- 1 - UUS IMMUNOTERAAPIA MITMETE KASVAJATE VASTU, SEALHULGAS SEEDETRAKTI- JA MAOVÄHI VASTU

Transcription

1

2 - 1 - EP EP UUS MMUNOTERAAPA MTMETE KASVAJATE VASTU, SEALHULGAS SEEDETRAKT- JA MAOVÄH VASTU Käesolev leiutis käsitleb peptiide, nukleiinhappeid ja rakke kasutamiseks immunoteraapia meetodites. Täpsemalt käsitleb käesolev leiutis vähi immunoteraapiat. Käesolev leiutis käsitleb veel kasvajaga seotud epitoope, mida tuvastavad CD8+ T-rakud, eraldi või koos teiste kasvajaga seotud peptiididega, mis on vaktsiinikoostiste farmatseutilisteks toimeaineteks, mis stimuleerivad kasvajavastaseid immuunvastuseid. Käesolev leiutis käsitleb peptiidide järjestusi, mis on saadud inimese kasvajarakkude HLA klassi molekulidest, mida võib kasutada vaktsiinikoostistes kasvajavastaste immuunvastuste esilekutsumiseks, eelkõige tsütotoksilise T-raku (CTL) vastuste esilekutsumiseks. Leiutise taust Maovähk on haigus, mille puhul moodustuvad pahaloomulised rakud maoseinas. Maovähk võib tekkida mao kõigis osades ja võib levida kogu maos ja teistesse organitesse: eelkõige söögitorusse, kopsudesse ja maksa. Maovähk on neljas kõige levinum vähi liik, mida diagnoositi juhtu aastal. See on kõrge suremusega haigus (u surmajuhtu aastas), mis teeb sellest teise kõige levinuma vähisurmade põhjuse üle kogu maailma kopsuvähi järel. Seda esineb sagedasemini meestel ja loomulikult sagedasemalt Aasia riikides ja arenevates riikides. ( See moodustab igal aastal umbes 2% ( juhtu) kõigist uutest vähijuhtudest Ameerika Ühendriikides, kuid seda esineb sagedasemalt teistes riikides. See on kõige sagedasemaks vähi liigiks Koreas, kus need moodustavad 20,8% kõikidest pahaloomulistest kasvajatest. Jaapanis on maovähk jätkuvalt kõige levinum vähi liik meeste seas. gal aastal diagnoositakse Ameerika Ühendriikides umbes mehel ja naisel maovähk. Enamus on üle 70 aasta vanad. Maovähk on neljas kõige levinum vähi liik maailmas kopsu-, rinna- ning käärsoole- ja pärasoolevähi järel. Samuti on maovähk jätkuvalt sageduselt teine vähist tingitud surma

3 - 2 - põhjus. Ameerika Vähiühingu hinnangul esines aastal üks miljon uut juhtumit, millest ligikaudu 70% esinesid arenevates riikides ja millega kaasnes surmajuhtumit ( Selle haiguse esinemissageduses on üle maailma olulised geograafilised erinevused. Haiguse esinemissagedus on kõige kõrgem Aasias ja Lõuna-Ameerika osades ning madalaim Põhja-Ameerikas. Kõige kõrgemat suremust on tuvastatud Tšiilis, Jaapanis, Lõuna-Ameerikas ja endises Nõukogude Liidus. Maovähki diagnoositakse tihti kaugelearenenud staadiumis, kuna skriinimist ei teostata suuremas osas maailmas, v.a Jaapanis (ja piiratud viisil Koreas), kus saavutatakse tihti varajane tuvastamine. Seetõttu kujutab see endast jätkuvalt suurt väljakutset tervishoiutöötajate jaoks. Maovähi riskifaktorid on Helicobacter pylori (H. pylori) infektsioon, suitsetamine, rohke soolatarbimine ja muud toitumuslikud asjaolud. Mõned maovähi juhtumid (1% kuni 3%) on seotud pärilike maovähile predisponeerivate sündroomidega. E-kadheriini mutatsioone esineb umbes 25% perekondades, kellel on autosoom-dominantne soodumus difuusse maovähi tekkimiseks. See maovähi alarühm on liigitatud päriliku difuusse maovähina. Geneetilise nõustamise pakkumine ja profülaktilise gastrektoomia kaalumine noortele asümptomaatilistele nonsenssmutatsiooni kandjatele võib olla kasulik. Maosein koosneb kolmest rakukihist: (kõige sisemisest) limaskestast, (keskmisest) lihaskestast ja (kõige välimisest) serooskestast. Maovähk algab limaskestas sisalduvatest rakkudest ja levib kasvades läbi välimiste kihtide. Kasutatakse nelja tüüpi standardravi. Maovähi ravi võib hõlmata kirurgilist ravi, kemoteraapiat, kiiritusravi või kemokiiritusravi. Kirurgiline ravi on maovähi peamiseks ravimeetodiks. Kirurgilise ravi eesmärgiks on saavutada negatiivsete marginaalide täielik resektsioon (R0-resektsioon). Samas ei saa R0- resektsiooni teostada umbes 50%-l lokoregionaalse maovähiga patsientidest. R1 märgib mikroskoopilisi kasvajajääke (positiivsed marginaalid) ja R2 märgib suuri (makroskoopilisi) kasvajajääke, kuid kaugelearenenud haiguse puudumist. Patsiendi ravitulemused sõltuvad vähi algstaadiumist diagnoosimise hetkel (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology ).

4 - 3 - Kirurgilise resektsioonravi 5-aastane elulemusmäär on vahemikus 30-50% staadiumis haigusega patsientidel ja vahemikus 10-25% staadiumis haigusega patsientidel. Nendel patsientidel on kõrge lokaalse ja süsteemse relapsi tõenäosus. Metastaas esineb 80-90%-l maovähiga inimestest ning nende 6-kuune elulemusmäär on varastes staadiumites diagnoositud patsientidel 65% ja alla 15% hilistes staadiumites diagnoositud patsientidel. Seetõttu püsib vajadus uute efektiivsete ja ohutute ravivõimaluste järele maovähi, eesnäärmevähi, suuõõne kartsinoomi, neelu lamerakulise kartsinoomi (OSCC), akuutse müeloidse leukeemia (AML), H. pylori indutseeritud MALT-lümfoomi, käärsoole kartsinoomi/pärasoolevähi, glioblastoomi, mitteväikeserakulise kopsuvähki (NSCLC), kaelakartsinoomi, inimrinnavähi, eesnäärmevähi, käärsoolevähi, kõhunäärmevähi, kõhunäärme juha adenokartsinoomi, munasarjavähi, hepatotsellulaarse kartsinoomi, maksavähi, erinevate fenotüüpidega ajukasvajate, leukeemiate, nagu akuutset lümfoblastse leukeemia (ALL), kopsuvähi, Ewingi sarkoomi, endomeetrilise vähi, pea ja kaela soomusrakk-kartsinoomi, kõri epiteelse vähi, maokartsinoomi, peroraalse kartsinoomi, kusepõiekartsinoomi, munasarjakartsinoomide, neeruraku kartsinoomi, atüüpilise meningioomi, papillaarse kilpnäärmekartsinoomi, akukasvajate, süljekanalikartsinoom, emakakaelavähi, ekstranodaalse T-/NK-rakklümfoomide, mitte-hodgkini lümfoomi ja pahaloomuliste kopsu- ja rinnasoliidkasvajate ja muude kasvajate raviks, millega parandatakse patsientide heaolu, kasutamata tõsiseid kõrvaltoimeid põhjustavaid kemoteraapia aineid või teisi aineid. WO 02/36614 avaldab 25-mer aminohapete järjestuse, mida kasutati ainult võrdluseks. Käesolev leiutis liidab peptiide, mis stimuleerivad immuunsüsteemi ja toimivad mitteinvasiivsel viisil kasvajavastase ainetena. Leiutise kokkuvõte mmuunvastuse stimuleerimine sõltub antigeenide juuresolekust, mida peremeesorganismi immuunsüsteem tunnistab võõraks. Kasvajaga seotud antigeenide olemasolu avastamine on suurendanud peremeesorganismi immuunsüsteemi kasutamise võimalust kasvaja kasvu vahelesekkumiseks. Vähi immunoteraapias kasutatakse praegusel ajal erinevaid mehhanisme immuunsüsteemi humoraalse ja tsellulaarse õla rakendamiseks.

5 - 4 - Tsellulaarse immuunvastuse spetsiifilised elemendid on võimelised kasvajarakke spetsiifiliselt ära tundma ja hävitama. Tsütotoksiliste T-rakkude (CTLid) eraldamine kasvajat infiltreerivatest rakupopulatsioonidest või perifeersest verest tähendab seda, et sellised rakud on olulised loomulikus immuunkaitses vähi vastu. CD8-positiivsed T-rakud (TCD8 + ), eriti need, mis tunnevad ära peamise koesobivuskompleksi (MHC) kandvate peptiidide klassi molekule, mis koosnevad tavaliselt 8-10 aminohappe jäägist, mis on saadud tsütosoolis asuvatest valkudest või defektsetest ribosoomi saadustest (DRPid), mängivad selles vastuses tähtsat rolli. nimese MHC-molekulid on samuti määratletud inimese leukotsüütide antigeenidena (HLA). MHC-molekule on kaks klassi: klassi MHC molekulid, mida võib leida enamusel rakkudest, millel on tuum. MHC molekulid koosnevad vastavalt raskest alfa-ahelast ja beeta-2-mikroglobuliinist (MHC klassi retseptorid) või alfa- ja beeta-ahelast (MHC klassi retseptorid). Nende kolmemõõtmeline konformatsioon annab tulemusena sidumisvao, mida kasutatakse mittekovalentseks vastastiktoimeks peptiididega. MHC klass presenteerib peptiidide, mis pärinevad peamiselt endogeensete valkude, DRPS ja suurte peptiidide proteolüütilisest lõhustamisest. MHC klassi molekule leidub peamiselt professionaalset antigeeni esindavatel rakkudel (APCd). Need presenteerivad eelkõige eksogeenseid või transmembraanseid peptiide, mille lahustavad APC-d endotsütoosi ajal ja järgnevalt need protsessitakse. Peptiidide ja MHC klassi molekulide komplekse tunnevad ära CD8-positiivsed tsütotoksilised T-lümfotsüüdid, mis kannavad vastavat T-raku retseptorit (TCR), ning peptiidide ja MHC klassi molekulide komplekse tunnevad ära CD4-positiivsed abistaja T-rakud, mis kannavad vastavat TCR-i. On teada, et TCR, peptiid ja MHC esinevad seejuures stöhhiomeetrilises koguses 1:1:1. Peptiid peab tsellulaarse immuunvastuse esilekutsumiseks seonduma MHC-molekuliga. See protsess sõltub MHC-molekuli alleelist ja peptiidi aminohappe järjestuse spetsiifilisest polümorfismist. MHC klassi seonduvate peptiidide pikkuseks on tavaliselt 8-12 aminohappe jääki ja tavaliselt sisaldavad nad järjestuses kahte konserveerunud jääki ( ankrut ), mis toimivad vastastikku MHC molekuli vastava sidumisvaoga. Sel viisil on igal MHC alleelil sidumise motiiv, mis määrab, milliseid peptiide saab spetsiifiliselt seostada sidumisvaoga.

6 - 5 - MHC klassi molekulidest sõltuvas immuunreaktsioonis ei pea peptiidid olema mitte ainult võimelised seostama kasvajarakkude poolt ekspresseeritud teatud MHC klassi molekule, vaid need peavad samuti olema äratuntavad T-rakkude poolt, mis kannavad spetsiifilisi T- raku retseptoreid (TCR). Antigeenideks, mille tunnevad ära kasvajale spetsiifilised CTLid, s.o nende epitoobid võivad olla molekulid, mis on saadud kõikidest valgu klassidest, nagu ensüümid, retseptorid, transkriptsioonifaktorid jne, mida ekspresseeritakse ja võrreldakse sama päritolu muutmata rakkudega, mis on ülereguleeritud vastava kasvaja rakkudes. Praegune kasvajaga seotud antigeenide (TAA-d) klassifikatsioon sisaldab järgnevaid peamisi rühmi: a) Vähi-testise antigeenid: esimesed identifitseeritud TAA-d, mida saavad kindlaks teha T- rakud, mis kuuluvad klassi, mida kutsuti alguses vähi-testise (CT) antigeenideks nende ekspressiooni tõttu histoloogiliselt erinevates inimese kasvajates ja normaalsete kudede seast ainult munandite spermatotsüütides/spermatogoonis ja vahetevahel platsentas. Kuna munandite rakud ei ekspresseeri HLA ja klassi molekule, ei saa T-rakud neid antigeene kindlaks teha normaalsetes kudedes ja seetõttu võib neid pidada immunoloogiliselt kasvajaspetsiifilisteks. CT antigeenide tuntud näideteks on MAGE perekonna liikmed või NY-ESO-1. b) Eristavad antigeenid: neid TAA-d on sarnased kasvajate ja normaalsete kudede vahel, millest kasvaja tekib, millest enamikku leitakse melanoomides ja normaalsetes melanotsüütides. Paljud nendest melanotsüütidest pärinemisega seotud valkudest on kaasatud melaniini biosünteesi ja seetõttu ei ole kasvajaspetsiifilised, kuid sellele vaatamata kasutatakse neid laialdaselt vähi immunoteraapia jaoks. Näidete hulka kuuluvad, kuid mitte ainult, türosinaas ja Melan-A/MART-1 melanoomi jaoks või PSA eesnäärme vähi jaoks. c) Üleekspresseeritud TAA-d: geenid, mis kodeerivad laialdaselt ekspresseeritud TAA-sid, on leitud histoloogiliselt erinevates kasvajate tüüpides ning samuti paljudes normaalsetes kudedes, üldiselt madalate ekspressioonitasemetega. On võimalik, et paljusid epitoope, mis on protsessitud ja potentsiaalselt esitatud normaalsete kudede poolt, on allpool T-rakkude kindlakstegemise läve, kuid nende üleekspresseerimine kasvajarakkudes võib vallandada vastuse ja eelneva tolerantsi lõppemise. Selle TAA-de klassi olulisemateks näideteks on Her-2/neu, surviviin, telomeraas või WT1.

7 - 6 - d) Kasvajaspetsiifilised antigeenid: need unikaalsed TAA-d tekivad normaalsete geenide mutatsioonidest (nagu -kateniin, CDK4 jne). Mõned nendest molekulide muutustest on seotud neoplastilise transformatsiooni ja/või progressiooniga. Kasvajaspetsiifilised antigeenid on üldiselt võimelised indutseerima tugevaid immuunvastuseid, omamata riski autoimmuunreaktsioonide suhtes normaalsete kudede vastu. Teiselt poolt on need TAA-d enamikel juhtudel tähtsad ainult konkreetsele kasvajale, millel need identifitseeriti ja tavaliselt ei ole need mitmele kasvajale ühised. e) TAA-d, mis tekivad ebanormaalsetest translatsioonijärgsetest modifikatsioonidest: sellised TAA-d võivad tekkida valkudest, mis ei ole ei spetsiifilised ega kasvajates üleekspresseeritud, kuid sellest hoolimata muutuvad kasvajaga seotuks translatsioonijärgsete protsessidega, mis on aktiivsed peamiselt kasvajates. Selle klassi näited tulevad esile muudetud glükosüülimise mudelites, mis viivad uute epitoopideni kasvajates, mis puutub MUC1 või juhtumitesse, nagu valgu splaissimine lagundamise ajal, mis võib olla kasvajaspetsiifiline või mitte. f) Viiruselised onkovalgud: need TAA-d on viiruselised valgud, mis võivad olla olulised onkogeenses protsessis ja seetõttu, et need on võõrad (mitte inimeselt pärinevad), võivad need kutsuda esile T-raku vastuse. Selliste valkude näideteks on inimese papilloomi 16. tüübi viiruselised valgud E6 ja E7, mis ekspresseeritakse emakakaela kartsinoomis. Valkude suhtes, mida peavad ära tundma tsütotoksilised T-lümfotsüüdid kasvajaspetsiifiliste või kasvajaga seotud antigeenidena, ja mida peab kasutama ravis, peavad olema täidetud eraldi eeltingimused. Antigeeni peaksid ekspresseerima peamiselt kasvajarakud ja mitte normaalsed terved koed või tegema seda suhteliselt väikestes kogustes. Peale selle on soovitav, et vastav antigeen ei ole mitte ainult olemas kasvaja tüübis, vaid seda on ka suures kontsentratsioonis (s.o vastava peptiidi koopiate arv raku kohta). Kasvajaspetsiifilised ja kasvajaga seotud antigeenid saadakse tihti valkudest, mis on otse kaasatud normaalse raku transformatsiooni kasvajarakuks funktsiooni tõttu, nt rakutsükli kontrollimisel või apoptoosi supressiooni ajal. Peale selle võivad valkude pärisuunalised märklauad, mis põhjustavad otseselt transformatsiooni, olla ülereguleeritud ja seetõttu võivad kaudselt olla seotud kasvajaga. Sellised kaudselt kasvajaga seotud antigeenid võivad olla samuti vaktsiini-kaudse ravi märklaudadeks (Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cancer mmunol. mmunother Mar; 453 (3): ). Mõlemal juhul on oluline, et epitoobid oleks antigeeni aminohapete järjestuses, kuna selline peptiid ( immunogeenne peptiid ), mis on saadud kasvajaga seotud antigeenist, peaks viima in vitro või in vivo T-raku vastuseni.

8 - 7 - Põhimõtteliselt võib mis tahes peptiid, mis on võimeline siduma MHC molekule, funktsioneerida T-raku epitoobina. n vitro või in vivo T-raku vastuse indutseerimise eeltingimuseks on T-raku olemasolu koos vastava TCR-ga ja selle konkreetse epitoobi immunoloogilise tolerantsi puudumine. Seetõttu on TAA-d lähtepunktiks kasvaja vaktsiini väljatöötamisel. TAA-de identifitseerimise ja iseloomustamise meetodid põhinevad CTL-i kasutamisel, mida võib eraldada patsientidelt või tervetelt isikutelt, või need põhinevad erinevate transkriptsiooniprofiilide või erinevate peptiidi ekspressioonimustrite genereerimisel kasvajate ja normaalsete kudede vahel. Siiski ei anna kasvaja kudedes või inimese kasvaja rakuliinides üleekspresseeritud geenide identifitseerimine täpset informatsiooni nendest geenidest transkribeeritud antigeenide kasutamise kohta immunoteraapias. See on seetõttu nii, et selliseks kasutamiseks sobivad ainult individuaalsed alampopulatsioonid nende antigeenide epitoopidest, kuna juures peab olema T-rakk koos vastava TCR-ga ja selle konkreetse epitoobi immunoloogiline tolerants peab puuduma või olema minimaalne. Seetõttu on tähtis valida üleekspresseeritud või selektiivselt ekspresseeritud valkude seast ainult neid peptiide, mis on olemas koos MHC molekulidega, mille vastu saab leida funktsionaalse T-raku. Selline funktsionaalne T-rakk on defineeritud T-rakuna, mis spetsiifilise antigeeniga stimuleerimisel võib klonaalselt laieneda ja on võimeline täitma efektori funktsioone (efektor T-rakk). T-abistajarakud mängivad tähtsat rolli CTL-ide efektorfunktsiooni korraldamisel kasvajavastases immuunsuses. T-abistajaraku epitoobid, mis vallandavad CD8-positiivsete T-tapjarakkude T H1 tüüpi toetavate effektorfunktsioonide T-abistajaraku vastuse, mis hõlmab tsütotoksilisi funktsioone, mis on suunatud kasvajarakkude vastu, presenteerides kasvajaga seotud peptiidi/mhc komplekse nende rakkude pinnal. Sel viisil saavad kasvajaga seotud T-abistajaraku epitoobid, kas üksi või koos teiste kasvajaga seotud peptiididega, sobida vaktsiinikoostise toimivateks farmatseutilisteks koostisosadeks, mis stimuleerivad kasvajavastast immuunvastust. Jooniste lühike kirjeldus

9 - 8 - Joonis ig 1: näide massispekter proovist CDC2-001, mis näitab selle esitamist primaarsel kasvajaproovil GC2464. NanoES-LCMS viidi läbi peptiidi kogumis, mis on elueeritud GC proovist Mass-kromatogramm väärtusel m/z 597,3501 ± 0,001 Da, z = 2 näitab peptiidi kõrgpunkti peetumisajal 151,63 min. B) Tuvastatud mass-kromatogrammi kõrgpunkt peetumisajal 151,63 min näitas MS spektrumis signaaliks 597,3501. C) Märgitud peetumisajal nanoes-lcms eksperimendis valitud eelühendist m/z 597,3501 salvestatud põrgetega indutseeritud lagunemise massispekter kinnitas CDC2-001 olemasolu GC2464 kasvaja proovis. D) Sünteetilise CDC2-001 võrdluspeptiidi fragmenteerumise muster salvestati ja seda võrreldi genereeritud loomuliku TUMAPi fragmenteerumise mustriga, mida on näidatud C-s järjestuse kontrollimiseks. Joonis ig 2: valitud valkude mrna ekspressiooniprofiilid normaalsetes kudedes ja 25 maovähi proovis a) CDC2 (proovikompleti D: _at) b) ASPM (proovikompleti D: _s_at) Joonis ig 3: klassi TUMAP-de peptiidide spetsiifilise in vitro immunogeensuse näidistulemused. CD8+ T-rakud valmistati ette, kasutades kunstlikke APC-sid, mis on koormatud vastavalt olulise (vasakpoolne paneel) ja ebaolulise peptiidiga (parempoolne paneel). Pärast kolme stimuleerimise tsüklit teostati peptiidiga reageerivate rakkude tuvastamine kahekordse värvimisega tähtsate ja tähtsusetute A*2402-multimeeridega. Näidatud rakkude juurdepääsu elus CD8+ lümfotsüütide juurde on piiratud ja arvud plotidel esindavad multimeerpositiivsete rakkude protsente. Leiutise detailne kirjeldus Leiutis vastab punktides esitatud määratlustele. Siin kasutatuna ja väljaarvatud sel juhul, kui on määratletud teisiti, on kõik terminid määratletud nii, nagu on esitatud edaspidi. Terminit peptiid kasutatakse siin aminohapete jääkide ridade määramiseks, mis tavaliselt on üksteisega seotud peptiidsidemetega alfa-amino- ja kõrvalasuvate aminohapete karbonüülrühmade vahel. Peptiidide pikkuseks on tavaliselt 9 aminohapet, kuid need võivad olla nii lühikesed nagu 8 aminohapet ja nii pikad nagu 10, 11, 12, 13 või 14 aminohapet.

10 - 9 - Terminit oligopeptiid kasutatakse siin aminohapete jääkide ridade määramiseks, mis tavaliselt on üksteisega seotud peptiidsidemetega alfa-amino- ja kõrvalasuvate aminohapete karbonüülrühmade vahel. Oligopeptiidide pikkus ei ole leiutise seisukohalt otsustav, kuni selles hoitakse korrektset epitoopi või epitoope. Oligopeptiidide pikkuseks on tavaliselt vähem kui ligikaudu 30 aminohappe jääki ja rohkem kui ligikaudu 14 aminohappe jääki. Terminiga polüpeptiid määratakse aminohapete jääkide read, mis tavaliselt on üksteisega seotud peptiidsidemetega alfa-amino- ja kõrvalasuvate aminohapete karbonüülrühmade vahel. Polüpeptiidi pikkus ei ole leiutise seisukohalt otsustav kuni selles hoitakse korrektset epitoopi või epitoope. Vastupidiselt terminitele peptiid või oligopeptiid mõeldakse termini polüpeptiid all molekule, mis sisaldavad enam kui ligikaudu 30 aminohappe jääki. Peptiid, oligopeptiid, valk või polünukleotiid, mis kodeerib selliseid molekule, on immunogeenne (ja seega immunogeen käesoleva leiutise piires), kui see on võimeline indutseerima immuunvastust. Käesoleva leiutise puhul on immunogeensus määratletud spetsiifilisemalt võimena indutseerida T-raku vastust. Seega oleks immunogeen molekul, mis on võimeline indutseerima immuunvastust ja käesoleva leiutise puhul, molekul, mis on võimeline indutseerima T-raku vastust. T-raku epitoop vajab lühikest peptiidi, mis on seotud MHC klassi retseptoriga, moodustades kolmikkompleksi (MHC klassi alfa-ahel, beeta-2-mikroglobuliin ja peptiid), mida saab kindlaks teha T-rakuga, millel on sobiv T-raku retseptor, mis on seostatud sobiva afiinsusega MHC/peptiidi kompleksiga. Peptiidide pikkuseks, mis seostuvad MHC klassi molekulidega, on tüüpiliselt 8-14 aminohapet ja kõige tüüpilisemaks pikkuseks 9 aminohapet. nimestel on kolm erinevat geenilookust, mis kodeerivad MHC klassi molekule (inimese MHC molekulideks on nimetatakse ka inimese leukotsüütide antigeenideks (HLA)): HLA- A, HLA-B ja HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 ja HLA-A*024 on erinevate MHC klassi alleelide näideteks, mida saab ekspresseerida nendest lookustest. Tabel 1: HLA*A024 ekspressiooni sagedused ja kõige sagedamini esinevad HLA*A02402 serotüübid. Sagedused on tuletatud haplotüübi sagedustest G f Ameerika populatsiooni piires, mille on kohandanud Mori et al.(mori et al ), kasutades

11 Hardy-Weinberg valemit =1-(1-G f )². Üksikasju vaadake publikatsioonist Chanock et al. (Chanock et al ). HLA*24 ja A*2402 serotüüpide ekspressiooni sagedused üle kogu maailma Alleel Riik Alleeli sageduse arvutuslik fenotüüp A*24 ilipiinid 65% A*24 Venemaa neenetsid 61% A*2402 Jaapan 59% A*24 Malaisia 58% A*2402 ilipiinid 54% A*24 ndia 47% A*24 Lõuna-Korea 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 Hiina 32% A*2402 ndia 29% A*24 Lääne-Austraalia 22% A*24 USA 22% A*24 Venemaa, Samaara 20% A*24 Lõuna-Ameerika 20% A*24 Euroopa 18% Siin kasutatuna hõlmavad viited DNA järjestustele nii üheahelalisi kui ka kaheahelalisi DNA-sid. Seega viitab spetsiifiline järjestus, kui kontekstist ei ole näha teisiti, sellise järjestuse üheahelalisele DNA-le, kahekordsele sellisele järjestusele koos selle komplemendiga (kaheahelaline DNA) ja sellise järjestuse komplemendile. Termin kodeeriv piirkond viitab geeni sellele osale, mis kas loomulikult või tavaliselt kodeerib selle geeni ekspressioonisaadust selle loomulikus genoomses keskkonnas, s.o piirkonnale, mis kodeerib in vivo geeni loomulikku ekspressioonisaadust. Kodeeriv piirkond võib olla pärit mittemuteerunud ( normaalsest ), muteerunud või teisenenud geenist või võib pärineda isegi DNA järjestusest või geenist, mis on täielikult sünteesitud laboratooriumis, kasutades meetodeid, mis on teada DNA sünteesi asjatundjatele. Termin nukleotiidi järjestus viitab desoksüribonukleotiidi heteropolümeerile.

12 Nukleotiidi järjestus, mis kodeerib konkreetset peptiidi, oligopeptiidi või polüpeptiidi, võib olla loomulikult esinev või neid võib sünteesiga valmistada. Üldiselt on DNA segmendid, mis kodeerivad selle leiutise peptiide, polüpeptiide ja valke, kokku pandud cdna fragmentidest ja lühikestest oligonukleotiidi linkeritest või oligonukleotiidide reast, esitamaks sünteesitud geeni, mida saab ekspresseerida rekombinantses transkriptsiooniüksuses, mis sisaldab reguleerivaid elemente, mis on saadud mikroobsest või viiruslikust operonist. Termin ekspressioonisaadus tähendab polüpeptiidi või valku, mis on geeni ja mis tahes nukleiinhappe järjestuse loomulik translatsioonisaadus, mis kodeerib ekvivalente, mis tulenevad geneetilise koodi degenereeruvusest ja seega kodeerivad sama aminohapet (- happeid). Termin fragment, kui viidatakse kodeerivale järjestusele, tähendab DNA osa, mis sisaldab vähem kui kogu kodeeriv piirkond, mille ekspressioonisaadus säilitab põhiliselt sama bioloogilise funktsiooni või toime nagu kogu kodeeriva piirkonna ekspressioonisaadus. Termin DNA segment viitab DNA polümeerile eraldi fragmendi kujul või suurema DNA konstrukti komponendina, mis on saadud DNA-st, mis on eraldatud vähemalt üks kord praktiliselt puhtana, s.o vabana saastavatest endogeensetest ainetest ja koguses või kontsentratsiooniga, mis võimaldab segmendi ja selle nukleotiidi järjestuse komponendi identifitseerimist, käsitsemist ja regenereerimist standardsete biokeemiliste meetoditega, näiteks kasutades kloonivaid vektoreid. Sellised segmendid on esitatud avatud lugemisraamide kujul, mida ei ole katkestatud seesmise mittetransleeritud järjestusega, või intronide kujul, mis esinevad tavaliselt eukarüootsetes geenides. Mittetransleeritud DNA järjestus võib olla avatud lugemisraamist allavoolu, kus see ei puutu kokku kodeeriva piirkonna käsitsemise või ekspressiooniga. Termin praimer tähendab lühikest nukleiinhappe järjestust, mida saab paari panna DNA ühe ahelaga ja see annab vaba 3'OH otsa, kus DNA polümeraas alustab desoksüribonukleotiidi ahela sünteesi.

13 Termin promootor tähendab DNA piirkonda, mis on kaasa haaratud RNA polümeraasi sidumisel, et initsieerida transkriptsiooni. Termin eraldatud tähendab seda, et materjale eemaldatakse oma esialgsest keskkonnast (nt loomulikust keskkonnast, kui see esineb loomulikult). Näiteks loomulikult esinevat polünukleotiidi või polüpeptiidi, mis on elava looma maksas, ei eraldata, kuid eraldatakse sama polünukleotiid või polüpeptiid, mis on eraldatud mõnest või kõigist kooseksisteerivatest materjalidest loomulikus süsteemis. Selline polünukleotiid võiks olla vektori osa ja/või sellised polünukleotiidid või polüpeptiidid võiks olla koostise osad ja seda võib ikka eraldada seetõttu, et selline vektor või koostis ei ole selle loomuliku keskkonna osa. Polünukleotiidid ja rekombinantsed või immunogeensed polüpeptiidid, mis on avaldatud vastavalt käesolevale leiutisele, võivad olla samuti puhastatud kujul. Termin puhastatud ei nõua absoluutset puhtust, vaid pigem on see mõeldud suhtelise definitsioonina ja võib hõlmata preparaate, mida on väga palju puhastatud, või preparaate, mida on ainult osaliselt puhastatud, nagu neist termineist saab aru asjasse puutuva ala asjatundja. Näiteks üksikuid kloone, mis on eraldatud cdna raamatukogust, puhastati tavapäraselt kuni elektroforeetilise homogeensuseni. Selgesõnaliselt vaadeldi lähtematerjali või loomuliku materjali puhastamist vähemalt ühe suurusjärguni, eelistatavalt kahe või kolme suurusjärguni ja enam eelistatavalt nelja või viie suurusjärguni. Peale selle vaadeldi selgesõnaliselt patendinõudlusega kaitstud polüpeptiidi, mille puhtus on eelistatavalt 99,999% või vähemalt 99,99% või 99,9%; ja veelgi enam soovitult 99% massi järgi või suurem. Vastavalt käesolevale leiutisele võivad avaldatud nukleiinhapped ja polüpeptiidi ekspressioonisaadused, samuti ekspressioonivektorid, mis sisaldavad selliseid nukleiinhappeid ja/või selliseid polüpeptiide, olla rikastatud kujul. Siin kasutatuna tähendab termin rikastatud seda, et materjali kontsentratsioon on vähemalt ligikaudu 2, 5, 10, 100 või 1000-kordne selle loomulikust kontsentratsioonist (näiteks), eelistatavalt 0,01 % massi järgi, eelistatavalt vähemalt 0,1% massi järgi. Vaadeldakse ka rikastatud preparaate kontsentratsiooniga ligikaudu 0,5%; 1%; 5%; 10% ja 20% massi järgi. Järjestused, konstruktid, vektorid, kloonid ja teised materjalid, mida käesolev leiutis hõlmab, võivad olla soodsalt rikastatud või eraldatud kujul.

14 Termin aktiivne fragment tähendab fragmenti, mis genereerib immuunvastuse (s.o sellel on immunogeenne toime), kui seda manustatakse eraldi või valikuliselt koos sobiva lisaainega loomale, nagu imetaja, näiteks küülikule või hiirele ja samuti hõlmates inimest, kusjuures selline immuunvastus saadakse stimuleerivate T-rakkude vastuse kujul retsipientloomas, nagu inimene. Alternatiivselt võib aktiivset fragmenti kasutada ka T- raku vastuse indutseerimiseks in vitro. Siin kasutatuna viitavad terminid osa, segment ja fragment, kui neid kasutatakse polüpeptiidide suhtes, pidevale jääkide järjestusele, nagu aminohapete jäägid, mille järjestus moodustab suure järjestuse alamrühma. Näiteks, kui polüpeptiidi töödeldaks mis tahes tavapärase endopeptidaasiga, nagu trüpsiin või kümotrüpsiin, siis oligopeptiidid, mis saadakse sellise töötlemise tulemusena, oleksid algse polüpeptiidi osad, segmendid või fragmendid. See tähendab seda, et mis tahes selline fragment sisaldab tingimata selle aminohappe järjestuse segmendi osana segmenti, fragmenti või osa, mis on praktiliselt identne, kui see ei ole täpselt identne, SEQ D nr 1 kuni 33 järjestusega, mis vastab SEQ D nr 1 kuni γγ looduslikult esinevatele või "emavalkudele. Kui seda kasutatakse polünukleotiidide suhtes, siis viitavad sellised terminid saadustele, mis valmistatakse nimetatud polünukleotiidide töötlemisel mis tahes tavapärase endonukleaasiga. Vastavalt käesolevale avaldusele tähendab termin identsuse protsent või seesama protsent, kui see viitab järjestusele seda, et järjestust võrreldakse patendinõudlusega kaitstud või kirjeldatud järjestusega pärast võrreldava järjestuse kokkulangemist ( võrreldav järjestus ) kirjeldatud või patendinõudlusega kaitstud järjestusega ( referentsjärjestus ). Sel juhul määratakse identsuse protsent vastavalt järgmisele valemile: identsuse protsent = 100 [ -(C/R)] milles C on erinevuse number referentsjärjestuse ja võrreldava järjestuse vahel kokkulangevuse pikkuse osas referentsjärjestuse ja võrreldava järjestuse vahel, milles (i) iga alus või aminohape referentsjärjestuses, millel ei ole vastavat kokkulangevat alust või aminohapet võrreldavas järjestuses ja (ii) iga tühik referentsjärjestuses ja (iii) iga kokkulangev alus või aminohape referentsjärjestuses, mis on erinev kokkulangevast alusest või aminohappest võrreldavas järjestuses, moodustab erinevuse ning R on aluste või

15 aminohapete arv referentsjärjestuses kokkulangevuse ulatuses võrreldava järjestusega ilma ühegi tühikuta, mis tekitati referentsjärjestuses, seega seda loetakse aluseks või aminohappeks. Kui kokkulangevus on võrreldava järjestuse ja referentsjärjestuse vahel, mille eespool esitatud valemiga arvutatud identsuse protsent on ligikaudu võrdne või suurem, kui määratletud minimaalne identsuse protsent, siis võrreldaval järjestusel on määratletud minimaalne identsuse protsent referentsjärjestuse suhtes isegi siis, kui võivad olla kokkulangevused, milles siin eespool arvutatud identsuse protsent on väiksem kui määratletud identsuse protsent. Siin avaldatud esialgseid peptiide saab modifitseerida ühe või enama jäägi asendamisega erinevates ja võimalusel selektiivsetes kohtades peptiidi ahelas, kui ei ole määratletud teisiti. Sellised asendused võivad olla konservatiivse iseloomuga näiteks seal, kus üks aminohape on asendatud sarnase struktuuriga ja iseloomuga aminohappega, nagu see, milles hüdrofoobne aminohape on asendatud teise hüdrofoobse aminohappega. Veelgi konservatiivsem oleks sama või sarnase suuruse ja keemilise iseloomuga aminohapete asendamine, nagu see, kus leutsiin on asendatud isoleutsiiniga. Järjestuste varieerumise uuringutes loomulikult esinevate homoloogsete valkude perekonnas lubatakse teatud aminohapete asendusi sagedamini kui teisi ja need näitavad tihti korrelatsiooni sarnasuse, laengu, polaarsuse ja hüdrofoobsusega esialgsete aminohapete ja nende asenduste vahel ja selline on konservatiivse asendamise määratlemise alus. Konservatiivseid asendusi määratletakse siin vahetustena ühes järgmisest viiest rühmast: 1. rühm väikesed alifaatsed, mittepolaarsed või nõrga polaarsusega jäägid (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 2. rühm - polaarsed, negatiivselt laetud jäägid ja nende amiidid (Asp, Asn, Glu, Gln); 3. rühm - polaarsed, positiivse laenguga jäägid (His, Arg, Lys); 4. rühm - suured alifaatsed, mittepolaarsed jäägid (Met, Leu, le, Val, Cys) ja 5. rühm - suured aromaatsed jäägid (Phe, Tyr, Trp). Vähem konservatiivsete asenduste hulka võib kuuluda ühe aminohappe asendamine teisega, millel on sarnased omadused, kuid mis on mõnevõrra erineva suurusega, näiteks alaniini asendamine isoleutsiini jäägiga. Väga mittekonservatiivsete asenduste hulka võib kuuluda happelise aminohappe asendamine osaga, mis on polaarne või osaga, mis on oma olemuselt

16 aluseline. Selliseid radikaalseid asendusi ei saa siiski lasta minna potentsiaalselt ebaefektiivsetena, kuna keemilised toimed ei ole täielikult ennustatavad ja radikaali asendused võivad põhjustada pooljuhuslikke toimeid, mis teisiti ei oleks lihtsate keemiliste komponentide puhul ennustatavad. Sellised asendused võivad hõlmata loomulikult teisi struktuure kui tavalised L- aminohapped. Seega võivad D-aminohapped olla asendatud L-aminohapetega, mida tavaliselt leidub leiutise antigeensetes peptiidides, ja need kuuluvad siiski siia. Peale selle võib asendamise eesmärgil kasutada aminohappeid, millel on mittestandardsed R-rühmad (s.o teised R-rühmad, mida on leitud looduslike valkude tavalises 20 aminohappes), et saada immunogeene ja immunogeenseid polüpeptiide vastavalt käesolevale leiutisele. Kui asendusi leiti enam kui ühes kohas, mille tulemusena saadi praktiliselt ekvivalentse või suurema antigeense toimega peptiid, nagu on määratletud allpool, siis testitakse selliste asenduste kombinatsioone, et määrata, kas kombineeritud asendused tulenevad lisanditest või peptiidi antigeensete toimete sünergistlikest toimetest. Peptiidi piires on samaaegselt asendatud mitte enam kui 4 asendit. Termin T-raku vastus tähendab efektorfunktiooni proliferatsiooni ja aktivatsiooni, mida indutseerib peptiid in vitro või in vivo. MHC klassi puhul võivad piiratud CTL efektorfunktsioonideks olla peptiidi pulseeritud, peptiidi eelühendi pulseeritud või loomulikult esinevate peptiidi esitavate sihtmärkrakkude lüüs, tsütokineesi sekretsioon, eelistatavalt interferoon-gamma, TN-alfa või peptiidi indutseeritud L-2, efektormolekulide, eelistatult gransüümide või peptiidi indutseeritud perforiini sekretsioon, või degranulatsioon. Eelistatavalt, kui CTL-e, mis on spetsiifilised peptiididele SEQ D nr: l kuni 33, testitakse asendatud peptiidide suhtes, siis peptiidi kontsentratsioon, mille juures asendatud peptiidid saavutavad pool lüüsi maksimaalsest suurenemisest tausta suhtes, ei ole enam kui ligikaudu 1 mm, eelistatavalt mitte enam kui ligikaudu 1 µm, enam eelistatavalt mitte enam kui ligikaudu 1 nm ja veelgi eelistatumalt mitte enam kui ligikaudu 100 pm ja enim eelistatult mitte enam kui ligikaudu 10 pm. Samuti eelistatakse, et asendatud peptiidi teevad kindlaks CTL-d, mis pärinevad enam kui ühelt isendilt, vähemalt kahelt ja enam eelistatult kolmelt isendilt.

17 Seega võivad käesoleva leiutise epitoobid olla identsed loomulikult esinevate kasvajaga seotud või kasvajale spetsiifiliste epitoopidega või need võivad hõlmata epitoope, mis erinevad mitte enam kui 4 jäägi suhtes võrdluseks kasutatavatest peptiididest, kuni neil on praktiliselt identne antigeenne toime. mmunoterapeutilised lähenemisviisid ravi teostamiseks mmuunvastuse stimuleerimine sõltub antigeenide juuresolekust, mida peremeesorganism tunnistab võõraks. Kasvajaga seotud antigeenide olemasolu avastamine on nüüd suurendanud peremeesorganismi immuunsüsteemi kasutamise võimalust kasvaja kasvu vahelesekkumiseks. Vähi immunoteraapias kasutatakse praegusel ajal erinevaid mehhanisme immuunsüsteemi humoraalse ja tsellulaarse õla rakendamiseks. Tsellulaarse immuunvastuse spetsiifilised elemendid on võimelised kasvajarakke spetsiifiliselt ära tundma ja hävitama. Tsütotoksiliste T-rakkude (CTL) eraldamine kasvajat infiltreerivatest rakupopulatsioonidest või perifeersest verest tähendab seda, et sellised rakud on olulised loomulikus immuunkaitses vähi vastu. CD8-positiivsed T-rakud, eriti need, mis tunnevad ära peamise koesobivuskompleksi (MHC) klassi molekule, mis kannavad peptiidide, mis koosnevad tavaliselt 8-12 jäägist, mis on saadud tsütosoolis asuvatest valkudest või defektsetest ribosoomi saadustest (DRPid), mängivad selles vastuses tähtsat rolli. nimese MHC-molekule nimetatakse ka inimese leukotsüütide antigeenideks (HLA). klassi MHC molekule võib leida enamusel tuumaga rakkudel, mis presenteerib peptiide, mis tulenevad peamiselt endogeensete, tsütosoolsete või tuumavalkude, DRPS ja suurte peptiidide proteolüütilisest lõhustamisest. Siiski võib tihti MHC klassi molekulidel leida peptiide, mis on saadud endosomaalsetest kompartmentidest või eksogeensetest allikatest. Sellele klassi mitteklassikalisele esitusele viidatakse kirjanduses kui ristuvale esitlusele. Valkude suhtes, mida peavad ära tundma tsütotoksilised T-lümfotsüüdid kasvajaspetsiifiliste või kasvajaga seotud antigeenidena, ja mida peab kasutama ravis, peavad olema täidetud eraldi eeltingimused. Antigeeni peaksid ekspresseerima peamiselt kasvajarakud ja mitte normaalsed terved koed, või teevad seda võrreldavalt väikestes kogustes. Peale selle on soovitav, et vastav antigeen ei ole mitte ainult olemas kasvaja

18 tüübis, vaid seda on ka suures kontsentratsioonis (s.o vastava peptiidi koopiate arv raku kohta). Kasvajaspetsiifilised ja kasvajaga seotud antigeenid saadakse tihti valkudest, mis on otse kaasatud normaalse raku transformatsiooni kasvajarakuks funktsiooni tõttu, nt rakutsükli kontrollimisel või apoptoosi ajal. Peale selle võivad ka valkude pärivoolu asetsevad märklauad, mis põhjustavad otseselt transformatsiooni, olla ülesreguleeritud ja seetõttu võivad kaudselt olla seotud kasvajaga. Sellised kaudselt kasvajaga seotud antigeenid võivad olla samuti vaktsiinipõhise ravi tegemise märklaudadeks. Mõlemal juhul on oluline, et epitoobid oleks antigeeni aminohapete järjestuses, kuna selline peptiid ( immunogeenne peptiid ), mis on saadud kasvajaga seotud antigeenist, peaks viima in vitro või in vivo T-raku vastuseni. Põhimõtteliselt võib mis tahes peptiid, mis on võimeline siduma MHC molekule, funktsioneerida T-raku epitoobina. n vitro või in vivo T-raku vastuse indutseerimise eeltingimuseks on T-raku olemasolu koos vastava TCR-ga ja selle konkreetse epitoobi immunoloogilise tolerantsi puudumine. Seetõttu on TAA-d lähtepunktiks kasvaja vaktsiini väljatöötamisel. TAA-de identifitseerimise ja iseloomustamise meetodid põhinevad CTL-i kasutamisel, mida võib eraldada patsientidelt või tervetelt isikutelt, või need põhinevad erinevate transkriptsiooniprofiilide või erinevate peptiidi ekspressioonimustrite genereerimisel kasvajate ja normaalsete kudede vahel (Lemmel et al ;Weinschenk et al ). Siiski ei anna kasvaja kudedes või inimese kasvaja rakuliinides üleekspresseeritud geenide identifitseerimine täpset informatsiooni nendest geenidest transkribeeritud antigeenide kasutamise kohta immunoteraapias. See on seetõttu nii, et selliseks kasutamiseks sobivad ainult individuaalsed alampopulatsioonid nende antigeenide epitoopidest, kuna juures peab olema T-rakk koos vastava TCR-ga ja selle konkreetse epitoobi immunoloogiline tolerants peab puuduma või olema minimaalne. Seetõttu on tähtis valida üleeskpresseeritud või selektiivselt ekspresseeritud valkude seast ainult neid peptiide, mis on olemas koos MHC molekulidega, mille vastu saab leida funktsionaalse T-raku. Selline funktsionaalne T-rakk on defineeritud T-rakuna, mis spetsiifilise antigeeniga stimuleerimisel võib klonaalselt laieneda ja on võimeline täitma efektori funktsioone (efektor T-rakk).

19 T-abistajarakud mängivad tähtsat rolli CTL-ide efektorfunktsiooni korraldamisel kasvajavastases immuunsuses. T-abistajaraku epitoobid, mis vallandavad CD8-positiivsete T-tapjarakkude T H1 tüüpi toetavate efektorfunktsioonide T-abistajaraku vastuse, mis hõlmab tsütotoksilisi funktsioone, mis on suunatud kasvajarakkude vastu, näidates kasvajaga seotud peptiidi/mhc komplekse nende rakkude pinnal. Sel viisil saavad kasvajaga seotud T-abistajaraku epitoobid, kas üksi või koos teiste kasvajaga seotud peptiididega, sobida vaktsiinikoostise toimivateks farmatseutilisteks koostisosadeks, mis stimuleerivad kasvajavastast immuunvastust. Kuna mõlemat tüüpi vastused, CD8-st ja CD4-st sõltuvad, toetavad ühiselt ja sünergistiliselt kasvajavastast toimet, on kasvaja vaktsiinide arendamisel tähtis kasvajaga seotud antigeenide, mille tunnevad ära kas CD8-positiivsed CTL-d (MHC klassi molekulid) või CD4-positiivsed CTL-d (MHC klassi molekulid), identifitseerimine ja iseloomustamine. Seetõttu on käesoleva leiutise objektiks peptiidide koostise esitamine, mis sisaldab peptiide, mis seostuvad mõlema klassi MHC kompleksidega. Võttes arvesse tõsiseid kõrvalmõjusid ja vähi raviga seotud kulusid, on meeleheitlikult vaja paremaid prognoosimise ja diagnoosimeetodeid. Seetõttu on vaja määrata teisi faktoreid, mis kujutavad endast üldiselt vähi biomarkereid, ja täpsemalt maovähki. Peale selle on vaja määrata faktoreid, mida saab üldiselt kasutada vähi ja eriti maovähi ravis. Peale selle ei ole kindlaks tehtud raviplaani maovähiga patsientide jaoks, kellel on biokeemiline relaps pärast radikaalset prostatektoomiat, mis on tavaliselt põhjustatud kasvaja in situ jäetud jääkidest paikselt edasiarenenenud kasvaja kasvamise juuresolekul. Soovitatavad on uued terapeutilised lähenemised, mis soosivad madalamat haigestumust koos võrreldava terapeutilise efektiivsusega praegusel ajal kasutatavate lähenemiste suhtes. Käesolevas leiutises esitatakse peptiidid, mis on kasulikud maovähi ja teiste kasvajate ravis, mis ekspresseerib üle leiutise peptiidide. Peptiide, mida esitavad loomulikult HLA molekulid inimese primaarse maovähi proovides, näidati massispektromeetriga (vt näidet 1 ja joonist fig 1). Alggeeni, millest saadi peptiidid näidati maovähis, neeruraku kartsinoomis, käärsoolevähis, mitteväikeserakulises kopsukartsinoomis, adenokartsinoomis, eesnäärmevähis,

20 healoomulises neoplasmas ja halvaloomulises melanoomis tugevasti üleekspresseerituna võrreldes normaalsete kudedega (vt näidet 2 ja joonist fig 2), näidates nende peptiidide kasvajaga seotuse kõrget astet, s.o need peptiidid on tugevasti esindatud kasvaja koes, kuid mitte normaalses koes. HLA-ga seonduvad peptiidid saab ära tunda immuunsüsteem, täpsemalt T-lümfotsüüdid/Trakud. T-rakud saavad hävitada rakud, mis presenteerivad kindlakstehtud HLA/peptiidi kompleksi, nt maovähi kasvajarakke, mis presenteerivad endal peptiidide derivaate. Kõik käesoleva leiutise peptiidid, mis sobisid kokku valideerimisplatvormiga (vt näidet 3), on näidanud T-rakkude vastuse stimuleerimise võimet (vt näidet 3 ja joonist fig 3). Seega on need peptiidid kasulikud immunvastuse genereerimiseks patsiendile ja nende abil saab kasvajarakud hävitada. Patsiendis saab immuunvastuse indutseerida kirjeldatud peptiidide või sobivate eelainete (nt pikendatud peptiidide, valkude või nukleiinhapete, mis kodeerivad neid peptiide) manustamisega otse patsiendile ideaaljuhul koos ainega, mis suurendab immunogeensust (s.o lisaainega). Võib loota, et immuunvastus, mis pärineb sellisest terapeutilisest vaktsineerimisest, on väga spetsiifiline kasvajarakkude vastu, sest käesoleva leiutise märklaudpeptiide ei ole normaalses koes võrreldava koopiate arvuna, vältides soovimatute autoimmuunreaktsioonide riski patsiendi normaalsete rakkude vastu. Ravimkoostis sisaldab peptiide kas vabana või farmatseutiliselt vastuvõetava soolana. Siin kasutatuna viitab farmatseutiliselt vastuvõetav sool avaldatud peptiidi derivaadile, mille puhul on peptiid muudetud tema happe või aluse soolaks. Näiteks happesoolad valmistatakse vabadest alustest (tavaliselt neist, milles ravimi neutraalsel vormil on neutraalne NH 2 rühm), hõlmates reaktsiooni sobiva happega. Happesoolade valmistamiseks sobivate hapete hulka kuuluvad orgaanilised happed, nt äädikhape, propioonhape, glükoolhape, püroviinamarihape, oksaalhape, õunhape, maloonhape, suktsiinhape, maleiinhape, fumaarthape, viinhape, sidrunhape, bensoehape, kaneelhape, mandelhape, metaansulfoonhape, etaansulfoonhape, p-tolueensulfoonhape, salitsüülhape jne, samuti anorgaanilised happed, nt vesinikkloriidhape, vesinikbromiidhape, väävelhape, lämmastikhape, fosforhape ja teised sarnased. Vastupidiselt sellele kasutatakse happe osapoole aluseliste soolade, mis võivad olla peptiidis, valmistamiseks farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli, nagu naatriumhüdroksiid, kaaliumhüdroksiid, ammooniumhüdroksiid, kaltsiumhüdroksiid, trimetüülamiin või muud sarnast.

21 Eriti eelistatud teostuses sisaldab ravimkoostis peptiide äädikhappe sooladena (atsetaatidena) või vesinikkloriidhappe sooladena (kloriididena). Peale selle, et käesoleva leiutise peptiidid on kasulikud vähi raviks, on need kasulikud diagnoosivahenditena. Kuna peptiidid genereeriti maovähi rakkudest ja kuna oli tehtud kindlaks, et neid peptiide ei ole normaalsetes kudedes, saab neid peptiide kasutada vähi olemasolu diagnoosimiseks. Patendinõudlusega kaitstud peptiidide olemasolu koe biopsia proovides saab aidata kaasa vähi diagnoosimisel. Teatud peptiidide leidmisega antikehade, massispektromeetria või tehnika tasemes tuntud teiste meetodite abil saab patoloog öelda, kas kude on pahaloomuline või põletikus või üldiselt haige. Peptiidirühmade juuresolek saab võimaldada haigestunud koe klassifitseerimist või alamklassi määramist. Peptiidide avastamine haigestunud koe proovides saab võimaldada teha otsust ravi kasust, mis hõlmab immuunsüsteemi ja eriti siis, kui on teada või loodetakse, et toimemehhanismi on kaasatud T-lümfotsüüdid. MHC ekspressiooni kadu on põhjalikult kirjeldatud mehhanism, mille puhul nakatatud või pahaloomulised rakud põgenevad immunojärelevalve eest. Seega näitab peptiidide juuresolek seda, et mehhanismi ei kasutata analüüsitud rakkude puhul. Peptiide võidakse kasutada lümfotsüütide vastuse analüüsimiseks nende peptiidide suhtes, nagu T-raku vastused või antikeha vastused peptiidi suhtes või peptiidi suhtes, mis on moodustanud kompleksi MHC molekulidega. Neid lümfotsüüdi vastuseid saab kasutada prognoosivate markeritena edasiste ravietappide üle otsustamiseks. Neid vastuseid saab kasutada samuti asendusmarkeritena immunoteraapia lähenemises, mis püüab indutseerida lümfotsüütide vastuseid erinevate vahenditega, nt valgu vaktsineerimisega, nukleiinhapetega, autoloogsete materjalidega, lümfotsüütide adoptiivse ülekandega. Geeniteraapia paikapanemisel saab arvestada lümfotsüütide vastuseid peptiidide suhtes kõrvaltoimete määramisel. Lümfotsüütide vastuste jälgimine võib olla samuti väärtuslikuks vahendiks translpantatsiooniravi järjekindla vaatlemise jaoks, s.o transplantaat-peremehevastu haiguse avastamiseks.

22 Peptiide saab kasutada spetsiifiliste antikehade genereerimiseks ja arendamiseks MHC/peptiidi komplekside vastu. Neid saab kasutada raviks, valides sihtmärgiks toksiinid või radioaktiivsed ained haige koe suhtes. Nende antikehade teiseks kasutamiseks võib olla radionukliidi valimine sihtmärgiks haige koe suhtes kujutamise eesmärgil, nagu PET. Selle kasutamine saab aidata avastada väikesi metastaase või määrata haige koe suurust ja täpset asukohta. Peale selle saab neid kasutada vähi patoloogilise diagnoosi kinnitamiseks, mis põhineb koeproovidel. Käesolev leiutis on seotud peptiidiga, mille üldine pikkus on 10 kuni 14 aminohapet, mis koosneb järjestusest, mis on valitud rühmast, mis hõlmab a) SEQ D nr 1 sisaldavat järjestust, b) SEQ D nr 1 varianti, mis kutsub esile T-rakkude ristreageerimist leiutise peptiidiga, kus asjaomane variant on valitud järjestusi LQLQGV, LYQLQGVL, LYQLQGV, LQLQGVL ja LQLQGV sisaldavast rühmast. Tabelis 2 näidatakse käesolevale leiutisele vastavaid peptiide, nende vastavaid SEQ D nr ja algvalke, millest need peptiidid võivad tekkida. Kõik peptiidid seonduvad HLA A*024 alleelidega. Tabel 2: Avaldatud peptiidid SEQ D nr: Peptiidi kood Järjestus Algvalk(/-valgud) 1* CDC2-001 LYQLQGV CDK1 2 ASPM-002 SYNPLWLR ASPM 3 UCHL5-001 NYLPMEL UCHL5 4 MET-006 SYDVLPE MET 5 PROM1-001 SYDPLNL PROM1 6 MMP VWSDVTPLT MMP11 7 MST1R-001 NYLLYVSN MST1R 8 NYB-001 VYTTSYQQ NYB 9 SMC4-001 HYKPTPLY SMC4 10 UQCRB-001 YYNAAGNKL UQCRB

23 PPAP2C-001 AYLVYTDRL PPAP2C 12 AVL9-001 YSPVNKL AVL9 13 NU2-001 VYGRLEH NU2 14 ABL1-001 TYGNLLDYL ABL1 15 MUC6-001 NYEETPH MUC6 16 ASPM-001 RYLWATVT ASPM 17 EPHA2-005 VYSKSEQL EPHA2 18 MMP3-001 VKGNQ MMP3 19 NU2-002 RLSGN NU2 20 PLK4-001 QYASRVQL PLK4 21 ATAD2-002 KYLTVKDYL ATAD2 22 COL12A1-001 VYNPTPNSL COL12A1 23 COL6A3-001 SYLQAANAL COL6A3 24 ANC-001 YQPKQQ ANC 25 RPS YYKNGLG RPS11 26 ATAD2-001 AYAKEEL ATAD2 27 ATAD2-003 LYPEVEK ATAD2 28 HSP90B1-001 KYNDTWKE HSP90B1 29 SAH2-001 VDTAAHL SAH2 30 SLC6A6-001 VYPNWAGL SLC6A6 31 QGAP3-001 VYKVVGNLL QGAP3 32 ERBB3-001 VYEKNDKL ERBB3 33 K2C-001 YNGKLDLL K2C * käesolevale leiutisele vastav peptiid Täiendavad huvitavad HLA A*024 peptiidid SEQ D nr: Peptiidi kood Järjestus Algvalk(/-valgud) 34 CCDC88A- QYDKLNEL CCDC88A CCNB1-003 MYMTVSDR CCNB1 36 CCND2-001 RYLPQCSY CCND2 37 CCNE2-001 YAPKLQE CCNE2 38 YPDASLL CEACAM1, CEA-010 CEACAM5,

24 CEACAM6 39 CLCN3-001 VYLLNSTTL CLCN3 40 DNAJC YLEVHNL DNAJC10 41 DNAJC AYPTVKY 42 SKVSL E2S3, E2S3-001 LOC YYYVGAYL E3L, E3L-001 LOC EPPK1-001 RYLEGTSC EPPK1 45 ERBB2-001 TYLPTNASLS ERBB2 46 GPR SYATLLHVL GPR39 47 TGB4-001 DYTGGK TGB4 48 LCN2-001 SYNVTSVL LCN2 49 SYLELVKSL LOC642502, SDHC-001 SDHC 50 PBK-001 SYQKVEL PBK 51 POLD3-001 LYLENDE POLD3 52 PSMD VYSSLALL PSMD14 53 PTK2-001 RYLPKGLNQ PTK2 54 RPS YYKNGLG RPS11 55 TSPAN1-002 VYTTMAEH TSPAN1 56 ZN DYAYLREH ZN ADAM LYQTDHL ADAM10 58 MMP TYKYVDNT MMP12 59 RRM2-001 YSHVLA RRM2 60 TMPRSS4-001 VYTKVSAYL TMPRSS4 61 TSPAN8-001 VYKETCS TSPAN8 Leiutise teises teostused avaldatakse maovähi vastu suunatud HLA A*02 seonduvad peptiidid. A*02 ja/või A*24 positiivsete inimeste puhul on võimalik kasutada avaldatud peptiidide segusid maovähi raviks. Eelistatud on segud, mis koosnevad 2 kuni 20 peptiidist, ja segud, mis koosnevad 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 või 20 peptiidist.

25 SEQ D nr: Peptiidi kood Järjestus Algvalk(/- valgud) 62 DO2-001 ALYDSVLL DO2 63 G2BP3-001 KQELTQV G2BP3 64 LMNB1-001 LADETLLKV LMNB1 65 WNT5A-001 AMSSKLV WNT5A 66 AP-003 YVYQNNYL AP 67 VLEDLEVTV COPG, COPG-001 COPG2, TSGA13 68 COL6A3-002 LLDGSANV COL6A3 69 COL6A3-003 NLLDLDYEL COL6A3 70 COL6A3-004 LDSSEGV COL6A3 71 PSMC2-001 ALDEGDAL PSMC2 72 UBE2S-001 ALNEEAGRLLL UBE2S 73 K LSPTVVS K11 74 ADAM8-001 KLLTEVHAA ADAM8 75 CCNB1-001 ALVQDLAKA CCNB1 76 CDC6-001 LQDRLNQV CDC6 77 2R-001 TLDPRSLL 2R 78 OLM4-001 TLDDLLLY OLM4 79 THY1-001 SLLAQNTSWLL THY1 80 CEP SLAEVNTQL CEP H1A-001 ALDGVMVL H1A 82 KRAS-001 GVDDAYTL KRAS 83 MET-001 YVDPVTS MET 84 NCAPG-001 YLLSYQS NCAPG 85 NCAPG-002 QDDVTK NCAPG 86 TOP-004 YLYGQTTTYL TOP2A 87 TOP-005 KLDETGNSL TOP2A 88 LAMC2-002 RLDDLKMTV LAMC2 89 AHR-001 LTDELTYV AHR 90 CCNB1-002 LDWLVQV CCNB1

26 CEACAM6- VLYGPDVPT CEACAM COPB1-001 SGEDALANV COPB1 93 HMMR-001 KLLEYEE HMMR 94 TPX2-001 KLEDVVGV TPX2 95 KDELVNA TOP2A, TOP-001 TOP2B Raku jagunemise tsükli 2 valk (CDC2) Seriin/treoniin kinaas CDC2, mida tuntakse ka Cdk1-na (tsükliinist sõltuv kinaas 1), mängib olulist rolli rakutsükli juhtimises. Seda tuntakse G2 faasis M faasi ülemineku peamise reguleerijana. nterfaasi lõpus seondub see A-tüüpi tsükliinidega. Pärast tuumamembraani lagunemist asenduvad A-tüüpi tsükliinid B-tsükliiniga, mis moodustab mitoosi tekitava faktori (MP) Cdc2-ga. MP on oluline rakkude mitoosist läbiviimiseks. Cdc2 toimimine mitoosis on mitteredundantne ja seda pole võimalik kompenseerida teiste Cdk-de, nagu Cdk 2, 4 ja 6, aktiivsusega. Võrdlusena märgiti Cdc2 toimimist rakutsükli teistes faasides, nagu ka G1-S üleminek, ja see suudab asendada interfaasi Cdk-sid. Seetõttu on Cdc2-te peetud ainsaks essentsiaalseks rakutsükli Cdk-ks. Cdc2 üleekspressiooni leiti mitmes vähis, mis on tihti seotud kehva prognoosiga. Nende hulgas on eesnäärmekartsinoom, suuõõnekartsinoomid, neelu lamerakuline kartsinoom (OSCC), akuutne müeloidne leukeemia (AML) (Qian et al.), H. pylori indutseeritud MALT-lümfoom (Banerjee et al ) ja käärsoolekartsinoom (Yasui et al ). Maokartsinoomis on märgitud üleekspressiooni ja/või suurenenud aktiivsust ning sellel võib olla kausatiivne roll. Cdc2 ja muude Cdk-de inhibiitoreid on käsitletud ravimikandidaatidena vähiraviks (Shapiro ). Abnormaalne käävilaadne mikrotsefaaliga seotud valk (ASPM) Abnormaalne käävilaadne mikrotsefaaliga seotud valk (ASPM) on drosofiilia abnormaalse käävi (asp) inimortoloog. See osaleb neurogeneesi reguleerimises ja mutatsioon põhjustab autosomaalset retsessiivset primaarset mikrotsefaaliat. ASPM on mitoosi ajal lokaliseeritud käävi poolustes. ASPMi üleekspressioon pakuti välja marker ja potentsiaalse terapeutilise sihtmärgina gliobastoomis. sirna poolt vahendatud allareguleerimine takistab

27 kasvajarakkude proliferatsiooni ja neutraalsete tüvirakkude proliferatsiooni. ASPMi üleekspressioon võib samuti prognoosida suuremat invasiivset/metastaatilist potentsiaali, varajast kasvaja taasesinemist ja hepatotsellulaarse kartsinoomi halba prognoosi. ASPM oli ülereguleeritud pidevalt paljunevates rakkudes ja mitteväikeserakulise kopsuvähi kudedes (Jung, Choi, and Kim ). Maatriks metalloproteaas 3 (MMP3) MMPγ, mida nimetatakse samuti proželatinaasiks või stromelüsiin-1-ks, on endopeptidaas, mis lõhustab rakuvälise maatriksi (ECM) komponente, nagu fibronektiin, laminiin, elastiin, proteoglükaani südamiku valk ja kollageenide mittespiraalsed piirkonnad. MMP-d on tähtsad mitmes füsioloogilises protsessis, mis nõuavad ECMi ümberkorraldamist, nagu rakkude migratsioon embrüogeneesi ajal, kudede ümbermodelleerimine, vaskularisatsioon, lakteeriva rinna involutsioon ja haavade paranemine. MMP3 mängib samuti tähtsat rolli trombotsüütide agregatsioonis. MMP3 suurema ekspressiooni ja eritumisega seotud patoloogilised seisundid hõlmavad autoimmuunseid põletikulisi seisundeid ja vähki. MMP3-e ekspresseeritakse üle mõnes kasvajas ja sellel on roll epiteliaal-mesenhümaalses transitsioonis (EMT). See võib samuti aidata kaasa kartsinogeneesi varastes etappides, vallandades epigeneetilised muutused, mis põhjustavad pahaloomulise fenotüübi tekkimist (Lochter et al ). MMP3 promootri polümorfismid, mis on seotud ekspressiooni tasemetega, mõjutasid mõne vähi riski ja prognoosi näiteks söögitoru adenokartsinoomi (Bradbury et al ) ja neelu lamerakulise kartsinoomi (Vairaktaris et al ) (Liu et al ) puhul. H.pylori-positiivsed maovähi patsiendid kõrgenenud MMP3- ja MMP7-seerumi tasemetega näitasid lümfisõlmede suuremat invasiooni ja lühemat elulemist. 74-st maovähi patsiendist koosnevas kohordis väljendus MMP3 27% juhtudest (Murray et al ). c-met c-met vahendab hepatotsüklilise kasvuteguri (HG)/hajumisteguri potentsiaalselt onkogeenseid tegevusi, sh rakukasvu, liikuvust, elulemist, ekstratsellulaarse maatriksi lahustumist ja angiogeneesi soodustamist. HGi seondumine aktiveerib signaali sündmused pärivoolu, sealhulgas ras, fosfatidüülinositool γ -kinaasi, fosfolipaasi C ja mitogeeni aktiveeritud valgu kinaasiga seotud rajad (Dong et al ;urge et al ;urge, Zhang, and Vande Woude ;Montesano et al ;Naldini et al ;Ponzetto et al ). c-meti ekspresseeritakse peamiselt epiteelirakkudes. c-meti onkogeenne

28 aktiveerimine (samuti mitteepiteelsetes pahaloomulistes rakkudes) võib tuleneda võimendamisest/üleekspressioonist, mutatsioonide aktiveerimisest või HG/c-Meti autokriinsete silmuste või kindlaksmääratud fosforüülimise omandamisest (Di Renzo et al ;erracini et al ;ischer et al ;Koochekpour et al ;Li et al ;Maulik et al ;Qian et al ;Ramirez et al ;Tuck et al ) (Nakaigawa et al ). c-meti kindlaksmääratud aktiveerimine HGüleekspresseeritud transgeensetes hiirtes soodustab ulatuslikku tumorigeneesi (Takayama et al ;Wang et al ). MET-i vaigistamine inhibeerib kasvaja kasvu ja metastastaseerumist (Corso et al ). METi võimendamist on seostatud inimese maovähi progressiooniga (Lin et al ).(Yokozaki, Yasui ja Tahara 49-95). Ubikvitiin karboksüterminaalne hüdrolaas L5 (UCHL5) UCHL5, mida nimetatakse ka ubikvitiin C-terminaalseks hüdrolaasiks (UCH37) või NO80R, on proteasoomiga seotud deubikvitinaas. See lagundab valguga seotud polüubikvitiinahelaid distaalsest otsast, lõhustades isopeptiidsideme C-terminaalse Cys76 ja Lys48 vahel (Nishio et al ). Tuumas on UCHL5 seotud no80 kromatiini remodelleerimise kompleksiga. Proteasoomi sidumise korral see aktiveerub ja võib aidata kaasa transkriptsiooni reguleerimisele või DNA parandamisele, mille vahendamist no80 ja proteasoomi poolt on arvatud. Ubikvitiinspetsiifilised proteaasid, nagu UCHL5, osalevad mitmes protsessis, nagu rakutsükli progressiooni, diferentseerimise, DNA replikatsiooni ja parandamise, transkriptsiooni, valgu kvaliteedi kontrolli, immuunvastuse ja apoptoosi juhtimine. UCHL5 võib aidata kaasa pahaloomulisele transformatsioonile. Selle aktiivsuse ülereguleeritust on täheldatud inimese emakakaela kartsinoomi kudedes, võrrelduna kõrvalasuvate normaalsete kudedega. See on võimeline deubikvitineerima ning seetõttu ka TG-beeta retseptorit ja selle pärivoolu paiknevaid mediaatoreid, Smade, stabiliseerima, parandades seega TGbeeta signaali. Suurenenud TG-beeta signaal võib toimida kasvaja promootorina vähiprogressiooni hilistes staadiumides, hoolimata selle duaalsest funktsioonist, ja see võib olla samuti kasvaja supressor varastes staadiumides ja enne initsieerimist (Bierie ja Moses 29-40;Horton et al ;Wicks et al ;Wicks et al ). Makrofaagi stimuleeriva valgu retseptor (MST1R)

29 MST1R-(ehk RON-)retseptor kuulub rakupinnaretseptori türosiinkinaaside Met perekonda ning see väljendub peamiselt epiteelrakkudes ja makrofaagides. MST1R võib indutseerida rakkude migratsiooni, invasiooni, levikut ja elulemist vastusena selle ligandile. Onkogeenseid omadusi on esinenud in vitro ja ka loommudelites in vivo ning seda on tihti dereguleeritud inimese vähkides (Dussault ja Bellon, 2009). Kliinilised uuringud on näidanud, et MST1R üleekspressioon on seotud kehva diagnoosi ja metastaseerumisega. MST1R ekspressiooni esineb olulisel määral maokartsinoomi koes ja vastavas paraneoplastses koes, kuid seda pole täheldatud normaalses mao limaskestas (Zhou et al ). MST1R allareguleerimine eesnäärmevähi rakkudes põhjustab endoteelse raku kemotaksise vähenemist in vitro ning vähenenud kasvaja kasvu ja vähenenud mikrosoonte tihedust ortotoopse transplantatsiooni järel eesnäärmesse in vivo. sirna poolt vahendatud MST1R nokaut äärmiselt tumorigeense käärsoole rakuliinis põhjustas vähenenud proliferatsiooni, võrrelduna kontrollrakkudega. Kinesiini sarnane valk (K2C)K2C on mikrotuubuli depolümeraas, mis reguleerib kinetohoor mikrotuubuli nõuetekohast kinnitumist käävi moodustamise ajal. See on oluline anafaasi kromosoomide segregatsiooniks ja võib olla vajalik õde-tsentromeeri eraldumise alguse koordineerimiseks. Häiritud mikrotuubuli kinnitumine kinetohooridele põhjustab kromosoomide vääralt segregeerimist ja aneuploidsust, mida on täheldatud enamikes soliidtuumorites (Maney et al ;Moore ja Wordeman ). K2C on rinnavähi rakkudes (Shimo et al ), käärsoolevähis, kolorektaalvähis ja maovähis (Nakamura et al ) üleekspresseeritud. Maovähi rakuliin (AZ521), mis ekspresseeris K2C-d stabiilselt, näitas suurenenud proliferatsiooni ja migratsiooni, võrrelduna DNA-vabalt transfekteeritud rakkudega. K2C suurenenud ekspressioon maovähis võib olla seotud lümfaatilise invasiooni, lümfisõlme metastaasi ja kehva diagnoosiga. Rinnavähirakkude ravi väikese vaheleastuva RNA-ga K2C vastu takistas nende kasvu. Kromosoomi struktuuri säilitavad valgud 4 (SMC4) SMC-valgud on kromosomaalsed ATP-aasid, millel on roll kõrgema järgu kromosoomide organiseerimises ja dünaamikas. SMC4 on kondensiinkompleksi südamiku komponent, millel on roll täita kromatiini kondensatsioonis ja mida on samuti seostatud nukleolaarse segregatsiooni, DNA parandamise ja kromatiini struktuuri säilitamisega. SMC4-geeni kõrgemääralist ekspresseerimist täheldati normaalses ees- ja süljenäärmes, väga nõrgalt käärsooles, kõhunäärmes ja soolestikus ning mitte üldse teistes kudedes. RNA

30 ekspressiooni täheldati kõrgetel tasemetel mitmetes vähirakuliinides ja vähiproovides, sh rinna-, eesnäärme-, käärsoole- ja kõhenäärmevähk (Egland et al ). A-tüüpi efriini retseptor 2 (EPAH2) Eph-retseptorid on retseptori türosiini kineaasi (RTK) ainulaadne perekond, mis mängib kriitilisi rolle embrüonaalse mustri kindlaksmääramises, neuronaalses sihtmärgistamises ja vaskulaarses arengus normaalse embrüogeneesi ajal. EphA2 stimuleerimine selle ligandiga (efriin-a1) põhjustab EphA2 autofosforülatsiooni, stimuleerimine annab pöördkäigu onkogeneetilisele transformatsioonile. Eph-retseptorid ja nende ligandid, efriinid, on tihti üleekspresseeritud mitmetes erinevates vähkides. EphA2 on tihti üleekspresseeritud ja funktsionaalselt muudetud agressiivsetes kasvajarakkudes ning arvatakse, et see soodustab kasvaja kasvu, parandades raku ekstratsellulaarse maatriksi adhesiooni, kinnitussõltumatut kasvu ja angiogeneesi. EphA2 ja EfriinA-1 üleekspressioni näidati maokartsinoomis, mis on seotud kasvaja invasiooni sügavuse, kasvaja-sõlme-metastaasi (TNM) staadiumide, lümfisõlmede metastaasi ja kehva prognoosiga (Yuan et al ). ATAD2 ATAD2 (mida nimetatakse ka ANCCA-ks) on AAA+ ATPaasi perekonna valkude uus liige. See suurendab androgeeni retseptori (AR) ja östrogeeni retseptori (ER) transkriptiivseid toiminguid, mis põhjustab geenide transkriptsiooni, sh vastavalt G1R, RS-2, SGK1 ja elulemine (AR) ning tsükliin D1, c-myc ja E21 (ER). See parandab samuti c-myc transkriptsionaalset tegevust. ATAD2-e ekspressioon on kõrge mitmes inimkasvajas, sh rinnavähis, eesnäärmevähis ja osteosarkoomis. Ekspressiooni on seostatud kehva prognoosiga. AVL9 Üllatavalt leiti käesolevat valku algvalguna ning AVL9 valgu ja vastava geeni funktsiooni kohta on saadaval ainult kehvad ja väga piiratud andmed. Kollageeni alfa-1(x) ahela valk (Col12A1) Kollageeni alfa-1(x) ahel on valk, mida kodeerib inimestes COL12A1 geen. See geen kodeerib X-tüüpi kollageeni alfa-ahelat, mis on ACT (fibrillidega seotud kollageenid kolme katkestatud heeliksiga) kollageenide perekonna liige. X-tüüpi kollageen on homotrimeer, mida leidub seotult -tüübi kollageeniga, mille sideme puhul arvatakse, et see

31 modifitseerib sidemeid kollageen fibrillide ja ümbritseva maatriksi vahel. On tuvastatud erinevaid isovorme kodeerivaid erinevalt splaissitud transkripti variante. Kollageeni alfa-3(v) ahela valk (COL6A3) COL6A3 kodeerib alfa-3 ahelat, üht V-tüüpi kollageeni kolmest alfa-ahelast. Valgu domeenid on näidanud üles ekstratsellulaarsete maatriksvalkude sidumisvõimet: sidet, mis selgitab käesoleva kollageeni tähtsust maatriksi komponentide organiseerimisel. Ekstratsellulaarse maatriksi ümbermodelleerimine kollageen V üleekspressiooni kaudu aitab kaasa tsisplatiiniresistentsusele munasarjavähi rakkudes. Kollageen V kohalolu korreleerub kasvaja astmega, munasarjavähi prognoosiva teguriga (Sherman-Baust et al ). COL6A3 on üleekspresseeritud kolorektaalses kasvajas (Smith et al ), süljenäärmekartsinoomis (Leivo et al ) ja diferentsieeritult ekspresseeritud maovähis (Yang et al ). COL6A3 tuvastati ühena seitsmest kasvajaspetsiifilise splaissimise variandiga geenist. Kinnitatud kasvajaspetsiifilised splaissimise muudatused olid äärmiselt järjepidevad, võimaldades selgelt eristada normaalseid ja vähiproove ning mõnel juhul isegi erinevaid kasvajastaadiume (Thorsen et al ). anconi aneemia, komplementaarrühm (ANC) ANC-valk lokaliseerub kromatiinile vastusena DNA kahjustusele ning osaleb DNA parandamises (Smogorzewska et al ). ANC-geeni mutatsioonid põhjustavad anconi aneemiat: geneetiliselt heterogeenset retsessiivset haigust, mida iseloomustab tsütogeneetiline ebastabiilsus, hüpersensitiivsus DNA ristsidemeid moodustavate ainete suhtes, suurenenud kromosomaalne lagunemine ja defektne DNA parandamine. ANCi alternatiivse splaissimise tulemuseks on kaks transkripti varianti, mis kodeerivad erinevaid isovorme. Kuumašoki valk 90 kda beeta-liige 1 (HSP90B1) HSP90 (mida tuntakse ka kui glükoosreguleeritud valk 94, Grp94), liige 1 on inimese tugivalk. See osaleb ER-ga seotud protsessides: translatsioon, valgu kvaliteedi kontroll ja ER-ga seotud lagundamine (ERAD), ERi stressi tuvastamine ja kaltsiumi sidumine / kaltsiumi säilitamine ERis (Christianson et al ;u ja Lee ). HSP90 sisaldab KDEL-järjestust, mis on tüüpiline ER-säilitatud valkude jaoks, kuid seda ilmneb samuti kasvajarakkude pinnal (Altmeyer et al ) ning ekstratsellulaarselt. HSP-de vabanemist nekrootilistest (kuid mitte apoptootilistest) rakkudest ja erinevate stimulantide,

32 nagu kuumašokk ja oksidatiivne stress, poolt stressitud rakkude vabanemist on täheldatud ning seda võib esineda ringluses (Basu et al ;Tsan ja Gao ). Ekstratsellulaarselt moduleerib (peamiselt stimuleerib) HSP90 immuunvastuseid ja osaleb antigeenide esitamises. Raku pinnal võib see toimida patogeeni sisenemise ja/või signaali retseptorina (Cabanes et al ). Kasvajaspetsiifilise raku pinna ekspressiooni või vabanemise korral võib see indutseerida kasvajavastast immuunsust (Zheng et al ). HSP90-põhised vaktsiinid on näidanud immunitseerimist vähi ja nakkushaiguste vastu nii profülaktilistes kui ka raviprotokollides (üle vaadatud (Bolhassani ja Rafati ;Castelli et al ;Murshid, Gong ja Calderwood ) poolt). Samas on võimalik HSP90 käsitleda ka kasvajaravi sihtmärgina, kuna 1) see on korrelatsioonis kasvaja progressiooniga ja see põhjustab resistentsust apoptoosi (ning ka kiiritus- või kemoteraapia) suhtes ning 2) see on üleekspresseeritud mitmes kasvajas, sh maovähk, osteosarkoom (Guo et al ), rinnakartsinoom (Hodorova et al ). HSP90 üleekspressioon on seotud maovähi agressiivse käitumise ja kehva prognoosiga (Wang, Wang ja Ying 35-41;Zheng et al ). HSP90 allareguleerimine maovähis põhjustab vähirakkude apoptoosi (Sheu, Liu ja Lan e1096). Muc 6 MUC6 ekspresseeritakse limaskesta rakkudes. Selle primaarseks funktsiooniks peetakse haavatavate epiteelpindade kaitset suure hulga endogeensete kaustiliste või proteolüütsete ainete suhtes pideva paljastatuse kahjulike mõjude eest (Toribara et al., 1997). MUC6-l võib samuti olla oluline roll epiteelorganogeneesis (Reid ja Harris, 1999). MUC6 ekspressiooni on täheldatud normaalses mao limaskestas. Seda ekspresseeritakse üle mõnes vähis, nagu intestinaalne adenoom ja kartsinoom, pulmonaarkartsinoom (Hamamoto et al ), kolorektaalsed polüübid (Bartman et al ) ja rinnakartsinoom (Pereira et al ), samas pole seda ekspresseeritud vastavates normaalsetes kudedes. MUC6-e kõrge ekspressioonimäär mutsinoosse kartsinoomi puhul toimib väidetavalt tõkkena vähkrakkude levimise vastu, mille tulemuseks on nende vähemagressiivne bioloogiline käitumine (Matsukita et al ). MUC6 ekspressioon oli madalam maokartsinoomis kui adenoomis või normaalses limaskestas ning see oli vastupidiselt korrelatsioonis kasvaja suuruse, invasiooni sügavuse, lümfaatilise ja venoosse invasiooni, lümfisõlmede metastaasi ja UCC staadiumiga. MUC6 allareguleerimine võib aidata kaasa mao epiteelrakkude pahaloomulisele transformatsioonile ja luua molekulaaralused maokartsinoomi kasvuks, invasiooniks, metastaasiks ja diferentseerimiseks (Zheng et al ). Samuti on

33 tõendeid, et Helicobacter pylori infektsioon, üks maokartsinoomi peamiseid põhjuseid, on seotud MUC6-e vähenenud ekspressiooniga (Kang et al ;Wang ja ang ). Kinetohoorvalk Nuf2 NU2 (CDCA-1) geen kodeerib valku, mis on äärmiselt sarnane pärmi Nuf2-le: tsentromeeriga seotud säilitatud valgukompleksile. Pärmi Nuf2 kaob tsentromeerilt meiootilise profaasi ajal, kui tsentromeerid kaotavad oma sideme käävi polaarsuse kehaga, ning mängib reguleerivat rolli kromosoomide segregatsioonis. On näidatud, et surviviini ja hnuf2 csirna-d reguleerivad ajutiselt oma mrna-d alla, põhjustades vastavalt multinukleatsiooni ja rakusurma mitootilise seiskumise kaudu (Nguyen et al ). Nuf2 ja Hec1 on vajalikud stabiilse mikrotuubuli positiivse poole seostumissaitide organiseerimiseks välisplaadis, mis on vajalikud poolusesuunaliste jõudude säilitamiseks, mis on vajalikud kinetohooride biorientatsiooniks (DeLuca et al ). Nuf2 valgu üleekspressiooni täheldati NSCLC-s, mis on seotud kehva prognoosiga (Hayama et al ), ja emakakaelavähis (Martin et al ). Kirurgiliselt resekteeritud maovähirakkudes (diffuusne tüüp, 6; intestinaalne tüüp, 4) olid 2 NU2 varianti ülesreguleeritud. Käesolevas uuringus tuvastatud alternatiivseid splaissimisvariante peetakse potentsiaalselt kasulikeks diagnostilisteks markeriteks ja/või uuteks sihtmärkideks vähivastases ravis (Ohnuma et al ). sirna poolt vahendatud allareguleerimine NU2 vastu takistab tulemuste kohaselt rakkude proliferatsiooni ja apoptoosi indutseerimist NSCLC-s, munasarjavähis, emakakaelavähis, maovähis, kolorektaalses vähis ja glioomis (Kaneko et al ). Lipiidfosfaat fosfohüdrolaas 2 (PPAP2C) osfatiidhappe fosfataasid (PAPid) muundavad fosfatiidhapet diatsüülglütserooliks ja osalevad glütserolipiidide de novo sünteesis ning retseptori poolt aktiveeritud signaali transduktsioonis, mida vahendab fosfolipaas D. Täheldatud on kolme alternatiivselt splaissitud transkripti variant, mis kodeerivad distinktiivseid isovorme. PPAP2C on ülesreguleeritud transformeeritud primaarsetes täiskasvanud inimese mesenhümaalsetes tüvirakkudes (MSC-d) ja mitmetes inimese vähkides. See võib olla vajalik rakkude proliferatsiooni suurendamiseks. PPAP2C üleekspressioon, kuid mitte katalüütiliselt inaktiivne mutant, põhjustas enneaegset sisenemist S-faasi, millega kaasnes enneaegne tsükliin A akumuleerimine. Allareguleerimine vähendab rakkude proliferatsiooni, viivitades S-faasi sisenemist (lanagan et al ).

34 S ribosomaalne valk S11 on valk (RPS11) Ribosoomid koosnevad väiksest 40S allüksusest ja suurest 60S allüksusest. Ühiselt koosnevad need allüksused 4 RNA liigist ja umbes 80 struktuurselt distinktiivsest valgust. RPS11-geen kodeerib ribosomaalset valku, mis on 40S allüksuse komponent. RPS11 oli kuue geeni hulgas, mis leiti kolorektaalse vähi diagnoosi määramise ajal fekaalsete RNApõhiste markerite skriinimisel. Seda leiti spetsiifiliselt vähipatsiendilt võetud fekaalkolonotsüütides (Yajima et al ). E3 ubikvitiinvalgu ligaas Seitse in absentia homoloog 2 (SAH2) SAH2 on E3 ubikvitiini ligaas. Selle substraatide hulka kuuluvad beeta-kateniin, TRA2 ja DCC (kustutatud kolorektaalses vähis) (Habelhah et al ;Hu ja earon ;Nakayama, Qi ja Ronai ). SAH2 viib ka nukleaarvalgu repp86 lagunemiseni, mis põhjustab käesoleva valgu üleekspressiooniga indutseeritud mitootilise seiskumise tühistamist (Szczepanowski et al ). SAH2-l on nii kasvajat kui ka metastaasi soodustavad omadused vähemalt kahe raja kaudu, üle vaadatud (Nakayama, Qi ja Ronai ) poolt: esiteks põhjustab see valkude ubkvitinatsiooni ja lagunemist hüpoksia vastuse rajal, mis viib hüpoksiat indutseerivate tegurite (Hid) transkriptsiooni suurenemiseni (Nakayama, Qi ja Ronai )(Calzado et al ). Teiseks supresseerib see Sprouty2, Ras/ERK signaali spetsiifilise inhibiitori. SAH2 aktiivsus on korrelatsioonis eesnäärmekasvaja arenguga tõenäoliselt selle positiivse mõju kaudu Ras-signaalile (Nakayama, Qi ja Ronai ). Kuigi SAH2 roll vähis on osaliselt vastuoluline, näitavad mõned aruanded SAH2 madalate tasemete seost kehvemate prognooside ja ravivastustega (Confalonieri et al ) (Jansen et al ), teised näitavad tumorigeenset funktsiooni (rasor et al ). SAH2 inhibitsiooni on kaalutud vähivastase ravina, kuna selle puhul on täheldatud ksenograafide kasvu takistamist melanoomi hiirmudelites (Qi et al ;Shah et al ) ning inimese kopsuvähi rakuliinides, mis on transplanteeritud karvututesse hiirtesse (Ahmed et al ). Naatrium- ja kloriidsõltuv tauriini transportija (SLC6A6) SLC6A6 on naatrium- ja kloriidsõltuv tauriini transportija (TauT) (Han et al., 2006). Tauriini transportija nokaut(taut-/-)hiirtel on krooniline maksapuudulikkus tauriinipuudulikkuse tõttu, mis võib hõlmata mitokondrilist düsfunktsiooni (Warskulat et

35 al., 2006). SLC6A6 ekspressioon on represseeritud p53 kasvaja supressorgeeni poolt ja seda transaktiveerib protoonkogenees, nagu WT1, c-jun ja c-myb. SLC6A6 üleekspressioon kaitseb neerurakke tsisplatiiniga indutseeritud nefrotoksilisuse eest (Han et al., 2006; Han ja Chesney, 2009). SLC6A6 mrna ekspressiooni reguleeris üles kasvaja nekroosi tegur alfa (TN-alfa) inimese intestinaalsetes epiteelsetes Caco-2 rakkudes (Mochizuki et al., 2005). Ubikinool-tsütokroom c reduktaasi siduv valk (UQCRB) UQCRB-geeni kodeerinud valk on osa ubikinool-tsütokroom c oksidoreduktaasi kompleksist. See seob ubikinooni ja osaleb elektronide edastamises. Käesoleva geeni mutatsioonid on seotud mitokondriaalse kompleksi puudulikkusega. Pseudogeeni on kirjeldatud X-kromosoomis. UQCRB-geen võib olla potentsiaalselt onkogeenne või kasvaja supressorgeen kõhunäärme juha adenokartsinoomis (Harada et al ). Selle üleekspressiooni on täheldatud hepatotsellulaarses kartsinoomis (Jia et al ) nimese epidermaalse kasvuteguri retseptor 3 (ERBB3) ERBB3 kodeerib retseptori türosiinkinaaside epidermaalse kasvuteguri retseptori (EGR) perekonna liiget. Selle aktiveerivad neureguliinid, teised ERBB- ja mitte-erbb-retseptorid ja muud kinaasid ning uudsed mehhanismid. Pärivoolu suhtleb see prominentselt fosfoinositool 3-kinaasiga/ATK-elulemise/mitogeense rajaga, kuid ka GRB, SHC, SRC, ABL, rasgap, SYK ja transkriptsiooni regulaatoriga EBP1 (Sithanandam ja Anderson ). ERBB3 üleekspressiooni on täheldatud mitmes vähis, sh maovähk, kus sellel võib olla võtmetähtsusega kausatiivne roll ja see võib negatiivselt prognoosi mõjutada (Kobayashi et al ) (Slesak et al ). (Zhang et al ) leidsid, et ERBB3 üleekspressioon oli sagedasem maovähi difuusse tüübi puhul (26,2%) kui intestinaalse tüübi puhul (5,0%). Mõlema tüübi puhul oli üleekspressioon seotud kehva prognoosiga. Lähenemised ERBB3 sihtmärgistamiseks vähiravis hõlmavad RNA aptameere ekstratsellulaarses domeenis (Chen et al ), selle geeniekspressiooni blokeerimist sünteetiliste transkriptsioonitegurite poolt (Lund et al ), väiksemolekulisi inhibiitoreid, nagu E-vitamiini isomeeri -tokotrienool (Samant ja Sylvester ), mirna (Scott et al ) ja sirna (Sithanandam et al ).

36 Prominiin 1 (Prom1) unktsioon: prominiin-1, mida nimetatakse ka CD133-ks, tuvastati CD34+ hematopoeetiliste progenitorrakkude jaoks spetsiifilise molekulina (Yin et al., 1997) ja seda näidati erinevate kudede normaalsete tüvirakkude ja vähi tüvirakkude (CSC-d) markerina. See asub peamiselt plasmamembraani protrusioonides ja võib osaleda membraani topoloogia korraldamises või plasmamembraani lipiidkompositsiooni säilitamises. Tehti ettepanek, et prominiin-1 splaissi isovorm, mille nimetus on AC133-2 ja millel puudub 27 aminohappe väike ekson, võib esindada veelgi paremat tüviraku markerit (Mizrak et al., 2008; Bidlingmaier et al., 2008). Ainult väike protsent kasvajarakkudest on tavaliselt prominiin-1 positiivsed, mis on CSCmarkeri puhul ootuspärane. Sõltuvalt kasvaja tüübist ulatub positiivsete rakkude arv kasvaja massis 1 kuni 15 %-ni ning üldiselt umbes 2 %-ni. Prominiin-1 on seostatud kasvaja moodustamise, angiogeneesi ja kemoresistentsusega (Zhu et al., 2009a) (Bruno et al., 2006; Hilbe et al., 2004) (Bertolini et al., 2009). Samas võivad prominiin-1 positiivsed rakud olla immuunsüsteemi jaoks juurdepääsetavad, kuna neid on võimalik tappa NK-rakkudega (Castriconi et al., 2007; Pietra et al., 2009) ja tsütotoksiliste T-rakkudega (Brown et al., 2009). Kuigi mitme vähivormi puhul on näidatud, et prominiin-1 positiivsed rakud on funktsionaalselt CSC-d ja ekspressiooni on sagedasti seostatud kehva prognoosiga, on endiselt vastuolusid. Mõned aruanded väidavad, et see pole vajalik ega piisav CSC-de tuvastamiseks (Cheng et al., 2009; Wu ja Wu, 2009). On võimalik, et prominiin-1 kombinatsioon teiste molekulidega, nagu CD44, või isegi mitu kombinatsiooni, nagu prom1(+), CD34(+), CD44(+), CD38(-), CD24(-), toimivad paremate CSC-markeritena (Zhu et al., 2009b; ulda ja Pervaiz, 2010). Diffuusse GC korral väideti PROM1 ekspressiooni in silico analüüsi põhjal (Katoh ja Katoh, 2007) ja üleekspressiooni GC-s võrrelduna tavaliste maokudedega valkude tasemel käsitlesid aruandes (Smith et al., 2008). Samas raporteerisid (Boegl ja Prinz, 2009), et prominiin-1 ekspressioon GC-s vähenes (eelkõige hilisemates staadiumides), ning väitsid, et prominiin-1 ekspressioon on korrelatsioonis pigem angiogeneesi (mis samuti hilisemates staadiumides väheneb) kui kasvaja kasvuga. GC rakuliine kasutav uuring (Takaishi et al., 2009) väidab, et CD44, mitte prominiin-1, on GC CSC-marker. Maatriks metalloproteinaas 11 (MMP11)

37 Sarnaselt teiste MMP-dega omab MMP11 endopeptidaas funktsioone protsessides, mis vajavad kudede ümbermodelleerimist, nagu areng, haavade paranemine ja armide moodustumine. See võib samuti rasvade homeostaasi negatiivselt reguleerida, vähendades adipotsüüdi diferentseerumist. Erinevalt teistest MMP-dest ei suuda see lõhustada tüüpilisi ekstratsellulaarseid maatriksmolekule, v.a kollageen V. Samas on tuvastatud teisi substraate, nagu alfa-2-makroglobuliin, kindlad seriinproteaasi inhibiitorid (serpiinid), sh alfa-1-antitrüpsiin, insuliinilaadne kasvutegurit siduv protein-1 ja laminiini retseptor. Vähi puhul on MMP11 peamiselt ekspresseeritud vähikudesid ümbritsevates stroomarakkudes. Seda on näidatud mitme kasvaja vormi puhul. Märgiti, et MMP11 on üleekspresseeritud enamikul invasiivsete inimkartsinoomide stroomas, kuid harva sakroomis ja muudes mitteepiteelsetes kasvajates. Enamikul (kuid mitte kõigil) juhtudel on MMP11 ekspresseeritud strooma rakkudes otse kasvaja kõrval, samas kui kasvajarakud ise, normaalsed rakud ja kasvajast kaugel asuvad strooma rakud on negatiivsed MMP11 kõrgemad tasemed on korrelatsioonis pahaloomulise fenotüübi / kõrgema invasiivsuse ja kehva prognoosiga. Samas oli kilpnäärmekartsinoomis MMP11 ekspressioon vastupidiselt seotud agressiivsete omadustega. MMP11 leiti kasvaja koes ja maovähipatsientide seerumis ning ekspressioon oli korrelatsioonis metastaasiga (Yang et al.). (Deng et al ) näitas, et MMP11 on kõrgelt ekspresseeritud kasvaja rakuliinides ja maovähi primaarses kasvajas (erinevalt teistest vähi tüüpidest, mis ei asu ainult stroomas) ning et see näib parandavat kasvajarakkude proliferatsiooni. Nukleaartranskriptsiooni teguri Y allüksus beeta (NYB) NYB, mida nimetatakse ka CB-B-ks või CB-A-ks, moodustab lisaks NYA-le ja NYC-le osa heterotrimeersest basaalsest transkriptsioonifaktorist N-Y (samuti CCAATd siduv faktor või CB), mis seondub CCAAT-motiivide või pöördmotiividega, ATTGG, mida nimetatakse Y-boksiks, mitmete geenide promootorites ja võimendajates. N-Y sihtgeenide hulgas on MHC klassi geenid, PDG beeta-retseptor, mitmed kuumašoki valgud, valepaardumise parandamise geen hmlh1 ja topoisemeraas alfa. NYB pole klassikaline onkogeen, kuid selle funktsioon võib aidata kaasa tumorigeneesile. Esiteks on mitmed rakutsükli geenid, nagu tsükliin A, tsükliin B1, Aurora A ja cdk1, N-Y sihtmärgiks. Rakud seiskuvad G2- / M-faasis ilma funktsionaalse NYB-ta. (Park et al.) näitab, et tsükliin B2-e ja muude rakutsükliga seotud geenide ülesreguleerimine kolorektaalses adenokartsinoomis on põhjustatud N-Y tegevusega. Teiseks on N-Y aktiivsusel vastumõju apoptoosi suhtes. N-Y-puudulikkusega rakud läbivad apoptoosi p53

38 aktiveerumise ja oma promootorites CCAAT-boksi sisaldavate antiapoptootiliste geenide, nagu Bcl-2, transkriptsiooni vähenemise tõttu. Kolmandaks suurenevad tumorigeensed omadused koosmõjul teiste transkriptsioonifaktoritega. Näiteks seondub muteerunud p53 N-Y- ja p300-valkudega, suurendades N-Y-indutseeritud rakutsükliga geenide ekspressiooni. ABL1 Valgu türosiinkinaas c-abl liigub nukleaarse ja tsütoplasmaatilise kompartmendi vahel. Nukleaarne c-abl osaleb rakukasvu inhibitsioonis ja apoptoosis, samas kui tsütoülasmaatilisel C-Abl-l võib olla roll aktiini dünaamikas, morfogeneesis ja signaalis, mille on indutseerinud ekstratsellulaarsed stiimulid, nagu kasvufaktorid ja integriini ligandid. Tsütoplasmaatilise c-abl-i puhul on raporteeritud mitogeneesi soodustamist. c-abl-valgu aktiivsust reguleerib negatiivselt selle SH3 domeen ning SH3 domeeni kustutamine muudab ABL1 onkogeeniks. Kroonilise müeloidse leukeemia (CML) puhul aktiveeritakse geen translokatsiooniga BCR (murdepunkti klastri piirkonna) geenis kromosoomil 22. See loodud BCR-ABL liitvalk kinnitub tsütosoolile ja võimaldab rakkudel prolifereeruda ilma tsütokiinidepoolse reguleerimiseta (Zhao et al.). c-abl-i aktiivsust reguleeritakse samuti üles soliidkasvajates, nagu seda näidati rinnakartsinoomide ja NSCLC puhul. Üleekspressioon pole piisav ja järgnev kinaastegevus nõuab valgu fosforülatsiooni. Rinnavähi rakkudes indutseerivad c-abl-i fosforülatsiooni plasmamembraani türosiinkinaasid, sh SK, EGR-perekonna liikmed ja G-1 retseptor. ABL-liitvalkusid pole tuvastatud soliidkasvajates (Lin ja Arlinghaus, 2008). ABLi ekspressiooni näidati maokartsinoomis ja seotud mikrosoontes, mis viitab võimalikule rollile angiogeneesis. Märkimisväärselt põhjustab H.pylori tsütoksiiniga seotud geen A (CagA) c-abl- aktiveerimist, mis järgnevalt fosforüleerib EGRi ja blokeerib seetõttu EGRi endotsütoosi (Bauer, Bartfeld ja Meyer ). Mitmed türosiinkinaasi inhibiitorid suuremal või vähemal määral Abl-i jaoks spetsiifilised. matiniibi (Gleevec) kasutatakse CMLi esmase ravina ning selle kasutamine on heaks kiidetud ka edasiarendatud seedetrakti stromaalsete kasvajate (GST) puhul ning see on suunatud ka KT vastu (Pytel et al ) (Croom ja Perry, 2003). Teised inhibiitorid, mida kasutatakse vähiraviks, on dasatiniib ja nilotiniib (Pytel et al ) (Deremer, Ustun ja Natarajan ). Polo-laadne kinaas 4 (Plk4)

39 Polo-kinaasi perekonna liikmed (Plk1-4) on olulised rakkude jagunemise ajal, reguleerides mitmeid etappe mitoosi ajal. Plk4 on tsentriooli moodustamise ja duplikatsiooni korraldaja (Rodrigues-Martins et al ). Kui Plk1 on selge onkogeen, on Plk4 funktsioon vähis vastuoluline. Vähiga inimestes, hiirtes ja kärbestes on seostatud nii Plk4 allareguleerimist kui ka üleekspressiooni (Cunha-erreira et al ). Kolorektaalses vähis tuvastati näiteks Plk4 üleekspresseerimine, kuid väike patsientide rühm näitas Plk4 tugevat allareguleerimist (Macmillan et al ). Seda on võimalik selgitada asjaoluga, et nii Plk4 üleekspressiooni kui ka puudulikkus põhjustavad ebakorrapärast tsentriooli moodustamist, mis põhjustab ebanormaalseid tsentrosoomide hulkasid ja struktuure, mida tuvastatakse sagedasti kasvajarakkudes ja mis aitavad kaasa mitootiliste ebakorrapärasuste tekkimisele, mis põhjustavad kromosoomide vääralt segregeerimist ja aneuploidsust (Peel et al ). (Kuriyama et al ). (Korzeniewski et al ). Q-motiiv, mis sisaldab GTPaasi aktiveerivat valku 3 (QGAP3) QGAPid osalevad tsellulaarsetel signaali radadel ning tsütoskeletaalses arhitektuuris ja raku adhesioonis. Need omavad domeeni, mille järjestus sarnaneb RasGAP-dele ja mis seondub väikeste GTPaasidega. Samas (ja hoolimata nende nimest) ei põhjusta ühegi nende toimingud GTPaasi aktiveerimist. QGAP1 ja QGAP2 puhul on näidatud, et need isegi stabiliseerivad Rac1 ja Cdc42 GTP-seotud olekut, ning väideti, et QGAP3 stabiliseerib aktiveeritud Rasi (Nojima et al ;White, Brown ja Sacks ). Need seonduvad oma Q-domeeni kaudu kaltsiumi/kalmoduliiniga ning kalponiini homoloogilise domeeni kaudu aktiini filamentidega (White, Brown ja Sacks ). (Wang et al ) raporteerib, et QGAP3 ekspresseeritakse ajus, kus see seondub aktiini filamentidega ning Rac1-ga ja Cdc42-ga. See akumuleerub aksonite distaalpiirkonda ja soodustab Rac1/Ccd42-sõltuvate aksonite väljakasvamist. Vähis osalevad QGAPid. QGAP1-e on käsitletud onkogeenina. See parandab mitmeid vähiga seotud radasid, nagu MAP-kinaas, beeta-kateniin ja VEGiga vahendatud signaal, ning see on üleekspresseeritud mitmetes kasvajates. QGAP2 tundub toimima pigem kasvaja supressorina ja tuvastati selle vähenenud tasemed kehva prognoosiga maovähkides (White, Brown ja Sacks ). QGAP3-e kohta on saadaval vähe teavet. (Skawran et al ) leidis, et see kuulub geenide hulka, mis on hepatotsellulaarses kartsinoomis oluliselt ülesreguleeritud. Kaks uuringut on täheldanud, et QGAP3 on spetsiifiliselt ekspresseeritud prolifereeruvates (Ki67+) rakkudes hiirte peensooles, käärsooles ja maksas (Nojima et al ) (Kunimoto et al ).

40 a-d sisaldav keerdunud keeru domeen (CCDC88A) CCDC88A on aktiinisiduv Akt-substraat, millel on roll aktiini korraldamises ja Aktsõltuvas rakkude liikuvuses fibroblastides. CCDC88A/Akt rada on samuti oluline VEGiga vahendatud postneonataalses angiogeneesis. CCDC88A on samuti kõrgelt ekspresseeritud erinevates inimese pahaloomulistes kudedes, sh rinna-, käärsoole-, kopsu- ja emakakaelakartsinoomides. Sellel on oluline roll kasvaja progressioonis, mis on seotud Akt-signaali raja ebakorrapärase aktiveerimisega. Tsükliin B1 (CCNB1) CCNB1 indutseeritakse mitoosi G2/M-faasi ajal ja see moodustab mitoosi tekitava faktori (MP) koos tsükliinist sõltuva kinaasiga 1 (Cdk1)/Cdc2. Üleekspressiooni leidub erinevates vähkides ja see on tihti seotud kehva prognoosiga, nt rinnavähis (Aaltonen et al., 2009; Agarwal et al., 2009; Suzuki et al., 2007), medulloblastoomis (de et al., 2008), NSCLC-s (Cooper et al., 2009), emakakaelavähis (Zhao et al., 2006) ja teistes. See oli üks geenidest, mis sisaldub 11 geenist koosnevas signatuuris, mille puhul tuvastati võime prognoosida haiguse taasesinemise lühikest intervalli 12 konkreetse vähi tüübiga patsientides (Glinsky, 2006). Ei leitud spetsiifilist teavet maovähi kohta. Tsükliin D2 (CCND2) CCND2 seob ja aktiveerib, nagu muud D-tüüpi tsükliinid (D1 ja D3), tsükliinist sõltuvat kinaasi 4 (Cdk4) või Cdk6. See on vajalik G1/S-üleminekul. CCND2 üleekspressioon tuvastati mitmes kasvajas, sh munandi- ja munasarjakasvajad (Sicinski et al., 1996), hematoloogilistes pahaloomulistes kasvajates (Hoglund et al., 1996; Gesk et al., 2006) ja maovähis, kus seda võib põhjustada H.pylori infektsioon ja see võib olla seotud kehva prognoosiga (Yu et al., 2003). (Yu et al., 2001) (Oshimo et al., 2003) (Takano et al., 1999) (Takano et al., 2000). Tsükliin E2 (CCNE2) CCNE2 seob ja aktiveerib, nagu muu E-tüüpi tsükliin CCNE1, Cdk2-e. Käesoleva aktiivsuse tipuks on G1/S-faasi üleminek. Tervislikes tingimustes pole võimalik CCNE2-e tuvastada märkamatult kulgevates rakkudes ja seda on võimalik leida ainult aktiivselt jagunevates kudedes (Payton ja Coats, 2002). See avaneb tihti ebakorrapäraselt vähis, nt rinnavähis, mis on korrelatsioonis kehva prognoosi (Desmedt et al., 2006; Ghayad et al.,

41 ; Payton et al., 2002; Sieuwerts et al., 2006) ja metastaatilise eesnäärevähiga (Wu et al., 2009). Kartsinoembrüonaalse antigeeniga seotud rakuadhesiooni molekulid 1, 5 ja 6 (CEACAM 1, 5 ja 6) CEACAMid on membraanile kinnitunud glükovalgud, mis vahendavad rakkudevahelist vastastikust toimet ja aktiveerivad integriini signaali rajad (Chan ja Stanners, 2007). Need võivad toimida samuti retseptoritena patogeenide, nagu E.coli (Berger et al., 2004) (Hauck et al., 2006), jaoks ja osaleda immuunregulatsioonis (Shao et al., 2006). CEACAM5-l ja CEACAM6-l on kantserogeensust soodustavaid funktsioone. Need inhibeerivad anoikist (Ordonez et al., 2000), soodustavad metastaseerumist (Marshall, 2003; Ordonez et al., 2000) ning häirivad rakkude polarisatsiooni ja kudede arhitektuuri (Chan ja Stanners, 2007). CEACAM1-e roll vähis on vastuoluline. See võib toimida kasvaja supressorina varajastes staadiumides ning aidata kaas metastaasi moodustumisele, kasvaja immuunreaktsioonist pääsemist ja angiogeneesi hilisemates faasides (Hokari et al., 2007; Liu et al., 2007; Moh ja Shen, 2009). Selle funktsionaalne roll sõltub isovormist, kuna CEACAM1-e esineb 11 splaiss-variandis, mille suhe määrab kindlaks signaali tulemuse (Gray-Owen ja Blumberg, 2006; Leung et al., 2006; Neumaier et al., 1993; Nittka et al., 2008). Splaiss-variantide suhe võib vähis muutuda (Gaur et al., 2008). CEACAM5-e või CEACAM6-e või mõlemat on üleekspresseeritud kuni 70% kõikidest inimese kasvajatest, mis on tihti seotud kehva prognoosiga (Chan ja Stanners, 2007; Chevinsky, 1991). Seerum CEACAM5 on kasutusele võetud kliiniline marker käärsoole- ja pärasoolekartsinoomi jaoks, mille kõrged tasemed näitavad kehva prognoosi või taasesinemist (Chevinsky, 1991; Goldstein ja Mitchell, 2005). Samuti on väidetud selle kasutamise sobilikkust teiste vormide puhul, sh maovähk, võttes samas arvesse selle piiratud prognoosivat võimet (Victorzon et al., 1995). CEACAM1-e on võimalik vähis üles või alla reguleerida sõltuvalt vormist (Kinugasa et al., 1998) (Dango et al., 2008) (Simeone et al., 2007). (Han et al., 2008) leidis CEACAM5-e ja CEACAM6-e kõrgeid tasemeid üheksas maovähi rakuliinis, samas kui CEACAM1-e ei tuvastatud. Samas näitas 222 patsiendi primaarse kasvaja proovide analüüs CEACAM1 puhul kas tsütoplasmilist või membraanset värvimist. Membraaniga seotud vorm oli seotud suurenenud angiogeneesiga (Zhou et al., 2009). Samuti näitas (Kinugasa et al., 1998) poolt läbi viidud uuring maoadenokartsinoomide ülesreguleerimist.

42 Mõnes kasvajas on CEACAM1 kasvajarakkudes alla reguleeritud, mis põhjustab VEGi ülesreguleerimist ning VEG või hüpoksia tingimused võivad indutseerida CEACAM1-e kõrvalasuvas endoteelis. Vastavalt blokeerib CEACAM1-vastane monoklonaalne antikeha VEG-idutseeritud endoteelse torukese moodustumise (Oliveira-errer et al., 2004; Tilki et al., 2006; Ergun et al., 2000). Eelkõige CEACAM5-e on testitud sihtmärgina vähivastaste ravimite jaoks, lisaks muudele vaktsineerimisega seotud lähenemistele. Need uuringud näitasid, et CEACAM5-e on võimalik määrata tsellulaarsete immuunreaktsioonide sihtmärgiks (Cloosen et al., 2007; Marshall, 2003). Ülevaade CEACAM5 T-rakkude epitoopide kohta sisaldub uuringus (Sarobe et al., 2004). Kloriidkanal 3 (CLCN3) CLCN3 on Cl- kanal, mis võib olla mahupiiranguga ja aidata kaasa regulatiivsele mahu vähenemisele (RVD), mis esineb reaktsioonina rakkude mahu suurenemisele tingimustes, nagu rakkude tsüklimine või hüpoosmoos (Lemonnier et al., 2004; Sardini et al., 2003). Samas on seda punkti vastuoluliselt arutatud (Wang et al., 2004) ja mahtuvähendav kanal aktiveerus apoptoosi ajal CLCN3-st erinevalt (Okada et al., 2006). CLCN3 ekspressioon muutub rakutsükli jooksul, saavutades tipptaseme S-faasis (Wang et al., 2004). CLCN3 voolud võivad olla tähtsad vähiga seotud protsessides vormides, kus CLCN3 on üles reguleeritud, nagu glioomis: kasvajarakud peavad saama hakkama proliferatiivse mahu suurenemisega, reageerima hüpoosmootilistele tingimustele, nt peritumoraalses ödeemis (Ernest et al., 2005; Olsen et al., 2003; Sontheimer, 2008). On teatatud, et CLCN3 parandab etoposiidi resistantsust, suurendades hilise endotsüütilise kompartmendi hapestumist (Weylandt et al., 2007). sirna poolt vahendatud CLCN3 allareguleerimine vähendas nasofarüngeaalse kartsinoomi rakkude migratsiooni in vitro (Mao et al., 2008). DNAJC10 DNAJC10 on supramolekulaarse ER-seotud degradatsiooni (ERAD) kompleksi liige, mis tunneb ära ja voldib lahti valesti volditud valgud nende tõhusaks retrotranslokatsiooniks (Ushioda et al., 2008). Valgu kõrgenenud tasemeid näidati hepatotsellulaarses kartsinoomis (Cunnea et al., 2007). DNAJC10 allareguleerimine sirna poolt neuroektodermaalse kasvaja rakkudes suurendas apoptootilist vastust kemoteraapilise ravimi fenretiniid suhtes

43 (Corazzari et al., 2007). Näidati, et ERdj5 vähendab neuroblastoomi rakkude elulemist, reguleerides lahtivolditud valgu vastust (UPR) alla (Thomas and Spyrou, 2009). Eukarüootilise translatsiooni käivitamise faktor 2, allüksus 3 gamma (E2S3) E2S3 on suurim allüksus valgukompleksis (E2), mis lisab initsiaator metionüül-trnad 40S ribosomaalsesse allüksusesse (Clemens, 1997). Ei aktiivsust alla reguleerivate kinaaside, nagu RNA-st sõltuv valgukinaas (PKR), tegevus võib olla proaptootiline ja kasvajat supresseeriv (Mounir et al., 2009). Maovähi puhul teatati fosforüleeritud ja fosforüleerimata E2 kõrgematest tasemetest ning täheldati tuuma redistributsiooni. See deregulatsioon osutab e2-alfa ilmnemisele seedetraktivähis (Lobo et al., 2000). Eukarüootilise translatsiooni käivitamise faktori 3 allüksus L (E3L) E3L on üks E3-e allüksusest, mis on seotud väikese ribosomaalse allüksusega. E3-l on roll suure ribosomaalse allüksuse enneaegse seondumise takistamises. E3L kuulub viie allüksuse hulka, mille puhul on teatatud, et need pole E3 moodustumises esmatähtsad (Masutani et al., 2007). Skriinimine antisenss-kogumiga viitas asjaolule, et E3L allareguleerimine suurendab 5-fluorouratsiili antitumorigeenset aktiivsust hepatotsellulaarse kartsinoomi rakkudes (Doh, 2008). Epiplakiin1 (EPPK1) EPPK1 on plakiinperekonna geen, mille funktsioonid on suures osas teadmata. Plakiini geenid osalevad teadaolevalt ühendavates tsütoskeletaalsetes filamentides ja seovad need plasma membraaniga seotud adhesiivse liidusega (Yoshida et al., 2008). G-valguga seotud retseptor 39 (GPR39) GPR39 on G-valguga seotud retseptor, mis arvatavalt osaleb gastrointestinaalses ja metaboolses funktsioonis (Yamamoto et al., 2009). Selle signaal aktiveerib camp ja seerumi vastuse elemendid (Holst et al., 2004). GPR39 endgeenne ligand on tõenäoliselt tsink (Chen ja Zhao, 2007). GPR39 on rakusurma uudne inhibiitor, mis võib endast kujutada terapeutilist sihtmärki implikatsioonidega protsessidele, mis hõlmavad apoptoosi ja endoplasmaatilise retiikulumi stressi, nagu vähk (Dittmer et al., 2008). GPR39 puhul tuvastati ülesreguleeritus nii inimese loote neeru HK kui ka blasteem-rikastatud tüvelaadsete Wilmsi tuumori ksenograftide mikromaatriksites (Metsuyanim et al., 2009)

44 ning hipokampuse rakuliinis, mis on resistentne erinevate rakusurma stimulaatorite vastu (Dittmer et al., 2008). ERBB2/HER2/NEU ERBB2 on restseptori türosiini kinaaside EGR perekonna liige. Selle ligand pole teada, kuid see on HER-perekonna teiste liikmete eelistuslik heterodimerisatsiooni partner (Olayioye, 2001). Kartsinoomis toimib HER2 onkogeenina: peamiselt kuna geeni kõrgetasemeline võimendamine indutseerib valgu üleekspressiooni rakumembraanis ning sellele järgnevat soodsate omaduste omandamist pahaloomulise raku jaoks (Slamon et al., 1989). Üleekspressiooni on täheldatud kindla protsendi ulatuses paljude vähkide puhul, sh maovähk. See on peamiselt seotud kehva prognoosiga (Song et al., 2010) (Yonemura et al., 1991) (Uchino et al., 1993) (Mizutani et al., 1993). ERBB2 on monoklonaalse antikeha trastutsumaabi (mida turustatakse hertseptiini nime all) sihtmärk, mida on pakutud välja ravivõimalusena HER2-positiivse edasiarenenud maovähiga patsientide jaoks kombineerituna kemoteraapiaga (Meza-Junco et al., 2009; Van Cutsem et al., 2009). Teine monoklonaalne antikeha, pertutsumaab, mis inhibeerib HER2- ja HER3-retseptorite dimerisatsiooni, on kliiniliste katsete hilises etapis (Kristjansdottir and Dizon, 2010). HER2 ja HER3 selektiivset üleekspressiooni kahte histoloogilist tüüpi maovähis (intestinaalset ja difuusset tüüpi) seostatakse tugevalt kehva prognoosiga (Zhang et al., 2009). Beeta-4 integriin (TGB4) ntegriinid vahendavad rakkude adhesiooni ning signaali transduktsiooni seest välja ja väljast sisse. ntegriini beeta-4 allüksus heterodimeriseerub koos alfa-6 allüksusega. Moodustunud integriin soodustab hemidesmosoomide moodustumist intratsellulaarse keratiini tsütoskeleti ja alusmembraani vahel (Giancotti, 2007). ntegriin beeta-4-l on vähis duaalne funktsioon, kuna see suudab ühelt poolt vahendada stabiilset adhesiooni ning teiselt poolt proinvasiivset signaali (sh Ras/Erk ja P3K signaal) ning angiogeneesi (Giancotti, 2007; Raymond et al., 2007). See on üleekspresseeritud paljudes kasvajates ning angiogeensetes endoteelsetes rakkudes, mis on tihti korrelatsioonis arengustaadiumi ja metastaasiga. Kõrged tasemed on olnud maovähis, eelkõige stroomasse tungivates rakkudes (Giancotti, 2007; Tani et al., 1996). Samas oli see alla reguleeritud diferentserimata tüüpi maokartsinoomis, kui kasvaja tungis sügavamale, tõenäoliselt järk-järgulise epiteliaal-

45 mesenhümaalse transitsiooni tõttu, kuna beeta-4 integriin on epiteelne integriin (Yanchenko et al., 2009). Lipokaliin (LCN2) LCNβ või neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliin (NGAL) on rauasisaldust reguleeriv valk, mis on olemas monomeeri, homodimeeri või disulfiidiga seotud heterodimeerina koos MMP9-ga (Coles et al., 1999; Kjeldsen et al., 1993). Ekspressioon on suurenenud mitmes vähis, mõnel juhul on seda seostatud progressiooniga. See võib mehhanistiliselt stabiliseerida MMP9 ja muuta E-kadheriiniga vahendatud rakkudevahelist adhesiooni, suurendades sellega invasiooni. MMP-9 ja LCN2 kompleksid olid seotud maovähi vähenenud elulemusmääraga (Kubben et al., 2007) (Hu et al., 2009). Kuigi erinevate inimkasvajate puhul on täheldatud selget kasvajate arengut soodustavat mõju, on mõned uuringud näidanud, et LCN2 võib inhibeerida proneoplastset faktorit H-1 alfa, Akinaasi fosforülatsiooni ja ka VEGi sünteesimist, mis võimaldab seega järeldada, et alternatiivsetes tingimustes on LCN2-l samuti paradoksaalselt kasvaja- ja metastaasivastane mõju näiteks käärsoole-, munasarja- ja kõhunäärmeneoplaasia korral (Bolignano et al., 2009; Tong et al., 2008). LCN2 võib olla kasulik kasvaja angiogeneesi inhibeerimiseks, lisaks kasvaja metastaasi supresseerimisele, vähkides, mis näitavad rasi aktiveerimist (Venkatesha et al., 2006). Suktsinaadi dehüdrogenaasi kompleks, allüksus C (SDHC) SDHC on üks neljast suktsinaadi dehüdrogenaasi nukleaarkodeeritud allüksusest (mitokondriaalne kompleks ), mis edastab elektrone suktainaadilt ubikinoonile, andes fumaraadi ja ubikinooli. Suktainaadi dehüdrogenaasi puudulikkus võib GSTe põhjustada (McWhinney et al., 2007). amiliaalseid seedetrakti stromaalseid kasvajaid võivad põhjustada mutatsioonid allüksuse geenides SDHB, SDHC ja SDHD ning seedetraktikasvajatega seotud abdominaalseid paraganglioome võivad põhjustada ainult SDHC mutatsioonid (Pasini et al., 2008). Muteerunud SDHC-valk transgeensetes hiirtes tekitab oksüdatiivset stressi ja võib aidata kaasa nukleaarse DNA-kahjustuse, mutageneesi ja viimaks tumorigeneesi tekkimisele (shii et al., 2005). Suktainaadi dehüdrogenaasi peetakse kasvaja supressoriks (Baysal, 2003; Gottlieb ja Tomlinson, 2005). Selle ensüümikompleksi vähenenud tasemed võivad põhjustada tumorigeneesi (Eng et al., 2003). PDZ-siduv kinaas (PBK)

46 PBK on MEK3/6-ga seotud MAPKK, mis aktiveerib p38 MAP kinaasi, nt pärivoolu kasvufaktori retseptoritest (Abe et al., 2000; Ayllon ja O'connor, 2007). JNK võib olla teisene sihtmärk (Oh et al., 2007). Kuna täiskasvanutes ekspresseeritakse PBK-d testises (vt alljärgnevat tabelit), on pakutud välja spermatogeneesi funktsioon (Abe et al., 2000; Zhao et al., 2001). Lisaks sellele osaleb see kasvajarakkudes proliferatsioonis ja apoptoosiresistentsuses. See fosforüleerub ja aktiveerub mitoosi ajal, mis on vajalik käävi moodustamiseks ja tsütokineesiks (Gaudet et al., 2000; Matsumoto et al., 2004; Park et al., 2009) (Abe et al., 2007). Muud kasvu soodustavad ja antiapoptootilised funktsioonid hõlmavad p53 ja histooni fosforülatsiooni allareguleerimist (Park et al., 2006; Zykova et al., 2006) (Nandi et al., 2007). PBK on klassifitseeritud vähi-testise antigeenina (Abe et al., 2000; Park et al., 2006) ning selle üleekspressiooni on täheldatud mitmes vähis. (DNA-juhitud) polümeraas, delta 3, lisaallüksus (POLD3) DNA polümeraasi delta-kompleks osaleb DNA replikatsioonis ja parandamises. See koosneb prolifereeruva raku nukleaarantigeenist (PCNA), mitme allüksuse replikatsiooni faktorist C ja 4 allüksuse polümeraasi kompleksist: POLD1, POLD2, POLD3 ja POLD4 (Liu ja Warbrick, 2006). POLD3-l on oluline roll PCNA tõhusas ümbertöötlemises pol delta dissotsiatsiooni-assotsiatsioonitsüklite ajal DNA replikatsiooni pikendamise faasi ajal (Masuda et al., 2007). Proteasoom (prosoom, makropaiin) 26S allüksus, mitte-atpaas, 14 (PSMD14) PSMD14 on üks 26S proteasoomi komponente. See kuulub 19S kompleksi (19S kapsel; PA700), mis vastutab substraadi deubikvitinatsiooni eest proteasomaalse degradatsiooni ajal (Spataro et al., 1997). PSMD14 üleekspressioon imetaja rakkudes mõjutab rakkude proliferatsiooni ja vastust tsütotoksiliste ravimite, nagu vinbalstiin, tsisplastiin ja dokorubiksiin suhtes (Spataro et al., 2002), PSMD14-e sirna supressioon HeLa rakkudes põhjustas rakkude eluvõimelisuse vähenemist ja polüubikvitineeritud valkude tasemete suurenemist (Gallery et al., 2007). PSMD14-e allareguleerimisel sirna poolt oli oluline mõju rakkude eluvõimelisusele, põhjustades rakkude seiskumist G0-G1-faasis, mis põhjustab viimaks senesentsi (Byrne et al., 2010). Proteasoom (prosoom, makropaiin) 26S allüksus, ATPaas, 2 (PSMC2) PSMC2 on osa 26S proteasoomi süsteemist. See on ATPaaside kolmik-a perekonna liige, mis täidavad saatjalaadseid toiminguid. Käesoleva allüksuse puhul on näidatud vastastikust

47 toimet mitme põhilise transkriptrioonifaktoriga, mistõttu võib see allüksus (lisaks proteasoomi funktsioonides osalemisele) osaleda transkriptsiooni reguleerimises. Näidati, et 26S proteasoomi süsteemi skeletilihases võib aktiveerida TN-alfa (Tan et al., 2006). HBx transgeensetes hiirtes, mis kannavad oma iduteeliinis B-hepatiidi reguleerivat geeni HBx ning mis arendavad HCC-d, PSMC2-e ja muid proteasoomi allüksusi, on kasvajarakkudes ülesreguleeritud (Cui et al., 2006). mrna tasemed 19S kompleksi ATPaasi allüksuse PSMC2 jaoks suurenesid vähkkahheksias (Combaret et al., 1999). Valgu türosiin-kinaas 2 (PTK2) PTK2 on mitteretseptor-türosiin-kinaas, mis moduleerib integriini signaali ja võib soodustada kasvaja kasvu, progressiooni ja metastaasi ((Giaginis et al., 2009); (Hauck et al., 2002); (Zhao ja Guan, 2009)). PTK2-e soovitati kasutada kartsinogeneesi ja vähi progressiooni markerina (Su et al., 2002; Theocharis et al., 2009; Jan et al., 2009). Üleekspressioon ja/või suurenenud aktiivsus esineb suures hulgas inimese vähkides, sh maovähk. PTK2 muundab samuti signaale gastriinretseptorist pärivoolu, mis aitab kaasa maovähi rakkude proliferatsioonile (Li et al., 2008b). 8% maokartsinoomidest on näidanud Epstein-Barr viiruse (EBV) kandmist. EBV-infektsiooniga inimese maovähi rakuliini alamliinid näitasid suurenenud PTK2 fosforülatsiooni (Kassis et al., 2002). PTK2 türosiini fosforülatsiooni taset mao epiteelirakkudes vähendab caga-positiivse Helicobacter pylori tootmine. Tetraspaniin 1 (TSPAN1) ja tetraspaniin 8 (TSPAN8) TSPAN1 ja TSPAN8 kuuluvad tetraspaniinide perekonda, mida iseloomustavad neli transmembraan-domeeni ning intratsellulaarsed N- ja C-terminaalsed otsad ning millel on rolle mitmetes protsessides, sh tsellulaarne adhesion, liikumisvõime, aktiveerimine ja kasvaja invasioon. Need moodustavad tihti teiste valkudega, nagu integriinid, suuri molekulaarkomplekse raku pinnal (Tarrant et al., 2003; Serru et al., 2000). TSPAN1-e funktsioone pole veel teada ning neil võib olla roll sekretsioonis (Scholz et al., 2009). TSPAN1 on üleekspresseeritud mitmes vähis, mis on tihti korrelatsioonis staadiumi, progressiooni ja halvema kliinilise tulemusega. Selle üleekspressioonist teatati 56,98%-l 86 maokartsinoomi juhtumist ning üleekspressioon oli positiivses korrelatsioonis kliinilise staadiumi, infiltratsiooni ja lümfisõlmede olekuga ning negatiivses korrelatsioonis elulemusmäärade ja kasvaja differentseerumise määraga (Chen et al., 2008). TSPAN8 geen

48 on seotud paljude kasvaja tüüpide metastaseerumisega (PMD: ). Seedetraktivähis on TSPAN8 ekspressioon seotud kehva prognoosiga (PMD: ). Tsink-sõrm valk 598 (ZN598) ZN598 on tsink-sõrm valk, mille funktsioon pole veel teada. A disintegriin ja metalloproteinaas 10 (ADAM10) ADAM10-l on roll angiogenesis, arengus ja tumorigeneesis. See on üleekspresseeritud maokartsinoomis. Selektiivsed ADAM inhibiitorid ADAM-10 vastu läbivad vähiravi kliinilisi katseid. (PMD: ) Maatriks metalloproteinaas 12 (MMP12) MMP12 on tsink-endopeptidaas, mis lagundab elastiini ja paljusid teisi maatriks- ja mittemaatriksvalke ning mis osaleb makrofaagi migratsioonis ja angiogeneesi inhibeerimises (Chakraborti et al., 2003; Chandler et al., 1996; Sang, 1998). Sellel on samuti roll rakkude hävitamise patoloogilistes protsessides, nagu astma, emfüseem ja krooniline obstruktiivne kopsuhaigus (COPD), reumatoidartriit ja kasvaja kasvamine (Cataldo et al., 2003; Wallace et al., 2008). MMP12 inhibiitoreid käsitletakse neid seisundeid ravivate ainetena (Churg et al., 2007; Norman, 2009). MMP12 on sagedasti üleekspresseeritud vähis, kus sellel võib olla vastuolulisi funktsioone. Kuigi see võib osaleda maatriksi lahustumises ja seega ka metastasis, võib see samuti angiostatiini tootmise kaudu kasvaja kasvamist takistada, mis mõjutab negatiivselt angiogeneesi. GC puhul teatati suurenenud MMP12 ekspressioonist ja seda näidati soodsana: See on negatiivses korrelatsioonis mikrosoonte tiheduse, VEGi, kasvaja diferentsserimise määra, vaskulaarse invasiooni, lümfisõlme metastastaseerumise ja taasesinemisega. MMP12-e üleekspressiooniga patsiendid näitasid oluliselt suuremat elulemusmäära (Cheng et al., 2010; Zhang et al., 2007b; Zhang et al., 2007a) Ribonukleotiidi reduktaas M2 (RRM2) RRM2 on üks kahest ribonukleoitiidi reduktaasi allüksusest, mis toodab desoksüribonukleotiide ribonukleotiididest. RRM2-e üleekspressiooni on täheldatud kasvajates, sh maovähk, ja see tõstab metastaatilist potentsiaali (PMD: ) (PMD: ) RRM2-e allareguleerimine sirna-ga aeglustas kasvaja kasvamist erinevates liikides (hiir, rott, ahv) (PMD: ; PMD: ).

49 Transmembraani proteaas, seriin 4 (TMPRSS4) TMPRSS4 on -tüübi transmembraani seriini proteaas, mida leidub raku pinnal ning mis on kõrgelt ekspresseeritud mitme vähi rakkudes, sh kõhunäärme-, käärsoole- ja maovähk. TMPRSS4 bioloogilised funktsioonid vähis pole veel teada. TMPRSS4-l on neli splaissvarianti (Scott et al., 2001; Sawasaki et al., 2004). Ekspressioon munasarjakartsinoomis oli korrelatsioonis staadiumiga (Sawasaki et al., 2004). TMPRSS4 on äärmiselt eleveeritud kopsuvähi rakkudes ning TMPRSS4 allareguleerimist sirna poolt väikese interfeeriva RNA raviga kopsu- ja käärsoolevähi rakuliinides seostati raku invasiooni vähenemise ning rakumaatriksi adhesiooni ja raku proliferatsiooni modulatsiooniga (Jung et al., 2008). Deiodinaas, jodotüroniin, tüüp (DO2) DO2 konverteerib prohormoon türoksiini (T4) bioaktiivseks γ,γ,5-trijodotüroniiniks (T3). Seda on kõrgelt ekspresseeritud kilpnäärmes ning ekspresiooni ja/või aktiivsust leiti dereguleeritult kilpnäärmevähkides (de Souza Meyer et al., 2005) (Arnaldi et al., 2005). Samas leiti seda ka teistes kudedes, nagu normaalne kops ja kopsuvähk (Wawrzynska et al., 2003) ja ajukasvajates (Murakami et al., 2000). nsuliinisarnane kasvufaktor 2 mrna seostusvalk 3 (G2BP3) G2BP3 on primaarselt olemas tuumakeses, kus see seob G2 mrna-d ja represseerib selle translatsiooni. Sellel on roll embrüogeneesis ja see on allareguleeritud täiskasvanu rakkudes. See võib olla kasvajarakkudes ülesreguleeritud ning seda peetakse seetõttu onkoferaalseks valguks (Liao et al. 2005). Paljudes vähkides, sh maovähis, täheldati selle üleekspressiooni, mis on seostatud kehva prognoosiga (Jeng et al. 2009)(Jiang et al. 2006). G2BP3-st tuletatud peptiide testiti vähi vaktsineerimise uuringutes (Kono et al. 2009). Lamiin B1 (LMNB1) Lamiin B1 on nukleaarse laamina maatriksi valk ja see osaleb nukleaarstabiilsuses, kromatiini struktuuris ja geenekspressioonis. Apoptoosi varajastes staadiumides on lamiin lagundatud (Neamati et al. 1995) (Sato et al. 2008b; Sato et al. 2008a; Sato et al. 2009). LMNB1-e on teatud ulatuses ekspresseeritud põhimõtteliselt kõigis normaalsetes somaatilistes rakkudes ning esialgsed uuringud osutavad sellele, et see väheneb mõne vähi patogeneesi jooksul, sh maovähk (Moss et al. 1999). Teistes vähkides, nagu

50 hepatotsellulaarne kartsinoom, täheldati LMNB1 ülesreguleeritust ja positiivset korrelatsiooni kasvaja staadiumi, suuruse ja noodulite arvuga (Lim et al. 2002). Tiibadeta tüüpi MMTV integratsioonisaidi perekond, liige 5A WNT5A on sektreteeritud signaalvalk, mida on implitseeritud arenguprotsessides ja onkogeneesis. Kanooniline WNT5A signaal rizzled ja LRP5/LRP6 retseptorite kaudu põhjustab tüvi-/progenitorrakkude säilitamist, samas kui mittekanooniline WNT5A signaal rizzled ja ROR2/PTK/RYK retseptorite kaudu juhib kudede polaarsust, rakkude adhesiooni või liikumist, nt kasvaja-stromaalse liidese kaudu, mis põhjustab invasiooni (Katoh ja Katoh, 2007). See võib olla kasvaja supressor mõnes vähis, kuid on ülesreguleeritud teistes, sh maovähis, kus see aitab kaasa progressioonile ja metastaasile ning põhjustab kehva prognoosi (Li et al., 2010) (Yamamoto et al., 2009) (Kurayoshi et al., 2006). ibroblasti aktiveeriv valk, alfa (AP) AP on integraalse membraani želatinaas. Selle oletataval seriinproteaasi aktiivsusel võib olla roll fibroblastide kasvu juhtimises või epiteel-mesenhümaalsetes vastastikustes toimetes arengu, kudede parandamise ja epiteelkartsinogeneesi ajal (Scanlan et al. 1994). APil on potentsiaalne roll vähi kasvus, metastaseerumises ja angiogeneesis rakkude adhesiooni ja migratsiooni protsesside kaudu ning ka ECM-komponentide kiire lagundamise kaudu. Seda esineb ECMi tungivatel kasvajarakkudel reaktiivsetes vähiga seotud fibroblastides ning endoteelirakkudes, mis osalevad angiogeneesis, kuid mitte samat tüüpi inaktiivsetes rakkudes. (Dolznig et al. 2005; Kennedy et al. 2009; Rettig et al. 1993; Rettig et al. 1994; Scanlan et al. 1994; Zhang et al. 2010). APi ekspressiooni on leitud maovähi rakkudes ja seotud stromaalsetes fibroblastides (Zhi et al. 2010) (Chen et al. 2006)(Mori et al. 2004; Okada et al. 2003). Hiirmudelis näidati AP-ekspresseeruvate rakkude mitteredundantsust, kasvaja mikrokeskkonna immuunsupressiivset komponenti (Kraman et al. 2010). Kasvaja vaktsinatsiooni hiirmudelites kasutati APi edukalt CD8+ ja CD4+ T-rakkude vastuste sihtmärgina (Loeffler et al. 2006; Wen et al. 2010)(Lee et al. 2005) (assnacht et al. 2005). Koatomeerne valgukompleks, alaüksus gamma (COPG); koatomeerne valgukompleks, alaüksus gamma 2 (COPG2); koatomeerne valgukompleks, alaüksus beeta 1 (COPB1);

51 COPG, COPG2 ja COPB1 koatomeerse kompleksi allüksused, mida nimetatakse samuti kaetud valgukompleks 1-ks (COP), mis on seotud mitteklatriiniga kaetud vesiikulitega. COP-kaetud vesiikulid vahendavad retrograadset transporti Golgi kompleksist tagasi ERi ja Golgi kompleksi sisest transporti (Watson et al., 2004). Need võivad samuti osaleda anterograadses transpordis (Nickel et al., 1998). Retrograadne ülekanne reguleerib muu hulgas EGRi EG-sõltuvat nukleaartransporti, mis seondub COPG-ga (Wang et al., 2010). Tuvastati COPG üleekspresseeritus kopsuvähi rakkudes ja kopsuvähiga seotud mikrovaskulaarsetes endoteelirakkudes (Park et al., 2008). Ubikvitoosselt ekspresseeritud COPG2 järjestus ühtib 80% ulatuses GOPG-ga (Blagitko et al., 1999). COPG2 võib moodustada COP -laadse kompleksi GOPG asemel, mis on tõenäoliselt funktsionaalselt redundantne (utatsumori et al., 2000). COPB1 allareguleerimine tsüstilise fibroosi transmembraanse juhtivuse regulaatorgeeni (CTR) ekspresseerivas rakuliinis lubab oletada, et koatomeerne kompleks osaleb CRTRi ülekandes plasma membraani (Denning et al., 1992) (Bannykh et al., 2000). Ubikvitiin-konjugeeritud ensüüm E2S (UBE2S) UBE2S anafaasi soodustava kompleksi (APC) lisafaktor, E3 ubikvitiini ligaas, mis reguleerib mitootilist väljumist ja G1-e, seades sihtmärgiks rakutsükli regulaatorid. UBE2S pikendab ubikvitiini ahelaid pärast seda, kui substraate on eelubikvitineeritud teiste komponentide poolt (Wu et al., 2010). UBE2S seab sihtmärgiks VHL-valgu samuti proteasomaalseks degradatsiooniks, stabiliseerides sellega H-1 alfa (Lim et al., 2008) ning teotades võimalusel proliferatsiooni, epiteliaal-mesenhümaalset transitsiooni ja metastaasi (Chen et al., 2009) (Jung et al., 2006). UBE2S on üleekspresseeritud mitmes vähivormis. Kinesiini perekonna liige 11 (K11) K11 on vajalik bipolaarse mitootilise käävi koostamiseks. Selle ülesreguleeritust on tuvastatud mitmes vähis, mis on tihti korrelatsioonis klinikopatoloogiliste parameetritega (Liu et al., 2010) (Peyre et al., 2010). K11-e väiksemolekulised inhibiitorid, nagu S- tritüül-l-tsüsteiin (STLC), mis on välja töötatud võimaliku vähivastase ravimine, seiskavad rakud mitoosis ja soodustavad vähirakkude apoptoosi (Tsui et al., 2009) (Wiltshire et al., 2010) (Ding et al., 2010). Kliinikus on K11 inhibiitorid näidanud ainult tagasihoidlikku

52 aktiivsust (Kaan et al., 2010; Tunquist et al., 2010; Wiltshire et al., 2010; Zhang ja Xu, 2008). A disintegriin ja metalloproteaasi domeen 8 (ADAM8) ADAM8-t peeti algselt immuunspetsiifiliseks ADAMiks, kuid seda leiti samuti teistest rakutüüpidest tihti tingimustes, mis hõlmasid põletikku ja ECMi ümbermodelleerimist, sh vähid ja hingamisteede haigused, nagu astma (Koller et al. 2009). Mitmed ADAMi liigid, sh ADAM8, on ekspresseeritud inimese pahaloomulistes kasvajates, kus need osalevad kasvufaktori toimingute ja integriini funktsioonide reguleerimises, mis põhjustab rakukasvu ja invasiooni soodustamist, sellest hoolimata pole praegusel hetkel nende täpsed mehhanismid selged (Mochizuki ja Okada 2007). Hiire maokasvajates suurenes ADAM8 ja teiste ADAMite tasemed, mis on tõenäoliselt tingitud paranenud EGRi signaalist (Oshima et al. 2011). Raku jagunemise tsükli 6 homoloog (S.cerevisiae) (CDC6) CDC6 on oluline DNA replikatsiooni käivitamiseks. See lokaliseerub tuumas G1 ajal, kuid translokeerub tsütoplasmasse S-faasi alguses. CDC6 reguleerib samuti replikatsiooni kontrollpunkti aktiveerimist vastastoime kaudu ATRiga (Yoshida et al. 2010). CDC6 deregulatsioon võib põhjustada NK4/AR lookust kodeeriva kolme olulise kasvaja supressorgeeni inaktiveerimist: p16nk4a ja p15nk4b, mis mõlemad on retinoblastoomi raja aktivaatorid, ja AR, p53-e aktivaator (Gonzalez et al. 2006).CDC6 sirna allareguleerimine võib takistada proliferatsiooni ja soodustada apoptoosi (Lau et al. 2006). CDC6 on vähkides ülesreguleeritud, sh maovähis (Nakamura et al. 2007) (Tsukamoto et al. 2008). 2R koagulatsiooni faktor (trombiini) retseptor (2R) 2R, mida nimetatakse ka proteinaasiga aktiveeritud retseptoriks (PAR1), on G-valguga seotud retseptor. PAR1, PAR2 ja PAR4 signaaid võivad reguleerida kaltsiumi vabanemist või mitogeen-aktiveeritud valgu kinaasi aktiveerimist ning viia trobotsüütide agregatsiooni, vaskulaarse lõdvestumise, rakkude proliferatsiooni, tsütokiini vabanemise ja põletiku tekkimiseni (Oikonomopoulou et al. 2010). 2R osaleb arvatavalt endoteliaalsete ja kasvaja rakkude proliferatsioonis ja angiogeneesis ning on üleekspresseeritud mitut tüüpi invasiivses ja metastaatilises kasvajas. Ekspressiooni tasemed on otseses korrelatsioonis vähi invasiivsuse astmega (Garcia-Lopez et al. 2010) (Lurje et al. 2010). Maokartsinoomi

53 rakkudes võib 2R aktiveerimine käivitada erinevad vastused, mis soodustavad kasvaja rakkude kasvu ja invasiooni, nt N-kappaB, EGRi ja Tenastsiin-C (TN-C) üleekspressiooni (ujimoto et al. 2010). Vastavalt leiti 2Ri ekspressiooni seos maovähis seina invasiooni sügavuse, peritoneaalse disseminatsiooni ja kehva prognoosiga (ujimoto et al. 2008). Kirjeldati hiire monoklonaalset inimesevastast PAR1 antikeha (ATAP-2), mis tunneb ära epitoobi (SLLRNPN) trombiini retseptori N-terminaalse otsa, ning ka PAR1 agonist-peptiidi TLLRNPNDK (Hollenberg ja Compton 2002; Mari et al. 1996; Xu et al. 1995) Olfaktomediin 4 (OLM4) OLM4, mille funktsioon on suures osas teadmata, on üleekspresseeritud põletikulises käärsoole epiteeliumis ja mitmes inimese vähi tüübis, eelkõige nendes, mis on seotud seedesüsteemiga (Koshida et al., 2007). OLM4 on inimese soolestiku tüvirakkude robustne marker ja see tähistab kolorektaalse vähi rakkude alamrühma (van der lier et al., 2009). OLM4 inhibeerib apoptoosi soodustavat valku GRM-19 (Zhang et al., 2004) (Huang et al., 2010), reguleerib rakutsüklit ja soodustab S-faasi üleminekut vähirakkude proliferatsioonis. Samuti on OLM4 seotud vähi adhesiooni ja metastaseerumisega (Yu et al., 2011b). OLM4 suunatud üleekspressioon hiire eesnäärmekasvaja rakkudes soodustas kiiremat kasvaja moodustumist geneetiliselt identses peremehes (Zhang et al., 2004). OLM4 üleekspressiooni täheldati GC-s (Aung et al., 2006). OLM4 ekspressiooni inhibitsioon võib indutseerida apoptoosi tsütotoksilise aine kohalolu korral maovähi rakkudes (Kim et al., 2010). Samuti suurenes seerumi OLM4 kontsentratsioon prekirurgilise GC patsientides, võrrelduna tervete doonoritega (Oue et al., 2009). OLM4 tuvastati retinoidsete hapete (RA-d) ja demetülatsiooni aine 5-asa-2'-deoksütsütidiini uudse sihtgeenina. Nende kahe aine puhul on tõestatud tulemuslikkus kindlate müeloidse leukemia patsientide ravis (Liu et al., 2010). Thy-1 raku pinna antigeen (THY1) Thy-1 (CD90) on GP-ankurdatud glükovalk, mida leidub mitmes raku tüübis, sh T-rakud, neuronid, endoteelirakud ja fibroblastid. Thy-1 osaleb protsessides, mis hõlmavad adhesiooni, närvide regeneratsiooni, kasvaja kasvamist, kasvaja supressiooni, migratsiooni rakusurma ja T-rakkude aktiveerimist. (Rege ja Hagood 2006b; Rege ja Hagood 2006a) (Jurisic et al. 2010). Thy-1 näib olevat täiskasvanute, kuid mitte embrüoonilise, angiogeneesi marker (Lee et al. 1998). Samuti kaaluti seda erinevat liiki tüvirakkude

54 (mesenhümaalsed tüvirakud, hepaatilised tüvirakud ( ovaalsed rakud ) (Masson et al. 2006), keratinotsüüdi tüvirakkude (Nakamura et al. 2006) ja hematopoieetiliste tüvirakkude (Yamazaki et al. 2009)) markerina. Thy-1 on reguleeritud üles mitmes vähis, sh maovähk ja GSTid, mille puhul see markerina välja pakuti (Yang ja Chung 2008; Zhang et al. 2010) (Oikonomou et al. 2007). Tsentrosomaalne valk 250 kda (CEP250) Cep250-l on roll mikrotuubuleid organiseerivate keskuste kohesioonis (Mayor et al., 2000). Seda nimetatakse ka tsentrosomaalseks Nek2-seotud valguks või C-Nap1-ks, kuna see kolokaliseerub koos seriin/treoniinkinaasiga Nek2 ja on selle substraat. Nek2 kinaas ja selle substraadid reguleerivad tsentrosoomide vahelist sidet (Bahmanyar et al., 2008). Mitoosi alguses, kui tsentrosoomid eralduvad bipolaarse käävi moodustamiseks, fosforüleeritakse C-Nap1 ning seejärel see dissotsieerub tsentrosoomidelt. n vitro katsed näitasid, et Cep250 üleekspressioon kahjustas mikrotuubulite organiseerumist tsentrosoomil (Mayor et al., 2002). Hüpoksiat indutseeriv faktor 1, alfa allüksus (aluseline heeliks-ling-heeliks transkriptsioonifaktor) (H1A) H1A on hüpoksiat indutseeriva faktori (H) hapnikutundlik allüksus, transkriptsioonifaktor, mis on aktiivne hüpoksilistes tingimustes, mida esineb kasvajates tihti. See vahendab transkriptsiooni üle 60 geenis, mis osalevad elulemises, glükooli metaboliseerimises, invasioonis, metastaseerumises ja angiogeneesis (nt VEG). H1 on üleekspresseeritud paljudes vähkides, mida on tihti seostatud kehva prognoosiga, ja seda peetakse huvitavaks sihtmärgiks farmakoloogilise manupulatsiooni jaoks (Griffiths et al. 2005; Quintero et al. 2004; Stoeltzing et al. 2004) (Zhong et al. 1999). Maovähis aitab H1A kaasa angiogeneesile (Nam et al. 2011), see on korrelatioonis kasvaja suuruse, madalama differentatsiooni, kasvaja staadiumi lühema elulemismäära (Qiu et al. 2011) ja metastaseerumisega (Wang et al. 2010) (Han et al. 2006; Kim et al. 2009; Oh et al. 2008; Ru et al. 2007). Arvatakse, et see põhjustab resistentsust kemoteraapiliste ravimite, nagu 5-U, suhtes ravimi poolt indutseeritud apopotoosi kaudu ja vähendab rakusisest ravimi akumuleerumist (Nakamura et al. 2009) (Liu et al. 2008). H-1alfainhibiitor 2-metoksü-estradiool vähendas oluliselt maovähi rakkude metastaatilisi omadusi (Rohwer et al. 2009).

55 v-ki-ras2 Kirsteni roti sarkoomi viiruslik onkogeeni homoloog (KRAS) KRAS on väikese GTPaasi superperekonna liige ja proto-onkogeen, mis osaleb paljude signaali transduktsiooni radade, nagu MAPK- ja AKT-vahendatud rajad, mis on potentsiaalselt onkogeensed, varastes staadiumides. Ühe aminohappe asendamised põhjustavad mutatsioonide aktiveerimist, mis annavad transformeeruva valgu, millel on võtmetähtsusega roll erinevates pahaloomuliste kasvajate, sh maovähi, korral (Capella et al., 1991). KRASi onkogeensed mutatsioonid on maovähis ebakorrapärased. Ühes maovähkide alarühmas oli KRASi lookus võimendatud, mille tulemuseks on KRAS valgu üleekspressioon. Seetõttu moodustab geeni võimendus tõenäoliselt KRASi üleaktiveerimise molekulaarse aluse maovähis (Mita et al., 2009). Mutantse KRASi alleelid aitavad kaasa hüpoksia poolt juhitud VEGi induktsioonile (Kikuchi et al., 2009; Zeng et al., 2010). Muteerunud KRASi on võimalik tuvastada ka vähipatsientide seerumis või plasmas ning see pakuti seetõttu välja kergesti juurdepääsetava kasvajamarkerina (Sorenson, 2000). Peptiid KRAS-001 on saadud ainult ühest kahe splaiss-variandi seast - NP_ (188 aminohapet) ja mitte splaiss-variandist - NP_ (189 aminohapet). Splaiss-variandid erinevad oma viimase eksoni poolest, kus KRAS-001 asub. Mitte-SMC kondensiin kompleks, allüksus G (NCAPG) NCAPG on osa kondensiin kompleksist, mis koosneb kromosoomide struktuuri säilitavatest (SMC) ja mitte-smc valkudest ning mis reguleerib kromosoomi kondensatsiooni ja segregatsiooni mitoosi ajal (Seipold et al., 2009). NCAPG üleekspressiooni leiti mitmetes kasvajates, sh nasofarüngeaalses kartsinoomis (Li et al., 2010), hepatotsellulaarses kartsinoomis (Satow et al., 2010) ja melanoomis (Ryu et al., 2007). Normaalsete kudede hulgas näitas NCAPG testises kõrgeimat ekspressiooni. Tehti ettepanek kasutada seda võimaliku proliferatsiooni markerina ja võimaliku prognootilise näitajana vähis (Jager et al., 2000). Topisomeraas (DNA) alfa (TOP2A) ja topoisomeraas (DNA) beeta (TOP2B) TOP2A ja TOP2B kodeerivad väga homoloogseid isovorme DNA topoisomeraasis, mis juhib ja muudab DNA topoloogilisi seisundeid transkriptsiooni ajal jam is osaleb kromosoomi kondensatsioonis, kromatiidi eraldumises, paljunemises ja transkriptsioonis. Topoisomeraas on mitme vähivastase ravimi suhtmärgiks, nagu antratsükliinid, ja mitmeid mutatsioone on seostatud ravimiresistentsusega (Kellner et al., 2002) (Jarvinen ja Liu, 2006). TOP2A (mitte TOP2B) on oluline rakkude proliferatsiooniks. See asub HER2

56 onkogeeni kõrval ja on võimendatud suures enamuses HER2-võimendatud rinnakasvajates, kuid ka sellistes, kus HER2 võimendus puudub (Jarvinen ja Liu, 2003), ning paljudes teistes kasvaja vormides. Samuti leiti TOP2A-d võimendatult ja üleekspresseeritult maovähkide alamrühmas, mida esineb tihti koos HER2-ga (Varis et al., 2002) (Liang et al., 2008). Laminiin, gamma 2 (LAMC2) Laminiinid on basaalmembraanide olulised mittekollageensed osad. Need osalevad rakkude adhesioonis, diferentseerimises, migratsioonis, signaalides ja metastaseerumises. Gamma 2 ahel koos alfa 3 ja beeta 3 ahelatega moodustavad laminiin 5-e. LAMC2 soodustab inimese vähirakkude in vivo invasiivset kasvamist. Seda on kõrgelt ekspresseeritud inimese vähkides invasiooni frondil ning ekspressioon on korrelatsioonis kehva prognoosiga (Tsubota et al., 2010). Laminiin 5-e MMP-2-genereeritud lõhustumisprodukt suudab aktiveerida EGRi signaali ja soodustada rakkude liikuvust (Schenk et al., 2003). Maovähis võivad LAMC2-e indutseerida EGRi perekonna liikmed või Wnt5a ning näidati invasiivsete toimingute sõltumist LAMC2-st (Tsubota et al., 2010) (Yamamoto et al., 2009). Arüülsüsivesiniku retseptor (AHR) AHR seob planaarseid aromaatilisi süsivesinikke, nagu TCDD (2,3,7,8-tetraklorodibensop-dioksiin), ning vahendab geenide, sh ksenobiootilised metaboliseerivad ensüümid, nagu tsütokroomi P450 ensüümid, transkriptsiooni. Sellel on samuti roll rakutsükli progressioonis (Barhoover et al. 2010). Arvatakse, et AhR on osaliselt seotud dioksiini kasvajate arengut soodustava toimega, kuna sellel on proproliferatiivsed ja antiapoptootilised funktsioonid, ning see võib põhjustada rakkudevahelise kontakti deregulatsiooni, dedifferatsiooni ja parandatud liikuvust (Watabe et al. 2010) (Dietrich ja Kaina 2010) (Marlowe et al. 2008). AHRi ekspressiooni on võimalik alla reguleerida TGbeetaga (Dohr ja Abel 1997; Wolff et al. 2001) ning indutseerida Wnt või beeta-kateniini signaaliga (Chesire et al. 2004). AHRi üleekspressiooni tuvastati paljudes vähkides, sh maovähk, kus see oli korrelatsioonis sagedase CYP1A1 ekspressiooniga (Ma et al. 2006). AHRi ekspressioon ja nukleaarne translokatsioon olid kõrgemad maovähis kui normaalsetes kudedes ning ekspressioon suurenes järk-järguliselt kartsinogeneesi ajal (Peng et al. 2009a). AhRi raja aktiveerimine suurendab maovähi rakkude invasiivsust tõenäoliselt MMP-9 c-jun-sõltuva induktsiooniga (Peng et al. 2009b). Hiirmudelis on arüülsüsivesiniku

57 retseptori (CA-AhR) konstitutiivselt aktiivse mutandi ekspressiooni tulemuseks maokasvajate areng, mis on korrelatsioonis suurenenud suremusega (Andersson et al. 2002; Kuznetsov et al. 2005). AhRi funktsioon vähis näib vastuolulisena, kuna mõned uuringud osutavad samuti kasvajaid supresseerivale toimele (Gluschnaider et al. 2010)(an et al. 2010). Hüaluroonvahendatud liikuvuse retseptor (RHAMM) (HMMR) HMMRi võib esineda raku pinnal, kus see seob hüaluroonhapet (HA) ja omab vastastikust toimet HA retseptori CD44-ga. Käesoleval vastastikusel toimel on roll protsessides, nagu rakkude liikuvus, haavade paranemine ja invasion (Gares ja Pilarski, 2000). Rakusiseselt on HMMR seotud tsütoskeleti, mikrotuubulite, tsentrosoomide ja mitootilise kääviga ning sellel on roll mitootilise käävi terviklikkuse kontrollis. HMMR on üleekspresseeritud mitme vähi rakkudes (Sohr ja Engeland, 2008). Pakuti välja, et HA kaitseb vähirakke immuunrünnaku eest. Seerumi HA suureneb tihti metastaatilistes patsientides (Delpech et al., 1997). HMMR tuvastati paljulubava kasvajaga seotud antigeenina ja võimaliku prognostilise faktorina AMLis ja CLLis. HMMRist tuletatud peptiide on kasutatud leukeemiavastastes vaktsiinides. HMMR-001 testiti samuti in vitro immunogeensuse suhtes, kuid seda ei kasutatud vaktsinerimiseks (Tzankov et al., 2011) (Greiner et al., 2010; Schmitt et al., 2008; Tabarkiewicz ja Giannopoulos, 2010) (Greiner et al., 2005). HMMRi üleekspressiooni leiti ka mitmes teises vähis, mida on tihti seostatud kehva prognoosiga. HMMR oli maovähis alati üleekspresseeritud (tihti koos CD44-ga) ning pakuti välja, et see soodustab invasiooni ja metastaasi (Li et al., 1999) (Li et al., 2000a) (Li et al., 2000b). TPX2, mikrotuubuliga seotud, homoloog (Xenopus laevis) (TPX2) TPRX2 on proliferatsiooniga seotud valk, mida ekspresseeritakse rakutsükli S-, G(2)- ja M- faasides ning mida käsitletakse proliferatsiooni markerina (Cordes et al., 2010). See on vajalik normaalse mikrotuubuli nukleatsiooni jaoks, nt mitootiliste käävide koostamiseks. TPX2 lisab ja aktiveerib Aurora A (Bird ja Hyman, 2008; Moss et al., 2009). TPX2-e fosforülatsioon polo-laadse kinaas 1-ga suurendab selle võimet aktiveerida Aurora A (Eckerdt et al., 2009). TPX2 on üle ekspresseeritud paljudes kasvaja tüüpides ja sagedasti kaasüleekspresseeritud Aurora-A-ga (Asteriti et al., 2010). Näited TPX2-e üleekspressiooni leidudest (mida seostatakse sagedasti kehva prongoosi või hilise staadiumiga) on meningioom (et al., 2010), kopsuvähk (Kadara et al., 2009) (Lin et al., 2006; Ma et al.,

58 ) (Manda et al., 1999) ja hepatotsellulaarne kartsinoom (Shigeishi et al., 2009b) (Satow et al., 2010) (Wang et al., 2003). Käesolev leiutis on seetõttu seotud peptiidiga, mille üldine pikkus on 10 kuni 14 aminohapet, mis koosneb järjestusest, mis on valitud rühmast, mis hõlmab a) SEQ D nr 1 sisaldavat järjestust, b) SEQ D nr 1 varianti, mis kutsub esile T-rakkude ristreageerimist leiutise peptiidiga, kus asjaomane variant on valitud järjestusi LQLQGV, LYQLQGVL, LYQLQGV, LQLQGVL ja LQLQGV sisaldavast rühmast. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud eelnevalt kirjeldatud peptiidiga, millel on võime seostuda inimese peamise koesobivuskompleksi (MHC) klassi molekuliga. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud eelnevalt kirjeldatud peptiididega, kus peptiid koosneb täielikult või peamiselt aminohappe järjestusest vastavalt SEQ D nr 1 kuni SEQ D nr 95. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud eelnevalt kirjeldatud peptiididega, kus peptiid hõlmab mittepeptiidsidemeid. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud eelnevalt kirjeldatud peptiididega, kus asjaomane peptiid on liitvalgu osa, mis sisaldab eelkõige HLA-DR antigeeniga seotud muutumatu ahela (i) N-terminaalseid aminohappeid. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud nukleiinhappega, mis kodeerib eelnevalt kirjeldatud peptiide tingimusel, et peptiid pole täielikult inimvalk. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud eelnevalt kirjeldatud nukleiinhappega, mis on DNA, cdna, PNA, RNA või nende kombinatsioon. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud ekspressioonivektoriga, mis ekspresseerib eelnevalt kirjeldatud nukleiinhapet. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud eelnevalt kirjeldatud peptiidi, eelnevalt kirjeldatud nukleiinhappe või eelnevalt kirjeldatud ekspressioonivektoriga kasutamiseks meditsiinis.

59 Käesolev leiutis on seotud peremeesrakuga, mis koosneb eelnevalt kirjeldatud nukleiinhappest või eelnevalt kirjeldatud ekspressioonivektorist. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud kirjeldatud peremeesrakuga, mis on antigeeni esitav rakk. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud kirjeldatud peremeesrakuga, kus antigeeni esitav rakk on dendriitiline rakk. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud kirjeldatud peptiidi valmistamise meetodiga, kus meetod koosneb kirjeldatud peremeesraku kasvatamisest ja peptiidi isoleerimisest peremeesrakust või selle kultiveerimise söötmest. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud in vitro meetodiga aktiveeritud tsütotoksiliste T- lümfotsüütide (CTL) valmistamiseks, kus meetod koosneb in vitro CTLi ühendamisest antigeeni kandva inimese MHC klassi molekulidega, mida ekspresseeritakse sobiliku antigeeni esitava raku pinnal ajavahemikuks, mis on piisav asjaomase CTLi aktiveerimiseks antigeenspetsiifilisel viisil, kus asjaomane antigeen on mis tahes kirjeldatud peptiid. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud kirjeldatud meetodiga, kus antigeen on seotud MHC klassi molekulidele, mida ekspresseeritakse sobiliku antigeeni esitava raku pinnal, ühendades piisava hulga antigeeni antigeeni esitava rakuga. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud kirjeldatud meetodiga, kus antigeeni esitav rakk koosneb ekspressioonivektorist, mis suudab ekspresseerida asjaomast peptiidi, mis sisaldab SEQ D nr 1 või aminohappe järjestuse varianti, mis on valitud järjestusi LQLQGV, LYQLQGVL, LYQLQGV, LQLQGVL ja LQLQGV sisaldavast rühmast. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud aktiveeritud tsütotoksiliste T-lümfotsüütidega (CTL), mida valmistatakse kirjeldatud meetodil, mis tunneb selektiivselt ära raku, mis ekspresseerib kõrvalekalduvalt polüpeptiidi, mis koosneb kirjeldatud aminohappe järjestusest.

60 Kirjeldatakse märklaudrakkude tapmise meetodit patsientide puhul, kelle märklaudrakud ekspresseerivad kõrvalekalduvalt polüpeptiidi, mis sisaldab mis tahes kirjeldatud aminohappe järjestust, kusjuures meetod sisaldab patsiendile efektiivse arvu tsütotoksiliste T-lümfotsüütide, nagu on määratletud eespool, manustamist. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud peptiidiga vastavalt leiutisele, nukleiinhappe või ekspressioonivektoriga vastavalt leiutisele, peremeesrakuga vastavalt leiutisele või aktiveeritud tsütotoksiliste T-lümfotsüütidega vastavalt leiutisele kasutamiseks vähiravis, näiteks mao-, seedetrakti-, kolorektaalse, kõhunäärme-, kopsu- või neeruvähi puhul. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud peptiidiga vastavalt leiutisele, nukleiinhappe või ekspressioonivektoriga vastavalt leiutisele, peremeesrakuga vastavalt leiutisele või aktiveeritud tsütotoksiliste T-lümfotsüütidega vastavalt leiutisele kasutamiseks ravimina kirjeldatud viisil, kus ravim on vaktsiin. Käesolev leiutis on täiendavalt seotud peptiidi mitteterapeutilise kasutamisega vastavalt leiutisele antikehade loomiseks ja arendamiseks, mis on spetsiifilised käesolevat peptiidi sisaldava MHC/peptiidi kompleksi vastu. Kirjeldatud on kindlaid markervalkusid, mida on võimalik kasutada maovähi prognoosis. Täiendavalt on kirjeldatud nende uudsete sihtmärkide kasutamist vähiraviks. Nagu käesolevas dokumendis kirjeldatud, ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, E2S3, LOC255308, EPHA2, ERBB2, ERBB3, 2R, AP, HMMR, HSP90B1, G2BP3, TGB4, K2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP12, MMP3, MST1R, NU2, OLM4, PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A, TSPAN1, WNT5A, H1A ja PTK2 poolt kodeeritud valkusid kirjeldati üleekspresseerituna maovähis, võrrelduna normaalsete mao ja muude eluvõimeliste rakkudega (nt maks, neerud, süda) kirjanduses. Valkudel, mida kodeerivad ABL1, ADAM10, ADAM8, AHR, ASPM, ATAD2, CCDC88A, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, CLCN3, COL6A3, EPHA2, ERBB2, ERBB3, 2R, AP, H1A, HMMR, HSP90B1, G2BP3, QGAP3, TGB4, K11, K2C, KRAS, LAMC2,

61 LCN2, MET, MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NYB, NU2, OLM4, PBK, PLK4, PPAP2C, PROM1, PTK2, RRM2, SAH2, THY1, TOP2A, TPX2, TSPAN1, TSPAN8, UBE2S, UCHL5 ja WNT5A, näidati olulise rolli täitmist tumorigeneesis, kuna need osalesid pahaloomulises transformatsioonis, rakukasvus, proliferatsioonis, angiogeneesis või invasioonis normaalsetesse kudedesse. Teatud tõendeid vähiga seotud funktsioonide kohta leiti ka valkude kohta, mida kodeerivad DNAJC10, E2S3, E3L, POLD3, PSMC2, PSMD14 ja TMPRSS4. Valgud, mida kodeerivad PROM1, WNT5A, SMC4, PPAP2C, GPR38, OLM4 ja THY1 on näidanud kõrget ekspressiooni ja/või funktsionaalselt olulist rolli tüvirakkudes ja/või vähi tüvirakkudes. PROM1-e kasutamist maovähi tüvirakkude markerina on arutatud, kuigi seda puudutavad andmed on vastuolulised. Vähi tüvirakud on kasvajarakkude alampopulatsioon, millel on iseuuenemise potentsiaali, mis on vajalik kasvaja kasvamise säilitamiseks. Need rakud asuvad spetsialiseerunud ja äärmiselt organiseeritud struktuurides, n.ö vähi tüvirakkude niššides, mis on vajalikud vähi tüvirakkude iseuuenemise potentsiaali säilitamiseks. Valkude AHR, ASPM, ATAD2, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDK1 (CDC2), CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, EPHA2, ERBB2, ERBB3, 2R, AP, H1A, HMMR,HSP90B1, G2BP3, TGB4, K11, K2C, KRAS, LAMC2, LCN2, LMNB1, MET, MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NU2, OLM4, PBK, PPAP2C, PROM1, PTK2, TMPRSS4, TPX2, TSPAN1 ja WNT5A üleekspressiooni kasvajates on näidatud seoses hiliste haigusstaadiumidega ja kehva prognoosiga patsientide jaoks. Seetõttu kirjeldatakse tõenäoliselt maovähiga looma, eelistuslikult inimese, identifitseerimise meetodeid. Ühes näites on määratud tõenäosus vahemikus 80% kuni 100%. Üks selline meetod põhineb vähemalt ühe valgu (MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6) taseme kindlaksmääramisel loomsubjekti kasvajaproovist. Ühes ravis hangitakse proov radikaalse kirurgilise raviga. Teises näites hangitakse proov nõelbiopsiaga. Kui MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 kindlaks määratud tase on rakkudes 20 % või rohkem üles reguleeritud, võrrelduna sama proovi

62 healoomuliste epiteelirakkudega, on loomsubjekt tuvastatud subjektina, kellel on tõenäoliselt maovähk. Mida suurem arv rühma keerulisemaid valkusid, mis sisaldavad MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6, on üles reguleeritud, seda kõrgem on võimalus, et loomsubjekt tuvastatakse subjektina, kellel on tõenäoliselt maovähk. Ühes näites teostatakse MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramine in situ. Teises näites teostatakse MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramine in vitro. Veel ühes näites teostatakse MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramine in vivo. Ühes näites teostatakse MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramine laserpüüdur mikroskoopiaga, mida kohaldatakse koos Western blot analüüsiga. Ühes näites teostati MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramist antikehaga, mis on spetsiifiline MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 jaoks. Teises sellises näites teostati MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramist PCRiga, kasutades MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 kodeeriva mrna jaoks spetsiifilist praimerit. Veel ühes näites teostati MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramist nukleotiidprooviga, mis on spetsiifiline MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 kodeeriva mrna jaoks. Ühes sellises näites teostatakse MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramine Northern blot analüüsiga. Teises näites teostatakse MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 taseme kindlaksmääramine ribonukleaasi kaitseanalüüsiga. Teises näites võidakse kasutada immunoloogilisi teste, nagu ensüümiga seotud immuunosorbendi analüüsid (ELSA), kiiritusimmunoanalüüsid (RA) ja Western blot analüüsid, et tuvastada MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiide kehavedelike proovides (nagu veri, seerum, röga, uriin või peritoneaalne vedelik). Biopsiaid, koeproove ja rakuproove (nagu munasarjad, lümfisõlmed, munsarjade pinna epiteelirakkude kraaped, kopsubiopsiad, maksabiopsiad ja mis tahes rakke sisaldavad vedelikuproovid (nagu peritoneaalne vedelik, röga ja

63 kopsukelmeefusioonid) võib testida koe- või rakuproovi disagregeerides ja/või solubiliseerides ning rakendades selle suhtes immunoanalüüsi polüpeptiidide tuvastamiseks, ELSA, RA või Western blot analüüsi. Selliseid raku- või koeproove võib samuti analüüsida nukleiinhapetel põhinevate meetoditega, nt transkriptsioon-polümeraasi ahela pöördreaktsiooni (RT-PCR) võimendamise, Northern hübridiseerimise või slot- või dot-blottimisega. Kasvajarakkude jaotuse visualiseerimiseks koeproovis võib kasutada diagnostilisi teste, mis säilitavad proovi koestruktuuri, nt immunohistoloogiline värvimine, in situ RNA hübridiseerimine või in situ RT-PDR, et tuvastada vastavalt maovähi markerpolüpeptiidi või mrna-d. Kasvaja masside in vivo lokaliseerimiseks võib kasutada kujutavaid teste, nagu magnetresonantstomograafia (MR), viies subjekti kehasse antikeha, mis seob spetsiifiliselt MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 polüpeptiidi (eelkõige raku pinnal lokaliseeritud polüpeptiidi), kus antikeha on ühendatud või muul viisil seotud paramagnetilise märgistusainega (või muu asjakohase tuvastatava osaga sõltuvalt kasutatud kujutamise meetodist); samas võib märgistamata kasvaja markerspetsiifilise antikeha lokalisatsiooni tuvastada, kasutades selleks sekundaarset antikeha, mis on seotud tuvastatava osaga. Samuti on kirjeldatud kimäärseid/liitvalke/-peptiide, mida hõlmavad MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 polüpeptiide ja nende fragmente, sh funktsionaalseid, proteolüütseid või antigeenseid fragmente. Hübriidmolekuli liitumise partner või osad pakuvad sobivalt epitome, mis stimuleerivad CD4 + T-rakkusid. CD4 + stimuleerivad epitoobid on valdkonnas hästi teada ning hõlmavad neid, mida on tuvastatud teetanuse toksoidis. Ühes näites on peptiid liitvalk, mis sisaldab HLA-DR antigeeniga seotud muutumatu ahela (i) N-terminaalseid aminohappeid. Ühes näites on kirjeldatud valgu fragmendi kärbitud inimvalku või liitvalku ja teise polüpeptiidi osa tingimusel, et inimosa sisaldab ühte või enamat leiutise aminohappe järjestust. On kirjeldatud MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 popüpeptiidide, MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 polüpeptiidide kimäärsete/liitvalkude või MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 polüpeptiidide fragmentide, sh proteolüütsed ja antigeensed fragmendid, ning neid fragmente sisaldavate kimäärsete/liitvalkude/-peptiidide antikehasid.

64 Samuti on kirjeldatud nende antikehade kasutamismeetodeid vähi (ja eelkõige maovähi) prognoosimiseks. Käesoleva leiutise antikehad võivad olla polüklonaalsed antikehad, monoklonaalsed antikehad ja/või kimäärsed antikehad. Käesoleva leiutise osaks on ka immortaliseeritud rakuliinid, mis toodavad käesoleva leiutise monoklonaalset antikeha. Valdkonnas tavapäraseid oskuseid omav isik mõistab, et mõnel juhul annab MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 kõrgem ekspressioon kasvaja markergeenina märku maovähiga patsiendi halvemast prognoosist. Näiteks võivad MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 ekspressiooni suhteliselt kõrgemad tasemed anda märku suhteliselt suurest primaarsest kasvajast, kõrgemast kasvaja koormusest (nt rohkem metastaase) või suhteliselt pahaloomulisemast kasvaja fenotüübist. Mida enam üleekspresseeritakse MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 sisaldava rühma erinevaid valke, seda halvem on prognoos. Kirjeldatud diagnostilised ja prognostilised meetodid hõlmavad teadaolevate meetodite kasutamist, antikehapõhised meetodid MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidide tuvastamiseks ning nukleiinhappe hübridiseerimisel ja/või võimendamisel põhinevad meetodid MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 mrna tuvastamiseks. Kuna kasvajarakkude kiire hävinemise tulemuseks on tihti autoantikehade loomine, võib leiutise maovähi kasvajamarkereid kasutada seroloogilistes analüüsides (nt uuritava seerumi ELSA testis), et tuvastada isikutel autoantikehasid MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 vastu. MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidispetsiifiliste autoantikehade tasemed, mis on vähemalt umbes 3 korda kõrgemad (ning eelistuslikult vähemalt 5 või 7 korda kõrgemad, kõige eelistuslikumalt 10 või 20 korda kõrgemad) kui kontrollproovis, osutavad maovähile.

65 Raku pinnal lokaliseeritud, intratsellulaarsed ja sekreteeritud MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiide võib kõiki kasutada biopsiate, nt koe- või rakuproovid (sh vedelike, nagu peritoneaalse õõnsuse vedelik, proovidest hangitud rakud), analüüsiks, et tuvastada maovähi rakkusid sisaldav koe- või rakubiopsia. Biopsiat võib analüüsida puutumatu koe või täisraku proovina või koe- või rakuproovi võib vastavalt vajadusele kasutatava diagnostilise testi asjaomase tüübi jaoks disagregeerida ja/või solubiliseerida. Näiteks võib biopsiate või proovide suhtes kohaldada täiskoe- või täisrakuanalüüsi MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidi või mrna tasemete suhtes in situ, nt kasutades immunohistokeemiat, in situ mrna hübridiseerimist või in situ RT-PCRi. Vastavate oskustega spetsialist teab, kuidas kudesid või rakkusid töödelda polüpeptiidi või mrna tasemete analüüsiks, kasutades immunoloogilisi meetodeid, nagu ELSA, immunoblottimine või samaväärsed meetodid, või mrna tasemete analüüsiks nukleiinhappepõhiste analüütiliste meetoditega, nagu RT- PCR, Northern hübridisatsioon või slot- või dot-blottimine. Komplektid MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 ekspressiooni tasemete mõõtmiseks. Kirjeldatud on komplekte MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 suurenenud ekspressiooni tasemete tuvastamiseks maovähi markergeenina subjektis. Maovähi markerpolüpeptiidi tuvastamise komplekt sisaldab eelistuslikult antikeha, mis seob spetsiifiliselt valitud maovähi markerpolüpeptiidi. Maovähi markermrna tuvastamise komplekt sisaldab eelistuslikult ühte või enamat nukleiinhapet (nt ühte või enamat oligonukleotiidi praimerit või proove, DNA-proove, RNA-proove või RNAproovide loomise malle), mis hübridiseeruvad spetsiifiliselt koos MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 mrna-ga. Antikehapõhist komplekti on võimalik kasutada eelkõige MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidi, mis on spetsiifiliselt seotud antikeha või selle immunoreaktiivse fragmendi poolt, olemasolu tuvastamiseks ja/või taseme mõõtmiseks. Komplekt võib hõlmata antikeha, mis reageerib antigeeni, ja reaktiivi, millega tuvastatakse antikeha reaktsioon antigeeniga. Selline komplekt võib olla ELSA-komplekt ja see võib asjakohastel juhtudel sisaldada kontroll- (nt kindlaks määratud hulk teatava maovähi markerpolüpeptiidi), primaar- ja sekundaarantikehasid ning mis tahes muid

66 vajalikke reaktiive, nagu ülelkirjeldatud tuvastatavad osad, ensüümi substraadid ja värvreaktiivid. Diagnostiline komplekt võib alternatiivselt olla immunobloti komplekt, mis sisaldab tavaliselt käesolevas dokumendis kirjeldatud komponente ja reaktiive. Nukleiinhappepõhist komplekti saab kasutada MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 ekspressioonitaseme tuvastamiesks ja/või mõõtmiseks, tuvastades ja/või mõõtes MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 mrna hulka proovis, nagu koe- või rakubiopsia. Näiteks sisaldab RT-PCR komplekt MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 suurenenud ekspressiooni tuvastamiseks eelistuslikult oligonukleotiidi praimereid, mis on piisavad maovähi marker-mrna pöördtranskriptsiooni teostamiseks cdna-le ning maovähi marker-cdna PCR-võimendamiseks, ning see sisaldab eelistuslikult ka kontroll- PCR-malli molekule ja praimereid asjakohaste negatiivsete ja positiivsete kontrolltoimingute ja kvantifitseerimiste sisekontrolltoimingute läbiviimiseks. Valdkonnas tavapäraseid oskuseid omav isik mõistab, kuidas valida sobilikke praimereid pöördtranskriptsiooni ja PCR-reaktsioonide läbiviimiseks ning sooritatavaid sobilikke kontrollreaktsioone. Sellekohased juhised leiduvad näiteks väljaandes. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., Valdkonnas on teada mitmeid RT-PCR variatsioone. mmunotoksiinide sihtmärgistatud manustamist MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6-le on võimalik rakendada terapeutiliste sihtmärkidena maovähi ravis või ennetamises. Näiteks antikeha molekuli, mis seob spetsiifiliselt raku pinnale lokaliseeritud MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidi, on võimalik ühendada radioisotoobi või muu toksilise ühendiga. Antikeha konjugaate manustatakse subjektile nii, et antikeha sidumine selle ühise päritoluga maovähi polüpeptiidiga annab tulemuseks terapeutilise ühendi sihtmärgistatud manustamise maovähi rakkudele, ravides sellega munasarjavähki. Terapeutiliselt aktiivne osa võib olla toksiin, radioisotoop, ravim, kemikaal või valk (vt nt Bera et al. Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent disulfide-stabilized v immunotoxin with improved antigen binding to erbbβ Cancer Res. 59: (1999)). Antikeha võib näiteks olla seotud või ühendatud bakteriaalse toksiiniga (nt difteeriatoksiin, pseudomonas eksotoksiin A, koolera toksiin) või taimse toksiiniga (nt ritsiini toksiin), et manustada toksiin sihtmärgistatult rakuni, mis ekspresseerib MST1R, UCHL5, SMC4,

67 NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6-t. Käesolevat immunotoksiini on võimalik rakule manustada ning raku pinnale lokaliseeritud maovähi markerpolüpeptiidi sidumise järel manustatakse rakule maovähi markerspetsiifilise antikehaga ühendatud toksiin. Samuti on kõigi MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidi ligndite puhul, millel on olemas spetsiifiline ligand (nt ligand, mis seob raku pinnale lokaliseeritud valku), võimalik ligandit kasutada antikeha asemel, et sihtmärgistada ülalkirjeldatud viisil toksilist ühendit maovähi rakule. Terminit antikehad kasutatakse käesolevas tekstis laias mõistes ning see hõlmab nii polüklonaalseid ja monoklonaalseid antikehasid. Terminis antikehad on lisaks puutumatutele immunoglobuliini molekulidele hõlmatud ka nende immunoglobuliini molekulide fragmendid või polümeerid ning immunoglobuliini molekulide humaniseeritud versioonid tingimusel, et need näitavad käesolevas dokumendis kirjeldatud mis tahes soovitud omadusi (nt maovähi markerpolüpeptiidi spetsiifiline sidumine, toksiini manustamine maovähi rakku, mis ekspresseerib suurenenud tasemel maovähi markergeeni, ja/või maovähi markerpolüpeptiidi aktiivsuse takistamine). Võimalusel võib kirjeldatud antikehasid osta kaubanduslikest allikatest. Leiutise antikehasid võib samuti toota hästituntud meetodeid kasutades. Vastavate oskustega spetsialist saab aru, et täispikkasid maovähi markerpolüpeptiide või nende fragmente on võimalik kasutada kirjeldatud viisil antikehade tootmiseks. Leiutise antikeha tootmiseks kasutatavat polüpeptiidi võib osaliselt või täielikult loomulikust allikast puhastada või seda võib toota, kasutades rekombinantse DNA meetodeid. Näiteks cdna-d, mis kodeerib MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6-e polüpeptiidi või selle fragmenti, on võimalik ekspresseerida prokarüootsetes rakkudes (nt bakterites) või eukarüootsetes rakkudes (näiteks pärmi, putuka või imetaja rakkudes), mille järel on võimalik rekombinantne valk puhastada ja seda kasutada monoklonaalse või polüklonaalse antikeha preparaadi loomiseks, mis seob spetsiifiliselt maovähi markerpolüpeptiidi, mida kasutatakse antikeha loomiseks. Asjatundjad teavad, et kahe või enama monoklonaalsete või polüklonaalsete antikehade komplekti tootmine maksimeerib kavandatud kasutuseesmärgiks vajaliku spetsiifilisuse ja afiinsusega antikeha hankimise tõenäosust (nt ELSA, immunohistokeemia, in vivo kujutamise või immunotoksiinraviga). Antikehasid testitakse nendepoolse soovitud

68 toimingute täitmise suhtes tuntud meetodeid kasutades, mis on kooskõlas antikehade kasutuseesmärgiga (nt ELSA, immunohistokeemia, immunoravi vms; täiendavaid suuniseid antikehade tootmise ja testimise kohta leiate nt väljaandest, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Näiteks võib antikehasid testida ELSA-analüüside, Western blot analüüside, formaliinis fikseeritud maovähkide immunohistokeemilise värvimise või külmutatud kudede osadega. Nende esialgse in vitro iseloomustamise järel testitakse terapeutilises või in vivo diagnostikaks mõeldud antikehasid tuntud kliinilise testimise meetodeid kasutades. Terminit monoklonaalne antikeha, nagu seda on käesolevas dokumendis kasutatud, osutab antikehale, mis on hangitud olulisel määral homogeensest antikehade populatsioonist, s.o populatsiooni moodustavad individuaalsed antikehad on identsed, v.a võimalikud loomulikult esinevad mutatsioonid, mida võib vähesel määral esineda. Käesolevas dokumendis kirjeldatud monoklonaalsed antikehad hõlmavad spetsiifiliselt kimäärseid antikehasid, kus osa raskest ja/või kergest ahelast on identne või homoloogne antikehade vastavate järjestustega, mis on saadud kindlast liigist või kuulub kindlasse antikehade klassi või alamklassi, samas kui ülejäänud ahel(ad) on identne (/identsed) või homoloogne(/homoloogsed) vastavate järjestustega antikehades, mis on saadud teiselt liigilt või kuulub teise antikehade klassi või alamklassi, sh selliste antikehade fragmendid, tingimusel, et need näitavad soovitud antagonistlikke toiminguid (U.S. pat. nr 4,816,567). Leiutise monoklonaalseid antikehasid võib valmistada hübridoomimeetodeid kasutades. Hübridoomimeetodis immuniseeritakse hiir või muu asjakohane peremeesloom immuniseerimisainega, et kutsuda esile lümfotsüüte, mis toodavad või suudavad toota antikehasid, mis seonduvad spetsiifiliselt immuniseerimisainega. Alternatiivselt võib lümfotsüüte in vitro immuniseerida. Monoklonaalseid antikehasid võib samuti toota rekombinantse DNA meetoditega, nagu need, mida on kirjeldatud USA pat. nr 4,816,567. Leiutise monoklonaalsete antikehade DNA kodeerimise saab kergesti isoleerida ja järjestada konventsionaalseid protseduure kasutades (nt oligonukleotiidi proove kasutades, mis suudavad seonduda spetsiifiliselt geenidega, mis kodeerivad hiirte antikehade raskeid ja kergeid ahelaid).

69 n vitro meetodid sobivad samuti monovalentsete antikehade valmistamiseks. Antikehade proteinolüüsi nende fragmentide (eelkõige ab fragmentide) tootmiseks on võimalik saavutada, kasutades valdkonnas tuntud tavapäraseid meetodeid. Näitekson proteinolüüsi võimalik teostada papaiini kasutades. Papaiini proteinolüüsi näiteid on kirjeldatud dokumendis WO 94/29348, mis avaldati 22. dets, 1994, ja on seotud USA pat. nr 4,342,566. Antikehade papaiiniga proteinolüüs toodab tavaliselt kaks identset antigeeniga seonduvat fragmenti (mida nimetatakse ab fragmentideks), kus kummalgi on sama antigeeni seondumiskoht ja järelejäänud e fragment. Pepsiinga proteinolüüs annab fragmendi, millel on kaks antigeeni kombineerimise saiti ja mis suudab endiselt antigeene ristsiduda. Antikeha fragmendid, mis on kinnitunud teistele järjestustele või pole sinna kinnitunud, võivad samuti hõlmata kindlate piirkondade või spetsiifiliste aminohapete jääkide insertsioone, deletsioone, asendusi või muid valitud modifiktsioone tingimusel, et fragmendi aktiivsust ei mõjutata või häirita olulisel määral, võrrelduna modifitseerimata antikeha või antikeha fragmendiga. Need modifikatsioonid võivad pakkuda täiendavaid omadusi, näiteks eemaldada/lisada aminohappeid, mis on võimelised disulfiidi seonduma, et suurendada selle bio-pikaealisust, muuta selle sekretoorseid omadusi vms. Antikeha fragment peab igal juhul omama bioaktiivset omadust, nagu seondamisaktiivsust, seondamise reguleerimist seondamisdomeenil vms. Antikeha funktsionaalseid või aktiivseid piirkondi on võimalik tuvastada mutageneesiga valgu spetsiifilises piirkonnas, millele järgneb ekspresseeritud polüpeptiidi ekspressioon ja testimine. Sellised meetodid on kergelt kättesaadavad asjatundja jaoks ning võivad hõlmata antikeha fragmenti kodeeriva nukleiinhappe saitspetsiifilist mutageneesi. Kirjeldatud antigeenid võivad sisaldada samuti humaniseeritud antikehasid või inimese antikehasid. Mitte inimpäritolu (nt hiire) antikehade humaniseeritud vormid on kimäärsed immunoglobuliinid, immunoglobuliini ahelad või nende fragmendid (nagu v, ab, ab' või muud antikehade antigeeniga seonduvad alamjärjestused), mis sisaldavad minimaalset järjestust, mis on tuletatud mitte inimpäritolu immunoglobuliinist. Humaniseeritud antikehad hõlmavad inimese immunoglobuliine (retsipientantikeha), milles retsipiendi komplementaarsust määrava piirkonna (CDR) jäägid asendatakse mitte inimliikide (doonorantikeha), nagu hiire, roti või jänese, millel on soovitud spetsiifilisus, afiinsus ja võime, CDRi jääkidega. Mõnel juhul asendatakse inimese immunoglobuliini v-raamistiku

70 (R) jäägid vastavate mitte inimpäritolu jääkidega. Humaniseeritud antikehad võivad samuti sisaldada jääke, mida ei leidu nii retsipientantikehas kui ka imporditud CDRi või raamistiku järjestustes. Üldiselt sisaldab humaniseeritud antikeha olulisel määral kogu vähemalt ühte (ja tüüpiliselt kahte) varieeruvat domeeni, mille puhul kõik või olulisel määral kõik CDRi piirkonnad vastavad mitte inimpäritolu immunoglobuliini domeenidele, ning kõik või olulisel määral kõik R-piirkonnad on sellised, mis on omased inimese immunoglobuliini konsensuse järjestusele. Humaniseeritud antikeha sisaldab optimaalselt samuti vähemalt osa immunoglobuliini konstantsest piirkonnast (c), mis tüüpiliselt kuulub inimese immunoglobuliinile. Mitte inimpäritolu antikehade humaniseerimise meetodid on valdkonnas hästi teada. Üldiselt on humaniseeritud antikehal üks või enam aminohappe jääki, mis on sellele lisatud allikast, mis on mitte inimpäritolu. Nendele mitte inimpäritolu aminohapete jääkidele osutatakse tihti importjääkidena, mis on tihti väetud imporditud varieeruvast domeenist. Humaniseerimist on võimalik põhimõtteliselt läbi viia, asendades närilise CDRid või CDRi järjestused inimese antikeha vastavate järjestustega. Vastavalt on sellised humaniseeritud antikehad kimäärsed antikehad (USA pat. nr 4,816,567), kus mitteinimliigi vastava järjestusega on asendatud oluliselt väiksem osa kui puutumatu inimese varieeruv domeen. Praktikas on humaniseeritud antikehad tüüpiliselt inimese antikehad, kus mõned CDRi jäägid ja võimalusel mõned R-jäägid on asendatud näriliste antikehade analoogsetest saitidest pärinevate jääkidega. On võimalik kasutada transgeenseid loomi (nt hiired), kes suudavad immuniseerimise korral toota inimese antikehade täieliku komplekti endogeense immonuglobuliini tootmise puudumise korral. Näiteks on kirjeldatud, et antikeha raske ahela ühendamise piirkonna geeni homosügootne kustutamine kimäärsetes ja iduliinis muteeritud hiirtes põhjustab endogeensete antikehade tootmise täielikku inhibeerimist. nimese iduliini immunoglobuliini geeniproovi ülekanne sellistes iduliinis muteeritud hiirtes põhjustab inimese antikehade tootmist antigeeni reaktsiooni korral. nimese antikehasid on samuti võimalik toota faagkuva raamatukogudes. Kirjeldatud antikehasid manustatakse eelistuslikult subjektile farmatseutiliselt vastuvõetava kandjaga. Tüüpiliselt kasutatakse preparaadis asjakohases hulgas farmatseutiliselt vastuvõetavat soola, et muuta preparaat isotooniliseks. armatseutiliselt vastuvõetavad

71 kandjad hõlmavad soola, Ringeri lahust ja dekstroosi lahust. Lahuse ph on eelistuslikult vahemikus u 5 kuni u 8 ja eelistuslikumalt vahemikus u 7 kuni u 7,5. Muud kandjad hõlmavad toimeainet järk-järgult vabastavaid preparaate, nagu antikeha sisaldavate tahkete hüdrofoobsete polümeeride poolläbilaskvaid maatrikseid, mille maatriksid on vormiliste artiklite vormis, nt kiled, liposoomid või mikroosakesed. Asjatundjate jaoks on selge, et kindlad kandjad võivad olla eelistuslikumad sõltuvalt näiteks manustamise viisist ja manustatava antikeha kontsentratsioonist. Antikehasid on võimalik subjektile, patsiendile või rakku manustada süstega (nt intravenoosne, intraperitoneaalne, subkutaanne, intramuskulaarne) või muude meetoditega, nagu infusiooniga, mis tagab selle toimetamise vereringesse efektiivses vormis. Antikehasid võib samuti manustada intratumoraalsel või peritumoraalsel viisil, et avaldada nii lojaalseid kui ka süsteemseid ravimõjusid. Eelistuslik on lokaalne või intravenoosne süste. Antikehade efektiivsed annused ja kava võib empiiriliselt kindlaks määrata ning selliste otsuste langetamine kuulub asjatundja pädevusse. Asjatundjad saavad aru, et manustatavate antikehade annus erineb sõltuvalt näiteks antikehasid vastuvõtjast subjektist manustamise viisist, kasutatava antikeha asjaomasest tüübist või muudest manustatavatest ravimitest. Üksi kasutatava antikeha tüüpiline igapäevane annus võib olla vahemikus u 1 µg/kg kuni 100 mg/kg kehakaalust või üle selle päevas, sõltuvalt ülalmainitud faktoritest. Maovähi raviks antikeha manustamise järel on võimalik hinnata terapeutilise antikeha tõhusust erinevatel viisidel, mis on asjatundja jaoks hästi teada. Näiteks on võimalik jälgida maovähi suurust, arvu ja/või jaotumist ravitavas subjektis, kasutades standardseid kasvaja kujutamise meetodeid. Terapeutiliselt manustatud antikeha, mis seiskab kasvaja kasvamise, põhjustab kasvaja kahanemist ja/või ennetab uute kasvajate arenemist, võrrelduna haiguse kuluga, mis esineks antikeha manustamise puudumise korral, on efektiivne antikeha maovähi raviks. Kuna on näidatud valkude ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, E2S3, LOC255308, EPHA2, ERBB2, ERBB3, 2R, AP, HMMR, HSP90B1, G2BP3, TGB4, K2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP12, MMP3, MST1R, NU2, OLM4, PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A, TSPAN1, WNT5A, H1A ja PTK2 üleekspressiooni

72 vähemalt ühes maovähi kudede alamrühmas, võrrelduna normaalsete kudede, võib nende ekspressiooni või aktiivsuse inhibeerimine olla integreeritud mis tahes maovähi ravi või ennetamise ravistrateegiasse. Antisensse ravi põhimõte põhineb hüpoteesil, et geeniekspressiooni järjestusspetsiifilist supressiooni (transkriptsiooni või translatsiooni kaudu) on võimalik saavutada intratsellulaarse hübridiseerimisega genoomse DNA või mrna ja komplementaarsete antisenseliikide vahel Sellise hübriidse nukleiinhappe dupleksi moodustumine sekkub sihtkasvaja antigeeni kodeeriva genoomse DNA transkriptsiooni või sihtkasvaja antigeeni mrna protsessimisse/transporti/translatsiooni ja/või stabiilsusesse. Antisensseid nukleiinhappeid on võimalik manustada erinevate lähenemistega. Näiteks on võimalik antisensseid oligonukleotiide või antisense RNA-d subjektile otse manustada (nt intravenoosse süstega) vormis, mis võimaldab imendumist kasvajarakkudesse. Alternatiivselt on võimalik antisensse RNA (või RNA fragmentide) viiruslikke või plasmiidseid vektoreid rakkudesse in vivo viia. Antisensseid mõjusid võivad samuti indutseerida senssjärjestused; samas erineb suuresti fenotüüpiliste muutuste ulatus. enotüüpilisi muutuseid, mis on indutseeritud efektiivse antisensse raviga, hinnatakse vastavalt muutustele nt siht-mrna tasemetes, sihtvalgu tasemetes ja/või sihtvalgu aktiivsustasemetes. Spetsiifilises näites võib maovähi markerfunktsiooni inhibeerimist antisensse geenraviga saavutada subjektile antisensset maovähi marker-mrna-d manustades. Antisensse kasvajamarkeri RNA-d on võimalik toota ja isoleerida mis tahes standardsete meetmetega, kuid seda on kõige lihtsam toota in vitro transkriptsiooniga, kasutades antisensse kasvajamarkeri cdna-d kõrge efektiivsusega promooteri kontrolli all (nt T7 promooter). Antisensse kasvajamarkeri RNA manustamist rakkudesse on võimalik teostada kõigi alljärgnevalt kirjeldatud otseste nukleiinhappe manustamise meetoditega. MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 funktsiooni inhibeerimise alternatiivne strateegia geeniravi abil hõlmab MST1R-, UCHL5-, SMC4-, NYB-, PPAP2C-, AVL9-, UQCRB- või MUC6-vastase antikeha või MST1R-, UCHL5-, SMC4-, NYB-, PPAP2C-, AVL9-, UQCRB- või MUC6-vastase antikeha osa intratsellulaarset ekspressiooni. Näiteks asetatakse monoklonaalset antikeha kodeeriv geen

73 (või geeni fragment), mis seondub spetsiifiliselt MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 polüpeptiidiga ja inhibeerib selle bioloogilist aktiivsust, spetsiifilise (nt koe- või rakuspetsiifilise) geeni reguleeriva järjestuse, mis asub nukleiinhappe ekspressiooni vektoris, transkriptsionaalse kontrolli alla. Vektorit manustatakse seejärel subjektile nii, et see imendub maovähi rakkudes või muudes rakkudes, mis sekreteerivad MST1R-, UCHL5-, SMC4-, NYB-, PPAP2C-, AVL9-, UQCRB- või MUC6-vastast antikeha ning seega blokeerivad MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidi bioloogilist aktiivsust. Eelistuslikult on MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 polüpeptiidid olemas maovähi rakkude ekstratsellulaarsel pinnal. Ülalkirjeldatud meetodites, mis hõlmavad eksogeense DNA manustamist ja imendumist subjekti rakkudesse (s.o geentransduktsiooni või -transfektsiooni), võivad käesoleva leiutise nukleiinhapped olla palja DNA vormis või nukleiinhapped võivad asuda vektoris, et manustada nukleiinhapped rakkudele maovähi markervalgu ekspressiooni inhibeerimiseks. Vektor võib olla kaubanduslikult kättesaadav preparaat, nagu adenoviiruse vektor (Quantum Biotechnologies, nc. (Laval, Quebec, Kanada). Nukleiinhappe või vektori manustamine rakkudele võib toimuda erinevate mehhanismide kaudu. Ühes näites võib manustamine toimuda liposoomi kaudu, kasutades kaubanduslikult kättesaadavaid liposoomi preparaate, nagu LPOEKTN, LPOEKTAMN (GBCO- 25 BRL, nc., Gaithersburg, Md.), SUPERECT (Qiagen, nc. Hilden, Saksamaa) ja TRANSEKTAAM (Promega Biotec, nc., Madison, Wis.) ning muud liposoomid, mis on töötatud välja kooskõlas protseduuridega, mis on valdkonnas standardsed. Samuti on võimalik käesoleva leiutise nukleiinhapet või vektorit manustata in vivo elektroporatsiooniga, mille tehnoloogia on saadaval ettevõttelt Genetronics, nc. (San Diego, Calif.) või SONOPORATSOON seadmega (marx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona). Ühe näitena võib vektori manustamine toimuda viirusliku süsteemi kaudu, nagu retroviiruslik vektorisüsteem, mis suudab pakendada rekombinantset retroviiruslikku genoomi. Rekombinantset retroviirust on võimalik siis kasutada rakkude nakatamiseks ja seega manustada nakatunud rakkudele antisensset nukleiinhapet, mis inhibeerib MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB või MUC6 ekspressiooni. Muudetud nukleiinhappe imetajate rakkudesse manustamise täpne meetod pole muidugi piiratud retroviiruslike vektorite kasutamisega. Käesoleva protseduuri jaoks on laialdaselt saadaval

74 muud meetodid, sh adenoviiruslike vektorite, adeno-assotsieerunud viiruslike (AAV) vektorite, lentiviiruslike vektorite või pseudotüüpsete retroviiruslike vektorite kasutamine. Samuti võib kasutada füüsilise transduktsiooni meetodeid, nagu liposoomi manustamine ning retseptorvahendatud ja muud endotsütoosi mehhanismid. Käesolevat leiutist on võimalik kasutada koos kõigi käesolevate või teiste üldiselt kasutatavate geenide ülekandemeetoditega. Antikehasid võib samuti kasutada in vivo diagnostilistes analüüsides. Üldiselt on antikeha märgistatud radionukleotiidiga (nagu 111 n, 99 Tc, 14 C, 131, 3 H, 32 P või 35 S), et kasvajat oleks võimalik lokaliseerida immunoskintiograafiat kasutades. Ühes näites seonduvad antikehad või nende fragmendid kahe või enama MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 sihtmärgi ekstratsellulaarse domeeniga ning afiinsusväärtus (Kd) on väiksem kui 1x10µM. Diagnostilistel eesmärkidel kasutatavad antikehad võival olla märgistatud proovidega, mis sobivad erinevate kujutamise meetoditega tuvastamiseks. Proovide tuvastamise meetodid hõlmavad (kuid pole piiratud) konfokaalfluorestsents- ja elektronmikroskoopiat; magnetresonantstomograafiat ja spektroskoopiat; fluoroskoopiat, kompuutertomograafiat ja positronemissioontomograafiat. Sobilikud proovid hõlmavad (kuid pole piiratud) fluorestsiini, rodamiini, eosiini ja muid fluorofoore, radioisotoope, kulda, gadoliiniumi ja muid lantaniide, paramagnetilist rauda, fluoriin-18 ja muid positrone emiteerivaid radionukliide. Samuti võivad proovid olla bi- või multifunktsionaalsed ja rohkem kui ühe loetletud meetodi poolt tuvastatavad. Need antikehad võivad olla nimetatud proovidega otseselt või kaudselt märgistatud. Proovide seondumine antikehadega hõlmab proovi kovalentset sidet, proovi inkorporeerimist antikehasse ja kelaatühendi kovalentset sidet proovi sidumiseks, muude valdkonnas tunnustatud meetmete hulgas. mmunohistokeemia jaoks võib haiguse koenäidis olla värske või külmutatud või see võib olla parafiini integreeritud ja fikseeritud säilitusainega, nagu formaliin. ikseeritud või integreeritud osa, mis sisaldab proovi, on ühendatud märgistatud primaatse antikeha ja sekundaarse antikehaga, kus antikeha kasutatakse, et tuvastada MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6 valkude ekspressiooni in situ.

75 Käesolev leiutis on seega seotud peptiidiga, mille üldine pikkus on 10 kuni 14 aminohapet, mis koosneb järjestusest, mis on valitud rühmast, mis hõlmab a) SEQ D nr 1 sisaldavat järjestust, b) SEQ D nr 1 varianti, mis kutsub esile T-rakkude ristreageerimist leiutise peptiidiga, kus asjaomane variant on valitud järjestusi LQLQGV, LYQLQGVL, LYQLQGV, LQLQGVL ja LQLQGV sisaldavast rühmast. Leiutise peptiididel on võime seostuda inimese peamise koesobivuskompleksi (MHC) klassi molekuliga. Käesolevas leiutises viitab termin homoloogne identsuse astmele kahe aminohappe järjestuse vahel, s.o peptiidi või polüpeptiidi järjestuse vahel. Eespool nimetatud homoloogia määratakse kahe järjestuse võrdlemisel, mis reastatakse optimaalsetes tingimustes võrreldavate järjestuste suhtes. Siin võrreldavatel järjestustel võib olla liitmine või deletsioon (näiteks tühimik jms) kahe järjestuse optimaalsel reastamisel. Sellist järjestuste homoloogiat saab arvutada reastuse loomisel, kasutades näiteks ClustalW algoritmi. Tavapäraselt on saadaval järjestuste analüüsimise tarkvara, täpsemalt Vector NT, GENETYX, analüüsivahendid, mis on saadavad avalikest andmebaasidest. Antud ala asjatundja on võimeline määrama, kas T-rakud, mis on indutseeritud spetsiifilise peptiidi variandi poolt, on võimelised ristreageerima peptiidi endaga (ong et al );(Appay et al ;Colombetti et al ;Zaremba et al ). Need CTLid võivad järgnevalt ristreageerida rakkudega ja tappa rakke, mis ekspresseerivad polüpeptiidi, mis sisaldab ühise päritoluga peptiidi looduslikke aminohapete järjestusi, nagu on määratletud leiutise aspektides. Nagu võib tuletada teaduslikust kirjandusest (Rammensee, Bachmann, and Stevanovic) ja andmebaasidest (Rammensee et al ), on HLA seostuvate peptiidide teatud asendid tüüpiliselt ankurjärjestused, moodustades seesmise järjestuse, mis sobib HLA retseptori seostumise motiivile, mis on määratletud polüpeptiidi ahela, mis moodustab sidumisvao, polaarsuse, elektrofüüsikaliste, hüdrofoobsuse ja ruumiliste omadustega. Käesoleva leiutise variandid säilitavad võime seostuda aktiveeritud CTL- TCR-ga, mis võib järgnevalt ristreageerida rakkudega ja tappa neid, mis ekspresseeruvad polüpeptiidi, mis sisaldab ühise päritoluga peptiidi loomulikke aminohapete järjestusi, nagu on määratletud leiutise aspektides.

76 Tabel 3: Peptiidide kirjeldatud variandid ja motiivid vastavalt järjestusele SEQ D nr: 1 kuni 33 Positsioon CDC2-001 Peptiidi kood L Y Q L Q G V SEQ D 1 Variandid L L Positsioon ASPM-002 Peptiidi kood S Y N P L W L R SEQ D 2 Variandid L L Positsioon UCHL5-001 Peptiidi kood N Y L P M E L SEQ D 3 Variandid Positsioon MET-006 Peptiidi kood S Y D V L P E SEQ D 4 Variandid L Positsioon PROM-001 Peptiidi kood S Y D P L N L

77 SEQ D 5 Variandid Positsioon MMP Peptiidi kood V W S D V T P L T SEQ D 6 Variandid Y L Y L Y L Positsioon MST1R-001 Peptiidi kood N Y L L Y V S N SEQ D 7 Variandid L L Positsioon NYB-001 Peptiidi kood V Y T T S Y Q Q SEQ D 8 Variandid L L Positsioon SMC4-001 Peptiidi kood H Y K P T P L Y SEQ D 9 Variandid L

78 L Positsioon UQCRB-001 Peptiidi kood Y Y N A A G N K L SEQ D 10 Variandid Positsioon PPAP2C-001 Peptiidi kood A Y L V Y T D R L SEQ D 11 Variandid Positsioon AVL9-001 Peptiidi kood Y S P V N K L SEQ D 12 Variandid Positsioon NU2-001 Peptiidi kood V Y G R L E H SEQ D 13 Variandid L L Positsioon ABL1-001 Peptiidi kood T Y G N L L D Y L

79 SEQ D 14 Variandid Positsioon MUC-006 Peptiidi kood N Y E E T P H SEQ D 15 Variandid L L Positsioon ASPM-001 Peptiidi kood R Y L W A T V T SEQ D 16 Variandid L L Positsioon EPHA2-005 Peptiidi kood V Y S K S E Q L SEQ D 17 Variandid Positsioon MMP3-001 Peptiidi kood V K G N Q SEQ D 18 Variandid Y L Y L Y

80 Positsioon NU2-002 Peptiidi kood R L S G N SEQ D 19 Variandid Y L Y L Y Positsioon PLK4-001 Peptiidi kood Q Y A S R V Q L SEQ D 20 Variandid Positsioon ATAD2-002 Peptiidi kood K Y L T V K D Y L SEQ D 21 Variandid Positsioon COL12A1-001 Peptiidi kood V Y N P T P N S L SEQ D 22 Variandid Positsioon COL6A3-001 Peptiidi kood S Y L Q A A N A L SEQ D 23 Variandid

81 Positsioon ANC-001 Peptiidi kood Y Q P K Q Q SEQ D 24 Variandid L L Positsioon RSP Peptiidi kood Y Y K N G L G SEQ D 25 Variandid L L Positsioon ATAD2-001 Peptiidi kood A Y A K E E L SEQ D 26 Variandid Positsioon ATAD2-003 Peptiidi kood L Y P E V E K SEQ D 27 Variandid L L Positsioon HSP90B1-001 Peptiidi kood K Y N D T W K E

82 SEQ D 28 Variandid L L Positsioon SAH2-001 Peptiidi kood V D T A A H L SEQ D 29 Variandid Y L Y L Y Positsioon SLC6A6-001 Peptiidi kood V Y P N W A G L SEQ D 30 Variandid Positsioon QGAP3-001 Peptiidi kood V Y K V V G N L L SEQ D 31 Variandid Positsioon ERBB3-001 Peptiidi kood V Y E K N D K L SEQ D 32 Variandid

83 Positsioon K2C-001 Peptiidi kood Y N G K L D L L SEQ D 33 Variandid Positsioon CDC2-001 Peptiidi kood L Y Q L Q G V SEQ D 1 Variandid L L Positsioon ASPM-002 Peptiidi kood S Y N P L W L R SEQ D 2 Variandid L L Positsioon UCHL5-001 Peptiidi kood N Y L P M E L SEQ D 3 Variandid Positsioon MET-006 Peptiidi kood S Y D V L P E SEQ D 4 Variandid L

84 Positsioon PROM-001 Peptiidi kood S Y D P L N L SEQ D 5 Variandid Positsioon MMP Peptiidi kood V W S D V T P L T SEQ D 6 Variandid Y L Y L Y L Positsioon MST1R-001 Peptiidi kood N Y L L Y V S N SEQ D 7 Variandid L L Positsioon NYB-001 Peptiidi kood V Y T T S Y Q Q SEQ D 8 Variandid L L

85 Positsioon SMC4-001 Peptiidi kood H Y K P T P L Y SEQ D 9 Variandid L L Positsioon UQCRB-001 Peptiidi kood Y Y N A A G N K L SEQ D 10 Variandid Positsioon PPAP2C-001 Peptiidi kood A Y L V Y T D R L SEQ D 11 Variandid Positsioon AVL9-001 Peptiidi kood Y S P V N K L SEQ D 12 Variandid Positsioon NU2-001 Peptiidi kood V Y G R L E H SEQ D 13 Variandid L

86 L Positsioon ABL1-001 Peptiidi kood T Y G N L L D Y L SEQ D 14 Variandid Positsioon MUC-006 Peptiidi kood N Y E E T P H SEQ D 15 Variandid L L Positsioon ASPM-001 Peptiidi kood R Y L W A T V T SEQ D 16 Variandid L L Positsioon EPHA2-005 Peptiidi kood V Y S K S E Q L SEQ D 17 Variandid Positsioon MMP3-001 Peptiidi kood V K G N Q SEQ D 18 Variandid Y

87 L Y L Y Positsioon NU2-002 Peptiidi kood R L S G N SEQ D 19 Variandid Y L Y L Y Positsioon PLK4-001 Peptiidi kood Q Y A S R V Q L SEQ D 20 Variandid Positsioon ATAD2-002 Peptiidi kood K Y L T V K D Y L SEQ D 21 Variandid Positsioon COL12A1-001 Peptiidi kood V Y N P T P N S L SEQ D 22 Variandid Positsioon

88 COL6A3-001 Peptiidi kood S Y L Q A A N A L SEQ D 23 Variandid Positsioon ANC-001 Peptiidi kood Y Q P K Q Q SEQ D 24 Variandid L L Positsioon RSP Peptiidi kood Y Y K N G L G SEQ D 25 Variandid L L Positsioon ATAD2-001 Peptiidi kood A Y A K E E L SEQ D 26 Variandid Positsioon ATAD2-003 Peptiidi kood L Y P E V E K SEQ D 27 Variandid L L

89 Positsioon HSP90B1-001 Peptiidi kood K Y N D T W K E SEQ D 28 Variandid L L Positsioon SAH2-001 Peptiidi kood V D T A A H L SEQ D 29 Variandid Y L Y L Y Positsioon SLC6A6-001 Peptiidi kood V Y P N W A G L SEQ D 30 Variandid Positsioon QGAP3-001 Peptiidi kood V Y K V V G N L L SEQ D 31 Variandid Positsioon ERBB3-001 Peptiidi kood V Y E K N D K L SEQ D 32 Variandid

90 Positsioon K2C-001 Peptiidi kood Y N G K L D L L SEQ D 33 Variandid Sobilikud võivad olla ka pikemad peptiidid. Samuti on võimalik, et MHC klassi epitoobid, kuigi nende pikkus on 8-11 aminohappe vahel, genereeritakse peptiidide poolt protsessimisega pikematest peptiididest või valkudest, mis sisaldavad tegelikku epitoopi. Eelistatakse, et jäägid, mis kaitsevad tõelist epitoopi, on jäägid, mis praktiliselt ei mõjuta proteolüütilist lõhustamist, mis on vajalik tõelise epitoobi väljapanemiseks protsessimise ajal. Käesolev leiutis esitab vastavalt samuti peptiidid ja MHC klassi epitoopide variandid, kus peptiidi või variandi üldiseks pikkuseks on 10 kuni 14 aminohapet. Muidugi on käesolevale leiutisele vastaval peptiidil või variandil võime seostuda inimese peamise koesobivuskompleksi (MHC) klassi molekuliga. Peptiidi või variandi seostumist MHC kompleksiga saab testida valdkonnas tuntud meetoditega. Leiutise eriti eelistatud teostuses koosneb peptiid aminohappe järjestusest vastavalt SEQ D nr: 1. Koosneb peamiselt tähendab, et käesolevale leiutisele vastav peptiid, lisaks järjestusele, mis vastab ühele SEQ D nr: 1 kuni SEQ D nr: 95 või nende variandile, sisaldab täiendavalt N- ja/või C-terminaalselt paigutatud aminohapete tükke, mis ei moodusta tingimata peptiidi osa, mis funktsioneerib epitoobina MHC molekuli epitoobi jaoks.

91 Sellest hoolimata võivad need tükid olla tähtsad käesolevale leiutisele vastava peptiidi efektiivseks sisseviimiseks rakkudesse. Käesoleva leiutise ühes teostuses on peptiid liitvalgu osa, mis sisaldab näiteks HLA-DR antigeeniga seotud muutumatu ahela (p33, edaspidi i ), nagu on saadud NCB, GenBank liitumisnumber X00497, 80 N-terminaalset aminohapet. Samuti võivad peptiid või variant sisaldada ümberpööratud peptiidsidemeid või mittepeptiidsidemeid. Ümberpööratud peptiidsideme aminohappe jäägid ei ole ühendatud peptiidi (-CO-NH-) ahelatega, kuid peptiidside on ümber pööratud. Selliseid retroinversiivseid peptidomimeetikume võib valmistada tehnika tasemest tuntud meetodeid kasutades, näiteks neid, mida on kirjeldatud publikatsioonis Meziere et al (1997) J. mmunol. 159, , mis on siia lisatud viitena. See lähenemisviis hõlmab pseudopeptiidide valmistamist, mis sisaldavad muutusi hõlmavat karkassi ja mitte kõrvalahelate orientatsiooni. Meziere et al (1997) näitavad, et need pseudopeptiidid on kasulikud MHC seostamiseks ja T-abistajaraku vastusteks. Tagurpidi ja ümberpööratud peptiidid, mis sisaldavad NH-CO sidemeid CO-NH peptiidsidemete asemel, on palju resistentsemad proteolüüsi suhtes. Mittepeptiidi side on näiteks -CH 2 -NH, -CH 2 S-, -CH 2 CH 2 -, -CH=CH-, -COCH 2 -, - CH(OH)CH 2 - ja -CH 2 SO-. Ameerika Ühendriikide patendis nr on esitatud polüpeptiidi ahelate mittepetiidisidemete (-CH 2 -NH) tahke faasi sünteesi meetod, mis hõlmab polüpeptiide, mis on sünteesitud standardsete protseduuridega, ja mittepeptiidsidet, mis on sünteesitud aminoaldehüüdi ja aminohappe reageerimisel NaCNBH 3 juuresolekul. Peptiide, mis sisaldavad järjestusi, mida on kirjeldatud eespool, võib sünteesida koos lisa keemiliste rühmadega, mis on nende amino- ja/või karboksürühma poolses otsas, suurendamaks peptiidi stabiilsust, biosaadavust ja/või afiinsust. Peptiidi aminorühmapoolsesse otsa võib lisada näiteks hüdrofoobseid rühmi, nagu karbobensoksüül-, dansüül- või t-butüüloksükarbonüülrühmad. Samamoodi võib panna peptiidi aminorühmapoolsesse otsa atsetüülrühma või 9- fluorenüülmetoksükarbonüülrühma. Peale selle võib peptiidi karboksürühmapoolsesse otsa lisada hüdrofoobse rühma, t-butüüloksükarbonüül- või aminorühma.

92 Peale selle võib leiutise peptiide sünteesida, muutmaks nende ruumilist konfiguratsiooni. Näiteks võib kasutada pigem ühe või enama aminohappe jäägi D-isomeeri kui tavalist L- isomeeri. Lisaks võib vähemalt ühe leiutise peptiidi aminohappe jääkidest asendada ühe tuntud looduses mitteesineva aminohappe jäägiga. Sellised muutused, nagu eespool nimetatud, võivad sobida leiutise peptiidide stabiilsuse, biosaadavuse ja/või seostumistoime suurendamiseks, Sarnaselt võib kirjeldatud peptiidi või selle varianti keemiliselt modifitseerida, viies spetsiifilised aminohapped reaktsiooni kas enne või pärast peptiidi sünteesi. Sellised modifikatsioonide näited on tuntud tehnika tasemest ja need on kokku võetud näiteks publikatsioonis R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3. trükk, CRC Press, 2005, mis on siia lisatud viitena. Aminohapete keemiliste modifikatsioonide hulka kuuluvad, kuid mitte ainult, järgnevad: modifitseerimine atsüülimisega, amiidimine, lüsiini püridoksüülimine, redutseeriv alküülimine, aminorühmade trinitrobensüülimine 2,4,6- trinitrobenseensulfoonhappega (TNBS), amiidi karboksüülrühmade modifitseerimine ja sulfüdrüülrühma modifitseerimine tsüsteiini persipelghappe oksüdeerimisega tsüsteiinhappeks, elavhõbedaderivaatide moodustamine, disulfiidide segu moodustamine teiste tiooliühenditega, reaktsioon maleimiidiga, karboksümetüülimine jodoäädikhappe või jodoatsetamiidiga ja karbamoüülimine tsüanaadiga leeliselise ph juures, kuigi ilma piiranguteta sellele. Selles suhtes antakse antud ala asjatundjale viide käesoleva protokolli 15. peatükile publikatsioonis n Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY ) ulatuslikuma metodoloogia jaoks, mis puudutab valkude keemilisi modifiktasioone. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY ) ulatuslikuma metodoloogia jaoks, mis puudutab valkude keemilisi modifiktasioone. Lühidalt öeldes põhineb modifikatsioon, nt arginüülijäägid valkudes, naaberdikarbonüülühendite, nagu fenüülglüoksaali, 2,3-butaandiooni ja 1,2- tsükloheksaandiooni, reaktsioonidel, moodustamaks adukti. Teiseks näiteks on metüülglüoksaali reaktsioon arginiini jääkidega. Tsüsteiini saab modifitseerida ilma kaasaskäiva teiste nukleofiilsete saitide, nagu lüsiin ja histidiin, modifitseerimiseta. Selle tulemusena on tsüsteiini modifitseerimiseks kättesaadavad paljud reaktiivid. irmade, nagu Sigma-Aldrich ( veebilehed pakuvad informatsiooni spetsiifiliste reaktiivide kohta.

93 Disulfiidsidemete selektiivne redutseerimine on samuti tavapärane. Disulfiidsidemeid saab moodustada ja oksüdeerida biofarmaatsia ainete kuumusega töötlemisel. Woodward i reaktiivi K võib kasutada spetsiifiliste glutamiinhappe jääkide modifitseerimiseks. Rakusiseste ristsidemete moodutamiseks lüsiini jäägi ja glutamiinhappe jäägi vahel saab kasutada N-(3-(dimetüülamino)propüül)-N -etüülkarbodiimiidi. Näiteks dietüülpürokarbonaat on reaktiiviks histidüülijäägi modifitseerimiseks valkudes. Histidiini saab samuti modifitseerida, kasutades 4-hüdroksü-2-nonenaali. Lüsiini jääkide ja teiste α-amino-rühmade reaktsioon on kasulik näiteks peptiidide sidumiseks pindadele või valkude/peptiidide ristsidumiseks. Lüsiin on polü(etüleen)glükooli kinnitamise koht ja peamine modifitseerimise koht valkude glükosülatsioonis. Metioniini jääke valkudes saab modifitseerida nt jodoatsetamiidi, bromoetüülamiini ja klooramiine T-ga. Tetranitrometaani ja N-atsetüülimidasooli saab kasutada türosüüli jääkide modifitseerimiseks. Ristsidumist ditürosiini moodustumise kaudu saab teostada vesinikperoksiidi-/vaseioonidega. Hiljutistes trüptofaani modifitseerimise uuringutes kasutati N-bromosukstiinimiidi, 2- hüdroksü-5-nitrobensüülbromiidi või 3-bromo-3-metüül-2-(2-nitrofenüülmerkapto)-3Hindooli (BPNS-skatool). Terapeutiliste valkude ja peptiidide edukas modifikatsioon PEG-ga on tihti seotud tsirkulatsiooni pooleluea pikenemisega, kusjuures hüdrogeelide valmistamiseks kasutatakse valkude ristsidumist glutaaraldehüüdi, polüetüleenglükooldiakrülaadi ja formaldehüüdiga. Allergeenide keemiline modifitseerimine immunoteraapia jaoks saadakse tihti karbamüülimisel kaaliumtsüanaadiga. Peptiid või variant, milles peptiid hõlmab mittepeptiidi sidemeid, on leiutise eelistatud teostuseks. Üldiselt võib peptiide ja variante (vähemalt neid, mis sisaldavad peptiidi ahelaid

94 aminohapete jääkide vahel) sünteesida tahke faasi peptiidi sünteesi mocpolüamiidmeetodil, nagu on avaldatud Lu et al. poolt (1981) ja siia lisatud viidetes. Ajutine N-aminorühma kaitse antakse 9-fluorenüülmetüüloksükarbonüülrühmaga (moc). Selle aluse suhtes väga ebastabiilse kaitserühma korduv lõhustamine tehakse 20% piperidiini N,N-dimetüülformamiidi kasutades. Kõrvalahela funktsionaalsust võib kaitsta nende butüüleetritena (seriintreoniini ja türosiini puhul), butüülestritena (glutamiinhappe ja asparthappe puhul), butüüloksükarbonüülrühma derivaadina (lüsiini ja histidiini puhul), tritüülrühma derivaadina (tsüsteiini puhul) ja 4-metoksü-2,3,6- trimetüülbenseensulfonüülrühma derivaadina (arginiini puhul). Seal, kus C-terminaalseteks jääkideks on glutamiin või asparagiin, kasutatakse kõrvalahela amidofunktsionaalsuse kaitsmiseks 4,4'-dimetoksübenshüdrüülrühma. Tahke faasi toetus põhineb polüdimetüülakrüülamiidi polümeeril, mis on moodustatud kolmest monomeerist, dimetüülakrüülamiidist (karkassi monomeer), bisakrüloüületüleendiamiinist (ristsiduja) ja akrüloüülsarkosiinmetüülestrist (funktsionaalsust andev aine). Peptiidi polümeeriga lõhustatavalt siduva ainena kasutatakse happe suhtes ebastabiilset 4- hüdroksümetüülfenoksüäädikhappe derivaati. Kõik aminohappe derivaadid lisatakse sellisena, nagu need oleks tehtud sümmeetriliste anhüdriidi derivaatidena, millest erandiks on asparagiin ja glutamiin, mis lisatakse ümberpööratud N,Nditsükloheksüülkarbodiimiidi/1-hüdroksübensotriasooli vahendatud sidestusprotseduuri. Kõiki sidestusreaktsioone ja kaitserühma eemaldamise reaktsioone jälgitakse ninhüdriini, trinitrobenseensulfoonhappe või isotiiniga testimisprotseduure kasutades. Sünteesi lõpetamisel peptiidid lõhustatakse polümeeri toe küljest lahti koos sellega kaasneva kõrvalahela kaitserühmade eemaldamisega 95% trifluoroäädikhappega töötlemisel, mis sisaldab 50 % desoksüdeerija segu. Tavaliselt kasutatud desoksüdeerijate hulka kuuluvad etaanditiool, fenool, anisool ja vesi, kusjuures täpne valik sõltub sünteesitava peptiidiga kokkukuuluvatest aminohapetest. Seega on peptiidi sünteesimiseks võimalik kasutada tahke faasi ja lahuse faasi metodoloogia kombinatsiooni (vt näiteks (Bruckdorfer, Marder ja Albericio 29-43) ja siia lisatud viiteid). Trifluoroäädikhape eemaldatakse aurustamisega vaakumis, millele järgneb tritureerimine dietüüleetriga, saades toorpeptiidi. Mis tahes juuresolev desoksüdeerija eemaldatakse lihtsa ekstraheerimisprotseduuriga, mis veefaasi lüofiliseerimisel annab desoksüdeerijatest vaba toorpeptiidi. Reaktiivid peptiidi sünteesimiseks on üldiselt kättesaadavad nt firmast Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.

95 Puhastamist võib teostada mis tahes meetodiga, nagu ümberkristallimine, suuruse järgi elimineeriv kromatograafia, ioonvahetuskromatograafia, hüdrofoobse vastastikuse toime kromatograafia ja (tavaliselt) pöördfaas-kõrgsurvevedelikkromatograafia, kasutades nt atsetonitriili/vee gradiendiga eraldamist, või nende kombineerimisel. Peptiidide analüüsi võib teostada, kasutades õhekihikromatograafiat, elektroforeesi, täpsemalt kapillaarelektroforeesi, tahke faasi ekstraheerimist (CSPE), pöördfaaskõrgsurvevedelikkromatograafiat, aminohappe analüüsi pärast happe hüdrolüüsi ja kiirete aatomitega pommitamise (AB) massispektromeetria analüüsi, samuti MALD ja ES-Q- TO massispektromeetria analüüsi. Leiutise järgmise aspektina esitatakse nukleiinhape (näiteks polünukleotiid), mis kodeerib leiutise peptiidi või peptiidi varianti. Polünukleotiidiks võib olla näiteks DNA, cdna, PNA, RNA või nende kombinatsioon, kas ühekordse ja/või kahekordse ahelaga, polünukleotiidide loomulikud või stabiliseeritud vormid, nagu fosforotioaadi karkassiga polünukleotiidid ja see võib sisaldada introone või mitte, kuni see kodeerib peptiide. Muidugi on polünukleotiidiga kodeeritavad ainult peptiidid, mis sisaldavad loomulikult esinevate aminohapete jääke, mis on ühendatud loomulikult esinevate peptiidsidemetega. Veel ühe leiutise aspektina esitatakse ekspressioonivektor, mis on võimeline ekspresseerima leiutisele vastavat polüpeptiidi. Polünukleotiidide ühendamiseks on välja töötatud palju erinevaid meetodeid, eriti DNA ühendamiseks vektoriga näiteks komplementaarse kohesiivse otsa kaudu. Näiteks komplementaarse homopolümeeri rajad saab lisada DNA segemendile, mis sisestatakse DNA vektorisse. Seejärel ühendatakse vektor ja DNA segment vesiniksidemega komplementaarse homopolümeeri sabadega, moodustamaks rekombinantsed DNA molekulid. Sünteetilised linkerid, mis sisaldavad üks või enam restriktsioonisaiti, pakuvad alternatiivset meetodit DNA segmendi ühendamiseks vektoritega. Sünteetilised linkerid, mis sisaldavad erinevaid restriktsiooni endonukleaasi saite, on kaubandusest saadavad paljudest allikatest, kaasaarvatud firma nternational Biotechnologies nc, New Haven, CN, USA.

96 DNA, mis kodeerib leiutise polüpeptiidi, soovitud modifitseerimise meetodis kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni, nagu on selle avaldanud (Saiki et al )). Seda meetodit võib kasutada DNA sobivasse vektorisse sisseviimiseks, näiteks juhtides sobivatesse restriktsioonisaitidesse, või seda võib kasutada DNA modifitseerimiseks teistel kasulikel viisidel, nagu on teada tehnika tasemest. Kui kasutataske viirusvektoreid, eelistatakse poksvõi adenoviirusvektoreid. DNA (või retroviirusvektori puhul RNA) võib seejärel ekspresseerida sobivas peremeesorganismis, et valmistada polüpeptiidi, mis sisaldab leiutise peptiidi või selle varianti. Seega võib DNA-d kodeerivat peptiidi või leiutise varianti kasutada vastavalt tuntud tehnikatele, mida on sobivalt modifitseeritud arvestades siin sisalduvaid õpetusi, et konstrueerida ekspressioonivektor, mida seejärel kasutatakse sobiva peremeesraku transformeerimiseks ekspressiooni jaoks ja leiutise polüpeptiidi valmistamiseks. Sellised tehnikad hõlmavad neid, mis on avaldatud USA patentides numbriga 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 ja 4,810,648. DNA (või retroviirusvektorite puhul RNA), mis kodeerib polüpeptiidi, mis moodustab leiutise ühendi, võib ühendada paljude teiste DNA järjestustega, et seda sisestada sobivasse peremeesorganismi. DNA paariline sõltub peremeesorganismi loomusest, DNA peremeesorganismi sisestamise viisist ja sellest, kas soovitakse episomaalset säilitamist või integratsiooni. Üldiselt sisestatakse DNA ekspressioonivektorisse, nagu plasmiid, ekspressiooni jaoks õige orientatsiooniga ja korrektse lugemisraamiga. Vajadusel võib DNA ühendada sobiva transkriptsioonilise ja translatsioonilise reguleeriva kontrollnukleotiidi järjestustega, mille tunneb ära soovitud peremeesorganism, kuigi sellised kontrollimised on kättesaadavad ekspressioonivektoris. Seejärel sisestatakse vektor standardsete meetoditega peremeesorganismi. Üldiselt ei transformeerita vektoriga kõiki peremeesorganisme. Seetõttu on vaja valida transormeeritud peremeesorganismi rakud. Üks valimistehnika hõlmab DNA järjestuse liitmist ekspressioonivektorisse koos kõigi vajalike kontrollimise elementidega, mis kodeerivad selekteeritavat tunnust transformeeritud rakus, nagu näiteks antibiootikumiresistentsus.

97 Alternatiivselt võib geen sellise selekteeritava tunnuse jaoks olla teise vektori juures, mida kasutatakse soovitud peremeesraku koos transformeerimiseks. Peremeesrakke, mis transformeeriti leiutise rekombinantse DNA-ga, kultiveeritakse seejärel piisavalt kaua ja sobivates tingimustes, mis on teada antud ala asjatundjale, arvestades tehnikaid, mis on siin avaldatud, et võimaldada polüpeptiidi ekspressiooni, mida saab regenereerida. Teada on palju ekspressioonisüsteeme, sealhulgas bakterite (näiteks E. coli ja Bacillus subtilis), pärmide (näiteks Saccharomyces cerevisiae), seeneniitide (näiteks Aspergillus spec.), taimerakkude, loomsete rakkude ja putukate rakkude süsteemid. Eelistatavalt võib süsteemiks olla imetaja rakud, nagu CHO rakud, mis on saadavad ATCC Rakubioloogia kollektsioonist. Tüüpiline imetaja raku vektori plasmiid konstituitiivseks ekspressiooniks sisaldab CMV või SV40 promootorit koos sobiva polü-a sabaga ja resistentsuse markeriga, nagu neomütsiin. Üheks näiteks on psvl, mida saab firmast Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. ndutseeritava imetaja ekspressioonivektori näiteks on pmsg, mida saab samuti firmast Pharmacia. Kasulikud pärmi plasmiidi vektorid on prs ja prs ning neid saab üldiselt firmast Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Plasmiidid prs403, prs404, prs405 ja prs406 on pärmi integreeritavad plasmiidid (Yps) ja ühendavad pärmi selekteeritavaid markereid HS3, TRP1, LEU2 ja URA3. Plasmiidid prs on pärmi tsentromeersed plasmiidid (Ycps). CMV promootoril põhinevad vektorid (näiteks firmast Sigma-Aldrich) pakuvad ülemineku või stabiilset ekspressiooni, tsütoplasmilist ekspressiooni või sekretsiooni ja N-terminaalset või C-terminaalset märgistamist LAG, 3xLAG, c-myc või MAT erinevates kombinatsioonides. Need liitvalgud võimaldavad rekombinantsete valkude leidmist, puhastamist ja analüüsi. Kahekordselt märgistatud liitmine pakub paindlikkust leidmiseks. Tugev inimese tsütomegaloviiruse (CMV) promootori reguleeritav piirkond viib määrava valgu ekspressiooni tasemed suuruseni 1 mg/l COS rakudes. Vähem võimekate rakuliinide valgu tasemed on tavaliselt ~0,1 mg/l. SV40 replikatsiooni juuresolek annab tulemusena kõrgemad DNA replikatsiooni tasemed SV40 replikatsiooni lubavates COS rakkudes. CMV vektorid võivad näiteks sisaldada pmb1 (pbr322 derivaat) algust replikatsiooniks bakteri

98 rakkudes, b-laktamaasi geeni ampitsilliini resistentsuse valimiseks bakterites, hgh polya ja f1 algust. Vektorid, mis sisaldavad preprotrüpsiini juhtivat (PPT) järjestust, võivad suunata LAG liitvakude sekretsiooni rakusöötmesse puhastamiseks, kasutades ANT- LAG antikehasid, polümeere ja taldrikuid. Teised vektorid ja ekspressioonisüsteemid on tuntud kasutamiseks mitmesugustes peremeesrakkudes. Käesolevas leiutises käsitletakse ka peremeesrakke, mida on transformeeritud käesoleva leiutise polünukleotiidi vektori konstruktiga. Peremeesrakk võib olla kas prokarüootne või eukarüootne. Bakterite rakud võivad mõnedel tingimustel olla eelistatud prokarüootseteks peremeesrakkudeks ja tavaliselt on selleks E. coli tüved, nagu E. coli tüvi DH5, mida saab firmast Bethesda Research Laboratories nc., Bethesda, MD, USA, ja RR1, mida saab Rockville Ameerika tüüpkultuuride kollektsioonist (ATCC), MD, USA (No ATCC 31343). Eelistatud eukarüootsete peremeesrakkude hulka kuuluvad pärmi, putukate ja imetaja rakud, eelistatavalt selgroogsete rakud, nagu need, mis on saadud hiire, roti, ahvi või inimese fibroblasti ja käärsoole rakuliinidest. Pärmi peremeesrakkude hulka kuuluvad YPH499, YPH500 ja YPH501, mida saab üldiselt firmast Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Eelistatud imetaja peremeesrakkude hulka kuuluvad hiina hamstri munasarjarakud (CHO), mida saadakse ATCC-st kui CCL61, NH šveitsi hiire embrüorakud NH/3T3, mis saadakse ATCC-st kui CRL 1658, ahvi neerust saadud COS-1 rakud, mis saadakse ATCC-st kui CRL 1650 ja 293 rakud, mis on inimese embrüo neerurakud. Eelistatud putukate rakud on Sf9 rakud, mida saab transfekteerida bakuloviiruse ekspressioonivektoritega. Ülevaadet, mis puudutab ekspressiooniks sobivate peremeesrakkude valikut, võib leida näiteks Paulina Balbás ja Argelia Lorence raamatust Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols, esimene osa, teine trükk, SBN , ja teistest kirjandusallikatest, mis on teada antud ala asjatundjale. Sobivate peremeesrakkude transformatsioon käesoleva leiutise DNA konstruktiga teostati tuntud meetoditega, mis sõltuvad tavaliselt kasutatud vektori tüübist. Prokarüootsete peremeesrakkude transformatsiooni kohta vt näiteks Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 ja Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Pärmirakkude transformatsiooni on kirjeldatud publikatsioonis Sherman et al (1986) Methods n Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Beggi meetod (1978) Nature 275, on

99 samuti kasulik. Selgroogsete rakkude jaoks saab reaktiive, mis on kasulikud selliste rakkude transfekteerimiseks, näiteks kaltsiumfosfaati ja DEAE-dekstraani või liposoomi preparaate, firmast Stratagene Cloning Systems või Life Technologies nc., Gaithersburg, MD 20877, USA. Elektroporatsioon on samuti kasulik rakkude transformeerimiseks ja/või transfekteerimiseks ja see on tehnika tasemes tuntud kasutamiseks pärmirakkude, bakterite rakkude, putukate rakkude ja selgroogsete rakkude transformeerimisel. Edukalt transformeeritud rakke, s.o rakke, mis sisaldavad käesoleva leiutise DNA konstrukti, saab identifitseerida tuntud meetoditega, nagu PCR. Alternatiivsell saab valgu olemasolu supernatandis määrata antikehasid kasutades. On mõistetav, et teatud leiutise peremeesrakud on kasulikud leiutise peptiidide valmistamisel, näiteks bakterite, pärmi ja putukate rakud. Siiski võivad teised peremeesrakud olla kasulikud teatud ravimeetodites. Näiteks antigeeni esitavad rakud, nagu dendriitilised rakud, võivad olla kasulikud leiutise peptiidide ekspresseerimiseks nii, et neid võib panna sobivatesse MHC molekulidesse. Seega esitatakse käesolevas leiutises peremeesrakud, mis sisaldavad leiutisele vastavat nukleiinhapet või ekspressioonivektorit. Eelistatud teostuses on peremeesrakk antigeeni esitav rakk, täpsemalt dendriitiline rakk või antigeeni esitav rakk. APC-d, millesse on pandud rekombinantsed liitvalgud, mis sisaldavad eesnäärme happelist fosfataasi (PAP), uuritakse praegusel ajal eesnäärmevähi ravi suhtes (Sipuleucel T) (Rini et al ;Small et al ). Leiutise järgmise aspektina esitatakse meetod peptiidi või selle variandi valmistamiseks, milles meetod sisaldab peremeeraku kultiveerimist ja peptiidi eraldamist peremeesrakust või selle rakusöötmest. Teises teostuses kasutatakse leiutise peptiidi, nukleiinhapet või ekspressioonivektorit meditsiinis. Näiteks peptiidi või selle variandi võib valmistada intravenoosseks (i.v.) süstimiseks, subkutaanseks (s.c.) süstimiseks, intradermaalseks (i.d.) süstimiseks, intraperitoneaalseks (i.p.) süstimiseks, intramuskulaarseks (i.m.) süstimiseks. Peptiidi eelistatud süstimise meetodite hulka kuuluvad s.c., i.d., i.p., i.m. ja i.v. DNA eelistatud süstimise meetodite hulka kuuluvad i.d., i.m., s.c., i.p. ja i.v. DNA või peptiidi võib anda annuses, nt vahemikus 50 µg ja 1,5 mg, eelistatavalt 125 µg kuni 500 µg, ja see sõtlub

100 vastavast peptiidist või DNA-st. Annuseid sellest vahemikust kasutati edukalt varasemates katsetes (Brunsvig et al ;Staehler et al.). Käesoleva leiutise teine aspekt hõlmab in vitro meetodit aktiveeritud T-rakkude valmistamiseks, milles meetod sisaldab T-rakkude kokkuviimist in vitro antigeeniga koormatud inimese MHC molekulidega, mis on ekspresseeritud sobiva antigeeni esitava raku pinnal aja jooksul, mis on piisav T-raku aktiveerimiseks antigeenile spetsiifilisel viisil, milles antigeen on leiutisele vastav peptiid. Eelistatavalt kasutatakse koos antigeeni esitava rakuga piisavat antigeeni kogust. Eelistatavalt puudub imetaja rakul TAP peptiidi transporter või on selle vähendatud tase või funktsioon. Sobivate rakkude hulka, millel puudub TAP peptiidi transporter, kuuluvad T2, RMA-S ja Drosophila rakud. TAP on transporter, mis on seotud antigeeni protsessimisega. nimese peptiidi koormavat puudulikku rakuliini T2 saadakse Ameerika tüüpkultuuri kollektsioonist, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA kataloogi numbri CRL 1992 alt; Drosophila rakuliini Schneider liin 2 saadakse ATCC-st kataloogi numbri CRL alt; hiire RMA-S rakuliini on kirjeldanud Karre et al Eelistatavalt ei ekspresseeri peremeesrakk enne transfekteerimist praktiliselt ühtegi MHC klassi molekuli. Samuti eelistatakse, et stimuleeriv rakk ekspresseerib molekuli, mis on tähtis ühise stimuleeriva signaali andmiseks T-rakkudele, nagu mis tahes rakk B7.1, B7.2, CAM-1 ja LA 3 hulgast. Paljude MHC klassi molekulide ja koos stimuleerivate molekulide nukleiinhapete järjestusi saab avalikkusele kättesaadavast geenipanga GenBank ja EMBL andmebaasist. MHC klassi epitoopide korral, mida kasutatakse antigeenina, on T-rakud CD8-positiivsed CTL-d. Kui antigeeni esitavat rakku transfekteeritakse, et ekspresseerida sellist epitoopi, siis sisaldab rakk eelistatavalt ekspressioonivektorit, mis on võimeline ekspresseerima peptiidi, mis sisaldab järjestust SEQ D nr: 1. 1 või aminohappe järjestuse varianti, kus ajasomane variant on valitud järjestusi LQLQGV, LYQLQGVL, LYQLQGV, LQLQGVL ja LQLQGV sisaldavast rühmast.

101 CTL genereerimiseks in vitro võib kasutada palju teisi meetodeid. Näiteks meetodites, mida on kirjeldatud publikatsioonis Peoples et al (1995) ja Kawakami et al (1992), kasutatakse CTL genereerimisel autoloogseid kasvajasse sisseimbuvaid lümfotsüüte. Plebanski et al (1995) kasutavad CTL valmistamisel autoloogseid perifeerseid vere lümfotsüüte (PLBs). Jochmus et al (1997) kirjeldab autoloogsete CTL valmistamist dendriitiliste rakkude pulseerimisel peptiidi või polüpeptiidiga või rekombinantse viirusega nakatamise kaudu. Hill et al (1995) ja Jerome et al (1993) kasutavad B-rakke autoloogsete CTL valmistamisel. Peale selle makrofaage, mida pulseeriti peptiidi või polüpeptiidiga või nakatati rekombinantse viirusega, võib kasutada autoloogsete CTL valmistamisel kirjeldab T- rakkude in vitro ettevalmistamist, kasutades kunstlikke antigeeni esitavaid rakke (aapcs), mis on samuti sobiv viis T-rakkude genereerimiseks valitud peptiidi vastu. Selles uuringus genereeriti aapcs eelnevalt valmistatud MHC:peptiidi komplekside sidestamisega polüstüreeni osakeste pinnaga (mikrohelmed) biotiin:streptavidiini biokeemia abil. See süsteem võimaldab kontrollida täpselt MHC tihedust aapcs peal, mis võimaldab selektiivselt esile kutsuda väga efektiivselt vereproovidest kõrge või madala aviidusega antigeenspetsiifilisi T-raku vastuseid. Eraldi MHC:peptiidi kompleksidest peaks aapcs kandma ühise stimuleeriva toimega teisi valke, nagu anti-cd28 antikehad, mis on sidestatud nende pinnaga. Peale selle nõuavad sellised aapc-l põhinevad süsteemid tihti sobiva lahustuva faktori, nt tsütokiinid, nagu interleukiin-12, lisamist. T-rakkude valmistamiseks võib samuti kasutada allogeenseid rakke ja meetodit on kirjeldatud detailsemalt publikatsioonis WO 97/ Näiteks peale Drosophila rakkude ja T2 rakkude võib antigeeni esitamiseks kasutada teisi rakke, nagu CHO rakud, bakuloviirusega nakatatud rakud, bakterite, pärmi, lehmarõugetega nakatatud märklaudrakud. Peale selle võib kasutada taimeviirusi (vt näiteks Porta et al (1994)), mida kirjeldab lehmaherne mosaiikviiruse areng suure saagisega süsteemina võõraste peptiidide esitamiseks. Aktiveeritud T-rakud, mis on suunatud leiutise peptiidide vastu, on kasulikud ravis. Seetõttu on kirjeldatud aktiveeritud T-rakke, mis on saadavad eelnevalt nimetatud leiutise meetoditega.

102 Aktiveeritud T-rakud, mis valmistatakse eespool nimetatud meetoditega, tunnevad selektiivselt ära raku, mis ekspresseerib kõrvalekalduvalt polüpeptiidi, mis sisaldab aminohappe järjestust SEQ D nr: 1 kuni 95. T-rakk tunneb eelistatavalt ära raku, toimides oma TCR kaudu HLA/peptiidi kompleksiga (näiteks seostudes). T-rakud on kasulikud kasutamiseks märklaudrakkude tapmise meetodites patsientide puhul, kelle märklaudrakud ekspresseerivad kõrvalekalduvalt polüpeptiidi, mis sisaldab leiutise aminohappe järjestust, kusjuures patsiendile manustatakse aktiveeritud T-rakkude efektiivne arv. T-rakud, mis manustatakse patsiendile, võivad olla saadud patsiendilt ja aktiveeritud nii, nagu on kirjeldatud eespool (s.o need on autoloogsed T-rakud). Alternatiivselt ei ole need T-rakud saadud patsiendilt, kuid on saadud teiselt isikult. Loomulikult eelistatakse, et see isik on terve. Terve isiku all mõtlevad leiutajad seda, et see isik on üldiselt hea tervisega, eelistatavalt on kompetentse immuunsüsteemiga ja enam eelistatavalt ei kannata mis tahes haiguse all, mida saab kergesti testida ja avastada. n vivo märklaudrakkudeks CD8-positiivsetele T-rakkudele, nagu on kirjeldatud, võivad olla kasvaja rakud (mis mõnikord ekspresseerivad MHC klassi) ja/või stroomarakud, mis ümbritsevad kasvajat (kasvajarakud) (mis mõnikord ekspresseerivad samuti MHC klassi; (Dengjel et al )). T-rakke, nagu on kirjeldatud, võib kasutada ravikoostise toimeainetena. Seega kirjeldatakse leiutises samuti märklaudrakkude tapmise meetodit patsientide puhul, kelle märklaudrakud ekspresseerivad kõrvalekalduvalt polüpeptiidi, mis sisaldab leiutise aminohappe järjestust, kusjuures meetod sisaldab patsiendile efektiivse arvu T-rakkude, nagu on määratletud eespool, manustamist. Termini kõrvalekalduvalt ekspresseeritud all mõtlevad leiutajad seda, et polüpeptiid on võrreldes normaalsete ekspressioonitasemetega üleekspresseeritud või seda, et geen on vaikne koes, millest kasvaja on saadud, kuid kasvajas on see ekspresseeritud. Termini üleekspresseeritud all mõtlevad leiutajad seda, et polüpeptiidi sisaldus on tasemel, mis on vähemalt 1,2-kordne normaalse koega võrreldes; eelistatavalt vähemalt 2-kordne ja enam eelistatavalt vähemalt 5-kordne või 10-kordne normaalse koe tasemest.

103 T-rakke võib saada meetoditega, mis on tehnika tasemes tuntud, nt nendega, mida on kirjeldatud eespool. Protokollid niinimetatud T-rakkude adoptiivse ülekande kohta on tuntud tehnika tasemest ja neid võib leida nt publikatsioonidest (Dudley et al ;Dudley et al ;Rosenberg et al ;Rosenberg et al ;Yee et al ); üle vaadatud (Gattinoni et al ) ja (Morgan et al.) poolt. Mis tahes leiutise molekul, s.o peptiid, nukleiinhape, ekspressioonivektor, rakk või aktiveeritud CTL, on kasulik haiguste raviks, mida iseloomustavad rakud, mis põgenevad immuunvastuse eest. Seetõttu võib mis tahes käesoleva leiutise molekuli kasutada ravimina või ravimi valmistamiseks. Kasutada võib molekuli ennast või kombineerituna leiutise teiste molekuli (molekulidega) või (a) tuntud molekuli (molekulidega). Eelistatavalt on käesoleva leiutise ravimiks vaktsiin. Seda võib manustada otse patsiendile, haigestunud organisse või süsteemselt i.d., i.m., s.c., i.p. ja i.v. teel, või panna ex vivo rakkude juurde, mis on saadud patsiendilt, või inimese rakuliini juurde, mis manustatakse järgnevalt patsiendile või kasutatakse in vitro, et valida patsiendilt saadud immuunrakkude alampopulatsioon, mis seejärel manustatakse uuesti patsiendile. Kui nukleiinhape manustatakse rakkude juurde in vitro, siis võib see olla kasulik transfekteeritavatele rakkudele selleks, et ekspresseerida koos immuunstimuleerivaid tsütokiine, nagu interleukiin-2. Peptiid võib olla praktiliselt puhas või kombineeritud immuunstimuleeriva lisaainega (vt allpool) või seda kasutatakse koos immuunstimuleerivate tsütokiinidega või see manustatakse sobiva manustamissüsteemiga, näiteks liposoomidega. Peptiid võib olla samuti ühendatud sobiva kandeainega, nagu kilpkodalase hemotsüaniin (KLH) või mannaan (vt WO 95/18145 ja Longenecker 1993). Peptiid võib olla samuti märgistatud, milleks võib olla liitvalk või hübriidmolekul. Arvatakse, et peptiidid, mille järjestus on esitatud käesolevas leiutises, stimuleerivad CD8 T-rakke. Siiski on CD8 CTL-de stimuleerimine efektiivsem abi juuresolekul, mida pakuvad CD4 T-abistajarakud. Seega MHC klassi epitoobid, mis stimuleerivad CD8 CTL liitumise partnereid või hübriidmolekulide osasid, pakuvad sobivalt epitoope, mis stimuleerivad CD4-positiivseid T-rakke. CD4 ja CD8 stimuleerivad epitoobid on tuntud tehnika tasemest ja need hõlmavad käesolevas leiutises identifitseeritud epitoope.

104 Ühe aspektina sisaldab vaktsiin vähemalt ühte peptiidi, millel on aminohape järjestusega SEQ D nr: 1 ja veel vähemalt ühte täiendavat peptiidi, eelistatavalt 2-50, enam eelistatavalt 2-25, veelgi eelistatavamalt 2-15 ja enim eelistatult kaks, kolm, neli, viis, kuus, seitse, kaheksa, üheksa, kümme, üksteist, kaksteist või kolmteist peptiidi. Peptiide võib saada ühest või enamast spetsiifilisest TAA-st ja see võib seostuda MHC klassi molekulidega. Polünukleotiid võib olla praktiliselt puhas või sisalduda sobivas vektoris või manustamissüsteemis. Nukleiinhapeteks võivad olla DNA, cdna, PNA, RNA või nende kombinatsioon. Selliste nukleiinhapete kavandamise ja sisseviimise meetodid on tehnika tasemes tuntud. Ülevaate sellest on esitanud nt (Pascolo et al ). Polünukleotiidseid vaktsiine on kerge valmistada, kuid nende vektorite toimimise viisist immuunvastuse indutseerimisel ei ole täielikult aru saadud. Sobivate vektorite ja manustamissüsteemide hulka kuuluvad viiruslik DNA ja/või RNA nagu süsteemid, mis põhinevad adenoviirusel, vaktsiiniaviirusel, retroviirustel, herpese viirusel, adeno-assotsieerunud viirusel või hübriididel, mis sisaldavad enam kui ühe viiruse elemente. Mitteviiruseliste manustamissüsteemide hulka kuuluvad katioonsed lipiidid ja katioonsed polümeerid ning need on DNA väljastajatena tuntud tehnika tasemest. üüsikalist manustamist, nagu geenipüssi kaudu, võib samuti kasutada. Peptiid või peptiidid, mida kodeerivad nukleiinhapped, võib olla liitvalk, näiteks koos epitoobiga, mis stimuleerib T-rakke vastava vastasoleva CDR jaoks, nagu on nimetatud eespool. Leiutise ravim võib samuti sisaldada ühte või enamat lisaainet. Lisaained on ained, mis suurendavad või võimendavad mittespetsiifiliselt immuunvastust, nt immuunvastuseid, mida vahendavad CTL ja T-abistajarakud (T H ) antigeenile, ja seega võib neid käesoleva leiutise ravimis pidada kasulikeks. Sobivate lisaainete hulka kuuluvad, kuid mitte ainult, 1018 SS, alumiiniumisoolad, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dslm, flagelliin või TLR5 ligandid, mis on saadud flagelliinist, LT3 ligand, GM-CS, C30, C31, imikvimood (ALDARA ), resikvimood, muact MP321, interleukiinid, nagu L-2, L-13, L-21, interferoon-alfa või -beeta, või selle pegüülitud derivaadid, S Patch, SS, SCOMATRX, SCOMid, juvimmuun, LipoVac, MALP2, M59, monofosforüüllipiid A, montaniid MS 1312, montaniid SA 206, montaniid SA 50V, montaniid SA-51, vesi-õlis- ja õli-vees-emulsioonid, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel vektorsüsteem, polü(laktiid koglükoliid) [PLG]-põhised ja

105 dekstraani mikroosakesed, talaktoferriin SRL172, virosoomid ja teised viirusesarnased osakesed, Y-17D, VEG püüdur, R848, beeta-glükaan, Pam3Cys, Aquila's QS21 stimulon, mis on saadud saponiinist, mükobakteriaalsed ekstraktid ja sünteetilised bakteri rakuseina jäljendajad ning teised omandiõigusega lisaained, nagu Ribi's Detox, Quil või Superfos. Eelistatud on lisaained, nagu reund's või GM-CS. Mitmeid immunoloogilisi lisaaineid (nt M59), mis on spetsiifilised dendriitilistele rakkudele ja nende preparaatidele, on kirjeldatud eelnevalt (Allison and Krummel ). Kasutada võib samuti tsütokiine. Mitmed tsütokiinid on liidetud otse, et mõjutada dendriitiliste rakkude migratsiooni lümfoidsetesse kudedesse (nt TN- ), kiirendades dendriitiliste rakkude küpsemist efektiivseteks antigeeni esitavateks rakkudeks T-lümfotsüütideks (nt GM-CS, L-1 ja L- 4) (USA pat. nr , mis on viitena lisatud spetsiifiliselt siia täies mahus) ja toimides immunolisaainena (nt L-12, L-15, L-23, L-7, N-alfa, N-beeta) [Gabrilovich 1996]. Teatatud on samuti CpG immunostimuleerivatest oligonukleotiididest, et suurendada lisaainete toimet vaktsiini koostises. Sidumata teooriaga toimivad CpG oligonukleotiidid loomupärast (mitteadaptiivse) immuunsüsteemi Tolli-laadsete retseptorite (TLR), peamiselt TLR9, kaudu aktiveerides. CpG vallandatud TLR9 aktiveerimine suurendab antigeenspetsiifilisi humoraalseid ja tsellulaarseid vastuseid paljudele erinevatele antigeenidele, sealhulgas peptiidi või valgu antigeenidele, elavatele või surnud viirustele, dendriitilise raku vaktsiinidele, autoloogsetele tsellulaarsetele vaktsiinidele ja polüsahhariidi konjugaatidele nii profülaktilistes kui ka terapeutilistes vaktsiinides. Veelgi tähtsam on see, et see suurendab dendriitilise raku küpsemist ja diferentseerumist, andes tulemusena T H1 rakkude suurema aktiveeerimise ja tugeva tsütotoksiliste T-lümfotsüütide (CTL) generatsiooni isegi CD4 T-abistajaraku puudumisel. T H1 nihe, mis on indutseeritud TLR9 stimulatsiooniga, säilitatakse isegi vaktsiini lisaainete juuresolekul, nagu maarjas või mittetäielik reund i lisaaine (A), mis normaalselt edendab T H2 nihet. CpG oligonukleotiidid näitavad isegi suuremat lisaaine toimet, kui see on valmistatud koos teiste lisaainetega või seda manustatakse koos teiste lisaainete või see on preparaatides, nagu mikroosakesed, nanoosakesed, lipiidide emulsioonid või sarnased preparaadid, mis on eriti vajalikud tugeva vastuse indutseerimiseks siis, kui antigeen on suhteliselt nõrk. Need kiirendavad samuti immuunvastust ja võimaldavad antigeeni annuseid vähendada suurusjärgus ligikaudu kaks korda koos võrreldava antikeha vastustega vaktsiini täisannuse suhtes ilma CpG-ta mõnes katses (Krieg ). USA patendis nr B1 kirjeldatakse CpG oligonukleotiidide, mittenukleiinhappest lisaainete ja antigeeni

106 kombineeritud kasutamist antigeenispetsiifilise immuunvastuse indutseerimiseks. CpG TLR9 antagonist on dslm (kahekordse tüvesilmusega immunomodulaator) Mologeni järgi (Berlin, Germany), mis on eelistatud käesoleva leiutise ravimkoostise eelistatud komponent. Kasutada võib ka teisi TLR siduvaid molekul, nagu RNA siduja TLR 7, TLR 8 ja/või TLR 9. Teiste kasulike lisaainete näidete hulka kuuluvad, kuid mitte ainult, keemiliselt muudetud CpGs (nt CpR, dera), dsrna analoogid, nagu polü(:c) ja selle derivaadid (nt AmpliGen, Hiltonol, polü-(clc), polü(c-r), polü(:c12u), mitte bakteriaalse CpG DNA või RNA, samuti immunoaktiivsed väikesed molekulid ja antikehad, nagu tsüklofosfamiid, sunitiniib, bevatsisumaab, kelebreks, NCX-4016, sildenafiil, tadalafiil, vardenafiil, sorafeniib, temosolomiid, temsirolimus, XL-999, CP , pasopaniib, VEG Trap, ZD2171, AZD2171, anti-ctla4, muud antikehad, mis sihivad immuunsüsteemi võtmetähtsusega struktuure (anti-cd40, anti-tgbeeta, anti-tnalfa retseptor) ja SC58175, mis võivad toimida terapeutiliselt ja/või lisaainetena. Lisa- ja abiainete kogused ja kontsentratsioonid, mis on kasulikud käesoleva leiutise kontekstis, saab kogenud laborant määrata kergesti ilma liigsete katseteta. Eelistatud abiained imikvimood, resikvimood, GM-CS, tsüklofosfamiid, sunitiniib, bevatsisumaab, interferoon-alfa, CpG oligonukleotiidid ja derivaadid, polü-(:c) ja derivaadid, RNA, sildenafiil ja osakeste preparaadid PLG või virosoomidega. Eelistatud teostuses valitakse leiutisele vastavasse ravimkoostisse lisaaine rühmast, mis koosneb kolooniat stimuleerivatest faktoritest, nagu granulotsüüdi makrofaagi kolooniat stimuleeriv faktor (GM-CS, sargramostiim), imikvimood, resikvimood ja interferoon-alfa. Eelistatud teostuses valitakse leiutisele vastavasse ravimkoostisse lisaaine rühmast, mis koosneb kolooniat stimuleerivatest faktoritest, nagu granulotsüüdi makrofaagi kolooniat stimuleeriv faktor (GM-CS, sargramostiim), imikvimood ja resikvimood. Leiutisele vastava ravimkoostise eelistatud teostuses on lisaaineks imikvimood või resikvimood.

107 Seda koostist kasutatakse parenteraalseks manustamiseks, nagu subkutaanne, intradermaalne, intramuskulaarne või peroraalne manustamine. Selleks lahustatakse või suspendeeritakse peptiidid ja valikuliselt teised molekulid farmatseutiliselt vastuvõetavas, eelistatavalt vee baasil tehtud kandeaines. Koostis võib lisaks sisaldada veel abiaineid, nagu puhverlahus, sideained, läbipuhumise ained, lahjendid, maitseained, libiained jne. Peptiide saab manustada samuti koos immuunsust stimuleerivate ainetega, nagu tsütokiinid. Abiainete, mida saab kasutada sellises koostises, ulatusliku nimekirja saab võtta näiteks publikatsioonist A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. trükk, 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Koostist saab kasutada adenomatoossete või vähilaadsete haiguste vältimiseks, profülaktikaks ja/või raviks. Näiteid preparaatides on võimalik leida dokumendist EP Käesolev leiutis pakub ravimit, mida on võimalik kasutada vähiravis, eelkõige maovähi, neeruraku kartsinoomi, käärsoolevähi, mitteväikeserakulise kopsukartsinoomi, adenokartsinoomi, eesnäärmevähi, healoomulise neoplasma ja halvaloomulise melanoomi ravis. Üksikasjalikumalt on kirjeldatud kasutusvalmis komplekti, mis sisaldab: (a) mahutit, mis sisaldab eespool kirjeldatud ravimkoostist lahuses või lüofiliseeritud kujul; (b) valikuliselt teist mahutit, mis sisaldab lahjendit või muutmise lahust lüofiliseeritud preparaadile, ning (c) valikuliselt juhiseid (i) lahuse kasutamise või (ii) muutmise ja/või lüofiliseeritud preparaadi kasutamise kohta. Kasutusvalmis komplekt võib sisaldada veel ühte või enamat järgnevatest: (iii) puhverlahust, (iv) lahjendit, (v) filtrit, (vi) nõela või (v) süstalt. Mahutiks on eelistatavalt pudel, viaal, süstal või testtuub ja see võib olla mitmekordselt kasutatav mahuti. Ravimkoostis on eelistatavalt lüofiliseeritud. Kirjeldatud komplektid sisaldavad käesoleva leiutise lüofiliseeritud preparaati sobivas mahutis ja juhiseid selle valmistamiseks ja/või kasutamiseks. Sobivate mahutite hulka kuuluvad näiteks pudelid, viaalid (nt kahe kambriga viaalid), süstlad (nagu kahe kambriga süstlad) ja testtuubid. Mahuti võib olla valmistatud paljudest erinevatest materjalides, nagu klaas või plastmass. Kasutusvalmis komplekt ja/või mahuti sisaldab eelistatavalt mahuti

108 peal või sellega seotult juhiseid, mis näitavad valmistamise juhiseid ja/või kasutamist. Näiteks etiketil võib olla näidatud, et lüofiliseeritud preparaadist peab valmistama peptiidi kontsentratsioonid, nagu on kirjeldatud eespool. Etiketil võib olla veel näidatud, et preparaat on kasulik või on mõeldud subkutaanseks manustamiseks. Preparaati sisaldavaks mahutiks võib olla mitmekordse kasutamisega viaal, mis võimaldab valmistatud preparaadi korduvat manustamist (nt 2-6 manustamiseks). Kasutusvalmis komplekt võib sisaldada veel teist mahutit, mis sisaldab sobivat lahjendit (nt naatriumvesinikkarbonaati). Lahjendi ja lüofiliseeritud preparaadi segamisel on peptiidi lõplik kontsentratsioon valmistatud preparaadis eelistatavalt vähemalt 0,15 mg/ml/peptiidi (=75 µg) ja eelistatavalt mitte enam kui 3 mg/ml/peptiidi (=1500 µg). Kasutusvalmis komplekt võib sisaldada teisi materjale, mis on soovitatavad kaubandusliku ja kasutaja seisukohalt, sealhulgas puhverlahuseid, lahjendeid, filtreid, nõelu, süstlaid ja pakendeid koos kasutusjuhistega. Kasutusvalmis komplektis, nagu on kirjeldatud, võib olla üks mahuti, mis sisaldab käesolevale leiutisele vastavat ravimkoostise preparaati koos teiste komponentidega või ilma (nt teisi ühendeid või nende teiste ühendite ravimkoostisi) või sellel võib olla iga komponendi jaoks selgelt eraldi mahuti. Eelistatavalt hõlmavad kasutusvalmis komplektid, nagu neid on kirjeldatud, leiutise preparaati, mis on pakendatud manustamiseks koos teise ühendiga (nagu lisaained (nt GM- CS), kemoteraapia aine, looduslik saadus, hormoon või antagonist, angiogeneesivastane aine või inhibiitor, apoptoosi indutseeriv aine või kelaator) või selle ravimkoostisega. Kasutusvalmis komplekti komponendid võivad olla enne patsiendile manustamist eelnevalt komplektina kokku pandud või iga komponent võib olla eraldi erinevates mahutites. Kasutusvalmis komplekti komponendid võivad olla esitatud ühes või enamas vedeliku lahuses, eelistatavalt vesilahuses, enam eelistatavalt steriilses vesilahuses. Kasutusvalmis komplekti komponente võib samuti esitada tahkete ainetena, mida võib muuta vedelikeks sobiva lahusti lisamisega, mis esitatakse eelistatavalt eraldi teises mahutis. Terapeutilise kasutusvalmis komplekti mahutiks võib olla viaal, testtuub, kolbpudel, pudel, süstal või mis tahes muu vahend tahke või vedela aine pakendamiseks. Tavaliselt sel juhul,

109 kui on enam kui üks komponent, sisaldab kasutusvalmis komplekt teist viaali või mahutit, mis võimaldab eraldi manustamist. Kasutusvalmis komplekt võib sisaldada samuti teist mahutit farmatseutiliselt vastuvõetava vedeliku jaoks. Terapeutiline kasutusvalmis komplekt sisaldab eelistatavalt seadet (ühte või enamat nõela, süstlaid, silmatilguteid, pipette jne), mis võimaldavad manustada leiutise aineid, mis on käesoleva kasutusvalmis komplekti komponendid. Käesolev preparaat on üheks, mis sobib peptiidide manustamiseks mis tahes vastuvõetaval viisil, nagu peroraalselt (enteraalne), nasaalselt, silma kaudu, subkutaanselt, intradermaalselt, intramuskulaarselt, intravenoosselt või transdermaalselt. Eelistatavalt on manustamine s.c. ja enim eelistatult i.d. Manustada võib infusioonipumbaga. Kuna kirjeldatud peptiide, mis on saadud MST1R, UCHL5, SMC4, NYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ja MUC6-st iseleeriti maovähist, kasutatakse leiutise ravimit eelistulsikult maovähi raviks. Käesolevat leiutist kirjeldatakse nüüd järgnevates näidetes, mis kirjeldavad eelistatud teostusi, ilma nendega piiramata. NÄTED NÄDE 1 Raku vpinnal asuvate kasvajaga seotud peptiidide identifitseerimine Koeproovid Patsientide koeproovid andsid Kyoto Prefektuuri Meditsiiniline Ülikool (KPUM), Kyoto, Jaapan, Osaka Linna Ülikooli Meditsiiniline Ülikool (OCU), Osaka, Jaapan, ning Tübingeni Ülikooli Haigla, Saksamaa. Enne kirurgilist protseduuri anti kõikidele patsientidele anti kirjalik informatsioon ja neilt võeti nõusolek. Koele tehti šokikülmutus vedelas lämmastikus vahetult pärast kirurgilist protseduuri ja seda hoiti kuni TUMAP-de eraldamiseni temperatuuril -80 C. HLA peptiidide eraldamine koeproovidest HLA peptiididevaru šokikülmutusega koeproovidest saadi immuunsadestamisega tahkest koest vastavalt veidi muudetud protokollile (alk, K.1991; Seeger,.H.T1999}, kasutades

110 HLA-A, -B, -C-spetsiifilist antikeha W6/32, HLA-A*02-spetsiifilist antikeha BB7.2, CNBr-aktiveeritud sefaroosi, happega töötlemist ja ultrafiltrimist. Meetodid HLA peptiidikogumid, nagu need saadi, eraldati vastavalt nende hüdrofoobsusele pöördfaaskromatograafia abil (nanoacquity UPLC süsteem, veed) ja elueeritavaid peptiide analüüsiti LTQ- Orbitrap hübriidmassispektromeetriga (Thermoisher Scientific), mis oli varustatud ES allikaga. Peptiidikogumid viidi otse analüüsiks kasutatava silikageeliga täidetud mikrokapillaarsesse kolonni (75 µm x 250 mm), kuhu oli pandud 1,7 µm C18 pöördfaasi materjali (Waters), kasutades voolukiirust 400 nl minutis. Järgnevalt peptiidid eraldati, kasutades kaheetapilist 180 minuti binaarset gradienti 10% kuni 33% B voolukiirusel 300 nl minutis. Gradient koostati lahustist A (0,1% sipelghape vees) ja lahustist B (0,1% sipelghape atsetonitriilis). NanoES allikasse viimiseks kasutati A kullaga kaetud klaaskapillaari (PicoTip, New Objective). LTQ-Orbitrap massispektromeetriga töötati andmetest sõltuval viisil, kasutades TOP5 strateegiat. Lühidalt öeldes alustati skaneerimistsüklit suure massi täpsusega täielikust skaneerimisest Orbitrap seadmes (R = ), millele järgnes MS/MS (massispektromeetria) skaneerimine samuti Orbitrap seadmes (R = 7500) 5 kõige rohkem leiduva eeliooniga koos eelnevalt valitud ioonide dünaamilise väljajätmisega. Teineteisele järgnevaid massispektreid interpreteeriti programmiga SEQUEST ja täiendava käsitsi kontrollimisega. dentifitseeritud peptiidide järjestus kinnitati genereeritud loomuliku peptiidi fragmenteerumise mustrite võrdlemisel järjestuse poolest identse sünteetilise võrdluspeptiidi fragmenteerumise mustriga. Joonis fig 1 näitab näite spektrit, mis hangiti kasvaja kudedest MHC klassiga seotud peptiidi CDC2-001 ja selle elutsooni profiili kohta UPLC-süsteemiga. NÄDE 2 Leiutise peptiide kodeerivate geenide ekspressiooni profiil Mitte kõik MHC molekulide poolt tuvastatud peptiidid, nagu need, mis on kasvajarakkude pinnal, ei ole sobivad immunoteraapia jaoks, sest enamus neist peptiididest on saadud normaalsetest tsellulaarsetest valkudest, mida ekspresseerivad paljud rakutüübid. Ainult vähesed neist peptiididest on kasvajaga seotud ja tõenäoliselt on võimelised indutseerima T-rakke väga kõrge spetsiifilise äratundmisega kasvaja suhtes, millest need on saadud.

111 Selleks, et identifitseerida selliseid peptiide ja vähendada vaktsineerimisega indutseeritud autoimmuunsuse riski, pöörasid leiutajad tähelepanu nendele peptiididele, mis on saadud valkudest, mis on üleekspresseeritud kasvaja rakkude peal võrreldes enamuse normaalse koega. deaalne peptiid saadakse valgust, mis on unikaalne kasvaja suhtes ja seda ei ole teistes kudedes. Peptiidide määramiseks, mis on saadud ideaalsele sarnase ekspressiooniprofiiliga geenidest, määrati identifitseeritud peptiidid vastavalt valkude ja geenide juurde, millest need saadi, ja genereeriti nende geenide ekspressiooniprofiilid. RNA allikad ja valmistamine Kirurgiliselt eemaldatud koeproovid hangiti erinevatest kliinilistest kohtadest (vt näidet 1) pärast igalt patsiendilt kirjaliku teadva nõusoleku hankimist. Kasvaja koeproovidele tehti hetkeline külmutus vedela lämmastikuga vahetult pärast kirurgilist protsessi ja hiljem homogeniseeriti vedelas lämmastikus uhmri ja uhmrinuiaga. Kogu RNA valmistati proovidest, kasutades TR Reagenti (Ambio, Darmstadt, Saksamaa), millele järgnes puhastamine RNeasy tootega (QAGEN, Hilden, Saksamaa), kusjuures mõlemad meetodid teostati vastavalt tootja protokollile. Kogu RNA terve inimese koest saadi kaubandusest (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, Netherlands; BioChain, Hayward, CA, USA). Mitmelt isikult saadud RNA (2 ja 123 isiku vahel) segati nii, et iga isiku RNA oli võrdselt kaalutud. Leukotsüüdid eraldati 4 vabatahtliku vereproovidest. Kõigi RNA provide kvaliteet ja kvantiteet määrati Agilent 2100 Bioanalüsaatoriga (Agilent, Waldbronn, Germany), kasutades RNA 6000 Pico LabChip kasutusvalmis komplekti (Agilent). Mikromaatriksi katsed Kõigi kasvaja ja normaalse koe RNA proovide geeniekspressiooni analüüs teostati firma Affymetrix inimese genoomiga (HG) U133A või HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotiidide mikromaatriksitega (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Kõik etapid teostati vastavalt firma Affymetrix kasutusjuhendile. Lühidalt öeldes sünteesiti kaheahelaline cdna kogu RNA 5 8 µg kogusest, kasutades SuperScript RT (nvitrogen) ja oligo-dt-t7 praimerit

112 (MWG Biotech, Ebersberg, Saksamaa), nagu on kirjeldatud kasutusjuhendis. n vitro transkriptsioon teostati BioArray suure saagisega RNA transkripti märgistamise komplektiga (ENZO Diagnostics, nc., armingdale, NY, USA) U133A maatriksite jaoks või GeneChip VT märgistamise komplektiga (Affymetrix) U133 Plus 2.0 maatriksite jaoks, millele järgnes crna fragmentatsioon, hübridisatsioon ja värvimine streptavidiinfükoerütriini ja biotinüülitud antistreptavidiini antikehaga (Molecular Probes, Leiden, Netherlands). Kujutised skaneeriti Agilent 2500A geenimaatriksi skanneriga (U133A) või firma Affymetrix geenikiibi skanneriga 3000 (U133 Plus 2.0), ja andmeid analüüsiti GCOS tarkvaraga (Affymetrix), kasutades vaikesätteid kõigi parameetrite jaoks. Normaliseerimiseks kasutati 100 koduhoidja geeni firmast Affymetrix. Suhtelised ekspressiooniväärtused arvutati tarkvara poolt antud signaali logi vahekorrast ja normaalsed neeruproovid seadistati meelevaldselt 1,0 peale. Maovähis kõrgelt üleekspresseeritud alggeenide ekspressiooni profiilid on näidatud joonisel fig. 2. NÄDE 3 n vitro immunogeensus MA941 MHC klassis esitatud peptiidide jaoks nformatsiooni saamiseks käesoleva leiutise TUMAPide immunogeensuse kohta tegime me uuringu, kasutades hästi kindlaksmääratud in vitro stimuleerimise platvormi, mida on juba kirjeldatud (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, ja Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. mmunol., 171, ). Selle süsteemiga oli meil võimalik näidata positiivse immunogeensuse (s.o spetsiifiliste T-rakkude ekspansiooni) tulemusi 47-l juhul 54-st testitud HLA-A*2402 jaoks piiratud TUMAPist ning 3-l juhul 3-st testitud HLA-A*0201 jaoks piiratud TUMAPist, mis näitas, et need peptiidid on T-raku epitoobid, mille vastu on inimeses olemas CD8+ eel T-rakud (tabel 4). CD8+ T-rakkude praiming in vitro n vitro stimuleerimise teostamiseks kunstlikku antigeeni esitavate rakkudega (aapc), mis on koormatud peptiidi MHC kompleksi (pmhc) ja anti-cd28 antikehaga, eraldasime kõigepealt CD8 T-rakud värsketest HLA-A*24 leukafereesi toodetest või Tuebingeni verepanga tervete doonorite HLA-A*02+ buffy coat dest

113 CD8 T-rakud rikastati kas otse või esmalt eraldati PBMC-d (perifeerse vere mononukleaarsed rakud), kasutades standardset tihedusgradiendi eraldamise keskkonda (PAA, Cölbe, Saksamaa). Eraldatud CD8 lümfotsüüdidi või PBMC-d inkubeeriti kuni kasutamiseni T-raku keskkonnas (TCM), mis sisaldas RPM-glutamaksi (nvitrogen, Karlsruhe, Saksamaa), millele lisati 10% kuuma inaktiveeritud inimese AB seerumit (PAN- Biotech, Aidenbach, Saksamaa), 100 U/ml penitsilliini / 100 µg/ml streptomütsiini (Cambrex, Köln, Saksamaa), 1 mm naatriumpüruvaati (CC Pro, Oberdorla, Saksamaa) ja 20 µg/ml gentamütsiini (Cambrex). 2,5 ng/ml L-7 (PromoCell, Heidelberg, Saksamaa) ja 10 U/ml L-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Saksamaa) tsütokiine lisati TCMile selle kultuuri sammu jaoks. CD8+ lümfotsüütide eraldamine teostati positiivse valimise komplektiga, kasutades CD8 MicroBeade (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Saksamaa). pmhc/anti-cd28-ga kaetud tilkade, T-rakkude stimuleerimine ja näidu lugemine teostati väikeste muudatustega nii, nagu on kirjeldatud eespool (Walter et al ). Lühidalt öeldes valmistati biotinüülitud peptiidiga koormatud rekombinantsed HLA-A*2402 ja HLA-A*0201 molekulid, millel puudub transmembraanne domeen ja mis on biotinüülitud raske ahela karboksü-terminaalses otsas. Puhastatud, koosstimuleeritud hiire gg2a ja antiinimese CD28 Ab 9.3 (Jung, Ledbetter, and Muller-Eberhard ) oli biotinüülitud keemiliselt, kasutades sulfo-n-hüdroksüsuktsiinimidobiotiini, nagu on soovitanud tootja (Perbio, Bonn, Saksamaa). Kasutatud terakesed olid 5,6 µm suurused polüstüreeniga kaetud streptavidiini osakesed (Bangs Laboratories, llinois, USA). pmhc kasutati kõrge immungeense kontrollina ja madala kontrollina olid vastavalt A*0201/MLA-001 (peptiid ELAGGLTV modifitseeritud Melan-A/MART-1-st) ja A*0201/DDX5-001 (YLLPAVH DDX5-st) terakest / 200 µl kaeti 96 süvendiga plaatidel 600 ng biotiin anti-cd28 plus 200 ng oluliste biotiin-pmhc (suure tihedusega terakesed) juuresolekul. Stimuleerimine algatati 96 süvendiga plaatides inkubeerides 1x10 6 CD8+ T-rakke koos 2x10 5 pestud kaetud terakestega 200 µl TCM-s, mida täiendati 5 ng/ml L-12 (PromoCell), 3-4 päeva temperatuuril 37 C, 5% CO 2 ja 95% suhteline õhuniiskus. Pool keskkonnast vahetati seejärel välja värske TCM vastu, mida oli täiendatud 80 U/ml L-2-ga, ja inkubeerimist

114 jätkati 3-4 päeva temperatuuril 37 C. Seda stimuleerimise tsüklit korrati kokku kolm korda. Multimeeranalüüsid viidi läbi, värvides rakke fuorestsentsete A*0201 või A*2402 HLA multimeeridega (toodetud kirjeldatud viisil {Altman, 1996 ALTMAN1996 /id} poolt) ja CD8-TC antikeha klooniga SK1 (BD, Heidelberg, Saksamaa) või täiendavalt elulemismarkeriga (elus/surnud-aqua või Violet värvaine (nvitrogen, Karlsruhe, Saksamaa)), ning need viidi läbi neljavärvilise ACSCaliburi (BD) või LSR SORP tsütomeetriga (BD; kaheksateist värvi, mis oli varustatud vastavalt sinise (488 nm), violetse (405 nm), punase (640 nm) ja rohelisega (532 nm). Peptiidi spetsiifilisi rakke arvestati protsendina kogu CD8+ T-rakkudest. Multimeeranalüüsi hindamine viidi läbi CSExpress või lowjo tarkvara (Tree Star, Oregon, USA) kasutades. Spetsiifilise multimeeri + CD8+ lümfotsüütide in vitro praiming leiti sobivate sammude ja negatiivse kontrolli stimuleerimise võrdlemisega. Antud antigeeni immunogeensus leiti siis, kui vähemalt üks in vitro hinnatav ühe terve doonori stimuleeritud süvend leiti sisaldavat spetsiifilisi CD8+ T-rakke pärast in vitro stimuleerimist (s.o see süvend sisaldas vähemalt 1% spetsiifilist multimeeri + CD8+ T-rakkude seas, rakkude protsent oli vähemalt 10 x vastavate negatiivsete kontrollide keskmisest (stimuleerimine irrelevantse multimeeri ja värvimine relevantse multimeeriga) ning rakud ei asunud ploti diagonaalil). MA941 peptiidide in vitro immunogeensus 47 juhul 54-st testitud HLA-A*2402 peptiididest ja 3 juhul testitud HLA-A*0201 peptiididest polnud võimalik näidata in vitro immunogeensust peptiidile spetsiifiliste T- rakuliinide loomisega. Näitlikud voolutsütomeetria tulemused TUMAP-spetsiifilise multimeeri värvimise järel leiutise kahe peptiidi tuvastamiseks on näidatud joonisel fig. 3 koos vastava negatiivse kontrolliga. 54 A*2402 ja 3 A*0201 peptdiidi tulemused on võetud kokku tabelis 4. Tabel 4: HLA klassi peptiidide in vitro immunogeensus irma mmatics poolt teostatud in vitro immunogeensuse katsete tulemused näitavad testitud positiivsete doonorite ja süvendite protsenti. ga peptiidi puhul oli võimalik hinnata vähemalt nelja doonorit ja 48 süvendit. SEQ D nr: 1 kuulub leiutisele. SEQ D nr: Antigeen Doonorid positiivsed/hinnatud [%] Süvendid positiivsed/hinnatud [%]

115 CDC ASPM MMP MET UCHL MST1R K2C SMC EPHA PROM MMP NYB ASPM PLK ABL ATAD ATAD ATAD AVL COL12A COL6A ANC HSP90B MUC NU NU PPAP2C RPS SAH SLC6A UQCRB

116 QGAP ERBB CCDC88A CCNB CCND CCNE CEA CLCN DNAJC DNAJC E2S E3L EPPK GPR TGB LCN SDHC PBK POLD PSMD PTK TSPAN ZN Järgmiseid peptiide on juba kirjeldatud immaticsi teistes taotlustes ning need on hõlmatud vaktsiinides MA901 (MET-001 ja TOP-001), MA910 (MET-001 ja TOP-001) ning MA950 (G2BP3-001). Kuna näiteks MET-001 annab äärmiselt häid in vivo reaktsioone, on võimalik andmeid käsitleda viitea peptiidide kliinilisele kasulikkusele. SEQ D nr: Antigeen Doonorid positiivsed/hinnatud [%] G2BP Süvendid positiivsed/hinnatud [%]

117 MET TOP Viidete nimekiri Ahmed, A. U., et al. "Effect of disrupting seven-in-absentia homolog 2 function on lung cancer cell growth." J Natl.Cancer nst (2008): Allison, J. P. and M.. Krummel. "The Yin and Yang of T cell costimulation." Science (1995): Altmeyer, A., et al. "Tumor-specific cell surface expression of the-kdel containing, endoplasmic reticular heat shock protein gp96." nt J Cancer 69.4 (1996): Appay, V., et al. "Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide." Eur.J mmunol (2006): Banerjee, S. K., et al. "Expression of cdc2 and cyclin B1 in Helicobacter pylori-associated gastric MALT and MALT lymphoma : relationship to cell death, proliferation, and transformation." Am J Pathol (2000): Bartman, A. E., et al. "Aberrant expression of MUC5AC and MUC6 gastric mucin genes in colorectal polyps." nt J Cancer 80.2 (1999): Basu, S., et al. "Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the N-kappa B pathway." nt mmunol (2000): Bauer, B., S. Bartfeld, and T.. Meyer. "H. pylori selectively blocks EGR endocytosis via the non-receptor kinase c-abl and CagA." Cell Microbiol (2009): Benatti, P., et al. "A balance between N-Y and p53 governs the pro- and anti-apoptotic transcriptional response." Nucleic Acids Res 36.5 (2008): Bertolini, G., et al. "Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A (2009): Bierie, B. and H. L. Moses. "TG-beta and cancer." Cytokine Growth actor Rev (2006):

118 Bitoun, E. and K. E. Davies. "The robotic mouse: unravelling the function of A4 in the cerebellum." Cerebellum. 4.4 (2005): Bolhassani, A. and S. Rafati. "Heat-shock proteins as powerful weapons in vaccine development." Expert.Rev.Vaccines. 7.8 (2008): Borset, M., et al. "The role of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in multiple myeloma and other blood malignancies." Leuk.Lymphoma (1999): Bradbury, P. A., et al. "Matrix metalloproteinase 1, 3 and 12 polymorphisms and esophageal adenocarcinoma risk and prognosis." Carcinogenesis 30.5 (2009): Brown, C. E., et al. "Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells." Cancer Research (2009): Bruckdorfer, T., O. Marder, and. Albericio. "rom production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future." Curr.Pharm.Biotechnol. 5.1 (2004): Brunsvig, P.., et al. "Telomerase peptide vaccination: a phase / study in patients with non-small cell lung cancer." Cancer mmunol.mmunother (2006): Cabanes, D., et al. "Gp96 is a receptor for a novel Listeria monocytogenes virulence factor, Vip, a surface protein." EMBO J (2005): Calzado, M. A., et al. "An inducible autoregulatory loop between HPK2 and Siah2 at the apex of the hypoxic response." Nat.Cell Biol (2009): Castelli, C., et al. "Heat shock proteins: biological functions and clinical application as personalized vaccines for human cancer." Cancer mmunol.mmunother (2004): Castriconi, R., et al. "Both CD133+ and C." Eur.J mmunol (2007): Chanock, S. J., et al. "HLA-A, -B, -Cw, -DQA1 and -DRB1 Alleles in a Caucasian Population from Bethesda, USA." Hum.mmunol. 65 (2004): Chen, C. H., et al. "nhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A (2003): Chen, Z. and J. J. O'Shea. "Regulation of L-17 production in human lymphocytes." Cytokine 41.2 (2008): Cho, S. O., et al. "Helicobacter pylori in a Korean solate Expressed Proteins Differentially in Human Gastric Epithelial Cells." Dig.Dis.Sci. (2009). Christianson, J. C., et al. "OS-9 and GRP94 deliver mutant alpha1-antitrypsin to the Hrd1- SEL1L ubiquitin ligase complex for ERAD." Nat.Cell Biol (2008):

119 Cisek, L. J. and J. L. Corden. "Phosphorylation of RNA polymerase by the murine homologue of the cell-cycle control protein cdc2." Nature (1989): Colombetti, S., et al. "Prolonged TCR/CD28 engagement drives L-2-independent T cell clonal expansion through signaling mediated by the mammalian target of rapamycin." J mmunol (2006): Confalonieri, S., et al. "Alterations of ubiquitin ligases in human cancer and their association with the natural history of the tumor." Oncogene (2009): Corso, S., et al. "Silencing the MET oncogene leads to regression of experimental tumors and metastases." Oncogene 27.5 (2008): Cox, C. V., et al. "Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood ALL." Blood (2009): Cunha-erreira,., et al. "The SC/Slimb ubiquitin ligase limits centrosome amplification through degradation of SAK/PLK4." Curr.Biol (2009): DeLuca, J. G., et al. "Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites." Mol.Biol.Cell 16.2 (2005): Deng, H., et al. "Matrix metalloproteinase 11 depletion inhibits cell proliferation in gastric cancer cells." Biochem.Biophys.Res Commun (2005): Dengjel, J., et al. "Unexpected Abundance of HLA Class Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas." Clin Cancer Res (2006): Deremer, D. L., C. Ustun, and K. Natarajan. "Nilotinib: a second-generation tyrosine kinase inhibitor for the treatment of chronic myelogenous leukemia." Clin Ther (2008): Di Renzo, M.., et al. "Overexpression and amplification of the met/hg receptor gene during the progression of colorectal cancer." Clin.Cancer Res. 1.2 (1995): Dong, G., et al. "Hepatocyte growth factor/scatter factor-induced activation of MEK and P3K signal pathways contributes to expression of proangiogenic cytokines interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in head and neck squamous cell carcinoma." Cancer Res (2001): Dudley, M. E., et al. "Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes." Science (2002): Dudley, M. E., et al. "Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma." J.Clin.Oncol (2005):

120 Duong, C., et al. "Pretreatment gene expression profiles can be used to predict response to neoadjuvant chemoradiotherapy in esophageal cancer." Ann Surg Oncol (2007): Egland, K. A., et al. "High expression of a cytokeratin-associated protein in many cancers." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A (2006): Eramo, A., et al. "dentification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population." Cell Death Differ 15.3 (2008): Esashi,., et al. "CDK-dependent phosphorylation of BRCA2 as a regulatory mechanism for recombinational repair." Nature (2005): Escobar, M. A., et al. "Profiling of nuclear extract proteins from human neuroblastoma cell lines: the search for fingerprints." J Pediatr.Surg 40.2 (2005): erracini, R., et al. "The Met/HG receptor is over-expressed in human osteosarcomas and is activated by either a paracrine or an autocrine circuit." Oncogene 10.4 (1995): ischer, J., et al. "Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET protooncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours." Oncogene 17.6 (1998): lanagan, J. M., et al. "Genomics screen in transformed stem cells reveals RNASEH2A, PPAP2C, and ADARB1 as putative anticancer drug targets." Mol.Cancer Ther. 8.1 (2009): ong, L., et al. "Altered peptide ligand vaccination with lt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A (2001): rasor, J., et al. "Estrogen down-regulation of the corepressor N-CoR: mechanism and implications for estrogen derepression of N-CoR-regulated genes." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A (2005): rew,. J., et al. "Generation and analysis of Siah2 mutant mice." Mol.Cell Biol (2003): u, Y. and A. S. Lee. "Glucose regulated proteins in cancer progression, drug resistance and immunotherapy." Cancer Biol.Ther. 5.7 (2006): urge, K. A., et al. "Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A (2001): urge, K. A., Y. W. Zhang, and G.. Vande Woude. "Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins." Oncogene (2000):

121 Gattinoni, L., et al. "Adoptive immunotherapy for cancer: building on success." Nat.Rev.mmunol. 6.5 (2006): Gherardi, E. and M. Stoker. "Hepatocyte growth factor--scatter factor: mitogen, motogen, and met." Cancer Cells 3.6 (1991): Glen, A., et al. "itraq-facilitated proteomic analysis of human prostate cancer cells identifies proteins associated with progression." J Proteome.Res 7.3 (2008): Gnjatic, S., et al. "NY-CO-58/K2C is overexpressed in a variety of solid tumors and induces frequent T cell responses in patients with colorectal cancer." nt J Cancer (2009). Guo, W. C., et al. "Expression and its clinical significance of heat shock protein gp96 in human osteosarcoma." Neoplasma 57.1 (2010): Habelhah, H., et al. "Stress-induced decrease in TRA2 stability is mediated by Siah2." EMBO J (2002): Hamamoto, A., et al. "Aberrant expression of the gastric mucin MUC6 in human pulmonary adenocarcinoma xenografts." nt J Oncol 26.4 (2005): Harada, T., et al. "Genome-wide analysis of pancreatic cancer using microarray-based techniques." Pancreatology (2009): Harper, L. J., et al. "Stem cell patterns in cell lines derived from head and neck squamous cell carcinoma." J Oral Pathol.Med (2007): Hayama, S., et al. "Activation of CDCA1-KNTC2, members of centromere protein complex, involved in pulmonary carcinogenesis." Cancer Research (2006): Hayashi, M., et al. "High expression of HER3 is associated with a decreased survival in gastric cancer." Clinical Cancer Research (2008): Heike, M., et al. "Expression of stress protein gp96, a tumor rejection antigen, in human colorectal cancer." nt J Cancer 86.4 (2000): Hodorova,., et al. "Gp96 and its different expression in breast carcinomas." Neoplasma 55.1 (2008): Horton, R. A., et al. "A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein." Anal.Biochem (2007): House, C. M., A. Moller, and D. D. Bowtell. "Siah proteins: novel drug targets in the Ras and hypoxia pathways." Cancer Research (2009):

122 Howard, E. W., et al. "Decreased adhesiveness, resistance to anoikis and suppression of GRP94 are integral to the survival of circulating tumor cells in prostate cancer." Clin Exp.Metastasis 25.5 (2008): Hu, G. and E. R. earon. "Siah-1 N-terminal RNG domain is required for proteolysis function, and C-terminal sequences regulate oligomerization and binding to target proteins." Mol.Cell Biol (1999): Huang, Y., et al. "Characterization of GPR56 protein and its suppressed expression in human pancreatic cancer cells." Mol.Cell Biochem (2008): Jansen, M. P., et al. "Downregulation of SAH2, an ubiquitin E3 ligase, is associated with resistance to endocrine therapy in breast cancer." Breast Cancer Res Treat (2009): Jia, H. L., et al. "Gene expression profiling reveals potential biomarkers of human hepatocellular carcinoma." Clinical Cancer Research 13.4 (2007): Jucker, M., et al. "The Met/hepatocyte growth factor receptor (HGR) gene is overexpressed in some cases of human leukemia and lymphoma." Leuk.Res (1994): Jung, G., J. A. Ledbetter, and H. J. Muller-Eberhard. "nduction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates." Proc Natl Acad Sci U S A (1987): Jung, H. M., S. J. Choi, and J. K. Kim. "Expression profiles of SV40-immortalizationassociated genes upregulated in various human cancers." J Cell Biochem (2009): Kaneko, N., et al. "sirna-mediated knockdown against CDCA1 and KNTC2, both frequently overexpressed in colorectal and gastric cancers, suppresses cell proliferation and induces apoptosis." Biochem.Biophys.Res Commun (2009): Kang, H. M., et al. "Effects of Helicobacter pylori nfection on gastric mucin expression." J Clin Gastroenterol (2008): Ko, M. A., et al. "Plk4 haploinsufficiency causes mitotic infidelity and carcinogenesis." Nat.Genet (2005): Kobayashi, M., et al. "Activation of ErbB3-P3-kinase pathway is correlated with malignant phenotypes of adenocarcinomas." Oncogene 22.9 (2003): Koochekpour, S., et al. "Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in human gliomas." Cancer Res (1997):

123 Korzeniewski, N., et al. "Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels." Cancer Research (2009): Krieg, A. M. "Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation." Nat.Rev.Drug Discov. 5.6 (2006): Kunimoto, K., et al. "nvolvement of QGAP3, a regulator of Ras/ERK-related cascade, in hepatocyte proliferation in mouse liver regeneration and development." J Cell Physiol (2009): Kuriyama, R., et al. "Gamma-tubulin-containing abnormal centrioles are induced by insufficient Plk4 in human HCT116 colorectal cancer cells." J Cell Sci. 122.Pt 12 (2009): Lee, H. S., et al. "MUC1, MUC2, MUC5AC, and MUC6 expressions in gastric carcinomas: their roles as prognostic indicators." Cancer 92.6 (2001): Leivo,., et al. "Characterization of gene expression in major types of salivary gland carcinomas with epithelial differentiation." Cancer Genet.Cytogenet (2005): Lemmel, C., et al. "Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling." Nat.Biotechnol (2004): Li, G., et al. "Downregulation of E-cadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor during melanoma development." Oncogene (2001): Lim, S. O., et al. "Expression of heat shock proteins (HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, GRP78, GRP94) in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules." World J Gastroenterol (2005): Lin, W., et al. "Tyrosine kinases and gastric cancer." Oncogene (2000): Liu, B. and Z. L. "Endoplasmic reticulum HSP90b1 (gp96, grp94) optimizes B-cell function via chaperoning integrin and TLR but not immunoglobulin." Blood (2008): Liu, S. Y., et al. "Requirement of MMP-3 in anchorage-independent growth of oral squamous cell carcinomas." J Oral Pathol.Med 36.7 (2007): Lochter, A., et al. "The significance of matrix metalloproteinases during early stages of tumor progression." Ann N.Y.Acad.Sci. 857 (1998): Lund, C. V., et al. "Zinc finger transcription factors designed for bispecific coregulation of ErbB2 and ErbB3 receptors: insights into ErbB receptor biology." Mol.Cell Biol (2005):

124 Ma, S., et al. "dentification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells." Gastroenterology (2007): MacLeod, R. J., M. Hayes, and. Pacheco. "Wnt5a secretion stimulated by the extracellular calcium-sensing receptor inhibits defective Wnt signaling in colon cancer cells." Am J Physiol Gastrointest.Liver Physiol (2007): G403-G411. Macmillan, J. C., et al. "Comparative expression of the mitotic regulators SAK and PLK in colorectal cancer." Ann Surg Oncol 8.9 (2001): Maney, T., et al. "The kinetochore of higher eucaryotes: a molecular view." nt Rev.Cytol. 194 (2000): Martin, C. M., et al. "Gene expression profiling in cervical cancer: identification of novel markers for disease diagnosis and therapy." Methods Mol.Biol. 511 (2009): Matsukita, S., et al. "Expression of mucins (MUC1, MUC2, MUC5AC and MUC6) in mucinous carcinoma of the breast: comparison with invasive ductal carcinoma." Histopathology 42.1 (2003): Maulik, G., et al. "Role of the hepatocyte growth factor receptor, c-met, in oncogenesis and potential for therapeutic inhibition." Cytokine Growth actor Rev (2002): Mizrak, D., M. Brittan, and M. Alison. "CD133: molecule of the moment." J Pathol (2008): 3-9. Montesano, R., et al. "Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis." Cell Growth Differ. 9.5 (1998): Monzani, E., et al. "Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential." Eur.J Cancer 43.5 (2007): Moore, A. and L. Wordeman. "The mechanism, function and regulation of depolymerizing kinesins during mitosis." Trends Cell Biol (2004): Morgan, R. A., et al. "Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes." Science (2006). Mori, M., et al. "HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry." Transplantation 64.7 (1997): Murray, G.., et al. "Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gastric cancer." Gut 43.6 (1998): Murshid, A., J. Gong, and S. K. Calderwood. "Heat-shock proteins in cancer vaccines: agents of antigen cross-presentation." Expert.Rev.Vaccines. 7.7 (2008):

125 Nakaigawa, N., et al. "nactivation of von Hippel-Lindau gene induces constitutive phosphorylation of MET protein in clear cell renal carcinoma." Cancer Res (2006): Nakamura, Y., et al. "Clinicopathological and biological significance of mitotic centromere-associated kinesin overexpression in human gastric cancer." Br.J Cancer 97.4 (2007): Nakayama, K., J. Qi, and Z. Ronai. "The ubiquitin ligase Siah2 and the hypoxia response." Mol.Cancer Res 7.4 (2009): Naldini, L., et al. "Hepatocyte growth factor (HG) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-met." Oncogene 6.4 (1991): Nguyen, Q. N., et al. "Light controllable sirnas regulate gene suppression and phenotypes in cells." Biochim.Biophys.Acta (2006): Nishio, K., et al. "Crystal structure of the de-ubiquitinating enzyme UCH37 (human UCH- L5) catalytic domain." Biochem.Biophys.Res Commun (2009): Nojima, H., et al. "QGAP3 regulates cell proliferation through the Ras/ERK signalling cascade." Nat.Cell Biol (2008): Nomura, H., et al. "Enhanced production of matrix metalloproteinases and activation of matrix metalloproteinase 2 (gelatinase A) in human gastric carcinomas." nt J Cancer 69.1 (1996): Nomura, H., et al. "Network-based analysis of calcium-binding protein genes identifies Grp94 as a target in human oral carcinogenesis." Br.J Cancer 97.6 (2007): Ohnuma, S., et al. "Cancer-associated splicing variants of the CDCA1 and MSMB genes expressed in cancer cell lines and surgically resected gastric cancer tissues." Surgery (2009): Park, Y. H., et al. "Capecitabine in combination with Oxaliplatin (XELOX) as a first-line therapy for advanced gastric cancer." Cancer Chemother.Pharmacol. (2007). Pascolo, S., et al. "The non-classical HLA class molecule HE does not influence the NKlike activity contained in fresh human PBMCs and does not interact with NK cells." nt.mmunol (2005): Peel, N., et al. "Overexpressing centriole-replication proteins in vivo induces centriole overduplication and de novo formation." Curr.Biol (2007): Pereira, M. B., et al. "mmunohistochemical study of the expression of MUC5AC and MUC6 in breast carcinomas and adjacent breast tissues." J Clin Pathol (2001):

126 Pietra, G., et al. "Natural killer cells kill human melanoma cells with characteristics of cancer stem cells." nt mmunol (2009): Poller, D. N., et al. "Production and characterization of a polyclonal antibody to the c-erbb- 3 protein: examination of c-erbb-3 protein expression in adenocarcinomas." J Pathol (1992): Pons, E., C. C. Uphoff, and H. G. Drexler. "Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in human leukemia-lymphoma cell lines." Leuk.Res (1998): Ponzetto, C., et al. "A novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase binding mediates its association with the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor." Mol.Cell Biol (1993): Poppe, M., et al. "Phosphorylation of Helicobacter pylori CagA by c-abl leads to cell motility." Oncogene (2007): Pytel, D., et al. "Tyrosine kinase blockers: new hope for successful cancer therapy." Anticancer Agents Med Chem. 9.1 (2009): Qi, J., et al. "The ubiquitin ligase Siah2 regulates tumorigenesis and metastasis by Hdependent and -independent pathways." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A (2008): Qian, C. N., et al. "Met protein expression level correlates with survival in patients with late-stage nasopharyngeal carcinoma." Cancer Res (2002): Qian, Z., et al. "Cytogenetic and genetic pathways in therapy-related acute myeloid leukemia." Chem.Biol.nteract. (2009). Ramirez, R., et al. "Over-expression of hepatocyte growth factor/scatter factor (HG/S) and the HG/S receptor (cmet) are associated with a high risk of metastasis and recurrence for children and young adults with papillary thyroid carcinoma." Clin Endocrinol.(Oxf) 53.5 (2000): Rammensee, H. G., et al. "SYPETH: database for MHC ligands and peptide motifs." mmunogenetics (1999): Rammensee, H. G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany, Rappa, G., O. odstad, and A. Lorico. "The stem cell-associated antigen CD133 (Prominin- 1) is a molecular therapeutic target for metastatic melanoma." Stem Cells (2008): Richardson, G. D., et al. "CD133, a novel marker for human prostatic epithelial stem cells." J Cell Sci. 117.Pt 16 (2004):

127 Rini, B.., et al. "Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy." Cancer (2006): Rodrigues-Martins, A., et al. "Revisiting the role of the mother centriole in centriole biogenesis." Science (2007): Rosenberg, S. A., et al. "A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone." N.Engl.J.Med (1987): Rosenberg, S. A., et al. "Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report." N.Engl.J Med (1988): Rott, R., et al. "Monoubiquitylation of alpha-synuclein by seven in absentia homolog (SAH) promotes its aggregation in dopaminergic cells." J Biol.Chem (2008): Rutella, S., et al. "Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors." Clinical Cancer Research (2009): Saiki, R. K., et al. "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science (1988): Samant, G. V. and P. W. Sylvester. "gamma-tocotrienol inhibits ErbB3-dependent P3K/Akt mitogenic signalling in neoplastic mammary epithelial cells." Cell Prolif (2006): Sanidas, E. E., et al. "Expression of the c-erbb-3 gene product in gastric cancer." nt J Cancer 54.6 (1993): Scott, G. K., et al. "Coordinate suppression of ERBB2 and ERBB3 by enforced expression of micro-rna mir-125a or mir-125b." J Biol.Chem (2007): Sergina, N. V., et al. "Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive HER3." Nature (2007): Shah, M., et al. "nhibition of Siah2 ubiquitin ligase by vitamin K3 (menadione) attenuates hypoxia and MAPK signaling and blocks melanoma tumorigenesis." Pigment Cell Melanoma Res 22.6 (2009): Shapiro, G.. "Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment." J Clin Oncol (2006):

128 Sherman-Baust, C. A., et al. "Remodeling of the extracellular matrix through overexpression of collagen V contributes to cisplatin resistance in ovarian cancer cells." Cancer Cell 3.4 (2003): Sheu, M. L., S. H. Liu, and K. H. Lan. "Honokiol induces calpain-mediated glucoseregulated protein-94 cleavage and apoptosis in human gastric cancer cells and reduces tumor growth." PLoS.ONE (2007): e1096. Shimo, A., et al. "nvolvement of kinesin family member 2C/mitotic centromere-associated kinesin overexpression in mammary carcinogenesis." Cancer Sci (2008): Singh, S. K., et al. "dentification of a cancer stem cell in human brain tumors." Cancer Res (2003): Singh, S. K., et al. "dentification of human brain tumour initiating cells." Nature (2004): Sithanandam, G. and L. M. Anderson. "The ERBB3 receptor in cancer and cancer gene therapy." Cancer Gene Ther (2008): Sithanandam, G., et al. "nactivation of ErbB3 by sirna promotes apoptosis and attenuates growth and invasiveness of human lung adenocarcinoma cell line A549." Oncogene (2005): Skawran, B., et al. "Gene expression profiling in hepatocellular carcinoma: upregulation of genes in amplified chromosome regions." Mod.Pathol (2008): Slesak, B., et al. "Expression of epidermal growth factor receptor family proteins (EGR, c-erbb-2 and c-erbb-3) in gastric cancer and chronic gastritis." Anticancer Res 18.4A (1998): Small, E. J., et al. "Placebo-controlled phase trial of immunologic therapy with sipuleucel-t (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer." J Clin Oncol (2006): Smith, L. M., et al. "CD133/prominin-1 is a potential therapeutic target for antibody-drug conjugates in hepatocellular and gastric cancers." Br.J Cancer 99.1 (2008): Smith, M. J., et al. "Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification." Br.J Cancer (2009): Smogorzewska, A., et al. "dentification of the ANC protein, a monoubiquitinated ANCD2 paralog required for DNA repair." Cell (2007): Staehler, M., Stenzl, A., Dietrich, P. Y., Eisen, T., Haferkamp, A., Beck, J., Mayer, A., Walter, S., Singh-Jasuja, H., and Stief, C. A phase study to evaluate safety, immunogenicity and anti-tumor activity of the multi-peptide vaccine MA901 in renal cell

129 carcinoma patients (RCC). Journal of Clinical Oncology, 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings Part Vol 25, No. 18S (June 20 Supplement), 2007: Ref Type: Abstract Stemmann, O., et al. "Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase." Cell (2001): Suetsugu, A., et al. "Characterization of CD133+ hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells." Biochem.Biophys.Res.Commun (2006): Suva, M. L., et al. "dentification of Cancer Stem Cells in Ewing's Sarcoma." Cancer Research (2009). Swallow, C. J., et al. "Sak/Plk4 and mitotic fidelity." Oncogene 24.2 (2005): Szczepanowski, M., et al. "Regulation of repp86 stability by human Siah2." Biochem.Biophys.Res Commun (2007): Tajima, Y., et al. "Gastric and intestinal phenotypic marker expression in early differentiated-type tumors of the stomach: clinicopathologic significance and genetic background." Clinical Cancer Research (2006): Takaishi, S., et al. "dentification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44." Stem Cells 27.5 (2009): Takayama, H., et al. "Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94.2 (1997): Teofili, L., et al. "Expression of the c-met proto-oncogene and its ligand, hepatocyte growth factor, in Hodgkin disease." Blood 97.4 (2001): Thorsen, K., et al. "Alternative splicing in colon, bladder, and prostate cancer identified by exon array analysis." Mol.Cell Proteomics. 7.7 (2008): Tirino, V., et al. "The role of CD133 in the identification and characterisation of tumourinitiating cells in non-small-cell lung cancer." Eur.J Cardiothorac.Surg 36.3 (2009): Todaro, M., et al. "Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4." Cell Stem Cell 1.4 (2007): Topol, L., et al. "Wnt-5a inhibits the canonical Wnt pathway by promoting GSK-3- independent beta-catenin degradation." J Cell Biol (2003): Toribara, N. W., et al. "Human gastric mucin. dentification of a unique species by expression cloning." J Biol.Chem (1993): Tsan, M.. and B. Gao. "Heat shock protein and innate immunity." Cell Mol.mmunol. 1.4 (2004):

130 Tuck, A. B., et al. "Coexpression of hepatocyte growth factor and receptor (Met) in human breast carcinoma." Am.J.Pathol (1996): Vairaktaris, E., et al. "Association of promoter polymorphism of matrix metalloproteinase-3 with increased risk for oral cancer." Anticancer Res 27.6B (2007): Vandenbroeck, K., E. Martens, and. Alloza. "Multi-chaperone complexes regulate the folding of interferon-gamma in the endoplasmic reticulum." Cytokine 33.5 (2006): Walter, S., et al. "Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres." J.mmunol (2003): Wang, Q., et al. "Overexpression of endoplasmic reticulum molecular chaperone GRP94 and GRP78 in human lung cancer tissues and its significance." Cancer Detect.Prev (2005): Wang, R., et al. "Activation of the Met receptor by cell attachment induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice." J.Cell Biol (2001): Wang, R. Q. and D. C. ang. "Effects of Helicobacter pylori infection on mucin expression in gastric carcinoma and pericancerous tissues." J Gastroenterol.Hepatol (2006): Wang, S., et al. "QGAP3, a novel effector of Rac1 and Cdc42, regulates neurite outgrowth." J Cell Sci. 120.Pt 4 (2007): Wang, X., et al. "mmunolocalisation of heat shock protein 72 and glycoprotein 96 in colonic adenocarcinoma." Acta Histochem (2008): Wang, X. P., et al. "Expression and significance of heat shock protein 70 and glucoseregulated protein 94 in human esophageal carcinoma." World J Gastroenterol (2005): Wang, X. P., et al. "Correlation between clinicopathology and expression of heat shock protein 70 and glucose-regulated protein 94 in human colonic adenocarcinoma." World J Gastroenterol (2005): Wang, X. P., Q. X. Wang, and X. P. Ying. "Correlation between clinicopathology and expression of heat shock protein 72 and glycoprotein 96 in human gastric adenocarcinoma." Tohoku J Exp.Med (2007): Weinschenk, T., et al. "ntegrated functional genomics approach for the design of patientindividual antitumor vaccines." Cancer Res (2002): White, C. D., M. D. Brown, and D. B. Sacks. "QGAPs in cancer: a family of scaffold proteins underlying tumorigenesis." EBS Lett (2009):

131 Wicks, S. J., et al. "Reversible ubiquitination regulates the Smad/TG-beta signalling pathway." Biochem.Soc Trans. 34.Pt 5 (2006): Wicks, S. J., et al. "The deubiquitinating enzyme UCH37 interacts with Smads and regulates TG-beta signalling." Oncogene (2005): Yajima, S., et al. "Expression profiling of fecal colonocytes for RNA-based screening of colorectal cancer." nt J Oncol 31.5 (2007): Yang, L., et al. "L-21 and TG-beta are required for differentiation of human T(H)17 cells." Nature (2008). Yang, S., et al. "Molecular basis of the differences between normal and tumor tissues of gastric cancer." Biochim.Biophys.Acta (2007): Yao, D.., et al. "Abnormal expression of HSP gp96 associated with HBV replication in human hepatocellular carcinoma." Hepatobiliary.Pancreat.Dis.nt 5.3 (2006): Yasui, W., et al. "ncreased expression of p34cdc2 and its kinase activity in human gastric and colonic carcinomas." nt J Cancer 53.1 (1993): Yee, C., et al. "Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A (2002): Yin, S., et al. "CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity." nt.j Cancer (2007): Yokozaki, H., W. Yasui, and E. Tahara. "Genetic and epigenetic changes in stomach cancer." nt Rev.Cytol. 204 (2001): Yuan, W., et al. "Expression of EphA2 and E-cadherin in gastric cancer: correlated with tumor progression and lymphogenous metastasis." Pathol.Oncol Res 15.3 (2009): Yuan, W. J., et al. "Over-expression of EphA2 and EphrinA-1 in human gastric adenocarcinoma and its prognostic value for postoperative patients." Dig.Dis.Sci (2009): Zaremba, S., et al. "dentification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen." Cancer Res (1997): Zhang, X., R. M. Kedl, and J. Xiang. "CD40 ligation converts TG-beta-secreting tolerogenic CD4-8- dendritic cells into L-12-secreting immunogenic ones." Biochem.Biophys.Res Commun (2009): Zhang, X. L., et al. "Comparative study on overexpression of HER2/neu and HER3 in gastric cancer." World J Surg (2009):

132 Zhao, C., et al. "Hedgehog signalling is essential for maintenance of cancer stem cells in myeloid leukaemia." Nature (2009). Zheng, H., et al. "Cell surface targeting of heat shock protein gp96 induces dendritic cell maturation and antitumor immunity." J mmunol (2001): Zheng, H., et al. "MUC6 down-regulation correlates with gastric carcinoma progression and a poor prognosis: an immunohistochemical study with tissue microarrays." J Cancer Res Clin Oncol (2006): Zheng, H. C., et al. "Overexpression of GRP78 and GRP94 are markers for aggressive behavior and poor prognosis in gastric carcinomas." Hum.Pathol (2008): Zhou, G., et al. "2D differential in-gel electrophoresis for the identification of esophageal scans cell cancer-specific protein markers." Mol.Cell Proteomics. 1.2 (2002): Zhou, L., et al. "TG-beta-induced oxp3 inhibits T(H)17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function." Nature (2008): Zhu, K. J., et al. "miquimod inhibits the differentiation but enhances the maturation of human monocyte-derived dendritic cells." nt mmunopharmacol. 9.4 (2009):

133 EP EP Patendinõudlus 1. Peptiid, mille üldine pikkus on 10 kuni 14 aminohapet, mis koosneb järjestusest, mis on valitud rühmast, mis hõlmab a) SEQ D nr 1 sisaldavat järjestust, b) SEQ D nr 1 varianti, mis kutsub esile T-rakkude ristreageerimist leiutise peptiidiga, kus asjaomane variant on valitud järjestusi LQLQGV, LYQLQGVL, LYQLQGV, LQLQGVL ja LQLQGV sisaldavast rühmast. 2. Käesoleva leiutise patendinõudluse punktile 1 vastaval peptiidil on võime seostuda inimese peamise koesobivuskompleksi (MHC) klassi molekuliga. 3. Patendinõudluse punktis 1 või 2 esitatud peptiid, kus peptiid sisaldab mittepeptiidseid sidemeid. 4. Peptiid vastavalt mis tahes punktile 1 kuni 3, milles nimetatud peptiid on liitvalgu osa, mis sisaldab eelkõige HLA-DR antigeeniga seotud muutumatu ahela (i) N-terminaalseid aminohappeid. 5. Nukleiinhape, mis kodeerib peptiidi vastavalt mis tahes punktile 1 kuni 4, tingimusel, et peptiid pole täielik inimese valk, kus eelistuslikult asjaomane nukleiinhape on DNA, cdna, PNA, RNA või nende kombinatsioon või ekspressioonivektor, mis asjaomast nukleiinhapet ekspresseerib. 6. Peptiid vastavalt mis tahes punktile 1 kuni 4 või nukleiinhape või ekspressioonivektor vastavalt punktile 5 kasutamiseks meditsiinis. 7. Peremeesrakk, mis sisaldab nukleiinhapet või ekspressioonivektorilt vastavalt punktile 5, mis on antigeeni esitav rakk. 8. Vastavalt mis tahes punktile 1 kuni 4 vastava peptiidi valmistamise meetod, milles meetod sisaldab punktile 7 vastava peremeesraku kultiveerimist ja peptiidi eraldamist peremeesrakust või selle kultiveerimise söötmest.

134 n vitro meetod aktiveeritud tsütotoksiliste T-lümfotsüütide (CTL) valmistamiseks, kus meetod koosneb in vitro CTLi ühendamisest antigeeniga laetud inimese MHC klassi molekulidega, mida ekspresseeritakse sobiliku antigeeni esitava raku pinnal ajavahemikuks, mis on piisav asjaomase CTLi aktiveerimiseks antigeenspetsiifilisel viisil, kus asjaomane antigeen on peptiid vastavalt punktile 1 või Meetod vastavalt punktile 9, kus asjaomane antigeeni esitav rakk sisaldab ekspressioonivektorit, mis ekspresseerib asjaomast peptiidi vastavalt punktile 1 või Aktiveeritud tsütotoksiline T-lümfotsüüt (CTL), mis on valmistatud vastavalt punktile 9 või 10, mis tuvastab selektiivselt punktile 1 või 2 vastava peptiidi. 12. Tsütotoksiline T-lümfotsüüt (CTL) vastavalt punktile 11, mis on mõeldud kasutamiseks vähi ravis sihtrakkude surmamisega patsiendis, kus asjaomased sihtrakud kõrvalekalduvalt esitavad peptiidi vastavalt punktile 1 või Peptiid vastavalt punktile 1 või 2, nukleiinhape või ekspressioonivektor vastavalt punktile 5, rakk vastavalt punktile 7 või aktiveeritud tsütotoksiline T-lümfotsüüt vastavalt punktile 12 kasutamiseks vähiravis, näiteks mao-, seedetrakti-, kolorektaalse, kõhunäärme-, kopsu- või neeruvähi puhul. 14. Peptiid, nukleiinhape või ekspressioonivektor, rakk või aktiveeritud tsütotoksiline T- lümfotsüüt kasutamiseks vastavalt punktile 13, kus asjaomane ravim on vaktsiin. 15. Peptiidi mitteterapeutiline kasutus vastavalt punktile 1 või 2 antikehade loomiseks ja arendamiseks, mis on spetsiifilised asjaomast peptiidi sisaldava MHC/peptiidi kompleksi vastu.

135 Lühikokkuvõte Käesolev leiutis käsitleb peptiide, nukleiinhappeid ja rakke kasutamiseks immunoteraapia meetodites. Täpsemalt käsitleb käesolev leiutis vähi immunoteraapiat. Käesolev leiutis käsitleb veel kasvajaga seotud tsütotoksiliste T-rakkude (CTL) peptiidi epitoope eraldi või koos teiste kasvajaga seotud peptiididega, mis on vaktsiinikoostiste farmatseutilisteks toimeaineteks, mis stimuleerivad kasvajavastaseid immuunvastuseid. Käesolev leiutis käsitleb 95 uut peptiidide järjestust ja nende variante, mis on saadud inimese kasvajarakkude HLA klassi molekulidest, mida võib kasutada vaktsiinikoostistes kasvajavastaste immuunvastuste esilekutsumiseks.

136 JÄRJESTUSLOETELU <110> immatics biotechnologies GmbH <120> UUS MMUNOTERAAPA MTMETE KASVAJATE VASTU, SEALHULGAS SEEDETRAKT- JA MAOVÄH VASTU <130> 31890EP <150> GB <151> <150> US 61/315,704 <151> <160> 95 <170> Patentn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <400> 1 Leu Tyr Gln le Leu Gln Gly le Val Phe <210> 2 <211> 9 <400> 2 Ser Tyr Asn Pro Leu Trp Leu Arg le 1 5 <210> 3 <211> 9 <400> 3 Asn Tyr Leu Pro Phe le Met Glu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <400> 4 Ser Tyr le Asp Val Leu Pro Glu Phe

137 1 5 <210> 5 <211> 9 <400> 5 Ser Tyr le le Asp Pro Leu Asn Leu 1 5 <210> 6 <211> 10 <400> 6 Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Thr Phe <210> 7 <211> 9 <400> 7 Asn Tyr Leu Leu Tyr Val Ser Asn Phe 1 5 <210> 8 <211> 9 <400> 8 Val Tyr Thr Thr Ser Tyr Gln Gln le 1 5 <210> 9 <211> 9 <400> 9 His Tyr Lys Pro Thr Pro Leu Tyr Phe 1 5 <210> 10 <211> 10

138 <400> 10 Tyr Tyr Asn Ala Ala Gly Phe Asn Lys Leu <210> 11 <211> 9 <400> 11 Ala Tyr Leu Val Tyr Thr Asp Arg Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <400> 12 Phe Tyr le Ser Pro Val Asn Lys Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <400> 13 Val Tyr Gly le Arg Leu Glu His Phe 1 5 <210> 14 <211> 9 <400> 14 Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <400> 15

139 Asn Tyr Glu Glu Thr Phe Pro His le 1 5 <210> 16 <211> 9 <400> 16 Arg Tyr Leu Trp Ala Thr Val Thr le 1 5 <210> 17 <211> 9 <400> 17 Val Tyr Phe Ser Lys Ser Glu Gln Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <400> 18 Val Phe le Phe Lys Gly Asn Gln Phe 1 5 <210> 19 <211> 9 <400> 19 Arg Phe Leu Ser Gly le le Asn Phe 1 5 <210> 20 <211> 9 <400> 20 Gln Tyr Ala Ser Arg Phe Val Gln Leu 1 5 <210> 21

140 <211> 9 <400> 21 Lys Tyr Leu Thr Val Lys Asp Tyr Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <400> 22 Val Tyr Asn Pro Thr Pro Asn Ser Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <400> 23 Ser Tyr Leu Gln Ala Ala Asn Ala Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <400> 24 Phe Tyr Gln Pro Lys le Gln Gln Phe 1 5 <210> 25 <211> 9 <400> 25 Tyr Tyr Lys Asn le Gly Leu Gly Phe 1 5 <210> 26 <211> 9 <400> 26

141 Ala Tyr Ala le le Lys Glu Glu Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <400> 27 Leu Tyr Pro Glu Val Phe Glu Lys Phe 1 5 <210> 28 <211> 10 <400> 28 Lys Tyr Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe <210> 29 <211> 10 <400> 29 Val Phe Asp Thr Ala le Ala His Leu Phe <210> 30 <211> 9 <400> 30 Val Tyr Pro Asn Trp Ala le Gly Leu 1 5 <210> 31 <211> 9 <400> 31 Val Tyr Lys Val Val Gly Asn Leu Leu 1 5

142 <210> 32 <211> 9 <400> 32 Val Tyr le Glu Lys Asn Asp Lys Leu 1 5 <210> 33 <211> 10 <400> 33 le Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu Leu <210> 34 <211> 9 <400> 34 Gln Tyr le Asp Lys Leu Asn Glu Leu 1 5 <210> 35 <211> 11 <400> 35 Met Tyr Met Thr Val Ser le le Asp Arg Phe <210> 36 <211> 9 <400> 36 Arg Tyr Leu Pro Gln Cys Ser Tyr Phe 1 5 <210> 37 <211> 9

143 <400> 37 le Tyr Ala Pro Lys Leu Gln Glu Phe 1 5 <210> 38 <211> 9 <400> 38 le Tyr Pro Asp Ala Ser Leu Leu le 1 5 <210> 39 <211> 9 <400> 39 Val Tyr Leu Leu Asn Ser Thr Thr Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <400> 40 le Tyr Leu Glu Val le His Asn Leu 1 5 <210> 41 <211> 9 <400> 41 Ala Tyr Pro Thr Val Lys Phe Tyr Phe 1 5 <210> 42 <211> 9 <400> 42 le Phe Ser Lys le Val Ser Leu Phe 1 5

144 <210> 43 <211> 9 <400> 43 Tyr Tyr Tyr Val Gly Phe Ala Tyr Leu 1 5 <210> 44 <211> 9 <400> 44 Arg Tyr Leu Glu Gly Thr Ser Cys le 1 5 <210> 45 <211> 11 <400> 45 Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe <210> 46 <211> 9 <400> 46 Ser Tyr Ala Thr Leu Leu His Val Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <400> 47 Asp Tyr Thr le Gly Phe Gly Lys Phe 1 5 <210> 48 <211> 9

145 <400> 48 Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe 1 5 <210> 49 <211> 9 <400> 49 Ser Tyr Leu Glu Leu Val Lys Ser Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <400> 50 Ser Tyr Gln Lys Val le Glu Leu Phe 1 5 <210> 51 <211> 9 <400> 51 Leu Tyr Leu Glu Asn le Asp Glu Phe 1 5 <210> 52 <211> 9 <400> 52 Val Tyr le Ser Ser Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 53 <211> 11 <400> 53 Arg Tyr Leu Pro Lys Gly Phe Leu Asn Gln Phe

146 <210> 54 <211> 9 <400> 54 Tyr Tyr Lys Asn le Gly Leu Gly Phe 1 5 <210> 55 <211> 9 <400> 55 Val Tyr Thr Thr Met Ala Glu His Phe 1 5 <210> 56 <211> 9 <400> 56 Asp Tyr Ala Tyr Leu Arg Glu His Phe 1 5 <210> 57 <211> 10 <400> 57 Leu Tyr le Gln Thr Asp His Leu Phe Phe <210> 58 <211> 10 <400> 58 Thr Tyr Lys Tyr Val Asp le Asn Thr Phe <210> 59 <211> 9

147 <400> 59 Tyr Phe le Ser His Val Leu Ala Phe 1 5 <210> 60 <211> 9 <400> 60 Val Tyr Thr Lys Val Ser Ala Tyr Leu 1 5 <210> 61 <211> 9 <400> 61 Val Tyr Lys Glu Thr Cys le Ser Phe 1 5 <210> 62 <211> 9 <400> 62 Ala Leu Tyr Asp Ser Val le Leu Leu 1 5 <210> 63 <211> 9 <400> 63 Lys le Gln Glu le Leu Thr Gln Val 1 5 <210> 64 <211> 9 <400> 64 Leu Ala Asp Glu Thr Leu Leu Lys Val

148 1 5 <210> 65 <211> 9 <400> 65 Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val 1 5 <210> 66 <211> 9 <400> 66 Tyr Val Tyr Gln Asn Asn le Tyr Leu 1 5 <210> 67 <211> 9 <400> 67 Val Leu Glu Asp Leu Glu Val Thr Val 1 5 <210> 68 <211> 9 <400> 68 Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val 1 5 <210> 69 <211> 9 <400> 69 Asn Leu Leu Asp Leu Asp Tyr Glu Leu 1 5 <210> 70 <211> 9

149 <400> 70 Phe Leu le Asp Ser Ser Glu Gly Val 1 5 <210> 71 <211> 9 <400> 71 Ala Leu Asp Glu Gly Asp le Ala Leu 1 5 <210> 72 <211> 11 <400> 72 Ala Leu Asn Glu Glu Ala Gly Arg Leu Leu Leu <210> 73 <211> 9 <400> 73 le Leu Ser Pro Thr Val Val Ser le 1 5 <210> 74 <211> 9 <400> 74 Lys Leu Leu Thr Glu Val His Ala Ala 1 5 <210> 75 <211> 9 <400> 75

150 Ala Leu Val Gln Asp Leu Ala Lys Ala 1 5 <210> 76 <211> 9 <400> 76 le Leu Gln Asp Arg Leu Asn Gln Val 1 5 <210> 77 <211> 9 <400> 77 Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu 1 5 <210> 78 <211> 9 <400> 78 Thr Leu Asp Asp Leu Leu Leu Tyr le 1 5 <210> 79 <211> 11 <400> 79 Ser Leu Leu Ala Gln Asn Thr Ser Trp Leu Leu <210> 80 <211> 9 <400> 80 Ser Leu Ala Glu Val Asn Thr Gln Leu 1 5 <210> 81

151 <211> 9 <400> 81 Ala Leu Asp Gly Phe Val Met Val Leu 1 5 <210> 82 <211> 9 <400> 82 Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu 1 5 <210> 83 <211> 9 <400> 83 Tyr Val Asp Pro Val le Thr Ser le 1 5 <210> 84 <211> 9 <400> 84 Tyr Leu Leu Ser Tyr le Gln Ser le 1 5 <210> 85 <211> 9 <400> 85 Gln le Asp Asp Val Thr le Lys le 1 5 <210> 86 <211> 10 <400> 86

152 Tyr Leu Tyr Gly Gln Thr Thr Thr Tyr Leu <210> 87 <211> 9 <400> 87 Lys Leu Asp Glu Thr Gly Asn Ser Leu 1 5 <210> 88 <211> 9 <400> 88 Arg Leu Asp Asp Leu Lys Met Thr Val 1 5 <210> 89 <211> 9 <400> 89 Leu Thr Asp Glu le Leu Thr Tyr Val 1 5 <210> 90 <211> 9 <400> 90 le Leu le Asp Trp Leu Val Gln Val 1 5 <210> 91 <211> 10 <400> 91 Val Leu Tyr Gly Pro Asp Val Pro Thr le

153 <210> 92 <211> 11 <400> 92 Ser le Phe Gly Glu Asp Ala Leu Ala Asn Val <210> 93 <211> 9 <400> 93 Lys Leu Leu Glu Tyr le Glu Glu le 1 5 <210> 94 <211> 9 <400> 94 Lys le Leu Glu Asp Val Val Gly Val 1 5 <210> 95 <211> 10 <400> 95 Lys le Phe Asp Glu le Leu Val Asn Ala

154 Joonis 1: A Relative Suhteline Abundance ohtrus Aeg Time [min] B Suhteline Relative Abundance ohtrus z= z= z= z= m/z

155 C D Suhteline Relative Abundance ohtrus Suhteline Relative Abundance ohtrus b b b9 b y y6 y b m/z b y4 y b b y b y2 b b y m/z

156 Suhteline relative ekspressioon expression adipose rasvkude tissue 8.6 adrenal neerupealis gland 0.7 artery 2.6 bone marrow luuüdi 6.5 brain, kogu peaaju whole 1.1 breast rind 7.5 käärsool colon 7.5 esophagus söögitoru 17.1 gallbladder sapipõis 2.1 heart süda 0.7 kidney neer 1.0 leukotsüüdid leukocytes 0.8 leukotsüüdid, leukocytes, dendriitilised dendritic rakud cells 0.6 maks liver 1.3 lung kops 0.7 lymph lümfisõlm node 14.9 lymphocytes, lümfotsüüdid, CD lymphocytes, lümfotsüüdid, CD kõhunääre pancreas 0.5 placenta platsenta 0.5 eesnääre prostate 0.4 salivary süljenääre gland 0.5 skeletal skeletilihas muscle 0.5 nahk skin 8.0 small intestine peensool 6.5 spleen põrn 0.5 stomach magu 1.4 munand testis 16.0 harkelund thymus 8.0 kilpnääre thyroid 0.5 hingetoru trachea 0.8 urinary kusepõis bladder 0.5 uterine emakakael cervix 4.0 emakas uterus 0.6 veen vein 17.1 GC2215T 26.0 GC2228M GC2230T GC2234T GC2419T 21.1 GC2423T 64.0 GC2424T GC2426T 68.6 GC2427T 42.2 GC2428T 84.4 GC2430T 48.5 GC2432T 29.9 GC2433T 52.0 GC2435T GC2436T 90.5 GC2437T GC2447T GC2448T 55.7 GC2449T 17.1 GC2451T GC2461T 36.8 GC2466T 52.0 GC702T 97.0 GC703T GC705T A A A A A A A P A A A A A A A P A A A A A A A P A A A M A A A A A A P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P b) adipose rasvkude tissue adrenal neerupealis gland artery bone marrow luuüdi brain, kogu peaaju whole breast rind käärsool colon esophagus söögitoru gallbladder sapipõis heart süda kidney neer leukotsüüdid leukocytes leukotsüüdid, leukocytes, dendriitilised dendritic rakud cells maks liver lung kops lymph lümfisõlm node lymphocytes, lümfotsüüdid, CD19+ lymphocytes, lümfotsüüdid, CD3+ kõhunääre pancreas placenta platsenta eesnääre prostate salivary süljenääre gland skeletal skeletilihas muscle nahk skin small intestine peensool spleen põrn stomach magu munand testis harkelund thymus kilpnääre thyroid hingetoru trachea urinary kusepõis bladder uterine emakakael cervix emakas uterus veen vein GC2215T GC2228M GC2230T GC2234T GC2419T GC2423T GC2424T GC2426T GC2427T GC2428T GC2430T GC2432T GC2433T GC2435T GC2436T GC2437T GC2447T GC2448T GC2449T GC2451T GC2461T GC2466T GC702T GC703T GC705T Suhteline relative ekspressioon expression P A A P A A P P P A A A P A P P A A A P A A A P P P A P P A A A P A P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P a) Joonis 2:

157 Joonis 3: A*2402/CDC2-001 A*2402/Negative Negatiivse control kontrolli stimulation stimuleerimine A*2402/ASPM-002 multimer multimeer A*2402/Negative Negatiivse control kontrolli multimer multimeer A*2402/CDC2-001 multimeer multimer A*2402/ASPM-002 A*2402/Negative Negatiivse control kontrolli stimulation stimuleerimine A*2402/Negative Negatiivse control kontrolli multimer multimeer