AGREGACIJA TROMBOCITA KAKO, KADA I ZAŠTO MJERITI

Transcription

1 AGREGACIJA TROMBOCITA KAKO, KADA I ZAŠTO MJERITI Sandra Margetić Odjel za laboratorijsku hematologiju i koagulaciju Klinički zavod za kemiju KBC Sestre milosrdnice Zagreb, 11. studenog Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

2 Multifunkcionalni trombocit adhezija aktivacija agregacija prokoagulantna aktivnost Hemostaza aterotromboza ateroskleroza Funkcije trombocita Održavanje /regulacija vaskularnog tonusa tromboksan prostaglandini Interakcije Trc-Lkc; Trc-ES Upala Obrana domaćina Biologija tumora rast tumora metastaze tumora fagocitoza mikrobicidni proteini Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

3 Uloga trombocita u primarnoj hemostazi ADHEZIJA Ozljeda krvne žile trombocit Adhezija trombocita na kolagen uendotelu krvne žile (vwf-gpib/ix/v) AGREGACIJA A k t i v a c i j a Promjena oblika Trc iz diskoidnog u sferični, povećanje površine, izlaganje membranskih FL i GP receptora Sekrecija sadržaja granula Agregacija ili međusobno sljepljivanje Trc (GPIIb/IIIa - fibrinogen) Primarni hemostatski (trombocitni) ugrušak Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

4 Pretrage agregacije trombocita 1. Ispitivanje poremećaja funkcije trombocita kao uzroka krvarenja u sklopu laboratorijske dijagnostike: nasljednih trombocitopatija (BSS, TG, vwb ) stečenih trombocitopatija - lijekovi (antiepileptici, antihistaminici, antibiotici (cefalosporini, penicilini), anestetici, fibrinolitici, dekstran, inhibitori trombina ) - patofoziološka stanja (kronično zatajenje bubrega, bolesti jetre, maligne hematološke bolesti (AL, mijeloproliferacije, disproteinemije) 2. Praćenje antiagregacijske (antitrombocitne) terapije

5 Agregometrija trombocita prema metodologiji 1. Optička agregometrija 2. Impedancijska agregometrija 3. Lumiagregometrija 4. Noviji sustavi za mjerenje agregacije trombocita u punoj krvi Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

6 OPTIČKA AGREGOMETRIJA TROMBOCITA engl. light transmission aggregometry (LTA) agregometrija prema Bornu zlatni standard u ispitivanju nasljednih i stečenih poremećaja funkcije trombocita Gustav Born ispituje funkciju trombocita in vitro uz različite agoniste agregacije: ADP kolagen epinefrin arahidonska kiselina ristocetin Prvi optički agregometar (1961) Suvremeni optički agregometar: Platelet Aggregation Profiler model 8E (Biodata, SAD)

7 % agregacije NAČELO OPTIČKE AGREGOMETRIJE TROMBOCITA Plazma bogata trombocitima (PRP) Agregati trombocita Trc u mirovanju Promjena oblika Primarna agregacija Sekrecija + Agonist agregacije (ADP, EPI, KOL, AA, RIS) Transmisija svjetla prije dodatka agonista magnetni štapić za miješanje Porast transmisije svjetla nakon dodatka agonista Dodatak agonista Sekundarna agregacija vrijeme (minute) Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

8 Analitički uzorak za optičku agregometriju PRP = plazma bogata trombocitima engl. platelet rich plasma Centrifugiranje: g 10 min PPP = plazma siromašna trombocitima engl. platelet poor plasma centrifugiranje: 1500g 15 min Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

9 OPTIČKA AGREGOMETRIJA TROMBOCITA Grafički prikaz krivulje agregacije Brojčani rezultat - maksimalna agregacija (%) otpuštanje nukleotida (ADP...) sekundarni val agregacije rezultat je otpuštanja endogenih agonista (ADP, TXA2 ) MAKSIMALNA AGREGACIJA (%) primarni val agregacije rezultat je dodatka egzogenog agonista (agonist kao reagens) bazična apsorb. promjena oblika dodatak agonista Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

10 Ograničenja optičke agregometrije Analitički uzorak - PRP (nefiziološki uvjeti) Priprema PRP-a Podložnost aktivacije trombocita in vitro Potreban veliki volumen uzorka Isključivo u specijaliziranim koagulacijskim laboratorijima Nedostupan kontrolni materijal Standardizacija (različiti agonisti i koncentracije agonista, referentni intervali ) otežana interpretacija rezultata i neusporedivost rezultata u različitim laboratorijima Cattaneo M et al. Results of a worldwide survey on the assessment of platelet function by light transmissionaggregometry: a report from the platelet physiology subcommittee of the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 2009;7: Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

11 Standardizacija optičke agregometrije Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: a consensus of the working party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 2013;11: **Ling LQ et al. Evaluation of an automated light transmissionaggregometry. Platelets 2017;28: Čimbenik Standardizirani postupak Napomena Priprema bolesnika Uzorkovanje Dozovljeno vrijeme analize Centrifugiranje Hemoliza Lipemija Kontrolni postupak Broj trombocita u PRP-u Agonisti i preporučene koncentracije agonista Anamneza uzetih lijekova 10 dana prije pretrage Prestanak uzimanja lijekova koji inhibiraju funkciju trombocita* (npr. ukinuti nesteroidne antiupalne lijekove 3 dana prije uzorkovanja) Spriječiti aktivaciju trombocita in vitro Antikoagulans 3,2% (109 mm) ili 3,8% (129 mm) natrijevcitrat Održati stabilan ph 7,2-8 u uzorku - preporuka je koristiti spremnike užeg promjera i držati ih zatvorene Uzorak Unutar 4 sata od uzorkovanja se ne može pohraniti za analizu PRP: g 10 minuta PPP: 1500g 15 minuta Uzorak pune krvi držati na sobnoj temperaturi 15 minuta prijecentrifugiranja, a uzorke PRP-a i PPP-a 15 minuta nakon centrifugiranja Hemoliza neadekvatan uzorak; ponoviti uzorkovanje Lipemija neadekvatan uzorak Uzorak dobiven od zdrave osobe Trc 600x10 9 /L broj trombocita se ne podešava Trc > 600x10 9 /L uzorak PRP-a preporučeno je razrijediti fiziološkom otopinom (a ne koristiti autologni PPP uzorak**) Trc <150x10 9 /L ADP 2 µm, Epinefrin 5 µm, Kolagen 2 µg/ml Arahidonska kiselina 1 µm, Ristocetin 1,2 µg/ml Ukoliko liječenje lijekovima koji utječu, na funkciju trombocita ne smije biti ukinuto prije uzorkovanja, utjecaj ovih lijekova treba uzeti u obzir pri interpretaciji rezultata pretraga * Izuzetak od ovog pravila su bolesnici na antiagregacijskoj terapiji Minimalna venska staza (podveza < 1minute) Spremnici: plastični (polipropilenski) ili stakleni silikonizirani Ne koristiti obe koncentracije citrata - razlike u rezultatima mogu biti značajne kod nižih koncentracija agonista Prva 3-4 ml uzorkovane krvi odbaciti ili koristiti za druge koagulacijske pretrage (PV, APTV) Kod ph < 6,4 potpuno izostaje agregabilnost trombocita, a kod ph > 8,0 prisutna je spontana agregacija trombocita. Promjena ph u plazmi je posredovana difuzijom CO 2 iz plazme Uzorak je potrebno dostaviti u laboratorij unutar 1 sata od uzorkovanja na sobnoj temeraturi u zatvorenom spremniku. Pothlađivanje uzorka uzrokuje aktivaciju trombocita te spontanu agregaciju nakon zagrijavanja ili miješanja U uzorcima s vrlo visokim brojem trombocita potrebno je uzorak krvi ostaviti da se sedimentira prije centrifugiranja Uzorak PPP-a dobiva se centrifugiranjem pune krvi ili krvi iz koje je prethodno uklonjen dobiveni uzorak PRP-a Analiza odmah nakon pripreme PRP-a može rezultirati smanjenim agregacijskim odgovorom Hemoliza rezultira otpuštanjem ADP-a iz eritrocita što trombocite čini neosjetljivima na dodatak egzogenog ADP-a Lipemija interferira u optičkom mjerenju. Ukoliko se agregacija izvodi u lipemičnom uzorku potrebno je rezultat izdati uz napomenu o nepouzdanosti rezultata Budući da nije dostupan komercijalni kontrolni uzorak, potrebno je koristiti uzorak zdrave osobe kao kontrolni materijal paralelno s ispitivanjem u uzorku ispitanika Agregacija se izvodi bez podešavanja broja trombocita na standardiziranu vrijednost s uzorkom autolognog PPP-a do vrijednosti trombocita 600x10*9/L (podešavanje utječe na agregabilnost trombocita) Ako se analiza izvodi u uzorku s brojem trombocita <150x10 9 /L u svrhu isključivanja težih oblika poremećaja funkcije trombocita, potreban je oprez pri interpretaciji rezultata, te se preporuča nalaz izdati uz napomenu o nepouzdanosti rezultata. Navedene preporučene koncentracije ADP-a (2 µm) i epinefrina (5 µm) proizvode bifazičnu krivulju agregacije (primarni i sekundarni val), dok je kod visokih koncentracija bifazični odgovor maskiran Veće koncentracije pojedinih agoonista mogu se koristiti za dodatno ispitivanje ako izostaje agregabilnost uz navedene preporučene koncentracije.

12 Standardizacija optičke agregometrije Cattaneo M i sur. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: a consensus of the working party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 2013;11: Čimbenik Broj trombocita u PRP-u Agonisti i preporučene koncentracije agonista Standardizirani postupak Trc 600x10 9 /L broj trombocita nije preporučeno podešavati Trc > 600x10 9 /L - prema najnovijim istraživanjima uzorak PRP-a preporuča se razrijediti fiziološkom otopinom, a ne autolognim PPP uzorkom ADP 2 µm Epinefrin 5 µm Kolagen 2 µg/ml Arahidonska kiselina 1 µm Ristocetin 1,2 µg/ml Cattaneo M et al. Platelet aggregation studies: autologous platelet poor plasma inhibits platelet aggregation when added to platelet rich plasma to normalize platelet count. Haematologica 2007;92: Ling LQ et al. Evaluation of an automated light transmission Aggregometry. Platelets 2017;28: Standardiziran panel agonista i koncentracije svakog pojedinog agonista Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

13 IMPEDANCIJSKA AGREGOMETRIJA TROMBOCITA kiveta elektrode nakupina trombocita na elektrodama Mjeri promjenu (porast) električnog otpora (impedancije) između elektroda nakon dodatka agonista Analitički uzorak: puna krv (bolje odražava in vivo uvjete, nema pripreme uzorka, potreban manji volumen uzorkovane krvi Trc u suspenziji + agonist agregacije (ADP, EPI, KOL, AA, RIS) magnetni štapić za miješanje Ograničenja: - utjecaj Hct, broja Trc i Lkc - ne razlučuje 1. i 2. val agregacije - ne korelira sa sekrecijom Trc-a - različit odgovor na agoniste u odnosu na optičku metodu (potrebne visoke konc. ADP, nemjerljiv odgovor na EPI) - ne pruža dodatnu dg. informaciju u odnosu na optičku metodu Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

14 LUMIAGREGOMETRIJA Uz optičku ili impedancijsku metodu agregometrije koristi i metodu luminiscencije (luciferin-luciferaza) - dodatno mjerenje otpuštanja nukleotida adenina iz tamnih (gustih) granula Trc-a Intenzitet emitiranog svjetla je razmjeran količini nastalog ATP-a - podatak o količini i omjeru ADP-a i ATP-a agregacija luciferin LUCIFERAZA oksiluciferin ATP svijetlo luminiscencija Metoda je osjetljiva za poremećaje pohrane i sekrecije Trc-a za razliku od klasične optičke i impedancijske agregometrije Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

15 Agregometrija u dijagnostici nasljednih trombocitopatija Harrison P i sur. Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function. Br J Haematol 2011;155:30-44.

16 Agregometrija trombocita uz različite agoniste u nasljednim trombocitopatijama osnovna klinička indikacija za pretrage agregacije Poremećaj ADP KOL EPI AA RIS RIS niska konc. vwb (vwf) N N N N --- //N ---** Tip 2B vwb (vwf) Pseudo vwb(gpib) Bernard-Soulier (BSS) (GPIb/IX/V) Trombastenija Glanzmann (GPIIb/IIIa) Manjak receptora za kolagen (GPVI) Poremećaj pohrane (storage pool dis.), i komb. ( + ) N N N N N N N N N N N N ** N ---** N P*/N /N N P*/N N /N N N N N ---** ---** *P prisutan samo primarni val, ** kod niskih konc. RIS izostanak agregabilnosti Trc-a je normalan nalaz

17 NOVIJI SUSTAVI KOJI MJERE AGREGACIJU TROMBOCITA U PUNOJ KRVI (1) Prema načelu mjerenja Adhezija trombocita simulira proces primarne hemostaze in vivo Impedancija mjeri promjenu el. otpora PFA-100 Siemens, Njemačka Multiplate Roche, Švicarska Sustav IMPACT DiaMed, Švicarska PlateletWorks/Ichor Osmišljeni kao testovi za praćenje antiagregacijske terapije ili kao probirni testovi za ispitivanje funkcije trombocita Point of care testing (POCT) Analitički uzorak: puna krv nema pripreme uzorka Mala količina uzorkovane krvi Jednostavniji i brži za izvedbu Optička metoda (mjeri promjenu transmisije svjetla) Viskozielastometri ja (TEG) uz dodatak modula za agregaciju ROTEM Platelet module VerifyNow Accumetrix, SAD TEG Platelet Mapping System Haemoscope SAD Helena Lab, SAD Isključivo probirni (a ne dijagnostički) testovi za poremećaje funkcije Trc-a Nestandardizirani: različite tehnologije, različiti načini izražavanja rezultata, različite granične vrijednosti, neusporedivost rezultata

18 NOVIJI SUSTAVI KOJI MJERE AGREGACIJU TROMBOCITA U PUNOJ KRVI (2) Prema načelu mjerenja Obilježja analitičkog sustava Adhezija i agregacija trombocita simuliraju proces primarne hemostaze in vivo mjere adheziju i agregaciju trombocita u fiziološkim uvjetima protoka brzine krvi u arterijama (engl. high shear) PFA-100 (PFA-200) IMPACT: Cone and Plate(let) Analyzer mjeri kapacitet primarne hemostaze u uzorku pune krvi funkcija trombocita mjeri se kao funkcija vremena (u sekundama) potrebnog za stvaranje trombocitnog ugruška jednokratne test kazete obložene kombinacijom agonista: COL/EPI; COL/ADP; noviji: P2Y (ADP) probirni test za poremećaje funkcije trombocita osjetljiv na teže poremećaje (BSS, TG, vwb), ali neosjetljiv na blaže oblike poremećaja utjecaj čimbenika (Trc<50x10*9/L, Hct <0,25 L/L; aktivnost vwf-a, povišen fibrinogen, broj Erc-a, prehrana (flavonoidi) probirni in vitro test krvarenja (zamjenjuje VK kao pretragu) Istodobna primjena COL/EPI i COL/ADP razlikovanje nasljednih trombocitopatija (BSS, TG, vwb) i učinka aspirina P2Y12 test noviji, još uvijek u ispitivanju, namijenjen praćenju inhibitora ADP rec. mjeri kapacitet primarne hemostaze u uzorku pune krvi brojanje trombocita prije i nakon agregacije potaknute dodatkom odgovarajućeg agonista automatizirano bojanje uzorka, slikovna analiza adhezije i agregacije Trca na polistirensku površinu probirni test za teže oblike trombocitpoatija (BSS, TG, vwb) nije u široj uporabi prvotno osmišljena kao metoda praćenja antagonista GPIIb/IIIa danas dostupni testovi s agonistima: arahidonska kiselina (AA) i ADP potencijalno primjenjiva za praćenje svih skupina antiagregacijskih lijekova

19 NOVIJI SUSTAVI KOJI MJERE AGREGACIJU TROMBOCITA U PUNOJ KRVI (3) Prema načelu mjerenja Obilježja analitičkog sustava Impedancija (mjeri promjenu električnog otpora) Multiplate osmišljena kao metoda praćenja antiagregacijske terapije mogućnost izvođenja tesotva uz sva tri agonista: Arahidonska kiselina (ASPI test); ADP + PGE1 (inhibitori ADP receptora) TRAP test (inhibitori GPIIb/IIIa) (TRAP = thrombin receptor activating peptide) nedovoljno ispitana metoda u dg. pormeećaja funkcije trombocita / nedovoljno osjetljiva za blaže oblike (ne daje kinetičku informaciju) Platelet Works/Ichor Usporedba broja trombocita prije agregacije (EDTA uzorak) i nakon agregacije (citratni uzorak) potaknute agonistima agregacije (AA, ADP, kolagen) - primjenjiva za praćenje antiagregacijske terapije stupanj agregacije trombocita određuje se iz odnosa broja Trc-a prije i nakon aktivacije agonistima agregacije nedostatak: analizasemoraučiniti odmah (unutar nekoliko minuta od uzorkovanja) primjena ograničena na operacijske sale ROTEM Platelet module trombelastometrija uz integrirani agregometar na načelu impedancije procjena globalne hemostaze i agregacija trombocita iz jednog uzorka pune krvi Agonisti: arahidonska kiselina (AA), ADP, TRAP metoda je primjenjiva za praćenje svih skupina antiagregacijskih lijekova

20 NOVIJI SUSTAVI KOJI MJERE AGREGACIJU TROMBOCITA U PUNOJ KRVI (4) Prema načelu mjerenja Optička metoda (mjeri promjenu transmisije svijetla) Obilježja analitičkog sustava VerifyNow jednokratne test kazete obložene odgovarajućim agonistom agregacije i kuglicama obloženim fibrinogenom sustav je osmišljen za praćenje antiagregacijske terapije agonisti agregacije: iso-trap (praćenje inhibitora GPIIb/IIIa receptora) VerifyNow Aspirin test (inhibitori ciklooksigenaze 1) VerfyNow P2Y12 test (praćenje inhibitora ADP receptora) nije namijenjen ispitivanju poremećaja funkcije trombocita Viskozielasto metrija (TEG) uz dodatak modula za agregaciju TEG Platelet Mapping System trombelastografija - viskozielastometrija uzorak: heparinizirana puna krv (neutralizira učinak trombina kao snažnog agonista agregacije) agonisti agregacije: arahidonska kis. (AA), ADP usporedba krivulje klasične TEG i krivulje nakon dodatka agonista agregacije

21 Agregometrija trombocita u praćenju antiagregacijske (antitrombocitne) terapije Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

22 Trombociti i arterijska tromboza Ateroskleroza kronična upalna bolest stijenke krvne žile Kardiovaskularna bolest Arterijska tromboza (AIM) Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

23 Trombociti i arterijska tromboza (2) 1 Adhezija 3 Agregacija 2 Aktivacija 4 Tromb

24 ANTIAGREGACIJSKI LIJEKOVI Ne-tienopiridin klopidogrel ticagrelor prasugrel Integrilin, ReoPro, Agrastat Inhibitori ciklooksigenaze-1 Inhbitori ADP receptora Inhibitori GPIIb/IIIa receptora Lijekovi pojedine skupine selektivno inhibiraju određeni put trombocitne aktivacije prevencija i liječenje akutnog koronarnog sindroma tijekom koronarnih intervencija u dugotrajnoj prevenciji kardiovaskularnih i cerebrovaskularnih incidenata Prema: Dade Behring, Holding GmbH, E 03/05

25 Antiagregacijski lijekovi Acetilsalicilna kiselina ireverzibilno inhibira COX-1 enzim Inhibicija sinteze tromboksana A2 (TXA2) vazodilatator i inhibitor agregacije trombocita vazokonstriktor i aktivator agregacije

26 Antiagregacijski lijekovi Inhibitori ADP (P2Y12) receptora P2Y12 1. Tienopiridini: Klopidogrel (Pigrel, Plavix) Prasugrel (Efient) 2. Ticagrelor (Brilique) (nije tienopiridin) Oksidacija klopidogrela u aktivni metabolit Tienopiridini metaboličkom transformacijom u jetri (citokrom P450) nastaje aktivni metabolit lijeka Prema: Vezanje Dade aktivnog Behring, metabolita Holding na ADP GmbH, receptor E 03/05 Prasugrel, ticagrelor jači antiagregacijski učinak, brži početak i dulje djelovanje u odnosu na klopidogrel

27 Antiagregacijski lijekovi ANTAGONISTI GPIIb/IIIa Antagonisti GPIIb/IIIa receptora Eptifibatide (Integrilin) Abciksimab (ReoPro) Tirofiban (Aggrastat) Snažna i potpuna inhibicija agregacije Trc-a GPIIb/IIIa receptor Intravenska primjena tijekom invazivnih kardioloških postupaka liječenja AIM INTEGRILINOM INHIBIRANA AGREGACIJA TROMBOCITA NALAZ AGREGACIJE TROMBOCITA NAKON 24 h neposredno nakon i.v. primjene lijeka GPIIb/IIIa receptor ADP=67% EPI=58% KOL=67% ADP=3% EPI=0% KOL=0%

28 Agregacija trombocita u praćenju antiagregacijske terapije mjerenje funkcije trombocita in vitro procjena stupnja inhibicije ostvarenog djelovanjem lijeka Praćenje antiagregacijske terapije 1. Ispitati terapijsku učinkovitost lijeka djeluje li lijek učinkovito na svoj molekularni cilj? 2. Predvidjeti klinički ishod (sekundarni ishemijski događaji - glavni nepovoljni klinički ishodi (MACE, engl. major clinical adverse events) 3. Podešavanjem vrste i doze lijeka spriječiti komplikacije (krvarenje i tromboza) Procjena oporavka funkcije trombocita nakon ukidanja antiagregacijske terapije prije operativnog zahvata

29 Rezultati dosadašnjih istraživanja: testovi funkcije trombocita mogu biti korisni u otkrivanju bolesnika rizičnih za razvoj neželjenih događaja, ali ne i za podešavanje terapije! PRO Postoji povezanost između visoke ostatne reaktivnosti Trc-a i pojave ishemijskih događaja u liječenih bolesnika CONTRA Nije dokazano da promjena terapije temeljena na rezultatu testa poboljšava klinički ishod Rezultat lab. testa agregacije Trc-a ne može biti kriterij za kliničku odluku promjeni doze ili vrste lijeka Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

30 Razlozi koji ograničavaju primjenu testova agregacije trombocita u praćenju antiagregacijske terapije 1. Primjena nespecifičnih testova (s obzirom na farmakološki cilj, odnosno agonist) (onemogućuje procjenu učinka lijeka) 2. Različiti podatci o pojavnosti neučinkovitog odgovora na lijek (pojavnost ovisi o metodi: specifične vs nespecifične metode) 3. Nema odluke o metodi i graničnoj vrijednosti koja se povezuje s neželjenim učincima liječenja (različiti testovi različite metodologije- različito izražavanje rezultata različite i neusporedive granične vrijednosti) 4. Nije dokazano da je povezanost visoke ostatne reaktivnosti trombocita isključivo posljedica neučinkovitog odgovora na lijek (ateroskleroza i posljedična aterotromboza su multičimbenične prirode!) 5. Ne postoje jasne kliničke preporuke o promjeni doze/vrste lijeka kada se lab. testom utvrdi neučinkovit odgovor na lijek 6. Nije poznato koja je vremenska točka mjerenja optimalna u odnosu na početak terapije (dosadašnje studije temelje se na jednokratnim mjerenjima, a ne na serijskim mjerenjima)

31 Interindividualna varijabilnost u odgovoru na antiagregacijske lijekove ( rezistencija na antiagregacijske lijekove) Rezistencija na lijek = nesposobnost lijeka da djeluje na određeni farmakološki cilj Inhibitor COX-1 enzima (ASA) Inhibitori ADP receptora nesposobnost lijeka da putem COX-1 inhibira sintezu TXA2 nesposobnost lijeka da inhibira P2Y12 receptor Wang TH i sur. Aspirin and clopidogrel resistance: an emerging clinical entity. Eur Heart J 2005;27: Rocca B i sur. Determinants of the interindividual variability in response to antiplatelet drugs. J Thromb Haem 2005;3: Verstuyft C, Simon T, Kim RB. Personalized medicine and antiplatelet therapy: ready for prime time? Eur Heart J 2009;30:1943:63.

32 Mogući uzorci i mehanizmi interindividualne varijabilnosti u odgovoru na antiagregacijsku terapiju Inhibitor COX-1 enzima: (ASA) Inhibitori ADP receptora (klopidogrel, prasugrel, ticagrelor) Smanjena bioraspoloživost lijeka (neadekvatna doza, neredovito uzimanje, slaba apsorpcija ASA iz GIT-a Interferencija s drugim lijekovima (nesteroidni antiupalni lijekovi (NSAIDs) mehanizmom kompeticije sprečavaju inhibiciju COX-1 enzima Nepotpuna inhbicija sinteze TXA2 Povećana osjetljivost trombocita na ADP i kolagen Polimorfizmi u genima za trombocitne receptore (GP IIb/IIIa, TXA2 receptor) i enzime (COX-1, COX-2, TXA2-sintaza) Povećana sinteza TXA2 alternativnim putevima (preko COX-2 enzima) u stanjima ubrzane izmjene trombocita u cirkulaciji Pojačani izražaj COX-2 enzima u stanjima stresa, upale ili infekcije u trombocitima, monocitima, makrofagima i endotelnim stanicama Smanjena bioraspoloživost lijeka (neredovito uzimanje, preniske ili neodgovarajuće doze, varijabilna crijevna apsorpcija (npr. pretile osobe trebaju veće doze) Interferencija s drugim lijekovima koji se također metaboliziraju putem citokroma P-450 (benzodiazepini, statini) lijekovi iz skupine tienopiridina Polimorfizmi enzima citokroma P450: CYP2C19 (klopidogrel); CYP3A4 (prasugrel) promijenjen odgovor na lijek Polimorfizam P2Y12 receptora (H2 haplotip receptora povećan broj receptora i posljedično smanjen učinak lijeka Pojačano oslobađanje ADP-a Alternativni putevi aktivacije trombocita (preko P2Y1 receptora)

33 Čimbenici kojima se pripisuje interindividualna varijabilnost ( rezistencija ) na antiagregacijsku terapiju: Slaba bioraspoloživost lijeka (neadekvatna doza, neredovito uzimanje lijeka, slaba apsorpcija iz GIT (ASA, klopidogrel) Funkcija jetre - metabolička aktivacija u jetri (klopidogrel) Interakcija s drugim lijekovima: klopidogrel + statini (CYP3A4) inhibiran metabolizam klopidogrela ASA + NSAIDS kompeticija za COX1 Polimorfizmi receptora/enzima Polimorfizam ADP receptora (H2 haplotip) - klopidogrel Polimorfne varijante CYP3A4 smanjeni odgovor na klopidogrel Alternativni izvori endogenih agonista nestab. angina, AIM, MU: TXA 2, COX2 (upalne st. i trombociti) ASA

34 Obilježja pojedinih metoda agregometrije u potencijalnoj primjeni praćenja bolesnika na antiagregacijskoj terapiji Inhibitor COX-1 enzima (ASA) Inhibitori ADP receptora PFA-100 uz KOL/EPI test može predvidjeti MACE, ali se smatra nedovoljno osjetljivm testom (nemaju svi liječeni bolesnici produžen KOL/EPI test), na test utječu drugi čimbenici neovisni o TXA2 (Hct, broj Trc-a i Erc-a, aktivnost vwf-a u plazmi). Zbog navedenih nedostataka potrebno je odrediti test prije i nakon uvođenja lijeka jer odgovor na ASA može biti neadekvatno interpretiran ukoliko se test izvodi samo nakon uvođenja terapije Optička agregometrija uz agonist arahidonsku kiselinu (AA) može predvidjeti MACE, ali složenost metode (dugotrajna i tehnički zahtjevna pretraga uz pripremu uzorka PRP-a i potreban veliki volumen uzorka) otežava primjenu u svakodnevnoj kliničkoj praksi VerifyNow test uz agonist AA - može predvidjeti MACE, osjetljiv i specifičan test za praćenje ASA MULTIPLATE uz agonist AA može predvidjeti MACE, metoda prikladna za svakodnevnu primjenu IMPACT ne predviđa MACE, nije prikladna metoda za praćenje ASA Impedancijska agregometrija uz agonist AA - može predvidjeti MACE, ali je nedovoljno ispitana u praćenju terapije aspirinom, izvodi se u uzorku pune krvi, te iako je manje tehnički zahtjevna u odnosu na optičku metodu, također treba veliku količinu uzorka PlateletWorks nedovoljno ispitana metoda, kliničku primjenu ograničava potreba za analizom neposredno nakon uzorkovanja (unutar nekoliko minuta) PFA-100 uz P2Y test test je još uvijek u fazi ispitivanja, različiti literaturni podatci koji se odnose na osjetljivost i specifičnost testa za praćenje terapije inhibitorima ADP receptora VerifyNow test uz agonist ADP - može predvidjeti MACE, osjetljiv i specifičan test za praćenje inhibitora ADP receptora (specifičnost testa osigurava korištenje prostaglandina PGE1 uz ADP agonist u test sustavu) Optička agregometrija uz agonist ADP može predvidjeti MACE, ali metoda nije dovoljno specifična za P2Y12 receptor, već ovisi i o P2Y1 receptoru čija aktivnost pokazuje veliku biološku varijabilnost, a odgovorna je za primarni agregacijski val ; složenost metode (dugotrajna i tehnički zahtjevna pretraga uz pripremu uzorka PRP-a, potreban veliki volumen uzorka) otežava primjenu u svakodnevnoj kliničkoj praksi MULTIPLATE uz agonist ADP predviđa MACE, metoda je prikladna za svakodnevnu primjenu Impedancijska agregometrija uz agonost ADP nedovoljno ispitana u praćenju terapije inhibitorima ADP receptora PlateletWorks nedovoljno ispitana metoda, kliničku primjenu ograničava potreba za analizom neposredno nakon uzorkovanja (unutar nekoliko minuta) IMPACT metoda je slabo ispitana u bolesnika na inhibitorima ADP receptora

35 Neovisno o metodi rabiti isključivo specifičan agonist agregacije za određenu skupinu lijekova! Lijek AA ADP KOL EPI Inhibitor COX-1 enzima (ASA) --/ /N /N /N Inhibitor ADP receptora N/ / N/ N/ Dvojna (kombinirana) terapija (ASA + inh. ADP) --/ / /N /N Primjenom agonista agregacije nespecifičnih za određeni lijek može se procijeniti samo ostatna aktivnost trombocita, ali ne i utvrditi neučinkovit odgovor na lijek Specifičan test može identificirati i one bolesnike koji prekomjerno reagiraju na lijek (preniska ostatna reaktivnost) i povećan rizik za krvarenje Terapijski prozor pojačani odgovor rizik krvarenja 50 smanjen odgovor rizik tromboze Agregabilnost trombocita uz ADP agonist (%) Seidel H i sur. Monitoring of antiplatelet therapy. Hamostaseologie 2011;31:41-51.

36 Agregometrija trombocita u procjeni oporavka funkcije trombocita nakon ukidanja antiagregacijske terapije Učinak antiagregacijskih lijekova na trombocite u cirkulaciji = 7-10 dana (životni vijek Trc-a u cirkulaciji!!! Funkcija inhibiranog enzima ili receptora se oporavlja za oko 10% dnevno rezultat ulaska novih trombocita u cirkulaciju!!! 5-6 dana je potrebno da bi se funkcija cirkulirajućih trombocita oporavila za oko 50%!!! Broj dana bez terapije (klopidogrel) ADP 36% EPI 35% KOL 37% ADP 40% EPI 37% KOL 40% ADP 50% EPI 45% KOL 42% ADP 69% EPI 64% KOL 70% Broj dana bez terapije (klopidogrel) 2 7 ADP 40% EPI 45% KOL 34% ADP 71% EPI 70% KOL 68% Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup

37 Tečaj trajnog usavršavanja HKMB: Trombociti interdisciplinarni pristup ADP = 89% EPI = 93% KOL = 86% ADP = 25% ASA + klopidogrel EPI = 43% KOL = 39% Hvala na pažnji...