QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA pakuotės informacinis lapelis

Transcription

1 QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA pakuotės informacinis lapelis 2 x 96 (katalogo nr ) 20 x 96 (katalogo nr ) IFN-γ gryno kraujo testas reakcijai į ESAT-6, CFP-10 ir TB7.7(p4) peptidų antigenus nustatyti Skirtas in vitro diagnostikai , Cellestis, QIAGEN Company Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148, Australija Tel. (Australija) QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse Hilden, VOKIETIJA LT leid

2

3 Turinys 1. Numatytoji paskirtis 4 2. Tyrimo santrauka ir paaiškinimas 4 Tyrimo principai 5 Tyrimo trukmė 5 3. Komponentai ir laikymo sąlygos 6 Būtinos, bet nepateikiamos priemonės 7 Sandėliavimas 8 4. Perspėjimai ir atsargumo priemonės 8 Skirtas in vitro diagnostikai 8 Įspėjimai 8 Atsargumo priemonės 9 5. Mėginių paėmimas ir apdorojimas Naudojimo instrukcija 12 1 etapas. Kraujo mėginio inkubavimas ir plazmos paėmimas 12 2 etapas. Žmogaus IFN-γ ELISA Skaičiavimas ir rezultatų aiškinimas 17 Standarto kreivės sudarymas 17 Testo kokybės patikrinimas Apribojimai Efektyvumo charakteristikos 20 Klinikiniai tyrimai Techninė informacija 22 Neaiškūs rezultatai 22 Sukrešėję plazmos mėginiai 22 Trikčių šalinimo vadovas Literatūra Techninis klientų aptarnavimas TRUMPAS TESTO PROCEDŪROS APRAŠAS 28 1 etapas. Kraujo mėginio inkubavimas 28 2 etapas. IFN-γ ELISA 28 SVARBŪS PAKEITIMAI 30 QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

4 1. Numatytoji paskirtis QuantiFERON-TB Gold (QFT ) yra in vitro diagnostinis testas, kurį sudaro peptidų mišinys, imituojantis ESAT-6, CFP-10 ir TB7.7(p4) proteinus, kad būtų stimuliuojamos ląstelės gryname heparinizuotame kraujyje. Interferono-γ (IFN-γ) nustatymas imunofermentinės analizės (ELISA) (angl. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) metodu naudojamas nustatant kiekį in vitro reakcijų į šiuos peptidų antigenus, kurie siejami su Mycobacterium tuberculosis infekcija. QFT yra netiesioginis testas, skirtas M. tuberculosis infekcijos (įskaitant ligos) nustatymui. Testas turi būti naudojamas atsižvelgiant į rizikos įvertinimą, rentgeno tyrimus ir kitus medicininius ir diagnostinius tyrimus. 2. Tyrimo santrauka ir paaiškinimas Tuberkuliozė yra užkrečiama liga, kurią sukelia infekcija su M. tuberculosis komplekso (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) organizmais. Nuo asmenų, kurie serga kvėpavimo takų tuberkulioze, paprastai užsikrečiama lašelinės infekcijos būdu. Naujai infekuotiems asmenims savaičių ar mėnesių laikotarpiu gali pasireikšti tuberkuliozės liga, bet didžiajai infekuotų asmenų daliai nepasireiškia jokie simptomai. Kai kuriems išlieka latentinė tuberkuliozės infekcija (LTBI), t. y. neužkrečiama besimptomė liga, kurios aktyvi forma gali pasireikšti tik po mėnesių ar metų. Pagrindinis tikslas nustačius LTBI yra tinkamas gydymas, siekiant užkirsti kelią susirgti tuberkulioze. Dar visai neseniai tuberkulino odos testas (TOT) (angl. tuberculin skin test, TST) buvo vienintelis turimas metodas LTBI diagnozuoti. Odos jautrumas tuberkulinui atsiranda praėjus 2 10 savaičių po užsikrėtimo. Tačiau kai kuriems infekuotiems asmenims reakcija į tuberkuliną nepasireiškia, pavyzdžiui, pacientams, kurių imuninės sistemos veikla sutrikusi dėl kitų ligų arba neturintiems tokių sutrikimų. Atvirkščiai, kai kurie asmenys, kurie iš tikrųjų nėra infekuoti M. tuberculosis, paskiepyti Bacille Calmette-Guérin (BCG) ir būdami užsikrėtę kitomis, o ne M. tuberculosis komplekso mikobakterijomis ar dėl kitų nežinomų faktorių yra jautrūs tuberkulinui. Jiems atlikus TST testą yra gaunamas teigiamas rezultatas. LTBI reikia skirti nuo tuberkuliozės ligos, kurią būtina registruoti ir kuri įprastai apima plaučius ir apatinius kvėpavimo takus, tačiau gali būti paveiktos ir kitos organų sistemos. Tuberkuliozės liga yra diagnozuojama remiantis istorinių, fizinių, radiologinių, histologinių ir mikobakteriologinių tyrimų rezultatais. QFT testas matuoja ląstelių perduotą imunologinį atsakymą (CMI) į peptido antigenus, kurie imituoja mikobakterinius proteinus. Šių proteinų (ESAT-6, CFP-10 ir TB7.7(p4) trūksta visose BCG atmainose ir didžiojoje mikobakterijų dalyje, išskyrus M. kansasii, M. szulgai ir M. marinum.(1) Asmenų, kurie yra infekuoti M. tuberculosis komplekso organizmais, kraujyje yra limfocitų, kurie atpažįsta šiuos ir kitus mikobakterinius antigenus. Šis atpažinimo procesas apima citokino, IFN-γ, generavimą ir sekreciją. IFN-γ aptikimas ir tolesnis jo formų kvantifikavimas sudaro šio tyrimo pagrindą. QFT teste panaudoti antigenai yra peptidų mišinys, kuris imituoja proteinus ESAT-6, CFP-10 ir TB7.7(p4). Daugelis atliktų tyrimų parodė, kad šie peptido antigenai imituoja IFN-γ reakciją M. tuberculosis infekuotų asmenų T-ląstelėse, kitaip nei T-ląstelėse neinfekuotų arba BCG vakcinuotų asmenų, nesergančių tuberkuliozės liga arba neturinčių LTBI rizikos.(1 32) Tačiau dėl medicininio gydymo arba susirgimų, kurie kenkia imuninei funkcijai, IFN-γ reakcija gali potencialiai sumažėti. Pacientai, užsikrėtę tam tikromis kitomis mikobakterinėmis infekcijomis, gali taip pat reaguoti į ESAT-6, CF-10 ir TB7.7(p4), nes genų, užkoduotų šių proteinų, yra ir M. kansasii, M. szulgai ir M. marinum (1, 23) Todėl QFT testas yra vertinga pagalba nustatant M. tuberculosis komplekso infekcijos diagnozę sergantiems pacientams. Teigiamas testo rezultatas pagrindžia tuberkuliozės ligos diagnozę, tačiau ir kitos mikobakterijos (pvz., M. kansasii) gali lemti teigiamą rezultatą. Kad būtų patvirtinta arba paneigta tuberkuliozės ligos diagnozė, būtina atlikti kitus medicininius ir diagnostinius tyrimus. 4 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

5 Tyrimo principai QFT sistemoje naudojami specialūs kraujo surinkimo mėgintuvėliai, kuriais yra surenkami gryno kraujo mėginiai. Kraujo surinkimo mėgintuvėliuose inkubavimas trunka nuo 16 iki 24 valandų. Tada paimama plazma ir patikrinama, ar joje yra IFN-γ, kuris pagal aplinkybes susidarė reakcijos į peptido antigenus metu. QTF testas atliekamas dviem etapais. Pirmiausia grynas kraujo mėginys surenkamas į kiekvieną QFT kraujo surinkimo mėgintuvėlį, tarp kurių yra nulinės kontrolės mėgintuvėlis, TB antigenų mėgintuvėlis ir mitogeno mėgintuvėlis. Mitogeno mėgintuvėlis QFT testuojant naudojamas kaip teigiama kontrolė. Tai gali būti ypač pateisinama, jei asmens imuninės sistemos būsena nėra aiški. Mitogeno mėgintuvėlis gali būti panaudotas kaip kontrolė siekiant tinkamai apdoroti ir inkubuoti kraują. Kraujas turi būti inkubuojamas kuo greičiau (per 16 valandų nuo surinkimo) 37 C temperatūroje. Po valandų inkubavimo mėgintuvėliai centrifuguojami. Tada plazma atskiriama ir ELISA metodu nustatomas IFN-γ (IU/ml) kiekis. Testas yra laikomas teigiamu pagal IFN-γ reakciją į TB antigenų mėgintuvėlį, jei ši reikšmė gerokai viršija nulinės kontrolės IFN-γ IU/ml reikšmę. Jei naudojama, mitogeno mėgintuvėlyje mitogeną stimuliuojantis plazmos mėginys taikomas kaip IFN-γ teigiama kontrolė kiekvienam patikrintam mėginiui. Silpna reakcija į mitogeną (< 0,5 IU/ml) vertinama kaip neaiškus rezultatas, kai kraujo mėginys parodo neigiamą reakciją ir į TB antigenus. Toks modelis gali būti taikomas esant nepakankamam limfocitų skaičiui, esant sumažėjusiam limfocitų aktyvumui dėl netinkamo mėginių apdorojimo, netinkamo mitogeno mėgintuvėlio užpildymo arba jo maišymo arba tada, kai paciento limfocitai negali gaminti IFN-γ. Nulinis mėginys koreguoja fono reakcijas, heterofilinius antikūnų efektus ar nespecifinį IFN-γ kraujo mėginiuose. Nulinio mėgintuvėlio IFN-γ reikšmė atimama iš TB antigenų mėgintuvėlio ir mitogeno mėgintuvėlio (jei naudojamas) IFN-γ reikšmės. Tyrimo trukmė Toliau rasite informaciją apie apytiksliai nustatytą QFT tyrimo trukmę, taip pat apie reikiamą laiką testuojant mėginių paketą: Kraujo mėgintuvėlių inkubavimas 37 C temperatūroje: ELISA: nuo 16 iki 24 val. apie 3 valandos vienai ELISA plokštelei (28 44 asmenys) < 1 val. darbo plius min. kiekvienai papildomai plokštelei QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

6 3. Komponentai ir laikymo sąlygos Blood Collection Tubes (Kraujo surinkimo mėgintuvėliai)* 300 mėgintuvėlių 200 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių Katalogo Nr. T T Paruošimų skaičius QuantiFERON Nil Tube (nulinis mėgintuvėlis) (pilkas dangtelis, baltas žiedas) 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių QuantiFERON TB Antigen Tube (TB antigenų mėgintuvėlis) (raudonas dangtelis, baltas žiedas) QuantiFERON Mitogen Tube (mitogeno mėgintuvėlis) (violetinis dangtelis, baltas žiedas) QFT kraujo surinkimo mėgintuvėlių pakuotės informacinis lapelis High Altitude (HA) Blood Collection Tubes (Kraujo surinkimo dideliame aukštyje (HA) mėgintuvėliai) (naudojami m aukštyje)* 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių Katalogo Nr. T T QuantiFERON Nil Tube (nulinis mėgintuvėlis) (pilkas dangtelis, geltonas žiedas) QuantiFERON HA TB Antigen Tube (HA TB antigenų mėgintuvėlis) (raudonas dangtelis, geltonas žiedas) QuantiFERON HA Mitogen (HA mitogeno mėgintuvėlis) (pilkas dangtelis, geltonas žiedas) QFT kraujo surinkimo mėgintuvėlių pakuotės informacinis lapelis 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių 100 mėgintuvėlių * Produkto konfigūracijos teikiamos ne į visas šalis. Daugiau informacijos apie tai, kokias konfigūracijas galima užsakyti, žr. QIAGEN klientų aptarnavimo informaciją (išsami informacija 6 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

7 ELISA komponentai 2 plokštelių komplektas ELISA Pakuotė referencinėms laboratorijoms Katalogo Nr Mikroplokštelės juostelės (12 x 8 duobutės), padengtos ne žmogaus IFN-γ monokloniniu antikūnu (pelių) Human IFN-γ Standard, lyophilized (Žmogaus IFN-γ standartas, liofilizuotas) (sudėtyje yra rekombinantinio žmogaus IFN-γ, galvijų kazeino, 0,01 % w/v timerosalio) Mikroplokštelės juostelės (12 x 8 duobutės), 2 rinkiniai 1 buteliukas (8 IU/ml po atkūrimo) Mikroplokštelės juostelės (12 x 8 duobutės), 20 rinkiniai 10 buteliukų (8 IU/ml po atkūrimo) Green Diluent (Žalias skiediklis) (sudėtyje yra galvijų kazeino, normalaus pelių serumo, 0,01 % w/v timerosalio) Conjugate 100X Concentrate, lyophilized (Konjugatas (100x koncentratas, liofilizuotas) (ne žmogaus IFN-γ (pelių) HRP; sudėtyje yra 0,01 % w/v timerosalio) Wash Buffer 20X Concentrate (Plovimo buferis (20x koncentratas)) (ph 7,2; sudėtyje yra 0,05 % v/v ProClin 300) Enzyme Substrate Solution (Fermento substrato tirpalas) (sudėtyje yra H 2 O 2, 3,3, 5,5 tetrametilbenzidino) 1 x 30 ml 10 x 30 ml 1 x 0,3 ml (po atkūrimo) 10 x 0,3 ml (po atkūrimo) 1 x 100 ml 10 x 100 ml 1 x 30 ml 10 x 30 ml Enzyme Stopping Solution (Fermento stabdymo 1 x 15 ml 10 x 15 ml tirpalas) (sudėtyje yra 0,5 M H 2 SO 4 ) QFT ELISA pakuotės informacinis lapelis 1 1 Sudėtyje yra sieros rūgšties. Atsargumo priemones žr. 9. Būtinos, bet nepateikiamos priemonės 37 C inkubatorius. CO 2 neturi reikšmės Kalibruotos reguliuojamojo tūrio pipetės (nuo 10 µl iki µl) su vienkartiniais švirkštais Kalibruota daugiakanalė pipetė tūriui nustatyti (nuo 50 µl iki 100 µl) su vienkartiniais švirkštais Mikroplokštelių kratytuvas Dejonizuotas arba distiliuotas vanduo (2 litrai) Mikroplokštelių plovimo aparatas (rekomenduojamas automatizuotas plovimo aparatas) Skaitymo įrenginys mikroplokštelėms su 450 nm filtru ir nm referencijos filtru QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

8 Sandėliavimas Kraujo surinkimo mėgintuvėliai Kraujo surinkimo mėgintuvėlius laikykite nuo 4 C iki 25 C temperatūroje. Komplekto reagentai Komplekto reagentus laikykite šaldytuve, 2 8 C temperatūroje. Fermento substrato tirpalą visada saugokite nuo tiesioginių saulės spindulių. Atkurti ir nepanaudoti reagentai Nurodymus, kaip atkurti reagentus, žr. 6 skyriuje (13 psl.) Sandėliuojant 2 8 C temperatūroje, atkurtas komplekto standartas gali būti laikomas iki 3 mėnesių. Užrašykite komplekto standarto atkūrimo datą. Nepanaudotas konjugatas (100x koncentratas) po atkūrimo turi būti vėl sandėliuojamas 2 8 C temperatūroje ir sunaudojamas per 3 mėnesius. Užrašykite konjugato atkūrimo datą. Naudoti paruoštas konjugatas turi būti sunaudojamas per 6 valandas po paruošimo. Naudoti paruoštą plovimo buferį kambario temperatūroje galima laikyti ne ilgiau nei dvi savaites. 4. Perspėjimai ir atsargumo priemonės Skirtas in vitro diagnostikai Įspėjimai Neigiamas QFT testo rezultatas nepanaikina M. tuberculosis infekcijos ar tuberkuliozės ligos buvimo tikimybės; klaidingus neigiamus rezultatus gali nulemti infekcijos fazė (pvz., kai kraujo mėginys yra surinktas prieš ląstelinės imuninės reakcijos pasireiškimą), imuninės funkcijos sutrikimai dėl kitų ligų, netinkamas mėgintuvėlių apdorojimas po kraujo surinkimo, neteisingas testo atlikimas arba kiti imunologiniai pakitimai. Teigiamas QFT testo rezultatas neturėtų būti vienintelis pagrindas priimant sprendimą dėl M. tuberculosis infekcijos buvimo. Neteisingai atliekant testą gali būti gauti apgaulingai teigiami rezultatai. Teigiamas QFT testo rezultatas turi būti patvirtintas atliekant tolesnius medicininius ir diagnostinius tyrimus; taip galima nustatyti, ar sergama aktyvia tuberkuliozės forma (pvz., AFB tepinėlis ir kultūra, krūtinės ląstos rentgenograma). Nors ESAT-6, CFP-10 ir TB7.7(p4) nėra BCG atmainose ir didžiojoje žinomų netuberkuliozinių mikobakterijų dalyje, tačiau QFT testo teigiamo rezultato pagrindas gali būti infekcija su M. kansasii, M. szulgai arba M. marinum. Jeigu tokia infekcija įtariama, turi būti atlikti alternatyvūs testai. 8 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

9 Atsargumo priemonės Skirtas tik in vitro diagnostikai. Dirbdami su chemikalais, visada dėvėkite tinkamą laboratorinį chalatą, mūvėkite vienkartines pirštines ir naudokite apsauginius akinius. Daugiau informacijos rasite atitinkamuose saugos duomenų lapuose (SDS). Jie pateikiami patogiu ir kompaktišku PDF formatu internete Čia galite rasti, peržiūrėti ir išspausdinti kiekvieno QIAGEN rinkinio ir jų komponentų SDS. ĮSPĖJIMAS: žmogaus kraujo mėginius visada laikykite potencialiai infekuojančiais. Laikykitės esminių elgsenos su krauju nurodymų. QuantiFERON-TB Gold ELISA taikomos toliau išvardytos rizikos ir saugos frazės. QuantiFERON fermento stabdymo tirpalas Xi Sudėtyje yra sieros rūgšties: dirginanti. Rizikos ir saugos frazės: R36/38, S26-36/37/39 Žalio skiediklio sudėtyje yra normalaus pelių serumo ir kazeino, kurie gali sukelti alergines reakcijas. Venkite kontakto su oda. Įvykus cheminei avarijai Išsiliejus, nutekėjus medžiagoms, pavojaus ar nelaimingo atsitikimo atveju visą parą skambinkite CHEMTREC JAV ir Kanadoje: Už JAV ir Kanados ribų: (priimami skambučiai, kai apmoka adresatas) Daugiau informacijos Saugos duomenų lapuose: Nukrypimai nuo QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informaciniame lapelyje aprašytos instrukcijos gali lemti klaidingus rezultatus. Prieš naudojimą atidžiai perskaitykite instrukcijas. Nenaudokite komplekto, jei kuris nors reagento buteliukas yra pažeistas ar ištekėjęs. Nenaudokite ir nemaišykite mikroplokštelių juostelių, žmogaus IFN-γ standarto, žalio skiediklio ar konjugato (100x koncentrato), paimtų iš skirtingų QFT komplektų siuntų. Kitus reagentus (plovimo buferį (20x koncentratą), fermento substrato tirpalą, fermento stabdymo tirpalą) galima imti iš skirtingų komplektų, jei reagentų galiojimo laikas yra tinkamas ir įrašoma partijos informacija. Nepanaudotus reagentus ir biologinius mėginius išmeskite laikydamiesi vietinių ir šalies įstatymų. Nenaudokite kraujo surinkimo mėgintuvėlių ar ELISA komplektų, jei pasibaigusi jų galiojimo data. Prieš naudojant patikrinkite, ar visi laboratorijos prietaisai, pavyzdžiui, plokštelių plovimo automatas ir skaitymo įrenginys, skirtas mikroplokštelėms, buvo kalibruoti / atitinkamai patikrinti. R36/38: dirgina akis ir odą; S26: po sąlyčio su akimis tuoj pat praskalaukite dideliu kiekiu vandens ir kreipkitės į gydytoją; S36/37/39: dėvėkite tinkamą apsauginę aprangą, pirštines ir akių / veido apsaugą. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

10 5. Mėginių paėmimas ir apdorojimas QFT tyrimo metu naudojami šie kraujo surinkimo mėgintuvėliai: 1. QuantiFERON nuliniai mėgintuvėliai (pilkas dangtelis su baltu žiedu, naudoti aukštyje iki 810 metrų virš jūros lygio) 2. TB antigenų mėgintuvėliai (raudonas dangtelis su baltu žiedu, naudoti aukštyje iki 810 metrų virš jūros lygio) 3. QuantiFERON mitogeno mėgintuvėliai (violetinis dangtelis su baltu žiedu, naudoti aukštyje iki 810 metrų virš jūros lygio) Mėgintuvėliai, skirti kraujui surinkti dideliame aukštyje (HA): 4. QuantiFERON HA nuliniai mėgintuvėliai (pilkas dangtelis su geltonu žiedu, naudoti m aukštyje) 5. HA TB antigenų mėgintuvėliai (raudonas dangtelis su geltonu žiedu, naudoti m aukštyje) 6. QuantiFERON HA mitogeno mėgintuvėliai (violetinis dangtelis su geltonu žiedu, naudoti m aukštyje) Antigenai yra išdžiovinti ant vidinių kraujo surinkimo mėgintuvėlių sienelių, todėl kraujo mėginiai turi būti kruopščiai sumaišyti su mėgintuvėlio turiniu. Tada mėgintuvėliai turi būti kiek galima greičiau (ne vėliau kaip per 16 valandų nuo kraujo surinkimo) perkeliami į inkubatorių (37 C) Optimalūs rezultatai yra pasiekiami laikantis šių procedūrų: 1. Iš kiekvieno tiriamojo paimkite po 1 ml veninio kraujo tiesiai į kiekvieną QFT kraujo surinkimo mėgintuvėlį. Šią procedūrą privalo atlikti išmokytas specialistas. Aukštyje iki 810 m virš jūros lygio turi būti naudojami standartiniai QFT kraujo surinkimo mėgintuvėliai. Kraujo surinkimo dideliame aukštyje (HA) mėgintuvėliai turi būti naudojami esant m aukščiui. Jei naudojami tame aukštyje netinkami QFT kraujo surinkimo mėgintuvėliai arba surenkami per maži kraujo kiekiai, kraujas gali būti paimamas ir švirkštu; tada į kiekvieną iš trijų mėgintuvėlių įpilama po 1 ml kraujo. Saugumo sumetimais nuimama švirkšto adata. Tai atlikdami imkitės įprastų atsargumo priemonių. Nuimkite šių trijų QFT mėgintuvėlių dangtelius ir kiekvieną mėgintuvėlį papildykite 1 ml kraujo (iki juodos žymos ant šoninės etiketės). Uždenkite dangtelius ir maišykite, kaip nurodyta toliau. Kadangi 1 ml mėgintuvėliai kraują įtraukia palyginti lėtai, kai atrodys, kad yra pasiektas reikiamas užpildymo lygis, mėgintuvėlį palikite ant adatos dar 2 3 sekundes. Juoda žymė ant mėgintuvėlio šono reiškia 1 ml užpildymo tūrį. QFT kraujo surinkimo mėgintuvėliai turi patvirtintą tūrį nuo 0,8 iki 1,2 ml. Jeigu imant kraują ši indikatorinė linija nepasiekiama, rekomenduojama paimti naują kraujo mėginį. Jei kraujui surinkti naudojama drugelio tipo adata, prieš uždedant QFT mėgintuvėlį, naudojant papildomą mėgintuvėlį reikia įsitikinti, kad jungiamasis vamzdelis yra užpildytas krauju. Antra vertus, kraują galima surinkti naudojant vieną įprastą kraujo surinkimo mėgintuvėlį, pripildytą ličio heparino, kuris veikia kaip antikoaguliantas, tada perpilti į QFT mėgintuvėlius. Kaip kraujo antikoaguliantą naudokite tik ličio hepariną, nes kiti antikoaguliantai trukdo tyrimui. Užpildykite kraujo surinkimo mėgintuvėlį (min. 5 ml tūrio) ir atsargiai sumaišykite pavartydami jį kelis kartus, kad heparinas ištirptų. Kraujas turi būti laikomas kambario temperatūroje (22 ± 5 C) prieš perkeliant jį į QFT mėgintuvėlius inkubavimui, kuris turi būti pradėtas per 16 valandų nuo kraujo surinkimo. 10 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

11 2. Pripildę mėgintuvėlius, pakratykite juos dešimt (10) kartų, kad visas vidinis mėgintuvėlio paviršius būtų padengtas krauju ir ištirptų ant mėgintuvėlio sienelių esantys antigenai. Kraujo surinkimo metu mėgintuvėliai turi būti C temperatūros. Per stipriai pakračius gali būti suardytas gelis ir taip iškreipti rezultatai. Jei kraujas surenkamas heparino mėgintuvėlyje, prieš paskirstant kraują QFT mėgintuvėliuose, mėginiai turi būti tolygiai sumaišyti. Prieš pat kraujo paskirstymą, atidžiai sumaišykite kraujo mėginius atsargiai juos pavartydami. Atskieskite 1,0 ml alikvoto (po vieną kiekviename QFT mėgintuvėlyje) kiekviename nuliniame TV antigenų ir mitogeno mėgintuvėlyje. Tai geriausia atlikti steriliai, imantis įprastų atsargumo priemonių. Nuimkite šių trijų QFT mėgintuvėlių dangtelius ir kiekvieną mėgintuvėlį papildykite 1 ml kraujo (iki juodos žymos ant šoninės etiketės). Uždenkite mėgintuvėlių dangtelius ir maišykite, kaip nurodyta anksčiau. 3. Pažymėkite mėgintuvėlius tinkamomis etiketėmis. Įsitikinkite, kad nuėmus dangtelį kiekvieną mėgintuvėlį (nulinį, antigenų, mitogeno) galima atpažinti pagal etiketę arba naudojant kitas priemones. 4. Užpildžius, pakračius mėgintuvėlius ir užklijavus tinkamą etiketę, mėgintuvėliai yra kiek galima greičiau (ne vėliau kaip per 16 valandų nuo kraujo surinkimo) perkeliami į inkubatorių (37 ± 1 C). Prieš inkubavimą mėgintuvėlius laikykite kambario temperatūroje (22 ± 5 C). Kraujo mėginių nelaikyti šaldytuve ar šaldymo kameroje. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

12 6. Naudojimo instrukcija 1 etapas. Kraujo mėginio inkubavimas ir plazmos paėmimas Pateikiamos priemonės QFT kraujo surinkimo mėgintuvėliai (žr. 3 skyrių). Būtinos, bet nepateikiamos priemonės Žr. 3 skyrių. Procedūra 1. Jeigu mėgintuvėliai neinkubuojami iš karto po surinkimo, iš karto prieš inkubavimą mėgintuvėlių turinys turi būti sumaišytas (vartant 10 kartų). 2. Inkubuokite mėgintuvėlius VERTIKALIOJE padėtyje val., esant 37 ± 1 C temperatūrai. CO 2 arba drėkinimas inkubuojant nėra reikalingas. 3. Po inkubavimo 37 C temperatūroje ir prieš atliekant centrifugavimą kraujo surinkimo mėgintuvėlius galima laikyti 4 27 C temperatūroje ne ilgiau nei 3 dienas. 4. Po inkubavimo 37 C temperatūroje, paimama plazma mėgintuvėlius 15 minučių centrifuguojant RCF (g). Susidarant gelio kamščiui ląstelės atsiskiria nuo plazmos. Jeigu tai neįvyksta, mėgintuvėliai turi būti centrifuguojami dar kartą ir didesniu greičiu. Plazmą galima paimti ir be centrifugavimo, tačiau tai reikia daryti labai atsargiai, kad paimant plazmos nebūtų sujudintos ląstelės. 5. Plazmos mėginį visada imkite naudodami pipetę. Po centrifugavimo ir prieš plazmos paėmimą kiekvienu atveju venkite mėginius traukyti pipete aukštyn ir žemyn arba plazmą sumaišyti. Visuomet dirbkite kruopščiai, kad nesujudintumėte medžiagos prie gelio paviršiaus. Plazmos mėginiai iš centrifuguotų kraujo paėmimo mėgintuvėlių gali būti perkelti tiesiai į QFT ELISA plokštelę. Tai galioja ir tais atvejais, kai yra naudojami ELISA automatai. Plazmos mėginiai 2 8 C temperatūroje gali būti laikomi iki 28 dienų; arba paėmus plazmą ją galima laikyti dar ilgiau 20 C temperatūroje. Norėdami gauti adekvačius rezultatus, surinkite bent 150 µl plazmos. 12 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

13 2 etapas. Žmogaus IFN-γ ELISA Pateikiamos priemonės QFT ELISA komplektas (žr. 3 skyrių). Būtinos, bet nepateikiamos priemonės Žr. 3 skyrių. Procedūra 1. Visi plazmos mėginiai ir reagentai, išskyrus konjugato 100x koncentratą, prieš naudojimą turi pasiekti kambario temperatūrą (22 ± 5 C). Temperatūrai išlyginti paskirkite ne trumpiau nei 60 minučių. 2. Nereikalingas juosteles išimkite iš rėmelio, įdėkite jas atgal į folijos įpakavimą ir iki naudojimo laikykite šaldytuve. Mažiausiai vieną juostelę paskirkite QFT standartams ir paimkite dar pakankamą juostelių skaičių tiriamiesiems (žr. 2A ir 2B pav., kur atitinkamai pavaizduoti 3 ir 2 mėgintuvėlių formatai). Po naudojimo rėmelį ir dangtelį palikite kitam kartui su likusiomis juostelėmis. 3. Atkurkite liofilizuotą komplekto standartą su ant standarto buteliuko etiketės nurodytu dejonizuoto arba distiliuoto vandens kiekiu. Atsargiai maišykite buteliuko turinį (vengdami putų susidarymo) ir įsitikinkite, kad turinys visai ištirpęs. Atkūrus standartą iki nurodyto tūrio, gaunamas tirpalas, kurio koncentracija yra 8,0 IU/ml. Pastaba: atkurto komplekto standarto tūris partijose bus skirtingas. Atkurtą komplekto standartą naudokite skiedinio serijos 1:4 iš IFN-γ žaliame skiediklyje (ŽS) paruošti (žr. 1 pav.). S1 (1 standarto) sudėtyje yra 4 IU/ml, S2 (2 standarto) sudėtyje yra 1 IU/ml, S3 (3 standarto) sudėtyje yra 0,25 IU/ml, o S4 (4 standarto) sudėtyje yra 0 IU/ml (tik ŽS). Standartai turėtų būti ištirti mažiausiai du kartus. Rekomenduojama procedūra dvigubam standartui a. Užrašykite ant 4 mėgintuvėlių: S1, S2, S3, S4. Rekomenduojama procedūra trigubam standartui a. Užrašykite ant 4 mėgintuvėlių: S1, S2, S3, S4. b. Įpilkite 150 µl ŽS į S1, S2, S3, S4. b. Įpilkite 150 µl ŽS į S1. c. Įpilkite 150 µl komplekto standarto į S1 ir kruopščiai sumaišykite. d. Perkelkite 50 µl iš S1 į S2 ir kruopščiai sumaišykite. e. Perkelkite 50 µl iš S2 į S3 ir kruopščiai sumaišykite. c. Įpilkite 210 µl ŽS į S2, S3, S4. d. Įpilkite 150 µl komplekto standarto į S1 ir kruopščiai sumaišykite. e. Perkelkite 70 µl iš S1 į S2 ir kruopščiai sumaišykite. f. Tik ŽS veikia kaip nulinis standartas (S4). f. Perkelkite 70 µl iš S2 į S3 ir kruopščiai sumaišykite. g. Tik ŽS veikia kaip nulinis standartas (S4). QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

14 150 µl 50 µl 50 µl Atkurtas komplekto standartas 1 standartas 4,0 IU/ml 2 standartas 1,0 IU/ml 3 standartas 0,25 IU/ml 4 standartas 0 IU/ml Žalias skiediklis 1 pav. Standarto kreivės sudarymas. Kiekvienam ELISA seansui paruoškite naujus komplekto standarto skiedinius. 4. Atkurkite liofilizuotą konjugato 100x koncentratą su 0,3 ml dejonizuoto arba distiliuoto vandens. Atsargiai sumaišykite buteliuko turinį (vengdami putų susidarymo) ir įsitikinkite, kad konjugatas visiškai ištirpo. Naudoti tinkamą konjugatą pagaminsite skiesdami reikiamą atkurto konjugato 100x koncentrato kiekį žaliame skiediklyje, kaip nurodyta 1 lentelėje (Konjugato paruošimas). 1 lentelė. Konjugato paruošimas Juostelių skaičius Konjugato 100x koncentrato kiekis Žalio skiediklio kiekis 2 10 µl 1,0 ml 3 15 µl 1,5 ml 4 20 µl 2,0 ml 5 25 µl 2,5 ml 6 30 µl 3,0 ml 7 35 µl 3,5 ml 8 40 µl 4,0 ml 9 45 µl 4,5 ml µl 5,0 ml µl 5,5 ml µl 6,0 ml Kruopščiai, tačiau atsargiai išmaišykite, vengdami putų susidarymo. Nesunaudotą konjugato 100x koncentratą nedelsiant grąžinkite į 2 8 C temperatūrą. Skiesdami naudokite tik žalią skiediklį. 14 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

15 5. Plazmos mėginiai, kurie buvo surinkti iš kraujo surinkimo mėgintuvėlių ir prieš testą buvo užšaldyti arba ilgiau nei 24 valandas sandėliuojami, turi būti prieš įdedant į ELISA duobutę kruopščiai sumaišyti. Jei plazmos mėginiai bus dedami tiesiai iš centrifuguotų kraujo surinkimo mėgintuvėlių, plazmos maišyti nereikėtų. 6. Į atitinkamas ELISA duobutes daugiakanale pipete įpilkite po 50 µl šviežiai naudoti paruošto konjugato. 7. Į atitinkamas ELISA duobutes daugiakanale pipete įpilkite po 50 µl tiriamo plazmos mėginio (tinkamą plokštelės išdėstymą žr. 15, 2A bei 2B pav.). Galiausiai įpilkite po 50 µl į kiekvieną iš standartų nuo 1 iki A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M 2A pav. Rekomenduojamas plokštelės panaudojimas nuliniam, TB antigenų, mitogeno mėgintuvėliams (28 testai kiekvienoje plokštelėje). S1 (1 standartas), S2 (2 standartas), S3 (3 standartas), S4 (4 standartas) 1N (1 mėginys, nulinės kontrolės plazma), 1A (1 mėginys, TB antigenų plazma), 1M (1 mėginys, mitogeno plazma) A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A 2B pav. Rekomenduojamas plokštelės panaudojimas nuliniam ir TB antigenų mėgintuvėliams (44 testai kiekvienoje plokštelėje). S1 (1 standartas), S2 (2 standartas), S3 (3 standartas), S4 (4 standartas) 1N (1 mėginys, nulinės kontrolės plazma), 1A (1 mėginys, TB antigenų plazma) QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

16 8. Konjugatą ir plazmos mėginius / standartus kruopščiai maišykite 1 minutę naudodami mikroplokštelių kratytuvą. 9. Kiekvieną plokštelę uždenkite dangteliu ir inkubuokite 120 ± 5 minučių kambario temperatūroje (22 ± 5 C). Inkubavimo metu plokšteles saugokite nuo tiesioginių saulės spindulių. 10. Inkubavimo metu praskieskite vieną dalį plovimo buferio 20x koncentrato su 19 dalių dejonizuoto ar distiliuoto vandens ir kruopščiai išmaišykite. Iš pateikto plovimo buferio 20x koncentrato galima pagaminti 2 litrus naudoti tinkamo plovimo buferio. Duobutes plaukite mažiausiai 6 kartus naudodami 400 µl tinkamo plovimo buferio. Rekomenduojame naudotis mikroplokštelių plovimo automatu. Siekiant tikslių tyrimo rezultatų labai svarbu kruopščiai išplauti. Kiekvieno plovimo ciklo metu patikrinkite, ar visos duobutės yra iki viršaus užpildytos plovimo buferiu. Rekomenduotina tarp plovimo ciklų mažiausiai 5 sekundes pamirkyti. Į atliekamų skysčių talpyklą turėtų būti įpilta laboratorijose įprastai naudojamos dezinfekcinės priemonės. Taip pat laikykitės potencialiai infekuojančios medžiagos padarymo nekenksmingomis taisyklių. 11. Pastuksenkite plokštelę duobutėmis į apačią ant nepūkuoto rankšluosčio, kad būtų pašalintas likęs plovimo buferis. Tada į kiekvieną duobutę įpilkite 100 µl fermento substrato tirpalo ir maišykite mikroplokštelių kratytuve. 12. Kiekvieną plokštelę uždenkite dangteliu ir inkubuokite 30 minučių kambario temperatūroje (22 ± 5 C). Inkubavimo metu plokšteles saugokite nuo tiesioginių saulės spindulių. 13. Po 30 minučių trukusio inkubavimo į kiekvieną duobutę įpilkite po 50 µl fermento stabdymo tirpalo ir išmaišykite. Fermento stabdymo tirpalas į duobutes turėtų būti įpiltas ta pačia eilės tvarka ir tuo pačiu tempu kaip ir substratas (11 punktas). 14. Pamatuokite optinį tankį (OT) kiekvienoje duobutėje 5 minučių intervalu nuo stabdymo tirpalo įpylimo. Naudokite skaitymo įrenginį, skirtą mikroplokštelėms, kuriame yra 450 nm filtras ir nuo 620 iki 650 nm referencijos filtras. OT reikšmės yra reikalingos skaičiuojant rezultatus. 16 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

17 7. Skaičiavimas ir rezultatų aiškinimas QFT analizės programinė įranga naudojama neapdorotiems duomenims analizuoti ir rezultatams skaičiuoti. Programinę įrangą galite gauti Įsitikrinkite, kad visada naudojate naujausią programinės įrangos versiją. Naudojant programinę įrangą atliekamas tyrimo kokybės kontrolės vertinimas, sudaroma standarto kreivė ir pateikiamas kiekvieno tyrimo rezultatas pagal skyriuje Rezultatų aiškinimas pateiktą metodą. Užuot naudojus QFT analizės programinę įrangą, rezultatai gali būti nustatomi ir pagal toliau paaiškintą metodą. Standarto kreivės sudarymas (kai nenaudojama QFT analizės programinė įranga) Nustatykite komplekto standarto pakartojimų vidutines OT reikšmes ant kiekvienos plokštelės. Sudarykite log (e) -log (e) standarto kreivę: pažymėkite vidutinės OT reikšmes log (e) (y-ašis) ir standarto IF-γ koncentracijos log (e) (x-ašis), bet į šiuos skaičiavimus neįtraukite nulinio standarto. Pasitelkę regresijos analizę, apskaičiuokite liniją su labiausiai standarto kreivei tinkančia forma. Standarto kreivę panaudokite IFN-γ koncentracijai (IU/ml) nustatyti kiekvienam tiriamam plazmos mėginiui, naudodami kiekvieno mėginio OT reikšmę. Šiems skaičiavimams gali būti panaudoti programinės įrangos paketai, gaunami su mikroplokštelių skaitytuvais, taip pat standartinės skaičiuoklės arba statistikos programos (pvz., Microsoft Excel ). Tokiais programinės įrangos paketais rekomenduojame naudotis atliekant regresijos analizę, skaičiuojant standartų variacijos koeficientą (%VK) bei standarto kreivei koreliacijos koeficientą (r). Testo kokybės patikrinimas Testo rezultatų teisingumas priklauso nuo teisingos standarto kreivės sudarymo. Todėl, prieš pradedant aiškinti testo rezultatus, turi būti patikrinti iš standartų išvesti rezultatai. ELISA galioja, kai: 1 standarto vidutinė OT reikšmė privalo būti 0, ir 2 standarto replikuotų OT reikšmių %VK turi būti 15 %. 3 ir 4 standarto replikuotos OT reikšmės nuo atitinkamų vidutinių reikšmių turi nukrypti ne daugiau kaip 0,040 OT vienetų. Iš standartų vidutinių absorbavimo reikšmių apskaičiuotas koreliacijos koeficientas (r) turi būti 0,98. QFT analizės programinė įranga skaičiuoja ir pateikia šiuos kokybės kontrolės parametrus. Jeigu šie kriterijai neatitinka, testas negalioja ir turi būti pakartotas. Nulinio standarto (žalio skiediklio) vidutinė OT reikšmė turi būti 0,150. Jeigu vidutinė OT reikšmė yra > 0,150, rekomenduojama patikrinti plokštelių plovimo procesą. Rezultatų aiškinimas QFT testo rezultatai turi būti interpretuojami pagal šiuos kriterijus: Pastaba: diagnozei nustatyti ar tuberkuliozės ligai paneigti ir LTBI tikimybei nustatyti reikia įvertinti epidemiologinius, istorinius, medicininius ir diagnostinius rezultatus; į juos privaloma atsižvelgti interpretuojant QFT testo rezultatus (2 ir 3 lentelė). QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

18 2 lentelė. Kai naudojami nulinis, TB antigenų ir mitogeno mėgintuvėliai Nulinis (IU/ml) < 8,0 TB antigenų minus nulinis (IU/ml) Mitogeno minus nulinis (IU/ml)* QFT rezultatas Ataskaita / aiškinimas < 0,35 < 0,5 Neigiamas M. tuberculosis infekcija NĖRA galima 0,35 ir < 25 % nulinės kontrolės vertės < 0,5 Neigiamas M. tuberculosis infekcija NĖRA galima 0,35 ir 25 % nulinės Bet koks Teigiamas M. tuberculosis infekcija galima kontrolės vertės < 0,35 < 0,5 Neaiškus Rezultatai pagal TB-antigeno reakciją neaiškūs 0,35 ir < 25 % nulinės kontrolės vertės < 0,5 Neaiškus Rezultatai pagal TB-antigeno reakciją neaiškūs > 8,0 Bet koks Bet koks Neaiškus Rezultatai pagal TB-antigeno reakciją neaiškūs * Teigiamos mitogeno (ir kartais TB antigenų) reakcijos dažnai yra už mikroplokštelių skaitymo aparato matavimo ribų. Tai neturi įtakos testo kokybei. Tais atvejais, kai M. tuberculosis nėra įtariama, pradžioje gauti teigiami testo rezultatai gali būti patvirtinti antrą kartą testuojant pradinius plazmos mėginius QFT ELISA testu. Jeigu pakartojus testą su pirmu arba antru mėginiu vėl gaunamas teigiamas rezultatas, testo rezultatas turi būti laikomas teigiamu. Galimų priežasčių ieškokite skyriuje Problemų sprendimas. Klinikinių tyrimų metu mažiau negu 0,25 % asmenų turėjo > 8,0 IU/ml IFN-γ koncentraciją nulinės kontrolės atžvilgiu. Pagal pamatuotos koncentracijos IFN-γ dydį negalima daryti išvados dėl infekcijos stadijos arba laipsnio, imuninio reaktyvumo lygio ar aktyvios ligos progresavimo tikimybės. Aiškinimas Ne TB antigenas nulinis 0,35 IU/ml Taip Ne TB antigenas nulinis 25 % nulinės kontrolės vertės IU/ml Taip Vertinimas Mitogenas nulinis < 0,50 IU/ml ir (arba) nulinis > 8,0 IU/ml Taip Neaiškus Ne Nulinis 8,0 IU/ml Ne Taip Neigiamas Teigiamas 3 pav. Aiškinimo schema, kai naudojami nulinis, TB antigenų ir mitogeno mėgintuvėliai. 18 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

19 3 lentelė. Kai naudojami tik QuantiFERON nulinis ir TB antigenų mėgintuvėliai Nulinis (IU/ml) TB antigenų minus nulinis (IU/ml) QFT rezultatas Ataskaita / aiškinimas < 0,35 Neigiamas M. tuberculosis infekcija NĖRA galima < 8,0 0,35 ir < 25 % nulinės kontrolės vertės Neigiamas M. tuberculosis infekcija NĖRA galima 0,35 ir 25 % nulinės kontrolės vertės Teigiamas* M. tuberculosis infekcija galima > 8,0 Bet koks Neaiškus Rezultatai pagal TB-antigeno reakciją neaiškūs * Tais atvejais, kai M. tuberculosis nėra įtariama, pradžioje gauti teigiami testo rezultatai gali būti patvirtinti antrą kartą testuojant pradinius plazmos mėginius QFT ELISA testu. Jeigu pakartojus testą su pirmu arba antru mėginiu vėl gaunamas teigiamas rezultatas, testo rezultatas turi būti laikomas teigiamu. Klinikinių tyrimų metu mažiau negu 0,25 % asmenų turėjo > 8,0 IU/ml IFN-γ koncentraciją nulinės kontrolės atžvilgiu. Galimų priežasčių ieškokite skyriuje Problemų sprendimas. Pagal pamatuotos koncentracijos IFN-γ dydį negalima daryti išvados dėl infekcijos stadijos arba laipsnio, imuninio reaktyvumo lygio ar aktyvios ligos progresavimo tikimybės. Aiškinimas Ne TB antigenas nulinis 0,35 IU/ml Taip Ne TB antigenas nulinis 25 % nulinės kontrolės vertės IU/ml Taip Vertinimas Neaiškus Ne Nulinis 8,0 IU/ml Taip Neigiamas Teigiamas 4 pav. Aiškinimo schema, kai naudojami nulinis ir TB antigenų mėgintuvėliai. 8. Apribojimai QFT testo rezultatai turi būti naudojami atsižvelgiant į kiekvieno asmens epidemiologinę istoriją, esamą būklę ir kitus diagnostinius vertinimus. Rezultatai, kurių nulinė vertė viršija 8 IU/ml, turi būti vertinami kaip neaiškūs, nes 25 % padidėjusi TB antigenų reakcija gali būti už tyrimo matavimo ribų. Nepatikimus ar neaiškius rezultatus galite gauti, nes: Nesilaikoma QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA informaciniame lapelyje aprašytos procedūros. Yra ypač aukštos cirkuliuojančio IFN-γ koncentracijos arba yra heterofilinių antikūnų. Ilgesnis nei 16 val. kraujo mėginio laikymas iki inkubavimo 37 C temperatūroje. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

20 9. Efektyvumo charakteristikos Klinikiniai tyrimai Nėra apibrėžto latentinės tuberkuliozės infekcijos (LTBI) patvirtinimo ar atmetimo standarto, todėl negalima praktiškai įvertinti QFT jautrumo ir tikslumo. QFT tikslumas buvo apytiksliai nustatytas įvertinant apgaulingai teigiamus rodiklius asmenims, turintiems mažą tuberkuliozės infekcijos riziką (t. y. be žinomų rizikos faktorių). Jautrumas buvo apytiksliai nustatytas įvertinant aktyvia patvirtintos kultūros tuberkuliozės forma sergančias pacientų grupes. Tikslumas JAV atlikto tyrimo metu, atliekant TOT, QFT testui buvo paimti kraujo mėginiai iš 866 savanorių. Demografiniai duomenys ir tuberkuliozės rizikos faktoriai buvo nustatyti testo metu atlikus standartinę apklausą. Iš 432 savanorių, neturinčių žinomų M. tuberculosis infekcijos rizikos faktorių, 391 asmens QFT ir TOT rezultatai. Nei vienas iš šių asmenų nebuvo vakcinuotas BCG. Antras tikslumo tyrimas naudojant QFT testą buvo atliktas Japonijoje su mažos rizikos savanoriais. 90 % iš šių asmenų buvo vakcinuoti naudojant BCG. Abiejų tikslumo tyrimų rezultatai yra pateikti 4 lentelėje. 4 lentelė. QFT tikslumas: rezultatai asmenų be žinomų M. tuberculosis infekcijos rizikos faktorių Tyrimas BCG būsena (% vakcinuota) Iš viso testuota Skaičius QFT neaiškus QFT teigiamų skaičius / įskaitytų testų skaičius QFT tikslumas (95 % CI) TOT teigiamų skaičius / testuotų skaičius TOT* tikslumas (95 % CI) JAV (nepaskelbta) 0 % /390 99,2 % (98 100) 6/391 98,5 % (97 99) Japonija (15) ~ 90 % /162 98,8 % (95 100) Iš viso 559 7/559 (1,3 %) 5/552 99,1 % (98 100) * TOT ribine verte imant 10 mm BCG nevakcinuotiems asmenims. Ribine verte imant 15 mm TOT tikslumas yra įvertinamas 99,1 %. Jautrumas aktyvios tuberkuliozės formai Siekiant nustatyti testo QFT jautrumą, buvo tiriami asmenys iš JAV, Australijos ir Japonijos. Jiems įtarta M. tuberculosis infekcija po to buvo įrodyta naudojant kultūrą. Nors nėra jokio apibrėžto latentinės tuberkuliozės infekcijos (LTBI) standarto, M. tuberculosis mikrobiologinė kultūra yra tinkamas pakaitalas, nes sergantys asmenys iš esmės yra infekuoti. Prieš kraujo surinkimą QFT testui pacientai buvo gydomi mažiau nei 8 dienas. 5 lentelėje yra pateikti šių 3 M. tuberculosis kultūrų teigiami pacientų grupių rezultatai. QFT testo bendras jautrumas aktyviai TB ligos formai buvo 89 % (157/177). 20 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

21 5 lentelė. QFT: asmenys, turinys nustatytos kultūros M. tuberculosis infekciją Tyrimas QFT teigiamų skaičius / įskaitytų testų skaičius QFT jautrumas (95 % CI) Japonijos TB pacientai (15) 86/92 93 % (86 97 %) Australai 24/27 89 % (70 97 %) JAV pacientai 47/58 81 % (68 90 %) Iš viso 157/ % (83 93 %) LTBI diagnozė Buvo paskelbti keli tyrimai, kurie įrodo QFT efektyvumą įvairiose LTBI rizikos populiacijose. Svarbiausi parinktų tyrimų duomenys yra išvardyti 6 lentelėje. 6 lentelė. Parinkti paskelbti tyrimai apie QFT panaudojimą LTBI rizikos populiacijose Tyrimas Healthcare workers in India (Pai, et al 2005) (26) Danish HIV+ patients (Brock, et al 2006) (5) Hospitalized children in India (Dogra, et al 2006) (10) Contact investigations in Germany (Diel, et al 2006) (9) Iš viso testuota Išvados ir rezultatai 726 Aplinka su labai didele TB dalimi. 40 % QFT teigiamų ar atitinkamai 41 % TOT teigiamų rezultatų, kai ribinė vertė 10 mm. Didelis sutapimas su TOT, jokio BCG poveikio testams. Abu testai susieti su tokiais rizikos faktoriais, kaip amžius ir darbo sveikatos apsaugos srityje trukmė. 590 LTBI bendras dominavimas QFT buvo 4,6 % (27/590) tiriant ŽIV teigiamus asmenis. Teigiami rezultatai buvo susiję su TB rizikomis. Du pagal QFT teigiami pacientai vienų metų laikotarpiu susirgo aktyvia TB ligos forma. Neaiškūs rezultatai (n = 20, 3,4 %) buvo glaudžiai susiję su CD4 skaičiumi < 100/μl. 105 Vaikai, kuriems įtariama TB arba kurie turėjo TB kontaktą, buvo testuojami su QFT ir TOT. 10,5 % QFT teigiamų ir atitinkamai 9,5 % TOT teigiamų, kai ribinė vertė 10 mm. Testų sutapimas iš viso 95,2 % ir atitinkamai 100 % tarp BCG nevakcinuotų atveju. 309 Buvo testuojami 15 įvairių indeksų atvejų artimo kontakto asmenys: 51 % buvo BCG vakcinuoti, 27 % gimę užsienyje, 70 % BCG vakcinuotų ir 18 % nevakcinuotų buvo TOT teigiami (5 mm) ir 9 % ar atitinkamai 11 % buvo QFT teigiami. QFT buvo susijęs su TB rizika. TOT buvo susijęs tik su BCG vakcinacija. QuantiFERON-TB Gold IT testo (QFT pirmtako) ir QFT testo mažiau jautraus skysto antigeno versijos efektyvumas yra aprašytas daugelyje kitų leidinių. Šie tyrimai apima ir testo (-ų) naudojimą asmenims, kontaktuojantiems su pacientais, sergančiais aktyvia TB (9,11,19,25), vaikams (6 10, 25,28), ŽIV teigiamus rezultatus turintiems asmenims (2,5,20), medicinos personalui (13,26,32), asmenims silpnu imunitetu (3,4,22,23,27,30,31) bei asmenims, kuriems įtariama TB (7,8,10,18) arba su maža rizika (15). Galimybė pakartoti ir TOT poveikis vėlesniems QFT testams Atliekant JAV specifikacijos tyrimą, vienas savanorių pogrupis buvo patikrintas praėjus 4 5 savaitėms nuo QFT ir TOT pirminio testo. Todėl 260 savanorių QFT testo ir TOT testo rezultatai buvo nustatyti du kartus; rezultatai sutapo 99,6 % (259/260). Prieš tai atliktas TOT testas nepadarė įtakos teigiamiems QFT rezultatams. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

22 10. Techninė informacija Neaiškūs rezultatai Neaiškūs rezultatai neturėtų būti dažni ir gali būti susiję su tiriamo asmens imuninės sistemos būkle, tačiau jie taip pat gali būti susiję su šiais techniniais faktoriais: Ilgesnis nei 16 val. kraujo laikymas iki inkubavimo 37 C temperatūroje. Kraujo mėginių laikymas kitoje temperatūroje nei rekomenduojama (17 27 C). Nepakankamas kraujo surinkimo mėgintuvėlių turinio maišymas. Nepakankamai švariai išplauta ELISA plokštelė. Esant įtarimui, kad paimant kraują arba dirbant su kraujo mėginiais buvo techninių problemų, visas QFT tyrimas turėtų būti pakartotas su nauju kraujo mėginiu. Stimuliuotų plazmos mėginių ELISA testas gali būti pakartotas, jeigu įtariama, kad buvo netinkamai išplauta arba buvo kitų ELISA metodo procedūrinių nukrypimų. Neaiškūs testo rezultatai, gaunami dėl žemų mitogeno ar aukštų nulinių reikšmių, pakartojus testą turėtų nepasikeisti, nebent atliekant ELISA testą buvo padaryta klaida. Apie neaiškius rezultatus turėtų būti pranešta. Tada pagal aplinkybes gydytojai gali paimti naują kraujo mėginį arba, reikalui esant, atlikti kitas procedūras. Sukrešėję plazmos mėginiai Jeigu plazmos mėginius laikant ilgesnį laiką susidaro fibrino krešulių, mėginius reikia centrifuguoti iki nuosėdų susidarymo; tai palengvina plazmos lašinimą pipete. 22 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

23 Trikčių šalinimo vadovas Šis trikčių šalinimo vadovas gali padėti šalinant atsiradusias triktis. Norėdami gauti daugiau informacijos žr. techninę informaciją, pateiktą Norėdami susisiekti žr. galinį viršelį. ELISA trikčių šalinimas Nespecifinės spalvos atsiradimas Galima priežastis a) Nepakankamai švariai išplautos plokštelės b) Kryžminis ELISA duobučių užteršimas c) Pasibaigęs komplekto / komplekto sudėtinių dalių galiojimo laikas d) Fermento substrato tirpalas yra užterštas e) Plazmos maišymas QFT mėgintuvėliuose prieš paimant plazmos mėginį Sprendimas Plokštelę plaukite mažiausiai 6 kartus po 400 µl plovimo buferio į duobutę. Atsižvelgiant į naudojamą plovimo aparatą, gali prireikti daugiau nei 6 plovimo ciklų. Rekomenduojama tarp plovimo ciklų bent 5 sekundes pamirkyti. Norėdami sumažinti riziką iki minimumo, pipete lašinkite ir maišykite mėginį atsargiai. Patikrinkite, ar nepasibaigęs komplekto galiojimo laikas. Patikrinkite, ar standartas ir konjugato 100x koncentratas buvo naudoti trijų mėnesių laikotarpiu nuo atkūrimo. Išmeskite substratą, jeigu nusidažo mėlynai. Įsitikinkite, kad naudojamos švarios reagentų talpyklos. Po centrifugavimo ir prieš plazmos paėmimą kiekvienu atveju venkite mėginius traukyti pipete aukštyn ir žemyn arba plazmą sumaišyti. Visuomet dirbkite kruopščiai, kad nesujudintumėte medžiagos prie gelio paviršiaus. Žema standartų optinio tankio reikšmė Galima priežastis a) Standarto skiedinio ruošimo klaida Sprendimas Komplekto standarto skiedinius paruoškite tiksliai laikydamiesi QFT ELISA pakuotės informacinio lapelio nurodymų. b) Klaida naudojantis pipete Patikrinkite, ar pipetės yra kalibruotos ir naudojamos tiksliai pagal gamintojo nurodymus. c) Per žema inkubavimo temperatūra d) Per trumpas inkubavimo laikas e) Naudojamas netinkamas plokštelių skaitytuvo filtras ELISA inkubavimas turėtų vykti kambario temperatūroje (22 ± 5 C) Plokštelės su konjugatu, standartais ir mėginiais inkubavimo trukmė turėtų būti 120 ± 5 min. Fermento substrato tirpalas ant plokštelės yra inkubuojamas 30 minučių. Plokštelės rezultatai turėtų būti skaitomi prie 450 nm naudojant nm referencijos filtrą. f) Per šalti reagentai Visi reagentai (neįskaitant konjugato 100x koncentrato) prieš pradedant tyrimą turi būti kambario temperatūros. Ją pasiekti trunka apie vieną valandą. g) Pasibaigęs komplekto / komplekto sudėtinių dalių galiojimo laikas Patikrinkite, ar nepasibaigęs komplekto galiojimo laikas. Patikrinkite, ar standartas ir konjugato 100x koncentratas buvo naudoti 3 mėnesių laikotarpiu nuo atkūrimo. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

24 ELISA trikčių šalinimas Didelis fonas Galima priežastis a) Nepakankamai švariai išplautos plokštelės b) Per aukšta inkubavimo temperatūra c) Pasibaigęs komplekto / komplekto sudėtinių dalių galiojimo laikas d) Fermento substrato tirpalas yra užterštas Sprendimas Plokštelę plaukite mažiausiai 6 kartus po 400 µl plovimo buferio į duobutę. Atsižvelgiant į naudojamą plovimo aparatą, gali prireikti daugiau nei 6 plovimo ciklų. Rekomenduojama tarp plovimo ciklų bent 5 sekundes pamirkyti. ELISA inkubavimas turėtų vykti kambario temperatūroje (22 ± 5 C). Patikrinkite, ar nepasibaigęs komplekto galiojimo laikas. Patikrinkite, ar standartas ir konjugato 100x koncentratas buvo naudoti 3 mėnesių laikotarpiu nuo atkūrimo. Išmeskite substratą, jeigu nusidažo mėlynai. Įsitikinkite, kad naudojamos švarios reagentų talpyklos. Nelinijinė standarto kreivė ir dvigubas kintamumas Galima priežastis a) Nepakankamai švariai išplautos plokštelės b) Standarto skiedinio ruošimo klaida Sprendimas Plokštelę plaukite mažiausiai 6 kartus po 400 µl plovimo buferio į duobutę. Atsižvelgiant į naudojamą plovimo aparatą, gali prireikti daugiau nei 6 plovimo ciklų. Rekomenduojama tarp plovimo ciklų bent 5 sekundes pamirkyti. Standarto skiedinius paruoškite tiksliai laikydamiesi QFT ELISA pakuotės informacinio lapelio nurodymų. c) Nepakankamas išmaišymas Prieš pildami duobutes kruopščiai sumaišykite reagentus apversdami arba lengvai pasukiodami. d) Netolygus lašinimas pipete arba pertraukimas pasirengimo tyrimo metu Mėginių ir standartų pylimas turėtų vykti nenutrūkstamai. Visi reagentai turi būti paruošti prieš pradedant tyrimą. Testavimo procedūrą demonstruojantį vaizdo įrašą ir didžiosios techninių problemų dalies sprendimą rasite internete užsiregistravę Gnowee. Produkto informaciją ir technines nuorodas gausite nemokamai iš QIAGEN, per platintoją arba apsilankę 24 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

25 11. Literatūra Bendrą literatūros sąrašą apie QFT rasite Gnowee QuantiFERON nuorodų bibliotekoje 1. Andersen, P. et al. (2000) Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 356, Balcells, M.E. et al. (2008) A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int. J. Infect. Dis. 12, Bartalesi, F. et al. (2009) QuantiFERON-TB Gold and TST are both useful for latent TB screening in autoimmune diseases. Eur. Respir. J. 33, Bocchino, M. et al. (2008) Performance of two commercial blood IFN-gamma release assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in patient candidates for anti-tnf-alpha treatment. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, Brock, I. et al. (2006) Latent tuberculosis in HIV positive, diagnosed by the M. tuberculosis specific interferon-gamma test. Respir. Res. 7, Chun, J.K. et al. (2008) The role of a whole blood interferon gamma assay for the detection of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated children. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 62, Connell, T.G. et al. (2008) A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB gold and T-SPOT.TB in children. PLoS ONE 3, e2624. doi: /journal.pone Detjen, A.K. et al. (2007) Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 45, Diel, R. et al. (2009) Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB-Gold In-Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest 135, Diel, R. et al. (2008) Predictive value of a whole-blood IFN-γ assay for the development of active TB disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177, Diel, R. et al. (2006) Tuberculosis contact investigation with a new, specific blood test in a low-incidence population containing a high proportion of BCG-vaccinated persons. Respir. Res. 7, Dogra, S. et al. (2007) Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J. Infect. 54, Drobniewski, F. et al. (2007) Rates of latent tuberculosis in health care staff in Russia. PLoS Med. 4, e Gerogianni, I. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma assay for the diagnosis of tuberculosis infection in an unselected Greek population. Respirology 13, Harada, N. et al. (2008) Comparison of the sensitivity and specificity of two whole blood interferongamma assays for M. tuberculosis infection. J. Infect. 56, Higuchi, K. et al. (2009) Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med. Microbiol. Immunol. 198, Kang, Y.A. et al. (2005) Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA 293, Katiyar, S.K. et al. (2008) Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, Kipfer, B. et al. (2008) Tuberculosis in a Swiss army training camp: contact investigation using an Interferon gamma release assay. Swiss. Med. Wkly. 138, Luetkemeyer, A. et al. (2007) Comparison of an interferon-gamma release assay with tuberculin skin testing in HIV-infected individuals. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, 737. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

26 21. Mackensen, F. et al. (2008) QuantiFERON TB-Gold - A new test strengthening long-suspected tuberculous involvement in serpiginous-like choroiditis. Am. J. Ophthalmol. 146, Manuel, O. et al. (2007) Comparison of Quantiferon-TB Gold with tuberculin skin test for detecting latent tuberculosis infection prior to liver transplantation. Am. J. Transplant. 7, Matulis, G. et al. (2007) Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen specific IFN-gamma assay. Ann. Rheum. Dis. 67, Mirtskhulava, V. et al. (2008) Prevalence and risk factors for latent tuberculosis infection among health care workers in Georgia. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, Nakaoka, H. et al. (2006) Risk for tuberculosis among children. Emerging Infect. Dis. 12, Pai, M. et al. (2005) Mycobacterium tuberculosis infection in health care workers in rural India: comparison of a whole-blood, interferon-g assay with tuberculin skin testing. JAMA 293, Ponce de Leon, D. et al. (2008) Comparison of an interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for detection of tuberculosis (TB) infection in patients with rheumatoid arthritis in a TB-endemic population. J Rheumatol. 35, Richeldi, L. et al. (2008) Prior tuberculin skin testing does not boost QuantiFERON-TB results in paediatric contacts. Eur. Respir. J. 32, Rothel, J.S. and Andersen, P. (2005) Diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: is the demise of the Mantoux test imminent? Expert Rev. Anti Infect. Ther. 3, Schoepfer, A.M. et al. (2008) Comparison of interferon-gamma release assay versus tuberculin skin test for tuberculosis screening in inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol. 103, Silverman, M.S. et al. (2007) Use of an interferon-gamma based assay to assess bladder cancer patients treated with intravesical BCG and exposed to tuberculosis. Clin. Biochem. 40, Stebler, A. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma release assay for baseline tuberculosis screening of healthcare workers at a Swiss university hospital. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 29, QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

27 12. Techninis klientų aptarnavimas Techninio klientų aptarnavimo adresai: Asia-Pacific Europe Middle East/Africa USA/Canada Latin America (not including Brazil or Mexico) Mexico Brazil QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

28 13. TRUMPAS TESTO PROCEDŪROS APRAŠAS 1 etapas. Kraujo mėginio inkubavimas 1. Kraujo surinkimo mėgintuvėliu iš paciento paimkite kraujo mėginį ir 10 kartų stipriai pakratydami kruopščiai sumaišykite turinį, kad mėgintuvėlio sienelių vidinė pusė būtų visiškai padengta krauju, su kuriuo susimaišytų antigenai, esantys ant mėgintuvėlio vidinių sienelių. 2. Inkubuokite mėgintuvėlius vertikalioje padėtyje val. 37 ± 1 C temperatūroje. 3. Po inkubavimo esant RCF (g) mėgintuvėlius 15 minučių centrifuguokite, kad plazma atsiskirtų nuo raudonųjų kraujo ląstelių. 4. Po centrifugavimo ir prieš plazmos paėmimą kiekvienu atveju venkite mėginius traukyti pipete aukštyn ir žemyn arba plazmą sumaišyti. Visuomet dirbkite kruopščiai, kad nesujudintumėte medžiagos prie gelio paviršiaus. 2 etapas. IFN-γ ELISA 1. ELISA komponentus, neįskaitant konjugato 100x koncentrato, palikite mažiausiai 60 minučių pastovėti, kad susilygintų su kambario temperatūra (22 ± 5 C). 2. Komplekto standartą atkurkite naudodami 8,0 IU/ml distiliuoto arba dejonizuoto vandens. Pagaminkite keturis (4) standarto skiedinius. 3. Naudodami distiliuotą arba dejonizuotą vandenį atkurkite liofilizuotą konjugato 100x koncentratą. 4. Pagaminkite darbui reikiamo stiprumo konjugatą su žaliu skiedikliu ir į visas duobutes įpilkite po 50 µl. 5. Į atitinkamas duobutes įpilkite po 50 µl plazmos mėginio ir 50 µl standartų. Išmaišykite naudodami kratytuvą ± 5 minučių inkubuokite kambario temperatūroje. 7. Duobutes plaukite mažiausiai 6 kartus įpildami po 400 µl plovimo buferio į duobutę. 28 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

29 8. Į kiekvieną duobutę įpilkite po 100 µl fermento substrato tirpalo. Išmaišykite naudodami kratytuvą minučių inkubuokite kambario temperatūroje. 10. Į kiekvieną duobutę įpilkite po 50 µl fermento stabdymo tirpalo. Išmaišykite naudodami kratytuvą. 11. Matuokite rezultatus prie 450 nm naudodami nm referencijos filtrą. 12. Analizuokite rezultatus. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

30 SVARBŪS PAKEITIMAI Šios QFT pakuotės informacinio lapelio leidimo ( LT leid. 01) svarbūs pakeitimai yra apibendrinti šioje lentelėje: Skyrius Puslapis Pakeitimas (-ai) 4. Perspėjimai ir atsargumo priemonės 8 9 Tam tikrų ELISA komponentų iš skirtingų komplekto partijų naudojimo pakeitimas. 12. Techninis klientų aptarnavimas 27 Nauji techninio klientų aptarnavimo el. pašto adresai. 30 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA pakuotės informacinis lapelis

31 Prekių ženklai: QIAGEN, QFT, QuantiFERON (QIAGEN grupė); Microsoft, Excel (Microsoft); ProClin (Rohm and Haas Co.). QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA ribotoji licencinė sutartis Šio produkto naudojimas reiškia pirkėjo ar naudotojo sutikimą su šiomis sąlygomis: 1. Produktą galima naudoti tik vadovaujantis protokolais, pateiktais su šiuo produktu, šiuo informaciniu lapeliu ir tik su komplekte esančiais komponentais. QIAGEN nesuteikia jokios intelektinės nuosavybės licencijos naudoti ar įtraukti pridėtus šio komplekto komponentus su į šį rinkinį neįeinančiais komponentais, išskyrus aprašytus protokoluose, pateiktuose su šiuo produktu ir šiame informaciniame lapelyje. 2. Išskyrus licencijose nurodytus atvejus, QIAGEN nesuteikia garantijos, kad šis komplektas ir (arba) jo naudojimas nepažeis trečiųjų šalių teisių. 3. Komplektui ir jo komponentams suteikta licencija naudoti vieną kartą; pakartotinai naudoti, atnaujinti ar perparduoti negalima, nebent QIAGEN nustatė kitaip. 4. QIAGEN aiškiai atsisako bet kokių kitų išreikštų ar numanomų licencijų, išskyrus aiškiai nurodytas licencijas. 5. Komplekto pirkėjas ir naudotojas sutinka nesiimti ir neleisti niekam kitam imtis veiksmų, kurie galėtų paskatinti arba palengvinti čia nurodytus draudžiamus veiksmus. QIAGEN gali priversti vykdyti šios Ribotosios licencinės sutarties draudimus bet kuriame teisme ir atgauti visas tyrimo ir teismo išlaidas, įskaitant išlaidas advokatams, pateikusi ieškinį dėl šios Ribotosios licencinės sutarties vykdymo arba su šiuo komplektu ir (arba) jo komponentais susijusių teisių į savo intelektinę nuosavybę. Naujausios licencijos sąlygos pateiktos adresu Cellestis, QIAGEN Company. Visos teisės saugomos.

32 Phone: (Australia) LT leid. 01