UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO GREGOR JUG. VPLIV delagg V I TRO U 6 GE A GSTM3 A MI ERAL O KOST O GOSTOTO

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO GREGOR JUG VPLIV delagg V I TRO U 6 GE A GSTM3 A MI ERAL O KOST O GOSTOTO IMPACT OF I TRO 6 delagg I GSTM3 GE E O BO E MI ERAL DE SITY DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana, 2009

2 Diplomsko delo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, v laboratorijih Katedre za klinično biokemijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Janje Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom Simone Jurković Mlakar, mag. farm. Meritve mineralne kostne gostote so opravili na Kliniki za endokrinologijo in bolezni presnove v Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani, v Splošni bolnišnici Celje in v Ambulanti za osteoporozo Zdravilišča Dolenjske toplice. Meritve koncentracije biokemijskih kazalcev kostne remodelacije so opravili na Kliniki za nuklearno medicino Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani. Sekvenčno analizo so opravili v podjetju MWG Biotech, Ebersberg, Nemčija. Zahvaljujem se mentorici, izr. prof. dr. Janji Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorici Simoni Jurković Mlakar, mag. farm. za številne strokovne nasvete in pomoč pri izdelavi diplomske naloge. Za vso pomoč in praktične nasvete se prav tako zahvaljujem vsem ostalim zaposlenim na Katedri za klinično biokemijo, Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani. Zahvaljujem se tudi družini in prijateljem za pomoč in podporo v času študija. Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelal pod mentorstvom izr. prof. dr. Janje Marc, mag. farm., spec. med. biokem. Gregor Jug Ljubljana, februar 2009 Predsednik komisije: prof. dr. Danijel Kikelj Članica komisije: izr. prof. dr. Saša Baumgartner

3 KAZALO VSEBI E KAZALO VSEBINE... i POVZETEK / ABSTRACT... iii SEZNAM OKRAJŠAV... iv SEZNAM PREGLEDNIC, SLIK IN GRAFOV... v 1 UVOD KOSTNINA ZGRADBA KOSTI REMODELACIJA KOSTI OSTEOPOROZA PREVALENCA ETIOPATOGENEZA DIAGNOSTIKA ZDRAVLJENJE OSTEOPOROZA IN OKSIDATIVNI STRES OKSIDATIVNI STRES IN ANTIOKSIDATIVNI ENCIMI VPLIV OKSIDATIVNEGA STRESA NA RAZVOJ OSTEOPOROZE GLUTATION S-TRANSFERAZE NAMEN DELA MATERIALI IN METODE OPIS PREISKOVANCEV OPIS VZORCEV DNA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO POMNOŽEVANJE ODSEKA DNA REAGENTI IN OPREMA i

4 3.4 DENATURACIJSKA TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI PRIPRAVA MIKROTITRSKE PLOŠČE PRIPRAVA APARATURE DHPLC ZA ANALIZO POTEK ANALIZE REAGENTI IN OPREMA SEKVENČNA ANALIZA PRIPRAVA VZORCEV IZVEDBA SEKVENČNE ANALIZE STATISTIČNE METODE REZULTATI IN RAZPRAVA OPTIMIZACIJA POGOJEV VERIŽNE REAKCIJE S POLIMERAZO OPTIMIZACIJA POGOJEV ANALIZE Z METODO DHPLC IN REZULTATI ANALIZE GENOTIPIZACIJA VZORCEV PONOVLJIVOST ANALIZE SEKVENČNA ANALIZA KLINIČNI POMEN delagg V GENU GSTM POGOSTOST delagg PRI SLOVENCIH VPLIV delagg NA MINERALNO KOSTNO GOSTOTO VPLIV delagg NA KONCENTRACIJO BIOKEMIJSKIH KAZALCEV KOSTNE REMODELACIJE SKLEP LITERATURA PRILOGE PRILOGA 1: REZULTATI GENOTIPIZACIJE PRILOGA 2: REZULTATI STATISTIČNE ANALIZE ii

5 POVZETEK / ABSTRACT VPLIV delagg GOSTOTO V I TRO U 6 GE A GSTM3 A MI ERAL O KOST O Glutation S-transferaza M3 je pomemben antioksidativni encim v človeškem telesu. V stanju oksidativnega stresa ščiti telo pred negativnimi učinki reaktivnih kisikovih spojin. Eden izmed teh učinkov je tudi zmanjšana mineralna kostna gostota, ki lahko privede do pojava osteoporoze. V okviru diplomske naloge smo na vzorcih 400 preiskovancev, 284 žensk in 116 moških, določili pogostost delagg v intronu 6 gena GSTM3, nato pa smo ocenili tudi klinični pomen polimorfizma. Z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) smo pomnožili želene odseke DNA. Produktom smo nato, po predhodni optimizaciji metode, določili dolžino s pomočjo nedenaturacijske tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (ne-dhplc). PCR produkti z delecijo so krajši in so se eluirali hitreje, kakor PCR produkti, kjer delecija ni bila prisotna. Ugotovili smo, da ima genotip +/+ 72 %, genotip -/+ 26,2 %, genotip -/- pa 1,8 % preiskovancev. Genotipi so porazdeljeni v skladu s Hardy-Weinbergovim ravnotežjem. S statističnimi testi smo pri skupini pomenopavznih žensk ugotovili statistično signifikantno povezanost med delagg in zmanjšano mineralno kostno gostoto vratu stegnenice (p = 0,026) in ledvenih vretenc (p = 0,033). Prav tako smo pri skupini pomenopavznih žensk ugotovili statistično signifikantno povezanost med polimorfizmom in koncentracijo liganda receptorja za aktivacijo jedrnega faktorja kappa-b (RANKL; p = 0,024). Smiselno bi bilo ponoviti raziskavo na večjem številu preiskovancev in obenem skušati razjasniti mehanizem vpliva polimorfizma na zmanjšanje mineralne kostne gostote. IMPACT OF I TRO 6 delagg I GSTM3 GE E O BO E MI ERAL DE SITY Glutathione S-transferase M3 is important antioxidant enzyme in human body. It protects human body from negative effects of reactive oxygen species in state of oxidative stress. One of these effects is diminished bone mineral density, which can lead to development of osteoporosis. In scope of our diploma work we determined on samples of 400 volunteers, 284 women and 116 men, frequency of intron 6 delagg in GSTM3 gene. We also estimated clinical importance of this polymorphism. First of all we have multiplied DNA fragments using polymerase chain reaction (PCR). Then we have optimised method of non-denaturation high performance liquid chromatography (non-dhplc) and have determined lenghts of multiplied DNA fragments. PCR products with deletion are shorter and were eluted before products without deletion. We found out, that genotype +/+ has 72 %, genotype -/+ 26,2 % and genotype -/- 1,8 % of volunteers. Genotypes are distributed in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium. Using statistical analysis we showed, that statistical significance is present between delagg and diminished bone mineral density of femoral neck (p = 0,026) and lumbar spine (p = 0,033) in group of postmenopausal women. We also found out, that there is statistical significance between delagg and concentration of receptor activator of nuclear factor-κb ligand (RANKL; p = 0,024). It would be reasonable to repeat this research on much larger group of volunteers. We also think, that there is a need to find out the mechanism by which this polymorphism effects bone mineral density. iii

6 SEZ AM OKRAJŠAV ALP alkalna fosfataza ALT alanin-amino transferaza ANCOVA analiza kovariance ANOVA analiza variance AST aspartat-amino transferaza BMD mineralna kostna gostota (angl.: bone mineral density) CTx prečno povezani C-terminalni telopeptid kolagena I DEXA dvoenergijska rentgenska absorpciometrija DHPLC denaturacijska tekočinska kromatografija visoke ločljivosti DNA deoksiribonukleinska kislina dntp deoksiribonukleozid trifosfat FoxO transkripcijski faktorji Forkhead box O GSTM3 glutation S-transferaza razreda mu 3 IL - interlevkin ITM indeks telesne mase M-CSF makrofagne kolonije stimulirajoči faktor NF-κB jedrni faktor kappa-b OC osteokalcin OPG - osteoprotegrin PBM povprečna kostna masa mladih odraslih (angl.: peak bone mass) PCR verižna reakcija s polimerazo (angl.: polymerase chain reaction) PGE 2 prostaglandin E 2 PTH parathormon RANKL ligand receptorja za aktivacijo jedrnega faktorja kappa-b ROS reaktivne kisikove spojine (angl.: reactive oxygen species) SD standardna deviacija SR hitrost sedimentacije eritrocitov TAE Tris-acetat EDTA TEAA trietilamonijev acetat TNF-α dejavnik tumorske nekroze alfa iv

7 SEZ AM PREGLED IC, SLIK I GRAFOV Preglednice Preglednica I: Nekateri dejavniki tveganja za nastanek in razvoj osteoporoze (2, 5, 6) Preglednica II: Biokemijski kazalci tvorbe (11) in razgradnje kosti (9, 11) Preglednica III: Učinkovine za zdravljenje osteoporoze Preglednica IV: Imena glutation S-transferaze M3 (42) Preglednica V: Bolezni, povezane z delecijo AGG v intronu 6 GSTM Preglednica VI: Frekvenca delagg glede na rasne skupine (58) Preglednica VII: Povprečne vrednosti in standardna deviacija parametrov za ženske, moške in celotno populacijo preiskovancev Preglednica VIII: Povprečne vrednosti in standardna deviacija parametrov za premenopavzne in pomenopavzne ženske preiskovanke Preglednica IX: Sestava reakcijske zmesi za pomnoževanje DNA odseka s PCR po optimizaciji.. 23 Preglednica X: Sestava reakcijske zmesi za pomnoževanje DNA odseka s PCR z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase Preglednica XI: Zaporedje začetnih oligonukleotidov Preglednica XII: Shema temperaturnega programa Preglednica XIII: Shema temperaturnega programa pri pomnoževanju z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase Preglednica XIV: Sestavine za pripravo 2 % agaroznega gela Preglednica XV: Potek analize z metodo ne-dhplc Preglednica XVI: Pregled uporabljenih statističnih testov Preglednica XVII: Pregled pogojev PCR reakcije z označenimi mesti sprememb parametrov (podčrtane vrednosti so se izkazali za primernejše) Preglednica XVIII: Prikaz različnih deležev pufrov A in B pri optimizaciji metode ne-dhplc Preglednica XIX: Optimiziran program analize z ne-dhplc (M5) Preglednica XX: Frekvenca genotipov med Slovenci v

8 Preglednica XXI: Frekvenca delagg glede na prebivalstvo nekaterih evropskih držav (63) Preglednica XXII: Statistično signifikantne vrednosti povezanosti delagg in mineralne kostne gostote na področju vratu stegnenice in ledvenih vretenc pri pomenopavznih ženskah (povzeto po Preglednicah XL in XLI, Priloga 2) Preglednica XXIII: Mejne statistično signifikantne vrednosti povezanosti delagg in mineralne kostne gostote na področju vratu stegnenice pri skupini moških (povzeto iz Preglednice XXXI, Priloga 2) Preglednica XXIV: Statistično signifikantni vrednosti povezanosti med delagg in vrednostjo RANKL pri skupini pomenopavznih žensk (povzeto po Preglednici XLII, Priloga 2) Preglednica XXV: Zbrani genotipi za posamezne vzorce; genotip +/+ je označen z»0«, genotip -/+ je označen z»1«, genotip -/- je označen z»2« Preglednica XXVI: Rezultati testa ANOVA Preglednica XXVII: Rezultati testov Post Hoc Preglednica XXVIII: Rezultati testa Kruskal-Wallis Preglednica XXIX: Rezultati testa ANCOVA Preglednica XXX: Rezultati testa ANOVA - moški Preglednica XXXI: Rezultati Post Hoc testov - moški Preglednica XXXII: Rezultati testa Kruskal-Wallis - moški Preglednica XXXIII: Rezultati testa ANCOVA - moški Preglednica XXXIV: Rezultati testa ANOVA - ženske Preglednica XXXV: Rezultati Post Hoc testov - ženske Preglednica XXXVI: Rezultati testa Kruskal-Wallis - ženske Preglednica XXXVII: Rezultati testa ANCOVA - ženske Preglednica XXXVIII: Rezultati testa ANOVA - premenopavzne ženske Preglednica XXXIX: Rezultati testa ANCOVA - premenopavzne ženske Preglednica XL: Rezultati testa ANOVA - pomenopavzne ženske Preglednica XLI: Rezultati Post Hoc testov - pomenopavzne ženske Preglednica XLII: Rezultati testa Kruskal-Wallis - pomenopavzne ženske Preglednica XLIII: Rezultati testa ANCOVA - pomenopavzne ženske vi

9 Slike Slika 1: Faze remodelacije kosti Slika 2: Razlika med zdravo kostjo in kostjo z osteoporozo Slika 3: Osteoporozi najbolj podvrženi deli skeleta Slika 4: Spreminjanje količine kostne mase s starostjo Slika 5: Dvoenergijska rentgenska absorpciometrija Slika 6: Mesto gena GSTM3 na kromosomu Slika 7: Shematski prikaz aparature DHPLC sistema WAVE ; A pufer A, B pufer B, C raztopina za spiranje igle, D raztopina D Slika 8: TEAA omogoči vezavo negativno nabitih molekul DNA na C18-alkiliran polistirendivinilbenzenski delec Slika 9: Potek čiščenja produktov PCR reakcije Slika 10: Optimizacija koncentracije MgCl 2 ; s številkami 1, 2 in 3 so označene koncentracije MgCl 2 v mm,»sl«predstavlja slepi vzorec,»m«pa DNA markerje Slika 11: PCR produkti po optimizaciji metode; 38 ciklov, temperatura prileganja začetnih oligonukleotidov 56,5 C, čas podaljševanja verige DNA pri 72 C znaša 20 sekund (M DNA marker, SL slepi vzorec, številke vzorcev) Slika 12: Primerjava kromatografskih vrhov genotipa +/+ pomnoženega z AmpliTaq Gold polimerazo (A; dva vrhova) in z Optimase Polymerase (B; en vrh) Slika 13: Primerjava kromatografskih vrhov genotipa -/+ pomnoženega z AmpliTaq Gold polimerazo (A; osem vrhov) in z Optimase Polymerase (B; dva vrhova) Slika 14: Kromatografski vrhovi treh genotipov; A homozigot -/- (dva vrhova), B heterozigot - /+ (osem vrhov), C homozigot -/- (trije vrhovi) Slika 15: vrh A - nezreagirani začetni oligonukleotidi; vrh B - acetonitril Slika 16: Sekvenciranje vzorca 730 z istosmernim začetnim oligonukleotidom (genotip +/+) Slika 17: Sekvenciranje vzorca 686 z istosmernim začetnim oligonukleotidom (genotip -/+) Slika 18: Sekvenciranje vzorca 983 z istosmernim začetnim oligonukleotidom (genotip -/-); s puščico je označeno mesto delecije AGG vii

10 Grafi Graf 1: Vrednosti BMD vratu stegnenice glede na genotip Graf 2: Vrednosti BMD ledvenih vretenc glede na genotip Graf 3: Vrednosti BMD vratu stegnenice glede na genotip pri moških viii

11 1 UVOD 1.1 KOST I A Kost je vitalno, dinamično povezovalno tkivo, katerega struktura in zgradba odražata ravnotežje med njenimi glavnimi tremi funkcijami, ki so (1, 2, 3): zagotovitev mehanske integritete za lokomocijo (telesu nudi oporo, je nasadišče za mišice); zaščita (ščiti kostni mozeg in vitalne organe); vpletenost v presnovne poti, katere so povezane s homeostazo mineralov (rezerva kalcija in fosfatov) ZGRADBA KOSTI Kost je sestavljena iz organskih in anorganskih sestavin (2). Glede na maso kosti, je približno 60 % le-te anorganske narave, 30 % organske narave, približno 10 % pa predstavlja voda. Anorganski del predstavlja nečisti hidroksiapatit (Ca 10 [PO 4 ] 6 [OH] 2 ) (1). Organski del sestavljajo beljakovine (glavna beljakovina je kolagen tipa I), mukopolisaharidi (vloga ni raziskana) in kostne celice, katere so (2): Osteoblasti nastanejo iz mezenhimskih celic strome kostnega mozga (2). Prisotni so na površju kosti. Sintetizirajo kostni matriks (osteoid) in uravnavajo njegovo mineralizacijo, po kateri se preobilje osteoblastov odstrani z apoptozo. Ostali osteoblasti se pretvorijo v mirujoče celice (mirujoči osteoblasti) na površju kosti, ali pa ostanejo zagozdeni v novo nastali kostnini kot osteociti (3). Osteoblasti tvorijo citokine, ki so nujno potrebni za dozorevanje osteoklastov (interlevkin-6, interlevkin-11) (2). Osteoblasti so bogati z alkalno fosfatazo (ALP), na svoji površini pa izražajo tudi mnogo receptorjev, vključno s tistimi za glukokortikoide, PTH, 1,25-dihidroksi vitamin D3, estrogene, prostaglandine, interlevkine, TNF-α in TGF-β (3). 1

12 Osteociti so preoblikovani osteoblasti, zagozdeni med kostne lamele ali pa se nahajajo na površini kosti. Imajo lastnosti osteoblastov in osteoklastov. Med seboj in s površino kosti so povezani z izrastki. Omogočajo hitro sproščanje kalcija iz kosti in tako zagotavljajo uravnoteženost notranjega okolja (2). Osteoklasti skrbijo za resorpcijo kosti (2). Nastanejo iz hematopoetskih celic makrofagne-monocitne vrste. Izražajo receptorje za M-CSF, RANKL in kalcitonin, ne pa za PTH (3) REMODELACIJA KOSTI Kost je živa, zato skozi vse življenje poteka njena gradnja in razgradnja. Proces gradnje in razgradnje kosti imenujemo remodelacija (2). Remodelacija kosti je sparjen proces, pri katerem pride do lokalnega odstranjevanja stare kosti (resorpcija) in nadomeščanja le-te z na novo zgrajeno kostjo. Pri odraslih med 25. in 35. letom sta ta procesa v ravnotežju (4). Pri otrocih gradnja kosti prevladuje nad njeno resorpcijo, po 35. letu pa začne proces resorpcije prevladovati nad izgradnjo kosti. Dokazi o sparjenem procesu temeljijo na ideji, da osteoblasti vplivajo na nastanek in aktivnost osteoklastov. Osteoblasti namreč izražajo večino citokinov (M-CSF, RANKL, OPG), ki vplivajo na diferenciacijo osteoklasta od hematopoetske celice, do zrelega večceličnega osteoklasta (1). Bistveno vlogo pri uravnavanju presnove kosti imajo hormoni, med katerimi so najpomembnejši PTH, kalcitonin in vitamin D 3, ki ga imenujemo tudi hormon D ter estrogeni. Poleg teh na gradnjo in razgradnjo vplivajo še nekateri drugi hormoni (rastni hormon, inzulin, glukokortikoidi, ščitnični in spolni hormoni). Posebno vlogo v uravnavanju remodelacije pa imajo lokalni dejavniki in tkivni hormoni (citokini, prostaglandini) (2). Skladno z modelom, ki ga je predlagal Parfitt, poteka remodelacija po zaporedju: faza mirovanja, faza aktivacije, faza resorpcije, faza preobrata, faza izgradnje in povratek v mirujočo fazo (Slika 1) (1, 2). V fazi mirovanja je površina kosti prekrita s tankimi, mirujočimi in neaktivnimi osteoblasti (2). Neaktivni osteoblasti imajo receptorje za različne snovi, ki spodbudijo resorpcijo kosti (PTH, PGE 2 ) (1). V fazi aktivacije se neaktivni osteoblasti razmaknejo in razgalijo kostno površino (2). To povzroči 2

13 kemotaktično privabljanje osteoklastov (1). V fazi resorpcije osteoklasti izdolbejo Howshipove lakune (2). Faza preobrata je časovni interval od konca resorpcije, do začetka izgradnje kosti (1). V tem času enojedrni fagociti očistijo dno votline in ga obložijo s cementno plastjo (2). To v normalnih razmerah traja 1 2 tedna (1). V Howshipovi lakuni se nato namestijo osteoblasti, ki nastanejo iz mezenhimskih celic, in tvorijo osteoid, ki kasneje mineralizira, kar imenujemo faza izgradnje (1, 2). Slika 1: Faze remodelacije kosti. Nepravilnosti v remodelaciji kosti se kažejo kot ene izmed najbolj pogostih bolezni, ki prizadenejo človeka. Mednje spadajo osteoporoza, osteomalacija, periodontitis, artritis in tumorsko sprožena osteoliza (2, 4). 1.2 OSTEOPOROZA Svetovna zdravstvena organizacija (WHO, angl.: World Health Organization) definira osteoporozo na podlagi merjenja mineralne kostne gostote z metodo dvoenergijske rentgenske absorpciometrije (DEXA). Osteoporoza je prisotna, če je kostna gostota 2,5 ali več standardnih deviacij (SD) pod povprečjem kostne gostote mladih odraslih (Tvrednost). 3

14 Osteoporoza je najbolj razširjena metabolična bolezen kosti pri odraslih (5). Zanjo sta značilni znižana količina kostne mase in porušenje mikroarhitekturne zgradbe kostnega tkiva (Slika 2). Ti dve spremembi vodita do povečane krhkosti kosti, obenem pa povečujeta tveganje za zlom le-teh že pri najmanjših telesnih poškodbah (2, 3). Zlomom so, čeprav je lahko prizadeta katerakoli kost, najbolj podvrženi kolk, hrbtenica in zapestje (6) (slika 3). Osteoporozo delimo na dve veliki skupini, in sicer na primarno in sekundarno osteoporozo. Pod primarno osteoporozo uvrščamo juvenilno, idiopatično in involutivno osteoporozo. Involutivno osteoporozo delimo na dve manjši skupini: tip I (pomenopavzna osteoporoza); tip II (senilna osteoporoza). Slika 2: Razlika med zdravo kostjo in kostjo z osteoporozo. Juvenilna in idiopatična osteoporoza sta izredno redki. Juvenilna se pojavlja pred puberteto in traja od 2. do 4. leta starosti, medtem ko se idiopatična pojavlja predvsem pri mlajših osebah moškega spola (2). Slika 3: Osteoporozi najbolj podvrženi deli skeleta. Pomenopavzna osteoporoza se pojavlja pri ženskah med 50. in 70. letom starosti. Povezana je s pomanjkanjem estrogenov po menopavzi, kar privede do povečane resorpcije in zmanjšane tvorbe kosti (2, 7). Senilna osteoporoza se pojavi po 70. letu starosti in v večjem številu zajame tudi osebe moškega spola (2). Vzrok za razvoj le-te pa ja pomanjkanje kalcija in staranje okostja (7). Teorijo delitve involutivne osteoporoze na dva tipa je nadomestila novejša teorija, ki trdi, da osteoporoza predstavlja neprekinjeno zvezo več patogenetskih mehanizmov, katerih 4

15 rezultat je zmanjšana količina kostne mase in porušenje mikroarhitekture kosti. Osnovni patogenetski mehanizmi, ki privedejo do krhkosti okostja so: (a) neuspešna tvorba okostja s primerno kostno maso in čvrstostjo med rastjo; (b) prekomerna resorpcija kosti, katere rezultat je zmanjšana količina kostne mase in porušenje mikrostrukture okostja; in (c) nezadostna tvorba kosti med remodelacijo kosti, kot odziv na povečano resorpcijo (7). Pojav sekundarne osteoporoze je pogojen s prisotnostjo nekaterih bolezni (endokrine bolezni, bolezni prebavil, bolezni kostnega mozga) oziroma so zanjo odgovorni številni drugi dejavniki (npr. imobilizacija, KOPB, kronični alkoholizem, dolgotrajno zdravljenje z glukokortikoidi, s heparinom, z antacidi, revmatoidni artritis, antikonvulzivna zdravila) (2) PREVALE CA Osteoporoza prizadene večinoma ženske, a zanjo zbolijo tudi moški; med bolniki z osteoporozo je kar 80 % žensk in 20 % moških (6). Po 70. letu se to razmerje nekoliko zmanjša, a še vedno znaša 2:1 v korist žensk. Študija na 610 Slovencih (418 ženskah in 192 moških, ki je bila izvedena v letu 2006, je pokazala, da za osteoporozo zboli 80,4 % Slovenk in 19,6 % Slovencev (8). Obstajajo številni dejavniki tveganja, ki lahko privedejo do nastanka osteoporoze (Preglednica I) : Preglednica I: Nekateri dejavniki tveganja za nastanek in razvoj osteoporoze (2, 5, 6). otranji dejavniki tveganja etnična pripadnost (belci, Azijci) ženski spol dednost in genetski faktorji zapoznela puberteta, zgodnja menopavza drobna konstitucija nekatere bolezni žlez z notranjim izločanjem (hipogonadizem, hiperkorticizem, hipertiroidizem, hiperparatiroidizem) starost bolezni jeter, žolčnih poti in prebavil presaditev jeter, srca maligna obolenja celic kostnega mozga Zunanji dejavniki tveganja prehrana s premalo kalcija nezadostna telesna aktivnost prekomerno uživanje alkohola kajenje zdravljenje z glukokortikoidi dolgotrajno zdravljenje z nekaterimi zdravili (heparin, ciklosporin, antacidi, antiepileptiki) imobilizacija 5

16 1.2.2 ETIOPATOGE EZA V dobi odraščanja izgradnjaa kosti prevladuje nad razgradnjo, zato se količina kostne mase veča (2). Med 20. in 30. letom dosežemo najvišjo vrednost količine kostne mase (angl.: peak bone mass; PBM) (3). Procesi izgradnje in razgradnje so nato nekaj let uravnoteženi, čemur pravimo tudi»utrjevanje kosti«(2). Okrog 40. leta starosti pa se začne (zaradi starosti) količina kostne mase zmanjševati (3). Pri ženskah je v času menopavze ta izguba pospešena (3), saj pride zaradi prenehanja delovanja jajčnikov do hitrega upada količine Slika 4: Spreminjanje količine kostne mase s starostjo. estrogenov (2). Pospešena razgradnja traja od 5 do 10 let (3). Pri višji starosti pa dobijo večjo vlogo pri propadanju kostnine še pomanjkanje vitamina D, zvišana koncentracija parathormona (PTH) oziroma sekundarni hiperparatiroidizem ter zmanjšana absorpcija kalcija iz črevesja (2, 3) (Slika 4) DIAG OSTIKA Osteoporozo pogosto imenujemo»tiha bolezen«, saj se kostna masa zmanjšuje brez simptomov (6). Diagnosticiramo jo lahko na podlagi zloma, ki je nastal ob precej nedolžni poškodbi. Seveda pa je zaželeno, da jo odkrijemo še pred zlomom (5). Osteoporozo se da ob pravočasnem odkritju preprečiti ali pa vsaj omiliti, kar daje pravočasni diagnozi še toliko večji pomen. Pri diagnosticiranju osteoporoze uporabljamo metode za merjenje kostne gostote, kot tudi laboratorijske teste. Metode za merjenje kostne gostote so: ultrazvočna preiskava petnice (za diferencialno diagnozo osteoporoze) (3); rentgensko slikanje hrbtenice (ob zlomu in za oceno deformacije vretenc) (3); kvantitativnii CT pregled (angl.: computer axial tomography; draga metoda, ob preiskavii je pacient izpostavljen veliki meri sevanja, nobene velike prednosti pred ostalimi metodami) (3); 6

17 dvoenergijska rentgenska absorpciometrija (angl.: dual energy X-ray absorptiometry, DEXA; slika 5); zlati standard za diagnostiko osteoporoze, merjenje mineralizacije kosti v gramih kalcija na kvadratni centimeter (g/cm 2 ) površine prereza kosti (5), natančna in točna metoda, pacient je ob preiskavi izpostavljen majhni meri sevanja) (3, 5). Po strokovnih smernicah diagnoza osteoporoze temelji na merjenju kostne gostote. Osnovana je na podlagi primerjave pacientove kostne gostote s povprečno kostno maso mladih odraslih oziroma PBM (angl.: peak bone mass) (5). Tudi definicija WHO, kot smo že omenili, temelji na primerjavi kostne gostote. Osteoporoza je prisotna, če je Slika 5: Dvoenergijska rentgenska absorpciometrija. kostna gostota 2,5 ali več standardnih deviacij (SD) pod povprečjem kostne gostote mladih odraslih (T-vrednost). SD od 0 do -1 pod T-vrednostjo označuje normalno kostno gostoto, SD med -1 in -2,5 pod T-vrednostjo označuje osteopenijo, če pa je kostna gostota -2,5 ali več SD pod T-vrednostjo in so obenem prisotni zlomi, gre za hudo osteoporozo (3, 10). Laboratorijski testi nam omogočajo spremljanje procesa tvorbe in razgradnje kosti (9) z določanjem biokemijskih kazalcev v serumu ali v urinu (11). Med biokemijskimi kazalci so najpomembnejši (Preglednica II): Preglednica II: Biokemijski kazalci tvorbe (11) in razgradnje kosti (9, 11). Kazalci tvorbe kosti osteokalcin kostno specifična alkalna fosfataza (ALP) N-terminalni propeptid kolagena tipa I Kazalci razgradnje kosti prečni povezovalci C-telopeptidov kolagena tipa I prečni povezovalci N-telopeptidov kolagena tipa I piridinolin deoksipiridinolin hidroksiprolin tartrat rezistentna kisla fosfataza 7

18 Postavitev diagnoze nam zelo olajša kombinacija obeh vrst preiskav, tako merjenje kostne gostote z eno izmed metod, kakor tudi določanje biokemijskih kazalcev (11). Da bi se lahko na podlagi rezultatov preiskav opredelili, katera oblika, primarna ali sekundarna, je prizadela pacienta, moramo narediti še nekaj ostalih kliničnih preiskav. Vsem pacientom določimo še koncentracijo kalcija, fosfata, alkalne fosfataze, sečnine, kreatinina, AST, ALT, TSH in prostega testosterona (pri moških) v serumu. Poleg naštetega naredimo še proteinogram, SR in hemogram. Pri primarni osteoporozi so vsi našteti kazalci v mejah normale (9) ZDRAVLJE JE Naš osnovni cilj je, da skušamo ljudi usmeriti k takemu načinu življenja, da bi preprečili pojav osteoporoze. Za preprečevanje osteoporoze so pomembni: zdrav način življenja (brez alkohola in cigaret), prehrana z zadostno količino kalcija ter stalna telesna aktivnost. Zato pacientom najprej svetujemo spremembo načina življenja (2). V kolikor je osteoporoza že prisotna, smo primorani k zdravljenju (5). Bistveni cilj zdravljenja osteoporoze je preprečiti zlom. Za zdravljenje sta nam na voljo naslednji skupini učinkovin (Preglednica III): Preglednica III: Učinkovine za zdravljenje osteoporoze. Zaviralci resorpcije kosti estrogeni kalcij (v obliki soli) bisfosfonati kalcitonin vitamin D selektivni modulatorji estrogenskih receptorjev (SERM) Pospeševalci tvorbe kosti natrijev fluorid rekombinantni parathormon (PTH) Uporabne so tudi kombinacijske terapije, kjer lahko kombiniramo dve učinkovini, ki zavirata resorpcijo, ali pa izberemo eno učinkovino, ki zavira resorpcijo in drugo, ki pospešuje tvorbo kosti (3). Za zdravljenje pa lahko uporabimo tudi anabolne steroide, a je njihova uporaba omejena s stranskimi učinki (androgenizacija in znižanje koncentracije 8

19 HDL). Mehanizem delovanja anabolnih steroidov še ni znan, verjetno pa zavirajo resorpcijo (2). 1.3 OSTEOPOROZA I OKSIDATIV I STRES OKSIDATIV I STRES I A TIOKSIDATIV I E CIMI V normalnih pogojih je med nastajanjem reaktivnih kisikovih spojin (angl.: reactive oxygen species, ROS) in antioksidativno kapaciteto celice vzpostavljeno dinamično ravnotežje (12). Reaktivne kisikove spojine, kot so superoksidni anion (O - 2 ), vodikov peroksid (H 2 O 2 ), hidroksilni radikal ( OH), organski peroksidi in radikali, nastajajo endogeno v vseh aerobnih celicah kot stranski produkt raznih metaboličnih reakcij (13). Te produkte v celicah običajno nevtralizirajo antioksidativni obrambni mehanizmi (12). Oksidativni stres se pojavi, če je nastajanje reaktivnih kisikovih spojin povečano, oziroma če so antioksidativni obrambni sistemi okrnjeni. Tako stanje lahko privede do poškodb celic, saj prihaja do lipidne peroksidacije in spremembe struktur proteinov in nukleinskih kislin (13). Velja prepričanje, da je oksidativni stres močno vpleten v številna bolezenska stanja, kakor tudi v proces staranja. Vendar bodo za točno določitev vpliva oksidativnega stresa potrebne še številne raziskave na več področjih (14). Sesalske celice so z namenom, da bi preprečile oksidativno škodo in omogočile preživetje v okolju s kisikom, razvile izpopolnjen antioksidativni obrambni sistem. Le-ta vključuje neencimske antioksidante (npr. glutation, vitamina C in E) in antioksidativne encime, med katerimi so najpomembnejši superoksid dismutaza (SOD), glutation peroksidaza (GPx), glutation reduktaza (GSR) in katalaza (CAT) (13, 22). Poleg naštetih, tudi antioksidativni encimi, ki lahko metabolizirajo učinkovine (glutation S-transferaze, glukuronozil transferaze, NADPH in NADH), znižujejo raven oksidativnega stresa in so prav tako del antioksidativnega obrambnega sistema (13). Dokazano je tudi, da stanje oksidativnega stresa zviša stopnjo izražanja genov, ki nosijo zapis za aktivnost antioksidativnih encimov, med drugimi tudi glutation S-transferaze (15). 9

20 1.3.2 VPLIV OKSIDATIV EGA STRESA A RAZVOJ OSTEOPOROZE Stanje oksidativnega stresa lahko dolgoročno vpliva tudi na pojav in razvoj osteoporoze. Ideja o povezovanju stanja povečane produkcije reaktivnih kisikovih spojin z osteoporozo se je porodila šele pred nekaj leti. Dokazali so, da imajo estrogeni neposreden vpliv na obrambo pred oksidativnim stresom (16). Tezo, da so prosti radikali vpleteni v osteoklastogenezo in resorpcijo kosti, so kasneje potrdili in vitro in na glodavcih (17). Ker je znano, da nivo estrogenov z naraščajočo starostjo upada, lahko ugotovimo, da pomanjkanje estrogenov tako posredno in neposredno vpliva na večanje kostne resorpcije in posledično na razvoj osteoporoze. Vpliv na nastanek in razvoj osteoporoze ima tudi pomanjkanje oziroma zmanjšana aktivnost antioksidativnih encimov. Glutation peroksidaza 1 (GPx) je prevladujoč antioksidativni encim (18). V procesu kostne remodelacije ima vpliv na delovanje osteoblastov (21). Izražanje gena za ta encim je močno povezano z estrogeni; ker je po menopavzi nivo estrogenov nižji, se posledično količina GPx v telesu zmanjša (18), s tem pa je okrnjeno delovanje osteoblastov. In vitro so dokazali, da ima katalaza (CAT) sposobnost preprečevanja diferenciacije osteoklastov (18). Količina glutation reduktaze (GSR) v telesu se s starostjo zmanjšuje. Aktivnosti tega encima v homeostazi kosti povezujejo z apoptozo osteoblastov in osteoklastov, obenem pa naj bi imel direkten vpliv na jakost kosti in kostno maso (22). Poleg omenjenih vplivov pa vodi pomanjkanje teh encimov do pojava stanja oksidativnega stresa. Raziskave, ki poskušajo pojasniti mehanizme, preko katerih prosti radikali vplivajo na kostno resorpcijo, potekajo oziroma so potekale večinoma na glodavcih (16-24). Nekatere raziskovalne skupine so že naredile korak naprej in naredile raziskave na ženskah in moških (25, 26). Mehanizmi, preko katerih prosti radikali vplivajo na nastanek in razvoj osteoporoze, niso popolnoma znani. Znano pa je, da reaktivne kisikove spojine vplivajo na prevajanje po nekaterih signalnih poteh, med katerimi so tudi tiste, ki so bistvene za aktivacijo osteoklastov. Nekatere izmed tarč so jedrni faktor kappa-b (NF-κB), c-jun aminoterminalna kinaza (JNK), fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K) in p38 MAP kinaza (16, 18). Tvorba osteoklastov je odvisna od aktivacije F-κB, le-ta pa je dokazana ob prisotnosti 10

21 reaktivnih kisikovih spojin (18, 25, 26). Reaktivne kisikove spojine so prav tako potencialni aktivatorji dejavnika tumorske nekroze α (T F-α), interlevkina 1 (IL-1), interlevkina 6 (IL-6) in drugih citokinov, ki so močno vpleteni v izgubo kostne mase zaradi pomanjkanja estrogenov (16). Garrett in sodelavci zagovarjajo možnost, da prosti radikali vplivajo tudi na parathormon (PTH) in preko delovanja le-tega povzročajo izgubo kostne mase. Prav tako izpostavljajo možnost, da je razgradnja kostnine možna kot posledica direktnega delovanja prostih radikalov (19). Grassi in sodelavci so dokazali, da upadanje količine estrogenov privede do stanja oksidativnega stresa, ki vodi do od antigenov odvisne aktivacije T celic s sočasnim povečanjem količine ko-stimulatorne molekule CD80 na dendritskih celicah, posledica česar je povečana produkcija TNF-α v T celicah. TNF-α v kostnih celicah in v celicah kostnega mozga stimulira nastajanje liganda receptorja za aktivacijo jedrnega dejavnika kappa-b - RANKL (angl.: receptor activator of nuclear factor-κb ligand) in makrofagne kolonije stimulirajočega dejavnika M-CSF (angl.: macrophage colony-stimulating factor), poveča dovzetnost prekurzorjev osteoklastov za RANKL in inducira dodatne osteoklastogenetske citokine IL-1, IL-6 in IL-7 (20). Vezava RANKL na prekurzorje osteoklastov povzroči diferenciacijo le-teh v popolnoma zrele, večjedrne osteoklaste. M-CSF inducira proliferacijo zgodnjih oblik prekurzorjev osteoklastov, diferenciacijo nekoliko bolj zrelih osteoklastov, fuzijo enojedrnih preosteoklastov in preživetje zrelih osteoklastov (27). Almeida in sodelavci so dokazali še eno možno pot, po kateri reaktivne kisikove spojine povzročajo izgubo kostne mase. Ugotovili so, da oksidativni stres antagonizira Wnt signalno pot v prekurzorjih osteoblastov, in sicer preko indukcije transkripcijskih faktorjev Forkhead box O (FoxO). Wnt signalna pot je bistvena v procesu osteoblastogeneze in tvorbe kosti, njeno zavrtje pa poleg zmanjšane osteoblastogeneze povzroča še apoptozo mezenhimskih celic kostnega mozga (22, 23, 24). Skupina transkripcijskih faktorjev FoxO (FoxO1 (Fkhr), FoxO3a (Fkhrl1), FoxO4 (Afx) in FoxO6) ima vlogo pri preživetju sesalskih celic, saj preko p27kip1 oziroma GADD45 inducira ustavitev in mirovanje celičnega cikla, kar nastane kot odgovor na oksidativni stres (23, 28). Prav tako preko regulacije ekspresije genov vpliva na apoptozo, diferenciacijo celic in hitrejšo obnovo poškodovane DNA, obenem pa vpliva tudi na metabolizem glukoze in lipidov (24, 28). Ima tudi vpliv na obrambo pred oksidativnim stresom, kar je paradoksalna trditev glede na zgoraj navedeno dejstvo, da so transkripcijski faktorji FoxO vpleteni v mehanizem, ki povzroča izgubo kostne mase. Smiselna razlaga je, da FoxO faktorji glede na intenziteto dražljaja vplivajo na transkripcijo različnih genov, 11

22 oziroma v različnih tkivih vplivajo na transkripcijo različnih genov (28). Oksidativni stres pospešuje povezovanje FoxO3a z β-kateninom. β-katenin je protein, ki ima v primeru vezave na transkripcijski faktor Tcf ključno vlogo v homeostazi kosti, saj vpliva na transkripcijo gena za Wnt (23, 24). Manolagas in Almeida domnevata, da je povezovanje β-katenina s FoxO pomembno za zvečano adipogenezo v kostnem mozgu, prav tako pa za povečano apoptozo osteoblastov in osteoklastov (24). Med reaktivnimi kisikovimi spojinami je najpomembnejši vodikov peroksid (H 2 O 2 ), saj mu njegove lastnosti omogočajo opravljanje funkcij intra- in intercelularnega prenašalca signala. Ima namreč relativno dolg razpolovni čas in lahko prehaja membrano. Prav tako je bilo dokazano, da direktno vpliva na tvorbo in delovanje osteoklastov (18). Glede na zgoraj navedena dejstva lahko trdimo, da lahko zadosten vnos antioksidantov s hrano v veliki meri ublaži negativne učinke prostih radikalov, ki prispevajo k zmanjševanju kostne mase. Povedano drugače, premajhen vnos antioksidantov in kovinskih ionov (selen, cink in baker), ki so potrebni za delovanje antioksidativnih encimov, lahko privede do oksidativnega stresa in posledično do osteoporoze (25) GLUTATIO S-TRA SFERAZE Glutation S-transferaze (GST) so dimerni detoksifikacijski encimi, katerih delovanje je pomembno v II. fazi metabolizma, saj omogočajo nastanek konjugata med reducirano obliko glutationa (GSH; γ-l-glutamil-l-cisteinil glicin), ki je pomemben celični reducent, in različnimi elektrofili, ki so lahko genotoksični in citotoksični. Konjugati so, ali bolj vodotopni in se laže izločijo iz telesa, ali pa so netoksični in zapadejo nadaljnjemu metabolizmu. GST katalizirajo nukleofilno adicijo tiolne skupine GSH (-SH) na elektrofilne akceptorje, kateri so lahko elektrofilni ogljik, elektrofilni dušik ali elektrofilni kisik (29, 30). Med molekule, ki so podvržene tej poti metabolizma, spadajo različni endogeni metaboliti, ksenobiotiki, nekatere protitumorne učinkovine (1,3-bis(2-kloroetil)- 1-nitrozourea), aril in alkil halidi, kinoni, organski peroksidi (peroksidi maščob in DNA), policiklični aromatski ogljikovodiki (benzo[a]piren), nekateri aldehidi, etilen oksid, 4- aminobifenil in nitrozamini (29-38). Med endogene metabolite spadajo tudi epoksidi policikličnih aromatskih ogljikovodikov, ki nastanejo v I. fazi metabolizma (produkt delovanja citokromov P450). Ta vrsta spojin nastaja tudi zaradi stanja oksidativnega stresa 12

23 (33). Glutation S-transferaze imajo poleg encimske še neencimsko funkcijo, in sicer uravnavajo številne celične procese, ki pripomorejo k intrinzični sposobnosti celic, da preživijo genotoksični, metabolični in oksidativni stres (31). Glutation S-transferaze delimo na citosolne oziroma jedrne, mitohondrijske in mikrosomalne (31). Med citosolne GST uvrščamo sedem od osmih do sedaj znanih razredov, in sicer alfa, mi, theta, pi, zeta, sigma, omega (znan tudi kot razred hi). Edini do sedaj znan razred mitohondrijskih GST je razred kappa (29, 31, 33). Znane pa so še tri izoforme encimov GST, ki so vezani na membrano (MGST1, MGST2 in MGST3) (39) GLUTATION S-TRANSFERAZA M3 Razred»mi«je najbolj razširjen v družini glutation S-transferaz v človeškem telesu. V tem razredu je identificiranih pet genov (GSTM1 - GSTM5), ki kodirajo za encime GSTM1 GSTM5. Geni so organizirani v skupino in se nahajajo v kromosomski regiji 1p13 (Slika 6) (29, 33). Locirani so eden za drugim v zaporedju 5'-GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5- GSTM3-3' (33). Slika 6: Mesto gena GSTM3 na kromosomu 1. Encim glutation S-transferaza M3 (GSTM3) je najbolj zastopan v testisih, pljučih, možganih in v jetrih (40). Prisoten je tudi v celicah kostnega mozga (41). GSTM3 poznamo še pod več drugimi imeni, ki so zbrana v Preglednici IV: 13

24 Preglednica IV: Imena glutation S-transferaze M3 (42). Alias EC GST5 GSTB GSTM3-3 GTM3 MGC3310 MGC3704 OTTHUMP hgstm3-3 Opisno ime GST razred mi S-(hidroksialkil)glutation liaza M3 možganska GST možganski tip mi-glutation S-transferaza glutation S-alkiltransferaza M3 glutation S-alkiltransferaza M3 glutation S-ariltransferaza M3 glutation S-transferaza M3 (možganska) glutation S-transferaza, Mi-3 GSTM3 kodira za protein, ki je še najmanj podoben ostalim štirim članom razreda»mi«, a še vedno ima 70 % zaporedja aminokislin enakega, kakor ostali proteini iz razreda. Prav tako je zanimivo, da se GSTM3 prepisuje v obratni smeri, kakor ostali štirje geni razreda»mi«. Gena GSTM5 in GSTM3 sta orientirana v nasprotnih smereh, 3' koncu GSTM5 sledi vmesno zaporedje nukleotidov, temu pa sledi 3' konec GSTM3. Temu pravimo orientacija»rep proti repu«. GSTM3 sestavlja osem eksonov in sedem intronov. Prvi in osmi ekson sta za malenkost daljša v primerjavi z ostalimi štirimi geni v razredu»mi«. Rezultat tega je za 4 aminokisline daljši N-konec in za 3 aminokisline daljši C-konec encima GSTM3. Razlike se prav tako pojavljajo v intronih, in sicer v intronu 3, ki je bistveno daljši v GSTM3, intron 7 pa je več kot desetkrat krajši v primerjavi s tistimi v ostalih štirih genih (38). Promotorska regija GSTM3 je edina v razredu»mi«, ki vsebuje TATA zaporedje (TATAAA - Hognesovo zaporedje) (38, 57). TATA je glavno mesto vezave za RNApolimerazo II, ki je odgovorna za prepis mrna in snrna (57). GSTM3 vsebuje tudi območje bogato z GC zaporedjem (38). V genu GSTM3 najdemo številne polimorfizme, tako v intronih, v eksonih, pri 3' in pri 5' koncu gena. Mi smo se osredotočili na intron 6, na katerem najdemo tri polimorfizme, odločili pa smo se za slednjega (44): deltcc (delecija TTC) delctc (delecija CTC) delagg (delecija AGG) 14

25 Zaradi delecije v intronu 6 dobimo dva različna alela: GSTM3*A»wild type«gstm3*b delecija AGG v intronu 6 (mesto delecije je obarvano rdeče in podčrtano) 5' CCATGTTTCTGGGGAAATTCTCATGGTTTGCCGGGGAAAAG[intron6]GT AGGAAGAAGGGAAAAGAAGAGGATACTTCTCTATCTCTGCAGGCTACT ACTCCTCAGACCTAAGCATCTTATTGCTTTTCTTCTAG[intron6]CTCACCT TTGTGGATTTTCTCACCTATGATATCTTGGATCAGAACCGTATATTTGA 3' Polimorfizem v alelu GSTM3*B povzroči nastanek prepoznavnega mesta (-AAGATA-) za transkripcijski faktor Ying Yang 1 (YY1). YY1 vpliva na transkripcijo, posledica česar je spremenjeno izražanje obeh alelov in tako močno spremenjena ekspresija GSTM3. Le-ta je lahko povečana, lahko pa je, kar je še bolj verjetno, zmanjšana. Točni mehanizmi, po katerih YY1 vpliva na transkripcijo, še niso znani (29, 31-34, 36-38, 40, 43). Polimorfizma delagg v GSTM3 in GSTM1 nič se običajno pojavljata skupaj, obenem pa naj bi GSTM1 nič vplival na zmanjšano ekspresijo GSTM3 (38, 56). Z GSTM1 nič označujemo polimorfizem gena GSTM1 (navadno je to delecija), ki povzroči popolno neaktivnost encima GSTM1. Zaradi spremenjene ekspresije GSTM3 se je smiselno vprašati, kakšne posledice prinaša ta polimorfizem pri obrambi pred stanjem oksidativnega stresa. Do sedaj so ta polimorfizem povezovali z več različnimi boleznimi (Preglednica V), nihče pa ga še ni povezoval z osteoporozo. 15

26 Preglednica V: Bolezni, povezane z delecijo AGG v intronu 6 GSTM3. Bolezen Genotip in statistična signifikanca rak požiralnika (34) GSTM3*A/B (p = 0,000) distalni kolorektalni rak (35) proksimalni in distalni kolorektalni rak (35) GSTM3*A/B+GSTM3*B/B+GSTM1 nič (p = 0,010) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B GSTM3*A/B + GSTM1 nič GSTM3*B/B + GSTM1 nič rak na materničnem vratu (36) GSTM3*A/B (p = 0,053) rak na prostati (37) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B (p = 0,044) rak na prostati (50) GSTM3*B/B (p = 0,016) gliom (43) GSTM3*B/B meningiom (43) GSTM3*B/B rak na dojki (ER-α pozitiven) (45) ni definirano Alzheimerjeva bolezen (46) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B (p = 0,050) akutna levkoblastna levkemija (47) ni definirano rak na grlu (51) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B rak na mehurju (52) rak na dojki (54) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B+GSTM1 nič GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B Nekatere raziskave so pokazale, da polimorfizem delagg nima vedno negativne vloge v človeškem telesu. Kadilke z genotipom GSTM3*A/A so bolj podvržene tveganju, da dobijo raka na materničnem vratu, kakor nosilke genotipov GSTM3*A/B in GSTM3*B/B (36). Prav tako so nosilci genotipa GSTM3*A/A podvrženi večjemu tveganju za razvoj multiplega karcinoma bazalnih celic kože (53). Prisotnost alela GSTM3*B pri pacientih z malignimi neoplazmami, ki se zdravijo s cisplatinom, izkazuje pomen pri zaščiti pred ototoksičnostjo. Le-ta se pojavi kot stranski učinek terapije s cisplatinom (48). Prav tako so imeli otroci s cistično fibrozo in prisotnim alelom GSTM3*B boljše rezultate pri testih FEV1 in FVC (49). Genotip GSTM3*A/A prav tako izkazuje pomen pri zaščiti pred rakom na mehurju (52). Zanimivo je tudi, da je frekvenca genotipa GSTM3*B/B pri pacientih z rakom na grlu signifikantno nižja, kakor pri kontrolnih osebah (55). 16

27 Frekvenca delagg se razlikuje glede na rasno pripadnost. Žal so podatki o frekvenci polimorfizma zelo skopi (N = 200). V preglednici so zbrani podatki za štiri rasne skupine (Preglednica VI): Preglednica VI: Frekvenca delagg glede na rasne skupine (58). Populacija Frekvenca genotipa Frekvenca alela (št.) +/+ -/+ -/- + - belci (58) 0,931 0,034 0,035 0,948 0,052 črnci (48) 0,292 0,542 0,166 0,563 0,437 prebivalci pacifiških držav (48) 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 Španci (46) 0,652 0,261 0,087 0,783 0,217 VSI (200) 0,730 0,200 0,070 0,830 0,170 17

28 2 AME DELA V uvodu smo pokazali, da bi stanje oksidativnega stresa lahko vplivalo na zmanjšanje mineralne kostne gostote. Prav tako smo navedli, da je eden izmed pomembnejših obrambnih encimov pred reaktivnimi kisikovimi spojinami, in posledično pred oksidativnim stresom, glutation S-transferaza M3. Namen naše študije je ugotoviti vpliv delecije AGG (delagg) v intronu 6 gena za glutation S-transferazo razreda mu 3 (GSTM3) na mineralno kostno gostoto. S tem namenom bomo v raziskavo vključili 400 preiskovancev, 284 žensk in 116 moških. Preiskovancem je bila predhodno z metodo DEXA v predelu kolka, ledvenih vretenc in vratu stegnenice izmerjena kostna gostota. Raziskava bo obsegala naslednje stopnje: optimizirali bomo verižno reakcijo s polimerazo, nato pa pomnožili odsek DNA, v katerem se nahaja polimorfizem vzorce bomo genotipizirali z denaturacijsko tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti s statistično analizo bomo ocenili vpliv polimorfizma gena GSTM3 na mineralno kostno gostoto in na koncentracijo biokemičnih kazalcev kostne remodelacije 18

29 3 MATERIALI I METODE 3.1 OPIS PREISKOVA CEV V študijo smo vključili vzorce 400 preiskovancev, med katerimi je bilo 284 žensk in 116 moških. Vsem preiskovancem je bila predhodno na Kliniki za endokrinologijo, diabetes in bolezni presnove Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani, v Splošni bolnišnici Celje in v Ambulanti za osteoporozo Zdravilišča Dolenjske toplice z metodo DEXA izmerjena mineralna kostna gostota (BMD) v predelu vratu stegnenice (del kolka), celotnega kolka in ledvenih vretenc. Pri vseh preiskovancih so prav tako opravili rutinske biokemijske teste za izključitev sistemskih in metaboličnih kostnih bolezni. Pred preiskavo preiskovanci niso jemali zdravil za zdravljenje osteoporoze. Vsi preiskovanci so dali soglasje za vključitev njihovih vzorcev v študijo. Študija ima prav tako dovoljenje etične komisije. Pri ugotavljanju povezanosti polimorfizma in ostalih parametrov (ITM, starost, BMD, t- vrednost, RANKL, poc, sctx, sopg in pri ženskah starost, ko se je pri njih začela menopavza in čas trajanja menopavze), smo preiskovance razdelili na več skupin, in sicer: vsi preiskovanci (400) ženske preiskovanke (284) moški preiskovanci (116) premenopavzne ženske (33); v kolikor ni bilo podatka o menopavzi, smo v to skupino uvrstili vse ženske, mlajše od 60 let pomenopavzne ženske (239) V Preglednicah VII in VIII so zbrane povprečne vrednosti parametrov glede na izbrane skupine preiskovancev: 19

30 Preglednica VII: Povprečne vrednosti in standardna deviacija parametrov za ženske, moške in celotno populacijo preiskovancev. Spremenljivka Ženske Moški Vsi Starost (leta) 64,42 ± 9,278 67,57 ± 6,099 65,36 ± 8,568 ITM 27,75 ± 4,782 27,89 ± 3,757 27,79 ± 4,509 Menopavza (starost) 49,92 ± 4,018 / / Leta menopavze 14,79 ±10,174 / / BMDtot (g/cm 2 ) 0,87 ±0,142 1,03 ± 0,163 0,91 ± 0,166 t_tot -0,79 ± 1,128-0,23 ± 1,099-0,62 ± 1,151 BMDfn (g/cm 2 ) 0,72 ± 0,129 0,82 ± 0,157 0,75 ± 0,144 t_fn -1,48 ± 1,182-1,17 ± 1,193-1,39 ± 1,192 BMDL1L4 (g/cm 2 ) 0,91 ± 0,156 1,06 ± 0,177 0,95 ± 0,176 tl1l4-1,38 ± 1,390-0,42 ± 1,511-1,10 ± 1,486 RANKL (pmol/l) 0,23 ± 0,296 0,18 ± 0,112 0,21 ± 0,249 poc (µg/l) 14,87 ±7,696 9,55 ± 5,171 13,05 ± 7,352 sctx (pmol/l) 3361,01 ± 2313, ,72 ± 1086, ,71 ± 2108, 740 sopg (pmol/l) 5,33 ± 1,703 5,46 ± 1,539 5,37 ± 1,640 Preglednica VIII: Povprečne vrednosti in standardna deviacija parametrov za premenopavzne in pomenopavzne ženske preiskovanke. Spremenljivka Premenopavzne ženske Pomenopavzne ženske Starost (leta) 53,73 ± 3,125 65,90 ± 8,869 ITM 25,67 ± 4,962 28,07 ± 4,725 BMDtot (g/cm 2 ) 0,92 ± 0,185 0,86 ± 0,134 t_tot -0,49 ± 1,196-0,84 ± 1,108 BMDfn (g/cm 2 ) 0,75 ± 0,122 0,72 ± 0,131 t_fn -1,25 ± 1,174-1,53 ± 1,178 BMDL1L4 (g/cm 2 ) 0,90 ± 0,144 0,91 ± 0,158 tl1l4-1,36 ± 1,297-1,40 ± 1,408 RANKL (pmol/l) 0,31 ± 0,161 0,30 ± 0,368 poc (µg/l) 17,73 ± 5,559 14,12 ± 8,079 sctx (pmol/l) 3773,33 ± 1967, ,95 ± 2418,497 sopg (pmol/l) 4,58 ± 0,851 5,59 ± 1,883 Menopavza (starost) / 49,92 ± 4,018 Leta menopavze / 14,79 ± 10,174 20

31 3.2 OPIS VZORCEV D A Preiskovancem so na Kliniki za endokrinologijo, diabetes in bolezni presnove Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani, v Splošni bolnišnici Celje in v Ambulanti za osteoporozo Zdravilišča Dolenjske odvzeli periferno vensko kri. Kri so shranili pri -20 C. V manj kot petih dneh je bila iz levkocitov odvzete krvi izolirana genomska DNA. To je bilo storjeno z metodo izsoljevanja po Millerju. 3.3 VERIŽ A REAKCIJA S POLIMERAZO Verižna reakcija s polimerazo (angl.: Polymerase Chain Reaction - PCR) je visoko specifična in selektivna encimska metoda pomnoževanja dela DNA. Reakcijo, ki poteka po naslednjih stopnjah, katalizira termostabilna DNA polimeraza: 1. začetna denaturacija dvoverižne DNA (2 minuti pri temperaturi C); 2. ciklično pomnoževanje DNA; 3. končno podaljševanje verige DNA s termostabilno DNA polimerazo (5 15 minut pri temperaturi 72 C). Druga stopnja se ciklično ponavlja, ponavadi 25 do 35-krat, poteka pa prav tako v treh stopnjah: 1. denaturacija DNA med cikli (20 30 sekund pri C); 2. prileganje začetnih oligonukleotidov (30 60 sekund pri C); 3. podaljševanje verige DNA s termostabilno DNA polimerazo (45 sekund do 2 minuti pri 72 C). Po prvi denaturaciji dobimo enoverižno DNA, ki služi kot matrica za sintezo novih odsekov. Število kopij želenega odseka DNA po»n«ciklih znaša 2 n kopij. Po fazi končnega podaljševanja pri temperaturi 72 C (po zadnjem ciklu), sledi inkubacija DNA pri 4 C. 21

32 3.3.1 POM OŽEVA JE ODSEKA D A S PCR reakcijo smo pomnožili 80 bp dolg odsek DNA, ki je vseboval del introna 6 gena GSTM PRIPRAVA REAKCIJSKE ZMESI Ključ za uspešno pripravo reakcijske zmesi za PCR reakcijo je, da delamo v fizično ločenem prostoru z ustrezno stopnjo čistoče. V laboratoriju za PCR smo uporabljali čisto delovno haljo in rokavice brez smukca. Vse delovne pripomočke, kot so polavtomatske pipete in ves plastični pribor, ki smo ga uporabili v delovni komori, smo pred uporabo avtoklavirali, oziroma smo uporabili sterilne nastavke za pipete. Reakcijsko zmes smo pripravili v za to namenjeni delovni komori. Delovno površino komore smo pred začetkom dela očistili z 10 % etanolom, delovne pripomočke pa s 3 % hipokloritom (pripravljen z razredčevanjem iz 13 % natrijevega hipoklorita, NaOCl). Prav tako smo s 3 % hipokloritom obrisali škatlice z nastavki za pipete in steklen kozarec, v katerem smo imeli shranjene avtoklavirane plastične epruvete s pokrovčkom. Te pripomočke smo nato postavili v delovno komoro. Vse pripomočke, ki smo jih zložili v delovno komoro, smo nato za 30 minut izpostavili UV svetlobi. Delovne raztopine DNA smo shranjevali v hladilniku pri temperaturi 4 C, prečiščene vzorce DNA pa v zamrzovalniku pri -20 C. Reagente smo prav tako shranjevali v zamrzovalniku pri -20 C, pred uporabo smo jih odmrznili in dobro premešali. DNA polimerazo Taq smo vzeli iz zamrzovalnika tik pred uporabo in jo takoj po uporabi vrnili v zamrzovalnik. Pri sobni temperaturi se namreč aktivnost le-te manjša. Reakcijsko zmes smo najprej optimizirali. Po optimizaciji smo jo, brez dodatka DNA, pripravili po predpisu (Preglednica IX). Pripravili smo jo v 3 do 20-kratni količini, jo dobro premešali in v vsako plastično epruveto s pokrovčkom odpipetirali po 19,0 µl. Nato smo v vse posamezne epruvete, razen v eno, dodali 1,0 µl delovne raztopine vzorčne DNA. Epruveta brez DNA nam je služila kot slepi vzorec. Plastične epruvete s pokrovčkom smo predhodno ustrezno označili s številkami vzorcev. 22

33 Preglednica IX: Sestava reakcijske zmesi za pomnoževanje DNA odseka s PCR po optimizaciji. Reagent Volumen (µl) pufer 10x 2,0 µl dntp (2mM) 2,0 µl istosmerni začetni oligonukleotid 2,0 µl obratnosmerni začetni oligonukleotid 2,0 µl MgCl 2 2,4 µl avtoklavirana ultračista voda 8,5 µl AmpliTaq Gold polimeraza DNA 0,1 µl (5U/µL) DNA 1,0 µl Končni volumen zmesi 20,0 µl Zaradi izredno nesimetričnih vrhov pri genotipizaciji z nedenaturacijsko tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, smo za pomnoževanje štirih vzorcev namesto DNA polimeraze AmpliTaq Gold, uporabili DNA polimerazo Optimase Polymerase. DNA polimeraza Optimase Polymerase potrebuje za optimalno delovanje nekoliko drugačno reakcijsko zmes, namesto MgCl 2 pa smo uporabili MgSO 4 (Preglednica X): Preglednica X: Sestava reakcijske zmesi za pomnoževanje DNA odseka s PCR z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase. Reagent Volumen (µl) pufer 10x 2,0 µl dntp (2mM) 1,6 µl istosmerni začetni oligonukleotid 1,5 µl obratnosmerni začetni oligonukleotid 1,5 µl MgSO 4 1,2 µl avtoklavirana ultračista voda 10,8 µl Optimase Polymerase polimeraza DNA 0,4 µl DNA 1,0 µl Končni volumen zmesi 20,0 µl V Preglednici XI so zbrani podatki o začetnih oligonukleotidih. Med njimi je predvsem pomembna Tm, saj nam omogoča izbiro primerne temperature v fazi prileganja začetnih oligonukleotidov. 23

34 Preglednica XI: Zaporedje začetnih oligonukleotidov. delagg Ime začetnega oligonukleotida Polimorfizem GSTM3delAGG- F GSTM3delAGG- R Zaporedje [5' 3'] Dolžina [bp] Tm [ C] AAATTCTCATGGTTTGCCGG 20 58,4 AGTAGTAGCCTGCAGAGATAGA 22 60,8 Spodaj je prikazano zaporedje odseka DNA, ki smo ga pomnoževali s PCR reakcijo. Označeno je tudi mesto delecije treh baznih parov (krepko in podčrtano). Mesti, kjer se prilegata začetna oligonukleotida, sta osenčeni s sivo barvo. Z zeleno barvo je osenčeno mesto začetka introna 6 (G) in mesto konca introna 6 (T) gena GSTM3. 5' AAATTCTCATGGTTTGCCGGGGAAAAGGTAGGAAGAAGGGAAAAGA AGAGGATACTTCTCTATCTCTGCAGGCTACTACT POTEK REAKCIJE PCR Preden smo dali epruvete s pokrovčkom, ki so vsebovale reakcijsko zmes, v ciklični termostat, smo jih dobro premešali in centrifugirali. Tako smo zagotovili, da je bila vsa reakcijska zmes homogena in na dnu epruvete, kar omogoča optimalen potek reakcije. Za pomnoževanje vzorčne DNA smo uporabili temperaturni program (Preglednica XII), katerega smo določili s predhodno optimizacijo. Preglednica XII: Shema temperaturnega programa. Stopnja reakcije delagg T [ C] t Število ciklov Začetna denaturacija min Denaturacija 95 1 min Prileganje začetnih oligonukleotidov 56,5 30 s 38-krat Podaljševanje s Končno podaljševanje 72 8 min Prekinitev reakcije

35 Kot smo omenili že prej, smo za pomnoževanje nekaj vzorcev uporabili DNA polimerazo Optimase Polymerase. Le-ta, ne samo, da zahteva pripravo drugačne reakcijske zmesi, ampak zahteva tudi drugačen temperaturni program cikličnega termostata (Preglednica XIII): Preglednica XIII: Shema temperaturnega programa pri pomnoževanju z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase. Stopnja reakcije delagg T [ C] t Število ciklov Začetna denaturacija 95 5 min Denaturacija s Prileganje začetnih oligonukleotidov 56,7 30 s 30-krat Podaljševanje s Končno 72 5 min podaljševanje Prekinitev reakcije 8 3 Skozi celoten potek pomnoževanja DNA smo ogrevali tudi pokrov cikličnega termostata, saj smo tako preprečili izhlapevanje reakcijske zmesi in posledično izgubo produktov. Temperatura pokrova je bila ves čas konstantna, in sicer 110 C PREVERJANJE USPEŠNOSTI PCR REAKCIJE Po končani PCR reakciji smo preverili, ali so v vseh epruvetah nastali produkti, in ali so nastali v dovolj veliki meri. Prav tako smo preverili, če so v slepem vzorcu nastali produkti in tako ugotovili ali je morda prišlo do kontaminacije. To smo naredili s pomočjo agarozne gelske elektroforeze. Agarozna gelska elektroforeza je separacijska metoda, ki temelji na potovanju nabitih delcev v električnem polju. Ločevanje nukleinskih kislin poteka na osnovi velikosti, saj potujejo manjši fragmenti proti anodi hitreje kakor večji. Razmerje med velikostjo in nabojem je pri vseh nukleinskih kislinah enako (59). Po končani elektroforezi smo s pomočjo etidijevega bromida, ki smo ga predhodno vgradili v gel, detektirali DNA. Etidijev bromid je planarna molekula, ki se interkalira med bazne pare dvovijačne DNA. Interkalirane molekule pod UV svetlobo fluorescirajo veliko 25

36 močneje, kakor proste molekule, kar izkoristimo za detekcijo položaja lis (DNA) na gelu (60). Detekcijo smo izvajali na 2 % agaroznem gelu, sestavo katerega prikazuje Preglednica XIV. Ustrezno količino agaroze smo natehtali v erlenmajerico, dodali TAE pufer in pokrili z urnim steklom. Isto erlenmajerico smo postavili na tehtnico in jo starirali. Erlenmajerico smo segrevali v mikrovalovni pečici, in sicer trikrat po 30 sekund. Vmes smo vsebino dobro premešali, da se je stalila vsa agaroza. Erlenmajerico smo nato ponovno postavili na tehtnico in dodali ustrezno količino pufra, ki je izparel med segrevanjem. Vsebino smo spet premešali, nato pa erlenmajerico postavili na pult, da se je agaroza začela ohlajati. Medtem smo pripravili nosilec za gel (velikosti 10x15 cm), ki smo ga vpeli v podstavek in ga zatesnili iz obeh strani. Na nosilec smo postavili dva»glavnička«, od katerih vsak omogoča nastanek 30 žepkov v ohlajenem agaroznem gelu. Ko se je agaroza ohladila na približno 50 C, smo vanjo odpipetirali 6 µl etidijevega bromida, vsebino dobro premešali in vlili v nosilec. Preverili smo, da v ulitem gelu ni zračnih mehurčkov, če pa so bili prisotni, smo jih s spatulo odstranili. Ves postopek, od dodajanja etidijevega bromida do vlivanja, smo izvajali v digestoriju, na rokah pa smo imeli posebne rokavice, saj je etidijev bromid mutagen, potencialno pa tudi teratogen in kancerogen. Nosilec za gel smo nato prekrili s kartonom in tako preprečili razpadanje etidijevega bromida na svetlobi. Gel se je strdil v približno pol ure, nakar smo ga s skalpelom razrezali na dva enaka dela, ter ga do uporabe shranjevali v ustrezno označeni plastični vrečki v hladilniku pri 4 C. Preglednica XIV: Sestavine za pripravo 2 % agaroznega gela. Sestavina Količina agaroza 1,5 g TAE pufer 75 ml etidijev bromid 6 µl Gel smo pred nanosom PCR produktov namestili v elektroforezno kadičko in preverili, da je bil v celoti potopljen v TAE pufer. PCR produkte smo pred nanosom pomešali z nanašalnim pufrom, ki vsebuje glicerol in ksilencianol. Glicerol poveča gostoto vzorca in omogoči usedanje PCR produktov v žepek. Ksilencianol modro obarva vzorce, kar olajša nanos le-teh v žepke, poleg tega pa omogoča spremljanje hitrosti potovanja proti anodi. Na parafilm smo zato večkrat nanesli po 2 µl nanašalnega pufra, nato pa pred nanosom PCR 26

37 produkta le-tega pomešali z nanašalnim pufrom (vsak vzorec z 2 µl nanašalnega pufra). V prvi žepek smo nanesli 2 µl označevalca velikosti DNA fragmentov. V naslednje žepke pa smo zaporedoma nanašali po 2 µl produktov posameznih vzorcev. Nazadnje smo v žepek nanesli še 2 µl slepega vzorca. Elektroforeza je potekala 20 minut pri napetosti 90 V. Po končani elektroforezi smo gel prenesli v komoro z digitalnim fotoaparatom in ga fotografirali. Z ustrezno programsko opremo smo dokumentirali gel in na fotografiji določili položaj ter jakost lis REAGE TI I OPREMA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO REAGENTI: avtoklavirana ultračista voda (aparat Elga, Purelab Classic) 10x PCR pufer Gold Buffer MgCl 2, 25 mm, 1,5 ml (Applied Biosystem, Roche, ZDA); sestava: 150 mm Tris-HCl, 500 mm KCl, ph (pufer) = 8, pri T = 25 C raztopina dntp, 2mM; sestava: 10 µl vsake od raztopin datp, dgtp, dctp in dttp koncentracije 100 mm z dodatkom 460 µl avtoklavirane ultračiste vode (Perkin Elmer) 25 mm raztopina MgCl 2 (Applied Biosystem, Roche, ZDA) začetna oligonukleotida GSTM3delAGG-F in GSTM3delAGG-F, redčenje 1:20 (Qiagen OPERON, Nemčija) delovne raztopine DNA pripravljene z redčenjem izolata 1:20 DNA polimeraza AmpliTaq Gold, 5 U/µL (Applied Biosystem, Roche, ZDA) DNA polimeraza Optimase Polymerase, 2,5 U/µL (Transgenomic) APARATURE IN PRIBOR: avtoklav (Kambič laboratorijska oprema, Semič, Slovenija) 27

38 delovna komora za PCR (Biosan DNA/RNA UV-Cleaner UVC/T-M-AR, Latvija) polavtomatske pipete (0,1-2,5 µl; 2-20 µl; µl, Eppendorf, Nemčija) mikrocentrifuga (FVL-2400N Combi-Spin, Biosan, Latvija) ciklični termostat (MWG AG Biotech Primus 96 Plus, Nemčija) mikrocentrifuga Mikro-242 (Tehtnica, Železniki, Slovenija) škatlice z avtoklaviranimi nastavki za pipete (Sarstedt, Nemčija) sterilni nastavki za pipete s filtrom e.p.t.i.p.s., 10 µl (Eppendorf, Nemčija) avtoklavirane plastične epruvete s pokrovčkom, 0,5 in 1,5 ml (Eppendorf, Nemčija) brezprašne rokavice Safeskin PFE, velikost L (Kimberly-Clark) AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA REAGENTI: agaroza (Agarose for rutine use, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija) TAE pufer (Tris-acetat in EDTA), redčenje 1:50 ultračista voda (aparat Elga, Purelab Classic) etidijev bromid, 10 mg/ml (Sigma-Aldrich, GmbH, Steinheim, Nemčija) označevalec velikosti DNA; fragmenti velikosti 50, 150, 300, 500, 700 in 1000 bp (PCR Markers G316A, Promega Corp., ZDA) nanašalni pufer (glicerol in ksilencianol) APARATURE IN PRIBOR: elektronska tehtnica Exactan300 EB (Tehtnica, Železniki, Slovenija) 28

39 mikrovalovna pečica centrifuga Centric 150 (Tehtnica, Železniki, Slovenija) kadička za elektroforezo (BIO-RAD Wide mini-sub cell, ZDA) vir napetosti (BIO-RAD Power Pac Basic, 300 V/400 ma/75 W) komora z UV svetilko (λ = 302 nm) in z digitalnim fotoaparatom za slikanje gelov (UVI Tec) računalnik s programom UVI Photo (verzija 99.01s za operacijski sistem Windows) polavtomatska pipeta (2-20 µl, HTL, Poljska) erlenmajerica z ozkim vratom (200 ml) merilni valj (100 ml) urno steklo plastična žlica gumijasta prijemalka za vročo steklovino parafilm oranžne rokavice (Orange Nitrile 260, SHIELDSkin ) nosilec za gel z glavnički za tvorbo žepkov polavtomatska pipeta (2-20 µl) avtoklavirani nastavki za pipete (Sarstedt, Nemčija) 3.4 DE ATURACIJSKA TEKOČI SKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI Analiza nukleinskih kislin z denaturacijsko tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (DHPLC) temelji na reverznofazni ionsko-izmenjevalni tekočinski kromatografiji. 29

40 Nukleinske kisline lahko analiziramo pri različnih pogojih, ki se razlikujejo po spremembah temperature: popolnoma denaturacijski pogoji (75 80 C; ločitev na podlagi velikosti ali velikosti in zaporedja) delno denaturacijski pogoji (50 75 C; ločitev na podlagi velikosti in zaporedja) nedenaturacijski pogoji (45 50 C; ločitev na podlagi velikosti) Za detekcijo se uporabljajo UV detektorji (254 nm). Le-ti omogočijo, da zaznamo nukleinske kisline v koncentracijah, ki so višje od 0,5 ng na vrh. Za genotipizacijo s PCR reakcijo pomnoženih produktov smo uporabili nedenaturacijske pogoje, saj je metoda dovolj občutljiva, da loči fragmente, ki se razlikujejo za dolžino 3 bp. Uporabili smo sistem WAVE proizvajalca Transgenomic. Sistem je popolnoma avtomatiziran. Povezan je z računalnikom, na katerem nam ustrezna programska oprema (Navigator Software) omogoča nastavitve pogojev oziroma programa analize, spremljanje napredovanja analize in pregled rezultatov. VZOREC GRELEC Slika 7: Shematski prikaz aparature DHPLC sistema WAVE ; A pufer A, B pufer B, C raztopina za spiranje igle, D raztopina D. 30

41 Princip ločbe temelji na interakcijah negativno nabite molekule DNA s stacionarno fazo. Stacionarno fazo sestavljajo nepolarni hidrofobni materiali, med katere spadajo različni alkilirani polistiren-divinilbenzenski delci ali pa delci alkiliranega silikagela. V našem primeru so stacionarno fazo predstavljali C18-alkilirani polistiren-divinilbenzenski delci. Vezavo negativno nabite DNA na stacionarno fazo omogoča pozitivno nabiti reagent, trietilamonijev acetat (TEAA), ki se s pozitivno nabito amonijevo skupino veže na DNA, s hidrofobnimi etilnimi skupinami pa na stacionarno fazo (Slika 8). Interakcija med DNA in stacionarno fazo je tem močnejša, čim daljši je odsek DNA. Elucijo DNA dosežemo pri optimalni temperaturi s povečevanjem koncentracije organskega topila. Največkrat je to acetonitril. Slika 8:»TEAA omogoči vezavo negativno nabitih molekul DNA na C18-alkiliran polistirendivinilbenzenski delec.«3.4.1 PRIPRAVA MIKROTITRSKE PLOŠČE Pred nanosom vzorcev smo si zaradi lažjega sledenja le-teh pripravili preglednico, v katero smo zabeležili, kateremu vzorcu pripada katera vdolbinica. Ta ukrep je pomemben, saj tako preprečimo zamenjavo vzorcev ali pa napake pri pipetiranju. Prav tako smo preglednico potrebovali kasneje pri pripravi programa analize z ne-dhplc, kjer smo z vnosom pozicij vzorcev in njihovih številk poskrbeli, da so se rezultati analize ujemali s številko posameznega vzorca. 31

42 V vsako vdolbinico, razen v eno, smo nanesli po 12 µl vzorca. Prazna nam je služila za ekvilibracijo aparature DHPLC. Pri pripravi ploščice smo namesto enega vzorca nanesli 10 µl standardne raztopine odsekov DNA znanih dolžin (DNA sizing standard), ki nam omogoči določitev dolžine analiziranega odseka DNA. Ko smo končali s pripravo ploščice, smo jo pokrili z avtoklaviranim gumijastim pokrovom, centrifugirali dve minuti (tako smo poskrbeli, da na steni vdolbinic niso ostale kapljice s produktom), nato pa ploščico vstavili v nosilec za mikrotitrske ploščice v DHPLC aparaturi. Nosilec ves čas analize vzdržuje konstantno nizko temperaturo (T = 2-20 C). Tako je preprečeno izparevanje vzorcev in posledično povečana optimalnost analize PRIPRAVA APARATURE DHPLC ZA A ALIZO Preden smo začeli z analizo vzorcev, smo morali v skladu s standardnim operativnim postopkom pripraviti celoten sistem. Standardni operativni postopek (SOP) je priložen aparaturi DHPLC (priloži ga proizvajalec, v tem primeru Transgenomic). Sprva smo preverili, ali je količina pufrov zadostna za nemoten potek analize. Nato smo iz kolone odstranili morebitne mehurčke in sprali iglo, ki avtomatsko odpipetira vzorce iz vdolbinic. Preverili smo še nivo odpadnih tekočin v za to namenjenem zbiralniku. Nazadnje smo še ekvilibrirali kolono. To smo storili s 50 % pufra A in 50 % pufra B. Ekvilibracija je pri pretoku 0,9 ml/min trajala 30 minut. Med celotnim postopkom smo kontrolirali tlak v koloni POTEK A ALIZE Metodo smo po nastavitvah vseh parametrov v skladu s SOP morali še optimizirati. Tako smo zagotovili pogoje, potrebne za genotipizacijo naših vzorcev. Odločili smo se za analizo pod nedenaturacijskimi pogoji. Vzorce smo iz kolone eluirali z uporabo linearnega gradienta pufrov A in B. Začetno razmerje pufrov se v odvisnosti od časa spreminja, tako da se veča količina pufra B. To nam omogoča postopno eluiranje odsekov DNA, saj pufer B vsebuje acetonitril. Analiza se začne z avtomatskim injiciranjem produkta PCR reakcije v kolono, kjer sledi vezava odsekov DNA na stacionarno fazo preko TEAA mosta, nato pa gradientna elucija 32

43 iz kolone ob zveznem spreminjanju razmerja pufra A in pufra B (pretok 0,9 ml/min). Aparatura po končani eluciji avtomatsko poskrbi za čiščenje in ekvilibracijo kolone, ter jo tako pripravi za analizo naslednjega vzorca. Potek analize po posameznih stopnjah, čas analize in delež pufrov v posamezni stopnji so zbrani v Preglednici XV: Preglednica XV: Potek analize z metodo ne-dhplc. Stopnja analize Čas (min) Delež pufra A ( %) Delež pufra B ( %) Injiciranje Začetek gradienta Konec gradienta 5,5 51,9 48,1 Začetek čiščenja 5, Konec čiščenja 6, Začetek ekvilibracije 6, Konec ekvilibracije 6, Temperatura grelca je bila skozi celoten čas analize konstantna in je znašala 50 C. Volumen injiciranega vzorca je znašal 8 µl. Delež pufra B je med procesom elucije naraščal s hitrostjo 1,8 % na minuto. Odseke DNA smo po eluciji iz kolone detektirali z UV detektorjem pri valovni dolžini 254 nm. Pri tej valovni dolžini namreč DNA molekule absorbirajo UV svetlobo. Analiza enega vzorca je znašala približno 7,9 minut REAGE TI I OPREMA REAGENTI: WAVE DNA Sizing standard (DNA odseki dolžin 80, 102, 174, 257, 267, 298, 434, 458 in 587 bp; Transgenomic Inc, Omaha, ZDA) pufer A (WAVE Optimized Buffer A; 0,1 M TEAA, raztopina v vodi, ph = 7; Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija) pufer B (WAVE Optimized Buffer B; 0,1 M TEAA, raztopina v vodi, 25 % acetonitril, ph = 7 ; Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija) raztopina D (WAVE Optimized Solution D; 25 % voda, 75 % acetonitril; Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija) 33

44 raztopina za spiranje igel (WAVE Optimized Syringe Wash Solution; 96 % voda, 4 % acetonitril; Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija) Opozorilo: Pri rokovanju s pufri za DHPLC, predvsem s tistimi, ki vsebujejo acetonitril, nujno uporabljamo rokavice; acetonitril je namreč toksičen ob inhaliranju in stiku s kožo. APARATURE IN PRIBOR: DHPLC aparatura: WAVE MD System model 4000 Plus s separacijsko kolono DNASep ter s programsko opremo Navigator Software (Transgenomic Inc, Omaha, ZDA) polavtomatska pipeta (2-20 µl, Eppendorf, Nemčija) avtoklavirani nastavki za pipete (Sarstedt, Nemčija) mikrotitrske ploščice (96 vdolbinic; Thermo Scientific, VB) avtoklavirani gumijasti pokrovi za mikrotitrske ploščice brezprašne rokavice Safeskin PFE, velikost L (Kimberly-Clark) 3.5 SEKVE Č A A ALIZA PRIPRAVA VZORCEV Po končani genotipizaciji vzorcev smo se odločili, da dobljene rezultate preverimo s sekvenčno analizo. Med dobljenimi rezultati analize z ne-dhplc smo izbrali po enega za vsakega izmed treh genotipov, in sicer enega z genotipom +/+ (»wild type«, brez prisotnega polimorfizma; vzorec št. 730), enega za genotip -/+ (heterozigot; vzorec št. 686) in enega z genotipom -/- (mutiran homozigot; vzorec št. 983). Izbrane vzorce smo še enkrat pomnožili pod enakimi pogoji s pomočjo PCR reakcije, razlika je bila le ta, da je tokratni končni volumen reakcijske zmesi v epruveti s pokrovom znašal 50 µl. Uspešnost PCR reakcije smo preverili na agaroznem gelu. Preden smo vzorce poslali na sekvenciranje, smo jih morali ustrezno očistiti, saj je le tako mogoča točna določitev zaporedja nukleotidov v DNA. Po PCR reakciji ostanejo poleg 34

45 produktov v epruveti še nečistote, kot so začetni oligonukleotidi, dntp, soli, DNA polimeraza in genomska DNA. Pri čiščenju smo si pomagali z že vnaprej pripravljenim kompletom za čiščenje PCR produktov (SIGMA GenElute PCR Clean-up Kit). Komplet vsebuje kolono iz silikagela, epruveto s pokrovom in raztopine, ki jih uporabimo v različnih stopnjah procesa čiščenja (Slika 9). Najprej smo kolono vstavili v epruveto s pokrovom. Nato smo kolono sprali z raztopino, ki omogoči vezavo PCR produktov na kolono. Nato smo nanesli zmes, ki je vsebovala naše PCR produkte, zatem pa iz kolone, z za to pripravljeno raztopino, sprali nečistote. Na koncu smo kolono prestavili v čisto epruveto s pokrovom in sprali čiste PCR produkte s priloženo raztopino za eluiranje. Očiščen PCR produkt vsakega od vzorcev smo razdelili v dve epruveti, in sicer smo v vsako najprej odpipetirali po 20 µl produkta. V prvo smo nato dodali 4 µl istosmernega začetnega oligonukleotida (GSTM3delAGG-F), v drugo pa 4 µl obratnosmernega začetnega oligonukleotida (GSTM3delAGG-R). Slika 9: Potek čiščenja produktov PCR reakcije IZVEDBA SEKVE Č E A ALIZE Vzorce smo na sekvenčno analizo poslali v tujino, natančneje v podjetje MWG Biotech (Ebersberg, Nemčija). Sekvenciranje so izvedli v okviru njihovih poslovnih aktivnosti z imenom Value Read Service. Uporabili so visoko avtomatizirano metodo sekvenciranja po Sangerju, kjer nukleotidno zaporedje določijo s pomočjo fluorescentno označenih dideoksiribonukleozid trifosfatov (ddntp). Zaradi boljših rezultatov in lažje interpretacije le-teh, so vsak vzorec analizirali dvakrat. Prvič so uporabili istosmerni začetni oligonukleotid GSTM3delAGG-F, drugič pa obratnosmerni začetni oligonukleotid GSTM3delAGG-R. 35

46 3.6 STATISTIČ E METODE Najprej smo s pomočjo Fisherjevega eksaktnega testa testirali genotipske in alelne frekvence. S pomočjo dobljenih rezultatov smo nato izračunali Hardy-Weinbergovo ravnotežje. Za statistično analizo dobljenih rezultatov smo uporabili računalniški program SPSS 16.0 for Windows, proizvajalca SPSS Inc., ZDA. V programu smo uporabili različne statistične teste (Preglednica XVI): Preglednica XVI: Pregled uporabljenih statističnih testov. Statistični test Kolmogorov-Smirnov test One-way ANOVA (analiza variance) Scheffe (Post Hoc) Bonferroni (Post Hoc) LSD (Post Hoc) Games-Howell (Post Hoc) Kruskal-Wallis ANCOVA (analiza kovariance) amen statističnega testa testiranje normalnosti porazdelitve posameznih spremenljivk testiranje povezanosti/vpliva delagg na izbrane parametre (normalna porazdelitev) testiranje povezanosti/vpliva posameznega genotipa na izbrane parametre (normalna porazdelitev) testiranje povezanosti/vpliva posameznega genotipa na izbrane parametre (normalna porazdelitev) testiranje povezanosti/vpliva posameznega genotipa na izbrane parametre (normalna porazdelitev) testiranje povezanosti/vpliva posameznega genotipa na izbrane parametre (normalna porazdelitev) testiranje povezanosti/vpliva delagg na izbrane parametre (nenormalna porazdelitev) testiranje povezanosti/vpliva posameznega genotipa na izbrane parametre z vključitvijo kovariable (normalna porazdelitev) 36

47 4 REZULTATI I RAZPRAVA 4.1 OPTIMIZACIJA POGOJEV VERIŽ E REAKCIJE S POLIMERAZO Optimalne pogoje pomnoževanja izbranega odseka DNA s PCR reakcijo smo določili eksperimentalno. Količino reagentov v reakcijski zmesi smo določili na podlagi dosedanjih izkušenj pri delu s PCR. Pogoje smo določili glede na dolžino odseka DNA, ki smo ga pomnoževali in glede na Tm začetnih oligonukleotidov. Načrtovanja priprave reakcijske zmesi za PCR reakcijo smo se lotili sistematično, saj je metoda precej občutljiva. Najprej smo pri podjetju Qiagen OPERON naročili primerne začetne oligonukleotide. Izbrali smo jih tako, da smo se čim bolj izognili nespecifičnemu prileganju na enoverižno DNA in tako nespecifičnim produktom. Istosmerni začetni oligonukleotid (GSTM3delAGG-F) je imel nukleotidno zaporedje 5'-AAATTCTCATGGTTTGCCGG-3', dolg je bil 20 bp in imel Tm pri 58,4 C (delež GC je znašal 45 %). Obratnosmerni začetni oligonukleotid (GSTM3delAGG-R) pa je imel nukleotidno zaporedje 5'-AGTAGTAGCCTGCAGAGATAGA-3', dolg je bil 22 bp s Tm pri 60,8 C (delež GC je znašal 46 %). Proizvajalec priporoča za optimalne rezultate analize z DHPLC uporabo posebne DNA polimeraze (Optimase Polymerase ), ki je kompatibilna s sistemom WAVE. Nekompatibilne DNA polimeraze lahko namreč povzročijo poškodbe separacijske kolone DHPLC. Ker je Optimase Polymerase precej draga, smo uporabili cenejšo DNA polimerazo (AmpliTaq Gold ), ki je prav tako kompatibilna s sistemom WAVE. A na žalost izbrana polimeraza naredi več napak pri samem pomnoževanju. Pri cenejši različici DNA polimeraze smo vztrajali, ker napake pri pomnoževanju niso motile naše analize, saj smo ločevali odseke DNA glede na dolžino pri nedenaturacijskih pogojih. Tudi ostale komponente reakcijske zmesi smo izbrali tako, da so bile primerne za delovanje DNA polimeraze in obenem niso povzročile poškodb na separacijski koloni DHPLC. 37

48 Pri procesu optimizacije PCR smo se osredotočili na štiri parametre: koncentracija MgCl 2 temperatura prileganja začetnih oligonukleotidov število ciklov pomnoževanja čas trajanja posameznih stopenj reakcije Najprej smo izvedli PCR reakcijo s tremi različnimi koncentracijami MgCl 2 v reakcijski zmesi (1, 2 in 3 mm). Ugotovili smo, da je najbolj optimalna koncentracija 3 mm (Slika 10). Naslednji korak je bila izbira primerne temperature prileganja začetnih oligonukleotidov. Izvedli smo PCR reakcijo pri 56,5 C, nato pa še pri 57,5 C. Ugotovili smo, da je za prileganje boljša temperatura 56,5 C. Nato smo število ciklov iz začetnih 35 povečali na 38 in dobili boljše rezultate. Nazadnje smo skrajšali še čas podaljševanja (znotraj cikla) iz 30 na 20 sekund, s čimer smo metodo še dodatno izboljšali. Tako smo prišli do primernih pogojev za pomnoževanje odsekov DNA (Preglednica XVII). Rezultat pomnoževanja pri optimiziranih pogojih je prikazan na Sliki 11. Pri teh pogojih smo pomnožili 400 vzorcev. Kot je razvidno iz gelov (Sliki 10 in 11), niti pri optimizaciji ni prihajalo do nastanka stranskih produktov, kar nam je le še olajšalo optimizacijo. Preglednica XVII: Pregled pogojev PCR reakcije z označenimi mesti sprememb parametrov (podčrtane vrednosti so se izkazali za primernejše). Stopnja reakcije delagg T [ C] t Število ciklov Začetna denaturacija min Denaturacija 95 1 min Prileganje začetnih 56,5 57,5 30 s 35-krat oligonukleotidov 38-krat Podaljševanje s 3 Končno 72 8 min podaljševanje Prekinitev reakcije 8 38

49 150 bp 50 bp Slika 10: Optimizacija koncentracije MgCl 2 ; s številkami 1, 2 in 3 so označene koncentracije MgCl 2 v mm,»sl«predstavlja slepi vzorec,»m«pa DNA markerje. Slika 11: PCR produkti po optimizaciji metode; 38 ciklov, temperatura prileganja začetnih oligonukleotidov 56,5 C, čas podaljševanja verige DNA pri 72 C znaša 20 sekund (M DNA marker, SL slepi vzorec, številke vzorcev). Uspešnost PCR reakcije smo preverjali z agarozno gelsko elektroforezo. Elektroforeza je trajala 20 minut pri napetosti 90 V. Glede na to, da smo pričakovali samo en produkt, elektroforeze nismo optimizirali. Ravnali smo se kar po dosedanjih izkušnjah z delom z elektroforezo. Lise na agaroznem gelu po končani ločbi niso bile vselej enako močno obarvane. Razloga za to sta lahko dva. Prvi in najbolj verjeten je, da ni vedno nastala enaka količina PCR produkta, saj je bila kakovost izhodne DNA zelo variabilna. Drugi možen razlog pa je način in kakovost priprave gela oziroma kakovost etidijevega bromida, ki smo ga vgradili v gel. Glede na to, da je ne-dhplc izredno občutljiva metoda in zazna že zelo majhne količine DNA, smo kot pozitivne reakcije označili vse tiste, pri katerih je bila po slikanju gela s prostim očesom vidna lisa. Vzorce, kjer lisa ni bila vidna, smo ponovno pomnožili s PCR reakcijo. Pri pripravi teh vzorcev smo naredili manjšo modifikacijo, in sicer smo v reakcijsko zmes namesto 1 µl odpipetirali 1,5 µl genomske DNA. Razen pri treh vzorcih, je bila pri vseh ostalih v drugo reakcija pozitivna. Nekaj časa smo imeli težave pri sami pripravi reakcijske zmesi, saj smo po elektroforezi ugotovili, da imamo prisotne produkte tudi v slepem vzorcu. To je bil znak, da je prišlo 39

50 tekom priprave reakcijske zmesi do kontaminacije in da so nastali produkti neuporabni. Sprva smo preverili, ali je način dela pravilen. Nato smo zamenjali vse reagente in podaljšali čas, ko je bila v delovni komori prižgana UV luč. Ker ti ukrepi niso zadostovali, smo bili prisiljeni popolnoma očistiti cel laboratorij, pripraviti novo avtoklavirano ultračisto vodo, ponovno avtoklavirati nastavke za pipete in tudi same polavtomatske pipete, ponovno pa smo zamenjali tudi reagente. Ta drastičen ukrep je zadostoval, da slepi vzorec ni več kazal znakov kontaminacije z DNA in da so dobljeni produkti bili primerni za nadaljnjo analizo. 4.2 OPTIMIZACIJA POGOJEV A ALIZE Z METODO DHPLC I REZULTATI A ALIZE Pri delu z metodo DHPLC imamo na voljo analizo pri različnih pogojih, in sicer pri popolnoma denaturacijskih, delno denaturacijskih ali nedenaturacijskih. Prvi korak je bil torej izbira ustreznih pogojev za analizo polimorfizma delagg v genu GSTM3. Odločili smo se za nedenaturacijske pogoje, saj je metoda dovolj občutljiva, da zazna spremembo dolžine odseka DNA za 3 bp. Analiza poteka v več korakih. Najprej pride do avtomatskega injiciranja vzorca v kolono, sledi faza gradientnega eluiranja, za njo pride na vrsto čiščenje kolone, na koncu pa še ekvilibracija kolone. Med temi stopnjami analize smo največ pozornosti posvetili gradientni eluciji iz kolone in posledično razmerju pufrov A in B (glej stran 33), ter hitrosti in deležu naraščanja pufra B. Pufer B vsebuje acetonitril, ki omogoča prekinitev mosta med DNA in stacionarno fazo, ki ga omogoča prisotnost TEAA. Preizkusili smo pet različnih možnosti (Preglednica XVIII), med katerimi smo izbrali najboljšo glede na uspešnost ločbe in čas trajanja analize, saj so reagenti za izvedbo ne-dhplc dokaj dragi (Preglednica XIX). 40

51 Preglednica XVIII: Prikaz različnih deležev pufrov A in B pri optimizaciji metode ne-dhplc. Stopnja Čas (min) Delež pufra A ( %) Delež pufra B ( %) Ime M1 M2 M3 M4 M1 M2 M3 M4 M1 M2 M3 M4 Injiciranje Začetek 1 0,5 1 0, Konec 15,4 3,5 9,1 7 39,8 51,5 39,7 43,7 60,2 48,5 60,3 56,3 Začetek 15,5 3,6 9,2 7, Konec 16 4,1 9,7 7, Začetek 16,1 4,2 9,8 7, Konec 16,5 4,6 10,2 8, Preglednica XIX: Optimiziran program analize z ne-dhplc (M5). Stopnja analize Čas (min) Delež pufra A ( %) Delež pufra B ( %) Injiciranje Začetek gradienta Konec gradienta 5,5 51,9 48,1 Začetek čiščenja 5, Konec čiščenja 6, Začetek ekvilibracije 6, Konec ekvilibracije 6, Pri primerjanju vseh petih programov smo ugotovili, da je čas injiciranja najbolj optimalen, če traja 1 minuto. Naraščanje deleža pufra B je bilo najboljše pri hitrosti 1,8 % na minuto, in sicer od deleža v zmesi 40 % do 48,1 % GE OTIPIZACIJA VZORCEV Genotip smo uspešno določili pri 397 od skupno 400 vzorcev (Priloga 1). Posamezne genotipe smo določili na podlagi retencijskega časa in oblike vrhov. Ker so bili vrhovi, v nasprotju s pričakovanjem, multipli, smo pri homozigotih primerjali retencijski čas glavnih vrhov, pri heterozigotih pa pozicijo štirih ali več vrhov. Med vzorci smo dokazali prisotnost treh genotipov. Prvi je bil homozigot +/+ (odsek DNA dolžine 80 bp; 2 3 vrhovi), z retencijskimi časi (t R ) okoli 4,95 minut (prvi vrh), okoli 5,07 minut (glavni vrh) in okoli 5,20 minut (tretji vrh). Drugi je bil heterozigot -/+ (odseka DNA dolžine 77 in 80 bp; 7 8 vrhov). Pri heterozigotu je bilo težko določiti dejanski retencijski čas, saj je bilo 41

52 vrhov preveč. Tretji genotip je bil homozigot -/- (odsek DNA dolžine 77 bp; 2 vrhova), z retencijskima časoma (t R ) okrog 4,50 minut (prvi vrh) in okrog 5,60 minut (drugi vrh). Zaradi multiplih vrhov smo domnevali, da DNA polimeraza AmpliTaq Gold pri pomnoževanju dela napako. Zato smo PCR reakcijo za genotipa +/+ in -/+ izvedli še s predpisano DNA polimerazo (Optimase Polymerase ), nato pa smo produkte analizirali z metodo ne-dhplc. S primerjavo kromatografskih vrhov smo potrdili domnevo, da je za pojav velikega števila pikov odgovorna DNA polimeraza AmpliTaq Gold (Sliki 12 in 13). Razlogov za napako pri pomnoževanju je lahko več. Možno je, da je že samo prileganje začetnih oligonukleotidov nepravilno, ali pa je uporabljena DNA polimeraza AmpliTaq Gold premalo specifična. Obenem DNA polimeraza AmpliTaq Gold nima sposobnosti kontrolnega branja, kar ji preprečuje, da bi odpravljala napake pri sintezi DNA odsekov. Problem prav tako predstavlja izredno kratek odsek DNA, saj je napaka pri pomnoževanju pri rezultatih analize z ne-dhplc še toliko bolj očitna. Domnevali bi lahko tudi, da je vir napake okvara sistema WAVE. A smo z analizo PCR produkta, ki smo ga pomnožili s pomočjo DNA polimeraze Optimase Polymerase, dobili kromatografske vrhove pravilnih oblik. Prav tako smo pri uporabi raztopine odsekov DNA standardnih velikosti dobili skoraj popolnoma simetrične kromatografske vrhove, kar je bil zadosten dokaz, da je aparatura DHPLC v brezhibnem stanju. Obenem pa smo še enkrat potrdili, da so razlog za obliko vrhov slabši PCR produkti. Tri izbrane vzorce, vsakega z drugačnim genotipom, smo poslali na sekvenciranje. Na podlagi zaporedja nukleotidov smo želeli ovreči še zadnjo senco dvoma o pravilnosti metode genotipiziranja. B A Slika 12: Primerjava kromatografskih vrhov genotipa +/+ pomnoženega z AmpliTaq Gold polimerazo (A; dva vrhova) in z Optimase Polymerase (B; en vrh). 42

53 A B Slika 13: Primerjava kromatografskih vrhov genotipa -/+ pomnoženega z AmpliTaq Gold polimerazo (A; osem vrhov) in z Optimase Polymerase (B; dva vrhova). Kromatografski vrhovi vzorcev so imeli različne intenzitete. Razlog za to je bila različna koncentracija DNA v vzorcih. Prav tako smo pri retencijskem času okrog 3,8 minut opazili nepričakovan vrh (Slika 14). Vzrok za pojav tega vrha je lahko napaka Taq polimeraze med PCR reakcijo ali pa nespecifično pripenjanje nukleotida A na odsek DNA (61). Prav tako je lahko nepričakovan vrh posledica zapolnjene kolone, do katere je prišlo zaradi predhodnih, že izvedenih analiz vzorcev. V takem primeru je potrebno kolono dodatno očistiti z glicerolom. Ker pa v našem primeru pojav tega vrha ne moti analize, se za to dodatno čiščenje nismo odločili. A B C nepričakovan vrh Slika 14: Kromatografski vrhovi treh genotipov; A homozigot -/- (dva vrhova), B heterozigot -/+ (osem vrhov), C homozigot -/- (trije vrhovi). 43

54 Poleg nepričakovanega vrha smo opazili pojav še dveh vrhov. Prvi, ki se nasploh pojavi pri analizi, predstavlja nezreagirane začetne oligonukleotide in dntp. Zadnji prisoten vrh pri analizi, pa predstavlja spiranje kolone z acetonitrilom (61) (Slika 15). A Slika 15: vrh A - nezreagirani začetni oligonukleotidi; vrh B - acetonitril B Rezultati analize vseh 400 vzorcev so potrdili prisotnost 286 genotipov +/+, 104 genotipe -/+ in 7 genotipov -/-. Treh vzorcev nam zaradi neuspešne reakcije PCR ni uspelo genotipizirati PO OVLJIVOST A ALIZE Ugotovili smo, da je zagotoviti popolno ponovljivost analize z metodo ne-dhplc zelo težko. Kljub temu, da smo pri vsaki analizi nastavili enake pogoje in spremljali, da je bil tlak v koloni ves čas konstanten, smo opazili manjše premike kromatografskih vrhov. Vrhovi so se premikali tako v levo, kakor v desno. Zato smo skušali analize narediti čim bolj povezano, in sicer v zaporednih dneh. Pred menjavo mikrotitrske ploščice smo vsakokrat očistili kolono in tako zagotovili neoviran pretok skoznjo. Prav tako smo, da smo se izognili napakam pri določanju dolžin PCR odsekov, pred vsako analizo 95 vzorcev uporabili standard, ki vsebuje odseke DNA z znanimi dolžinami. Le-ta nam je omogočil primerjavo vrhov in tako določitev dolžine analiziranih vzorcev. Razlog, zakaj je prišlo do premikov kromatografskih vrhov je verjetno sestava pufrov A in B. Oba namreč vsebujeta hlapne sestavine, ki sčasoma izparijo. Posledica tega je sprememba sestave pufra, kar vpliva na retencijski čas in na premik posameznih pikov. Naslednja možnost pa je kontaminacija pufrov pri sami postavitvi sistema, kar ima seveda 44

55 prav tako vpliv na potek analize. Proizvajalec priporoča zaradi navedenih razlogov uporabo enega pufra le določen (kratek) čas. Ker pa so pufri izredno dragi, si iz ekonomskega stališča tega nismo mogli privoščiti. Premik kromatografskih vrhov je nenazadnje lahko posledica nihanja tlaka v koloni oziroma posedanja le-te zaradi visokih tlakov. 4.3 SEKVE Č A A ALIZA Ker smo pri analizi dobili nepričakovano veliko število vrhov, smo želeli naše domneve o genotipih potrditi s pomočjo sekvenciranja. Vzorce smo za sekvenciranje pripravili z ustreznim paketom za čiščenje PCR produktov (SIGMA GenElute PCR Clean-up Kit), nato pa smo jih poslali v Nemčijo k podjetju MWG, ki je za nas določilo zaporedje nukleotidov v odseku DNA s pomočjo visoko avtomatizirane metode sekvenciranja po Sangerju (Slike 16, 17 in 18). Slika 16: Sekvenciranje vzorca 730 z istosmernim začetnim oligonukleotidom (genotip +/+). Slika 17: Sekvenciranje vzorca 686 z istosmernim začetnim oligonukleotidom (genotip -/+). Slika 18: Sekvenciranje vzorca 983 z istosmernim začetnim oligonukleotidom (genotip -/-); s puščico je označeno mesto delecije AGG. Sekvenciranje je potrdilo rezultate analize z metodo ne-dhplc. Vzorec 686 je bil potrjen kot heterozigot -/+, vzorec 730 kot homozigot +/+, vzorec 983 pa kot homozigot -/-. 45