TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT RAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOL

Transcription

1 TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT RAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOL TARTU ÜLIKOOL ARSTITEADUSKOND ÜLD- JA MOLEKULAARPATOLOOGIA INSTITUUT INIMESE BIOLOOGIA JA GENEETIKA ÕPPETOOL Raido Elmat MUC3 β-ahela-spetsiifiliste monoklonaalsete antikehade iseloomustamine Magistritöö Juhendaja Erkki Juronen, Ph.D Kaasjuhendaja Sulev Ingerpuu, Ph.D TARTU 2014

2 SISUKORD SISUKORD...2 KASUTATUD LÜHENDID...3 Sissejuhatus...4 KIRJANDUSE ÜLEVAADE Mutsiinid Membraanseoseliste mutsiinide üldiseloomustus Membraanseoselised mutsiinid terapeutilise sihtmärgina MUC3 struktuur MUC3 funktsioonid MUC3 kasvajakoes EKSPERIMENTAALNE OSA Töö eesmärgid Materjal ja metoodika Kasutatud antikehad Kasutatud rakuliinid MUC3 monoklonaalsete antikehade seostumise tuvastamine peptiididel SDS-PAGE forees Rakkude värvimine immuunotsütokeemilisteks uuringuteks CaCo-2 mõjutamine antikehadega Tulemused Hübridoomide skriinimine ELISA meetodil kasutades antigeenina peptiide MUC3A ja MUC3B MUC3 ekspressiooni tuvastamine rakuliinidel Western blot meetodiga Hübridoomide skriinimine Western blot meetodiga ELISA-l positiivsete MUC3 antikehade spetsiifika kontroll erinevate rakuliinide lüsaatidel Western blot-i meetodil MUC3 antikehade seostumise kontroll erinevatel MUC3 valku ekspresseerivatel ja mitteekspresserivatel rakuliinidel immuunotsütokeemia meetodil CaCo-2 mõjutamine antikehadega Arutelu KOKKUVÕTE SUMMARY KASUTATUD KIRJANDUS Kasutatud veebiaadressid Litsents... 42

3 KASUTATUD LÜHENDID CT (Cytoplasmic Tail) tsütoplasmaatiline osa DAB (DiAminoBenzidin) - diaminobensidiin EGF (Epidermal Growth Factor) epidermaalne kasvufaktor FITC (Fluorescein IsoThioCyanate) fluorestseiinisotiotsüanaat IFN- γ (Interferon gamma) interferoon gamma MUC (mucin) mutsiin PBS (Phosphate Buffered Saline) - fosfaatpuhverdatud füsioloogiline lahus PFA (ParaFormAldehyde) - paraformaldehüüd SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)- naatrium dodetsüülsulfaat polüakrüülamiidgeel-elektroforees SEA (sea urchin Sperm protein, Enterokinase, Agrin) - spermi proteiin, enterokinaas, agriin TEMED (Tetra Methyl Ethylene Diamine) tetrametüületüülenediamiin TGF- β (Transforming Growth Factor betta ) - transformeeriv kasvufaktor alpha TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha) - kasvaja nekroosifaktor alfa VNTR (Variable Number of Tandem Repeat ) - varieeruvad tandemkordused

4 Sissejuhatus Vähkkasvajad on tingitud arenguhäiretest raku elutsüklis. Rakkude normaalse arengu puhul püsib tasakaal rakkude paljunemise ja suremise vahel. Häired rakkude arengut ja suremist reguleerivate geenide regulatsioonis viivad kasvaja tekkimiseni. Membraanseoselised mutsiinid mõjutavad rakkude kasvu, paljunemist, apoptoosi ja on seotud kasvajate tekkega. MUC3 on kõrgelt O-glükosüleeritud membraanseoseline mutsiin, mida ekspresseeritakse sekretoorsete epiteelrakkude apikaalses osas. Võttes arvesse MUC3 struktuuri ja lokalisatsiooni raku pinnal arvatakse, et neil on oluline roll erinevates signaalsüsteemides, rakk-rakk interaktsioonides. MUC3 üleekspressioon on seotud mitmete erinevat tüüpi vähkkasvajatega ja põletikuliste protsessidega. Membraanseoseliste mutsiinide üleekspressioon vähktõve korral on muutnud nad võimalikeks sihtmärkideks vähiteraapia arendamisel ja väljatöötamisel. Läbiviidud uurimused on näidanud, et MUC3 kujutab endast vähiravi sihtmärki ning prekliinilistele mudelitele toetudes takistab MUC3 funktsioonide pärssimine organismis erinevate kasvajate teket. MUC3 vastased antikehad on võimelised inhibeerima teatud tüüpi kasvajarakkude jagunemist ja teisi rakule omaseid funktsioone ning neid võib seetõttu kasutada nii kasvajate diagnostikas kui ka teraapias. Antud töö eesmärgiks on iseloomustada ja välja valida MUC3 vastased kõrge spetsiifikaga antikehad, et neid tulevikus kasutada uuringutes, diagnostikas ja võimalik, et ka kasvajate teraapias. Kirjanduse ülevaates antakse kokkuvõte membraanseoselistest mutsiinidest, MUC3 struktuurist ja funktsioonist normaalses koes ning kasvajarakkudes ja hetkel teadaolevatest rollidest vähiteraapia väljatöötamisel.

5 KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Mutsiinid Mutsiinid on sekretoorsete valkude hulka kuuluvad suured glükoproteiinid, millede molekulmass jääb vahemikku 200 kuni 2000 MDa (Kesimer ja Sheehan, 2012). Mutsiine on avastatud epiteelrakkude apikaalselt pinnalt, seerumist, vereloomerakkudest ja erinevat päritolu kasvajarakkudest. Konkreetsete mutsiinide kombinatsioonid ja suhteline kogus erinevad küllaltki suurtes piirides, sõltudes konkreetsest raku- ja koetüübist (Hattrup ja Gendler, 2008). Mutsiinide peamine tunnus on nende olemasolu lima koostises, niisutades ja kaitstes epiteelkudesid erinevate kahjustavate füüsiliste ja keemiliste tegurite eest (Linden jt., 2008). Mutsiinide perekond on suur - alates MUC1-st ja lõpetades MUC 21-ga. Mutsiinid on jagatud membraanseoselisteks ja sekretoorseteks mutsiinideks (Kufe, 2009). Sekretoorsete ehk lima moodustavate mutsiinide hulka kuuluvad MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9 ja MUC19 (Kufe, 2009; Wang jt., 2008). Sekretoorsed mutsiinid moodustavad füüsilise kaitsekihi, mis viskoosse geelja moodustisena kaitseb respiratoor-, urogenitaal- ja gastrointestinaaltraktis epiteelirakke ning juhade pindasid maksas, kõhunäärmes ja neerudes (Kufe, 2009). Membraanseoselised mutsiinid nagu MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC20 ja MUC21 (Kufe, 2009; Thornton jt., 2008), omavad peale kaitsefunktsiooni olulist rolli ka rakkude omavahelises kommunikatsioonis, diferentseerumises, rakkude adhesioonis ja signaaliülekanderadades (Hattrup ja Gendler, 2008; Singh ja Hollingsworth, 2006). Normaalse füsioloogilise seisundi puhul hoitakse organismi regulatoorsete radade poolt mutsiinide tootmine optimaalsel ja kontrollitud tasemel. Mutsiinide erinev ekspressioon kasvajate arengu erinevates staadiumites viitab nende olulisele rollile kasvajatega seotud protsessides ja arengus. Mutsiinid on epiteliaalsete kasvajate spetsiifilisteks markeriteks (Hollingsworth ja Swanson, 2004). Tavaliselt on erinevate mutsiinide ekpressioon sõltumas rakkude tüübist ja mõjutatud erinevatest teguritest nagu põletikuliste protsessidega seotud tsütokiinidest ja hormoonidest (Davis ja Dickey, 2008). Mutsiini molekul koosneb valgulisest selgroost ehk apomutsiinist, O-seoselistest suhkrujääkidest ja mõnedest N-seoselistest glükaanidest (Moniaux jt., 2006). Mutsiinide molekuli iseloomustab ka varieeruvate tandemkorduste (VNTR) olemasolu. Suure osa VNTR järjestusest moodustavad seriini ja treoniini jäägid, mis tekitavad rohkeid 0-glükosüleerimiste

6 asukohti, tänu milledele moodustavad peamise osa mutsiini molekulist erinevad sahhariidid. Mutsiinide suhkrujäägid, sõltuvalt konkreetsest mutsiinist ning rakus ekspresseeruvatest glükosüültransferaasidest, võivad moodustada kuni 50-90% valgu molekulmassist (Hattrup ja Gendler, 2008). Erinevate mutsiinide tandemkordused võivad erineda oma hulgalt, pikkuselt ja järjestuselt. Kuna seriin ja treoniin on 0-glükosüülimise kohad, võivad need erinevused seega mõjutada ka vastavate piirkondade omadusi. Mutsiinide biokeemilised ja -füüsikalised omadused sõltuvad suures osas nende glükosüülimise ulatusest ja iseloomust (Bafna jt., 2010). Suur polüsahhariidsete kõrvalahelate hulk, mis on seotud mutsiini VNTR kordusjärjestustega annab mutsiinidele pudeliharja taolise struktuuri, mis ulatub rakupinnast kuni 1500 nm kaugusele (Knowles ja Boucher, 2002). Polüsahhariidsed-kõrvalahelad seotuna VNTR korduvjärjestustega annavad mutsiinidele pudeliharja meenutava kuju (Joonis 1). Joonis 1. Mutsiini struktuur (

7 Mõnedes mutsiinides esineb VNTR polümorfism. Geneetiline polümorfism võimaldab valgu rakuvälise piirkonna pikkuse varieerumist, mis omakorda võib tekitada mutsiinile erinevaid füüsikalisi omadusi (Knowles ja Boucher, 2002). Säärasel moel võib mutsiini genotüüp mõjutada rakkudele iseloomulikke bioloogilisi omadusi. Kõrgemate loomade struktuursete geenide kodeerivates järjestuses täheldatakse VNTR polümorfismile sarnast nähtust küllaltki harva ja sellepärast võib mutsiine nimetada mõnevõrra erandlikeks valkudeks (Knowles ja Boucher, 2002). Kasvajarakud võrreldes normaalsete rakkudega ekspresseerivad erinevaid mutsiinide glükosüülitud vorme, samuti võivad normaalsest erineda glükosüülimise kohad. Vähktõvega seotud mutsiinid soodustavad kasvaja teket raku erinevate mehhanismide kaudu, näiteks adhesiooni, jagunemise, diferentseerumise ja kaitsemehhanismidega immuunsüsteemi mõju eest (Bafna jt., 2010; Hattrup ja Gendler, 2008). 1.2 Membraanseoseliste mutsiinide üldiseloomustus Membraanseoseliste mutsiinide gruppi kuulub kümme mutsiini: MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17 ja MUC20. MUC3 kodeeriv geen paikneb seitsmenda kromosoomi pikas õlas (7q22) (Andrianifahanana, Moniaux jt., 2006). Membraanseoselised mutsiinid kuuluvad O-glükoproteiinide perekonda. Sõltuvalt nende struktuurist ja lokalisatsioonist raku pinnal mängivad olulist bioloogilist rolli rakk-rakk ja rakk-maatriks interaktsioonides, rakusignalisatsioonis ja vähirakkude bioloogiliste omaduste määramisel. Teistsugune ekspressioonimuster vähkkasvajate puhul (üleekspressioon hingamis-, gastrointestinaal-, urogenitaaltraktis ja maksa-sapiteedes) viitab olulisele rollile vähktõve kulgemisel, metastaseerumisel, vähirakkude vastupidavusele kemoteraapiale ning on spetsiifiline marker epiteliaalset päritolu vähirakkude puhul (Li, Ren jt., 2001). Membraanseoselised mutsiinid moodustuvad pikast peptiidahelast ehk apomutsiinist ja selle külge kinnituvatest sadadest oligosahhariidestest ahelatest. Alates amino ja lõpetades karboksüül-terminaalotsaga, paljastub membraanseoseliste mutsiinide struktuuris kolm piirkonda: 1) ekstratsellulaarne domään ehk ektodomään, kus paikneb tsentraalne tandemkorduste regioon külgedel asetsevate unikaalsete järjestustega; 2) transmembraanne domään; 3) tsütoplasmaatiline saba. Ektodomään ulatub välja glükokaalüksisse ja on

8 organiseeritud moodulitena ning hoiab endas vähemalt nelja erinevat tüüpi funktsionaalset domääni, kaasa arvatud epidermaalse kasvufaktori (EGF) sarnaseid domääne, mis on esindatud MUC3, MUC4, MUC12, MUC13 ja MUC17 (Gum, Crawley jt., 2002; Moniaux, Nollet jt., 1999; Gum, Ho jt., 1997); SEA (sperm protein, enterokinase, agrin) domään, mis on esindatud MUC1, MUC3, MUC13, MUC16 ja MUC17 (Gum, Crawley jt., 2002; Bork ja Patthy, 1995; Yin ja Lloyd, 1995); tsüsteiini rikkad domäänid MUC4 puhul (Moniaux, Nollet jt., 1999); transmembraanne domään, mis on kõigil membraanseoselistel mutsiinidel. Karboksüül-proksimaalne osa mutsiinide molekulis sisaldab lühikest tsütoplasmaatilist saba, mis võib koosneda seriini, treoniini või türosiini fosforüleerimise saitidest (Li, Ren jt., 2001; Williams, McGuckin jt., 2001; Zrichan-Licht, Baruch jt., 1994). Hoolimata membraanseoselisest iseloomust, võivad nimetatud mutsiinid toota lahustuvaid produkte tänu proteolüütilisele lagunemisele või tänu geeniproduktidele, mis on läbinud alternatiivse splaisingu (Wreschner, Hareuveni jt., 1990). 1.3 Membraanseoselised mutsiinid terapeutilise sihtmärgina Vähktõvevastane immuunteraapia baseerub spetsiifilistel antikehadel ja antigeeni spetsiifilistel T-rakkudel, mis võimaldavad organismi immuunsüsteemil eristada kasvajarakke normaalsetest rakkudest (Ding jt., 2008). Vähivastane läbiviidav ravi monoklonaalsete antikehadega on kinnistumas kui standardne raviviis kasvajate vastu (Adams ja Weiner, 2005). MUC3 on üheks selliseks võimalikuks antigeeniks, mis võib esile kerkida kasvajavastase ravi sihtmärgina. MUC3 üleekspressioon inimese vähirakkudes on teinud temast võimaliku sihtmärgi vaktsiinide, antikehade ja kasvajaraku inhibiitorite arendamisel (Tang ja Apostolopoulos, 2008). Katsed vähirakkudega on näidanud, et MUC3 mrna-d on saab tuvastada juba vähktõve varajastes faasides. MUC3 hulga suurenemine on potentsiaalselt hea marker näiteks kõhunäärmevähi diagnostikas (Ohuchida jt., 2006). Mutsiinide prognostilist väärtust on uuritud ka teiste kasvajate puhul (Wang jt., 2003). Erinevatest katsetest kogutud andmed näitavad, et MUC3 ekspressioon suureneb vähikudedes kuni 100 korda võrreldes normaalsete kudedega (Tang ja Apostolopoulos, 2008). Erinevad teadusuuringud on näidanud, et kõrge MUC3 ekspressiooniga rinnavähi juhtumite puhul on elulemus viletsam, võrreldes kasvajatega, kus on madalam ekspressiooniga (Duncan jt., 2007; Rakha jt., 2005). Varajases staadiumis rinnavähi ning loomuliku humoraalse vastusega MUC3 suhtes patsientidel on

9 metastaseerumise tõenäosus pisem ning elulemus on parem. Seega MUC3-vastased antikehad võivad kontrollida kasvajarakkude paljunemist ja levikut (von Mensdorff-Pouilly jt., 2000). Mutsiine kasutatakse samuti fenotüüpiliste markeritena kasvajate puhul. Lisaks saab nende abil kindlaks teha metastaseerunud kasvaja algkolle (Jonckheere ja Van Seuningen, 2010). MUC3 glükosüülimismustri muutumine vähihaiguste korral toob nähtavale epitoobid, mis normaalsetes rakkudes ekspresseeritud ja avaldunud MUC3 puhul on kaetud pikkade suhkruahelatate poolt (Taylor-Papadimitriou jt., 2002). Tänu sellele on võimalik antikehade saamine, mis kasvajal ja normaalsel rakul vahet teevad. Vähkkasvajaga seotud rakkudes leitud erinevused glükosüülimises avaldavad mõju ka B- ja T-rakkudele paljastuvate epitoopide profiilis, tänu sellele on MUC3 vastu huvi kui vähiga seotud antigeeni vastu (Taylor-Papadimitriou jt., 2002). Teaduslike uurimuste abil on tõendeid, et olles ise antigeeniks võib MUC3 indutseerida nii rakulist kui humoraalset immuunsust patsientidel, kellel on diagnoositud rinnavähk, kuid toime pole piisavalt tugev, et kasvajat hävitada (Taylor-Papadimitriou jt., 2002). Kasvajate pärssiv võime immuunsüsteemi efektorrakkudega funktsioonidele on hästi uuritud ja tõenäoliselt võib see olla seotud MUC3 ekspressiooniga raku pinnal (Taylor-Papadimitriou jt., 2002). Mutsiinid võivad immuunvastust mõjutada erineval moel. Nad võivad tekitada läbimatu barjääri immuunsüsteemi rakkudele; võivad immuunsüsteemi mõjutavate rakkude aktiivsust pärssida retseptor-ligandi interaktsiooni kaudu (näiteks mutsiinide EGF-taolised domäänid); võivad seondudes blokeerida tsütokiine ja muid aineid, mis võivad immuunsüsteemi aktiveerida (Hollingsworth ja Swanson, 2004). MUC3-l on seega nii immuunsüsteemi stimuleeriv kui ka takistav funktsioon (Brayman jt., 2004). Kemoterapeutiliste ühendite ja antikehade ligipääs vähirakkudele on takistatud membraanseoseliste mutsiinide ekstratsellulaarse domääni glükosüülituse tõttu. Glükoahelatest moodustunud hüdrofiilsete omadustega regioonist on hüdrofoobsete kemoterapeutikumide läbipääs takistatud ja seega ravimite jõudmine rakus asuvate sihtmärkideni on blokeeritud. Nii nagu mutsiinide moodustatud barjäär kaitseb patogeenide eest, võib see pärssida terapeutiliste teoimeainete mõju rakkudele (Hattrup ja Gendler, 2008). 1.4 MUC3 struktuur MUC3 on suur membraanseoseline glükoproteiin, mis ekspresseerub soole sekretoorsete epiteelirakkude apikaalses osas (Tang ja Apostolopoulos, 2008). MUC3 geen

10 kodeerib transmembraanset mutsiintüüpi glükoproteiini. Suur hulk järjestikuseid ühenukleotiidilisi muutusi täheldati erinevates MUC3 cdna-des, mis võimaldab oletada vähemalt kolme erineva transkripti olemasolu. Transkriptide heterogeensuse põhjuseks on MUC3 geeni topeltkordused ja alleelide olemasolu. MUC3 esimese korduse järjestuse põhjal võib öelda, et tal on sama C-terminaalne domään ja intronite / eksonite struktuur kui teisel MUC3-l. Tandemkorduste domäänil on samasugune aminohapete konsensusjärjestus, aga ta sisaldab rohkem asendusi. Artikli autorid on välja pakkunud nimetada teist geeni MUC3B ja MUC3 jätta MUC3A tähistuseks. Unikaalne eksonite järjestus varieerub nukleotiidse identsuse poolest vahemikus %. Intronite puhul on identsus 95%. cdna kloonide põhjal võib öelda, et mõlemat geeni ekspresseeritakse sooles ja CaCo-2 rakuliinis (Pratt, Crawley jt., 2000; Williams, Munster jt., 1999). MUC3 molekulmass on umbes kda, mis suureneb tänu glükosüülimisele kda (Brayman jt., 2004). MUC3 ulatab nm kaugusele raku pinnast (Tang jt., 2008). Esimesed MUC3 cdna kloonid eraldati aastatel inimese soole cdna raamatukogust (Gum jt., 1990). Kaks neist kodeerisid 17 aminohappe pikkuseid seriini ja treoniini rikkaid tandemjärjestusi. Kordusjärjestus koosneb 20 kordusest, millele järgneb unikaalne regioon, mis on samuti seriini, treoniini ja proliini rikas. Need kaks eraldiseisvat Ser/Thr/Pro järjestust on kodeeritud unikaalse eksoni poolt. Regioonile järgnevad kaks EGF moodulit, kaks oletatavat transmembraanset motiivi ja 72 aminohappe pikkune tsütoplasmaatiline saba (Crawley jt., 1999; Gum jt., 1997). Kaks EGF domääni külgnevad SEA domääniga. SEA domään, sisaldab minimaalselt 120 aminohapet, milledest 60% on konserveerunud ning paikneb reeglina ekstratsellulaarses domäänis di- või multimeersetel membraanseoselistel mutsiinidel. SEA domäänis paikneb proteolüütilise lõikamise koht ja aminohapetest koosnevad järjestused, mis on vajalikud valgu subühikute kokkupanekuks (Wreschner, McGuckin jt., 2002; Bork ja Patthy, 1995). MUC3A geen koosneb vähemalt 13 eksonist ning kolmas ekson kodeerib Ser/Thr/Pro järjestust (Moniaux jt., 2006). Tsentraalne ekson vastutab VNTR-korduste eest (Kyo jt., 1999) ning kasutades RT-PCR meetodit Caco-2 rakkude RNA analüüsimisel arvatakse, et väike osa MUC3A transkriptidest on läbinud alternatiivse splaisingu. MUC3 α-ahel osaleb rakkude adhesioonis. MUC3 võib toimida nii adhesioonilise kui ka anti-adhesioonilise molekulina. MUC3 osaleb samuti kaitsebärjaari moodustumises, mis kaitseb epiteelkudesid füüsiliste ja keemiliste tegurite eest (Hollingsworth ja Swanson, 2004). MUC3 β-ahel on seotud mitme erineva rakkudevahelise signaalrajaga, mis indutseerivad rakkude jagunemist ja kasvu (Behrens jt., 2010). MUC3 β-ahela tsütoplasmaatiline domään on seotud rakkude

11 signalisatsiooniradadega, mis on reguleeritud tsütoplasmaatilise domääni 5 (on kinnitsust leidnud) ja 7 (potentsiaalne) türosiini, seriini ja treoniini fosforüülimisega (Kufe, 2009). Joonis 2. MUC3 struktuur. Ekstratsellulaarne α-ahel koosneb peamiselt varieeruvaist tandemkordustest. β-ahel koosneb lühikesest ekstratsellulaarsest piirkonnast (sisaldab SEA ja EGF domääni), transmembraansest ja tsütoplasmaatilisest piirkonnast. ( 1.5 MUC3 funktsioonid MUC3 ekspresseeritakse normaalses respiratoor-, urogenitaal-, gastrointestinaal- ja maksa-sapiteede epiteeli apikaalsel pinnal (Hollingsworth ja Swanson, 2004; Gendler, 2001). Lisaks epiteelrakkudele on MUC3 glükoproteiini ekspresseerumist kirjeldatud ka testiserakkudes, tserebraalses korteksis ja südamelihase rakkudes (Brayman jt., 2004; Kamoshida jt., 1998; Agrawal jt., 1998). MUC3 eskpressioon epiteelrakkudes võib olla üsna dünaamiline sõltuvalt reageerimisest erinevatele teguritele (Brayman jt., 2004). Tavalised kasvufaktorid (EGF, TGF-β) või pro-põletikulised faktorid (IFN-γ, TNF-α) on samuti MUC3 geeni regulaatoriteks (Jonckheere ja Van Seuningen, 2010). Olulist rolli MUC3 ekspressiooni reguleerimisel mängivad ka tsütokiinid (Brayman jt., 2004). Lisaks MUC3 teadaolevatele funktsioonidele nagu näiteks epiteelirakkudega kaetud pinna niisutamine, kaitse ja barjääri moodustamine, on MUC3 seotud veel epiteeli morfogeneesi-, rakkudevahelise interaktsiooni-, rakusisese signaalide- ning

12 immuunregulatsiooniga (von Mensdorff-Pouilly jt., 2011; Kufe, 2009; Agrawal ja Longenecker, 2005). Mutsiine on palju uuritud ka hingamisteedes. Erinevad teadusuuringud hiirtel on näidanud, et Muc3 ekspressioon korreleerub polariseerunud epiteeli formeerumisega mitmetes kudedes, ka kopsus (Braga jt., 1992). Keskkonna faktorid, toksiinid ja patogeenid suurendavad olemasolevate mutsiinide taset hingamisteedes (Braga jt., 1992; Stonebraker jt., 2004). Mutsiinide suurenenud avaldumine hingamisteedes on kopsuhaiguse (CF, astma, bronhiit) tunnuseks (Hattrup ja Gendler, 2008). See annab võimaluse kasutada MUC3 markerina erinevate kopsuhaiguse puhul. Mutsiinid on hetkel uurimise all kui potentsiaalsed diagnostilised markerid (Hattrup ja Gendler, 2008; Hollingsworth ja Swanso, 2004). MUC3 ekspresseerub enne menopausi algust naise emakas mesenhümaalsetes rakkudes ning ekspresseerub pärast menopausi emaka näärmerakkudes (Brayman jt., 2004). Ka seerumis suureneb mutsiinide tase raseduse ajal märgatavalt (Croce jt., 2001). Arvatavasti kaitseb MUC3 emaka limaskesta. Katse Muc3 -/- fenotüübiga hiirtel, keda hoiti patogeenidega keskkonnas näitas, et neil esines sageli reproduktiivtraktiga ja emakaga seotud infektsioone (DeSouza jt., 1999). MUC3 on leitud ka pankrease näärmerakkudes, maosooletraktis, käärsooles ja peensooles (Gendler, 2001). MUC3 on peamine membraaniga seotud mutsiin kõhunäärmes, eelkõige aatsinusrakkude tsütoplasmas ning apikaalselt juha rakkudes, mao limaskesta ülemises osas, südamelihases müotsüütides (Jonckheere ja Van Seuningen, 2010). MUC3 kõige paremini kirjeldatud funktsioonid on seotud limaskihtidega: hüdratsioon, lubrikatsioon, kaitse erinevate proteaaside ja patogeenide eest (Hollingsworth ja Swanson, 2004; Knowles ja Boucher, 2002; Gendler, 2001). MUC3 ulatuslik glükosüülimine tekitab hüdrofiilse keskkonna, mis on igati sobiv epiteelide niisutamiseks ja lubrikatsiooniks. Lisaks hoiavad valgu suur skelett ja tihedalt paikevad suhkrute külgahelad ära potentsiaalse juurdepääsu raku pinnale. Tugevast glükosüülimisest tingitud ruumilised pinged tekitavad mutsiinidel laienenud pudeliharja taolise struktuure (Carraway jt., 2003). Valguskelett laieneb ja suhkruahelad hargnevad molekuli teljelt laiali nagu harjased (Gendler, 2001; Lamblin jt., 2001). MUC3 võib ulatuda kuni 1500 nm rakumembraanist välja, samas enamik raku pinnal paiknevad valgud jäävad sellest pinnast 10 nm võrra seespoole (Jentoft, 1990). Membraanseoselised mutsiinid laienevad rakupinnast kaugemale kui enamik rakuväliseid retseptoreid, tekitades mehhanisme, mille kaudu mutsiinid saavad blokeerida rakkude ja patogeenide kinnitumist (Wesseling jt., 1995; Bramwell jt., 1986). Seega mutsiinid võivad funktsioneerida ruumilise, steerilise ja

13 elektrostaatilise barjäärina, takistamaks juurdepääsu epiteelile (Kufe, 2009; Hattrup ja Gendler, 2008). Erinevad uuringud on näidanud, et MUC3 kaitseb soole luumenit (McGuckin jt., 2007). Mutsiinide molekulid omavad võimet siduda organismi sattunud baktereid ja muid võõrorganisme, et neid organismist eemaldada. Erinevate süsivesikute kõrvalahelate segane ekspressioon võib tähendada, et mutsiinid on võimelised siduma paljusid erinevaid baktereid, viiruseid ja organismi sattunud võõrosakesi. Antud mehhanismi abil saab toimuda peaaegu kõigi sissehingatud võõraste aineosade kõrvaldamine hingamisteedest (Knowles ja Boucher, 2002; Gendler, 2001). Mutsiinid võivad omada nii anti- kui proadhesiivset võimet. MUC3 korral moodustavad valguskelett ja süsivesikute erinevad modifikatsioonid palju epitoope erinevatele adhesioonimolekulidele (Gubbels jt., 2006; Rump jt., 2004; Gendler, 2001). Rakkude signaliseerimisel osalevad nii mutsiinide rakuvälised kui ka rakusisesed piirkonnad (Singh ja Hollingsworth, 2006). MUC3 tsütoplasmaatiline osa on ainus domään, mis on konserveerunud erinevate liikide vahel, mis viitab funktsionaalsele olulisusele (Walsh jt., 2000). Erinevad teadusuuringud näitavad, et inimpäritolu MUC3-CT-st leitud seitsmest türosiini jäägist kuus olid 100%-liselt konserveerunud (Spicer jt., 1995). Türosiinid koos teiste MUC3-CT seriinide ja treoniinidega moodustavad kinaasiga seostuvaid asukohti ning võivad olla fosforüleeritud in vivo ja in vitro (Singh jt., 2007; Schroeder jt., 2001). Normaalsetes rakkudes asetleidvad interaktsioonid võivad erineda sellest, mis toimub kasvajarakkude puhul (Hattrup ja Gendler, 2008).. MUC3 on atraktiivne ja uurimise all olev valk, kuna omab olulist rolli nii kasvajate biomarkerina ja lisaks potentsiaalse terapeutilise sihtmärgina vähijuhtumite korral (Wang jt., 2007; Hollingsworth ja Swanson, 2004). 1.6 MUC3 kasvajakoes Mitmed uuringud inimeste kasvajatega seoses on näidanud, et vähipatsientide seerumis on kõrgenenud MUC3 hulk (Gold jt., 2006; Croce jt., 2003). MUC3 valgu üleekspressiooni on täheldatud umbes 74% kõigist vähkkasvajatega seotud juhtumitest (Ren jt., 2004). MUC3 üleekspressiooni kirjeldatakse soole-, eesnäärme-, rinna-, munasarja-, kopsu-, põie-, maksa- ja kõhunäärmevähi korral (Gendler, 2001). MUC3 eskpressioon tõuseb vastavalt sellele, kuidas kasvaja areneb (Rabassa jt., 2006; Nagai jt., 2006). Lisaks on täheldatud MUC3 üleekspressiooni melanoomi ja testise vähi puhul (Kufe, 2009). Üldiselt

14 MUC3 kõrge tase annab eeliseid kasvajarakkude arenemiseks (Hattrup ja Gendler, 2008). MUC3 lokalisatsioon erineb normaalsetes ja kasvajatele omastes rakkudes. MUC3 ekspresseerub reeglina epiteelirakkude apikaalsel pinnal (Hollingsworth ja Swanson, 2004; Gendler, 2001) vastandina adhesiooni molekulidele ja kasvufaktori retseptoritele, mis lokaliseeruvad epiteelrakkude basaalsetel ja lateraalsetel pindadel (Singh ja Hollingsworth, 2006). Erinevate kasvajate korral ekspresseerub MUC3 tugevasti üle kogu rakupinna. Koos polaarsuse kadumisega, mis on seotud epiteeli stressi või transformatsiooniga, leiab aset MUC3 ümberpaiknemine epiteelrakkude kogu membraani ulatuses, andes MUC3-le võimaluse interakteeruda türosiini kinaasidega, mis üldjuhul paikneksid basolateraalselt. Niimoodi võtab MUC3 osa rakkude signaaliradadest (Kufe, 2010). MUC3 tsütoplasmaatiline domään funktsioneerib substraadina fosforüleerimisel. Fosforüleerimine annab võimaluse paremateks interaktsioonideks teiste rakkudega (Kufe, 2009). MUC3 valk on defektselt glükosüülitud kasvajarakkudes lisaks depolariseeritusele. Suurenenud on suhkrutega seotud glükosüülimiskohtade hulk, aga süsivesinikahelad on lühemad ning sisaldavad normaalsele MUC3-le mitteiseloomulikke ahelaid (von Mensdorff- Pouilly jt., 2011). See on tingitud sellest, et MUC3 üleekspressiooniga kasvajate puhul muutub ka glükosüültransferaaside profiil (Taylor-Papadimitriou jt., 2002). Spetsiifilised valguskeletiga seotud suhkrute ahelad sõltuvad konkreetsest rakutüübist. Lisaks sõltub glükosüülimise ulatus füsioloogilisest seisundist, mille käigus MUC3 on ekspresseerunud (Parry jt., 2001). Valguskeleti suuruse sõltuvus VNTR polümorfismidest, muudab MUC3 väga polümorfseks valgumolekuluks (Müller jt., 1997). MUC3 O-glükosüülimise muster VNTR-l on erinev võrrelduna normaalsetes epiteelrakkudes ja kasvajarakkudes. Vähirakkudega seotud MUC3-l on pisemad ja mitte nii tihedad O-glükaanahelad, pakkudes uusi regioone valguskeletil (von Mensdorff-Pouilly jt., 2011). MUC3 ekspressiooni esines mõõdukalt kuni kõrge tasemeni 76% kasvajatest. Osad teadusuuringud on näidanud, et MUC3 võib olla väheesinev käärsoole vähktõve puhul võrreldes normaalse soolega (Rakha jt., 2005; Cao jt., 1997). Rakha jt. näitasid oma töös, et MUC3 ekspressiooni esineb 91% juhtudest rinnavähi puhul. Wang näitas oma uurimuses, et MUC3 suurenenud ekspressioon maovähi puhul halvendas prognoosi. Kuigi MUC3 ekspressioon oli suurem metastaseerunud juhtudel (p < 0.01) ja kliinilise staadiumi III-IV puhul võrreldes I-II (p < 0.05). MUC3 ekspressioon progresseerus intraepiteliaalse pankreaatilise neoplaasia puhul ja oli kõrgelt ekspresseerunud juhade adenokartsinoomi puhul (Duncan jt., 2006; Williams jt., 1999).

15 MUC3 roll adhesiooni modifitseerijana kaitsmaks patogeenide vastu, omab negatiivseid külgi, juhul kui kasvajarakud seda funktsiooni negatiivselt mõjutama hakkavad. Lisaks võib MUC3 antiadhesiooniline võime ehk adhesiooni takistamine segada ka immuunvastuse rakkude ligipääsu kasvajarakkudeni (Carraway jt., 2005; Gendler, 2001). Niiviisi võivad kasvajad põgeneda immuunsüsteemi eest. Probiootikum Lactobacillus plantarium indutseerib MUC3 mutsiini ja inhibeerib EPEC (enteropatogeenne Escherichia coli) kleepumist, osutades sellele, et suurenenud mutsiinikiht ja glükokaalüks soolestiku epiteelis ja seondumiskohtade hõivamine Lactobacillus spp poolt pakuvad kaitset patogeenide invasiooni vastu (Smith, Caper, 1995). MUC3 seotus vähiga võib olla tingitud MUC3 β-ahela tsütoplasmaatilise osa ja signaliseerivate molekulide omavahelistest interaktsioonidest, samas kui kasvajate puudumine hiirtel, kellel ei ole Muc3 tandemkorduseid, annab alust arvata, et α-ahela funktsioonid (adhesiooni moduleerimine) on seotud lisaks metastaseerumisele ka onkogeneesiga (Hattrup ja Gendler, 2008). MUC3 olemasolu pidurdab kemoteraapia toimet (Wei jt., 2005; Raina jt., 2004; Ren jt., 2004). Viimasel ajal on leitud, et MUC3 toimib ka galektiin-3 loodusliku ligandina inimese kasvajarakkudes ja tsirkuleeriva galektiin-3 ning MUC3 omavaheline interaktsioon tundub soodustab vähirakkude endoteeliga seondumist ning seega võimendab metastaseerumist (Zhao jt., 2009).

16 EKSPERIMENTAALNE OSA 2.1 Töö eesmärgid Käesoleva magistritöö peamiseks eesmärgiks oli iseloomustada ja välja valida MUC3 β- ahela vastased kõrge spetsiifikaga monoklonaalsed antikehad, et tulevikus kasutada neid MUC3 ekspressiooni ja funktsioonide uuringutes ja ka diagnostikas.

17 2.2 Materjal ja metoodika MUC3 β-ahela ekstratsellulaarse domääni vastased monoklonaalsed antikehad on saadud TÜ ÜMPi-s hiirte immuniseerimisel 2 sünteetilise peptiidiga (MUC3A ja MUC3B) (Joonis 3). Hiiri immuniseeriti kahe erineva sünteetilise peptiidiga, mis seoti KLH valguga: MUC3A - APTGYEEFYFPLVEATRLRC (aminohapped ) MUC3B - PFSPQLESEYEQVKTTLKE (aminohapped valgu SEA domäänis) MUC3A SQMTTQSTLT TTAGTCDNGG TWEQGQCACL PGFSGDRCQL QTRCQNGGQW DGLKCQCPST FYGSSCEFAV EQVDLDVVET EVGMEVSVDQ QFSPDLNDNT SQAYRDFNKT FWNQMQKIFA DMQGFTFKGV EILSLRNGSI VVDYLVLLEM PFSPQLESEY EQVKTTLKEG LQNASQDANS CQDSQTLCFK PDSIKVNNNS KTELTPEAIC RRAAPTGYEE FYFPLVEATR LRCVTKCTSG VDNAIDCHQG QCVLETSGPA CRCYSTDTHW FSGPRCEVAV HWRALVGGLT AGAALLVLLL LALGVRAVRS GWWGGQRRGR SWDQDRKWFE TWDEEVVGTF SNWGFEDDGT DKDTNFHVAL MUC3-transmembraanne osa SEA regioon EGF-sarnane regioon MUC3 proteolüütiline sait MUC3A peptiid MUC3B peptiid

18 Joonis 3. MUC3 β-ahel ja immuniseerimiseks valitud peptiidide asukoht ( ; MUC3 β-ahela-spetsiifiliste monoklonaalsete antikehade iseloomustamine ja edasiseks tööks vajalike antikehade väljavalimine toimus järgmiselt: 1) Hübridoomide skriinimine ELISA meetodil kasutades antigeenina peptiide MUC3A ja MUC3B; 2) Rakuliinide iseloomustamine MUC3 ekspressiooni suhtes kasutades kommertsiaalseid polüklonaalseid antikehi; 3) ELISA-l positiivsete MUC3 antikehade spetsiifika kontroll erinevate rakuliinide lüsaatidel Western blot i meetodil; 4) Western blot il positiivsete MUC3 antikehade seostumise kontroll erinevatel MUC3 valku ekspresseerivatel ja mitteekspresserivatel rakuliinidel immuunotsütokeemia meetodil; 2.3 Kasutatud antikehad MUC3 vastaste polüklonaalsete antikehadena kasutati: 1) Anti-MUC3 α-ahela vastaseid küüliku antikehad (ab1), saadud sünteetilise peptiidi vastu järjestusega MLCADVVETEVGMEVSVDQQFSPDLNDNTSQAYRDFNKTFWNQMQKIFAD (Sigma- Aldrich, Lot: QC24454, SAB UG, USA); 2) Anti-MUC3 β-ahela vastaseid küüliku antikehad (ab2), saadud sünteetilise peptiidi vastu järjestusega DQDRKWFETWDEEVVGTFSNWGFEDDGTDKDTNFHVALENVDTTMKVHIKCT (Sigma-Aldrich, Lot: QC24999, SAB UG, USA). Sekundaarsete antikehadena kasutati peroksüdaasiga konjugeeritud küüliku IgGvastaseid kitse antikehi, peroksüdaasiga konjugeeritud küüliku IgG-vastaseid kitse antikehi (LabAs, Tartu) ja Alexa 488-ga konjugeeritud hiire IgG-vastaseid kitse antikehi (Invitrogen).

19 2.4 Kasutatud rakuliinid Käesolevas töös kasutatud inimese rakuliinid on esitatud Tabelis 1. Rakke kasvatati RPMI1640 vedelsöötmes (PAA, Austria), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (FCS, PAA, Austria) ja antibiootikumina gentamütsiini (GIBCO). Rakke kasvatati temperatuuril 37 C, 5% CO 2 keskkonnas koekultuuri inkubaatoris (Galaxy S+ Incubator, RS Biotech). Tabel 1. Töös kasutatud inimese rakuliinid A-549 kopsu adenokartsinoom Bowes melanoom PANC-1 kõhunäärme kartsinoom JAR platsenta koorionikartsinoom Capan-2 kõhunäärme kartsinoom DLD-1 jämesoole adenokartsinoom Caco-2 jämesoole adenokartsinoom MKN-28 mao adenokartsinoom MKN-45 mao adenokartsinoom HEK293 embrüonaalsed neerurakud MDA-MB-231 rinna adenokartsinoom A-172 aju glioblastoom 2.5 MUC3 monoklonaalsete antikehade seostumise tuvastamine peptiididel 96-augulisele ELISA plaadile (Nunc, Maxisorp) kanti 100 µl/kannu peptiidi lahust 5 μg/ml PBS-s. Plaati hoiti üle öö +4 C juures. Plaati blokeeriti 30 min PBS-Tweenkaseiiniga, kasutades kannu kohta 200 µl blokeerimislahust. Plaadi kannudesse lisati 50 µl PBS-Tweeni ning 50 µl uuritavad hübridoomide superit. Plaati inkubeeriti seejärel loksutil (600 r.p.m.) toatemperaatuuril 60 min. Plaati pesti 3x PBS-Tweeniga, kasutades kannu kohta 200 µl pesulahust. Plaadile kanti 100 µl/kannu hiire IgG vastaseid peroksüdaasiga märgistatud kitse antikehi (GAM-HRP) PBS-Tweenis lahjenduses 1:2000 (5µl/10ml). Plaati inkubeeriti seejärel 30 minutit toatemperatuuril loksutil. Seejärel pesti plaati 3x PBS- Tweeniga. Kannu kohta lisati 100 µl substraadi lahust, inkubeeriti toatemperatuuril 10

20 minutit, reaktsioon peatati 50 µl 3M väävelhappe lisamisega ning loeti automaatsel spektrofotomeetril sobival lainepikkusel (TMB substraadil on see 450nm). 2.6 SDS-PAGE geelelektroforees ja valkude ülekanne polüvinüülideendifluoriid (PVDF) filtrile Western blot meetodil SDS-PAGE forees viidi läbi 4-12% gradientgeelis kasutades Hoefer SE 280 (Hoefer Scientific Instruments, CA, USA) ja Consort (Consort bvba, Belgia) elektroforeesi aparaati. Valkude molekulmassi määramisel kasutati markervalkude segu (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific). Pärast elektroforeesi tasakaalustati geel katoodi puhvris (25 mm Tris, 40mM glütsiin, 0,1% SDS, ph 8,4) 15 min jooksul loksutil toatemperatuuril. Järgmiseks asetati geel Immobilon TM polüvinüülideendifluoriid (PVDF) filtrile (Millipore), mis oli immutatud metanoolis ja seejärel bidestilleeeritud vees. Valkude ülekanne toimus 2 tundi toatemperatuuril voolutugevusega 0,8 μa/cm 2. Selleks kasutati LKB Bromma 2117 MultiphorII Electrophoresis Unit aparaati. Mittespetsiifilise seostumise blokeerimiseks inkubeeriti membraani 30 minutit PBS- Tweenis (0,05%), mis sisaldas 1% kaseiini. Seejärel inkubeeriti membraani vastavate MUC3 vastaste monoklonaalsete antikehadega 60 min toatemperatuuril või üleöö 4 C juures. Järgnevalt pesti membraane 5x5 minutit PBS 0,05% Tween-ga. Sekundaarse antikehaga, milleks oli peroksüdaasiga konjugeeritud hiire IgG-vastane kitse antikeha (lahjendusega 1:1000), inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril loksutil. Seejärel korrati pesu 5 korda 5 minutit PBS 0,05% Tween-s ja 1x10 minutit PBS-s. Valgud toodi PVDF filtril nähtavaks reaktsiooniseguga, milleks oli 0,05 %-line 3,3- diaminobenzidiintetrahüdrokloriidi hüdraadi (DAB; Sigma-Aldrich, USA) ja 6%-lise kloronaftooli (Sigma, MO, USA), 0,05% H2O2 (Merck, Darmstadt) lahus PBS-s. Inkubeeriti 5-10 minutit toatemperatuuril. Värvusreaktsiooni peatamiseks pesti membraani Milli-Q kvaliteediga veega 3x5 minutit. Peale seda membraan kuivatati ja analüüsiti tulemusi.

21 2.7 Caco-2 rakkude immuunotsütokeemiline analüüs Rakkudel lasti kinnituda katteklaasidele ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdi lahusega PBS-s toatemperatuuril 5 minutit ning pesti 3 korda 5 minutit PBS-s. Seejärel töödeldi rakke 50 mm ammooniumkloriidiga (NH 4 Cl) PBS-s toatemperatuuril 10 minutit ja pesti 2 kord PBS-s. Permeabiliseerimiseks töödeldi rakke 0,1% Triton X-100 lahusega PBS-s 10 minutit, pesti 1 kord 5 minutit PBS-s ja blokeeriti blokeerimislahuses (0,3% kaseiin, 0,01% Tween 20 PBS-s) 1 tund toatemperatuuril või üleöö 4 C juures. Pärast blokeerimislahuse eemaldamist inkubeeriti rakke primaarsete antikehadega 1 tunni jooksul toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist pesti rakke vähemalt 3 korda PBS-s. Seejärel inkubeeriti rakke Alexa 488-ga konjugeeritud hiire IgG-vastaste kitse antikehadega (Molecular Probes, Eugene, USA) (1:1000) 1 tunni jooksul toatemperatuuril ja pesti PBS-s vähemalt 3 korda 5 minutit, kusjuures lõpuks lisati PBS-le 10 μl 4'-6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI; 1μg/ml) tuumade nähtavaks tegemiseks. Pärast destilleeritud vees loputamist sulundati klaasid Prolong Gold Antifade ga (Molecular Probes). Rakke analüüsiti mikroskoobiga Olympus BX (objektiiv UplanFI 20x/0.50, 40x/0.75, 100x/1.30 Oil Iris). Tulemused pildistati kaameraga Olympus DP50-CU. 2.8 CaCo-2 mõjutamine antikehadega Rakke kasvatati koekultuuris, eemaldati sööde ja pesti 1 x PBS-ga (PAA, Austria), rakud eemaldati plastikult 10 ml 0,025% trüpsiin/0.02% EDTA lahusega ja paigutati 10 min 37 C termokappi. Trüpsiini toime peatamiseks kanti rakkudele peale 5 ml söödet. Peale seda kanti rakkude suspensioon 15 ml tuubi, milles oli 5 ml seerumiga söödet ning sadestati 10 min jooksul ja 200 g juures. Rakud loendati Funch-Rosenthali loenduskambris ning kanti edasi 24 kannulistele plaatidele (Nunclon 24-Well, Taani), tihedusega 1250, 2500, 5000 ja rakku kannu kohta. Kõikidesse aukudesse lisati 0,5 ml söödet. Seejärel lisati rakkudele MUC3 vastased monoklonaalsed antikehad. Antikeha lisati juurde 2 korda 48 tunniste vahedega, lõppkontsentratsioonis 100 μg/ml. Rakke kasvatati koekultuuri inkubaatoris 37 C ja 5% CO 2 juuresolekul 2 nädalat. Rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdi (PFA) lahusega PBS-s toatemperatuuril 15 minutit ning pesti 2 korda destilleeritud veega (1 ml). Rakke värviti 1% kristallvioletiga 70% metanoolis 20 min. Peale värvimist pesti rakke 3 korda destilleeritud veega ning kuivatati pimedas toatemperatuuril. Peale kuivamist lisati neile 10% äädikhappe

22 lahust ning loksutati loksutil 20 min toatemperatuuril. Edasi võeti igast kaevukesest 300 μl spensiooni ning kanti mikrotiiterplaadile (Nunc TM F96 MicroWell Plates, Taani) ja mõõdeti spektrofotomeetril (TECAN Sunrise Remote Microplate Reader, Šveits) optiline tihedus 620 nm juures.

23 Tulemused 3.1 Hübridoomide skriinimine ELISA meetodil kasutades antigeenina peptiide MUC3A ja MUC3B MUC3A ja MUC3B hübridoomide skriinimisel ELISA meetodiga selgus, et positiivse tulemuse MUC3A peptiidiga andis 80 erinevat klooni. (26 klooni need andsid positiivse reakstiooni Westernil (ei saa aru!!) MUC3B peptiidiga saadi 93 positiivset klooni. Positiivse tulemuse andnud kloone kasutati edasi Western Bloti meetodiga analüüsimiseks. 3.2 Rakuliinide iseloomustamine MUC3 ekspressiooni suhtes kasutades kommertsiaalseid polüklonaalseid antikehi MUC3 ekspressiooni tuvastamiseks kasutati Western blot meetodit, kommertsiaalseid küüliku polüklonaalseid antikehi ning erinevaid kasvajarakuliinide lüsaate (Tabel 1.). Positiivne reaktsioon tuvastati CaCo-2 rakkude lüsaadist, mida oli kirjanduse põhjal ka oodata ja üllatusena ka MUC3 Bowes rakkudel, mida ei ole varem kirjeldatud (Joonis 4.). Hilisema töö käigus kasutati negatiivse kontrollina rakuliini Capan-2. Positiivse reaktsiooni andis ainult α-ahela vastane polüklonaalne küüliku antikeha, teine antikeha andis suure hulga mittespetsiifilisi triipe.

24 Joonis 4. MUC3 ekspressioon rakuliinidel (8-24% SDS-PAGE). Primaarse antikehana kasutati anti-muc3b (ab1) vastast küüliku antikeha, mis oli saadud peptiidi järjestuse MLCADVVETEVGMEVSVDQQFSPDLNDNTSQAYRDFNKTFWNQMQKIFAD vastu (Sigma-Aldrich, Lot: QC24454, SAB UG, USA), 1:1000. Sekundaarsete antikehadena kasutati peroksüdaasiga konjugeeritud hiire IgG-vastaseid antikehi GAM-HRP (1:1000). 3.2 ELISA meetodi abil tuvastatud MUC3 positiivsete antikehade spetsiifika kontroll erinevate rakuliinide lüsaatidel Western blot i meetodil Western blot meetodil testiti 105 hübridoomi (Joonis 7.) Väljavalituks osutusid positiivse reaktsiooni andnud MUC3A 7C10, 8F1, 8H4, 9A2 ja MUC3B 1G1, 2E12, 3H5, 4A4, 4F1, 5D8, 5E4, 7G2, 7H10, 8H4, 9A9, 9B8, 9C7, 10G10, milledega teostati hiljem CaCo-2 ja Bowesi ning Capan-2 lüsaatidel täiendav spetsiifika kontroll. Positiivse kontrollina kasutati MUC1-2A3.1, mis annab positiivse bändi ~25 kda juures (MUC3 β-ahel ~45 kda).

25 Joonis 7. Hübridoomide skriinimine Western blot meetodil. Positiivse kontrollina kasutati MUC1-2A Western blot il positiivsete MUC3 antikehade seostumise kontroll erinevatel MUC3 valku ekspresseerivatel ja mitteekspresserivatel rakuliinidel immuunotsütokeemia meetodil. Väljavalituks osutunud MUC3A 7C10, 8F1, 8H4, 9A2 ja MUC3B 1G1, 2E12, 3H5, 4A4, 4F1, 5D8, 5E4, 7G2, 7H10, 8H4, 9A9, 9B8, 9C7, 10G10, spetsiifilisemal testimisel CaCo-2 ja Bowesiga ning Capan-2 lüsaatitega andsid positiivse tulemuse ~45 kda juures MUC3B 1G1.1, 2E12.1, 3H5.1, 4A4.1, 7G2.1, 8H4.1, 9A9.2, 9B8.1, 9C7.1, 10G10.1 ja 10H2.1. MUC3B 4A4.1 puhul andis CaCo-2 positiivse bändi ja lisaks mittespetsiifilised bändid ka Capan-2 puhul ~250 kda juures. MUC3B 8H4.1, mis andis tugeva signaali ELISA puhul, ei andnud Westernil ühtegi bändi (Joonis 8.)

26 Joonis 8. MUC3 antikehade spetsiifika kontroll. Sekundaarse antikehana kasutati peroksüdaasiga konjugeeritud hiire IgG-vastast antikeha GAM-HRP.

27 3.4 MUC3 antikehade seostumise kontroll erinevatel MUC3 valku ekspresseerivatel ja mitteekspresserivatel rakuliinidel immuunotsütokeemia meetodil MUC3 β-ahela spetsiifika ja täpsema lokalisatsiooni uurimiseks kasutati tugevalt MUC3 valku ekspresseerivat rakuliini CaCo-2. Rakud fikseeriti katteklaasidel 8% paraformaldehüüdi (PFA) lahusega, et uurida antikehade seostumist rakupinnale. MUC3 rakusisese lokalisatsiooni uurimiseks permeabiliseeriti rakke 0,1% Tritone X-100 lahusega. Analüüsi tulemuste alusel selgus, et MUC3B vastased monoklonaalsed antikehad 7G2.1 (Joonis 9, 3) ja 9C7.1 (Joonis 9, 5) ei anna reaktsiooni permeabiliseerimata rakkudel. Tuvastatava reaktsiooni annavad MUC3B 3H5.1 nii permeabiliseeritud kui permeabiliseerimata rakkudel, 7G2.1 ja 9C7.1 permeabiliseeritud rakkudel (Joonis 9, 4 ja Joonis 9, 6). Permeabiliseerimata MUC3B 3H5.1 puhul paikneb β-ahel üle kogu rakumembraani ja raku piirjooned on hästi näha, millest võib järeldada, et β-ahel paikneb plasmamembraanis. Permeabiliseeritud rakkude puhul on väga nõrgalt võimalik täheldada iseloomulikku reaktsiooni tuumas, spetsiifiline värving koondub tuuma ümber põhiliselt.

28 Joonis 9. Immuunotsütokeemiline analüüs. MUC3 antigeeni ekspressioon CaCo-2 rakuliini rakkudes. Kasutatud on erinevaid MUC3 β-ahela vastaseid antikehi: 1. MUC3B 3H5.1, rakud permeabiliseerimata; 2. MUC3B 3H5.1, rakud permeabiliseeritud 3. MUC3B 7G2.1, rakud permeabiliseerimata; 4. MUC3B 7G2.1, rakud permeabiliseeritud 5. MUC3B 9C7.1, rakud permeabiliseerimata; 6. MUC3B 9C7.1, rakud permeabiliseeritud 7. neg. kontroll, rakud permeabiliseerimata; 8. neg. kontroll, rakud permeabiliseeritud 9. pos. kontroll MUC1B 6B8.1, rakud permeabiliseerimata 10. pos. kontroll MUC3A 1F8.1, rakud permeabiliseeritud

29 3.5 CaCo-2 mõjutamine antikehadega Uurimaks MUC3 β-ahela vastaste antikehade võimet mõjutada rakkude paljunemist uuriti antikehade mõju MUC3 ekspresseeriva CaCo-2 rakuliinil. Katsel kasutati MUC3 β-ahelaga reageerivaid antikehi 3H5.1, 7G2.1 ja 9C7.1, mis valiti välja eelnevate analüüside põhjal. Negatiivseks kontrolliks kasutati inimese müoglobiini vastast monoklonaalset antikeha MGB. Rakke töödeldi metoodika osas kirjeldatud viisil, inkubeeriti MUC3B antikehadega ning määrati optiline tihedus erineva lahjendusega lüsaatidel (Joonis 10.) Saadud tulemustest võib järeldada, et MUC3B antikehad suurendavad rakkude jagunemist, nii nagu ka müoglobiini vastane antikeha. 1 Caco2 rakuliini mõjutamine antikehadega 0,8 OD (620 nm) 0,6 0,4 0,2 0 MUC3B 3H5 MUC3B 7G2 MUC3B 9C7 MGB neg Joonis 10. CaCo-2 mõjutamine antikehadega MUC3B 3H5, 7G2 ja 9C7. Negatiivse kontrollina kasutati müoglobiini vastast antikeha (MGB). Võrdluseks on esitatud rakud, mille kasvukeskonda ei lisatud antikehi.

30 Arutelu Erinevates uuringutes on näidatud MUC3 üleekspressiooni mitmetes inimese vähkkasvajates ja kasvajate rakuliinides. Tulemused viitavad sellele, et MUC3 sobib markeriks kasvajate diagnostikas ja ka märklauana vähiteraapias (Mukhopadhyay, Chakraborty jt., 2011). Tulevikus võib MUC3 omada head perspektiivi kasvajate prognoosimisel, diagnoosimisel ja teraapias. MUC3 α-ahelat ja β-ahelat äratundvad antikehad on kommertsiaalsetena saadaval. Suurem osa anti-muc3 antikehadest on välja töötatud MUC3 α-ahela vastu. Antud magistritöö peamiseks eesmärgiks oli iseloomustada ja välja valida MUC3 β- ahela ekstratsellulaarse domääni vastased monoklonaalsed antikehad, et tulevikus kasutada neid MUC3 ekspressiooni ja funktsioonide uuringutes, vähidiagnostikas, sobivuse korral ka kasvajavastases teraapias. MUC3 β-ahela ekstratsellulaarse domääni vastased monoklonaalsed antikehad saadi TÜ ÜMPi-s hiirte immuniseerimisel 2 sünteetilise peptiidiga (MUC3A - APTGYEEFYFPLVEATRLRC (aminohapped ) ja MUC3B - PFSPQLESEYEQVKTTLKE (aminohapped valgu SEA domäänis). Antikehade olemasolu tuvastati ELISA meetodil, kasutades antigeenina nimetatud peptiide. Edasiseks iseloomustamiseks valiti välja 38 ELISA testis positiivse tulemuse andnud monoklonaalset antikeha. Sünteetilisi peptiide kasutatakse valguvastaste antikehade saamiseks, kuid antud meetodil on kaks puudust: 1) peptiidiga reageerivad antikehad ei pruugi reageerida natiivse valguga, sest valgu konformatsioonilised muutused ja glükosüülimine ei pruugi lasta peptiidi vastasel antikehal seostuda algupärase konformatsiooniga valguga; 2) peptiidiga reageerivad antikehad võivad anda mittespetsiifilist ristireaktsiooni teiste valkudega, mis omavad sarnast aminohappelist järjestust, mida on näha ka käesolevas töös ühe MUC3B antikeha puhul Western blotil. Nimetatud põhjustel on vajalik konkreetse valgu vastu valmistatud antikehasid erinevate meetoditega analüüsida eri tüüpi rakkudel, et välja sõeluda antikehad, mis annavad reaktsiooni MUC3 β-ahela ekstratsellulaarse domääniga ja ei annaks ristireaktsioone teiste analoogsete valkudega. Esiteks teostati hübridoomide skriinimine ELISA meetodil, kasutades antigeenina MUC3A ja MUC3B valgu järjestusele vastavaid peptiide. Kokku skriiniti MUC3A peptiidiga

31 80 erinevat klooni, milledest positiivse tulemuse andis 26 klooni (3B10, 4A6, 5B4, 5G10, 6A7, 6C5, 6E9, 6E11, 6G6, 7B11, 7C10, 7D12, 7F11, 7G6, 7H4, 8A10, 8C8, 8D7, 8E5, 8F1, 8H4, 8H7, 9A9, 9E6, 9H6, 10D11) ja MUC3B peptiidiga skriiniti 93 klooni, milledest positiivse tulemuse andis 12 klooni (2C10, 3G9, 6F8, 7E2, 7E10, 7H3, 8A9, 8B1, 8E8, 8H2, 9A4, 10E3). Vastavalt tulemustele valiti antikehad täpsemaks iseloomustamiseks Western blot meetodil. Edasises töös toimus rakuliinide iseloomustamine MUC3 ekspressiooni suhtes kasutades kommertsiaalseid polüklonaalseid antikehasid ja erinevaid kasvajarakuliine, mida näeb käesoleva töö Tabelis 1. Primaarse antikehana kasutati kommertsiaalset anti-muc3b (ab1) α-ahela vastast küüliku antikeha ja sekundaarsete antikehadena kasutati peroksüdaasiga konjugeeritud hiire IgG-vastaseid antikehi GAM-HRP. Oodatud tulemuse andis CaCo-2 rakuliin, mille tugevat MUC3 ekspressiooni on ka kirjanduses märgitud (Klinken jt., 1996). Huvitava tulemuse andis MUC3 ekspresseerimise puhul Bowes, mida ei ole varasemalt kirjanduses märgitud. Järgnevaks analüüsiks selekteeriti välja kõigepealt ELISA-l positiivse tulemuse andnud antikehad, mida saaks ka Western blotil kasutada. Western blot meetodil testiti 105 hübridoomi, milledest positiivse tulemuse andsid 18. Täpsemal analüüsil kasutati MUC3 ekspresseerivat CaCo-2 ja Bowesi rakkude lüsaate ning negatiivse kontrollina MUC3 mitteekspresseerivat Capan-2 rakuliini. Positiivse kontrollina kasutati antikeha MUC1-2A3.1, mis andis reaktsiooni ~25 kda juures. Oodatud kohas andsid positiivse reaktsiooni MUC3B 1G1.1, 2E12.1, 3H5.1, 4A4.1, 7G2.1, 8H4.1, 9A9.2, 9B8.1, 9C7.1, 10G10.1 ja 10H2.1, mis annab alust arvata, et toimus seondumine MUC3 β-ahelaga. MUC3B 4A4.1 antikeha andis CaCo-2 puhul küll positiivsereaktsiooni, aga lisaks seostus ka mittespetsiifiliselt Capan-2 puhul ~250 kda juures. Võib oletada, et antikeha 4A4.1 puhul Western blotil äratuntavad valgud ei ole seotud MUC3B-ga, vaid on ristreaktsiooni tulemus teiste valkudega. MUC3B 8H4.1, mis andis tugeva signaali ELISA puhul, ei töötanud Western blotil. MUC3A peptiidiga reageerivad antikehad andsid Western blotil mittespetsiifilise reaktsiooni, seega võib oletada, et need antikehad ei seostu MUC3 β-ahelaga. Töös uuriti ka MUC3 antigeeni lokalisatsiooni 4% PFA-ga fikseeritud rakuliinidel CaCo-2 ja Capan-2 puhul. MUC3B rakusisese lokalisatsiooni uurimiseks permeabiliseeriti rakke 0,1% Tritone X-100-ga. Immuunotsütokeemilise analüüsi tulemusena selgus, et MUC3B vastased antikehad 1G1, 2E12, 4A4, 4F1, 5D8, 5E4, 7H10, 8H4, 9A9, 9B8 ja 10G10 ei anna permeabiliseeritud ja permeabiliseerimata rakkudel positiivseid tulemusi. MUC3B vastased antikehad 7G2.1 ja 9C7.1 ei anna reaktsiooni permeabiliseerimata rakkudel.

32 Positiivse reaktsiooni annavad MUC3B 3H5.1 nii permeabiliseeritud kui permeabiliseerimata rakkudel, 7G2.1 ja 9C7.1 permeabiliseeritud rakkudel. Tulemuste põhjal saab väita, et permeabiliseerimata MUC3B 3H5.1 puhul paikneb β-ahel üle kogu rakumembraani ja raku piirjooned on hästi näha. Permeabiliseeritud rakkude puhul on väga nõrgalt võimalik täheldada iseloomulikku reaktsiooni tuumas, spetsiifiline värving koondub põhiliselt tuuma ümber. Et uurida kas MUC3 β-ahela ekstratselluraarne domään on võimeline rakkude jagunemist mõjutama, määrasime MUC3B antikehade mõju rakkude kasvule, kasutades MUC3 ekspresseerivat CaCo-2 rakuliini. Läbiviidud katse näitasid, et MUC3 β-ahela vastased antikehad suurendavad MUC3-positiivsete kasvajarakkude proliferatsiooni, kuid üllatuslikult teeb seda ka inimese müoglobiini vastane antikeha. Kokkuvõtteks võib öelda, et käesolev töö näitas, et MUC3 β-ahela vastastest antikehadest on edaspidiseks diagnostikaks sobivad 3H5.1 ja 9C7.1, mis töötavad hästi Western blot il ning 7G2.1, mis töötab hästi rakkudel. Võimalik, et antud antikehasid võib tulevikus pärast täiendavaid uuringuid kasutada MUC3 ekspressiooni ja funktsioonide uuringutes, diagnostikas ja võimalik, et tulevaste katsete põhjal ka kasvajate immuunoteraapias.