1- NAUDOJIMO PASKIRTIS

Transcription

1 Platelia EBV-VCA IgM 1 plokštelė FERMENTINĖ IMUNOLOGINĖ ANALIZĖ, SKIRTA KOKYBINIAM IgM ANTIKŪNŲ PRIEŠ EPTEIN-BARR VIRUSĄ (VIRUSINĖS KAPSIDĖS ANTIGENĄ) NUSTATYMUI ŽMOGAUS SERUME 215/4 1- NAUDOJIMO PASKIRTIS Šis imunologinės analizės rinkinys yra skirtas kokybiniam IgM antikūnų prieš Epstein-Barr viruso virusinės kapsidės antigeną (VCA) nustatymui žmogaus serume. Platelia EBV-VCA IgM tyrimo rinkinį galima naudoti kartu su kitais Epstein-Barr serologiniais tyrimo rinkiniais (Platelia EBV- VCA IgG, Platelia EB-NA-1 IgG ir Platelia EBV-EA-D IgG) infekcinės mononukleozės diagnostikoje. 2 KLINIKINĖ REIKŠMĖ Epstein-Barr virusas yra dažnas žmogaus patogenas, kuriuo yra infekuoti 8% suaugusiųjų populiacijos Jungtinėse Valstijose metais atradus Epstein-Barr virusą, buvo nustatyta, kad šis virusas yra etiologiškai susijęs su stipriai plintančia žmonių liga infekcine mononukleoze. EBV taip pat yra susijęs su B ląstelių limfomomis nusilpusio imuniteto pacientuose, įskaitant pacientus po transplantacijos bei sergančius AIDS. Pagal morfologiją EBV yra priskiriamas Herpes virusų šeimai. Visiems dedervinės (Herpes) virusams būdinga tai, kad savo šeimininkams jie gali sukelti latentines infekcijas. Infekcinė mononukleozė (IM) yra ūminė savaime praeinanti limfoproliferacinė liga, kurią sukelia EBV. Nors pirminė EBV infekcija vaikystėje dažnai būna nesimptomatinė, beveik pusė-du trečdaliai pirminės infekcijos atvejų paauglystėje ar jaunystės periodu išsivysto į ligą infekcinę mononukleozę, kuriai būdingi tokie simptomai: karštinis faringitas, tonzilitas, limfadenopatija, bendras negalavimas, galvos skausmas, raumenų skausmai, blužnies- ir hepatomegalija, bėrimas ir leukocitozė. EBV infekcijos metu organizme formuojasi antikūnai prieš keturis skirtingus viruso kompleksus: EBV indukuotą branduolio antigeną (EBNA), EBV indukuotą ankstyvąjį antigeną (EA), virusinės kapsidės antigeną (VCA) ir EBV indukuotą membranos antigeną (MA). EA kompleksą sudaro du komponentai EA-D (difuzinis komponentas) ir EA-R (ribotas komponentas). IgM antikūnai prieš VCA yra aptinkami ankstyvoje ligos stadijoje. Ligos eigoje antikūnų kiekis didėja ir po 3-4 savaičių pasiekia piką, tada pradeda mažėti iki nebenustatomo lygio. 3 PROCEDŪROS PRINCIPAS Bio-Rad fermentinė imunosorbento analizė (ELISA) paremta biologinių medžiagų (t.y. antigenų)- gebėjimu adsorbuotis ant plastmasinių paviršių, tokių kaip polistitrenas (kietoji fazė). Platelia EBV-VCA IgM tyrime taikomas ELISA metodas, kuriame naudojami afiniškai išgryninti VCA antigenai, kuriais ir yra padengiami mikroplokštelės šulinėliai. Kai mikroplokštelėse imobilizuoti antigenai inkubuojami su pacientų serumo mėginiais, tai mėginiuose esantys antikūnai (jei yra) jungsis su imobilizuotais antigenais ir suformuos antigeno-antikūno kompleksą. Tyrimui galinčių trukdyti IgG ir IgM-RF pašalinimui serumas apdorojamas specialiu tirpalu. Antikūnų perteklius yra pašalinamas plovimo procedūros metu. Tada į šulinėlius įnešamas ožkos anti-žmogaus IgM globulinas, konjuguotas su krienų peroksidaze. Šis konjugatas jungiasi su antigeno-antikūno kompleksais. Konjugato perteklius išplaunamas ir tada į šulinėlius įnešamas substratas tetrametilbenzidinas (TMB). Jei paciento serume yra EBV-VCA antigenui specifinis IgM antikūnas, šulinėlio reakcijos spalva taps mėlyna. Sustabdžius fermentinę reakciją 1N H 2SO 4, šulinėlių spalva tampa geltona. Antikūnų koncentracijai serume proporcinga spalva yra matuojama spektrofotometru arba ELISA mikroplokštelių analizatoriumi. ELISA metodo jautrumas, specifiškumas ir rezultatų atsikartojimas yra panašus į antikūnų serologinių tyrimų charakteristikas, tokių kaip imunofluorescencija, komplemento fiksacija, hemagliutinacija ir radioimunofluorescencija.

2 4 RINKINIO SUDĖTIS Visi reagentai išimtinai skirti tik in vitro diagnostiniam naudojimui. R1 R2 R3 R4a R4b R5 R6 R7 R9 R1 Etiketė Reagentas Kiekis Mikroplokštelė : 12 juostelių (po 8 šulinėlius) dengtų inaktyvuotais afiniškai išgrynintais 1 Microplate EBV virusinės kapsidės antigenais (gp125); Laikoma folijos maišelyje su drėgmę sugeriančia medžiaga/drėgmės indikatoriumi). Concentrated Koncentruotas plovimo tirpalas (2 x) : 1x5ml Washing Tris buferis (ph 7.2 ±.2) su 1% Tween 2. Solution Konservantas: Proclin 3 (.1%). (2x) Non Reactive control Positive Control I Positive Control II Calibrator Conjugate Diluent II Chromogen TMB Stopping Solution Nereaktyvi anti-ebv-vca IgM antikūnų kontrolė (žmogaus); Neigiama pagal HBs Ag ir ŽIV- 1, ŽHIV-2 ir HCV antikūnus. Konservantai : natrio azidas (<.1%) ir pen/strep (.1%) Teigiama kontrolė I (žmogaus) su anti-ebv-vca IgM antikūnais; Neigiama pagal HBs Ag ir ŽIV-1, ŽHIV-2 ir HCV antikūnus. Konservantai : natrio azidas (<.1%) ir pen/strep (.1%) Teigiama kontrolė II (žmogaus) su anti-ebv-vca IgM antikūnais; Neigiama pagal HBs Ag ir ŽIV-1, ŽHIV-2 ir HCV antikūnus; Konservantai : natrio azidas (<.1%) ir pen/strep (.1%) Anti-EBV-VCA IgM antikūnų kalibratorius (žmogaus), specifinis rinkinio faktorius nurodytas išorinės dėžutės etiketėje. Neigiama pagal HBs Ag ir ŽIV-1, ŽIV-2 ir HCV antikūnus; Konservantai : natrio azidas (<.1%) ir pen/strep (.1%) Konjugatas (paruoštas naudojimui): ožkos antikūnai prieš žmogaus IgM, konjuguoti su krienų peroksidaze. Konservantai: Proclin 3 (.1%) ir gentamicinas Skiedimo tirpalas II: paruoštas naudojimui buferis (ph7.5) su baltymų stabilizatoriais. Ožkos/avies anti-žmogaus IgG, naudojama IgG pašalinimui iš serumo; Konservantas: Proclin 3 (.1%) Chromogeno/substrato tirpalas (paruoštas naudojimui): Tetrametilbenzidinas (TMB). Nenaudojamą reagentą reikia laikyti gerai uždarytą, nes laikant kitaip, reakcijos šulinėliuose gali iškristi nuosėdos. Sustabdymo tirpalas (paruoštas naudojimui): 1N sieros rūgštis 1x.4ml 1x.4ml 1x.4ml 1x.4ml 1x16ml 2x45ml 1x15ml 1x15ml 5- ĮSPĖJIMAI IR ATSARGUMO PRIEMONĖS Atsargumo priemonės Patikimus tyrimo rezultatus gausite laikydamiesi Geros Laboratorinės Praktikos principų: Nenaudokite reagentų pasibaigus galiojimo laikui. Vienam tyrimui nenaudokite reagentų iš skirtingų serijų. PASTABA: Kai kuriuos reagentus galima naudoti ir iš kitų rinkinio serijų, tačiau būtina, kad vienoje tyrimo procedūroje būtų naudojami vienos serijos reagentai: plovimo tirpalas (R2), Chromogeno/Substrato tirpalas (R9) ir sustabdymo tirpalas (R1). Šiuos reagentus galima naudoti su Platelia EBV-VCA IgG, Platelia EBV-EA-D IgG ir Platelia EB-NA-1 IgG rinkiniais. Dėl išsamios informacijos kreipkitės į mūsų techninį centrą. Prieš naudojimą, leiskite reagentams stabilizuotis 3 minučių kambario temperatūroje (18-3 C). Kruopščiai paruoškite reagentus, neužkrėskite. Tyrimo negalima atlikti tose patalpose, kur yra reaktyvių garų (rūgščių, šarmų, aldehidų garų) ar dulkių, kurie gali paveikti konjugato fermentinį aktyvumą. Naudokite kruopščiai išplautus ir dejonizuotu vandeniu išskalautus stiklinius indus. Rekomenduojama naudoti vienkartines priemones. Neleiskite mikroplokštelei išdžiūti tarp plovimo ir reagentų paskirstymo etapų.. Fermentinė reakcija yra labai jautri metalams ar metalų jonams. Todėl į įvairius tirpalus, kuriuose yra konjugato ar substrato tirpalų negalima pamerkti jokių metalinių elementų. Ryškalo tirpalas (substrato buferis + chromogenas) turi būti bespalvis. Jei po reagento paruošimo dviejų minučių laikotarpyje susidaro tirpalo spalva, vadinasi reagento naudoti negalima, jį reikia pakeisti kitu tirpalu. Kiekvienam mėginiui paskirstyti naudokite naują antgalį. Šulinėlių plovimas yra kritinis procedūros žingsnis: laikykitės nurodyto plovimo ciklų skaičiaus, patikrinkite, ar visi šulinėliai yra pilnai užpildomi ir nusiurbiami. Dėl netinkamo plovimo gali būti gauti netikslūs rezultatai. Niekada nenaudokite tų pačių priemonių konjugato ir ryškalo tirpalo paskirstymui. Patikrinkite, ar pipetės ir kita įranga veikia tinkamai. Nekeiskite tyrimo procedūros.

3 Sveikatos apsaugos ir saugumo instrukcijos Visi rinkinio reagentai yra skirti tik diagnostikai in vitro. Dirbdami su reagentais, dėvėkite vienkartines pirštines. Netraukite skysčio su burna. Žmogaus organizmo kilmės medžiaga, naudota reagentų gamybai, buvo patikrinta ir patvirtinta neigiama pagal hepatito B paviršiaus antigeną (HBsAg), žmogaus imunodeficito viruso anti-živ1, anti-živ2 ir hepatito C viruso anti-hcv antikūnus. Kadangi nėra metodų, pilnai užtikrinančių, kad infekcinių agentų nėra, todėl su reagentais ir mėginiais reikia dirbti kaip su infekcines ligas galinčia pernešti medžiaga. Stenkitės neišpilti mėginių ir tirpalų su mėginiais. Bet kokios priemonės, kontaktavusios su mėginiais ir žmogaus organizmo kilmės reagentais, bei buferiniai tirpalai yra pripažįstami užterštomis medžiagomis. Nuopylos turi būti nuplautos 1% baliklio tirpalu. Jei nuopylos yra rūgštinės, paveiktą vietą pirmiausia reikia neutralizuoti natrio bikarbonatu, tada nuvalyti balikliu ir po to nusausinti sugeriamuoju popieriumi. Valymui naudotą medžiagą reikia išmesti į užkrėstų atliekų konteinerį. Mėginiai, žmogaus organizmo kilmės reagentai bei užkrėstos medžiagos ir produktai turi būti nukenksminami. - pamerkus į 5% natrio hipochlorido tirpalą 3 minučių, arba - autoklavuojant 121 C mažiausiai 2 valandas. Autoklavavimas yra geriausias metodas ŽIV ir HBV virusų inaktyvacijai. DĖMESIO: Į AUTOKLAVĄ NEDĖKITE TIRPALŲ SU NATRIO HIPOCHLORIDU. Chemines medžiagas reikia naudoti ir utilizuoti laikantis Geros Laboratorinės Praktikos principų. Venkite gleivinės ir odos kontaktų su substrato buferiu, chromogenu ir sustabdymo tirpalu (toksiškas, dirginantis, deginantis). Kai kurių reagentų sudėtyje yra konservanto natrio azido. Laboratorijos nutekamuosiuose vamzdynuose natrio azidas gali sudaryti vario ar švino azidus. Šie junginiai yra sprogstamosios medžiagos. Todėl, kad vamzdžiuose nesikauptų azidai, išpylus į kriauklę inaktyvuotus natrio azido turinčius tirpalus, nuopylas nuplaukite dideliu kiekiu vandens. Su kai kuriomis šio testo rinkinio cheminėmis medžiagomis susijusių pavojų ir atsargumo priemonių rekomendacijos pateikiamos etikečių piktogramose ir naudojimo instrukcijų gale pateikiamoje informacijoje. Saugos duomenų lapą galima rasti 6- REIKALINGOS NETIEKIAMOS PRIEMONĖS Maišyklė. Mikroplokštelių analizatorius su 45 nm filtrais (*). Vandens vonelė ar panašaus tipo mikroplokštelių inkubatorius, 37±1 C (*). Konteineris biologiškai pavojingoms atliekoms. Natrio hipochlorodas (baliklis) ir natrio bikarbonatas. Distiliuotas ar dejonizuotas vanduo. Graduoti cilindrai. Vienkartinės latekso pirštinės. Apsauginiai akiniai. Sugeriamasis popierius. Automatinės, pusiau automatinės, reguliuojamos ar fiksuotos pipetės ar daugiakanalės pipetės 1, 1 ir 1 µl tūrių Rankinis, pusiau automatinis ar automatinis mikroplokštelių plovėjas (*). Vienkartiniai mėgintuvėliai. (*) Išsamesnę informaciją apie prietaisus, patvirtintus jūsų techninio aptarnavimo centre, galite gauti kreipdamiesi į firmos atstovus. 7- REAGENTŲ PARUOŠIMAS IR LAIKYMO SĄLYGOS Rinkinys laikomas +2-8 C temperatūroje iki nurodytos galiojimo datos (nebent nurodyta kitaip). Prieš naudojimą sušildykite reagentus iki kambario temperatūros ( C). Po naudojimo visus reagentus padėkite atgal į šaldytuvą. 1) Paruošti naudojimui reagentai Reagentas 1 (R1): mikroplokštelė Kiekviename dėkle yra 12 juostelių. Kiekviena juostelė yra supakuota maišelyje. Žirklėmis ar skalpeliu nukirpkite pakuotę ties,5-1 cm virš linijos. Išimkite juostelę, o nepanaudotas juosteles iškart sudėkite atgal į maišelį ir gerai uždarykite. Laikykite +2 C - +8 C. Šiose sąlygose laikomos juostelės išlieka stabilios 1 mėnesį.

4 Reagentas 3 (R3): nereaktyvi kontrolė Reagentas 4a (R4a): teigiama kontrolė I Reagentas 4b (R4b): teigiama kontrolė II Reagentas 5 (R5): kalibratorius Reagentas 6 (R6): konjugatas Reagentas 7 (R7): skiedimo tirpalas II Reagentas R9: Chromogeno/Substrato tirpalas Reagentas1 (R1): sustabdymo tirpalas 2) Reagentai, kuriuos reikia ruošti Reagentas 2(R2): plovimo tirpalo koncentratas 2x Skieskite 5 ml 2X plovimo tirpalo koncentrato su 1. l distiliuoto ar dejonizuoto vandens, gausite paruoštą naudojimui tirpalą. Po skiedimo tirpalą galima laikyti 5 dienas +2-8 C. 8 MĖGINIŲ PAĖMIMAS IR NAUDOJIMAS Kraujo mėginius reikia paimti standartinėmis procedūromis. Tyrimui galima naudoti serumą ar plazmą. Serumą ar plazmą nuo eritrocitų reikia atskirti kaip galima greičiau, kad mėginys nehemoliziuotų. Stipri hemolizė gali paveikti tyrimą. Jei mėginiuose yra matomų dalelių, prieš tyrimą mėginius reikia nucentrifuguoti. Fibrino dalelių ar agregatų suspensija gali duoti klaidingai teigiamus rezultatus. Mėginius galima laikyti +2-8 C temperatūroje, jei jie bus tiriami 5 dienų laikotarpyje. Arba mėginius galima užšaldyti -2 C temperatūroje keliems mėnesiams. Venkite pakartotinių užšaldymo/atitirpinimo ciklų. Jei mėginius reikia transportuoti, jie turi būti supakuojami remiantis etiologinių agentų transportavimo reikalavimais. NENAUDOKITE UŽKRĖSTŲ, HIPERLIPEMINIŲ, GELTINIŲ, STIPRIAI HEMOLIZIUOTŲ IR AUKŠTOJE TEMPERATŪROJE INAKTYVUOTŲ SERUMŲ. 9- TYRIMO PROCEDŪRA Griežtai laikykitės nurodytos procedūros. Tyrimo rezultatų patvirtinimui kiekvieną kartą naudokite kontroles. Laikykitės Geros Laboratorinės Praktikos principų. 1. Paruoškite mėginių paskirstymo ir identifikavimo schemą. 2. Paruoškite skiestą plovimo tirpalą (R2) (žr. sk. 7). 3. Iš apsauginės pakuotės išimkite dėklą ir juosteles (R1). Reikiamą skaičių antigenais dengtų juostelių sudėkite į rėmelį. Vieną šulinėlį palikite atskaitos taško (blank) nustatymui, 3 šulinėlius kalibratoriui, ir po 1 šulinėlį neigiamai, teigiamai I ir teigiamai II kontrolėms A B1 S2 B R3 S3 C R4a S4 D R4b S5 E R5 S6 F R5 S7 G R5 S8 H S1 S9 4. Visus mėginius, kalibratorius ir kontroles prieš naudojimą gerai sumaišykite. Mėgintuvėliuose arba skiedimo plokštelėje skieskite tiriamuosius mėginius, kalibratorių, neigiamą ir teigiamas kontroles santykiu 1:81 (pvz., 1 µl + 8 µl) su skiedimo tirpalu II R7. 5. Į atitinkamus šulinėlius įneškite po 1 µl skiestų kalibratoriaus, kontrolių ir paciento mėginių. Į atskaitos taško šulinėlį (blank) įneškite 1 µl mėginių skiedimo tirpalo II (R7). 6. Inkubuokite mikroplokštelę 3 minučių ± 2 min. kambario temperatūroje (21-25 C). 7. Nusiurbkite iš šulinėlių skystį ir išpilkite į biologiškai pavojingų atliekų konteinerį (su natrio hipochloridu). Tada į kiekvieną šulinėlį iškart įneškite po maždaug 3 µl plovimo tirpalo. Vėl nusiurbkite skystį. Pakartokite šią procedūrą mažiausiai dar 4 kartus (iš viso 5 plovimo ciklai). Jei reikia, apverskite plokštelę ant sugeriamojo popieriaus, kad skystis pilnai nutekėtų. Jei naudojamas automatinis mikroplokštelių plovimo įrenginys, būtina laikytis tokios pačios plovimo procedūros. 8. Į visus šulinėlius įneškite po 1 µl paruošto naudojimui konjugato (R6). 9. Inkubuokite mikroplokštelę 3 minučių ± 2 min. kambario temperatūroje (21-25 C). 1. Nusiurbkite iš šulinėlių skystį ir plaukite 5 kartus, kaip nurodyta aukščiau. 11. Į visus šulinėlius greitai įneškite po 1 µl Chromogeno/Substrato tirpalo (R9). 12. Reakcija vyksta tamsoje 1 minučių ± 2 min. kambario temperatūroje (21-25 C). Šios inkubacijos metu nenaudokite lipnios plėvelės. Chromogeno/Substrato tirpalas taps mėlynos spalvos tuose šulinėliuose, kuriuose yra nustatomas IgM antikūnų kiekis.

5 13. Į visus šulinėlius įneškite po 1 µl sustabdymo tirpalo. Švelniai pakratykite plokštelę, kad šulinėlių turinys gerai susimaišytų. Įnešus sustabdymo tirpalo, mėlynų šulinėlių spalva taps geltona. 14. Palaukite mažiausiai 5 minutes, tada analizuokite šulinėlių reakcijas. Atsargiai nušluostykite plokštelės apačią. Per 3 minučių po sustabdymo tirpalo įnešimo mikroplokštelių analizatoriumi matuokite optinį tankį 45 nm bangoje (iki analizavimo plokšteles reikia laikyti tamsoje). 15. Patikrinkite, ar gauti rezultatai atitinka sudarytą plokštelės paskirstymo ir identifikacijos schemą. 1- REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS IR INTERPRETACIJA 1) Absorbcijos vidurkio apskaičiavimas 1. Ribinės vertės kalibratoriaus OD (optinio tankio) vidurkis ribinės vertės kalibratoriaus OD vidurkis apskaičiuojamas iš trijų kalibratoriaus R5 optinio tankio reikšmių. Jei nors viena iš šių reikšmių nuo vidurkio reikšmės skiriasi daugiau nei 15%, tą reikšmę reikia atmesti, o vidurkį perskaičiuoti iš dviejų likusių reikšmių. 2. Korekcijos faktorius norint kompensuoti kasdieniu tyrimo rezultatų svyravimus dėl aplinkos temperatūrų ir trukmės svyravimų, kiekvienam rinkiniui yra nustatytas korekcijos faktorius. Korekcijos faktorius yra nurodytas kalibratoriaus buteliuko etiketėje. 3. Ribinė kalibratoriaus vertė kiekvieno tyrimo ribinė kalibratoriaus vertė yra nustatoma korekcijos faktorių padauginus iš ribinės vertės kalibratoriaus OD vidurkio (nustatyti 1 žingsnyje), 4. ISR reikšmė kiekvieno mėginio atsparumo būklės santykis (ISR) apskaičiuojamas mėginio OD reikšmę padalijus iš ribinės vertės kalibratoriaus OD reikšmės (nustatyta 3 žingsnyje). Pavyzdys : kalibratoriaus OD reikšmės =.38,.4,.42 Kalibratoriaus OD vidurkis =.4 Korekcijos faktorius =.5 Kalibratoriaus ribinė vertė =.5 x.4 =.2 Nustatyta paciento serumo OD reikšmė =.6 ISR reikšmė =.6/.2 = 3. 2) Tyrimo patvirtinimas 1. Atskaitos taškos šulinėlio (optinis tankis išmatuotas prieš orą) OD turi būti < nm bangoje: OD RB < Neigiamos kontrolės R3 OD turi būti nm bangoje (išmatuota prieš atskaitos taško šulinėlį): OD R Kiekvieno kalibratoriaus R5 OD tyri būti nm bangoje (išmatuota prieš atskaitos taško šulinėlį): OD R Teigiamos kontrolės R4b OD turi būti.5 45 nm bangoje (išmatuota prieš atskaitos taško šulinėlį): OD R4b.5 5. Neigiamos, teigiamos I ir teigiamos II kontrolių (R3, R4a, R4b) ISR (atsparumo būklės santykis) reikšmės turi patekti į šių kontrolių buteliukų etiketėse nurodytas ribas. Jei šie kriterijai neišpildomi, tyrimas yra negaliojantis, todėl jį reikia atlikti iš naujo. 3) Rezultatų interpretacija Paciento ISR (atsparumo būklės santykio) reikšmės interpretuojamos taip: ISR reikšmė Rezultatas Interpretacija.9 Neigiamas Nereikšmingas EBV-VCA IgM antikūnų kiekis Abejotinas Mėginių tyrimus reikia pakartoti 1.1 Teigiamas Reikšmingas EBV-VCA IgM antikūnų kiekis. Rodo esamą arba buvusią infekciją. 1. Rekomenduojamas toks gautų rezultatų pateikimas: Šie rezultatai buvo gauti su Platelia EBV-VCA IgM tyrimo rinkiniu. Skirtingais metodais gautų reikšmių negalima naudoti vienoje rezultatų interpretacijoje. Nurodyta IgM kiekio reikšmė nerodo tikrojo antikūnų titro. 2. Tiksli EBV infekcijos interpretacija yra paremta keturių skirtingų EBV antikūnų (IgG prieš EBV-branduolio antigeną (EB-NA), IgG prieš EBV-ankstyvąjį antigeną (EBV-EA), IgG ir IgM prieš virusinės kapsidės antigeną (EBV-VCA)) nustatymo rezultatais, kurie papildo bendrą EBV infekcijos klinikinį vaizdą. Tikslią EBV infekcijos diagnozę galima pateikti tik turint šių keturių grupių antikūnų nustatymo rezultatus. Diagnozės negalima nustatyti pagal vieno tyrimo rezultatus. 3. Jei po pakartotinio tyrimo mėginio rezultatai vėl lieka abejotini, mėginį reikia ištirti kitu metodu, pvz., imunofluorescenciniu (IFA) metodu. Jei rezultatai ir vėl išlieka abejotini, reikia paimti kitą mėginį. 4) Laukiamos reikšmės Ūminė fazė EBV-VCA IgM kiekis greitai didėja ankstyvoje ūminėje stadijoje. Šio tipo antikūnus galima nustatyti anksčiau arba kartu su EBV- VCA IgG ir EB-NA-1 IgM ir heterofiliniais antikūnais. EBV-VCA IgM kiekis vėlyvoje stadijoje krinta kartu su EB-NA-1 IgM, tačiau EBV-VCA IgG išlieka. Pereinamoji fazė EBV-VCA IgM kiekis krenta iki labai mažo, maždaug tokio, nuo kurio EB-NA-1 IgG pradeda didėti. EBV-VCA IgG išlieka. Sveikimo fazė EBV-VCA IgM kiekis labai mažas, beveik neigiamas, tuo tarpu EB-NA-1 IgG kyla iki didelių kiekių.

6 5) Paplitimas Platelia EBV-VCA IgM tyrimo rinkiniu buvo patikrinti 158 serumo mėginiai, paimti iš sveikų, įvairaus amžiaus ir lyties bei įvairių geografinių JAV zonų asmenų. Platelia EBV-VCA IgM tyrimu teigiamais buvo nustatyti 2.5 % mėginių, o 1,9% sudarė abejotino rezultato mėginiai. Šiame tyrime nustatytų ISR reikšmių pasiskirstymas duotoje populiacijoje pavaizduotas žemiau. ISR reikšmių pasiskirstymas normalioje populiacijoje (n=158) Lentelėje žemiau pateikiama pagal amžių suskirstytos normalios populiacijos rezultatų santrauka: Amžius Neigiami Abejotini Teigiami Viso Viso ) Apribojimai 1. Nesilaikant tyrimo procedūros ar šio rinkinio pakuotės instrukcijų, gausite abejotinus rezultatus. Neatsikartojančios ar negaliojančios reakcijos dažniausiai gaunamos dėl: - Nepakankamo mikroplokštelių plovimo, - Neigiamų mėginių užteršimo serumo ar plazmos mėginiais su dideliu antikūnų titru; - Ryškinimo tirpalo užteršimo oksiduojančiais agentais (balikliu, metalų jonais ir kt.), - Sustabdymo tirpalo užteršimo. Užkrėstų, geltinių, lipeminių, hemoliziuotų ar aukštoje temperatūroje inaktyvuotų serumų tyrimo rezultatai gali būti klaidingi, todėl šių mėginių naudoti nerekomenduojama. Tyrimo charakteristikos nustatytos tik serumo mėginiuose. 2. Šio tyrimo rezultatus galima interpretuoti tik atsižvelgiant į kitus klinikinius duomenis ir diagnostines procedūras. Šis tyrimas yra skirtas imuninio atsako nustatymui, pagal kurį galima nustatyti pirminę infekciją ar viruso reaktyvaciją. Tyrimo charakteristikos nenustatytos šio tipo pacientų mėginiuose: nosiaryklės karcinomos, Burkitt limfomos, kitų su EBV susijusių limfodenopatijų, ir kitų su EBV susijusių ligų, (ne EBV infekcinės mononukleozės). Platelia EBV-VCA IgM tyrimai, atlikti su nusilpusio imuniteto pacientų mėginiais, turi būti interpretuojami atsargiai. Šio tyrimo charakteristikos pediatriniuose mėginiuose taip pat nenustatytos. Nesant nustatomo EBV-VCA IgM antikūnų kiekio, nereiškia, kad atmetama esamos ir praėjusios infekcijos galimybė. Mėginys galėjo būti paimtas prieš antikūnų susidarymą arba po to, kai antikūnai jau yra nebeaptinkami. Jei EBV infekcija vis tiek yra įtariama, po 5-7 dienų reikia paimti kitą mėginį ir pakartoti tyrimą. Tačiau dažnai tyrimo metu IgM antikūnų koncentracijos jau yra mažėjimo stadijoje.

7 Specifiniai IgG gali konkuruoti su IgM dėl sąveikos vietų, todėl tyrimo rezultatas gali būti klaidingai neigiamas. Priešingai, reumatoidiniai faktoriai, esant specifiniams IgG, gali duoti klaidingai teigiamą reakciją. Ožkos/avies anti-žmogaus IgG, esantis Serumo Skiedimo Tirpale Plus, silpnina specifinių IgG konkurenciją ir mažina galimą reumatoidinių faktorių įtaką. Kai kuriuose ELISa metoduose antibranduoliniai antikūnai gali sąlygoti klaidingai teigiamas reakcijas. 11-CHARAKTERISTIKOS 1 Santykinis jautrumas ir specifiškumas, nustatyti pagal serumo apibūdinimą Šimtas šešiasdešimti šeši atrinkti serumo mėginiai buvo tiriami klinikinėje laboratorijoje. Tyrimuose naudoti serumo mėginiai buvo serologiškai neigiami (jokių serologinių praėjusios ar esamos EBV infekcijos požymių), ūminės fazės (su EBV-VCA IgM ir heterofiliniais antikūnais, be EBV-VCA IgG) ir serologiškai teigiami (su EBV-VCA IgG antikūnais ir RBV-NA IgG, be EBV-VCA IgM ar heterofilinių antikūnų, rodančių praėjusią infekciją). Serumų apibūdinimui buvo naudoti komerciniai ELISA tyrimai. Tyrimo jautrumas, specifiškumas ir rezultatų atsikartojimas ir buvo nustatyti pagal serumo mėginių apibūdinimą. Buvo priimta, kad EBV- VCA IgM atsakas turi būti neigiamas serologiškai neigiamame ir sveikimo stadijos serume, ir teigiamas ūminės stadijos serume. Rezultatai pateikiami lentelėje žemiau: Platelia EBV-VCA IgM Teigiamas Abejotinas Neigiamas Viso Ūminis EBV-VCA IgM + EB-NA IgG - heterofiliniai Serologiškai teigiamas EBV-VCA IgG + EB-NA IgG + EBV-VCA IgM - heterofiliniai Serologiškai neigiamas EBV-VCA IgG - EB-NA IgG - EBV-VCA IgM - heterofiliniai Santykinis jautrumas (ūminis) = 37/38 = 97.4 % 95 % Leistinas intervalas = 92.2 % - 1 % Santykinis specifiškumas (serologiškai neigiamas) = 27/28 = 96.4 % 95 % Leistinas intervalas = 89.4 % - 1 % Santykinis specifiškumas (serologiškai teigiamas) = 98/99 = 99. % 95 % Leistinas intervalas = 97. % - 1 % Santykinis sutapimas = 162/165 = 98.2 % 95 % Leistinas intervalas = 96.1 % - 1 % Abejotini rezultatai į apskaičiavimus nebuvo įtraukti. Abejotinų rezultatų mėginiai pakartotinai tirti nebuvo. 95 % leistinas intervalas buvo apskaičiuotas normaliniu metodu. Nepamirškite, kad santykinis reiškia šio tyrimo rezultatų palyginimą su kito panašaus tyrimo rezultatais. Koreliacija tarp tyrimo rezultatų ir ligos buvimo/nebuvimo tirta nebuvo. Ligos negalima nustatyti lyginant tyrimo tikslumo reikšmes. 2 Rezultatų atsikartojimas (Tyrimo tikslumas) Platelia EBV-VCA IgM tyrimo tikslumas buvo įvertintas tiriant tris serumo mėginius po dešimt kartų toje pačioje plokštelėje. Rezultatai pateikiami lentelėje žemiau: Serumas n X S.D. CV % Neigiamas Silpnai teigiamas Teigiamas X = ISR reikšmės vidurkis S.D. = standartinis nuokrypis C.V. = nukrypimo koeficientas 3 Rezultatų atsikartojimas (Skirtingų tyrimų tikslumas) Platelia EBV-VCA IgM tyrimo tikslumas buvo įvertintas tiriant tris serumo mėginius po dešimt kartų tris skirtingas dienas. Rezultatai pateikiami lentelėje žemiau: Serumas n X S.D. CV % Neigiamas Silpnai teigiamas Teigiamas

8 4 Tarpusavio reaktyvumas Tyrimui buvo naudoti serumo mėginiai su ELISA metodu nustatytais IgM antikūnais prieš Herpes Simplex Virusą I & II, citomegalovirusą, Varicella-Zoster virusą. Taip pat buvo naudojami mėginiai, turintys reumatoidinių faktorių. Tyrimai buvo atliekami komerciniais ELISA rinkiniais. Lentelėje žemiau pateikti duomenys rodo, kad antikūnai prieš Herpes Simplex virusus ir serumai, turintys RF, nepasižymi tarpusavio sąveika su Platelia EBV-VCA IgM komponentais. Tarpusavio reaktyvumo tyrimas su Platelia EBV-VCA IgM Specifiškumas RF+ RF+ RF+ RF+ RF+ VZV IgM+ VZV IgM+ VZV IgM+ VZV IgM+ VZV IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 1 IgM+ HSV 2 IgM+ HSV 2 IgM+ HSV 2 IgM+ HSV 2 IgM+ CMV IgM+ CMV IgM+ CMV IgM+ CMV IgM+ Platelia EBV-VCA IgM Kitas metodas NAUDOTA LITERATŪRA 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt s Lymphoma. Lancet. 1: Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G Achong Studies wilth Burkitt s Lymphoma. Wister Inst. Sympos. Monogr. 4: Schooley, R.T. and R. Dolin Epstein-Barr Virus (Infectious Mononucleosis), 2nd edition. In: Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G.L., R.G.Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York. Pp Henle, W. and Henle G. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Stematsky, eds. Marcel Dekker, Inc. NR. Basel Tobi, M. and S.E. Straus Chronic Epstein-Barr Virus Diseas: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 13 (6(pt. 1)): Birx, D. L., R.R. Redfield, and G. Tosarto Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Aquired Immunodefiency Syndrome (AIDS) or AIDS-Related Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14): Gottlieb-Sematsky, T. and Glaser, R Assocation of Epstein-Barr Virus with Neurological Diseases. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Sematsky, eds. Marcel Dekker, Inc., NR. Basel. 8. Henle, G., W. Henle and V. Diehl Relation of Burkitt s Tumor-Associated Herpes-Type Virus to Infectious Mononucleosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59: Henle G., and W. Henle The Virus as the Etiologic Agent of Infectious Mononucleosis. In: The Epstein-Barr Virus. Berlin Sprihger-Verlag. Pp Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab. Mgmt. Oct., pp Lenelle, E.T. and W. Henle Epstein-Barr Virus Infections: Clinical and Serological Features. Laboratory Mgmt. Oct., pp Nikoskelainen, J. and P. Hanninen Antibody Response to Epstein-Barr Virus in Infectious Mononucleosis. Infect. Immun. 11: Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and other EBV Infections: Diagnostic Factors. Laboratory Management. pp Henle, W. and G. Henle Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. New Eng. J. Med. 228: Engvall, E. and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-Labeled Anti-Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 19: Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs Immunoassay Using Antigen-Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15: Engvall, E., and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:

9 18. Engvall, E. and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. In: Proteins of the Biological Fluids, H. Peeters, ed., Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge Oxford. Pergamon Press. p Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman Enzyme- Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme-Labelled Antigen and Antibody-Coated Tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251: CDC/NIH Interagency Working Group BioSafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 3rd edition. U.S. Dept. Of Health and Human Services, Public Health Service. pp Drew, W.L Diag. Med. 6: Lennete, E.T. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. Chapter Okano, M Clinical Microbiology Reviews. Epstein-Barr Virus and Human Diseases. Recent Advances in Diagnosis. Vol.1, p Baltz, M Identifying Stages of EBV Infection. In: American Clinical Lab. pp Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Hayward, G.S., and Hayward, S.D Functional Domains of Epstein- Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1. Journal of Virology, ASM. Vol. 65, No.3, pp Davidsohn, I Serologic Testing of Infectious Mononucleosis. Journal of American Medical Association. 183: Evans, A.S History of Infectious Mononucleosis. In: American Journal of Medical Science. 267: Lennette, E.T Herpesviridae: Epstein-Barr Virus. In: Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases, Principles and Practice. Vol. II. Lennette, E.H., Halonen, P., Murphy, F.A., eds. Springer-Verlag, NY. pp Bakerman, S Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp Voller, A. and D. E. Bidwell, Brit. J. Exp. Pathology 56 : R. Sohier, R.J. Freund, G. de-thé, N.E. Day, A. Geser and G. Denhaut Seroepidemiology of Herpesvirus Type Epstein-Barr in Blood Donors from Communities around Lyon. American Journal of Epidemiology. Vol. 99, No.6, pp

10

11 TRINITY BIOTECH USA, 2823 Grits Road, Jamestown, NY, 1471 TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow Ireland Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 9243 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 () Fax. : +33 () /4