ANALIZA GENETSKIH DEJAVNIKOV PRI BOLNIKIH POVEZANIH S PRISOTNOSTJO HLA-B27

Transcription

1 UNIVERZA V MARIBORU MEDICINSKA FAKULTETA ANALIZA GENETSKIH DEJAVNIKOV PRI BOLNIKIH POVEZANIH S PRISOTNOSTJO HLA-B27 JASMINA REHAR Delo je pripravljeno v skladu s Pravilnikom o častnih nazivih, nagradah, priznanjih in pohvalah Medicinske fakultete Univerze v Mariboru pod mentorstvom prof. dr. Nadje Kokalj-Vokač, univ. dipl. biol. in somentorstvom asist. dr. Borisu Zagradišniku, dr. med. Maribor, 2011

2 IZVLEČEK UVOD. Ankilozirajoči spondilitis je pogosta spondiloartropatija. Etiologija še ni popolnoma pojasnjena. Gre za multifaktorialno bolezen, ki nastane kot posledica interakcije med dedovanjem in okoljem. Pomembno vlogo pri tveganju za razvoj bolezni in ekspresiji le-te imajo genetski dejavniki. Več kot 90% bolnikov je nosilcev genskega označevalca HLA-B27. Raziskave so nakazale povezavo med spondiloartropatijami in proinflamatornim vnetnim citokinom interlevkinom-23 (IL-23), natančneje receptorjem za IL-23 (IL-23R) in njegovimi polimorfizmi posameznega nukleotida (SNP). Polimorfizem posameznega nukleotida (single-nucleotide polimorphism SNP) rs nosi značilno povišano tveganje za nastanek bolezni za nosilce alela A v primerjavi z genotipom GG. Odkritje povezave in vpletenosti gena IL23R v nastanek AS pomeni, da lahko njegove polimorfizme uporabimo pri opredeljevanju bolezni oz. pri postavljanju diagnoze ali celo prognoze za potek bolezni. Namen študije je ugotoviti vlogo gena IL23R s primerjavo frekvenc genotipov in alelov polimorfizma rs med preiskovanci s sumom na AS/neopredeljeno spondiloartropatijo in kontrolno skupino zdravih oseb. HIPOTEZA. Določevali smo pogostost pojavljanja polimorfizma rs v genu IL23R, da bi preverili naslednjo hipotezo: Alel A polimorfizma rs se pri preiskovancih s sumom na ankilozirajoči spondilitis oziroma neopredeljeno seronegativno spondiloartropatijo pojavi pogosteje kot v splošni populaciji. METODE. V raziskavi smo uporabili DNA 108 bolnikov ki so (bili) obravnavani v revmatoloških ambulantah Klinike za intero medicino Univeritetnega kliničnega centra Maribor in kontrolno skupino 396 zdravih oseb, polovica teh je bila nosilcev alela za antigen HLA-B27. Bolniki so imeli revmatološke simptome in so bili napoteni na testiranje alela HLA-B27. Prisotnost alelov smo določali z metodo veriţne reakcije s polimerazo (PCR). Pri vseh preiskovancih smo nato določili še polimorfizem posameznega nukleotida (SNP) rs gena IL23R z metodo (PCR). Rezultate smo statistično obdelali z izračunanjem Hardy-Weinberg ovega ravnoteţja, z uporabo testa hi kvadrat ( 2 ) in Fisherjevega natančnega testa. Tveganje smo ocenili s pomočjo razmerja obetov. REZULTATI. Primerjava deleţev genotipov in alelov polimorfizma rs je pokazala, da pri skupini bolnikov s spondiloartropatijo v primerjavi s celotno skupino zdravih kontrol

3 ni pomembnih razlik (p = 0,8736). Razmerja obetov za povezavo polimorfizma rs s seronegativno spondiloartropatijo ob predpostavki avtosomno dominantnega dedovanja je bilo 0,9218 (s 95% intervalom zaupanja med 0,5951 in 1,4278), ob predpostavki avtosomno recesivnega delovanja pa 1,0375 (s 95% intervalom zaupanja med 0,5517 in 1,9512). Analize povezave med polimorfizmom rs in seronegativno spondiloartropatijo niso potrdile. ZAKLJUČKI. Odsotnost statistično pomembne povezave med polimorfzmom rs gena IL23R ne potrjuje vloge tega polimorfizma pri nastanku ankilozirajočega spondilitisa oz. neopredeljene seronegativne spodiloartropatije. Morebitni vpliv polimorfizma je verjetno premajhen, da bi z našo študijo njegov prispevek pri nastanku AS/neopredeljenih spondiloartropatij lahko zaznali. Rezultati naše študije tudi ne potrjujejo vpletenosti gena IL23R v etiopatogenezo AS/neopredeljenih spondiloartropatij. KLJUČNE BESEDE. polimorfizem, IL23, alel, HLA-B27, ankilozirajoči spondilitis, spondiloartropatija

4 ABSTRACT PURPOSE. Ankylosing spondylitis (AS) is a common spondyloarthropathy. Etiology has not yet been fully explained. It is a multifactorial disease, which forms as a consequence of interaction between inheritance and environment. Genetic factors have a substantive role in AS susceptibility and expression. HLA-B27 is the major gene associated with AS and is present in more then 90% of pacients. Studies have shown a connection between spondyloarthropathy in inflammatory cytokine interleukin IL23 (IL-23), more precisely the receptor for IL-23 (IL-23R) and his single-nucleotide polymorphism (SNP). Singlenucleotide polymorphism (SNP) rs carries a typical increased risk for formation of diseases for carriers of allele A in comparison with genotype GG. Detection of the connection and interference of gene IL23R in the forming of AS means that we can use its polimorphisms when detecting diseases or making diagnosis or even making a prognosis for the course of the disease. We undertook the current study to determine the role of gene IL23R with comparing frequencies of genotypes and alleles of polymorphism rs between patients with AS/undifferentiated spondyloarthropathy and a test group of healthy individuals. HYPOTHESIS. We determined the frequency of polymorphism rs in gene Il23R in order to test the following hypothesis: Allele A of polymorphism rs accurs more often at patients with AS/undifferentiated spondyloarthropathy than in general population. METHODS. In our study 108 patients from the Department of rheumatology from University medical center Maribor and 396 controls (half of them being carriers of the allele HLA- B27.) were included. Patients had rheumatological symptoms and were directed to having a test for allele HLA-B27. The presence of HLA-B27 was detected with the method of polymerase chain reaction (PCR). We have specified single-nucleotide polimorhism (snp) rs of gene IL23R in case of each subject of investigation. The Hardy-Weinberg equilibrium was calculated using the chi-square test and possible association was determined by calculating odds ratios. RESULTS. The genotype and allele frequencies of rs polymorphism between patients and the control group did not differ significantly (p = 0,8736).

5 Odds ration for possible association between the polymorphism rs and seronegative spondyloarthropathy was 0,9218 (95% confidence interval [CI]: 0,5951 in 1,4278) with autosomal dominant mode for allele A and 1,0375 (95% CI 0,5517-1,9512) with autosomal recessive mode for allele A. The analysis have not confirmed the connection between polimorphism rs and AS/undifferentiated spondyloarthropathy. CONCLUSION. The results indicate that the polymorphism rs of the IL23R gene is not associated with the AS/undifferentiated spondyloarthroparthy. The contribution of this particular genetic variation is probably too small to be detected with our study. A possible role for the IL23R gene in ethiopathogenesis of spondiyloarthropathies was not confirmed. KEY WORDS. polymorphisms, IL23, allele, HLA-B27, ankylosing spondylitis, spondyloarthropathy

6 VSEBINA 1 VSEBINA 1. UVOD ETIOLOGIJA IN EPIDEMIOLOGIJA KLINIČNA SLIKA ANKILOZANTNEGA SPONDILITISA GENETIKA Poglavitni histokompatibilnostni kompleks (major histocompatibility complex MHC) in gen HLA B IL23R NAMEN ŠTUDIJE METODE PREISKOVANCI Bolniki Kontrolna skupina zdravih oseb nosilcev alela za antigen HLA-B Kontrolna skupina zdravih oseb brez alela za antigen HLA-B IZOLACIJA GENOMSKE DNA IZ LEVKOCITOV PERIFERNE VENSKE KRVI Postopek izolacije DNA Merjenje koncentracije DNA DOLOČANJE PRISOTNOSTI ALELA HLA-B27 V GENU ZA HLA-B (MODIFICIRANO PO MOLECULAR TYPING OF HLA-B27 ALLELES) (19) AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA DOLOČANJE POLIMORFIZMA POSAMEZNEGA NUKLEOTIDA (SNP) RS GENA IL23R Genska tipizacija SNP rs s tehniko PCR STATISTIČNA ANALIZA REZULTATOV REZULTATI PREISKOVANCI Bolniki Kontrolna skupina zdravih oseb nosilcev alela za antigen HLA-B Kontrolna skupina zdravih oseb brez alela za antigen HLA-B REZULTATI GENOTIPIZACIJE POLIMORFIZMA RS V GENU IL23R ANALIZA VEZAVE RAZPRAVA... 25

7 VSEBINA 2 5. LITERATURA ZAHVALA UPORABLJENI SIMBOLI IN KRATICE... 32

8 SEZNAM TABEL 3 SEZNAM TABEL TABELA 1-1: POGOSTOST GENSKEGA OZNAČEVALCA HLA-B TABELA 1-2: MERILA ZA POSTAVITEV DIAGNOZE AKILOZIRAJOČI SPONDILITIS (NEW YORK)....7 TABELA 3-1: SPLOŠNI PODATKI BOLNIKOV S SERONEGATIVNO SPONDILOARTROPATIJO TABELA 3-2: KONTROLNA SKUPINA ZDRAVIH OSEB, NOSILCEV ALELA HLA-B TABELA 3-3: KONTROLNA SKUPINA ZDRAVIH OSEB BREZ ALELA HLA-B TABELA 3-4. GENOTIPI IN FREKVENCE ALELOV POLIMORFIZMA RS PRI BOLNIKIH TABELA 3-5. GENOTIPI IN FREKVENCE ALELOV POLIMORFIZMA RS V GENU IL23R PRI ZDRAVIH OSEBAH NOSILCIH ALELA ZA ANTIGEN HLA-B TABELA 3-6. GENOTIPI IN FREKVENCE ALELOV POLIMORFIZMA RS V GENU IL23R PRI ZDRAVIH OSEBAH BREZ ALELA ZA ANTIGEN HLA-B TABELA 3-7. PRIMERJAVA GENOTIPOV POLIMORFIZMA RS MED KONTROLNIMA SKUPINAMA TABELA 3-8. PRIMERJAVA GENOTIPOV IN ALELOV POLIMORFIZMA RS MED PODSKUPINAMA BOLNIKOV Z DIAGNOZO ANKILOZIRAJOČEGA SPONDILITISA OZ. DRUGO DIAGNOZO SPONDILOATROPATIJE TABELA 3-9. PRIMERJAVA GENOTIPOV IN ALELOV POLIMORFIZMA RS MED SKUPINO BOLNIKOV Z DIAGNOZO ANKILOZIRAJOČEGA SPONDILITISA OZ. DRUGO DIAGNOZO SPONDILOATROPATIJE IN CELOTNO SKUPINO KONTROLNIH PREISKOVANCEV TABELA RAZMERJA OBETOV ZA POVEZAVO POLIMORFIZMA RS S SERONEGATIVNO SPONDILOARTROPATIJO OB PREDPOSTAVKI AVTOSOMNO DOMINANTNEGA DELOVANJA TABELA RAZMERJA OBETOV ZA POVEZAVO POLIMORFIZMA RS S SERONEGATIVNO SPONDILOARTROPATIJO OB PREDPOSTAVKI AVTOSOMNO RECESIVNEGA DELOVANJA... 24

9 SEZNAM SLIK 4 SEZNAM SLIK SLIKA 1-1. SHEMATSKI PRIKAZ HLA-B27 KOMPLEKSA....8 SLIKA 2-1. PREPOZNAVANJU SPECIFIČNEGA ZAPOREDJA NUKLEOTIDOV V GENU HLA-B SLIKA 2-2. AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA SLIKA 2-3. SNP RS IN POLOŢAJ ZAČETNIH OLIGONUKLEOTIDOV SLIKA 2-4. AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA IL23R RS

10 UVOD 5 1. UVOD Med serološko negativne spondiloartritise (spondiloartropatije, SpA) prištevamo skupino vnetnih revmatičnih bolezni, ki imajo podobno klinično sliko, rentgenske spremembe in genetsko ozadje. Vnetje hrbtenice predstavlja njihovo glavno značilnost. Sem sodijo ankilozirajoči spondilitis, reaktivni artritis, psoriatični artritis, entropatični artritis in neopredeljena spondiloartropatija. Ankilozirajoči spondilitis (AS) predstavlja vzorec za SpA, zato s to boleznijo primerjamo vse ostale bolezni iz te skupine (1) Etiologija in epidemiologija Etiologija še ni popolnoma pojasnjena. Gre za multifaktorialno bolezen, ki nastane kot posledica interakcije med dedovanjem in okoljem. Pomembno vlogo pri tveganju za razvoj bolezni in ekspresiji le-te imajo genetski dejavniki. Gen HLA-B27 (human leukocyte antigens) igra pri AS pomembno vlogo, saj predstavlja skoraj 40% genetske obrementitve za nastanek bolezni v primerjavi z ostalimi multigenetskimi boleznimi. Za to skupino bolezni zboli pribliţno 0,5% belih Evropejcev (2). Prevalence bolezni je odvisna od prevalence antigena HLA-B27. Pri belcih se odstotek HLA-B27 pozitivnih oseb giblje okrog 8, medtem ko je pri Japoncih in afriških črncih pod 1. Nosilci genskega označevalca HLA-B27 imajo do 20X večje tveganje za razvoj serološko negativne spondiloatropatije kot HLA-B27 negativne osebe. Bolniki z AS so nosilci genskega označevalca HLA-B27 v 90 do 95 % (tabela 1-1) (2, 3). Tabela 1-1: pogostost genskega označevalca HLA-B27. Skupina HLA-B27 pozitivni (%) belci 2-18 Slovani 7-14 ankilozirajoči spondilitis 90-95

11 UVOD 6 Primerjava sorodnikov bolnikov z AS in splošno populacijo je pokazala 5-16 krat večje tveganje za pojav bolezni pri HLA-B27 pozitivnih sorodnikih kakor pri HLA-B27 pozitivnih posameznikih iz splošne populacije (2,4). Hkrati pa večja pojavnost znotraj druţine nakazuje obstoj skupnega dejavnika tveganja, ki je lahko genetski ali okoljski. Različne raziskave so potrdile obstoj drugih genov, ki vplivajo na gen HLA-B27 in povečajo tveganje za nastanek bolezni pri nosilcih HLA-B27(1). Opazovan vzorec bolezni sovpada z poligenetskim tipom bolezni (1, 3, 4). Pri enojajčnih dvojčkih je 63 75% konkordantnost, kar nakazuje vlogo dejavnikov okolja. Domnevajo, da so okuţbe z mikroorganizmi, ki se nahajajo povsod, sproţilni dejavnik v razvoju AS. Do tega zaključka so prišli na podlagi raziskav na HLA-B27 transgenih podganah, ki so razvile bolezen le, če so tekom razvoja bile izpostavljene normalni črevesni flori (3). Drugi moţen mehanizem je predstavitev artrogenih peptidov črevesnih bakterij v sklopu HLA-B27 molekul limfocitom T. Bakterijski antigeni, z afiniteto do tetivnih in vezivnih narastišč, naj bi prek vnete sluznice vstopali v krvni obtok in dosegali ta specifična mesta (4). Dve veliki raziskavi (Welcome trust case control consortium in Australo-Anglo-American spondyloarthritis consortium) ter raziskave kroničnih vnetnih črevesnih bolezni so nakazale povezavo med avtoimunimi boleznimi in proinflamatornim vnetnim citokinom interlevkinom-23 (IL-23), natančneje receptorjem za IL-23 (IL-23R) in njegovimi polimorfizmi posameznega nukleotida (SNP) (5,6,7) Klinična slika ankilozirajočega spondilitisa AS se najpogosteje začne v drugem ali tretjem desetletju ţivljenja. Le redko se bolezen prvič manifestira po 50. letu ţivljenja. Moški zbolevajo 2-do3-krat pogosteje (2). Najpogosteje se prične z bolečinami v spodnjem delu hrbtenice in sakroiliakalnem področju, ki izţarevajo v stegna in prsni koš. Bolečine se pri gibanju zmanjšajo, v mirovanu pa ne izzvenijo. Značilna je nočna bolečina, pojavi se jutranja okorelost. Z napredovanjem bolezni se bolečina razširijo tudi na prsni in vratni del hrbtenice, gibljivost le-te pa postaja vedno bolj omejena. Sklepi (predvsem veliki) so občasno ali stalno vneti pri % bolnikov. Entezitis pogosteje napade narastišče Ahilove tetive, medrebrnih mišic in plantarne facije (2,3,8). Ker je AS sistemska bolezen, lahko prizadane tudi zunajsklepna tkiva. Najbolj znan zunajsklepni pojav je iridociklitis (prizadane 25 30% bolnikov). Kardiovaskularni sistem je

12 UVOD 7 prizadet pri manj kot 10% bolnikov (fibroza prevodnega sistema srca, aortitis, popuščanje mitralne zaklopke). Pojav restriktivne pljučne bolezni je posledica omejene podajnosti prsnega koša v poznejših stadijih AS. Klinično neme vnetne spremembe v terminalnem ileumu in debelem črevesu ima do 60% bolnikov, 5-10% bolnikov ima pridruţeno klinično evidentno kronično vnetno črevesno bolezen (9). Nevrološki zapleti so običajno posledica poškodb, ki so zaradi krhke, osteoporotične in zatrdele hrbtenice pogostejše kakor pri zdravi populaciji (2,3,8,9). Osnovni bolezenski proces pri AS je entezitis. V območju narastišč vezi, kit in fascij pride do infiltracije limfocitov in makrofagov, kasneje pa fibroblastov in hondrocitov. V končnem obdobju pride do kostenenja vezivne hrustančevine. Diagnozo postavimo s pomočjo prirejenih meril (New York Criteria: 83 % senzitivnost, 98 % specifičnost) (tabela 1-2) (10). Tabela 1-2: Merila za postavitev diagnoze akilozirajoči spondilitis (prirejena merila New York). Prirejena merila (New York) Klinična merila bolečina v spodnjem delu hrbtenice, ki traja vsaj 3 mesece in se po razgibavanju izboljša, med počitkom pa ne popusti zmanjšana gibljivost ledvenega dela hrbtenice v sagitalni in frontalni ravnini zmanjšana razteznost prsnega koša glede na normalne vrednosti za spol in starost Radiološki kriteriji obojestranski sakroiliitis (razred 2 ali več) enostarnski sakroiliitis (vsaj razred 3 ali 4) Diagnozo ankilozirajočega spondilitisa postavimo pri bolniku z enim rentgenskim in vsaj enim kliničnim merilom Glavni cilji zdravljenja AS so ohranitev gibljivosti hrbtenice, prizadetih perifernih sklepov in lajšanje bolečine. Bolnika je treba seznaniti z naravo bolezni, zelo pomembno je redno izvajanje dihalnih in gibalnih vaj (2,8). Za obvladovanje bolečine se priporočajo nesteroidni antirevmatiki in antagonisti TNF-alfa (11). Pri prizadetosti perifernih sklepov sta učinkovita tudi sulfasalazin ali glukokortikoidi. Ob napredovanju bolezni je pri nekaterih bolnikih potrebno tudi kirurško zdravljenje (9,10).

13 UVOD Genetika Poglavitni histokompatibilnostni kompleks (major histocompatibility complex MHC) in gen HLA B27 MHC je velika skupina genov na 6. kromosomu, ki imajo v imunskem sistemu vlogo razločevanja med lastnimi in tujimi antigeni v organizmu in predstavljanja le-teh limfocitom T. MHC vpliva na mnoge aktivnosti imunskih celic, vključno z zavrnitvijo presadkov in ubijanjem z virusi inficiranih celic s pomočjo specifičnih T-limfocitov ali celicubijalk. MHC je samo del večjega poglavitnega imunogenega kompleksa (MIC). Pri ljudeh se imenuje človeški levkocitni antigeni (human leukocyte antigens) in je označeni s kratico antigen HLA. Antigene HLA delimo v dva razreda, in sicer I in II. V prvega sodijo molekule HLA-A, -B in -C, v drugega pa HLA-DR, -DQ in -DP. Molekule I razreda so transmembranski proteini sestavljeni iz dveh polipeptidnih verig (dolge in kratke). Izraţeni so skoraj na vseh telesnih celicah (razen na eritrocitih in na celicah osrednjega ţivčnega sistema). Do sedaj so odkrili več kot 50 različnih alelov gena HLA B27. Različni podtipi imajo različno moč povezave z nastankom AS (12). Z nastankom bolezni so močneje povezani podtipi B*2702, B*2704, B*2705, B*2707. Zelo redko pa se bolezen pojavi pri podtipih B*2706 in B*2709 (12). Obstaja več teorij kako bi naj bil HLA B27 povezan z nastankom AS. Poleg ţe zgoraj omenjene moţnosti predstavitve točno določenih peptidov limfocitom T in posledičnega kroničnega vnetja, bi lahko k nastanku bolezni vplivali tudi naslednji mehanizmi: molekularna mimikrija, endoplazmatski retikularni stres zaradi napačno zvitih proteinov in akumulacije le-teh in alternativne oblike HLA B27 homodiemere. HLA B 27 pogosto tvori homodimere, le-te pa povzročajo AS tako, da predstavljajo proteine napačno ali pa tako, da NK celice napačno prepoznajo proteine (12,13). Slika 1-1. Shematski prikaz HLA-B27 kompleksa.

14 UVOD IL23R Gen za IL23R kodira receptor za interlevkin 23 (IL-23), nahaja se na kromosomu 1p31. Ta protein se nahaja v membranah celic imunskega sistema (limfocitiov T, NK celic, monocitov in dendritičnih celicah). Heterodimerni citokin IL-23 je sestavljen iz dveh podenot (p40 in p19), podenoto p40 si deli skupaj z interlevkinom 12 (IL-12) (1). Na površini celic receptorji za interlevkin 23 reagirajo s citokinom interlevkin 23, ki regulira aktivnost imunskih celic na ta način, da stimulira diferenciacijo CD4 T limfocitov v T H 17 limfocite (helper T limfociti). T H 17 celice se najpogosteje in v nejvečjem številu nahajajo v koţi in na površini gastrointestinalnega trakta (14,15). Tukaj sodelujejo pri obrambi pred vdorom gliv in bakterij s sekrecijo defenzinov in rekrutacijo nevtrofilcev (16). Limfocitni odgovor v smeri produkcije limfocitov T H 17 se je izkazal kot pomemben faktor pri nastanku in razvoju avtoimunih bolezni kot so Crohnova bolezen, psoriaza in AS (15,16). Celice T H 17 izločajo IL-17, ki je proimflamatorni citokin in povzroča poškodbe tkiva v moţganih, sklepih, pljučih in črevesja (16,17). T H 17 celice poleg IL17 izločajo tudi IL22, ki je prav tako proimflamatorni citokin. Skupaj sodelujeta pri patologiji avotimunih obolenj kot je AS ali psoriaza (1). Nekateri podtipi gena za IL23R povečujejo moţnost razvoja AS. Raziskava Genome-wide IBD study (5) je pokazala, da je v genu za IL23R polimorfizem posameznega nukleotida (single-nucleotide polimorphism SNP) Arg381Gln povezan z nastankom kronične vnetnih bolezni. Delovanje alela z glutaminom je protektivno in ščiti pred nastankom Crohnove bolezni, psoriaze in tudi AS (1). Gen za Il23R ima še druge polimorfizme, ki so tudi povezani z boleznijo AS (1). Mednje sodi tudi polimorfizem rs , za katerega je značilno povišano tveganje za nastanek bolezni za nosilce alela A (1) v primerjavi z genotipom GG (1). Odkritje povezave in vpletenosti gena IL23R v nastanek AS pomeni, da lahko njegove polimorfizme uporabimo pri opredeljevanju bolezni oz. pri postavljanju diagnoze ali celo prognoze za potek bolezni. Za polimorfizem rs je opisana statistično zelo značilna povezava z nastankom bolezni AS. To pomeni, da gre za genetsko variabilnost za katero lahko z večjo verjetnostjo pričakujemo, da bo mogoče ugotoviti povečano pojavljanje kritičnega alela pri bolnikih s postavljeno diagnozo AS in posledično pri preiskovancih, ki so v postopku postavljanja diagnoze spondiloartropatije.

15 UVOD Namen študije Polimorfizem rs v genu IL23R spada med variabilnosti gena IL23R s statistično zelo značilno povezavo z nastankom bolezni AS. Predpostaviti je mogoče, da se alel A polimorfizma rs pri preiskovancih s sumom na ankilozirajoči spondilitis oziroma neopredeljeno seronegativno spondiloartropatijo pojavi pogosteje kot v splošni populaciji. Namen študije je ugotoviti vlogo gena IL23R s primerjavo frekvenc genotipov in alelov polimorfizma rs med preiskovanci s sumom na AS/neopredeljeno spondiloartropatijo in kontrolno skupino zdravih oseb.

16 METODE METODE Preiskovanci Bolniki V raziskavo smo zajeli 108 bolnikov, ki so (bili) obravnavani v revmatološki ambulanti Klinike za intero medicino Univeritetnega kliničnega centra Maribor. Gre za bolnike z diagnozo seronegativne spodiloartropatije, pri katerih ni bil ugotovljen obstoj psoriaze, kronične vnetne črevesne bolezni ali prebolele infekcije. Vsi zajeti bolniki so bili napoteni na testiranje HLA-B27 alela v Laboratorij za medicinsko genetiko. Preiskovance smo opredelili glede: spola prisotnosti antigena HLA-B27 diagnoze Podatke smo zajeli iz popisov bolezni, ki so na voljo na Kliniki za interno medicino Univeritetnega kliničnega centra za obdobje od do (zadnji vključen bolnik) Kontrolna skupina zdravih oseb nosilcev alela za antigen HLA-B27 Za potrebe raziskave smo izbrali kontrolno skupino 198 zdravih nosilcev alela za antigen HLA-B27. Določili smo jih iz vzorcev DNA iz banke vzorcev DNA Laboratorija za medicinsko genetiko Univerzitetnega kliničnega centra Maribor. Uporabili smo DNA oseb, ki po naših podatkih niso sorodniki preiskovancev Kontrolna skupina zdravih oseb brez alela za antigen HLA-B27 V raziskavo smo vključili kontrolno skupino 198 zdravih oseb, ki niso imele prisotnega HLA- B27 alela in niso bili obravnavani pri revmatologu. Njihove vzroce DNA smo določili iz banke vzorcev DNA Laboratorija za medicinsko genetiko Univerzitetnega kliničnega centra Maribor. Osebe po naših podatkih niso sorodniki preiskovancev.

17 METODE 12 Vsi preiskovanci so s podpisom izjave po predhodnem obvestilu o namenu, privolili v odvzem krvi, hrambo izolirane DNA in uporabo le-te za raziskavo. Študija je del raziskave za katero je Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko izdala pozitivno mnenje Izolacija genomske dna iz levkocitov periferne venske krvi Postopki za izolacijo določenega tipa DNA iz celic so lahko različni, imajo pa nekatere skupne značilnosti (osnovni princip lize celic, deproteinacija in renaturacija DNA) (18). Z opisanim postopkom smo pridobili zadostne količine genomske DNA, ki je bila primerno čista Postopek izolacije DNA 1. Odvzeli smo do 1-10 ml periferne venske krvi v standardno epruveto z antikoagulantom EDTA (epruveta z vijoličnim zamaškom). 2. Kri smo prelili v 50 ml plastično posodo s pokrovom in dodali do 50 ml raztopine za lizo eritrocitov (20 mm Tris-HCl, 5 mm EDTA). Vsebino smo temeljito premešali, da se je konus posode sprostil, jo inkubirali v hladilniku 10 minut in centrifugirali 15 minut pri 2500 obr/min. Odsesali smo supernatant. 3. Spiranje smo ponavljali, dokler ni postal pelet levkocitov bled. 4. Po zadnjem spiranju smo popolnoma odstranili supernatant, dodali 2 ml raztopine za lizo eritrocitov in vsebino temeljito pretresli, da so se levkociti ločili. Dodali smo do 10 ml raztopine za lizo levkocitov (20 mm Tris HCl, 5 mm EDTA, 50 mm NaCl, 0.2% SDS) in 400 µg proteinaze K (Fluka). Zmes smo inkubirali čez noč pri 37 0 C ob zmernem stresanju. 5. Dodali smo 1/3 volumna (3 ml) 9.5 M amonijevega acetata in zmes dobro premešali z vorteksom. Centrifugirali smo pri 2500 obr/min 30 minut. 6. Po prenosu supernatantna v novo epruveto smo z absolutnim etanolom oborili DNA. 7. DNA smo prenesli v 1.5 ml posodico in jo sprali 3-krat s 70% etanolom. 8. Po zadnjem centrifugiranju smo odstranili etanol in posušili DNA na zraku. 9. DNA smo raztopili v 100 µl raztopine TE (10 mm Tris-HCl, 1mM EDTA).

18 METODE Merjenje koncentracije DNA Vsem vzorcem DNA smo izmerili koncentracijo DNA. Merili smo absorbnost vodne raztopine genomske DNA glede na topilo vodo pri 260 nm. Osnova je absorpcija 1 koncentracije DNA 50 ng/µl. S pomočjo znane koncentracije smo pripravili delovne vzorce genomske DNA s povprečno koncentracijo 100 ng/µl Določanje prisotnosti alela hla-b27 v genu za hla-b (modificirano po Molecular typing of hla-b27 alleles) (19) Za določanje polimorfizma HLA-B27 smo uporabili metodo veriţne reakcije s polimerazo (PCR), s pomočjo katere smo pomnoţili fragment v genu HLA-B27. Glede na specifičen vzorec signalov na agaroznem gelu smo določili prisotnost posameznega alela. Pripravili smo naslednjo reakcijsko mešanico za veriţno reakcijo s polimerazo: 1,5 µl 2 mm dntp (2 mm ATP, 2 mm CTP, 2 mm GTP, 2mM TTP) 1,5 µl 10x PCR pufra 2 µl 25 mm MgCl2 0,5 µl 10 µm oligonukleotida E91s (5'-GGG TCT CAC ACC CTC CAG AAT-3') 0,5 µl 10 µm oligonukleotida E135as (5'-CGG CGG TCC AGG AGC T-3') 0,5 µl 1 µm oligonukleotida C825T-F (5'-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC-3') 0,5 µl 1 µm oligonukleotida C825T-R (5'-GCA GCA GCC AGG GCT GGC-3') 3 µl 5M betaina 0,25 µl encima KT (Taq DNA polimeraza) 4,25 µl bidestilirane vode do končnega volumna 14.5 µl in 0,5 µl genomske DNA Vloga naštetih sestavin reakcijske mešanice za veriţno reakcijo s polimerazo je naslednja: v tarčni molekuli DNA (v našem primeru genomska DNA) ţelimo pomnoţiti izbrani fragment.

19 METODE 14 S segrevanjem reakcijske mešanice nad 90 C se obe verigi DNA molekule ločita, ker se prekinejo vodikove vezi korak denaturacije. Z inkubacijo pri optimalni temperaturi se oligonukleotidi veţejo na specifična mesta v tarčni DNA. Sledi inkubacija pri 72 C, da encim podaljša oligonukleotide do končne dolţine fragmenta. Za uspešen potek reakcije morajo biti na voljo prosti nukleozid-trifosfati (dntp), primerno okolje za encim (PCR pufer in Mg). Betain je dodatek, ki izboljša izkoristek reakcije in omogoči sintezo več produkta. Z enim krogom reakcije dobimo iz ene molekule tarčne DNA dve molekuli. Z vsakim naslednjim krogom se število molekul veča eksponentno. Na sliki 2-1 je prikazan princip alelno specifične veriţne reakcije s polimerazo za določanje alela za HLA-B27. Slika 2-1. Prepoznavanju specifičnega zaporedja nukleotidov v genu HLA-B. Veriţna reakcijsa s polimerazo poteče samo v primeru popolnega ujemanja 3' konca oligonukleotida E91s. Temperaturni protokol za PCR za določanje prisotnosti alela HLA-B27: 30 sekund pri 94 C 30 sekund pri 65 C 1 minuto pri 72 C (30 ponovitev).

20 METODE 15 PCR reakcija poteka v grelnih blokih Mastercycler (Eppendorf) in TGradient Professional (Biometra) Agarozna gelska elektroforeza Produkte cepitve smo nanesli na 3% agarozni gel. Tega smo pripravili tako, da smo odtehtali 0,75 g agaroze v prahu in dolili 25 ml raztopine 0,5xTBE (45,5 mm tris, 45,5 mm borova kislina, 1 mm EDTA). Zmes smo zavreli v mikrovalovni pečici, da je nastala bistra raztopina, jo še vročo vlili v kalup za gel in vstavili glavničke za ţepke. Ko se je gel ohladil in strdil, smo ga prenesli v elektroforezno posodo, ga potopili v 0,5xTBE in nanesli vzorce. K vsakemu vzorcu smo, preden smo ga nanesli na gel, dodali 3 µl nanašalnega pufra (1 µl SYBR GREEN I (Fluka), 99 µl dimetill sulfoxid - DMSO (Sigma), 100 µl BFB, 50 µl etilen glikol (Sigma), 50 µl vode, BP (CL SBM)). Elektroforezno posodo smo preko obeh elektrod povezali z napajalnikom električne napetosti. Elektroforezo smo izvajali 15 minut pri 160 V. Zaradi dodatka flourescentnega barvila (SYBR Green) smo rezultate na gelu odčitali s pomočjo UV svetlobe na transiluminatorju. Vsak gel smo potem še fotografirali za dokumentacijo (slika 2-2). Slika 2-2. Agarozna gelska elektroforeza

21 METODE Določanje polimorfizma posameznega nukleotida (snp) rs gena il23r Gen IL 23R kodira receptor za citokin IL 23 na podskupini efektorskih T-celic. Določeni SNP-ji v tem genu so pogosteje prisotni pri bolnikih z različnimi avtoimunimi obolenji, kar kaţe na vpletenost gena IL23R pri nastanku bolezni (6). Med polimorfizme z najmočnješo povezavo sodi rs , zato je zanimiv za analizo Genska tipizacija SNP rs s tehniko PCR Za dokazovanje alelov enobaznega polimorfizma rs smo uporabili alelno specifično veriţno reakcijo s polimerazo (20). Oba alela smo pomnoţevali v ločenih reakcijah, ki so vsebovale alelno specifični začetni oligonukleotid (IL23R-GR ali IL23R-AF) in navaden oligoukleotid (IL23R-GF ali IL23R-AR) (slika 2-3). Slika 2-3. SNP rs in poloţaj začetnih oligonukleotidov. Alelno specifična oligonukleotida se z zadnjo bazo končata na SNP-u in samo v primeru popolnega ujemanja se fragment pomnoţi (R moţni bazi G ali A).

22 METODE 17 Reakcijska mešanica: IL 23 (A ali G) 1,5 µl 2 mm dntp (2 mm ATP, 2 mm CTP, 2 mm GTP, 2mM TTP) 1,5 µl 10x PCR pufra 1,5 µl 25 mm MgCl2 1 µl oligonukleotida IL23R-AF (5'-CCT ACA TCA CCC TCT TTG CAC TA-3') in 1 µl oligonukleotida IL23R-AR (5'-CAG GAA TAA TTG CTG AGA TGC A-3') ali 1 µl oligonukleotida IL23R-GR (5'-TAT GCC AAT TCT TCC ATC TTC C-3') in 1 µl oligonukleotida IL23R-GF (5'-TGG TGT TTG TTT TAT CTT GTA CGC-3') 3 µl raztopine Q (QIAGEN) 0,05 encima Taq DNA polimeraze (Fermentas) 6,05 µl bidestilirane vode do končnega volumna 14.5 µl In 0,5 µl genomske DNA Temperaturni protokol za dokazovanje alelov enobaznega polimorfizma rs je: 30 sekund pri 94 C 30 sekund pri 60 C 1 minuto pri 72 C (30 ponovitev).

23 METODE 18 Produkte pomnoţevanja smo analizirali z agarozno gelsko elektroforezo po postopku opisanem pri določanju prisotnosti alela HLA-B27 (slika 2-4). Slika 2-4. Agarozna gelska elektroforeza IL23R rs Statistična analiza rezultatov Za vsak polimorfizem, ki smo mu določili frekvence genotipov, smo izračunali Hardy- Weinberg ovo ravnoteţje: primerjali smo ugotovljene frekvence polimorfizmov s frekvencami genotipov, ki smo jih izračunali iz frekvenc alelov. Z uporabo Hi kvadrat testa ( 2 ) ali Fisherjevega natančnega testa neodvisnosti smo določali statistično pomembne razlike. Meja statistične pomembnosti je bila pri p < Izračunali smo razmerja obetov z 95% intervalom zaupanja.

24 REZULTATI REZULTATI Preiskovanci Bolniki V raziskavo smo zajeli 108 bolnikov z diagnozo seronegativne spodiloartropatije, pri katerih med diagnostičnim postopkom in kasnejšim spremljanjem poteka bolezni oziroma zdravljenjem ni bil ugotovljen obstoj psoriaze, kronične vnetne črevesne bolezni ali prebolele infekcije. Vsi so HLA-B27 pozitivni. Njihovi splošni podatki in diagnoze so navedeni v tabeli 3-1. Tabela 3-1: Splošni podatki bolnikov s seronegativno spondiloartropatijo. vsi bolniki moški ženske število bolnikov povprečna starost v letih 44,2 45,8 42,5 razpon starosti v letih diagnoza ankilozirajoči spondilitis diagnoza sakroiliitis diagnoza spondiloartropatija druge diagnoze Kontrolna skupina zdravih oseb nosilcev alela za antigen HLA-B27 V splošni slovenski populaciji je pribliţno 10% oseb nosilcev alela za antigen HLA-B27. V raziskavo smo zajeli 198 zdravih nosilcev alela za antigen HLA-B27. Njihovi splošni podatki so podani v tabeli 3-2. Tabela 3-2: Kontrolna skupina zdravih oseb, nosilcev alela HLA-B27. vsi moški ženske število zdravih oseb HLA-B27 poz povprečna starost v letih 48,1 49,5 46,8 razpon starosti v letih

25 REZULTATI Kontrolna skupina zdravih oseb brez alela za antigen HLA-B27 V raziskavo smo zajeli 198 zdravih oseb, ki so brez alela za antigen HLA-B27 in v dosedanjem ţivljenju niso preboleli kakšne revmatološke bolezni ali bili v obravnavi pri revmatologu. V tabeli 3-3 so navedeni njhovi splošni podatki. Tabela 3-3: Kontrolna skupina zdravih oseb brez alela HLA-B27. vsi moški ženske število zdravih oseb HLA-B27 neg povprečna starost v letih 46,1 44,3 48,1 razpon starosti v letih Rezultati genotipizacije polimorfizma rs v genu IL23R S pomočjo alelno specifične veriţne reakcije s polimerazo smo določali prisotnost alelov A in G polimorfizma rs v vseh treh skupinah preiskovancev. V tabeli 3-4 so navedeni podatki genotipizacije pri skupini bolnikov. Posebej so podani podatki za bolnike z diagnozo ankilozirajočega spondilitisa in bolnikov z drugo diagnozo. Nadaljnja delitev preiskovancev in analiza genotipizacije zaradi majhnega števila oseb ni smiselna. Tabela 3-4. Genotipi in frekvence alelov polimorfizma rs pri bolnikih. rs genotip GG(%) GA(%) AA(%) bolniki (n=108) 41 (37,9) 53 (49,1) 14 (13,0) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = 0,2376 (p = 0,888) bolniki z ankilozirajočim spondilitisom 17 (35,4) 25 (52,1) 6 ( 12,5) (n=48) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = 0,4743 (p=0.7889) bolniki z drugimi diagnozami (n=60) 24 (40,0) 28 (46,7) 8 (13,3) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = (p= 0,9994) rs aleli G(%) A(%) bolniki (n=216) 135 (62,5) 81 (37,5) bolniki z ankilozirajočim spondilitiom (n=96) 59 (61,5) 37 (38,5) bolniki z drugimi diagnozami (n=120) 75 (62,5) 45 (37,5)

26 REZULTATI 21 V tabeli 3-5 so prikazani rezultati genotipizacije polimorfizma rs pri zdravih osebah, ki so nosilci alela za antigen HLA-B27. Tabela 3-5. Genotipi in frekvence alelov polimorfizma rs v genu IL23R pri zdravih osebah nosilcih alela za antigen HLA-B27. rs genotip GG(%) GA(%) AA(%) vsi zdravi s HLA-B27 (n=198) 77 (38,9) 94 (47,5) 27 (13,6) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = 0,0397 (p = 0,9803) moški zdravi nosilci HLA-B27 (n=96) 38 (39,6) 45 (46,9) 13 (13,5) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi = 0,0031 (p = 0,9985) ţenske zdrave nosilke HLA-B27 (n=102) 39 (38,3) 49 (48,0) 14 (13,7) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = 0,0502 (p = 0,9752) rs aleli G(%) A(%) vsi zdravi s HLA-B27 (n=396) 248 (62,6) 148 (37,4) moški zdravi nosilci HLA-B27 (n=192) 121 (63,0) 71 (37,0) ţenske zdrave nosilke HLA-B27 (n=204) 127 (62,3) 77 (37,7) V tabeli 3-6 so prikazani rezultati genotipizacije polimorfizma rs pri zdravih osebah brez alela za antigen HLA-B27. Tabela 3-6. Genotipi in frekvence alelov polimorfizma rs v genu IL23R pri zdravih osebah brez alela za antigen HLA-B27. rs genotip GG(%) GA(%) AA(%) vsi zdravi brez HLA-B27 (n=198) 81 (40,8) 91 (46,1) 26 (13,1) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = 0,0030 (p = 0,9985) moški zdravi brez HLA-B27 (n=100) 40 (40,0) 46 (46,0) 14 (14,0) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = 0,0176 (p = 0,9912) ţenske zdrave brez HLA-B27 (n=98) 41 (41,8) 45 (45,9) 12 (12,3) ravnoteţje Hardy-Weinberg Chi square = 0,0041 (p = 0,998) rs aleli G(%) A(%) vsi zdravi s HLA-B27 (n=396) 253 (63,9) 143 (36,1) moški zdravi brez HLA-B27 (n=200) 126 (63,0) 74 (37,0) ţenske zdrave brez HLA-B27 (n=196) 127 (65,8) 69 (35,2)

27 REZULTATI 22 V vseh vzorcih in podskupinah smo ugotovili Hardy-Weinberg- ovo ravnoteţje Analiza vezave Primerjava deleţev genotipov in alelov polimorfizma rs je pokazala, da med obema vzorcema kontrolnih oseb ni razlik med nosilci in tistimi brez alela za antigen HLA- B27 ne glede na spol preiskovane osebe. V tabeli 3-7 so predstavljeni rezultati primerjave razporeditve genotipov. Za izračun so uporabljeni podatki iz tabel 3-5 in 3-6. Tabela 3-7. Primerjava genotipov polimorfizma rs med kontrolnima skupinama. Chi square p vsi zdravi s HLA-B27 / vsi zdravi brez HLA-B27 0,3373 0,8448 zdravi moški s HLA-B27 / zdravi moški brez HLA-B27 0,0301 0,9851 zdrave ţenske s HLA-B27 / zdrave ţenske brez HLA-B27 0,5599 0,7558 zdravi moški s HLA-B27 / zdrave ţenske s HLA-B27 0,0683 0,9664 zdravi moški brez HLA-B27 / zdrave ţenske brez HLA-B27 0,3126 0,8553 zdravi moški s HLA-B27 / zdrave ţenske brez HLA-B27 0,2530 0,8812 zdravi moški brez HLA-B27 / zdrave ţenske s HLA-B27 0,1653 0,9207 Zaradi odsotnosti razlik med obema vzorcema kontrolnih oseb smo za nadaljnjo analizo rezultatov uporabljali zdruţeni vzorec kontrolnih oseb. V tabeli 3-8 so prikazani rezultati primerjave razporeditve genotipov med obema podskupinama bolnikov z diagnozo ankilozirajočega spondilitisa in drugimi diagnozami, kjer prav tako ni statistično pomembnih razlik pri razporeditvi genotipov. Za izračun so uporabljeni podatki iz tabele 3-4.

28 REZULTATI 23 Tabela 3-8. Primerjava genotipov in alelov polimorfizma rs med podskupinama bolnikov z diagnozo ankilozirajočega spondilitisa oz. drugo diagnozo spondiloatropatije. Bolniki z ankilozirajočim spondilitisom / bolniki z drugo Chi square p diagnozo spondiloartropatije Genotipi 0,5730 0,7509 Aleli (G/A) natančni Fisher-jev test 0,887 p Statistična primerjava razporeditve genotipov pri skupini bolnikov s spondiloartropatijo v primerjavi s celotno skupino zdravih kontrol je pokazala, da ni pomembnih razlik. Tudi deleţi alelov polimorfizma rs se niso razlikovali. Rezultat je prikazan v tabeli 3-9. Za izračun so uporabljeni podatki iz table 3-4, 3-5, in 3-6. Tabela 3-9. Primerjava genotipov in alelov polimorfizma rs med skupino bolnikov z diagnozo ankilozirajočega spondilitisa oz. drugo diagnozo spondiloatropatije in celotno skupino kontrolnih preiskovancev. vsi bolniki (n=108) / vsi zdravi (n=396) Chi square p Genotipi 0,2473 0,8837 Aleli (G/A) natančni Fisher-jev test 0,8736 p V tabelah 3-10 in 3-11 so prikazani rezultati izračuna razmerja obetov za dva različna modela delovanja genetskega dejavnika polimorfizma rs pri spondiloartropatijah. V tabeli R10 je podan izračun za avtosomno dominatni učinek alela A (sešteti so genotipi GA+AA), ob predpostavki da za učinek zadostuje zgolj prisotnost alela A. Za izračun so uporabljeni podatki iz tabel 3-4, 3-5 in 3-6.

29 REZULTATI 24 Tabela Razmerja obetov za povezavo polimorfizma rs s seronegativno spondiloartropatijo ob predpostavki avtosomno dominantnega delovanja GG GA+AA OR (95% interval zaupanja) bolniki (n=108) ,9218 (0,5951 1,4278) zdrave kontrole (n=396) V tabeli 3-11 je podan izračun za avtosomno recesivni učinek alela A (sešteti so genotipi GG+GA), ob predpostavki da sta za učinek potrebna oba alela A. Za izračun so uporabljeni podatki iz tabel 3-4, 3-5 in 3-6. Tabela Razmerja obetov za povezavo polimorfizma rs s seronegativno spondiloartropatijo ob predpostavki avtosomno recesivnega delovanja GG+GA AA OR (95% interval zaupanja) bolniki (n=108) ,0375 (0,5517 1,9512) zdrave kontrole (n=396) Obe analizi iz tabel 3-10 in 3-11 ne potrjujeta povezave med polimorfizmom rs in seronegativno spondiloartropatijo.

30 RAZPRAVA RAZPRAVA S študijo smo ţeleli opredeliti vlogo gena za receptor interlevkina 23 (IL23R) pri nastanku in poteku seronegativnih spondiloartropatij, predvsem ankilozirajočega spondilitisa in neopredeljene spondiloartropatije. Predpostavili smo, da se pri bolnikih, ki izpolnjujejo kriterije za postavitev diagnoze seronegativne spondiloartropatije, razmerje genotipov in alelov enobaznega polimorfizma rs v genu IL23R statistično pomembno razlikuje od razporeditve pri zdravih kontrolah. Naša analiza ni odkrila razlik, saj se deleţi posameznih genotipov in alelov tega polimorfizma med bolniki in kontrolno skupino niso razlikovali. Zato naša študija ne potrjuje vloge polimorfizma rs oz. gena IL23R pri seronegativnih spondiloartropatijah. Rezultati predstavljeni v študiji ne kaţejo na statistično pomembno povezavo med polimorfizmom rs gena IL23R in nastankom bolezni seronegativne spondiloartropatije (glej tabele 3-9, 3-10 in 3-11). Zato se ne ujemajo z rezultati drugih študij, ki so identificirale polimorfizem rs gena Il23R kot dejavnik tveganja za nastanek ankilozirajočega spondilitisa (1, 6, 7). Alel A polimorfizma rs velja za dejavnik tveganja za bolezen ankilozirajoči spondilitis (razmerje obetov okoli 1,3, (21, 22)), kar z našo analizo nismo uspeli potrditi (tabela 3-10). Naši rezultati zato odstopajo od do sedaj objavljenih, kar pomeni, da se zasnova naše študije pomembno razlikuje od študij, ki so odkrile povezavo med polimorfizmom rs gena Il23R in ankilotirajočim spondilitisom. V analizo smo lahko zajeli 108 bolnikov, ki so izpolnjevali pogoje za diagnozo seronegativne apondiloartropatije (tabela 3-1). Pri tem je samo 44,4% ali 48 bolnikov izpolnjevalo vse kriterije za diagnozo ankilozirajočega spondilitisa, medtem ko so bili ostali bolniki opredeljeni z diagnozo seronegativne spondiloartropatije, ker niso izpoljnjevali vseh kriterijev za AS. Naš vzorec bolnikov je bistveno manjši kot vzorci bolnikov, ki so uporabljeni v podobnih študijah (23, 24, 25, 26). Majhno število bolnikov z ustrezno diagnozo v naši študiji zato predstavlja glavni razlog za odsotnost povezave med alelom A polimorfizma rs gena IL23R in nastankom bolezni. S povečanjem vzorca bolnikov bi se pribliţali primerljivim študijam (npr. 24), kar bi pomembno vplivalo na vrednotenje pridobljenih rezultatov ne glede nato ali bi potrdili povezavo ali ovrgli postavljeno hipotezo (27,28).

31 RAZPRAVA 26 Razlike v deleţih genotipov oz. alelov, ki so temelj določanja povezav, so lahko tudi posledica napak pri genotipizaciji (29). Prisotnost alelov polimorfizma gena IL23R smo določali s pomočjo metode alelno specifične veriţne reakcije s polimerazo, ki smo jo razvili za potrebe študije (glej Metode). Iz analiz ravnoteţja Hardy-Weinberg je razvidno, da je to ravnoteţje prisotno v vseh vzorcih preiskovancev zajetih v študijo (tabele 3-4, 3-5, 3-6). Pri analizi nismo ugotovili razlik med obema skupinama kontrolnih vzorcev. To je bilo pričakovano, ker sta gena HLA-B in IL23R nepovezana genetska dejavnika in leţita na različnih kromosomih. Tudi frekvence alelov v vseh analiziranih skupinah so primerljive z objavljenimi frekvencami (1, 6). Celoten nabor rezultatov ne vsebuje ničesar, kar bi kazalo na prisotnost morebitne sistemske napake pri izvajanju genotipizacije. Zato je mogoče upravičeno zaključiti, da odsotnost razlik v deleţih genotipov polimorfizma rs gena IL23R med bolniki in kontrolami ni posledica napak pri genotipizaciji. Obstoj ravnoteţja Hardy-Weinberg v vzorcu bolnikov tudi pomeni, da je manj moţnosti za obstoj pomembnih odstopanj deleţev genotipov in alelov analiziranega polimorfizma (30). Ker je ravnoteţje Hardy-Weinberg prisotno v obeh podskupinah bolnikov kot tudi v celotnem vzorcu bolnikov to pomeni, da je povezava polimorfizma rs z AS/neopredeljeno negativno spondiloartropatijo malo verjetna (31). Poudariti velja, da smo z vključitvijo bolnikov, ki niso izpolnjevali vseh kriterijev za AS povečali klinično heterogenost skupine bolnikov. Iz tabele 3-1 je razvidna razlika med dvema podskupinama bolnikov glede na spol. To ni presenetljivo, saj znano, da zaradi AS nekoliko pogosteje zbolevajo moški (2, 32). Kljub temu naša analiza ni odkrila razlik v deleţih genotipov in alelov polimorfizma rs , ki se med obema skupinama statistično pomembno ne razlikujejo (tabela 3-8). Dosedanje analize so vedno obravnavale bolnike z AS, povezava polimorfizma rs in AS pa temelji na izbiri ustreznih bolnikov (22). Za oceno vpliva vključitve bolnikov, ki ne dosegajo vseh kriterijev za AS v analizo, naši rezultati niso primerni zaradi majhnosti vzorca. Ker iz primerljivih študij ni razvidno ali so zajele tudi podobne atipične bolnike, o vlogi polimorfizma rs pri njihovi bolezni ni mogoče soditi. Med bolnike vključene v študijo smo zajeli zgolj tiste brez drugega znanega razloga za bolezen kot je psoriaza ali kronična vnetna črevesna bolezen. To so znani razlogi za nastanek seronegativne spondiloartropatije za katere je opisana tudi povezava z genom Il23R (33,34). Takšen način izbora za študijo je lahko prispeval k temu da nismo ugotovili povezave med polimorfizmom rs gena IL23R in nastankom bolezni. Izbor bolnikov in upoštevanje dodatnih dejavnikov ima pomemben vpliv na moč povezave (21). Zato je mogoče predvideti, da bi analiza ob vključitvi bolnikov z drugimi oblikami seronegativne

32 RAZPRAVA 27 spondiloartropatije lahko odkrila morebitno povezavo med polimorfizom rs gena IL23R in nastankom bolezni. Izbor polimorfizma rs za analizo je temeljil na dejstvu, da gre za variabilnost gena IL23R, ki ima zelo značilno povezavo z nastankom AS (21). Ta povezava je tipična predvsem za narode kavkaškega (belskega) izvora (35), med katere sodimo tudi Slovenci. Zato glede na ugotovljene frekvence alelov polimorfizma (tabele 3-4 do 3-5) ne gre iskati razlage za odsotnost povezave med polimorfizmom rs in seronegativne spondiloartropatije v genetskih posebnosti naše splošne populacije. V genu IL23R so opisani drugi polimorfizmi, ki so povezani s tveganjem za nastanek bolezni kot tudi z zaščito pred njo (21, 36). Vendar je zelo vprašljivo ali bi z analizo našega maloštevilnega vzorca bolnikov uspeli ugotoviti kakšno statistično pomembno povezavo med kakšno drugo izbrano genetsko variabilnostjo in nastankom bolezni. Klinična sorodnost seronegativnih spondiloartropatij se lahko pojasni z identifikacijo signalnih poti, ki vsebujejo iste molekularne elemente. Mednje vsekakor sodijo tiste, ki vključujejo IL23R. Odkrivanje genetskih variabilnosti, ki povezujejo IL23R in specifične klinična stanja, je zato le prvi korak do razumevanja molekularnih mehanizmov, ki so podlaga teh bolezni. Končni cilj raziskav je ugotavljanje funkcionalnih posledic genetskih variabilnosti in razvoj novih terapevtskih moţnosti ne samo za ankilozirajoči spondilitis, temveč tudi za druge bolezni iz skupine, ki povzročajo seronegativne spondiloartropatije. Zaključimo lahko, da z našo študijo nismo ugotovili statistično pomembnih razlik v deleţih genotipov in frekvencah alelov polimorfizma rs gena IL23R pri skupini bolnikov z AS/neopredeljeno seronegativno spondiloartropatijo v primerjavi z zdravimi kontrolami. Zato postavljene hipoteze nismo potrdili in nismo ugotovili povezave med genom Il23R in slovenskimi bolniki s seronegativnimi spondiloartropatijami.

33 LITERATURA 28 LITERATURA 1. Rahman P, Inman RD, Gladman DD, Reeve JP, Peddle L, Maksymowych WP. Association of interleukin-23 receptor variants with ankylosing spondylitis. Arthritis and rheumatism. April 2008; 58: Kocjančič A, Mrevlje F, Štajer D. Interna medicina. Tretja izdaja. Ljubljana; 2005: Brent LH, Diamond SH. Ankylosing spondylitis and undifferentiated spondyloarthropathy. Prebrano na: URL: 4. Brown MA. Progress in spondylarthritis. Progress in studies of the genetics of ankylosing spondylitis. Arthritis Research and Therapy 2009; 11: Duer RH, Taylor KD, Brant SR, et al. A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene. Science 2006; 314: WTCCC TASC. A genome-wide scan of 14,000 non-synonymous coding SNPs in 5,500 individuals. The Welcome trust case control consortium. Nat Genet 2007; Australo-Anglo-American spondyloarthritis Consortium (TASC), Genome-wide association study of ankylosing spondylitis identifies non-mhc susceptibility loci. Nat Genet. 2010; 42: Yu DT, Sieper J. Clinical manifestations of ankylosing spondylitis in adults. Prebrano na: URL: 9. Yu DT, Sieper J. Pathogenesis of spondyloarthritis. Prebrano na: URL: spondyloarthritis?source=search_result&selectedtitle=1~ Yu DT, Sieper J. Clinical manifestations, diagnosis, and management of undifferentiated spondyloarthritis and related spondyloarthritides. Prebrano na: URL: +in+classification&selectedtitle=1~ Temekonidis TI, Alamanos Y, Nikas SN, Bougias DV, Georgiadis AN Voulgari PV. Infliximab therapy in patients with ankylosing spondylitis: an open label 12 month study. Ann Rheum Dis 2003; 62: Brown MA, Thomas GP. Genetics and genomics of ankylosing spondylitis. Imunological reviews 2010; 233:

34 LITERATURA Brown MA. Breaktroughts in genetic studies of ankylosing spondylitis. Rheumatology 2008; 47: Helper T cells. Prebrano na: URL: com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/t/th1_th2.html+th17+t+cell+subse&cd=2 &hl=sl&ct=clnk&gl=si&source= 15. Stockinger B, Veldhoen M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology 2007; 19: Matsui M. Roles of the novel interleukin-12-associated cytokine, interleukin-23, in the regulation of T-cell-mediated immunity. Hepatol Res 2007; 37: S Steinman L. A brief history of T(H)17, the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage. Nat Med 2007; 13: Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 16: Dominguez O, Coto E, Martinez-Naves E, Choo SY, López-Larrea C. Molecular typing of HLA-B27 alleles. Immunogenetics 1992; 36: Ye S, Dhillon S, Ke X, Collins AR, Day IN. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 2001; 29: E Karaderi T, Harvey D, Farrar C, Appleton LH, Stone MA, Sturrock RD. Association between the interleukin 23 receptor and ankylosing spondylitis is confirmed by a new UK case control study and meta-analysis of published series. Rheumatology 2009; 48: Duan Z, Pan F, Zeng Z, Zhang T, Wang S, Li G, et al. Interleukin-23 receptor genetic polymorphisms and ankylosing spondylitis susceptibility: a meta-analysis. Rheumatol Int 2011; [Epub ahead of print] 23. Rueda B, Orozco G, Raya E, Renandez-Sueiro JL, Mulero J, Blanco FJ, et al. The IL23R Arg381Gln non-synonymous polymorphism confers susceptibility to ankylosing spondylitis. Ann Rheum Di 2008; 67: Pimentel-Santos FM, Ligeiro D, Matos M, Mourão AF, Sousa E, Pinto P, et al. Association of IL23R and ERAP1 genes with ankylosing spondylitis in a Portuguese population. Clin Exp Rheumatol 2009; 27: Burton PR,Calyton DG, Cardon LR, et al. Association scan of 14,500 nonsynonymous SNPs in four diseases identifies autoimmunity variants. Nat Genet 2007; 39: