SALIVARNI KORTIZOL KAO SAVREMENI BIOMARKER

Transcription

1 EVROPSKI UNIVERZITET FARMACEUTSKI FAKULTET SALIVARNI KORTIZOL KAO SAVREMENI BIOMARKER -DIPLOMSKI RAD- Kandidat: Milka Popović Mentor: prof. dr Mirka Ilić Novi Sad, 2014.

2 Biografija kandidata Dr Milka Popovic (rođ. Obrenović) rođena je u Beogradu. Osnovnu i srednju školu završila je u Londonu, Velikoj Britaniji. Diplomirala je medicinsku biohemiju 1997 godine na Kraljevskom Koleđžu (King s College) na Univerzitetu u Londonu. Doktorske studije je takođe završila na Univerzitetu u Londonu gde je po završetku bila najmlađi doktor medicinskih nauka. Za vreme doktorskih studija radila je kao asistent na predmetu farmakologiji na prvoj godini fakulteta School of Pharmacy UCL. Nakon doktorskih studija 2001, Milka Popović je nastavila da se bavi naučnim istraživanjem u oblasti niozomalnih i lipozomalnih DNK vakcina. Objavila je više stručnih radova i učestvovala u inovaciji nove generacije vakcina, radeći za farmaceutsku kompaniju Lipoxen LTD u Londonu. Sertifikat za primenu funkcionalne medicine u kliničkoj praksi je stekla u Tampi, Floridi nakon čega se našla na svetskoj listi prakticionista funkcionalne medicine Instituta za Funkcionalnu Medicinu. Post diplomske studije iz nutricionalne terapije (Nutritional Therapy) je završila u CNELM, Univerzitetu Midlseks u Engleskoj. Zbog velike ljubavi prema medicinskoj biohemiji i želje da dobije licencu u Srbiji, u janurau 2013 upisala je Evropski Univerzitet-Farmaceutski Fakultet, Novi Sad, integrisane akademske studije farmacije-medicinska biohemija.

3 Zahvalnica Zahvaljujem se svima koji su mi bezrezervno pomogli tokom izrade ovog diplomskog rada, a posebno svom mentoru Prof. Dr. Mirki Ilić za svu podršku. Takođe sam zahvalna ass. Mr ph Biljani Glišić, kao i članovima komisije koji su učestvovali u korekcijama finalnog rada. Najiskrenije sam zahvalna mojoj porodici na podršci i strpljenju koju su mi pružili tokom studiranja.

4 SADRŽAJ 1.UVOD KORTIZOL Uloga kortizola Sinteza kortizola Metabolizam kortizola Faktori koji utiču na metabolizam kortizola Bolest jetre Bubrežne bolesti Bolesti tiroidne žlezde Stres Starost Hipotalmusno-hipofizno-adrenalna osa (HPA osa) Mehanizam povratne sprege HPA ose Cirkadijalni ritam kortizola Fiziološki uticaj na koncentracije kortizola ODREĐIVANJE KORTIZOLA Biološki materijali Krv Urin Saliva SALIVARNI KORTIZOL Uzorkovanje i rukovanje uzorcima Analitičke metode Metode hromatografije Imunoodređivanje Referentne vredosti Kušingov sindrom...17

5 4.2 Kongenitalna adrenalna hiperplazija Adrenalna insuficijencija Praćenje supstitucione terapije hidrokortizonom Salivarni kortizol i njegove aplikacije u istraživanjima ODREĐIVANJE SALIVARNOG KORTIZOLA KOD PRIPADNIKA SPECIJALNE ANTITERORISTIČKE JEDINICE (SAJ) -PILOT STUDIJA Značaj programa i ciljevi projekta Salivarni kortizol kao marker stresa u istraživanju Cilj projekta Metodologija rada Rezultati DISKUSIJA I ZAKLJUČAK...26 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA...33

6 1.UVOD Biomarkeri su proizvodi organizma koji se mogu koristiti kao indikatori zdravlja ili bolesti; oni ukazuju na normalni biološki ili patološki proces u organizmu. Zato poslednjih godina postoji sve veće interesovanje za istraživanja biomarkera, u cilju detekcije i praćenja bolesti. Prema nedavnimi istraživanjima, broj kliničkih ispitivanja u kojima su korišćeni biomarkeri u poslednje četiri godine se povećao 10 puta. Razlog ovakavog trenda je pojava složenih bolesti koje se još uvek i pored intenzivnih napora istraživača nedovoljno brzo dijagnostikuju ili leče. Da bi biomarker bio uspešano primenjen mora da ima relativno visoku koncentraciju u odgovarajućem tkivu, a zanemarljivu u drugim tkivima. Treba da je pogodno subcelularno raspodeljen, kako bi se nakon oštećenja tkiva brzo našao u cirkulaciji. U cirkulaciji je potrebno da se zadržava dovoljno dugo kako bi mogla da se prati njegova koncentracija. Takođe je potrebno da se može odrediti pomoću pogodne i osetljive analitičke metode, primenljive i na automatskim analizatorima (1). 1.1 KORTIZOL Kortizol (ili hidrokortizon) je steroidni hormon kore nadbubrežne žlezde. Nadbubrežne ili adrenalne žlezde su smeštene u retroperitonealnom prostoru iznad bubrega svaka od njih sastoji se od dva odvojena, funkcionalno različita dela. Spoljašni deo ili kora čini do 90% žlezde i izvor je steroidnih hormona (Sl. 1). Preostali unutrašnji deo, ili medula deluje endokrino, tj. izlučuje kateholamine direktno u krv. Kora adrenalne žlezde luči tri glavne klase steroidnih hormona koji imaju razne fiziološke funkcije: glukokortikoide, mineralokortikoide i adrenalne androgene hormone. Kortikosteroidi su fiziološki i kvantitativno najznačajnija grupa adrenalnih steroida. Kortizol je glavni glukokortikoid. Izlučuju ga adrenalne žlezde i to prosečno 25 mg/dnevno. Najveći deo kortizola je u krvi (90%) i cirkuliše vezan za transkortin ili kortikosteroid vezujući globulin (CBG), oko 7% je vezan za albumin, a preostali deo je slobodan i biološki aktivan. 1 Strana

7 Slika 1. Hemijska struktura kortizola 1.2 Uloga kortizola Glukokortikoidi imaju mnogobrojne fiziološke funkcije a posebno su značajni u adaptaciji organizma na stres. Kortizol ima značajnu ulogu u procesu upale, učestvuje u regulisanju metabolizma ugljenih hidrata, masti i proteina, u različitoj meri deluje na brojne sisteme organa u telu čoveka. Među važnim ulogama kortizola ubrajaju se: odlaganje glikogena u jetri, održavanje glukoneogeneze, delovanje na metabolizam koštanog tkiva, učešće u hematopoezi i misićnoj aktivnosti, kao i u funkciji imunološkog sistema. Danas je poznato da svakodnevni problemi izazivaju stress, zbog čega nadbubrežne žlezde luče još više kortizola, moćnog hormona stresa, koji je uzrok hroničnog umora, gojaznosti, depresije, oslabljenog pamćenja i srčanih bolesti. Svaki stres, bilo da je fizički, emotivan ili mentalni, zahteva od organizma prilagođavanje koje omogućava delovanje hormona. Lučenje kortizola pokazuje cirkadijalni ritam, a karakteriše ga nagli porast koncentracija rano ujutru, postepeni pad do kasne večeri. Stres dovodi do povećanja nivoa kortizola, čije koncentracije ostaju povišene sve dok se uzrok stresa ne eliminiše. Glavna uloga kortizola je da pomogne organizmu pod stresom da se adaptira na izmenjene uslove koordiniranim odgovorom većeg broja organa. Kortizol ima veliki efekat na metabolizam ugljenih hidrata, proteina i masti. Uticaj kortizola na metabolizam ugljenih hidrata uključuje ulogu u glukoneogenezi preko aktivacije ključnih enzima u njegovom metaboličkom putu, (fosfoenolpiruvat karboksikinaze i glukoza-6-fosfataze), povećanog skladištenja glikogena jetre (kroz aktivaciju glikogen sintaze i inhibicije glikogen fosforilaze), i smanjenog korišćenja glukoze i preuzimanja od strane perifernih tkiva kao što su mišićno i masno tkivo. 2 Strana

8 Slika 2. Uticaj aktivnosti kortizola na organizam Kortizol takođe utiče na metabolizam masti tako što aktivira lipolizu i oslobađanje slobodnih masnih kiselina u cirkulaciju (Sl. 2). Kada je kortizol prisutan u prevelikoj količini on utiče na centralnu distribuciju masti u predelu lica, vrata i trbuha. Kortizol takođe može da stimuliše diferencijaciju adipocita i promoviše lipogenezu kroz aktivaciju enzima lipoprotein lipaze i pojačane sinteze leptina. Uloga kortizola se najčešće ispituje u dve glavne oblasti: metabolizam i zapaljenski procesiinflamacija. Povišen kortizol povećava snabdevanje energijom i kiseonikom što se prevodi u 3 Strana

9 privremen rast krvnog pritiska, glukoze u krvi, i slobodnih masnih kiselina. Preduga izloženost kortizolu ili disregulacija ovog hormona može dovesti do metaboličkih abnormalnosti (2). Anti-inflamatorne osobine kortizola su dobro poznate i navele su na širok spektar kliničke upotrebe ekzogenog kortizola (hidrokortizon). Međutim, uloga endogenog kortizola je mnogo kompleksnija od regulacije metabolizma i inflamacije. Neke studije ukazuju na to da kortizol može da modulira ekspresiju 10% gena u ljudskom organizmu (3). Kortizol deluje na intracelularne nuklearne receptore koji se nalaze na većini ćelija. Na ovaj način kortizol reguliše transkripciju targetovanih ćelija (4). Nasuprot hormonima stresa kao što su adrenalin i noradrenalin, koji naglo ulaze u cirkulaciju nakon izlaganja stresu, lučenje kortizola je generalno sporije i dostiže visoke koncentracije (pik) tek 20 do 30 minuta kasnije (3). Glukokortikoidi, od kojih je najznačajniji kortizol, sekretuje se kao odgovor na adrenokortikotropni hormon (ACTH), a koji luči hipofiza kao odgovor na hipotalamusni i kortikotropini-oslobađajući hormon (CRH). Kortizol na oslobađanje ACTH deluje mehanizmom negativne povratne sprege. 1.3 Sinteza kortizola Kortizol se sintetiše iz pregnenolona preko dva sintetska puta u zoni fascikulati i zoni retikularis adrenalnih žlezda. Enzim 17-α-hidroksilaza i enzimski kompleks Δ 5-3β-hidroksisteroid dehidrogenaza i Δ 5 -ketosteroid izomeraza, koji se nalazi u endoplazmom retikulumu, sintetišu 17- α-hidroksiprogesteron. Hidroksilacijom ove substance enzimom 21-hidroksilazom na poziciji 21α, formira se 11-deoksikortizol koji se zatim konvertuje u kortizol, pod dejstvom enzima 11βhidroksilaze u mitohondrijama (Sl. 3). 4 Strana

10 Slika 3. Sinteza kortizola 1.4 Metabolizam kortizola Razumevanje metabolizma kortizola je važno zbog interpretacije testova koji su dizajnirani za evaluaciju promena u stvaranju kortizola i poremećaja adrenalne funkcije (5). Manje od 2% koritzola se izlučuje nepromenjen u urinu. Kao rezultat jake veze sa CBG, kortizol se metaboliše sporo (t ½ =100 minuta). U jetri, metabolizam kortizola uključuje redukciju nezasićene veze između C4 i C5 od strane Δ4-5β ili Δ4-5α-reduktaza koje formiraju dihidrokortizol ili dihidrokortizon koji se dalje metabolišu do kortoične kiseline, kortola i kortolona. Preko 95% metabolita korizola i korizona su konjugovani u jetri procesom glukuronizacije. 5 Strana

11 1.4.1 Faktori koji utiču na metabolizam kortizola Bolesti jetre, bubrega i tiroidne žlezde mogu uticati na lučenje i metabolizam adrenalnih steroida. Drugi faktori koji mogu da utiču na ove procese jesu stres, starost, estrogena terapija, ishrana i lekovi Bolest jetre Hronične bolesti jetre smanjuju metabolizam kortizola i proizvodnju urinarnih metabolita. Koncentracije kortizola su povišene kod akutne upotrebe alkohola. Osobe sa alkoholnom cirozom imaju normalne ili povišene koncentracije bazalnog kortizola, snižen cirkadijalni ritam i produženo vreme metabolisanja. Takođe, bolesti jetre mogu da prouzrokuju endogeni hiperkortizam i senzitivnost prema oralnim kortikosteroidima Bubrežne bolesti Pacijenti sa hroničnim bubrežnim oštećenjima uglavnom imaju normalne koncentracije ukupnog ili slobodnog kortizola i ACTH. Zbog smanjene renalne ekskrecije, koncentracije konjugovanih metabolita kortizola u plazmi su povišene. ACTH stimulacija (4 sata) prouzrokuje normalan ili blago povišen odgovor kortizola, DHEA-S (dihridroepiandrostenon-sulfat) i androsterona Bolesti tiroidne žlezde Hipotiroidizam smanjuje, a hipertiroidizam povećava lučenje i metabolizam kortizola bez da utiče na njegove koncentracije u krvi. Tiroidni hormoni menjaju aktivnost enzima 11βhidroksisteroid dehidrogenaze. Ovaj enzim konvertuje kortizol u kortizon. Kod hipertiroidizma, 11-ketometaboliti, tetrahidrokortizon i kortoloni su dominantni. Suprotno, kod hipotiroidizma tetrahidrokortisol i kortoli su dominantni Stres Akutni stres, trauma ili bolest utiču na pojačano lučenje kortizola, kortikosterona i adrenalnih androgena. Hronična bolest može da prouzrokuje povećane koncentracije kortizola u plazmi što suprimira koncentracije DHEA-S, DHEA kao i androstendiona. Produženi stres može da dovede do stanja opšte adrenalne insuficijencije, a što može da utiče na celokupno zdravlje dovodeći organizam u bolesno stanje. 6 Strana

12 Starost Novorođenčad proizvode više kortizona nego kortizola. Nekoliko dana nakon rođenja, proizvodnja kortizola postaje dominantnija, slična kao i kod odraslih osooba. Novorođenčad ne poseduju enzim 5α-reduktazu i imaju deficit glukoronil transferaze, što dovodi do pojačane proizvodnje 6β-hidroksiliranih metabolita kortizola u odnosu na odrasle osobe (6). Cirkulatorne koncentracije kortizola i CBG postaju konstantne nakon neonatalnog perioda. Kod starijih osoba, proizvodnja kao i metabolički klirens kortizola su 25% manje nego kod mlađih ljudi. Urinarna ekskrecija kortizola i drugih 17-hidroksil metabolita se smanjuje s godinama, ali ACTH stimulacija kortizola ostaje normalna kod starih osoba. 1.5 Hipotalmusno-hipofizno-adrenalna osa (HPA osa) Hipotalamus, hipofiza i nadbubrežna žlezda čine neuroendokrinu osu koja reguliše proizvodnju kortizola. Hipotalamus proizvodi kortikotropin oslobađajući hormon (CRH) kao odgovor na različite cirkadijalne, neurosenzorne, i limbične signale (7). CRH utiče na pituitarnu žlezdu tako što prouzrokuje izlučivanje adrenokortikotropnog hormona (ACTH) u cirkulaciju. ACTH deluje na adrenalnu žlezdu tako što za uzvrat proizvodi oslobađanje kortizola. U cirkulaciji kortizol je primarno vezan za kortikosteroidni vezujući protein (CBG) sa malom frakcijom (~10%) koja egzsistira kao slobodan biološki aktivan kortizol. Cirkulišući kortizol negativno reguliše CRH i oslobađanje ACTH u hipotalamusu i hipofizi što dovodi do negativne povratne sprege (Sl. 4). CRH je najvažniji fiziološki stimulator sekrecije ACTH. Međutim, oslobađanje ACTH pituitarno nije potpuno zavisno od CRH. Anititela na CRH blokiraju samo porast ACTH na različite stimuluse, ali ne blokiraju bazalnu sekreciju ACTH. I drugi faktori su važni za sekreciju ACTH: α i β adrenergički stimulusi, limfokini, angiotenzin II, opijati, somatostatin (8). Kortikotropin ili ACTH nastaje u kortikotropnim ćelijama hipofize proteolitičkim cepanjem zajedničkog prehormona, proopiomelanokortina. U prvom koraku cepanja nastaje ACTH, β-lph (beta Lipotropin) i N-terminalni ostatak iz kojeg nastaje γ-msh (gama Melanocit stimulišući hormon). Kasnije β-lph se cepa u β-endorfin i γ- LPH. Poluživot ACTH je oko 20 minuta. U cirkulaciji nije vezan za proteine (9). Lučenje ACTH iz hipofize kontrolšu tri mehanizma. Prvi je mehanizam negativne povratne sprege, u kojem koncentracija kortizola kontroliše sekreciju ACTH (duga petlja). Drugi mehanizam negativne povratne sprege je pod kontrolom centralnog nervnog sistema (CNS-a) i deluje preko hipotalamusa. Posredstvom biogenih amina u njemu deluju brojni spoljni i unutrašnji faktori (dnevni ritam i srčani rad, strah, temperatura, bol, depresija). Treći mehanizam regulacije je preko hipotalamusa, gde ACTH kontroliše sekreciju CRH (kratka petlja) (9). 7 Strana

13 ACTH stimuliše sintezu i lučenje steroida u kori nadbubrežne žlezde preko receptora za ACTH (8). Preko camp (ciklični adenozin monofosfat) ostvaruje akutni i hronični uticaj na steroidogenezu. Akutni uticaj ACTH vidi se već za nekoliko minuta i brzo prestaje kad koncentracija ACTH u krvi padne. Hronični uticaj ACTH vidljiv je u hipertrofiji i hiperplaziji ćelija kore nadbubrežene žlezde, te u steroidogenezi. U stresnom hiperkortizolemijskom odgovoru stimulacija može trajati 24 sata, puna aktivnost 3 dana, a oporavak može trajati nedeljama i mesecima (8). Slika 4. Hipotalmusno-hipofizno-adrenalna osa Mehanizam povratne sprege HPA ose Svaka žlezda sa unutrašnjim lučenjem ima težnju da vrši prekomernu sekreciju hormona, ali čim hormon obavi normalan fiziološki efekat, žezdi se prenosi signal da se sekrecija obustavi. Obrnuto, luči li žlezda premalo hormona, fiziološki efekat tog hormona će se smanjiti. Zbog toga 8 Strana

14 se inhibitorno delovanje regulatornih mehanizama smanjuje, a to dozvoljava žlezdi da ponovno započne lučenje adekvatne količine hormona. Ovo je osnov delovanja mehanizma povratne sprege. HPA osa (hipotalamusno-hipofizno-adrenalna osa) je klasični primer endokrine povratne sprege. ACTH povećava lučenje kortizola, a kortizol smanjuje CRH i ACTH dugom i kratkom petljom. Glukokortikoidi mogu snižavati ACTH brzom, srednjom i sporom povratnom spregom, međutim, najčešće postoji kontinuitet u odgovoru (8). Kad bolesnik sa Adisonovom bolešću dobije intravenusni kortizol, već nakon 15 minuta ACTH pada, te ostaje suprimiran kroz 90 do 120 minuta na 10% početne vrednosti. Početna brza povratna sprega smanjuje odgovor ACTH na neke stimuluse, ali ne na jake stimuluse (veliki hirurški zahvat, endotoksin). Ovakav mehanizam se verovatno odvija na nivou hipotalamičkog CRH, a ne na hipofiznom nivou (8). Povišene vrednosti glukokortikoida ubrzavaju progresiju od brze prema sporoj povratnoj sprezi koja je okarakterisana sniženom ili odsutnom sintezom ACTH, potpunom supresijom transkripcije Proopiomelanokortin gena (POMC), nemogućnošću odgovora na CRH, kao rezultat smanjenim sadržajem ACTH u hipofizi. U dugotrajnom hiperkorticizmu kao što je to slučaj dugotrajne Kušingove bolesti ili dugotrajne primene egzogenih kortikoida, hipofiza postaje potpuno neosetljiva (8). Oporavak može trajati mesecima. 1.6 Cirkadijalni ritam kortizola Za većinu populacije su tipične diuralne varijacije nivoa kortzola. Jutarnji kortizol dostiže svoje najviše koncentracije 30 do 45 minuta nakon buđenja. Nivo kortizola postepeno opada u toku dana kada dostigne svoje najniže koncentracije kasno uveče između 24h i 04h (10). Nije iznenađujuće da jutarnji kortizol bude 10 puta veći od večernjih vrednosti. ACTH i kortizol su najviši ujutru, a najniži uveče. Najviše vrednosti ACTH su između 4 i 6 h, a kortizola oko 8 h (8 ). ACTH i kortizol se luče epizodično (pulsirajuće) svakih 30 do 120 minuta, tokom celog dana, ali frekvencija i amplituda je mnogo veća ujutru. Na ritmično lučenje kortizola i ACTH utiče nekoliko faktora. Prvi faktor je ritmičnost lučenja hipotalamičkog CRH, koji nije hormonalno zavisan, niti osetljiv na ultrakratku petlju povratne sprege. Iako su CRH, ACTH i kortizol u dobroj korelaciji, nije svaka vrednost kotrizola praćena kretanjem vrednosti ACTH i CRH. Drugi je faktor ciklus hranjenja. Najviša koncentracija kortizola je ujutro pre doručka, a nešto manji "pikovi" su pre ručka i pre večere. Kortizol se jače luči u gladovanju i pada nakon jela, te stoga diurnalni ritam služi kao zaštita organizma od hipoglikemije. Treći faktor koji utiče na diurnalni ritam je ciklus svetlo/mrak, a četvrti faktor urođena ritmičnost sekrecije nadbubrežnih žlezda (8). 9 Strana

15 1.7 Fiziološki uticaj na koncentracije kortizola Fiziološki uticaj na koncentraciju kortizola ide preko CNS-a. Veći stresovi, poput traume, operacije, hipotenzije, hipoglikemije, povišene temperature, umerene ili jake fizičke vežbe, mogu i do 6 puta povećati koncentraciju kortizola. Od hroničnih bolesti ciroza i srčana dekompenzacija imaju uticaj na lučenje kortizola (11). U depresiji se povećava bazalna koncentracija ACTH i kortizola, te urinarna sekrecija slobodnog kortizola kao rezultat smanjenog diurnalnog ritma kortizola i ACTH, slično kao u Kušingovoj bolesti. CRH u cerebrospinalnoj tečnosti je povećan, a HPA osa je manje osjetljiva na supresiju egzogenim glukokortikoidima (12). 10 Strana

16 2. ODREĐIVANJE KORTIZOLA 2.1 Biološki materijali Steroidi se mogu određivati u uzoku krvi, urina i salive Krv Određivanje steroida u krvi danas se koristi za merenje njihovog nivoa lučenja u rutinskom radu u laboratorijskoj dijagnostici. Kortizol se nalazi u serumu u vezanom obliku. Tačnije, kortizol je vezan za globulin poznat kao kortikosteroid-vezujući globulin (CBG). Nivo ukupnog kortizola ponekad ne ukazuje na realnu funkciju žlezde i to u situacijama kada postoje bolesti kao što su sepsa, ciroza jetre ili nefrotski sindrom, tj. u slučajevima kada je CBG sinteza smanjena ili klirens povećan. U takvim slučajevima merenje ukupnog kortizola u krvi je nepouzdana metoda za utvrđivanje deficita kortizola ili njegove hiper sekrecije (13,14) Urin Iako urinarna ekskrecija hormona ili njihovih metabolita ne predstavlja ukupnu količinu hormona izlučenog od strane žlezde, ona najčešće predstavlja dobru aproksimativnu količinu izlučenu u toku perioda sakupljanja urina. Prema tome urinarna određivanja omogućavaju realnu procenu sekretorne aktivnosti žlezde. Normalno, samo 1% ukupne količine serumskog kortizola se izlučuje nepromenjeno urinom, jer je najveća količina kortizola vezana za proteine, te se ne filtrita u glomerulima. Nekompletno sakupljanje, poremećena renalna funkcija usled bolesti i doprinos više žlezdi ukupnom zbiru lučenja istog hormona zahteva posebnu opreznost kod interpretacije urinarnih vrednosti. Analiti ukupnih urinarnih metabolita imaju dodatan problem jer prikazuju samo deo aktivnog steroidnog hormona koji je metabolisan kroz različite metaboličke puteve, shodno tome količina i priroda ovih metabolita može za uzvrat da zavisi ne samo od patološkog stanja pacijenta već i od farmakoterapije i ishrane pojedinca. Bez obzira na sve neugodnosti vezane za uzorkovanje 24 časovnog urina, određivanje urinarnog kortizola je precizan način merenja slobodnog kortizola. Kada koncentracija kortizola u serumu pređe 500 nmol/l, transkortin postaje zasićen i time količina nevezanog kortizola raste. Rezultat je povećan slobodan kortizol u urinu. 11 Strana

17 2.1.3 Saliva Većina steroidnih hormona se može odrediti u salivi (15). Salivarni kortizol je realan indikator slobodnog oblika kortizola u plazmi. Nevezan kortizol je biološki aktivan oblik cirkulišućeg hormona, a njegova koncentracija je nezavisna od promena koncentracije transportnog proteina. Protokoli uzorkovanja salive su jednostavni, omogućavaju često i jednostavno uzorkovanje, neinvazivni su i bez stresa. Testiranje iz uzorka salive je naročito pogodno za decu i odrasle koji imaju strah od uboda iglom. Koncentracija kortizola u salivi odražava koncentraciju nevezanog kortizola u krvi (usled nedovoljnih količina albumina i transkortina u salivi). Određivanje kortizola u salivi takođe zaobilazi poteškoće uzorkovanja 24 časovnog urina. Pacijenti koji imaju slabu salivaciju imaju dovoljno vremena da blagovremeno prikupe potrebnu zapreminu salive u adekvatnoj posudi. Merenje uzoraka sakupljenog u roku od 1 do 2 sata po ustajanju omogućavaju precizno merenje bazne linije endokrinih koncentracija. Najveći broj određivanja koj se koriste za određivanje serumskog kortizola mogu se koristiti i za određivanje salivarnog kortizola, pri čemu nije potrebna ekstrakcija jer u salivi nema kortizol-vezujućih globulina. 12 Strana

18 3. SALIVARNI KORTIZOL Određivanje salivarnog kortizola postalo je veoma popularno ranih 80-tih godina prošlog veka. Salivarni kortizol je mera aktivnog slobodnog kortizola koji prati diurnalni ritam serumskog ili plazma kortizola. Postoji više faktora koji potencijalno mogu da utiču na analitiku, preciznost i određivanja koncentracije salivarnog kortizola: proces uzorkovanja, rukovanje uzorkom, transport, skladištenje uzorka, izbor analitičke metode i postavljanje adekvatnih referentnih intervala Uzorkovanje i rukovanje uzorcima Adekvatna priprema uzorka je krucijalna za pravilno određivanje kortizola u salivi. Postoji razne komercijalno dostupne posude za sakupljanje salive: jednostavne sterilne posude, posude sa vaterolnom (Salivette) ili specijalizovani sistemi za sakupljanje salive. Sakupljanje salive u jednostavne sterilne posude se vrši tako što pacijent pljuje direktno u posudu i sakupi između 2 i 3 ml salive. Saliva zatim prolazi kroz proces zamrzavanja i odmrzavanja pri čemu se rešava problem viskoziteta salive (16). Salivette (Sarstedt, Nümberecht, Nemačka) su najčešće upotrebljavane za sakupljanje salive. Ovaj sistem sadrži vaterolnu koja se stavlja u usta i žvaće se oko 30 sekundi do 3 minuta (17, 18), a zatim se transferuje u epruvetu. Vaterolna može da upije između 0.5 i 3 ml salive. Naučnici Owen i Poll sa saradnicima (17, 19) su pronašli da uzorci sakupljani Salivette sistemom daju znatno niže rezultate nego oni uzorci koji su prikupljani u običnim plastičnim bočicama. Suprotno od ove studije, Kidd sa saradnicima (20) je pronašao da je salivarni kortizol značajno veći kod uzoraka koji su sakupljani Salivette sistemom. Prednost vaterolne jeste što omogućavaju čistiji uzorak salive i to zbog absorpcije nečistoća i viskoznog dela salive. Takođe, vaterolne su prikladnije za pacijente i omogućavaju lakše rukovanje uzorkom u laboratoriji (16). Sa aspekta stabilnosti kortizola, pacijenti mogu da skladište uzorak u kućnom frižideru na temperaturi između 4 i 8 C do 7 dana pre donošenja u laboratoriju na testiranje (21). U laboratoriji, uzorci salive se centrifugiraju kako bi se izdvojio čist supernatant (analitički deo uzorka). Nakon centrifugiranja uzorak se odmah analizira ili dalje zamrzava na -20 C do momenta analiziranja (22). Zamrzavanje uzorka omogućava precipitaciju salivarnih glikoproteina što pretvara uzorak u neviskoznu tečnost jednostavnu za pipetiranje. Zbog toga se uzorci salive najčešće zamrzavaju (minimum 2h), zatim pre određivanja odmrzavaju i finalno ponovo centrifugiraju pre same analize kako bi se osigurao što čistiji uzorak za analizu. Protokoli centrifugiranja nisu standardizovani te se u raznim publikacijama pominje centrifugiranje između 800 i 4000 xg sa vremenom od 2 do 20 minuta (22). Salivarni kortizol se može skladištiti u frižideru na 5 C do 3 meseca ili na -20 C i -80 C do 12 meseci dok se na sobnoj temperaturi koncentracije smanjuju za 9.2% mesečno (23). 13 Strana

19 U tabeli 1 su prikazane reprezentativne vrednosti slobodnog kortizola u serumu (određivane imunohemiluminescentnom metodom) (24) i u salivi (određivane pomoću RIA metode - radioimunoodređivanje) (25) kod odraslih osoba. Tabela 1. Reprezentativne vrednosti kortizola u serumu i salivi Serum µg/dl nmol/l 08:00 h :00 h Saliva ng/ml nmol/l 07:00 h :00 h Analitičke metode Salivarni kortizol se najčešće određuje metodom imunoodređivanja. Prvo se koristila metoda radioimunoodređivanja - radioimmunoassay (RIA), zatim enzyme-linked-immuno-sorbent-assay (ELISA), automatizovano elektrohemijsko-luminiscentno imunoodređivanje (ECLIA). U novije vreme koristi se metoda tečne hromatografije koja je vezana za masenu spektrometriju, liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Upotreba metoda imunoodređivanja je pre svega popularna zbog jednostavnosti i dostupnosti u mnogim laboratorijama. Retke su laboratorije koje poseduju opremu za LC-MS/MS metodu, pa je to razlog slabije upotrebe ove metode. Kod imunoodređivanja kortizola mogu se javiti unakrsne inteferencije sa drugim steroidima. Koncentracije salivarnog kortizola koje se nalaze na donjim granicama diurnalnog ritma su blizu funkcionalnog opsega detekcije metode imunoodređivanja. Da bi se ovaj problem prevazišao i postigla bolja reproducibilnost i preciznost potrebne su veće zapremine uzorka. LC-MS/MS metoda je 10 do 100 puta osetljivija metoda imunoodređivanja, a poseduje i visok nivo specifičnosti (26). Koristeći RIA metodu autori Kidd i saradnici (20) su pronašli koeficijent varijacije od 14.1% do 7.4% kod salivarnih koncentracija od 2 do 16 nmol/l. Od sedam sličnih testiranih steroida, samo je kortikosteron proizveo očiglednu unakrsnu reaktivnost od 18.6%. RIA metoda je unakrsno reagovala sa drugim steroidima: kortizon <1%, kortikosteron 0.3%, 11- deoksikortizol 2.2%, 21-deoksikortizol 10.9%, 6β-hidroksikortizol 50% i prednizolon 56.6% (22). Direktna kontaminacija salive steroidnim lekovima, losionima ili gelovima utiču na sve pomenute metode (18). 14 Strana

20 3.2.1 Metode hromatografije Nekoliko hromatografskih metoda su korišženešćene za određivanje kortizola: gasna hromatografija (GC), tečna hromatografija (LC), tečna hromatografija visokih preformansi (HPLC) i gasno tečna hromatografija povezana sa masenom spektrofotometrijom (GC/MS i LC/MS). Sve navedene metode jednostavno razlikuju kortizol od drugih steroida i steroidnih metabolita. Međutim, ove metode zahtevaju specijalizovan kadar, veliko vreme za rad, detaljnu preanalitičku pripremu uzorka. Na primer, većina HPLC metoda zahtevaju ekstrakciju kortizola iz uzorka koristeći kolone čvrste faze ili tečnu ekstrakciju praćenu hromatografijom reversne i normalne faze i detekciju koristeći fluorescenciju ili ultraljubičastu absorpciju (27). HPLC metoda ima prednost u tome što omogućava da se dvoje svi relevantni steroidi jednim hromatografskim korakom, ali zbog komplikovanosti procedure nije rasprostranjena metoda Imunoodređivanje U praksi, imunoodređivanje je najjednostavniji i najčešće korišćena metode koja se koriste u određivanju serumskog, urinarnog i salivarnog kortizola i široko su dostupni u mnogim kliničkim laboratorijama na poluautomatizovanim i automatizovanim sistemima (28). Razvijen je veliki broj metoda imunoodređivanja kortizola u kojima se koriste različite vrste antitela (29), šeme procesovanja (29), obeležavanja (izotopne i neizotopne) i principe određivanja uključujući beta i gama brojače (30, 31), fotometriju (32), fluorimetriju (33) i hemiluminescenciju (34). Mnoge imunohemijske metode koriste antitela proizvedena imunizacijom životinja sa raznim derivatima kortizola konjugovanih proteinima. Antitela na kortizol-21-hemisukcinat i kortizol-3-karboksimetiloksim konjugati su se pokazala kao veoma stabilna i široko su u upotrebi u direktnim imunoodređivanjima gde ekstrakcija uzorka nije potrebna. Specifična monoklonska antitela kortizola su takođe proizvedena upotrebom hibridoma tehnike. U direktnim određivanjima, kortizol je kvantitativno istisnut od strane agensa kao što je 8-anilino-1-naftalen-sulfoinska kiselina (ANS). Ovaj agens deluje putem zamene ili blokiranjem. Zamena vezanog kortizola za protein seruma ovim agensom olakšava vezivanje kortizola za reagens antitela. Efikasnost zamene ANS agensom zavisi i od koncentracije vezujućih proteina u uzorku. Na primer, količina ANS-a koja je adekvatna kod normalnog čoveka može biti nedovoljna da istisne kortizol kod trudnice koja sadrži veće koncentracije CBG-a. Takođe koncentracije ANS-a koje su potrebne u ovakvim slučajevima, kako bi se obavila kompletna zamena vezanog kortizola, može uticati na smanjeno specifično vezivanje steroida za reagens antitela. Danas su dostupna visoko specifična antitela koja se koriste u veoma senzitivnim neizotopskim tehnikama kao što su hemiluminescencija i fluoresencija, omogućavajući da se kortizol iz salive, krvi i urina jednostavno i lako odredi. Nije retko da se nailazi na varijacije u nivoima salivarnog kortizola između istih tipova metoda koje se koriste za određivanje. Kod različitih metoda postoje nedostaci u harmonizaciji sertifikovanog referentnog materijala i u programu eksternog laboratorijskog poređenja. 15 Strana

21 3.3 Referentne vredosti Većina laboratorija citiraju referentne vrednosti za ponoćni salivarni kortizol s obzirom da se ova vremenska tačka koristi za dijagnozu Kušingovog sindroma. Koncentracije salivarnog kortizola su nezavisne od pola (35) ali mogu biti niže kod starijih ljudi što je i dokazano u jednoj studiji koja poredi četrdesetogodišnjake sa dvadesetogodišnjacima (35). Prema preporukama Instituta za kliničke i laboratorijske standarde (CLSI) potrebno je minimum 120 referentnih vrednosti da se koriste kako bi se odredili referentni intervali. Sa aspekta postavljanja metode određivanja salivarnog kortizola, krucijalna komponenta bi bila uspostavljanje lokalnih referentnih intervala koji uključuju gojazne osobe, osobe sa diabetom tip II ili sa pseudo-kušingovim sindromom. Pojedini naučnici smatraju da nije uvek idealno da se oslanja na referentne vrednosti koje preporučuje proizvođač testa (17). Publikovane studije su izračunale visok opseg referentnih intervala graničnih cut-off vrednosti kako bi razlikovali normalne vrednosti od Kušingovog sindroma. Interpretacija vrednosti salivarnog kortizola zahteva standardizaciju sredstva za uzorkovanje, protokole uzorkovanja i tehnologiju ispitivanja. Velika raznovrsnost testiranja salivarnog kortizola u literaturi ne daje mogućnost da se zaključi ispravna laboratorijska metoda ispitivanja ovog parametra. Standardizacija procesovanja uzorka bi morala da se sprovede u svakoj laboratoriji kako bi se lakše vršila poređenja podataka sa publikovanim podacima. 16 Strana

22 4. KLINIČKE INDIKACIJE ODREĐIVANJA SALIVARNOG KORTIZOLA 4.1 Kušingov sindrom Prema smernicama Endokrinološkog društva (Endocrinology Society Clinical Practice Guidelines) određivanje ponoćnog salivarnog kortizola je jedan od tri skrining testova koji se koristi za dijagnostikovanje Kušingovog sindroma (36). Ranije studije koje su poredile kortizol u salivi i plazmi kod zdravih osoba i pacijenta sa Kušingovim sindromom su pokazale da se salivarni kortizol ponaša očekivano, isti diurnalni ritam viđen je kod kortizola u plazmi (37), kao i da daje sličan odgovor na sintetički ACTH (1-24) i deksametazon (38). Gubitak diurnalnog ritma koji se sreće kod Kušingovog sindroma je očigledan kod salivarnog kortizola sa velikim vrednostima u večernjim satima (38). Ova zapažanja su sledila detaljnije studije koje su ispitivale potencijalnu ulogu salivarnog kotizola kao skrining ili dijagnostičkog parametra za Kušingov sindrom. Studije koje su ispitivale senzitivnost i specifičnost kasnog, ponoćnog salivarnog kortizola kao dijagnostički test za Kušingov sindrom (39, 40) su pokazale da je generalna senzitivnost i specifičnost veća od 90%. Skorašnja studija koja je koristila LC-MS/MS metodu pokazala je senzitivnost od samo 74.5% koristeći preporučene referentne vrednosti od strane proizvođača (41). Ranija studija koja je kortistila istu metodu i referentne vrednosti je pokazala senzitivnost od 93% (42). Bez obzira na razlike u ovim rezultatima različitih autora, određivanje ponoćnog salivarnog kortizola ima prednosti u odnosu na druge skrining testove kao što su supresioni test sa 1 mg deksametazona (DST) ili određivanjem slobodnog kortizola u 24- časovnom urinu (43, 36). Supresivni test deksametazonom često ima lažno pozitivne rezultate kod vrednosti kortizola blizu 50 nmol/l. Osobe koje su na terapiji lekovima koji indukuju enzim citohrom P450, koji stimuliše metabolizam deksametazona takođe mogu imati lažno pozitivne rezultate (44). Iako su preporuke Endokrinološkog društva da se određuje slobodan 24h urinarni kortizol, problem ovog testa može biti neugodnost i nekompletnost uzorkovanja, a vrednosti zavise od renalne funkcije i zapremine urina (36). Uzorkovanje salive je ugodan proces za pacijenta bilo da se nalazi u bolnici ili kod kuće. Test ne zavisi od metabolizma deksametazona jer se određuje slobodan kortizol, a nemaju uticaj ni eksogeni estrogeni hormoni koji se koriste kao kontraceptivi (45). Blag oblik ili subklinički oblik Kušingovog sindrom nije moguće odrediti večernjim kasnim salivarnim kortizolom. U ovakvim slučajevima salivarni kortizol kontrolne grupe se ne razlikuje mnogo od one sa subkliničkim hiperkortizolizmom, gde je senzitivnost manja od 25% (46). U ovakvim slučajevima problem je u autonomnom lučenju kortizola, a ne u gubitku diurnalnog ritma. Kod ovih pacijenata, skrining test izbora je supresija sa 1 mg DTS gde se koristi konvencijalna cut-off tačka od 140 nmol/l umesto 50 nmol/l (47). U slučaju da postoji adrenalni adenom koji autonomno luči kortizol, onda neće postojati mogućnost da se suprimira kortizol, a plazmatski ACTH će biti nizak. 17 Strana

23 4.2 Kongenitalna adrenalna hiperplazija Tretman kongenitalne adrenalne hiperplazije (KAH) ima za cilj da suprimira ACTH kako bi se smanjila adrenalna i androgena proizvodnja. Sa kliničkog aspekta važno je pratiti brzinu rasta i višak androgenih hormona. Sa biohemijskog aspekta prati se nivo 17-hidroksiprogesterona (17OHP) pre merenja doze steroida. Ovaj pristup ima svoje negativne strane jer normalne vrednosti mogu navesti na preteranu medikaciju (48). Određivanje salivarnog kortizola je preporučeno kao dodatna smernica za fino podešavanje individualnog tretmana (49). 4.3 Adrenalna insuficijencija Jutarnji plazma i salivarni kortizol imaju visoku korelaciju (r=0.73) kod pacijenata sa Adisonovom bolešću. Međutim, određivanje kortizola nije koristan kod dijagnostike adrenalne insuficijencije (50). Senzitivnost salivarnog kortizola je 33%, a specifičnost 20% za detekciju Adisonove bolesti. Sa druge strane, određivanje salivarnog kortizola ima svoju značajnu ulogu kod ACTH 1-24 testa kada se utvrđuje primarna ili sekundarna adrenalna insuficijencija kod dece i odraslih (51), gde su rezultati uporedljivi sa kortizolom u plazmi. Određivanje salivarnog kortizola ima prednost nad određivanjem kortizola u plazmi, utoliko što vrednosti ne zavise od promena CBG (kao na primer kod korisnika kontraceptiva) ili drugih interferirajućih steroida koji pacijenti koriste (51). Stanja koja su vezana sa deficitom CBG, kao što su bolesti jetre, nefrotski sindrom, multipli mielom, hipotiroidizam i gojaznost, mogu prouzrokovati nizak kortizol. U ovakvim slučajevima određivanje slobodnog kortizola u salivi je korisnije. Upotreba LC-MS/MS metode za određivanje salivarnog kortizola je superiorna u odnosu na serumski kortizol posle konvencijalnog (250 ug) ACTH 1-24 testa kod pacijenata sa mešovitom etiologijom deficitarnog kortizola (52). 4.4 Praćenje supstitucione terapije hidrokortizonom Hidrokortizon se uzima kao supstituciona terapija u slučajevima gde postoji hipofizni deficit ACTH ili kod insuficijencije adrenalne žlezde kao što je to slučaj kod Adisonove bolesti. Praćenjenje supstitucione terapije glukokotikoidima je danas uglavnom empirijsko, gde se prate simptomi pacijenta i znaci glukokorikoidnog viška ili deficita u cilju prevencije komplikacija zbog prekomernog unosa (53). Preporučena «dnevna kriva» se koristi kao alatka za praćenje glukokortikoidne supstitucione terapije (54, 55) ali često određivanje serumskog kortizola može biti opterećujuće i stresno za pacijenta. Salivarni kortizol bi svakako bio praktičniji put da se obezbedi «dnevna kriva» u udobnijim uslovima po pacijenta. Poređenje nivoa kortizola u salivi, kapilarnoj krvi i venskoj krvi u sedam različitih tačaka u toku dana kod pacijenata sa hipoadrenalnom funkcijom koji su na supstitucionoj terapiji hidrokortizonom su pokazali bolju korelaciju i slaganje između serumskog i kapilarnog kortizola (r= i 85% saglasnosti). Sa druge strane, serumski i salivarni kortizol su imali nešto nižu korelaciju i saglasnost (r= i 18 Strana

24 65% saglasnost) (56). Razlog može biti rezultat saturacije CBG-a nakon terapije hidrokortizonom. Nakon terapije dolazi do porasta kortizola koji može da pređe koncentracije od 550 nmol/l (57). Prema tome salivarni kortizol može biti bolji za određivanje kortizola nakon terapije jer određuje približnije skok koncentracije kortizola koji je u slobodnom obliku. Svakako, postoje praktični razlozi za brigu da veoma visoke koncentracije slobodnog kortizola mogu zapravo biti uzrok kontaminacije uzoraka salive tabletama hidrokortizona i pored predhodnog ispiranja usta koji su pacijenti sproveli. Detekcija salivarnog kortizola može biti problem kod koncentracija koje su niže na primer 0.6 nmol/l što je ispod limita detekcije za test salivarnog kortizola (58). U publikacijama primećen je širok varijabilitet koncentracija salivarnog kortizola kod pacijenata koji su na supstitucionoj terapiji hidrokortizonom (59). Međutim, mala studija Lovas i saradnika (60) je prikazala blisku korelaciju između serumskog i salivarnog kortizola nakon terapije oralnim kortizonom i intravenusnim hidrokortizonom, koji su ukazali da salivarni kortizol može da ima kliničku korist. Svakako, dalja ispitivanja su potrebna pre nego što se salivarni kortizol usvoji i postane rutina kod praćenja supstitucione terapije glukokortikoidima. 4.5 Salivarni kortizol i njegove aplikacije u istraživanjima Salivarni kortizol se široko koristi u istraživanjima hormona stresa kao uticaja aktivacije hipotalmusno-hipofizno-adrenalne ose i to naročito u uslovima psihološkog stresa. Zbog svoje ne invazivnosti i jednostavnost uzorkovanja salivarni kortizol je naročito pogodan za istraživanja, kao i ona istraživanja koja uključuju decu. Uprkos faktorima koji mogu da utiču na varijabilnost salivarnog kortizola, ovaj parametar je odlična mera slobodnog kortizola i veoma je koristan u situacijama kada promenjene koncentracije CBG-a mogu da komplikuju interpretaciju ukupnog serumskog kortizola. 19 Strana

25 5. ODREĐIVANJE SALIVARNOG KORTIZOLA KOD PRIPADNIKA SPECIJALNE ANTITERORISTIČKE JEDINICE (SAJ) -PILOT STUDIJA U praktičnom radu kao saradnik učestvovala sam u pilot projektu koji je uključio procenu psihofizičkog zdravlja i preventivni pristup kod pripadnika SAJ-a. Praćen je uticaj stresa u dužem vremenskom periodu kod ove grupe ispitanika merenjem nivoa salivarnog kortizola. Stres je funkcionalan odgovor koji omogućava organizmu da se adaptira na situacije povećanih fizioloških, fizičkih i psiholoških napora. Visok nivo stresa u dužem vremenskom periodu doprinosi nastanku i razvoju hroničnih bolesti, kao što su kardiovaskularne bolesti, dijabetes, psorijaza, poremećaj funkcije gastrointestinalnog trakta, a može dovesti i do slabljenja imunološkog sistema, zamora, povećanja telesne težine i izazvati glavobolju, depresiju, nesanicu i anksioznost. Povećan stres pokreće niz mehanizama među kojima je aktivacija HPA ose. Postoje dokazi koji ukazuju da psihosocijalni i faktori sredine mogu da utiču na nivo kortizola, kao i na dnevne varijacije u nivou kortizola, što ga čini jednim od najpoznatijih i često korišćenih markera stresa. Fiziološki stres može biti prouzrokovan dugim i intezivnim treninzima, ali i psihološki stres kome su pripadnici SAJ-a često izloženi, može da se prouzrokuje supresiju imunološkog odgovora i poveća incidencu infekcija. Posebno mesto u odbrani od patogena zauzima imuni sistem sluzokože usta i gornjih respiratornih puteva. Sekretorni IgA (siga), antimikrobni proteini kao što je lizozim, čini mukozni imunitet važnom komponentom nativnog imuniteta u prvoj liniji odbrane od patogena. Stoga u okviru studije pratili smo nivo kortizola, sekretorni IgA i lizozima u salivi pripadnika SAJ. Ovde ćemo se samo osvrnuti na princip testiranja i rezultate koje smo dobili za salivarni kortizol. 5.1 Značaj programa i ciljevi projekta Program procene ukupnog psihofizičkog zdravlja i preventivni pristup kod pripadnika specijalne antiterorističke jedinice ima veliki značaj ne samo za SAJ kao jedinicu već iz naučnog ugla ima nesumnjiv značaj, jer ima za uzorak vrhunski trenirane pojedince koji se u mnogome mogu porediti sa vrhunskim sportistima, a jedan broj njih svoju veštinu dokazuju na redovnim takmičenjima u borilačkim veštinama, streljaštvu, maratonu, triatlonu itd. 5.2 Salivarni kortizol kao marker stresa u istraživanju Dosadašnja istraživanja kortizola su bila naročito fokusirana na sakupljanje uzoraka krvi u cilju merenja hormona kao načina procene odgovora organizma na fizički i psihički stres. Ipak, sve je 20 Strana

26 više dokaza koji ukazuju da saliva kao biološki material može biti korisna alternativa krvi u cilju procene nivoa kortizola. Određivanje salivarnog kortizola je pre svega neinvazivna metoda i veoma je jednostavna za sprovođenje. 5.3 Cilj projekta Cilj ovog istraživanja bio je da se utvrdi nivo salivarnog kortizola, kao i dnevne varijacije u nivou kortizola u toku redovnih svakodnevnih treninga, ali i u toku obavljanja specijalnih zadataka. Pored toga, cilj ovog istraživanja je bila kvantifikacija stresa putem standardizovanih skala merenja stresa, kao i ispitivanje korelacije između subjektivne ocene nivoa stresa i salivarnog kortizola kao biloškog markera stresa. 5.4 Metodologija rada U studiji je učestvovalo 28 pripanika specijalnih antiteroristickih jedinica. Prosečan uzrast ispitanika je bio 34 godine. Antropometrijske vrenosti u proseku su iznosile; telesna težina 89 kg, telesna visina 180 cm i indeks telesne mase (BMI) 27,1 kg/m 2. Kod ispitanika su merene fizičke karakteristike: aerobni kapacitet, snaga i fleksibilnost. Merena je srčana frekvencija u mirovanju. Pored toga u studiji je određivan i nutritivni status ispitanika koji su uključeni u program ishrane i suplementacije. Određivan je nivo kortizola ispitanicima u okviru: Redovnih aktivnosti (uzorci sakupljani u 6:30, 9:15 i 22:00 h) i nakon obaveštenja o akciji (9:15h), uzrok stresa. Saliva je prikupljana koristeći salivete sistem (Sarstedt, Nümberecht, Germany). Pamučna vaterolna je stavljana ispod jezika nekoliko minuta. Odmah nakon uzorkovanja saliva je odvajana od vaterolne centrifugiranjem na 1500 xg 15 minuta. Supernatant je zatim zamrznut na C. Učesnici pilot studije nisu mogli da primene savete o sakupljanju salive na dan stresa kada nisu očekivali uzorkovanje. Tada su isprali usta čistom vodom nakon čega su sakupljali salivu. Prilikom sakupljanja uzoraka salive u okviru redovnih aktivnosti učesnici su savetovani da ne jedu, ne piju, ne peru zube minimum 30 minuta pre uzorkovanja. Salivarni kortizol je određivan ELISA metodom (IBL international GmbH, Hamburg, Nemačka). 21 Strana

27 5.5 Rezultati a) Nivo kortizola je najviši ujutru, neposredno nakon buđenja i smanjuje se u toku dana, i dostiže najnižu vrednost uveče pred spavanje. Nivo kortizola pripadnika SAJ odgovara normalnim varijacijama nivoa kortizola u toku dana (Graf.1). Studija je pokazala da je prosečna vrednost nivoa kortizola pripadnika SAJ viša od srednje referentne vrednosti. Grafikon 1. Dnevne varijacije u nivou kortizola- redovan rad (vreme nakon buđenja T1:0-1.5h; T2: h; T3: h; T4: h; T5: h) Studija je pokazala sledeće: - Svi pripadnici su imali viši nivo kortizola u odnosu na srednju referentnu vrednost ujutru, nakon buđenja - 12/23 pripadnika je imalo viši nivo kortizola u odnosu na srednju referentnu vrednost ujutru, u 9:00-8/23 pripadnika je imalo viši nivo kortizola u odnosu na na srednju referentnu vrednost uveče u 22:00 22 Strana

28 b) Salivarni kortizol je određivan i nakon obaveštenja ispitanika o akciji. Dobijeni rezultati ukazuju da je prosečan nivo kortizola nakon obaveštenja o akciji viši od srednje referentne vrednosti i znatno viši u odnosu na nivo kortizola u isto vreme tokom mirnog dana (Graf.2). Grafikon 2. Dnevne varijacije u nivou kortizola akcija (vreme nakon buđenja T1:0-1.5; T2: ; T3: ; T4: ; T5: ) Studija je pokazala sledeće: - Svi pripadnici SAJ, osim jednog, su imali viši nivo kortizola u odnosu na srednju referentnu vrednosti ujutru, u 9:00 h, nakon obavestenja o akciji. 23 Strana

29 c) Određivane su vrednosti salivarnog kortizola u toku dana kada pripadnici SAJ imaju redovne aktivnosti i u stresu, kada je dobijeno obaveštenje o akciji. U oba slučaja vršena su mernja kortizola u dva različita vremenska razdoblja: neposredno nakon buđenja (T1) i u 9:15 h (T2). Jasno se vidi razlika između nivoa kortizola ujutru, nakon buđenja i nivoa u 9:15 (Graf. 3). Grafikon 3. Kortizol u miru i u stresu (T1-neposredno nakon buđenja; T2-9:00 h) Nakon obaveštenja o akciji dolazi do fiziološkog odgovora organizma koje se manifestuje kroz povećanu produkciju kortizola. Pokazano je da je nivo kortizola veći u odnosu na referentne vrednosti čak i tada kada pripadnici SAJ imaju redovne aktivnosti. 24 Strana

30 Povišene vrednosti kortizola pripremaju organizam za odbranu od opasnosti, ali mogu imati i dugotrajne negativne posledice po zdravlje. Napomena: Obzirom da rad ovog ispitivanja treba da bude publikovan u narednom periodu, nismo bili u mogućnosti da iznesemo kompletne rezultat 25 Strana

31 6. DISKUSIJA I ZAKLJUČAK U salivi se istražuju i proučavaju savremeni biomarkeri koji bi mogli otkriti postojanje bolesti u najranijoj fazi. Tako je u proceni različitih bolesti do sada ispitano više od 20 relevantnih biomarkera. Saliva je adekvatan biološki materijal u kojem se sa velikom preciznošću mogu određivati različiti parametri, pre svega hormoni, različiti lekovi i njihovi metaboliti, antitela, narkotici itd. Ipak, najveća prednost ovog medijuma ogleda se pri analizi steroidnih hormona koji zbog dobre rastvorljivosti u lipidima lako prolaze kroz ćelijsku membranu acinarnih ćelija. Zato koncentracija steroidnih hormona u salivi vrlo često odražava plazmatsku koncentraciju hormona. Za razliku od serumskih testova kojima se meri ukupna koncentracija hormona, salivarni testovi omogućavaju merenje samo nevezanog dela hormona. S obzirom da je samo nevezani deo hormona funkcionalno aktivan, određivanje nivoa hormona u salivi nam daje bolji uvid u aktivnost hormona nego kada se za testove koristi serum. Danas se sa značajnom preciznošću mogu određivati: kortizol, DHEA-S, estradiol, estriol, progesteron, testosteron. Za razliku od drugih telesnih tečnosti, upotreba salive kao dijagnostičkog medijuma nudi jednostavan, jeftin, siguran i neinvazivan pristup u otkrivanju bolesti i otvara novo poglavlje u dijagnostici. Saliva je takoreći gotov uzorak spreman za analizu koji nudi mnogobrojne prednosti. Sakupljanje materijala je brzo i bezbolno, neinvazivno i bez stres efekta koji izaziva venepunkcija, što može bitno uticati na rezultate. Saliva može biti višekratno uzimana u toku 24 časa i van zdravstvene ustanove, i ne zahteva posebne uslove za deponovanje i transport. Pri radu sa salivom izostaje neželjeni efekt hemolize, a predstavlja i mnogo bezbedniji materijal u odnosu na mogućnosti prenošenja infektivnih agenasa. Činjenica da su neke supstance salive zastupljene u nižoj koncentraciji nego u serumu, korišćeno je da se ospori dijagnostička vrednost salive. Međutim, upravo je razvoj novih, visoko osetljivih metoda omogućio analizu sastava salive prisutnih u nižim koncentracijama. Od ranije je poznato da je kortizol pouzdani stres marker. Veliki broj radova ukazuje da vrednost kortizola u plazmi raste kod osoba koje su izložene hroničnom stresu na poslu u odnosu na referentne vrednosti u istom vremenskom periodu, što je prikazano i u ovom istraživanju. Stres je opšti pojam koji se može odnositi na stimulus (stresor), kao i na reakciju organizma. Stres kao odgovor, uključuje niz fizioloških, bihejvioralnih, motornih i kognitivnih reakcija, sa ciljem obnavljanja narušene homeostaze. Stres ima značajne efekte na niz fizioloških sistema, uključujući autonomni nervni sistem i hipotalamusno-hipofizno-adrenalnu osovinu. Stres utiče na količinu pljuvačke (smanjeno lučenje), kao i na sastav pljuvačke (povećan nivo salivarnog kortizola). Isto tako vrednosti dobijene u prikazanom istraživanju se slažu sa literaturnim podacima koji ukazuju da vrednosti kortizola u salivi variraju u odnosu na doba dana. Najnovija istraživanja pokazuju da visok nivo kortizola, hormona stresa, može da bude okidač za niz zdravstvenih nevolja, uključujući gojaznost i srčane bolesti. 26 Strana