Sandra Vujević. IZRAŽAJ GENA RNazeH2A U UROTELNIM TUMORIMA MOKRAĆNOG MJEHURA. Završni rad. Doc. dr. sc. Vedrana Čikeš Čulić. Split, 2014.

Transcription

1 SVEUČILIŠTE U SPLITU Podružnica SVEUČILIŠNI ODJEL ZDRAVSTVENIH STUDIJA PREDDIPLOMSKI SVEUČILIŠNI STUDIJ MEDICINSKO LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA Sandra Vujević IZRAŽAJ GENA RNazeH2A U UROTELNIM TUMORIMA MOKRAĆNOG MJEHURA Završni rad Mentor: Doc. dr. sc. Vedrana Čikeš Čulić Split, 2014.

2 Sadržaj 1. UVOD Mokraćni mjehur Histološka građa mokraćnog mjehura Zloćudni tumori mokraćnog mjehura Čimbenici rizika za nastanak karcinoma mokraćnog mjehura Stupnjevanje bolesti Gradus tumora mokraćnog mjehura RNaze (Ribonukleaze) RNazaH Funkcija RNazaH Uloga RNaze H2A i povezanost s karcinomom HIPOTEZA Cilj istraživanja MATERIJALI I METODE Ispitanici i uzorci Postupak izolacije RNA iz tkiva Sinteza cdna Postupak sinteze cdna Kvantitativna PCR reakcija u stvarnom vremenu (qrt-pcr) Test efikasnosti primera (engl. Primer efficiency test) Standardna krivulja efikasnosti početnica RNazeH2A Obrada podataka REZULTATI... 22

3 5. RASPRAVA ZAKLJUČCI SAŽETAK SUMMARY ŽIVOTOPIS LITERATURA... 36

4 Završni rad izrađen je u Laboratoriju za istraživanje raka medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu pod vodstvom mentorice doc. dr. sc. Vedrane Čikeš Čulić.

5 Zahvala Najiskrenije zahvaljujem mentorici doc. dr. sc. Vedrani Čikeš Čulić, koja mi je savjetima, iskustvom i potporom omogućila izradu ovoga završnog rada. Posebno zahvaljujem prof. dr. sc. Janošu Terziću bez čije podrške, susretljivosti i strpljenja sve ovo ne bi bilo moguće. Hvala kolegama s Katedre za imunologiju i medicinsku genetiku. Najveće hvala mojoj obitelji!

6 1. UVOD 1

7 1.1. Mokraćni mjehur Mokraćni mjehur (lat. vesica urinaria) šuplji je mišićni organ koji je smješten u zdjelici, a služi kao spremnik za mokraću (urin) koja nastaje u bubrezima (Slika 1.). Mokraća iz bubrega dolazi mokraćovodima (lat. ureter), a iz mjehura odlazi kroz mokraćna cijev (lat. urethra). Na mokraćnom mjehuru razlikujemo: vrh, bazu i srednji dio. Ispred mjehura je simfiza preponske kosti, a iza se nalazi zadnje crijevo kod muškarca (lat. rectum), te maternica i rodnica kod žena. Slika 1. Shematski prikaz mokraćnog mjehura muškarca Histološka građa mokraćnog mjehura Presjek kroz stijenku mokraćnog mjehura otkriva da je građen od četiri sloja. Unutrašnji sloj čini tzv. prijelazni epitel ili urotela ispod kojeg se nalazi submukoza (lat. lamina muskularis) koju čini sloj rahlog vezivno-mišićnog tkiva. Najdeblji dio stjenke mokraćnog mjehura je mišićni sloj (lat. lamina muskularis propria) kojeg s vanjske strane prekriva seroza (adventicija) (Slika 2.). Navedena građa stijenke mjehura koristi se za stupnjevanje malignih tumora i to pri postavljanju dijagnoze, donošenju terapijskih odluka kao i u prognostičke svrhe (1,2). 2

8 Epitel mokraćnog mjehura svojim izgledom dijelom podsjeća na nekeratinizirajući višeslojni pločasti i cilindrični epitel, koji histolozi urotel. Debljina urotela u mnogome ovisi o stupnju rastegnutosti mokraćnog mjehura, gdje u maksimalno distendiranom mjehuru urotel sadrži svega 2-3 sloja spljoštenih stanica, dok se u kontrahiranom stanju nalazi 7-8 slojeva stanica. U kontrahiranom stanju prijelazni epitel može se podijeliti na sloj površinskih, intermedijarnih i bazalnih stanica (3). Slika 2. Presjek kroz stijenku mokraćnog mjehura. Vide se slojevi mokraćnog mjehura: prijelazni epitel, lamina proprija, i glatki mišić. (Preuzeto sa stranice; Zloćudni tumori mokraćnog mjehura Karcinom mokraćnog mjehura je najčešći maligni tumor mokraćnog sustava (4). U muškaraca je trostruko češći, te se pojavljuje ranije nego u žena (69 prema 71 godina) (5). Karcinom mokraćnog mjehura nije homogena bolest već uključuje površinsku, invazivnu te metastatsku bolest od kojih svaka ima drugačiju kliničku sliku, prognozu i liječenje Čimbenici rizika za nastanak karcinoma mokraćnog mjehura Najvažnijim čimbenikom rizika za nastanak karcinoma mokraćnog mjehura smatra se izlaganje određenim kemijskim karcinogenima (anilinskim bojama, benzidinu te aromatskim aminima). Navedene karcinogene uglavnom susrećemo u kemijskoj 3

9 industriji, industriji obradi kože i metala, gume, tiskarama, pogonima koji koriste boje, laboratorijima zubne tehnike, salonima za uljepšavanje itd. Karcinom mokraćnog mjehura smatra se jednim od najbolje poznatih tzv. industrijskih karcinoma. Vrijeme djelovanja kemijskog karcinogena potrebno da se razvije maligna bolest (vrijeme latencije) je vrlo dugo i iznosi godina (6). Pored navedenog, kao rizični čimbenik treba napomenuti i pušenje cigareta koje se dovodi u uzročnu vezu s nastankom raka mokraćnog mjehura još od 60-tih godina prošlog stoljeća (7). Nasljedni čimbenici nemaju značajniju ulogu u nastanku raka mokraćnog mjehura. Prema istraživanju Kiemeney i sur. relativni rizik pojave raka mjehura među islanđanima bio je viši u drugoj i trećoj generaciji nego u prvoj, što upućuje na malu ulogu nasljednih čimbenika u ovoj bolesti (8) Klinička slika i dijagnostika Dijagnoza se često kasno postavi jer simptomi nalikuju benignim stanjima poput mokraćnih infekcija, upale prostate ili kamenca, a znaju biti i povremeni. Bezbolna, spontana pojava krvi u mokraći (hematurija) najčešći je znak tumora mokraćnog mjehura i u 85% slučajeva predstavlja prvi simptom (4). Sljedeći simptom je bol, koja nastaje kao rezultat lokalno ili metastatski uznapredovanog tumora i povezana je s veličinom i lokacijom tumora i/ili metastaza. Smetnje prilikom mokrenja mogu biti posljedica funkcionalnog smanjenja kapaciteta mjehura, pretjerane aktivnosti mišića, invazije donjeg dijela mjehura ili začepljenja izlaza mjehura. Ti se simptomi javljaju u trećine pacijenata, a uključuju: učestalo mokrenje tijekom dana i/ili noći, hitna potreba za mokrenjem, otežano mokrenje, nekontrolirano mokrenje, isprekidan mlaz mokraće, noćno mokrenje, slab mlaz mokraće, te osjećaj nepotpunog pražnjenja mjehura. Opći simptomi su umor, gubitak tjelesne mase, gubitak apetita i obično su znaci uznapredovale bolesti, te pokazatelji loše prognoze (9). Osim kliničkih znakova i nalaza mikrohematurije u sedimentu urina, dijagnostika se temelji na citološkom pregledu sedimenta urina, cistoskopiji i transuretralnoj resekciji (TUR), te patohistološkoj analizi tumorskog tkiva. Radiološke pretrage uključuju intravensku urografiju koja se posljednjih godina sve više zamjenjuje kompjutoriziranom tomografijom (CT). 4

10 Stupnjevanje bolesti Procjena stadija karcinoma mokraćnog mjehura od strane patologa temelji se na TNM sustavu objavljenom od Međunarodne organizacije za borbu protiv raka (UICC). TUMOR Tx: Tumor se ne može procijeniti T0: Nema dokaza tumora Ta: Neinvazivni papilarni karcinom Tis: Karcinom in situ T1: Invazija tumora u subepitelno tkivo T2: Invazija tumora u mišićni sloj mjehura T3: Invazija tumora u perivezikalno tkivo T4: Invazija tumora u okolne organe ili stjenke zdjelice NODUS (limfni čvor) Nx: Regionalni limfni čvorovi se ne mogu procijeniti N0: Nema metastaza u regionalne limfne čvorove N1: Metastaze u 1 limfnom čvoru čiji je promjer 2 cm N2: Metastaze u 1 limfnom čvoru s promjerom do 5 cm N3: Metastaze u 1 limfnom čvoru s promjerom > 5 cm METASTAZE Mx: širenje karcinoma se ne može procijeniti M0: Nema udaljenih metastaza M1: Dokazano postojanje udaljenih metastaza 5

11 Masno tkivo Mišić Vezivno tkivo Prijelazni epitel ili ili urotel urotel Porast invazivnosti tumora Slika 3. Stadiji tumora mokraćnog mjehura (Preuzeto iz CancerHelp Velika Britanija). Približno 90% svih tumora mokraćnog mjehura su karcinomi prijelaznih stanica (tranzitocelularni ili urotelialni karcinom, TCC), otprilike 5% otpada na skvamozni karcinom (SCC) i 2% na adenokarcinom (10). Obično se tumori stadija Ta, Tis i T1 nazivaju površinskima ili onima koji ne prodiru u mišićni sloj. Oko 75-80% bolesnika s tumorom mokraćnog mjehura ima površinski karcinom dok ostatak boluje od invazivnog karcinoma. Tako stadij Ta predstavlja neinvazivni papilarni tumor. Tis je plosnati tumor ograničen na epitel. T1 stadij tumora je ograničen na podsluznicu i/ili laminu propriju. Od navedenog postotka površinskih karcinoma oko 70% čini Ta stadij, 20% T1 i 10% karcinom in situ (CIS,Tis). Invazivni tumori, tj. oni koji prodiru u mišićni sloj su T2, T3 i T4 (Slika 3.). T2 stadij tumora prodire u mišićni sloj i ne prelazi granice mokraćnog mjehura. T3 invadira u okolno perivezivno tkivo, te eventualno u prostatu u muškaraca ili maternicu i vaginu u žena. Stadij T4 je tumor proširen na stjenku abdomena ili zdjelice, te eventualno na limfne čvorove i druge udaljene dijelove tijela, npr. pluća (11). 6

12 Gradus tumora mokraćnog mjehura Osim sustava TNM, u dijagnostičke, prognostičke i terapijske svrhe koristi se i određivanje gradusa tumora prema stupnju diferenciranosti, odnosno prema stupnju nalikovanja na normalno tkivo. Tradicionalno se tumor mjehura klasificira prema stupnju diferenciranosti (engl. grading) stupnjevanjem po WHO (World Health Organisation) iz godine i to u tri stupnja: G1: dobro diferencirani tumor G2: srednje diferencirani tumor G3: loše diferencirani tumor Tumori mokraćnog mjehura pokazuju ogromne heterogenosti što se očituje različitim morfološkim i molekularnim promjenama povezanim s fenotipovima te bolesti. U posljednjih desetak godina identificirani su brojni biomarkeri tumora mokraćnog mjehura, uključujući razne tumor supresorske gene, onkogene, čimbenike rasta, receptore za čimbenike rasta, hormonske receptore, biljege proliferacije i apoptoze, molekule stanične adhezije, stromalne čimbenike i onkoproteine. Opisano je nekoliko signalnih puteva, poput p53, prb, PTEN i njihovih interakcijskih proteina, koji posreduju u razvoju invazivnog karcinoma mokraćnog mjehura (12,13). Ipak, miševi s urotelnim delecijama p53 i prb gena razvijaju kasno-nastupajuću hiperplaziju i isključivo neinvazivne papilarne tumore mokraćnog mjehura niskog gradusa (14). Zbog ograničenih vrijednosti tih prognostičkih biljega ukazuje se potreba za analiziranjem novih molekularnih parametara koji bi se koristili u klinici za otkrivanje i praćenje ove bolesti RNaze (Ribonukleaze) Ribonukleaze (RNaze) su enzimi koji razgrađuju molekule RNA na manje dijelove. Dijele se na endoribonukleaze i egzoribonukleaze koje obuhvaćaju više podklasa. Svi organizmi sadrže RNaze što ukazuje na važnost njihove funkcije. Osim uklanjanja stanične RNA kada je to potrebno, RNAza ima važnu ulogu i u sazrijevanju različitih molekula RNA kao što je glasnička RNA koja nosi genski materijal za sintezu proteina i 7

13 nekodirajuća RNA koja sudjeluje u različitim staničnim procesima. Isto tako, razgradnja molekula RNA prva je linija obrane protiv RNA virusa RNazaH Enzim RNazaH je nespecifična endonukleaza koja katalizira cijepanje RNA pomoću hidrolitičkih mehanizama. RNazaH prisutna je u gotovo svim organizmima od Archaea do bakterija i eukariota. Trodimenzionalna struktura RNazeH prikazuje da se enzim sastoji od 5 β-nabranih ploča okruženih α-uzvojnicama (Slika 4.). (15). ribonukleaza H Slika 4. Trodimenzionalni prikaz RNazeH1 E.coli Ribonukleazna aktivnost RNazeH očituje se u cijepanju 3'-O-p veze (fosfo-di-esterska veza) RNA u RNA/DNA hibridu, te nastajanju 3'-hidroksila i 5'-fosfata kao krajnjih produkata. Neke RNazeH, kao što je ona pronađena u virusu HIV-1, imaju nedostatak jedne od uzvojnica (c-uzvojnica) dok pozitivno nabijena stršeća α-uzvojnica povećava kapacitet vezanja supstrata (16) Funkcija RNazaH RNazaH specifično razgrađuje RNA u RNA/DNA hibridu i neće razgraditi DNA ili nehibridiziranu RNA, što se često koristi za uklanjanje RNA početnica prilikom sinteze cdna. RNazaH se također koristi za razgradnju specifičnog lanca RNA tijekom sinteze 8

14 cdna, te za uklanjanje poli(a) repa iz mrna (Slika 5.) ili uništavanje određene nekodirajuće RNA unutar ili izvan žive stanice. RNazeH RNazaH RNazaH Slika 5. Uklanjanje RNA kalupa tijekom uređivanja RNA i sinteze komplementarne DNA reverznom transkripcijom. Eukarioti imaju dvije klase staničnih RNazaH i to tip 1 i 2. RNazaH1 (tip 1 enzima) je neophodna za replikaciju mitohondrija, dok je RNazaH2 (tip 2) glavni izvor aktivnosti RNazeH u stanicama sisavaca (17). RNazaH2 je heterotrimer koji se sastoji od katalitičke podjedinice RNazaH2A i ne katalitičkih podjedinica RNazaH2B i RNazaH2C (Slika 6.), koji su podjednako važne za funkciju i aktivnost, te zajedno mogu prepoznati i pocijepati jedan ribonukleotid pogrešno ugrađen u DNA/DNA kompleks. Ovaj kompleks također ima ključnu ulogu u metabolizmu nukleinskih kiselina, prevenciji imunoreakcije najvjerojatnije posredovanjem u isijecanju pojedinačnih ribonukleotida iz RNA/DNA hibrida kao i u uklanjanju zaostalog lanca Okazakijevih fragmenata tijekom replikacije DNA, u uklanjanju pogrešno umetnutih ribonukleotida DNA polimerazom i u eliminaciji RNA/DNA hibrida tijekom stanične smrti (17). 9

15 RNazaH2 Slika 6. Kristalna struktura RNazaH2 enzimskog kompleksa. Mutacije u humanom genu za RNazuH2 uzrokuju Aicardi-Goutierov sindrom (AGS). Određena je kristalna struktura RNazaH2 enzimskog kompleksa miša u svrhu boljeg razumijevanja molekularne osnove RNazeH2 i disfunkcije kod autoimunih bolesti u čovjeka. Struktura otkriva usku povezanost RNazeH2B i RNazeH2C s RNazomH2A u kompleksu što je idealno za vezanje nukleinskih kiselina i hidrolizu u interakciji protein-protein što omogućuje učinkovito sudjelovanje u više staničnih funkcija Uloga RNaze H2A i povezanost s karcinomom Velike preraspodjele kromosoma (GCRs), poput translokacija, delecija, amplifikacija i aneuploidija, često su prisutne kod različitih tipova humanih tumora. Unatoč njihovoj važnosti u karcinogenezi, molekularni mehanizmi nastajanja i kontrole preraspodjele kromosoma slabo su poznati. Pomoću «GCR testa», koji mjeri stopu akumulacije spontanih GCR-ova u Saccharomyces cerevisiae, Motegi i sur. otkrili su da mnogi proteini koji sudjeluju u DNA replikaciji, popravku DNA, rekombinaciji DNA, kontroli staničnog ciklusa, remodeliranju kromosoma i očuvanju telomera, imaju vrlo važnu ulogu pri nastanku GCR-a (19). Nestabilnost genoma je karakteristika progresije svih karcinoma, uključujući i rak mokraćnog mjehura (20). Mišićno invazivni karcinom mokraćnog mjehura karakteriziraju mutacije ili delecije u tumor supresorskim genima, kao što su TP53 Rb i PTEN koje dovode do genomske nestabilnosti (18). Ipak, mnoga istraživanja pokazuju da genomska nestabilnost proizlazi iz dvolančanih lomova DNA. 10

16 Istraživanja u kvasaca i na stanicama sisavaca pokazala su da se nestabilnost i dvolančani lomovi mogu pojaviti tijekom poremećene elongacije i prekrajanja RNA kada nastaju DNA-RNA hibridi. Wahba i sur. objavili su da se kod kvasaca hibridi spontano stvaraju na mnogim lokusima stanica divljeg tipa, vjerojatno zbog transkripcijske pogreške, ali se uklanjaju s dvije evolucijski konzervirane RNazeH (21). Uspjeh novih terapeutskih strategija za maligne tumore temelji se na identifikaciji ključnih točaka u onkogenim signalnim putevima. Stanice raka podliježu velikim prilagodbama u svojim signalnim i metaboličkim procesima. Pri tome maligne stanice mogu postati ovisne o promjenama pojedinih gena koji nisu sami po sebi onkogeni. U stvari, aktivnost tih gena može ograničavati brzinu razvoja stanica raka. Izraz 'neovisan o onkogenu je stvoren kako bi opisao taj fenomen. Vjeruje se da inhibicija ključnih čimbenika unutar signalne mreže inducira pogreške u signaliziranju, a time utječe na razvoj malignog procesa (22). Kao enzim prisutan u funkcionalno jedinstvenom putu povezanom s agresivnim tipom karcinoma, RNazaH2A predstavlja idealnu ciljnu molekulu za liječenje raka i najnovija bioinformatička istraživanja svrstavaju RNazuH2A među 2% gena koji su pokazali najveći potencijal za antitumorsku terapiju (23). 11

17 2. HIPOTEZA 12

18 Pretpostavka je da će RNazaH2A pokazati pojačanu espresiju (engl. over-expression) u urotelnom karcinomu mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo. Također, očekuje se da će ekspresija RNazeH2A korelirati sa stupnjem, gradusom, invazivnošću, brojem tumora, dobi i spolom kod urotelnog tumora mokraćnog mjehura. Zbog svega navedenog, RNazaH2A mogla bi biti vrlo koristan biomarker ove bolesti te novi potencijalni cilj u prevenciji i liječenju ove malignosti Cilj istraživanja Pomoću qrt-pcr metode odrediti razinu izražaja RNazeH2A u urotelnim tumorima mokraćnog mjehura pacijenata koji su podvrgnuti transuretralnoj resekciji u usporedbi s zdravim uzorcima tkiva mokraćnog mjehura, te prikazati moguću povezanost izražaja RNazeH2A sa stadijem, gradusom, te invazivnošću urotelnog tumora mokraćnog mjehura. 13

19 3. MATERIJALI I METODE 14

20 3.1. Ispitanici i uzorci Analiza uključuje uzorke pacijenata koji su bili podvrgnuti transuretalnoj resekciju tumora mokraćnog mjehura (TUR) u Kliničkom bolničkom centru Split. Informirani pristanak dobiven je od svih ispitanika prije prikupljanja uzoraka, a u skladu s dopuštenjem Etičkog odbora Sveučilišne bolnice u Splitu (klasa: /06-01/208, ur.br: /01-MJ) i Etičkog povjerenstva Sveučilišta u Splitu Medicinskog fakulteta (klasa: /0005, ur.br: / ). Patološki stadij svakog tumora je određen prema TNM sustavu. Tumorski uzorci i uzorci zdravog tkiva odmah nakon operacije pohranjeni su u tekućem dušiku (na -196 C) do izolacije molekule mrna Postupak izolacije RNA iz tkiva Prvi korak u istraživanju bila je izolacija molekula mrna iz zdravog i tumorskog tkiva mokraćnog mjehura. Uzorak iz tekućeg dušika je homogeniziran (engl. tissue pulverizer) snažnim udaranjem čekićem čime je zaleđeni uzorak zdrobljen u prah (Slika 7.). Slika 7. Homogenizator tkiva (engl. tissue pulverizer) Nakon toga uzorak smrvljenog tkiva prebačen je u 1,5 ml tubice bez DNAze i RNAze u koje je stavljen Qiazol Lysis Reagent (Tablica 1.). Tubice se drže na ledu, a volumen dodanog tkiva ne smije prelaziti 10% volumena Qiazol Lysis Reagent-a. Korišteno je ~100 mg uzorka na 1 ml reagensa. Uzorak u tubici s Qiazolom je treskan kratko i ostavljen na sobnoj temperaturi (15-25 C) 5 minuta. U sljedećem koraku dodano je 0,2 ml kloroforma, te je uzorak energično treskan (vorteksiran) 15 sekundi, a zatim 15

21 inkubiran 2-3 minute na sobnoj temperaturi. Nakon toga slijedi centrifugiranje 12000g/15 minuta/+4 C. Nakon centrifugiranja gornja, prozirna faza u kojoj se nalazi molekula mrna prebačena je u novu tubicu i dodano je 0,5 ml izopropanola (na 1 ml Qiazol Lysis Reagent-a). Uslijedilo je vorteksiranje i inkubacija na sobnoj temperaturi 10 minuta. Nakon toga slijedilo je centrifugiranje g / 10 minuta /+4 C. Pažljivo je uklonjen supernatant, a RNA talog vidljiv je kao bjelkasti trag na dnu tubice. Na kraju je dodan 1 ml 75%-tnog etanola (na 1 ml Qiazol Lysis Reagent-a), te je uzorak centrifugiran na 7500g / 5 minuta / +4 C. Nakon centrifugiranja uklonjen je supernatant, a RNA talog ostavljen na sobnoj temperaturi da se posuši. U zadnjem koraku RNA talog je laganim pipetiranjem otopljen u određenom volumenu DNase, RNase free vode (30μl). Istim postupkom izolirana je RNA iz sva 72 uzorka (36 uzoraka zdravog i 36 uzoraka tumorskog tkiva istog ispitanika). Uzorci su zatim pohranjeni na -80 C do postupka sinteze cdna. Tablica 1. Materijal korišten za izolaciju molekule mrna. Reagens QIAzol lysis reagent Kloroform Izopropanol Etanol apsolutni Voda (engl. DNase/RNase free water) Proizvođač Qiagen, Njemačka J.T. Baker, Nizozemska T.T.T., Hrvatska Alkaloid, Skopje, Makedonija Gibco, SAD 3.3. Sinteza cdna Izolirana mrna prevedena je u cdna enzimom reverznom transkriptazom. Za sintezu cdna je korišten kit High-Capacity cdna Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems). Komponente sadržane u kitu su: 10x RT Buffer, 25x dntp Mix(100mM), 10xRT Random Primers, MultiScribe Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, Nuclease free voda (Tablica 2.). Tablica 2. Materijal za sintezu cdna Reagens High-Capacity cdna Reverse Transcription Kits Proizvođač Applied Biosystems, Velika Britanija 16

22 Postupak sinteze cdna Cijeli postupak izvodi se na ledu (sve komponente kita drže se na ledu za vrijeme cijelog postupka). Postupak započinje miješanjem sljedećih komponenti u tubici: 10x RT Buffer (2,0 μl), 25x dntp Mix(100mM) (0,8 μl), 10xRT Random Primers (2,0 μl), MultiScribe Reverse Transcriptase (1,0 μl), RNase Inhibitor (1,0 μl), voda bez nukleaza (3,2 μl), RNA (izračuna se, do 1µg) i doda se voda bez RNaza do 20µL. Navedena smjesa je dostatna za jedan uzorak, pa je smjesa načinjena za svih 72 uzorka istovremeno i podijeljena na 72 tubice u koje je naknadno dodana RNA (1µg) u potrebnom volumenu s vodom bez RNaza do 20µL. Sadržaj tubice je nježno promiješan. Nakon toga slijede 4 koraka inkubacije: 10 minuta na 25 C, 120 minuta na 37 C, 5 minuta na 85 C i zadnji korak na 4 C. Dobivena se cdna u volumenu od 20 µl razrijedi u 180 µl vode bez RNaza. Konačno je dobiveno 200 µl cdna koja je pohranjena na -20 C, a potom korištena za kvantitativni RT-PCR Kvantitativna PCR reakcija u stvarnom vremenu (qrt-pcr) Kvantitativna PCR reakcija u stvarnom vremenu (qrt-pcr, od engl. Real-time PCR) je korištena za kvantifikaciju ekspresije gena. Za reakciju je pripremljena mješavina za svaki uzorak na ledu: Sybr Green master mix (10,0µL), početnice (svaka po 1,0µL) te po 3µL cdna i 3µL vode što čini volumen od 15µL (Tablice 3 i 4). Uzorci su potom inkubirani na programu 50 C/2min, 95 C/10min, 95 C/15sek, 60 C/1min (40 ciklusa), 95 C/15sek, 60 C/1 min, 95 C/15sek, 60 C/15sek. Koristili smo uređaj 7500 Real Time PCR System. Tablica 3. Materijali za kvantitativnu PCR reakciju u stvarnom vremenu (qrt-pcr) Reagens Sybr Green PCR master mix Početnice (engl. primers) Proizvođač Applied Biosystems, Velika Britanija 17

23 Tablica 4. Početnice za kvantitativnu PCR reakciju u stvarnom vremenu (qrt-pcr) Početnice h-rnaseh2a h-rps 23 Sekvenca FORWARD: 5-'GCT GTCTCC AAA CCT CAT CTC-3' REVERSE: 5'-CCT ACG GTG TCC ACG AAT AC-3' FORWARD: 5 -TGG AGG TGC TTC TCA TGC AA-3 REWERSE: 5 -AAT GGC AGA ATT TGG CTG TTT G-3 Tablica 5. Uređaji korišteni u postupku izolacije RNA, sinteze cdna i qrt-pcr-a Uređaji Proizvođač Tissue pulverizer, 10 to 100 mg tissue Cole-Parmer, SAD capacity (59012N) 7500 real Time PCR System Applied Biosystems, Velika Britanija NanoDrop 1000 Spectrofotometar ThermoScientific, SAD Arktik Thermal Cycler ThermoScientific, SAD 3.5. Test efikasnosti primera (engl. Primer efficiency test) Standardna krivulja efikasnosti početnica RNazeH2A Za izradu standardne krivulje efikasnosti korištena su serijska razrjeđenja 1:10 u rasponu od 10 7 na predlošku prethodno umnoženom klasičnim PCR-om i upotrebom početnica za RNazeH2A. Amplifikacijska krivulja prikazana je na Slici 8. 18

24 Slika 8. Amplifikacijska krivulja efikasnosti početnica gena RNazaH2A. Krivulja prikazuje Ct vrijednost svakog od serijskih razrjeđenja. Za izradu standardne krivulje efikasnosti početnice, Ct vrijednosti različitih razrjeđenja prikazane su u odnosu na razrjeđenje, te je određen pravac linearne regresije kroz točke (Slika 9.). Efikasnost početnica (E) izračunava se iz koeficijenta smjera pravca linearne regresije (A) prema formuli: E = 10 (-1/A) U idealnom slučaju 100% efikasnosti početnica kod serijskih razrjeđenja 1:10, koeficijent smjera pravca linearne regresije (A) iznosi U slučaju RNazeH2A početnica, koeficijent smjera pravca linearne regresije (A) iznosi 3.44 (Slika 9), a pripadna efikasnost početnica (E) jest 95%. 19

25 Slika 9. Standardna krivulja efikasnosti početnica za RNazuH2A. Graf označava pripadne Ct vrijednosti različitih razrjeđenja predloška kroz koje je provučen pravac linearne regresije. Slika 10. Disocijacijska krivulja početnica za RNazuH2A. Krivulja disocijacije početnica (Slika 10.) prikazuje specifičnu hibridizaciju početnica i predloška. Točka disocijacije nalazi se na 73 C. U svrhu dodatnog utvrđivanja specifičnosti početnica, produkt amplifikacije s početnicama RNazeH2A analiziran je na agaroznom gelu (Slika 11.), gdje se vidi specifičan produkt od 147 parova baza koji odgovara veličini očekivanog produkta za RNazaH2A početnice. Slika 11. Prikaz pet amplifikacijskih produkata RNazeH2A početnica na agaroznom gelu vizualiziranim etidijevim bromidom. 20

26 3.6. Obrada podataka Rezultati dobiveni pomoću qrt-pcr-a predstavljaju Ct vrijednosti (engl. cycle treshold) koje definiraju ciklus u kojem fluorescentni signal prelazi zadani prag detekcije. Ct-vrijednost je obrnuto proporcionalna ekspresiji ciljnog gena u uzorku. U ovom istraživanju mjerene su relativne promjene ekspresije gena RNazeH2A u tumorskom i zdravom tkivu istog pacijenta, a kao endogena kontrola za kvantifikaciju korišten je gen RPS 23. Svi uzorci rađeni su u duplikatima. Srednja Ct vrijednost ciljnog i kontrolnog gena ispitivanog uzorka uspoređena je neparametrijskim Wilcoxonovim t-testom izračunatih relativnih vrijednosti promjena ciljnog gena u odnosu na kontrolni gen, za tumorsko i zdravo tkivo (prema formuli 2 (Ct kontrole - Ct ciljanog gena) ). Nakon toga izračunat je omjer relativnih vrijednosti za tumorsko tkivo / relativne vrijednosti za zdravo tkivo i dobivena promjena (porast ili pad) ekspresije ciljnog gena u tumorskom tkivu. Omjer > 2 smatran je porastom ekspresije RNazeH2A. Isto tako, u skupinu s porastom ekspresije svrstani su uzorci kod kojih je Ct-vrijednost RNazeH2A u zdravom tkivu bila ispod praga detekcije, dok je Ct-vrijednost RNazeH2A u tumorskom tkivu bila unutar detekcijskog praga. Napravljen je i Hi-kvadrat test kako bi se utvrdila promjena ekspresije RNazeH2A gena u tumorskom u odnosu na zdravo tkivo istog pacijenta. Vrijednost od p <0.05 smatrana je statistički značajnom. Izračun relativnih promjena grupiran je prema stupnju, invazivnosti, gradusu, spolu, dobi i broju tumora pomoću Kruskal Wallis jednosmjerne analize varijanci. Izračun relativnih promjena rađen je u programu Microsoft Office Excel

27 4. REZULTATI 22

28 Učestalost pojavljivanja Omjer relativnih vrijednosti promjena Ct-vrijednosti gena za RNazuH2A u odnosu na kontrolni gen (RPS 23) za tumorsko i zdravo tkivo veća od 2 smatrana je povećanom ekspresijom RNazeH2A. Gen za RNazuH2A pojačano je eksprimiran u uzorcima urotelnih tumora mokraćnog mjehura. Povećana ekspresija gena za RNazuH2A u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kod istog pacijenta uočena je kod 29/36 parova uzoraka, smanjenje ekspresije uočeno je kod 2/36 uzoraka, a 5/36 parova uzoraka nije pokazalo nikakve promjene (Slika 12.). BROJ PACIJENATA POVEĆANJE SMANJENJE BEZ PROMJENE Slika 12. Promjena ekspresije gena za RNazuH2A u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kod istog pacijenta. Značajan broj pacijenata ima povećanu ekspresiju RNazeH2A u tumorskom tkivu. Hi-kvadrat test pokazuje razinu značajnosti P< Nadalje, uzorci su grupirani prema omjeru relativnih vrijednosti promjena Ctvrijednosti gena za RNazuH2A u odnosu na kontrolni gen za tumorsko i zdravo tkivo, a što je prikazano na Slici Relativni porast izražaja RNazeH2A u tumorima Slika 13. Učestalosti pojavljivanja uzoraka s obzirom na omjer relativnih vrijednosti promjena Ct-vrijednosti gena za RNazuH2A u odnosu na gen za RPS 23 za tumorsko i zdravo tkivo 23

29 Povećana ekspresija RNazeH2A nije dovedena u svezu s dobi pacijenata (P=0.5954), spolom (P=0.6621), invazivnosti tumora (P=0.3931), stadijem tumora (P=0.8396) kao ni s brojem tumora (P=0.7511). Kruskal-Wallis t-testom nađena je značajna korelacija povećane ekspresije RNazeH2A i gradusa tumora mokraćnog mjehura (P=0.0428) (Tablica 6). Tablica 6. Prikaz povezanosti varijabli (dobi, spola, invazivnosti, gradusa, stadija, broja tumora) i povećane ekspresije gena za RNazuH2A u urotelnim tumorima mokraćnog mjehura. DOB (god) SPOL INVAZIVNOST GRADUS STADIJ M Ž Neinv. Inv. Niski Visoki Ta T1 T2 65 N=25 N=7 N=29 N=20 N=16 N=16 N=20 N=20 N=9 N=6 N=11 T4 N=1 BROJ TUMORA 1 >1 N=18 N=18 P = 0,5954 P = 0,6621 P = 0,3931 P = 0,0428 P = 0,8396 P = 0,7511 Amplifikacijski produkti qrt-pcr reakcije četiri para uzoraka (tumorsko i zdravo tkivo) korišteni su u gel elektroforezi za vizualizaciju ekspresiju ciljnog gena. Dobiveni specifični produkti veličine su 147 parova baza koji odgovara veličini očekivanog produkta za RNazaH2A početnice (Slika 14.). Slika 14. Četiri primjerna amplifikacijska produkta uzorka tumorskog i zdravog tkiva istog pacijenta na agaroznom gelu bojanom etidijevim bromidom. 24

30 5. RASPRAVA 25

31 Rezultati istraživanja u kojem smo analizirali razlike u ekspresiji gena za RNazuH2A u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo, pokazali su da je RNazaH2A statistički značajno više eksprimirana na razini gena kod urotelnih tumora mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo (P< 0,0001). U posljednjih desetak godina identificirani su brojni biomarkeri tumora mokraćnog mjehura, uključujući razne tumor supresorske gene, onkogene, čimbenike rasta, hormonske receptore, markere proliferacije i apoptoze, onkoproteine itd. Nekoliko signalnih puteova, poput p53, prb, PTEN i njihovih interakcijskih proteina, opisani su u posredovanju razvoja invazivnog karcinoma mokraćnog mjehura (12,13). Ograničene vrijednosti tih prognostičkih biljega pridonose potrebi analiziranja novih molekularnih parametara koji bi se koristili u klinici za otkrivanje i praćenje bolesti. Kompleks RNazeH2A ima ključnu ulogu u metabolizmu nukleinskih kiselina, prevenciji imunoreakcije najvjerojatnije posredovanjem u isijecanju pojedinačnih ribonukleotida iz RNA/DNA dupleksa kao i u uklanjanju zaostalog lanca Okazakijevih fragmenata tijekom replikacije DNA, u uklanjanju pogrešno umetnutih ribonukleotida DNA polimerazom i u eliminaciji RNA/DNA hibrida tijekom stanične smrti (17). Velike preraspodjele kromosoma ( GCRs ), poput translokacija, delecija, amplifikacija i aneuploidija, često su prisutni kod različitih tipova humanih tumora, te je jasno da su jako važne u karcinogenezi, ali molekularni mehanizmi nastajanja i kontrole preraspodjele kromosoma slabo su poznati. Nestabilnost genoma je karakteristika svih karcinomskih progresija, uključujući i rak mokraćnog mjehura (20). Ipak, mnoga istraživanja pokazuju da genomska nestabilnost proizlazi iz dvolančanih lomova DNA. Uspjeh novih terapeutskih strategija za rak temelji se na identifikaciji ključnih točaka (u smislu molekule) u onkogenim signalnim putevima. Stanice raka podliježu velikim adaptacijama u svojim signalnim i metaboličkim procesima i mogu postati ovisne o pojedinim genima koji nisu sami po sebi onkogeni, ali njihova aktivnost može ograničavati brzinu razvoja stanica raka. Vjeruje se da inhibicija tih ključnih čimbenika unutar signalne mreže inducira pogreške u signaliziranju malignog puta, a time i suzbijanje malignog procesa (22). Kao enzim u funkcionalno jedinstvenom putu povezanom s agresivnim rakom, RNazaH2A predstavlja idealnu metu za liječenje raka i nedavni bioinformatički probir stvrstao je RNazuH2A među 2% gena koji bi mogli biti vrlo uspješne mete za antitumorske lijekove (23). Rezultati ovog istraživanja koji 26

32 pokazuju da urotelni tumori mokraćnog mjehura pojačano eksprimiraju RNazuH2A svakako potvrđuju tu hipotezu. Genska ekspresija RNazeH2A ne ovisi o spolu i dobi pacijenata s urotelnim tumorom mokraćnog mjehura (P=0,6621 i P=0,5954). Također, nisu pronađene statistički značajne korelacije porasta genske ekspresije RNazeH2A i invazivnosti tumora mokraćnog mjehura (koja ukazuje na povećanu mogućnost stvaranja metastaza) (P=0,3931), stadija (P=0,8396), te broj tumora (P=0,7511). Statistički značajna korelacija pronađena je samo kod povećane ekspresije RNazeH2A i gradusa tumora (koji upućuje na stupanj agresivnosti tumora) (P=0,0428). Buduća istraživanja trebala bi uključiti veći broj uzoraka tumora mokraćnog mjehura u kojima bi se odredila ekspresija gena za RNazuH2A metodom PCR reakcije u stvarnom vremenu, kao i drugim pokusima koji bi na proteinskoj razini potvrdili naše rezultate. 27

33 6. ZAKLJUČCI 28

34 Genski izražaj RNazeH2A značajno je povećana u urotelnim tumorima mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo. Povećana genska ekspresija RNazeH2A ne korelira sa spolom i dobi pacijenata s urotelnim tumorom mokraćnog mjehura, kao ni s invazivnošću i brojem tumora. Povećana genska ekspresija RNazeH2A značajno korelira s povećanjem gradusa urotelnog tumora mokraćnog mjehura. 29

35 7. SAŽETAK 30

36 Cilj istraživanja: otkriti postoji li značajna razlika u izražaju gena RNazeH2A u tumorskom tkivu mokraćnoga mjehura u odnosu na zdravo tkivo istog pacijenta, te prikazati moguću povezanost izražaja RNazeH2A sa stadijem, gradusom, invazivnošću, brojem tumora, spolom i dobi. Metode: Na prikupljenim uzorcima provedena je izolacija RNA iz tkiva, nakon čega je RNA reverznom transkripcijom prevedena u cdna koja je služila kao predložak za qrt-pcr. Elektroforezom na agaroznom gelu potvrđena je specifičnost početnica. Rezultati: Rezultati ovog rada pokazuju da RNazaH2A ima pojačan izražaj u 29 od 36 urotelnih tumora mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo istog pacijenta (P<0,0001), te pokazuje pozitivnu korelaciju s gradusom tumora (P=0,0428), dok s dobi i spolom pacijenata, te stadijem, invazivnošću i brojem tumora nema korelacije. Zaključci: Genski izražaj RNazeH2A značajno je povećan u urotelnim tumorima mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo i ne korelira sa spolom, dobi, invazivnošću ni brojem tumora pacijenata s urotelnim tumorom mokraćnog mjehura, međutim značajno korelira s povećanjem gradusa urotelnog tumora mokraćnog mjehura. Rezultati ovog rada ukazuju na veliki potencijal RNazeH2A kao biomarkera u dijagnozi urotelnih tumora mokraćnog mjehura, kao i ciljne molekule u liječenju ove bolesti. 31

37 8. SUMMARY 32

38 Aims: To determine if there is a significant difference in the RNaseH2A expression between urothelial tumor and healthy tissue of urinary bladder and to show possible association between RNaseH2A expression and stage, grade, invasiveness, tumor multiplicity, gender and age. Methods: RNA was isolated from tissues samples and then converted into cdna by reverse transcription. cdna was used as a template for qrt-pcr. Specificity of the amplification reaction was verified by agarose gel electrophoresis. Results: We found that RNaseH2A is over-expressed in 29 of 36 urothelial bladder tumors (P<0,0001). Moreover, RNaseH2A over-expression correlates with tumor grade (P=0,0428), whereas no association was found in correlation with age, gender, stage, invasiveness and tumor multiplicity. Conclusions: RNaseH2A gene expression was significantly increased in the urothelial bladder tumors compared to normal tissue, and does not correlate with gender, age, or number of invasive tumors, but significantly correlates with grade increase of urothelial bladder tumors. Results of this study indicate a great potential of RNaseH2A as a biomarker in the diagnosis of urothelial bladder tumors, as well as a target molecule for the treatment of this disease. 33

39 9. ŽIVOTOPIS 34

40 SANDRA VUJEVIĆ Datum rođenja: Adresa: Put Glavice 14, Split Državljanstvo: Republike Hrvatske Obrazovanje: Zdravstveni obrazovni centar Split, smjer: zdravstveni tehničarlaborant Sveučilište u Splitu, Odjel zdravstvenih studija, smjer: medicinsko laboratorijska dijagnostika (preddiplomski sveučilišni studijski program) Radno iskustvo: Laboratorijski tehničar u Domu zdravlja- Brodosplit u Splitu Laboratorijski tehničar u Domu zdravlja Željezničara u Splitu Laboratorijski tehničar u Privatnoj spec. Ambulanti Primarijusa Mr.sc.dr. B. Pivalice u Splitu Laboratorijski tehničar u Mikrobiološkom laboratoriju spec.dr.sc. Ozrena Budimira u Splitu Laboratorijski tehničar u Poliklinici za dječje bolesti- Badem u Splitu Laboratorijski tehničar na Medicinskom fakultetu, Sveučilišta u Splitu Sudjelovanja: Na projektu Uloga upalnih procesa u nastanku malignnih bolesti MZOŠ pod voditeljstvom prof.dr.sc.janoša Terzića 35

41 10. LITERATURA 36

42 1. Wein JA. Campbell-Walsh Urology. 9. izdanje. Philadelphia: Saunders, Sobin LH, Wittekind C. UICC: TNM Classification of Malignant Tumors. 6. izdanje. New York: Wiley, Mikuz G. Clinical Pathology of Urogenital Tumors. London: Informa Healthcare, Babjuk M, Oosterlinck W, Sylvester R, Kaasinen E, et al. EAU Guidelines on nonmuscle invasive urothelial carcinomaof the bladder. Eur Urol 2008;54: Walsh PC. Campbell's Urology. 6.izdanje, Philadelphia: Saunders, Hayat MJ, Howlander N, Reichman ME, Edwards BK. Cancer statistics, trends and multiple primary cancer analyses from the Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER) Program. Oncologist 2007;12: Pelucchi C, Bosetti C, Negri E, Malvezi M, et al. Mechanisms of disease: The epidemiology of bladder cancer. Nat Clin Pract Urool 2006;3: Kiemeney LA, Moret NC, Witjes JA, Schonberg MP, et al. Familial transitional cell carcinoma among the population of Iceland. J Urol 1997;157: Medicina.hr Karcinom mokraćnog mjehura; pristupljeno Heney N. M. Natural history of superficial bladder cancer. Prognostic features and long-term disease course. Urol Clin North Am 1992;19: Edge S. B., Byrd D. R., Compton C. C., Fritz A. G., et al. AJCC Cancer Staging Manual 7th ed. New York. NY Springer:. 12. Cairns P, Proctor AJ, Knowles MA. Loss of heterozygosity at the RB locus is frequent and correlates with muscle invasion in bladder carcinoma. Oncogene. 1991;6: Puzio-Kuter AM, Castillo-Martin M, Kinkade CW, Wang X, Shen TH,Matos T, et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & evelopment. 2009;23: He F, Mo L, Zheng XY, Hu C, Lepor H, Lee EY, et al. Deficiency of prb family proteins and p53 in invasive urothelial tumorigenesis. Cancer Res. 2009;69: Schmitt TJ, Clark JE, Knotts TA. "Thermal and mechanical multistate folding of ribonuclease H". J Chem Phys. 2009;131: Schultz SJ, 37

43 Champoux JJ. "RNase H activity: structure, specificity, and function in reverse transcription". Virus Res.-2008;134: Bubeck D, Reijns MA, Graham SC, Astell KR, et al. PCNA directs type 2 RNase H activity on DNA replication and repair substrates. Nucleic Acids Res. 2011;39: Cheng L, Davison DD, Adams J, Lopez-Beltran A, et al. Biomarkers in bladder cancer: Translational and clinical implications. Critical reviews in oncology/hematology. 2014;89: Motegi A, Myung K. Measuring the rate of gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae: A practical approach to study genomic rearrangements observed in cancer. Methods. 2007;41: Palmeira C, Lameiras C, Amaro T, Lima L, et al. CIS is a surrogate marker of genetic instability and field carcinogenesis in the urothelial mucosa. Urologic oncology. 2011;29: Wahba L, Amon JD, Koshland D, Vuica-Ross M. RNase H and multiple RNA biogenesis factors cooperate to prevent RNA:DNA hybrids from generating genome instability. Mol Cell : Hoelbl A, Schuster C, Kovacic B, Zhu B, et al. Stat5 is indispensable for the maintenance of bcr/abl positive leukaemie. EMBO molecular medicine. 2010;2: Mayburd AL, Golovscihova I, Mulshine JL, Successful anti-cancer drug targets able to pass FDA rewiev demonstrate to identifiable signature distinct from the signature distinct from the signatures of random genes and initially proposed targets. Bioinformatics 2008;24: