Cross-Mediterranean Environment and Health Network (CROME) LIFE12 ENV/GR/ Tehnično poročilo

Transcription

1 Cross-Mediterranean Environment and Health Network Okoljsko zdravstvena mreža na Mediteranu CROME-LIFE Poročilo: B6.1 Priporočila za odločevalce LIFE ENVIRONMENT PROGRAMME Aktivnost: B.6 Naloga: 6.1 Datum poročanja: 31/12/

2 Bibliografski podatki Cross-Mediterranean Environment and Projekt: Okoljsko zdravstvena mreža na Mediteranu (Cross- Mediterranean Environment and Health Network CROME-LIFE) Dokument: Priporočila za odločevalce Program LIFE ENVIRONMENT Št. pogodbe. Trajanje pogodbe: 01/07/ /12/2016 AKTIVNOST: B.6 Priprava priporočil Naloga: 6.1 Priprava priporočil Partner zadolžen za urejanje: ISS Drugi partnerji: AUTH, CSIC, JSI Datum poročanja: 31/12/2016 Št. strani: 34 (vključuje slike, tabele, priloge, reference) Ključne besede: priporočila za odločevalce, vrzeli v podatkih, interpretacija podatkov, humani biomonitoring Kontaktna oseba partnerja za urejanje in drugi avtorji Ime: Dr. Gemma Calamandrei Ime: Telefon: Telefon: Fax: Fax: gemma.calamandrei@iss.it CROME-LIFE web site: 2

3 Kazalo Povzetek 4 Opis uporabljenih protokolov in ugotovljenih težav pri izvajanju nacionalnih študij 4 Grčija 4 Italija 6 Slovenija 10 Španija 12 Obstoječi podatki in vrzeli v podatkih 15 Grčija 15 Italija 17 Slovenija 18 Španija 20 Analiza rezultatov in priporočila za odločevalce 22 Specifična priporočila po državah 22 Splošna metodološka priporočila 27 Priporočila glede optimalne uporabe podatkov, ki so na voljo 27 Priporočila glede pridobivanja dodatnih podatkov za zapolnitev vrzeli v podatkih 28 Zaključki 30 Povzetek specifičnih in metodoloških priporočil 30 Reference 31 3

4 Povzetek Cross-Mediterranean Environment and Cilj tega poročila je priprava smernic glede ponovno uporabo metodologije razvite v projektu CROME-LIFE v več demonstracijskih primerih v državah, ki so sodelovale v projektu. Vključuje priporočila za zbiranje vzorcev iz okolje in humani biomonitoring, obdelavo podatkov, statistično analizo, lahko služi kot referenčni dokument in kot preliminarna priporočila pri odločanju politike ukrepov na evropski, nacionalni in regionalni ravni. Razvite smernice bodo pripomogle k že vzpostavljenemu tesnemu sodelovanju s skupinami COPHES in DEMOCOPHES. Poročilo je sestavljeno iz treh glavnih delov: prvi vsebuje pregled protokolov, ki se uporabljajo skupaj z glavnimi težavami pri izvajanju posameznih študij v projektu, drugi del povzema razpoložljive podatke in glavne vrzeli v podatkih. Tretji del pa na podlagi teh dveh poglavij povzema ključne ugotovitve in rezultate, ki izhajajo iz uporabe razvite metodologije, in predlaga priporočila za ukrepanje na evropski nacionalni in regionalni ravni. Predlagana priporočila vključujejo predloge glede optimalne uporabe razpoložljivih podatkov, glede meritev, ki naj se izvedejo za odpravo vrzeli v podatkih, in glede uporabe statističnih metod za optimalno interpretacijo podatkov okoljskega in humanega biomonitoringa. Opis uporabljenih protokolov in ugotovljenih težav pri izvajanju nacionalnih študij Grčija Oinofoita Cr(VI) Vključili smo 50 posameznikov stratificiranih po starosti (od 4 do 65 let), da bi ocenili sedanjo, pa tudi preteklo in kumulativne izpostavljenosti kromu (Cr). V ta namen smo vzorčili urin in lase. Izbrana populacija je pokrivala širše območje porečja Asopos, ki odraža variabilnost v izpostavljenosti Cr, opaženo v okoljskih monitoringih. Vzorci las so bili zbrani iz zadnjega dela glave. Postrigli smo jih s škarjami iz nerjavečega jekla iz dela glave nad vratom. Vzorce las smo narezali na približno 0,5 cm velike koščke, homogenizirali, da smo dobili reprezentativen vzorec las. Analitska metoda je temeljila na opisu Afridi s sod (2006), ki so vzeli biološke vzorce 56 delavcem, ki so bili dolgotrajno izpostavljeni v jeklarski industriji (PW), 35 delavcev za nadzor kakovosti (QCW) in 75 neizpostavljenih normalnih kontrol (vsi moški, starostni razred let). Delovna raztopina Cr je bila pripravljena iz certificiranih standardnih raztopin vseh analiziranih snovi v 2M dušikovi kislini. Vse raztopine so bile shranjene pri 4 C. Vsi vzorci las so najprej oprani v mešanici dietileter- aceton (3 + 1), nato z raztopino detergenta in nazadnje z ultra čisto vodo. Po pranju se vzorci las sušijo 6 ur pri 80 C. Vzorce las vsakega udeleženca smo shranili v ločene plastične ovojnice, na katerih je bila navedena identifikacijska številka udeleženca. 0,5 ml certificiranega vzorca urina v duplikatu ali 0,2 g vzorca človeških las BCR 397 smo dali v 50 ml Pyrex bučke. V vsako bučko smo dodali 5 ml sveže pripravljene mešanice koncentrirane HNO3 in H2O2 (2:1, v/v), raztopine segrevamo na električni grelni plošči pri 80 C 2-3 ure oz. dokler ne dobimo prozorne raztopine. Končno raztopino smo dobili z razredčitvijo z 2M HNO3 do 10 ml v polietilenskih bučkah za določanje Cr z ETAAS. Slepi vzorci so bili narejeni na enak način kot je opisano zgoraj, ravno tako realni vzorci QCW, PW in normalne kontrole v duplikatih. Kalibracijo smo redno preverjali z analizo standarda na vsakih 10 vzorcev. Postopek razkroja s pomočjo mikrovalovne pečice je bil uveden, da bi skrajšali čas razkroja. Za razkroj smo stehtali 200 mg posušenega vzorca las v duplikatu ali tri paralelke vzorca CRM 397 neposredno v teflonske posode za razkroj, dodali 2 ml HNO3 in 1 ml 30% H2O2 in pustili, da stojijo 10 min, nato so posode zaprli in postavili v PTFE reaktor. V mikrovalovni pečici je potekal razkroj po enostopenjskem programu za razkroj (250 W, 15 min za vzorce las). Po 20 minut hlajenju teflonskih posod v ledeni kopeli, posodice odpremo, nastalo raztopino uparimo skoraj do suhega, da odstranimo presežek kisline in nato razredčimo do 10 ml v merilnih bučkah z 2M HNO3. Slepi vzorci (samo reagenti) so pripravljeni za obe metodi. Koncentracije smo dobili neposredno iz kalibracijskih grafov po korekciji absorbance signala ustreznega slepega vzorca. 4

5 Metoda identifikacije Cr v vzorcih urina je temeljila na metodi, ki jo je predlagal Scheepers et al. (2008). Vzorci trenutnega urina so bili shranjeni pri 4 C v temi in prenešeni v laboratorij za nadaljnje skladiščenje pri -18 C. Analiza Cr se izvede v skladu z Lewalter, Korallus et al. (1985). Urin smo razredčili z raztopino magnezijevega nitrata s Tritonom-X in žveplovo kislino (matrični modifikator). Vrednosti Cr so bile določene pri 357,9 nm z uporabo elektrotermične atomske absorpcijske spektrometrije, AAS (Solaar M, Thermo Analytical) z Zeeman korekcijo ozadja. LOQ je bila 0,05 μg/l urina in koeficient variacije 5,4% pri 0,31 μg/l. Aspropyrogos PCDD/PCDF Vzorce krvi smo zbrali pri 60 osebah, starih od 6 do 58 let, ki živijo v neposredni bližini obrata za recikliranje. Od vsakega posameznika je bilo zbranih približno ml krvi. Vzorce krvi smo zbrali v polietilenskih zbiralnike. Takoj po vzorčenju so bili vzorci krvi obdelani tako, da so separirali serum, po ločitvi so vzorce seruma takoj zamrznili in prepeljani v laboratorij za merjenje PCDD / PCDF. Serumi so ostali zamrznjeni pri temperaturi -80 C dokler jih niso analizirali. Vsa uporabljena topila za analizo so bila pikograde in so bila kupljena pri Promochemu (Nemčija). Izomere za pripravo 13C12 internih standardnih raztopin so bile kupljene pri Wellington Laboratories (Kanada). Carbosphere mesh je bila kupljena pri Alltech in prečiščena z eluiranjem z metanolom in nato s toluenom pred uporabo. Alumina je bila Basic activity Super 1 za analizo dioksinov, MP Biochemicals GmbH. Silikagel impregniran z žveplovo kislino, smo pripravili tako, da smo Silikagel (100 g, mesh, Merck) aktivirali v peči pri 200 C vsaj 2 dni in nato pomešali s koncentrirano žveplovo kislino (44 ml). V vzorcih krvnega seruma smo najprej izvedli ekstrakcijo tekoče-tekoče z mešanico natrijevega oksalata in metanola, ki mu je sledila ekstrakcija s kombinacijo dietiletra-petrolej etra. Organski sloj smo uparili in lipidni ostanek osušili in stehtali, da smo izračunali delež lipidov v serumu in materinem mleku. Vsakemu vzorcu smo pred ekstrakcijo dodali označene standard za kvantifikacije. To so bile toluenske raztopine, ki vsebujejo mešanico izomerov 13 C12 vseh 17 PCDD-jev / PCDF-jev kongenerov, razen OCDF. Kvantifikacijo PCDD / PCDF smo naredili z HRGC-HRMS (EI) v načinu MID na plinskem kromatografu Trace GC (ThermoFinnigan), ki je bil priključen na masni spektrometer MAT-95 XP (ThermoFinnigan) z ločljivostjo (10% definicija doline) in opremljen z avtomatskim vzorčevalnikom CTC A 200S. Instrumentalni pogoji in merila za nadzor čistosti so bili v skladu z metodami EPA 1613B in EPA 1668A. Kvantitativno določanje koncentracije in izkoristka smo izvedli z metodo izotopskega redčenja. Meja detekcije (LOD) za vsak kongener je bila določena kot koncentracija v ekstraktu, ki je povzročila odziv instrumenta za dva različna iona, kjer je bilo razmerje signal/ šum 3:1 za manj občutljiv signal. Za izračune TEQ so bili uporabljeni toxicity equivalent factors WHO-98 (TEF) (Van den Berg et al., 1994). Solun PM-PAH Okoljski podatki Glede na to, da obstaja veliko podatkov o povprečni dnevni izpostavljenosti PM in PAH na območju Soluna, je še posebej zanimivo spremljati dnevno variabilnost PM v zunanjem zraku in zraku v zaprtih prostorih ter s povezanimi dejavnostmi. To nam bo omogočilo nadaljnje izboljšanje ocene izpostavljenosti za različne skupine in sčasoma narediti ocene tveganja za nastanek pljučnega raka v povezavi z izpostavljenostjo PAH. Zato smo dvakrat v hladnejšem obdobju leta, in , kontinuirano spremljali PM z izvajanjem časovno dinamičnih meritev z uporabo aerosolnega spektrometra Mini Laser (Mini-LAS) vzporedno z obstoječo opremo za gravimetrično vzorčenje PM in kemijsko analizo. Za meritve na prostem so bili vzorčevalniki za PM10 in PM2.5 nameščeni na višini 3,5 m nad tlemi in sicer na mestu, ki se nahaja na zelo prometnem delu in drugi v delu mesta, ki služi kot ozadje. Prometno območje vključuje območje z več ulicami s tipičnimi mestnimi cestami z zelo veliko prometa, območje ozadja pa se nahaja v mestnem okolju brez neposrednih emisij iz prometa. Meritve so trajale 2,5 meseca in zajemajo prehod iz toplega v hladno obdobje (povprečne dnevne temperature med 23 in 4 C). Paralelne meritve kakovosti zraka v zaprtih prostorih (za PM10 in PM2.5) so bile opravljene v 30 hišah, ki so ali blizu prometu ali pa služijo kot mestno ozadje, da bi s tem potrdili INTERA ocene. Da bi ugotovili prispevek gorenja biomase na kakovost zraka v zaprtih prostorih, so bile izvedene ciljane meritve za ugotavljanje učinka delovanja odprtih kaminov na koncentracije PM in sicer na izbranih lokacijah v zaprtih 5

6 prostorih in pod nadzorovanimi pogoji hitrosti menjave zraka (AER). Natančnejše, v stanovanju s 140 m2 v tretjem nadstropju, so bile izvedene obsežne meritve PM10 in PM2.5, medtem ko je bil za merjenje časovnih sprememb v številu PM in masnih koncentracijah uporabljen števec delcev. Meteorološki podatki potrebni za študijo so bili pridobljeni iz lokalne meteorološke postaje. Vzorci za določitev PM2.5 in PM10 so bili zbrani z uporabo 6 pretočnih vzorčevalnikov zraka (ENCO PM, TCR TECORA, Italija). Vzorčevalniki so imeli vzorčevalne glave, ki ustrezajo EN (PM10) in EN (PM2.5), in so delovali s pretokom 38 L/min, s časom zbiranja 24 ur/vzorec. Vzorce smo zbrali na filtrih s PTFE membrano s PMP nosilnim obročem (PALL Life Sciences, Ø 47 mm, velikost por 2 μm, ZDA). Teflonske filtre smo gravimetrično analizirali z uporabo elektronske mikrotehtnice z občutljivostjo ±1 μg po 24-urnem uravnavanju pri temperaturi med 20 C in 23 C ter relativni vlažnosti (RH) med 30 in 40% in tako določili masno koncentracijo delcev. Vsak filter smo stehtali vsaj trikrat pred in po vzorčenju, neto maso pa smo dobili, tako da smo povprečje mas pred vzorčenjem odšteli od povprečja mas po vzorčenju. Razlike med ponovitvami so bile <5 μg za prazne filtra in vzorce. Pred začetkom kampanje vzorčenja smo kalibrirali pretok skozi PM2.5 in PM10 vzorčevalnike. Zbirali smo tudi terenske slepe vzorce filtrov in jih uporabili za korekcijo koncentracij ozadja in vplivov zaradi rokovanja s filtri in transporta. Uporabili smo enake vzorčevalnike PM10 in PM2.5, 24 h vzorčenje v 30 zaprtih prostorih, z delovanjem kamina in brez njega. Poleg tega smo delce spremljali s prenosnim števcem delcev (Lasair II, Model 525, Sistem za merjenje delcev). Vgrajena črpalka črpa aerosol s pretokom 0,01425 m 3 /min skozi instrument. Nastale kapljice štejemo z laserjem z diodo, 780nm. Lasair II omogoča merjenje koncentracije števila delcev v velikostnih razredih 0,5-0,7μm, 0,7-1,0μm, 1,0-5,0μm, 5,0-10,0μm, 10-25μm in PM nad 25,0 μm. Lasair II je bil uporabljen pri meritvah v zaprtih prostorih z delujočim in nedelujočim kaminom. Koncentracije števila delcev smo pretvorili v masno koncentracijo z uporabo naslednje formule: PNC d Dmedian C = 3 ( g/ m ) 6 3 PNC je koncentracija števila delcev pri določenem območju premera delcev, p je gostota delcev, ki ustreza 1 g/cm3, Dmedian je srednji premer izbranega razreda delcev. Italija CROME Trst Kovine in rezultati nevropsiholoških testiranj pri otrocih starih 7 let V okviru skupne študije CROME je skupina ISS v sodelovanju s pediatrično bolnišnico Burlo Garofolo v Trstu vključila študijo na otrocih (N=200) starih 7 let, ki so bili vključeni v predhodno študijo NAC II PHIME, ki se je začela v regiji Friuli Venezia Giulia v Italiji leta Za to študijo so na voljo podatki o perinatalni izpostavljenosti kovinam in polkovinam, življenjskemu slogu in zdravju matere, socio-ekonomskih dejavnikih in rezultati nevropsiholoških testiranj pri 18 in 40 mesecih. V starosti sedmih let so bili zbrani otrokovi lasje in urin ter vzorec sline mame in otroka (Oragene DNA self-collection kit). Matere so izpolnile vprašalnik za posodobitev informacij o življenjskem slogu. Otroci so opravili nevropsihološko testiranje, ki so ga vodili usposobljeni nevropsihologi. Uporabljeni nevropsihološki testi so vključevali Wisc-IV (Wechslerjev inteligenčni test za otroke), Nepsy-II za ocenjevanje senzomotorike, pozornosti, učne sposobnosti, MT za ocenjevanje bralnih spretnosti, BVSCO2 za popolno oceno pisnih spretnosti, CBCL za prepoznavanje vedenjskih in čustvenih težav pri otrocih. Podrobneje, matere (N=201), so izpolnile vprašalnike za pridobitev informacij o prehrambnih navadah otroka in družine, socio-ekonomskih razmerah, življenjskem slogu, poklicni/ bivanjski izpostavljenosti in uživanju rib. Matere so testirali s PSI testom (Parental Stress Index), da bi ocenili povezave psihološkega stanja mame z drugimi okoljskimi dejavniki. PSI je bil posebej zasnovan za zgodnje prepoznavanje tistih lastnosti, ki lahko vplivajo na normalni razvoj in delovanje otroka, in omogoča identifikacijo otrok s čustvenimi 6

7 in vedenjskimi motnjami ter staršev, ki imajo lahko težave pri svoji starševski vlogi (Guarino, Blasio et al., 2008). Vsak otrok je opravil nevropsihološko testiranje, ki so ga izvajali nevropsihologi v prostorih Pediatrične bolnice Burlo Garofolo v Trstu. Ocenjevanje je trajalo približno štiri ure za vsakega otroka in je vključevalo naslednje teste: A. Wisc-IV (Wechsler Intelligence Scale for Children) daje IQ oceno, ki predstavlja otrokovo splošno kognitivno sposobnost. B. Nepsy-II je specifičen za ocenjevanje senzomotorike, pozornosti, učnih zmožnosti C. MT za ocenjevanje bralnih spretnosti D. BVSCO2 za celovito oceno spretnosti pisanja E. CBCL - Child Behaviour Check List - ugotavlja vedenjske in čustvene težave pri otrocih (primanjkljaj pozornosti, hiperaktivna motnja, opozicijska deviantna motnja, motnje vedenja, depresijo v otroštvu, anksioznost pri ločitvi, otroške fobije itd.). Negotovost pri tej študiji je bila v pomanjkanju določitev arzenovih zvrsti in ne samo celotnega As z validirano analitsko metodo. Da bi zapolnili to vrzel, smo uporabili speciacijsko analizo z uporabo ionske kromatografije povezane z ICP-MS za določitev šestih različnih As vrst pri 200 otrocih. Rezultati so pokazali, da relativno visoka koncentracija organskega As (predvsem AsBet) odraža glavni vir izpostavljenosti pri otrocih, ki je uživanje morske hrane. Zato visoke koncentracije skupnega As (ki vključuje tudi organski As) ne pomenijo nujno povišane izpostavljenosti anorganskemu As, ki predstavlja škodljivo obliko. Dodaten vir negotovosti študije so vedenjski in prehranski podatki, ki temeljijo na vprašalnikih. Negotovosti, ki izhajajo iz podatkov o zunanji izpostavljenosti, omogočajo le približne ocene vzorcev izpostavljenosti, vendar so kljub temu pomemben pokazatelj za nadaljnje preiskave. Treba je opozoriti še na omejitev, ki velja za celotno študijo CROME, to je nereprezentativnost pri nadaljnjem vključevanju v študijo. Znano je, da je osip pri študijah povezan z izidi testiranj in z izpostavljenostjo. Za družine z nižjim socialno-ekonomskim položajem je bolj verjetno, da bodo izstopile iz longitudinalne študije. Tako je naš vzorec reprezentativen samo za bolj izobražene in zdrave družine, kar vpliva na oceno količine okoljskih stresorjev, ki so jim otroci izpostavljeni. Kemijske analize Kemijske analize bioloških vzorcev zbranih po nevropsihološki oceni, so vključevale meritve koncentracije petih kovin, znanih po nevrotoksičnosti (živo srebro, svinec, mangan, kadmij, arzen) v laseh ali urinu. Lasje: Mangan (Mn) in živo srebro (Hg) smo določili v 200 vzorcih las, zbranih v plastičnih vrečah in shranjenih v sušilniku do analiz. Pred analizo smo dali vzorce las v steklene čaše, ki smo jih predhodno očistili s HNO3. Lase smo oprali po naslednjem postopku: (i) trije cikli izpiranja z mešanico etil etra-acetona(sigma-aldrich, St.Louis, MS, USA) v razmerju 3:1 (v/v) ob stalnem mešanju (30 minut), da odstranimo z las lojni film; po vsakem ciklu smo vzorce las sprali z deionizirano vodo (EASY-pure UV, PBI, Milano, Italija) ob stalnem mešanju; (ii) pranje las z 5% natrijevo soljo etilendiamintetraocetne kisline (EDTA) (Sigma-Aldrich, ZDA), 1 uro ob mešanju, da odstranimo kemijske elemente, prisotne na površini las in (iii) ponovljeno izpiranje z deionizirano vodo (EASY-pure UV, PBI, Milano, Italija). Po sušenju v peči, 16 h pri 85 C, smo nato odtehtali približno 0,25 g vsakega vzorca las. Sledil je razkroj na ModBlock plošči (ModBlock CPI International, Santa Rosa, CA, ZDA) s 4 ml HNO3 pri C, približno pol ure pred koncem smo dodali 1 ml H2O2. Kvantitativno določitev Mn in Hg smo naredili z masno spektrometrijo z induktivno sklopljeno plazmo (icap Qs ICP-MS, Thermo-Fisher, Bremen, Nemčija). Konfiguracija instrumenta in parametri delovanja so prikazani v tabeli 1. ICP-MS uporabljen v tej študiji je opremljen s PFI ST MicroFlow razpršilcem (ESI, Omaha, NB, USA), kvarčno razpršilno komoro (hlajeno na 3 C), injektorjem (sapphire) z ID 2,0 mm, plamenico iz kvarca in Ni stožci. Tabla 1. Parametri delovanja instrumenta RF moč 1550 w 7

8 Pretok Ar (L/min) Plazma 14, dodatni 0.8, razpršilec 1.08 Reakcijski plin KED pregrada Analitski parametri Analizirane mase Interni standard He 4.2 ml/min 2 V Dwell time 80 ms/ peak, 50 sweeps, 3 ponovitve 55Mn, 202Hg 115In Urin: Vzorci urina (ca.100 ml) so se zbirali v polietilenskih posodah, do analiz so shranjeni pri temperaturi -20 C. Lončki so bili predhodno očiščeni z razredčeno (10% v/v) ultra čisto HNO3 (Normatom, Leuven, Belgija) in sprani z deionizirano vodo (Barnstead EASY-Pure II, Dubuque, IA, ZDA). Urin je bil analiziran z metodo razvito v laboratoriju, ki jo je predhodno akreditiral italijanski akreditacijski organ (ACCREDIA). Vzorce urina smo razredčili v razmerju 1: 5 (v/v) z deionizirano vodo z visoko čistosti. Kovine smo določali s sektorskim masnim spektrometrometrom z induktivno sklopljeno plazmo (SF-ICP-MS, Element 2, Thermo Fischer, Bremen, Nemčija), ki delujejo pri nizki ločljivosti (LR, m / m = 300) za kovine brez interferenc: 114Cd, 202Hg, 208Pb; pri načinu srednje ločljivosti (MR, m / m = 4000) za kovin z interferencami: 55Mn; in pri visoki ločljivosti (HR, m / m = 10000) za kovine z zelo veliko interferencami: 75As in 82Se. Instrument je bil opremljen z Ni stožci, Meinhardovim razpršilcem, hlajeno razpršilno komoro (Scott-type) in napravo za zaščitno elektrod. Kalibracija s standardi v matrici vzorca in uporaba internih standardov (115In 69Ga s konc. 1 ng/ml v merjenih raztopinah) zagotavljajo zadovoljivo kompenzacijo morebitnih preostalih matričnih učinkov in zmanjšanje instrumentalne spremembe signala med merjenjem. Za testiranje natančnosti analitskega postopka smo uporabili dva certificirana referenčna materiala liofiliziranega urina: Seronorm (Sero AS, Billingstadt, Norveška) in ClinCheck (Recipe, München, Nemčija). Statistika Zanimala nas je izpostavljenost otrok starih 7 let kovinam, zato smo merili koncentracije kovin v krvi (Hg, Mn, Pb, Cd, As) in laseh (Hg, Mn). Ker je bilo v prvotni študiji PHIME pokazano, da je uživanje rib med nosečnostjo glavni vir izpostavljenosti Hg, smo s podrobnim vprašalnikom (138 vprašanj), med drugim tudi o uživanju rib, želeli oceniti izpostavljenost otroka. FFQ so matere izpolnile kmalu po rojstvu otroka. V vprašalnik je bilo vključenih 7 kvantitativnih vprašanj o ribah, ki so obravnavala pogostost uživanja 150 gramske porcije rib, rakov in mehkužcev (pripravljenih po različnih receptih) in rib v olju. Frekvenčna porazdelitev teh spremenljivk je bila opisana z uporabo števila oseb in odstotkov oseb v vsaki kategoriji. Za vsako vrsto rib je bila narejena pretvorba iz kategorij uživanja v zvezno skalo ribjih obrokov in sicer smo vsaki kategoriji dodelili porabe rib, ki je enako srednji vrednosti za to kategorijo (npr. 2-4 krat/ teden v 3-krat/ teden). Celoten vnos rib je bil izračunan tako, da smo sešteli tedenski vnos vseh vrst rib. Porazdelitve vnosa rib in koncentracije kovin so bile predstavljene z aritmetičnimi sredinami in SD, kvartili in območjem min-max. Izračunali smo tudi geometrijsko sredino za koncentracijo Hg. Normalnost distribucije smo preverili s testom Shapiro-Wilk. Koncentracija MeHg v bioloških vzorcih je bila določena samo pri podskupini oseb, naredili smo primerjavo vrednosti za MeHg z vrednostmi za THg za osebe v podskupini. Pri nevroloških testiranjih so nas zanimali kompozitni rezultati kognitivnih, socialno-čustvenih in prilagoditvenih sposobnosti. Porazdelitve rezultatov nevropsiholoških testiranj so predstavljale z aritmetično sredino in SD, kvartili in območjem min-max. Razlike med skupinami smo testirali z Wilcoxon rank sum testom (za zvezne spremenljivke) in χ2 test (za števne spremenljivke). S pomočjo linearne regresijske analize smo testirali povezave med koncentracijami kovin in posameznimi rezultati nevropsiholoških testov. Za oceno povezave med Hg in nevrološkim razvojem smo uporabili multivariatno linearno regresijo ob upoštevanju morebitnih konfounderjev. Naslednje spremenljivke lahko vplivajo na nevrološki razvoj otroka in so bile zato upoštevane pri analizi: uživanje svežih, zamrznjenih in konzerviranih rib otroka in matere v času nosečnosti, otrokov spol, rojstna masa, gestacijska starost, IQ matere, starost matere ob porodu, BMI pred nosečnostjo, povečanje telesne mase, zakonski status ob porodu, socio-ekonomski status (SES, izračunano 8

9 po Bennett et al(28)), velikost bivališča, število odraslih in otrok, ki živijo v stanovanju, kajenje in vnos alkohola med nosečnostjo. Model so vključevali tudi koncentracije Cu, Zn in Se v popkovni krvi. Ker so bili podatki večinoma pridobljeni iz vprašalnikov, ki pa so lahko nepopolno izpolnjeni, smo v izogib izgubi statistične moči v multivariatnih analizah zaradi manjkajočih vrednosti naredili naključno pripisovanje vrednosti za nekatere spremenljivke. Med kovariantami, ki so lahko potencialni konfounderji, so bile v končne modele vključene le tiste, ki so povezane z vsaj enim nevropsihološkim rezultatom (P <0,10). Uporabili smo analize, ki smo jih stratificirali glede na otrokov spol, da bi ocenili, ali se je učinek Hg na nevrološki razvoj razlikoval pri dečkih in deklicah. Podatke smo analizirali s Pearsonovimi korelacijami ter z multiplo regresijsko analizo z uporabo programske opreme SPSS. Regija Lazio Kovine pri mladostnikih V okviru projekta PROBE (PROgramme for Biomonitoring of the Exposure) se je v letu 2008 začela kampanja biomonitoringa prebivalcev Italije z namenom določanja kovin v krvi. Posebna raziskava je bila namenjena mladostnikom in je potekala v sodelovanju z Nacionalnim združenjem proti mikrocitemiji (ANCI) med letnim pregledom šolske populacije za talasemijo. V nacionalni študiji v Italiji je bil protokol sestavljen tako, da je razširil prvotno skupino PROBE na skupno 453 mladostnikov in ponovno analiziral celoten sklop podatkov biomonitoringa kar je vključevalo: i) ovrednotenje vprašalnikov za povezovanje koncentracij kovin v krvi z življenjskim slogom mladostnikov in demografskimi značilnostmi kot so: spol, območje bivanja, intenzivnost prometa, socio-ekonomski status (SES), prisotnost zobnih zalivk in aparatov za zobe, prisotnost tetovaž in pirsingov, pasivno kajenje, uživanje rib in mleka. ii) zbiranje podatkov o kakovosti zraka (benzen, CO, NO2, NOX, O3, PM10, PM2.5) iz postaj za spremljanje kakovosti zraka, ki so najbližje naslovom prebivališča posameznikov določenih z GIS, podatke je zagotovila Regionalna agencija za okolje (ARPA, Lazio) za povezovanje koncentracij kovin v krvi mladostnikov z vrednostmi izbranih kazalnikov kakovosti zraka. iii) Zbiranje podatkov o vsebnosti As v pitni vodi iz območja Viterbo za povezavo koncentracije v krvi mladostnikov in izpostavljenosti As preko vode. Populacija V študijo o mladostnikih je bilo vključenih 453 oseb, starih let, ki živijo v mestnih in podeželskih območjih regije Lazio. Porazdelitev mladostnikov na štiri vzorčevalna območja je bila: 160 iz Viterbo (majhno mesto), 131 iz Fontenuove in 72 iz Monterotondo (podeželska poljedelska območja) ter 89 iz Rima (velikega mesta). ANMI je med letnim pregledom (2009) za mikrocitemijo v šolah pridobil vzorec krvi. V vzorcu krvi smo določili 19 kovin: As, Cd, Co, Cr, Hg, Ir, Mn, Mo, Ni, Pb, Pd, Pt, Rh, Sb, Sn, Tl, U, V in W. Analize Vzorce krvi smo shranili pri -20 C, v laboratoriju odpipetiramo 1 ml vzorca krvi od ca. 1,5 ml celotnega volumna. Sledi razkroj v mikrovalovni peči (Milestone ETHOS MEGA II, FKV, Bergamo, Italija) z ultra čisto HNO3 (Romil Ltd., Cambridge, Velika Britanija), po razkroju razredčimo z deionizirano vodo (sistem EASY Pure, Barnstead, Dubuque, ZDA ). Vsebnost kovin v razkrojenih raztopinah smo izmerili z masno spektrometrijo z induktivno sklopljeno plazmo (SF-ICP-MS, Element 2, Thermo Scientific, Bremen, Nemčija). Metoda, uporabljena za analizo krvi, je bila validirana in akreditirana s strani ACCREDIA (italijanskega akreditacijskega organa). Ocenili smo naslednje validacijske karakteristike: linearnost, mejo zaznavanja (LOD) in meja kvantifikacije (LOQ), specifičnost, natančnost, pravilnost, robustnost in razširjena negotovost (AOAC, 1998, Odločba Komisije 2002/657 / EC, LGC, 2003, NATA, 2009, Thompson in sod., 2002). Vsak mladostnik je izpolnil vprašalnik, ki je vključeval vprašanja za zbiranje informacij o splošnih podatkih kot so spol, prisotnost pirsingov, nakit, prehrambene navade, pitna voda, dejavniki življenjskega sloga (npr. izpostavljenost tobačnemu dimu, uživanje alkohola, uporaba kozmetike itd.), zobne zalivke in aparati, poklicni status staršev. Socio-ekonomski status (SES) družine je bil ocenjen na osnovi nivoja izobrazbe in poklicnega 9

10 statusa staršev; poklic je bil klasificiran glede na mednarodno standardno klasifikacijo poklicev (International Standard Classification of Occupations, 2008). Iz vprašalnikov smo pridobili naslednje informacije: 138 mladostnikov je imelo zobne zalivke in/ali aparat za zobe, 49 je imelo pirsing in pri 93 mladostnikih so starši kadili doma. Prehrambene navade: 265 mladostnikov je uživalo ribe 1 x teden (1/t) in 81 dvakrat na teden ali več ( 2/t), 241 pa mleko vsak dan (7/m), 63 od 4 do 6 krat na teden (4-6 /t) in 99 od 1 do 3 krat tedensko (1-3 /t). Ocena izpostavljenosti je bila dokončana z geo-lociranjem vseh oseb z naslovom stalnega prebivališča z orodji GIS in ob upoštevanju načina življenja mladostnikov in njihovih družin. Glavna omejitev študije PROBE je bila pomanjkanje informacij o zdravstvenem stanju mladostnikov vključenih v študijo, ponoven stik z njimi pa ni bil mogoč. Brez teh podatkov nismo mogli povezati vsebnosti kovin v krvi z morebitnimi učinki na zdravje mladostnikov. Okoljski podatki Koncentracije kovin v krvi smo skušali povezati z okoljskimi podatki o kakovosti zraka in vode, ki jih je zagotovil Regionalni urad za okolje (regija Lazio). Tehniko kriging smo uporabili za pridobivanje prostorske razporeditve koncentracij kemikalij v zunanjem zraku izhajajoč iz podatkov, ki jih zbirajo postaje za spremljanje zraka. Obravnavane kemikalije so bile NOx, PM10, PM 2,5, benzen, CO, NO2, O3. Statistične analize Osnovna statistika podatkov o 453 mladostnikih je vključevala percentile, geometrijsko sredino (GM) in 95- odstotni interval zaupanja za geometrijsko sredino (CI, GM). Geometrijska sredina bolje kot mediana ponazarja podatke, če je razdelitev podatkov asimetrična. V statističnih vrednotenjih smo vrednosti pod LOD zamenjali z LOD/2 in ekstremne vrednosti izključili. Postopek smo uporabili za pridobitev referenčnih vrednosti (RV), kjer 95. percentil predstavlja zgornjo vrednost, ki je uporabna na področju zdravstvenega varstva in okoljske politike. Študijo z mladostniki smo tudi stratificirali glede na nekatere značilnosti, vključno s spolom, območjem bivanja v povezavi z intenzivnostjo prometa, prisotnostjo zobnih zalivk in aparatov za zobe, prisotnostjo pirsingov in tetovaž, pasivnim kajenjem, uživanjem rib in mleka, SES. Vsaka spremenljivka je bila kodirana glede na stopnje uporabljene v vprašalniku: število zobnih zalivk in /ali aparati za zobe, pirsingov in tetovaž (0: ne, 1: da), pasivno kajenje (0: ne; 1: doma; 2:zunaj), uživanje rib (0: nikoli, 1: 1 / teden; 2: 2 / teden) in uživanjem mleka (0: nikoli; 1: 1-3 /teden; 2: >3 / teden, 3: 7/ teden), SES družine (0: nizek, 1: srednji, 2: visok). Za vse primerjave in druge statistične analize je bila upoštevana podatkovna baza, ki je vsebovala tudi ekstremne vrednosti. Razlike v koncentracijah kovin med podskupinami, ki temeljijo na različnih spremenljivkah, smo testirali z različnimi testi: Mann-Whitney U test, Kruskall-Wallis test ali Wilcoxon test (odvisno od števila nivojev za vsako spremenljivko). Mann-Whitney U test z Bonferronijevim popravkom je bil uporabljen za več primerjav, kadar je bilo to primerno. Stopnja signifikantnosti je bila nastavljena na p <0,05. Statistične izračune smo naredili s statistično programsko opremo STATA Release 8.1 (STATA Corporation, TX). Za geostatistične analize smo za vseh 453 oseb na podlagi njihovega naslova prebivališča v sistemu GIS naredili geo-lociranje. Podatke smo shranili v podatkovni bazi Geodatabase skupaj s podatki o biomonitoringu ljudi, prehranjevalnih navadah, okoljskih podatkih in rabi tal. Za iskanje povezav med podatki humanega biomonitoringa, načinom življenja, prehranjevalnih navadah (ribe in mleko) in rabi tal smo uporabili generalizirani linearni model (GLM) in EWAS študijo združevanja podatkov (environmentwide association study-ewas). Model EEA 2006 ( kjer je prikazana površina tal v visoki prostorski ločljivosti (100 m), je bil uporabljen za analizo možnih prostorskih povezav med vrsto rabe tal, kjer so živeli mladostniki in koncentracijami kovin v krvi Slovenija Nacionalni podatki HBM in opredelitev virov izpostavljenosti Nacionalni program HBM je bil prvič izveden v Sloveniji med letoma 2007 in 2015, njegovo izvajanje pa je temeljilo na zakonodaji za izvajanje programa HBM v Sloveniji (opredeljenem v Aktu o kemikalijah v poglavju IX, 49. člen). Program je vključeval zbiranje bioloških vzorcev za spremljanje notranje izpostavljenosti 10

11 prebivalcev na različnih območjih države, ni pa vključeval spremljanja zunanje izpostavljenosti. V okviru CROME so bile oblikovane in izvedene številne okoljske kampanje skupaj z zbiranjem pomožnih podatkov, da bi zapolnile vrzeli v podatkih o zunanji izpostavljenosti. Poleg dodatnih podatkov, zbranih in povezanih z obstoječimi podatki HBM, je CROME bistveno pripomogel k dolgoročnim ciljem in zahtevam programa HBM v Sloveniji. Ciljne okoljske kampanje so bile zbiranje vzorcev pitne vode na 108 lokacijah po vsej Sloveniji in vzorčenje mahu na 102 lokacijah v Sloveniji kot biološki kazalniki kakovosti zraka. Podatki o kakovosti zraka (AQ) so bili dopolnjeni s podatki iz nadzorne mreže AQ (O3, PM2.5 in PM10) na evropski ravni in podatki o emisijah in izpustih iz točkovnih in razpršenih virov (NOx, SOx, CO, amonijak NH3, ogljikov dioksid CO2 in PM10). Kemična sestava tal je bila pridobljena iz interpolirane geokemijske karte Slovenije. Poleg tega smo zbrali podatke o zgradbah v okolju iz katastra javne infrastrukture. Kot približek porabe gnojil so bili iz geološke raziskave v Sloveniji pridobljeni modelni podatki o presežnih vrednostih dušika in fosforja. Posebne negotovosti v povezavi posameznimi približki so opisane v nadaljevanju. V primeru geokemične sestave tal so uporabljeni podatki rezultat prostorske interpolacije na podlagi točkovnih podatkov. Presežki dušika in fosforja so ocene glede na trenutno prevladujoče rabe zemljišč na območju. V primeru evropskih podatkov za AQ lahko rečemo, da imajo ti zelo grobo ločljivost in zato ne zagotavljajo dovolj podrobnega vpogleda v izpostavljenost posameznika in razlike med različnimi skupinami prebivalstva. Podobno velja za promet, če ni bilo dejanskih podatkov o gostoti prometa, je bila uporabljena vrsta cestne infrastrukture v bližini bivalnega okolja posameznikov. Zbrani podatki o okolju skupaj z podatki pridobljenimi iz vprašalnikov o vedenjskih in prehrambnih navadah izbrane populacije v HBM, so podprli opredelitev skupnih vzorcev izpostavljenosti prebivalstva po vsej državi. Glavne težave so bile razlike v prostorski ločljivosti med različnimi bazami podatkov o okolju in nekaterimi parametri, ki se uporabljajo kot približki (npr. presežek dušika kot približek za porabo umetnih gnojil), kar povečuje negotovost okoljskih podatkov v primerjavi z natančnostjo podatkov o notranji izpostavljenosti. Specifične negotovosti v zvezi s posameznimi približki so naslednje: v primeru geokemične sestave tal so uporabljeni sloji rezultat prostorske interpolacije na podlagi točkovnih podatkov, presežki dušika in fosforja so ocene le na podlagi prevladujoče rabe zemljišč na območju, v primeru evropskih podatkov za AQ imajo le-ti zelo grobo ločljivost in zato ne zagotavljajo dovolj podrobnega vpogleda v izpostavljenost posameznika in razlike med različnimi skupinami prebivalstva, podobno velja za promet saj če ni bilo dejanskih podatkov o gostoti prometa, je bila uporabljena vrsta cestne infrastrukture v bližini bivališč posameznikov. Dodaten vir negotovosti so podatki o vedenjskih in prehranskih navadah, ki temeljijo na vprašalnikih. Negotovosti, ki izhajajo iz podatkov o zunanji izpostavljenosti, omogočajo le približne ocene vzorcev izpostavljenosti, vendar so kljub temu pomemben pokazatelj za nadaljnje raziskave. Mediteranska študija V okviru mediteranske študije smo nadaljevali s spremljanjem populacije otrok, ki so bili v študijo vključeni ob rojstvu v okviru projekta PHIME. Za ocenjevanje povezave med izpostavljanjem živemu srebru (Hg) med nosečnostjo in nevrološkim razvojem so bili otroci pri starosti 7-8 let ponovno ocenjeni z Weschlerjevim testom (WISC), ki je primeren za nevropsihološko testiranje otrok v tej starosti. Kot je znano lahko več dejavnikov vpliva na rezultat nevropsihološkega testa, med drugim izpostavljenost drugim kovinam/ elementom in genetski dejavniki. Protokol je tako poleg testiranja WISC vključeval tudi določanje Hg in drugih pomembnih elementov (Pb, Mn, Cd, As, Se, Zn, Cu) v bioloških vzorcih in določanje genskih polimorfizmov, zaradi katerih imajo lahko nekateri posamezniki večje nagnjenje k škodljivim učinkom na zdravje kot splošna populacija. Polimorfizmi, ki so bili izbrani za študij v okviru protokola v CROME Cross-Mediterranean Study, so na genih, ki kodirajo encime vključene v absorpcijo, porazdelitev, metabolizem ali odstranjevanje kovine, in na nekaterih genih direktno vključenih v procese razvoja možganov (npr. sinaptogeneza). Do sedaj so bile analize genotipov skupaj z notranjo izpostavljenostjo in nevropsihološko oceno opravljene na majhnem vzorcu vključene slovenske populacije (n = 179). Tako majhen vzorec ne omogoča stratifikacije zbranih podatkov po genotipih. Povezava med oceno izpostavljenosti pred rojstvom/ v starosti otroka 7-9 let in razvojem otroka (WISC) bo lahko narejena, ko bo zbirka podatkov dopolnjena s podatki iz drugih študijskih populacij (Hrvaška, Italija). 11

12 Raven BPA pri otrocih in njihovih starših Cross-Mediterranean Environment and Podatki za Bishenol A (BPA) v urinu otrok (6-11 let) in njihovih staršev, ki so bili pridobljeni za slovensko populacijo v okviru demonstracijskega projekta DEMOCOPHES, so v okviru CROME projekta prvič uporabljeni za ocene tveganja. Na podlagi podatkov iz vprašalnikov, je bil dnevni vnos za posameznike izračunan z uporabo biokinetičnega modela, ki temelji na fiziologiji posameznika (PBBK) in ki je bil prilagojen za BPA skupaj z algoritmom rekonstrukcije izpostavljenosti. Ponovni zagon modela PBBK v naprednem načinu je omogočil oceno biološko učinkovitih odmerkov (prosti BPA) in ustreznega dnevnega območja pod krivuljo (AUC). Nazadnje, razmerje opredelitev tveganja je bilo izpeljano z uporabo meritev zunanjega in notranjega odmerka. Španija Mediteranska študija - Sabadell Nosečnice in izpostavljenost kovinam V okviru raziskovalne mreže INMA (Otroštvo in okolje) (Guxens, Ballester et al., 2012) so v letih rekrutirali 657 nosečnic med zdravniškim pregledom v Sant Fèlix Primary Care Center II (Sabadell) v 12. tednu nosečnosti. Vključitveni kriteriji: bivanje v Sabadellu, starejše od 16 let, noseče z enim otrokom, prostovoljna prijava v program in želijo roditi v bolnišnici Sabadell ali Terrassa (bližnje mesto). Izključene so bile ženske s kroničnimi boleznimi, s pomanjkljivo komunikacijo ali pa so zanosile z biomedicinsko pomočjo. Po pridobitvi soglasja so usposobljeni sodelavci opravili voden intervju v 12. in 32. tednu nosečnosti. Ta populacija predstavlja reprezentativen vzorec urbane populacije na španskem sredozemskem območju. Vzorce urina so zbrali v 100 ml posodicah iz polipropilena v prvem in tretjem trimesečju nosečnosti pri 489 nosečnicah iz te skupine. Vzorci so bili nato shranjeni v polietilenskih epruvetah pri -20ºC do nadaljnje obdelave. Ta raziskovalni projekt je odobrila komisija za medicinsko etiko CREAL. Da bi ohranili zaupnost, so bili podatki o udeležencih kodirani. Analize vzorcev urina Pred analizo s Q-ICP-MS smo vzorce razkrojili in razredčili, da smo odstranili organske snovi ter zmanjšali koncentracijo anorganskih trdnih snovi (Krachler, Radner et al., 1996, Castillo, Martinez et al., 2008). V teflonske posode smo odpipetirali 3 ml vzorca urina, 3 ml 65% HNO3, Instra-Analysed (J.T. Baker, Nemčija) in 1,5 ml 30% H2O2, Instra-Analysed (Baker). Mešanico smo pustili v peči pri 90 C preko noči. Po ohlajanju smo posodice odprli in postavili na ogrevano ploščo pri 250 C, da izhlapi presežek dušikove kisline. Nato smo trdni preostanek raztopili v 3 ml 4% HNO3, prenesli v v 7 ml stekleničke in shranili v hladilniku do analize. Pred analizo smo dodali interni standard, 10 ppb In, in z MilliQ vodo razredčili na 30 ml ali 60 ml, da bi se izognili nespektralnim motnjam. Analizo v vzorcih smo izvedli s Q-ICP-z instrumentom X-SERIES II (Thermo Fisher Scientific). Izbrali smo specifične isotope za Co in Ni, da bi se izognili morebitnim interferencam zaradi kalcija iz matrice vzorca. Atomi Cl lahko vplivajo na določanje As in Se, zato je treba v teh primerih z instrumentom delati v načinu z reakcijsko celico. V našem primeru nismo opazili motenj, zato te celice nismo uporabili. Instrumentalna meja zaznavanja (LOD) za vse kovine je bila 0,2 ng/ml, določena s pomočjo najnižje kalibracijske točke. Dva vzorca, ki pripadata prvemu in tretjem trimesečju posamezne osebe, smo pripravili in izmerili istočasno. V vsaki seriji vzorcev smo dodali slep vzorec, ki je namesto vzorca vseboval MilliQ vodo, s tem smo nadzorovali morebitno kontaminacijo. Če je prišlo do kontaminacije, je bilo opravljeno temeljito čiščenje vsega pribora in ponovitev razkrojev. S slepimi vzorci smo preverjali tudi potek vzorčenje in shranjevanja vzorcev. V vzorčevalne posode smo dali Milli Q vodo in jih transportirali skupaj z vzorci. Razvito metodologijo smo preverili z uporabo referenčnega materiala Bio-Rad Level 1 urine reference material (Lyphochek Urine Metals Control ; Marnes-la-Coquette, France), saj ima določene certificirane referenčne vrednosti za elemente, ki so nas zanimali v raziskavi in sicer za As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Tl, Zn in Se. Pred razkrojem smo liofiliziran referenčni urin rekonstituirani s 25 ml vode MilliQ, kot priporoča proizvajalec. 12

13 Vso steklovino in polipropilenski material smo temeljito očistili s 24-urnim namakanjem v 10% dušikovi kislini, nato pa smo izpirali trikrat z MilliQ vodo. Teflonske posode smo po vsaki uporabi trikrat očistili z 10% dušikovo kislino, po zadnjem izpiranju smo jih pustili v peči pri 90 C čez noč, na koncu smo jih izprali z veliko količino MilliQ vode. Kreatinin so določili v laboratoriju Echevarne v Barceloni z Jaffé metodo z Beckman Coulter reactive v AU5400 (IZASA ) Statistična analiza Izračunali smo deskriptivne statistične parameter za koncentracijo kovin: povprečje, srednja vrednost, standardni odklon (SD) in P91 percentil. Normalnost je bila preverjena s testom Kolmogorov-Smirnov. Koncentracije kovin med prvim in tretjim trimestrom smo primerjali z uporabo Spearmanovega korelacijskega testa in Mann-Whitney primerjalnega testa. Izračunali smo tudi posamezna razmerja med koncentracijami kovin v tretjem in prvem trimesečju. Izračunali smo srednjo vrednost, povprečje in standardni odklon za ta razmerja. Vse statistične analize so bile izvedene s programsko opremo Stata 12.0 (Stata Corporation, College Station, Texas). Asturija Izpostavitev organohalogenim spojinam Študijo je v Asturiji vodil Preventivni oddelek Univerze v Oviedu, v okviru projekta INMA -Infancia y Medio Ambiente (Okolje in otroštvo) (Guxens, Ballester in sodelavci 2012). Med majem 2004 in junijem 2007 je bilo rekrutiranih 494 nosečnic. Porodi so potekali med oktobrom 2004 in februarjem 2008 v referenčni bolnišnici San Agustin v kraju Avilés (Asturias, Španija). Uspešno so zbrali 326 vzorcev popkovne krvi od 485 porodov v študijo vključenih žensk. Na koncu smo imeli za to študijo na voljo 308 parov vzorcev materine in popkovne krvi. Placento smo vzorčili pri podskupini 50 žensk. Prikazani so podatke o koncentracijah obstojnih organskih onesnažil (POPs) za 308 razpoložljivih parov vzorcev krvi in 50 vzorcev placente. Značilnosti mater iz te skupine 308 niso pokazale pomembnih razlik od celotne rekrutirane skupine. Študijski protokol je potrdila Komisija za medicinsko etiko referenčne bolnišnice, za vsakega udeleženca pa je bilo pridobljeno informirano soglasje. Zbiranje podatkov in vzorcev V prvem trimesečju nosečnosti so bili zbrani vzorci materine krvi (mediana = 12 tednov, razpon = tednov). Vzorci popkovne krvi so bile zbrani s punkcijo iz vene popkovnice preden je bila placenta zunaj telesa. Serum smo v obeh primerih dobili z 10 minutnim centrifugiranjem, nato smo ločili v alikvote po 1 ml in shranili pri -80 C do analiz. Vzorčili smo celotno placenta takoj po porodu. Polovico, vključno z materino in plodovo stranjo ter osrednjimi in perifernimi deli, smo dali v stekleno posodo mešalnika (Büchi Mixer B-400 Büchi Laboratories AG, Flavil, Švica) za homogenizacijo. Po homogenizaciji so bili shranjeni 25 g alikvoti pri -80 C. Noseče ženske so izpolnile dva podrobna vprašalnika (teden in 28-32) o antropometričnih in sociodemografskih značilnostih in o življenjskem slogu. Laboratorijske analize Laboratorijske analitske metode in postopki kontrole kakovosti rezultatov za analizo POPs so podrobneje opisani drugje (Vizcaino, Arellano in ostali, 2009, Grimalt, Howsam et al., 2010). Koncentracije 7 PCB kongenerjev (PCB28, PCB52, PCB101, PCB138 in PCB180), α-hch, β-hch, 4'-DDT, 2,4'-DDE, 4,4'-DDE, 2,4'-DDD, 4,4'-DDD in 14 kongenerjev PBDE (BDE17, BDE28, BDE47, BDE66, BDE71, BDE85, BDE99, BDE 100, BDE153, BDE154 BDE138 BDE 183 in BDE 190 in BDE 209) so bile določene v vzorcih placente, materinem serumu in serumu popkovne krvi. Na kratko, 1 ml seruma ali 1 g placentalnega tkiva smo dodali standarde tetrabromobenzena (TBB) in dekahlorobifenila (CB 209) in mešali 30 sekund pri 2000 obr/min. Dodali n-heksan (3 ml), čemur sledi koncentrirana žveplova kislina (2 ml). Po reakciji zmes mešamo 30 sekund in n-heksansko fazo ločimo s centrifugiranjem. Preostalo raztopino z žveplovo kislino še dvakrat ekstrahiramo z 2 ml n-heksana (vsakokrat s 30 sekundnim mešanjem in centrifugiranjem). Združene n-heksanske ekstrakte (7 ml) smo dodatno očistili z žveplovo kislino (2 ml, mešali 30 s). Nato smo n-heksansko fazo ločili s centrifugiranjem in zmanjšali na manjši volumen z nežnim tokom dušika. Ekstrakt smo prenesli v viale za plinsko kromatografijo 13

14 (GC) s štirimi izpiranji s 25 μl izooktana. CB 142, BDE 118 (20 μl) in [13C]-BDE 209 (10 μl) so bili dodani kot interni standardi pred injiciranjem. Organoklorovne spojine smo določili z GC z detekcijo na zajetje elektronov (GC-ECD). BDE kongenerje smo analizirali z GC, ki je bila povezana z masno spektrometrijo v načinu kemijske ionizacije in s snemanjem negativnih ionov. Celokupni holesterol in trigliceridi so bili določeni v vzorcih serumov s kolorimetričnimi encimskimi metodami v Laboratoriju za splošno biokemijo bolnišnice San Agustin. Vzorci so bili analizirani na Roche Diagnostics COBAS C711. Celotne koncentracije lipidov v serumu smo izračunali, kot je opisal Phillips et al (1989) z uporabo naslednje formule: TL = (2.27*TC) + TG mg dl-1 Lipide v placenti smo določili gravimetrično. 1 g placente smo homogenizirali v 5 ml mešanice kloroform:metanol:klorovodikova kislina (20:10:0,1) (v/v v). Po ponovitvi postopka dodamo 10 ml 0,1 M HCl in centrifugiramo 10 minut pri 3000 obr./min. Nato smo zbrali organsko fazo; ne-organsko fazo smo ponovno ekstrahirali in dodali prvi fazi. Celotno vsebnost lipidov smo določili po sušenju organskih ekstraktov v toku dušika do konstantne teže, celotni lipidi so bili izraženi v gramih lipida na gram placente (Lopez- Espinosa, Lopez-Navarrete et al., 2008). Preverjanje analiznih rezultatov (vključno z POPs in skupnimi koncentracijami lipidov) je bilo opravljeno z analizo referenčnega materiala pridobljenega v oviru programa za spremljanje in ocenjevanje Arktike (AMAP). Redno sodelujemo v programu za preverjanje AMAP za testiranje POPs v humanem serumu (Center de Toxicologie Institut National de Santé Publique du Québec, Québec, Kanada), laboratorijski rezultati so ponavadi v območju +/-20% koncentracijske vrednosti, vključno s koncentracijami lipidov. Analiza podatkov Rezultati za koncentracije POPs so bili izraženi v ng/ml. Prav tako so bile izraženi na koncentracijo lipidov v serumu (ng/g lipid). Vrednostim pod mejo zaznavnosti smo dodelili vrednost polovico LOD. Za preučevanje povezav med vrednostmi za POPs v placenti, v serumu mamine in popkovne krvi smo uporabili Spearmanovo korelacijo in grafe raztrosa. Prenos čez placenta smo ovrednotili z izračunom razmerij koncentracij med pari vzorcev mamine in popkovne krvi za vsako spojino v ng/ml in ng/g lipidov: Rcm= Cuc/Cm; Rpm= Cp/Cm kjer je Cuc koncentracija popkovni krvi, Cm je koncentracija v mamini krvi in Cp je koncentracija v placenti. Korelacije in razmerja koncentracije smo izračunali brez vrednosoti pod LOD. Vrednosti, ki so presegle trikratni standardni odklon od povprečja, smo obravnavali kot ekstremne vrednosti in jih posledično izključili iz izračunov razmerij. Razmerje za posamezno spojino je bilo izračunano samo, če je bilo vsaj 10 parov vzorcev nad mejo zaznavnosti (Needham, Grandjean et al., 2011). Naredili smo tudi regresijsko analizo s prisilno regresijo skozi 0. Med uporabljenimi načini niso bile ugotovljene velike razlike (podatki niso prikazani), zato poročamo samo o razmerjih srednjih koncentracij. Povečanje gestacijske teže Povečanje gestacijske teže (Gestational weight gain-gwg) je bila opredeljena kot razlika med zadnjo zabeleženo težo med nosečnostjo in materino težo pred nosečnostjo, ki jo je vpisala v vprašalnik. Da bi se izognili morebitnim heteroscedastičnostim in nelinearnim učinkom, je bilo GWG izračunano iz tedenskih GWG (wgwg) med nosečnostjo, ki so bili izračunani za vsak teden na podlagi razlik med meritvami telesne teže iz zapisov med obiski zdravnika in težo pred nosečnostjo, ki jo je navedla mati, normirano glede na gestacijsko starost pri vsakem merjenju. Povprečno število meritev teže na mater (± SD) je bilo 6,5 ± 2,7. Telesna masa pred nosečnostjo, ki jo je poročala mati, smo nadomestili s prvim kliničnim zapisom telesne mase, če je bila merjena pred 8 tednom nosečnosti in je bilo drugo merjenje po 15 tednih (n = 1) (Nielsen et al., 2006 ). Za manjkajoče ali malo verjetne poročane teža pred nosečnostjo (če je bil wgwg> 1,5 kg/teden ali <-1 kg/ teden) smo uporabili linearno ekstrapolacijo, če sta bili zabeleženi dve GWG pred 15 gestacijskimi tedni (n = 4). Skupno tedensko povečanje GWG (twgwg) je bilo izračunano kot razlika med zadnjo težo ob koncu nosečnosti in težo pred nosečnostjo, ki jo je poročala mati, normirtano z gestacijsko starostjo. Za ženske, 14

15 katerih zadnje merjenje telesne teže je bilo zabeležene v 37,5-42 tednu nosečnosti, smo uporabili meritve, ki so bile zabeležene najbliže 39 tednu (wgwg39). Ta meritev ni bila nujno zadnja, saj se GWG določi ob koncu nosečnosti. Za 194 žensk, ki jim niso merili telesne teže med 37,5-42 tednih nosečnosti, smo izračunali twgwg39 iz zadnje izmerjene teže. Natančneje, za žensko i in teden k: twgwgi39 =mean(wgwg39)+{[twgwgik mean(wgwgk)] [sd(wgwg39)/sd(wgwgk)]} [1] Povprečna vrednosti (wgwg39), povprečna vrednosti (wgwgk), sd (wgwg39) in sd (wgwgk) so bile pridobljene iz porazdelitve wgwg združenenih podatkov celotni študiji INMA, ki zajema nosečnice iz Asturije, Gipuzkoe, Sabadella in Valencije (n = 2.413). Porazdelitve wgwg v Asturiji in referenčni študiji INMA so bile podobne, vključno z večjim wgwg in manjšo heteroscedastičnost (SD) v poznejši gestacijski starosti, kar je v skladu s prejšnjimi študijami (Dietz, Callaghan et al., 2006, Kleinman, Oken et al., 2007, Nohr, Timpson in drugi 2009). Na koncu je bil skupni GWG izračunan kot produkt gestacijske starosti v tednih in twgwg39. Ta spremenljivka je bila oblikovana kot neprekinjena spremenljivka (skupni kg) in kot kategorizirana spremenljivka (priporočena, nezadostna ali prekomerna), kot jo je opredelil Medicinski inštitut (Rasmussen, Stene in sod. 2009) glede na BMI pred nosečnostjo. Natančneje priporočeni GWG znaša 11,25-15,75 kg za ženske, ki imajo normalen BMI pred nosečnostjo (po priporočilih Svetovne zdravstvene organizacije), in 12,60-18,00 kg, 6,75-11,25 kg in 4,95-9,00 kg za ženske, ki imajo prenizek BMI, previsok BMI oz. se jih uvršča v razred debelosti. Druge spremenljivke Gestacijska starost je bila izračunana iz datuma zadnjega menstruacijskega obdobja (LMP), ki so ga ženske navedle ob rekrutiranju, in je bil potrjen pri pregledu z ultrazvokom v 12. tednu nosečnosti. Če sta se datuma razlikovala za več kot 6 dni (pri 12,9% udeleženkah), smo gestacijsko starost dobili s preračunom iz meritev zarodka pri zgodnjem ultrazvoku (Westerway, Davison et al., 2000). Starost, BMI pred nosečnostjo, število nosečnosti, stopnja izobrazbe, družbeni razred, vnos rib in zgodovina dojenja so možne spremenljivke, ki lahko vplivajo na povezave GWG s koncentracijami POPs v serumu (Sarcinelli, Pereira et al., 2003, Vizcaino, Grimalt et 2011, Glynn, Miller in sod., 2012). Noseče ženske so izpolnile dva podrobna vprašalnika (v in tednu), da smo dobili informacije o številu nosečnosti, starosti in družabnem razredu (uporabljena je bila španska verzija mednarodne klasifikacije ISCO88 (Vrijheid, Casas et al. 2012)), stopnji izobrazbe, BMI pred nosečnostjo (na podlagi meritev višine ob naboru in teži pred nosečnostjo, ki so poročale ženske same) in zgodovino dojenja. Podatki o prehrani so bili zbrani iz validiranega semikvantitativnega vprašalnika o uživanju živil (N=101) (Vioque, Navarrete -Munoz et al., 2013) in se osredotoča na mlečne izdelke, meso, zelenjavo, sadje in ribe. Skupno uživanje rib je vključevalo puste ribe, mastne ribe, tune v pločevinkah, morske sadeže, predelane ribe, mešane ocvrte ribe ter sušene ali prekajene ribe. Obstoječi podatki in vrzeli v podatkih Grčija Oinofoita Cr(VI) Pri pregledu literature pred letom 2007 nismo zasledili sistematčnih meritev Cr(VI). Od leta 2007 dalje pa so za območje Oinofyta na voljo tri neodvisna merjenja šestvalentnega kroma. To vključuje naslednje raziskave: študija Inštituta za geologijo in mineralno raziskovanje (IGME 2008) v obdobju od novembra 2007 do februarja 2008, ki je odkrila 35 vzorcev (od 87), vzetih iz različnih vodnjakov na istem območju, kjer so bile koncentracije nad 10 μg/l, največja vrednost je bila 156 μg/l; 15