルブラインド プラセボ対照試験 ) トレーニング期間(1 3 ) およびトレーニング終了翌 (4 ) の早朝空腹時に前腕静脈から採 を実施した なお 各条件のトレーニング 1 の 2 回 の運動 3 時間後においても採 を実施した すべての被験者は 1 4 の 8:00 に研究室に集合し 安静後に体組成の計測 採 および Visual analog scale(vas) を いた主観的疲労度および筋痛の評価を った トレ 47

58 AEVE ーニング時の飲み物は のみとし 飲 量やタイミングは被験者の 由とした また 3 間のトレーニング期間中の 事は規定 とし 各 の 11:00 13:30 および 19:00 に提供し た トレーニングの内容 1 2 回の持久性トレーニングとして 午前 (Ex 1; 8:30 10:45) および午後 (Ex 2; 13: 00 14:15) に 75 %AEVE AOR2maxRに相当する 速度で 75 分間のランニングを実施した 運動時 は 連続的に 拍数を測定した 連 のトレーニングによる疲労の蓄積が原因で規定の 速度に追随できなかった場合には 速度を低下させ トレーニングを継続させた 規定 の設定 事からの鉄などの栄養素の摂取量を統 させるため 3 間のトレーニング時の 事は規定 を提供した トレーニング期間中は毎朝体重を測定し トレーニング開始 より体重が 2 kg 以上の増減がないように調整した (3) 測定項 速度の決定 3 間のトレーニング開始の約 2 週間前に 多段階漸増負荷法により AEVE AOR2maxR を評価した AOR2maxR の測定には トレッドミル (Life Fitness 95T, Chicago IL, USA) を使 した 最初のス テージの 速度は時速 6 km とし 毎分時速 2 km ずつ増加させた 速度が時速 14.6 km に達してからは 毎分時速 0.6 km ずつ増加させた トレッドミルの勾配は 0 % であった 運動中は 呼気ガスパラメータおよび 拍数を連続的に測定した 呼気ガスパラメータの測定には 代謝分析測定機 (AE300S ミナト医科学株式会社 阪) を いて breath-by-breath 法により評価した 得られたデータからは 30 秒毎の平均値を算出した 運動測定開始前には 既知の酸素濃度および 酸化炭素濃度の混合ガス ( 千穂化学 業株式会社 東京 ) を いて 酸素および 酸化濃度計の校正を った また 流量 ( 換気量 ) を計測するためのトランスデューサーの校正は 2 L の専 シリンジを いて った 得られたデータから 48

59 75 %AEVE AOR2maxR に相当する 速度を算出した 液指標実験期間中 (1 4 ) の安静時およびトレーニング 1 の Ex 2 の 3 時間後に採 を実施した 得られた 液から 末梢 液検査の 般項 として 中ヘモグロビン (Hb) 濃度を測定した 末梢 液検査は 臨床検査会社に委託をした ( 株式会社ファルコバイオシステムズ 京都 ) それ以外の 液は rpm で 10 分間遠 分離し 清および 漿を得た 得られた 清および 漿は解析までの間 -80 の超低温冷凍庫で保存した 清からは フェリチン 鉄 TIBC および CK 感度 C 反応性たんぱく質 (hscrp) およびミオグロビンを測定した ( 株式会社 SRL 東京) トランスフェリン飽和度(TSAT) は 清鉄濃度 / 清 TIBC 濃度 100 として計算した 漿 IL-6 濃度は 市販のキット (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) を いた ELISA 法によって解析した ELISA 法を いた解析では 全てのサンプルを 2 回分析し その平均値を算出した 清ヘプシジン濃度の測定には 液体クロマトグラフィー質量分析法 {Liquid chromatography (LC)-mass spectrometry (MS)/MS} を いた 液解析に伴う CV 値は 0.6 % (Hb) 3.8 %( フェリチン ) 1.4 %( 鉄 ) 1.6%(TIBC) 2.3 %(CK) 3.2 %(hscrp) 3.4 %( ミオグロビン ) 5.2 %(IL-6) であった 主観的疲労度および筋痛主観的疲労度および筋 痛は VAS を いて評価した VAS の 評価スコアは 100 mm の線分とし 左端 (0) には 全く疲れていない 右端 (100) には とても疲れている 状態と表記し 測定時の主観に応じて線上に印を記 させた 筋痛は 左端には 全く痛みがない 右端には とても痛い と教 し 疲労度と同様に記 させた (McCormack et al. 1988) 49

60 (4) 統計解析検定したすべての測定値は 平均値 ± 標準誤差 (Means ± SE) で した 群間における各変数の平均値の差の検定には 反復測定による 元配置の分散分析 (two-way ANOVA) を い 交互作 および主効果の有無を検定した { 群 (Fe 群, CON 群 ) 期間 (1 4 )} 元配置の分散分析においては Mauchly の球 性の検定を い 球 性が仮定できなかったときには Greenhouse-Geisser のイプシロンを いて 由度を修正した ANOVA により交互作 および主効果が認められた場合は Tukey 法により多重 較検定を った また p 値に加えて Cohen の d 値 ( 独 した t 検定 ) または偏イータ 2 乗 (two-way ANOVA) により 効果量 (Effect Size; ES) を算出した 統計解析には SPSS software ver (International Business Machines Co., USA) を いて 有意 準は危険率 5 % 未満に設定した 3. 結果 (1) 距離および 拍数 Table 12 には トレーニング時の 距離および平均 拍数を した いずれの項 にお いても 群間に有意差はみられなかった 3 間のトレーニング ( 合計 6 回のトレーニン グ ) における総 距離は Fe 群では ± 2.6 km CON 群では 98.0 ± 3.3 km であり 群 間で有意差はみられなかった (p > 0.05) Table 12. Running distances and HR during training period. Group Day 1 Day 2 Day 3 Running distance Fe 34.5 ± ± ± 0.9 (km) CON 33.3 ± ± ± 0.7 Heart rate (bpm) Ex1 Fe 158 ± ± ± 3 CON 156 ± ± ± 2 Ex2 Fe 158 ± ± ± 4 CON 159 ± ± ± 3 Value are means ± SE. 50

61 (2) 液指標鉄関連指標 1 の 中 Hb 濃度には 群間で有意差はみられなかった (Fe 群 :15.4 ± 0.3g / dl CON 群 :15.4 ± 0.5g / dl p > 0.05) Table 13には 清フェリチン 鉄濃度および TSAT の 1 から 4 までの変化を した 清フェリチン 鉄濃度および TSAT には 有意な交互作 および群の主効果は されず 時間の有意な主効果のみが認められた Table 13. Serum ferritin, iron levels, TSAT during Days 1-4. Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Ferritin Fe 47.9 ± ± ± ± 10.0 (ng/ml) CON 38.0 ± ± ± ± 11.1 Iron Fe 89.1 ± ± ± ± 13.5 (µg/dl) CON 73.3 ± ± ± ± 7.5 TSAT Fe 31.4 ± ± ± ± 6.0 (%) CON 24.4 ± ± ± ± 3.7 The values are means ± SE. Serum ferritin; Interaction (group time) : p = (ES = 0.005), Main effect for group : p = (ES = 0.05), Main effect for time: p = (ES = 0.47), Serum iron: Interaction (group time): p = (ES = 0.19), Main effect for group (p = 0.321, ES = 0.08), Main effect for time: p = (ES = 0.36), Serum TSAT: Interaction: p = (ES = 0.19), Main effect for group : p = (ES = 0.02), Main effect for time: p = (ES = 0.38) 51

62 筋損傷および炎症関連指標 Figure 11 には 清ミオグロビン CK および hscrp 濃度の 1 から 4 までの変化を した 清ミオグロビン濃度の変化には 有意な交互作 および群の主効果はみられず 時間の有意な主効果のみが認められた 清 CK および hscrp 濃度の変化には 交互作 時間および群に対する有意な主効果はみられなかった Figure 12 には 漿 IL-6 濃度の変化を した 1 の運動前後での 漿 IL-6 濃度の変化には 時間の主効果が認められ 両群ともに有意な増加を した 1 から 4 までの変化には 有意な交互作 および群の主効果は されず 時間の有意な主効果のみが認められた (A) Serum myoglobin (ng/ml) * * Fe group Training period CON group 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day4 Interaction (group time) : p = (ES = 0.01) Main effect for condition : p = (ES =0.05) Main effect for time : p = (ES = 0.38) (C) Serum hscrp (mg/dl) * * (B) Serum CK (IU) Training period Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 * * Training period Day 1 Day2 Day3 Day 4 Interaction (group time) : p = (ES = 0.01) Main effect for condition : p = (ES = 0.02) Main effect for time : p < (ES = 0.33) Fe group CON group Interaction (group time) : p = (ES = 0.03) Main effect for condition : p = (ES = 0.06) Main effect for time : p = (ES = 0.26) * * Fe group CON group Figure 11. Serum myoglobin (A), CK (B) and hscrp (C) levels during Days 1-4. Value are means ± SE. *; Significant difference from Day1. 52

63 (A) (B) Plasma IL-6 (pg/ml) before exercise day1 3 h after exercise on Day 1 * * Fe group CON group Interaction (group time) : p = (ES = 0.030) Main effect for group : p = (ES < 0.001) Main effect for time : p = (ES = 0.638) * Significantly difference from resting on day1. Plasma IL-6 (pg/ml) Training period Fe group CON group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Interaction (group time) : p = (ES = 0.054) Main effect for group : p =0.148 (ES =0.166) Main effect for time : p = (ES = 0.284) * Significantly difference from day1. Figure 12. Plasma IL-6 levels before and after exercise on Day1(A) and resting levels during Days 1-4(B). Value are means ± SE. *; Significant difference from resting on Day1. 53

64 清ヘプシジン濃度 Figure 13 には 清ヘプシジン濃度の変化を した 1 の運動前後の 清ヘプシジン濃度の変化には 有意な交互作 時間および群の主効果が され Fe 群においてのみ運動前後で有意な増加がみられた また 1 から 4 までの安静時の変化においても 有意な交互作 時間および群に対する主効果が認められ Fe 群では 1 と 較して 4 で有意な増加を した また 4 の時点で Fe 群が CON 群に 較して有意に 値を した (A) (B) Serum Hepcidin (ng/ml) Fe group CON group a * * 3 h after exercise on Day 1 Interaction (group time) : p = (ES = 0.311) Main effect for group : p = (ES = 0.75) Main effect for time : p = (ES = 0.603) Serum Hepcidin (ng/ml) Fe group CON group Training period * Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Interaction (group time) : p = (ES = 0.230) Main effect for group : p = (ES = 0.90) Main effect for time : p = (ES = 0.414) Figure 13. Serum hepcidin levels before and after exercise on Day1(A), and resting levels on Days 1-4(B). Value are means ± SE. *; Significant difference from resting on Day 1.P P; Significant differentce between group. 54

65 (3) 疲労度と筋痛 Table 14 には 疲労度および筋痛から 1 4 までの変化を した 疲労度および筋痛の変化には 有意な交互作 および群の主効果は されず 時間の有意な主効果が認められた Table 14. Score of fatigue and muscle soreness during training period. Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Fatigue Fe 25 ± 7 30 ± 7 41 ± 10* 42 ± 6* (mm) CON 26 ± 4 39 ± 9* 43 ± 7* 42 ± 7* Muscle Soreness Fe 16 ± 5 36 ± 6* 57 ± 9* 55 ± 7* (mm) CON 23 ± 4 43 ± 9* 59 ± 5* 53 ± 7* Fatigue; Interaction (group time): p = (ES = 0.02), Main effect for condition: p = (ES = 0.01), Main effect for time: p = (ES = 0.61). Muscle soreness; interaction (group time): p = 0.881(ES = 0.02), Main effect for group: p = (ES = 0.04), Main effect for time: p < (ES = 0.55) *; Significant difference from resting on Day 1. 55

66 P (4) トレーニング期間中の栄養摂取状 Table 15 には トレーニング期間中の平均 事摂取量を した トレーニング期間中のエネルギー 炭 化物 たんぱく質および脂質の摂取量には 群間での有意差はみられなかった 3 間の平均炭 化物摂取量は 7.0 ± 0.2 g/kg(fe 群 ) および 6.9 ± 0.3 g/kg(con 群 ) であった トレーニング期間中の鉄サプリメント摂取により Fe 群は CON 群と 較して 鉄の摂取量が有意に 値を した (p <0.001, ES = 2,400) Table 15. Total energy and macronutrients intakes during training period. Group Day 1 Day 2 Day 3 Total energy Fe ± ± ± 136 (KJ) CON ± ± ± 71 CHO Fe ± ± ± 6.8 (g) CON ± ± ± 3.7 Protein Fe 87.0 ± ± ± 1.4 (g) CON 86.8 ± ± ± 0.2 Fat Fe 65.2 ± ± ± 0.04 (g) CON 65.2 ± ± ± 0.04 Iron Fe 30.5 ± 0.01P 30.5 ± 0.01P 30.5 ± 0.01P (mg) CON 6.5 ± ± ± 0.01 Value are means ± SE. P; Significant difference between groups. 56

67 4. 考察研究課題 4 では 3 間の連続した持久性トレーニング期間中における鉄サプリメントの摂取が 清ヘプシジン濃度に及ぼす影響を検討した 本研究から得られた主な知 としては 1 2 回 3 間連続での持久性トレーニングは 安静時の 清ヘプシジン濃度に影響を及ぼさなかったこと トレーニング期間中における中程度の鉄サプリメントの摂取 (24 mg / ) は 清ヘプシジン濃度を有意に上昇させたことが挙げられる 仮説とは対照的に CON 群では 1 4 にかけて安静時のヘプシジン濃度に有意な変化は認められなかった これまでに 過性の持久性運動後に 清ヘプシジン濃度の上昇することは報告されているが 連 にわたり持久性トレーニングを繰り返した際の安静時のヘプシジンの分泌応答への影響は 分に検討されていない Sim et al.(2014) は 7 間連続でのトレーニングが安静時の尿ヘプシジン濃度を有意に増加させたことを報告した (Sim et al. 2014) また McClung et al.(2013) は 7 間連続での冬季トレーニング (4 間の軍事トレーニング 3 間のクロスカントリースキー ) が安静時の 清ヘプシジン濃度を有意に上昇させたことを認めている (McClung et al. 2013) さらに トレーニング強度の増加およびトレーニング期間の延 は スポーツ競技者における 清ヘプシジン濃度を上昇させた (Ziemann et al. 2013; Diaz et al. 2015) これらの報告とは対照的に 8 週間の持久性トレーニングが ヘプシジン濃度には影響しなかった例もみられる 同様に 性兵 を対象とした 9 週間の軍事トレーニングの結果 ヘプシジン濃度に影響がみられなかった (Karl et al. 2010) 上述の研究で使 されたトレーニング内容や対象者は研究間で異なるため明確な結論を導き出すことは難しいが 本研究では 3 間連続での 1 2 回のトレーニングは 安静時の 清ヘプシジン濃度に きく影響しないことが された 運動に伴う 中 IL-6 濃度の上昇は ヘプシジンの産 を刺激することが 唆されている (Nemeth et al. 2004a) 本研究では運動直後に 中 IL-6 濃度を測定しなかったが これまでの研究において持久性運動によって IL-6 が上昇することは多数報告されている (Pedersen et al. 2001; Nieman et al. 2014) また 持久性運動直後の IL-6 の上昇に続いて ヘプシジン濃度は運動後約 3 時間で最 値を す (Peeling et al. 2009a, 2014) 本研究においても 1 の 2 回 のトレーニング 3 時間後に 清ヘプシジン濃度の有意な増加が認められた なお 運動に 57

68 伴う IL-6 濃度の上昇は初期の炎症反応の亢進を反映する 筋損傷や炎症はヘプシジン濃度を上昇させることが 唆されているため (Zhang and Enns 2009) 筋損傷の間接指標である 清ミオグロビンおよび CK 濃度の変化についても検討した その結果 清ミオグロビンおよび CK 濃度は 両群ともに 2 および 3 に有意に上昇したが 群間で有意差はみられなかった さらに 清ミオグロビン濃度は 2 に 清 CK 濃度は 3 にそれぞれ最 値を したが 4 には減少する傾向がみられた したがって 本研究では筋損傷や炎症の亢進した期間は 較的短く このことが CON 群でヘプシジン濃度に変化がみられなかった 因とも考えられる 運動によるヘプシジンの産 はエネルギー収 の影響を受けることが 唆されている 負のエネルギーバランスや筋グリコーゲン量が枯渇した ( または減少した ) 状態での運動は IL-6 産 の増加を介してヘプシジン濃度を増加させる可能性が指摘されている このことから 炭 化物摂取量の増加には ヘプシジンの上昇を抑 する効果が期待されているが これまでの研究では 致した 解は得られていない (Sim et al. 2012; Badenhorst et al. 2015a,b, 2016) 本研究では 3 間のトレーニング期間中は規定 を準備し 炭 化物の摂取量は体重あたり約 7 g / であった しかし トレーニング期間中は 1 2 回 (1 あたり 150 分 ) のランニング運動を実施したことを考慮すると 両群ともにトレーニングによるエネルギー消費量に対してエネルギー摂取量は同様に不 していたものと推察される したがって Fe 群で認められた 3 間のトレーニング期間終了翌朝 (4 ) におけるヘプシジン濃度の上昇には 負のエネルギーバランスが直接的な要因であったとは考えにくい 本研究では トレーニング期間中の鉄サプリメントの摂取が 清ヘプシジン濃度に及ぼす影響についても検討した そのため Fe 群では 3 間連続でのトレーニング期間中に 中程度の鉄サプリメント (24 mg/ ) を摂取した 鉄サプリメントの吸収率は 物の有無にかかわらず 2.3 % 8.5 % の範囲であり (Asobayire et al. 2001) 少量の鉄のみが吸収される 鉄は 体内での酸化ストレスの産 を亢進させるため 容量の鉄サプリメントの摂取は毒性を有する可能性がある また鉄サプリメントの摂取 体が ヘプシジン濃度を増加させるものと考えられる (Papanikolaou et al. 2005) これまでにも 性に対する 量の鉄 (> 40 mg) が 清ヘプシジン濃度を増加させること (Moretti et al. 2015) 3 週間にわたる中程度の鉄 58

69 サプリメント摂取が 体内での酸化作 を促進し 炎症を亢進させることが されている (Deli et al. 2017) 詳細なメカニズムは依然として不明であるが 本研究の結果は短期間の持久性トレーニングと中程度の鉄サプリメントの併 は ヘプシジン濃度の上昇を助 する可能性があることを 唆している 5. 結論 3 間連続での持久性トレーニングの結果 安静時の 清ヘプシジン濃度は変化しなかった で トレーニング期間中に中程度の鉄サプリメント (24 mg/ ) を摂取した場合には トレーニング期間終了翌 に 清ヘプシジン濃度の有意な上昇が認められた 59

70 Ⅶ. 短期間の持久性トレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響 : Energy availability の相違の影響 ( 研究課題 5) 1. 緒 研究課題 4 では 短期間の持久性トレーニング期間中における中程度の鉄サプリメントの摂取は安静時における 清ヘプシジン濃度を増加させることが明らかとなった このことは 持久性トレーニング期間中の鉄サプリメント摂取は 鉄 乏の予防に必ずしも適切でない可能性を すものと考えられる 2015 年に Relative energy deficient in sports (RED-S) の概念が提唱されて スポーツ競技者における相対的エネルギー不 でのトレーニングはコンディショニングやパフォーマンスに悪影響を及ぼすことが された (Mountjoy et al. 2015) 動物実験を いた近年の報告によると ヘプシジンの産 は絶 に伴い亢進する (Vecchi et al. 2014) さらにヒトを対象とした研究では 過性の持久性トレーニング時の負のエネルギー収 バランスは ヘプシジンの分泌増 と関連することが されている (Pasiakos et al. 2016) さらに 研究課題 3 では 翌朝の 清ヘプシジン濃度の上昇がレプチン濃度と負の相関関係を したことから エネルギーバランスの変化がヘプシジンの分泌増 に関与しているものと推察される 筋グリコーゲン量が低下した状態での運動では IL-6 の産 が亢進する (Pedersen et al. 2001) したがって LEA ( 利 可能なエネルギー量の低下した状態 ) でのトレーニングは 利 可能なエネルギー量が通常状態でのトレーニングと 較してヘプシジンの分泌を亢進させる可能性が い で 連 実施する持久性トレーニング時におけるエネルギーバランスの違いがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響は明らかにされていない そのためには 持久性トレーニング期間中におけるエネルギー消費量およびエネルギー摂取量を管理した上で 異なるエネルギーバランスでトレーニングを実施する際のヘプシジンの分泌応答を 較することが有 であると考えられる そこで 本研究では異なる EA での 3 間連続した持久性トレーニングが筋グリコーゲン量およびヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響を検討することを 的とした ここでは LEA 状態でのトレーニングは筋グリコーゲン量 60

71 を減少させ ヘプシジンの分泌を亢進させるという仮説を設けた 2. 法 (1) 被験者男 陸上 距離選 7 名を対象とした { 年齢 :19.8 ± 0.4 yrs, :1.75 ± 0.02 m, 体重 : 61.4 ± 2.0 kg, 最 酸素摂取量 (AEVE AOR2maxR):67.5 ± 1.63mL/kg/min} 実験に参加したすべての被 験者は健康であり 週 6 以上定期的にトレーニングを実施していた (4 時間 / ) すべての被験者に対し 研究の 的 測定内容および参加に伴う危険性について 分に説明し 書 にて協 への同意が得られた者のみを対象とした なお 本研究は 国 スポーツ科学センターに帰属する倫理委員会の承認を得て実施した (IRB ) (2) 実験デザイン 被験者は 事前に測定した AEVE AO₂RmaxRの 70 % に相当する 速度での 75 分間のランニング運 動を 3 間連続で実施した EA は エネルギー摂取量 (Energy Intake ; EI) からエネルギー消費量 (Energy Expenditure ; EE) を引いたものを除脂肪体重 (Lean Body Mass ; LBM) で除すことにより算出した {EA (kcal/kg LBM) = (EI EE)/LBM} その際 エネルギー消費量に対して エネルギー摂取量を 分に確保した Neutral Energy Availability (NEA) 条件および EA が低い LEA 条件の 2 条件を設け 両条件をランダムに実施した 条件間には 約 2 週間を設けた トレーニング開始 1 (Day 1) 2 (Day 2) 3 (Day 3) 4 (Day 4 トレーニング終了翌 ) の早朝空腹時に採 および筋グリコーゲン量の測定を実施した さらに トレーニング後におけるヘプシジンの 過性の分泌応答を評価するために各条件のトレーニング 3 の運動直後 (Day 3 Post 0 h) 3 時間後 (Day 3 Post 3 h) に採 を実施した また 早朝空腹時およびトレーニングの前後において Visual analog scale (VAS) を いて 疲労および筋痛の程度を評価した (Fig. 14) すべての被験者は 1 4 の 8:00 に研究室に集合し 安静後に体組成の計測 採 および VAS を いた主観的疲労度および筋痛の評価を った トレーニング時の飲み物 61

72 は のみとし 飲 量は 1 条件 のトレーニング時に計量し 2 条件 では 1 条件 とでき る限り同量を飲むように指 した 飲 のタイミングは 被験者の 由とした Figure 14. Experimental design during training period. トレーニングの内容 持久性トレーニングとして 70 %AEVE AOR2maxRに相当する 速度で 75 分間のランニングを実 施した 運動時は 連続的に 拍数 (RCX5 ポラール エレクトロ ジャパン株式会社) を測定した 連 のトレーニングによる疲労の蓄積が原因で規定の 速度に追随できなかった場合には 速度を低下させトレーニングを継続させた 規定 の設定 IOC は EA が 45 kcal/kg FFM 以上であれば 運動後によるエネルギー消費量とエネルギー摂取量のバランスがとれ 体重の維持ができるとしている EA が 30kcal/kg FFM を下回った際 代謝に関連する内分泌動態に影響がみられ 性では 経異常を誘発する可能性があるとされている (Mountjoy et al. 2014) これらを踏まえ 本研究では 先 研究を参考に NEA 条件では EA を 45 kcal/kg FFM 以上 LEA 条件では EA を 20 kcal/kg FFM 以下に設 62