Bubanovi} Ivan Najman Stevo Pop-Trajkovi} Zoran IMUNOKONTRACEPCIJA

Transcription

1 Bubanovi} Ivan Najman Stevo Pop-Trajkovi} Zoran IMUNOKONTRACEPCIJA

2 Bubanovi} Ivan Najman Stevo Pop-Trajkovi} Zoran IMUNOKONTRACEPCIJA 2

3 IMUNOKONTRACEPCIJA Bubanovi} Ivan Najman Stevo Pop-Trajkovi} Zoran Recenzenti: Prof. dr. Kamenov Borislav Prof. dr. Miladinovi} Petar Izdava~: Mrlje{ d.o.o. Beograd Za izdava~a: Radojko Mrlje{ Lektura: Radmila Savi} Tira`: 600 [tampa: Mrlje{, Beograd Kneza Milo{a 9/1 CIP - Katalogizacija u publikaciji Narodna biblioteka Srbije, Beograd BUBANOVI], Ivan Imunokontracepcija / Bubanovi} Ivan, Najman Stevo, Pop-Trajkovi} Zoran. - Beograd : Mrlje{, 2002 (*** : ***) str. : ilustr. ; 24 cm Tira`: Bibliografija: str. 98. ISBN Bubanovi}, Ivan 2. Najman Stevo 3. Pop-Trajkovi} Zoran a) Kontracepcija - Imunolo{ki aspekt EAN

4 PREDGOVOR Imunokontracepcija predstavlja jednu od najmla ih grana imunologije i pored ~injenice da istra`ivanja na ovom polju traju poslednjih sto godina. Revolucionarni napredak imunokontracepcionih procedura omogu}ila su nova otkri}a na polju genetike, molekularne biologije i imunologije. Prve kontracepcione vakcine su za antigensku osnovu imale cele }elije ili ~ak ekstrakte tkiva i organa, tako da nije moglo biti re~i o precizno definisanim antigenima vakcine. Tek u poslednjih dvadeset godina u koncept imunokontracepcije uvedene su vakcine bazirane na jednom antigenu ili ~ak antigenskom epitopu, {to je omogu}ilo veliki napredak u ovoj oblasti. Ograni~enja klasi~nog pristupa u re{avanju problema kontrole ra anja ti~u se komfora, cene, efikasnosti, mogu}ih komplikacija i mogu}nosti neselektivne primene na ve}u grupu `ivotinja i ljudi. Klasi~na kontracepciona sredstva je prakti~no nemogu}e primeniti na velikoj populaciji ljudi ili `ivotinja bez anga`ovanja ogromnog broja stru~nih lica koja bi sprovodila i nadzirala ~itavu proceduru. Kontracepcione vakcine u tom smislu donose pravu revoluciju. Ova mogu}nost je naro~ito dobila na zna~aju razvojem tehnologije rekombinantne DNK i otvaranjem mogu}nosti kreiranja mikroorganizama koji bi bili nosioci kontracepcione mikroorganizmi kori{}eni kao antigenska osnova kontracepcione vakcine pru`aju mogu}nost epidemijske imunizacije ~itavih populacija `ivotinja, dok epidemijski model primene kontracepcione vakcine na ljudima daje ovim vakcinama zastra{uju}e karakteristike biolo{kog oru`ja. Na{i motivi za pisanjem ove publikacije bazirani su na velikom zna~aju kontracepcionih vakcina, koje je realno o~ekivati u budu}nosti, i ~injenici da su dostignu}a u ovoj oblasti u na{oj 4

5 literaturi neadekvatno ispra}ena. S obzirom da se radi o prili~no kompleksnoj i obimnoj materiji, prilikom pisanja ove publikacije ograni~ili smo se na opisivanje najva`nijih imunskih mehanizama na kojima se temelje mehanizmi dejstava kontracepcionih vakcina, kao i na najva`nije rezultate istra`ivanja razli~itih antigena sa imunokontracepcionim potencijalom. U nameri da prika`emo samo najbitnije momente problematike imunokontracepcije, po{li smo od pretpostavke da je ve}ina ~italaca upoznata sa osnovama imunologije i reprodukcije sisara, tako da smo odustali od detaljnih opisa mehanizama koji se mogu na}i u literaturi iz op{te imunologije, embriologije, genetike i reprodukcije. Od ovakvog pristupa prezentaciji materije odustali smo samo u poglavlju o imunskoj toleranciji, autoimunosti i infertilitetu, zbog ~injenice da su mehanizmi akcije imunokontracepcionih vakcina veoma sli~ni autoimunskim procesima, kao i zbog naj~e{}ih i najte`ih komplikacija imunokontracepcionih procedura koje se pojavljuju u obliku autoimunskih procesa na gonadama i drugim organima. ^itaoci koji bi `eleli da upotpune svoja znanja iz podru~ja imunokontracepcije preporu~ujemo autore kao {to su: Naz, Gupta, Moudgal, Primakoff, Lea, Afzalpurkar, Umashashi, Radhakantha, Moodbidri, Kenneth, Koyama, Barlow, Govinda itd. Autori ibubanovic@yahoo.com 5

6 PREDGOVOR... 3 I. UVOD Imunokontracepcija Tradicionalne i kontracepcione vakcine Potencijalni antigeni kontracepcionih vakcina Vakcine sa pre i postfertilizacionim efektima Imunokontracepcioni tretman `ena i/ili mu{karaca Kontracepcione procedure pasivnom imunizacijom Ekolo{ki aspekti imunokontracepcije Diseminiraju}e metode imunokontracepcije II. IMUNSKA TOLERANCIJA, ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA I IMUNOKONTRACEPCIJA Imunska tolerancija (IT) Tolerancije indukovana interakcijom nezrelog imunskog sistema i antigena Tolerancija zasnovana na deleciji i/ili anergiji klonova perifernih limfocita Bystander tolerancija Mehanizmi imunske tolerancije prema antigenima mu{kog genitalnog trakta Imunoglobulini i barijera krv-testis Autoimunska reakcija na spermatozoide Antispermatozoidna antitela (ASA) "Prirodna" antispermatozoidna antitela Uloga ASA u neplodnosti Udru`enost vazektomije i autoimunosti Citokini i funkcija testisa

7 III. ANTIGENI SA IMUNOKONTRACEPCIONIM POTENCIJALOM Adhezioni molekuli spermatozoida i ooleme Put razvoja kontracepcione vakcine Standardi za izbor kontracepcionog antigena Tehnologija rekombinantne DNK Primena tehnologije rdnk u medicini Imunokontracepcioni antigeni mu{kog genitalnog trakta kda epididimalni spermatozoidni faktor (26ESF) Proteinski nosa~ riboflavina (RCP) Inhibin semene plazme (SPI) Laktat dehidrogenaza-4 (LDH-C4) Porodica ze~jih spermatozoidnih antigena (RSA) Spermatozoidni izoenzim hijaluronidaze (PH-20) Spermatozoidni antigen SP Spermatozoidni antigen SP Humani spermatozoidni antigen (HS-63 antigen) Fertilizacioni antigen-1 (FA-1) Fertilizacioni antigen-2 (FA-2) Humani spermatozoidni protein (SOB-2) Epididimalni protein pacova (DE) F10 protein kda humani spermatozoidni antigen (80HSA) Spermatozoidni YLP-12 protein Hormoni kao kontracepcioni antigeni Gonadotropin rilizing hormon (GnRH) FSH i -subjedinica FSH ( -FSH) Horionski gonadotropin Kontracepcioni antigeni oocite i prate}eg kompleks Antigeni zone pelucide Antigeni ZP i autoimunska ovarijalna bolest Glikoprotein zone pelucide-1 (ZP-1) Glikoprotein zone pelucide-2 (ZP-2) Glikoprotein zone pelucide-3 (ZP-3) Glikoprotein zone pelucide-4 (ZP-4) Antigen oocitne membrane (OM antigen) IV. LITERATURA

8 I. UVOD 1. IMUNOKONTRACEPCIJA Kontrola ra anja je jedna od va`nijih tekovina moderne civilizacije, bilo da se radi o individualnoj ili populacionoj kontroli prira{taja. Metode koje su danas u upotrebi uklju~uju oralne steroidne kontraceptive, dugo-deluju}e steroidne implante, kondome, dijafragme, cervikalne kape, vaginalne kondome, spermicidne gelove i pene, intrauterine ulo{ke i najdrasti~niji oblik kontrole ra anja - ve{- ta~ki prekid trudno}e. Imunokontracepcija se bitno razlikuje od svih navedenih kontracepcionih sredstava u skoro svim elementima koji odre uju osobine i kvalitet neke kontracepcione procedure. Osnovni koncept na kome se temelji vizija imunokontracepcionih metoda i sredstava je imunizacija mu{karaca i/ili `ena (putem inokulacije ili oralnim putem) odre enim antigenom, koja rezultuje pokretanjem produkcije specifi~nih antitela i/ili celularnih imunskih mehanizama sa posledi~nim reme}enjem reproduktivnih procesa i uspostavljanjem privremene infertilnosti, bez razvijanja zna~ajnijih komplikacija i ne- `eljenih dejstava. Carl Djerassi, koji je od mnogih autora progla{en "ocem anti-baby" pilula, o ideji imunokontracepcije je rekao: "Imunokontracepcija predstavlja najrevolucionarniji napredak u celokupnoj problematici kontracepcije. Ovaj pristup radikalno menja na{e shvatanje kontracepcije i kontrole ra anja kod ljudi i `ivotinja". 1 Ideja o regulaciji fertilnosti sisara preko imunskih mehanizama je stara blizu 100 godina. Pioniri moderne imunologije Karl Landersteiner i Eli Metchnikoff prvi su naslutili vezu izme u imunskih mehanizama i fertilnosti eksperimentalnih `ivotinja. Ovi autori 8

9 su potvrdili mogu}nost generisanja antispermatozoidnih citotoksi~nih antitela imunizacijom eksperimentalnih `ivotinja spermatozoidima. 2 Po~etkom tridesetih godina pro{loga veka u Francuskoj i SAD patentirane su prve kontracepcione vakcine, koje su u stvari bile sme{a ispranih spermatozoida i Freundovog adjuvansa. Mehanizmi kontracepcionog efekta ove relativno uspe{ne vakcine temeljili su se na senzibilizaciji mu{karaca ili `ena na antigene spermatozoida, produkciji citotoksi~nih i/ili imobili{u}ih antispermatozoidnih antitela (ASA) i uni{tavanju i imobilizaciji spermatozoida, pa ~ak i ometanju procesa spermatogeneze. 2,3,4 Bez obzira na relativnu efikasnost opisane procedure i ~este komplikacije u obliku pokretanja mehanizama autoimunskog orhitisa i epididimitisa, osnovni principi funkcionisanja modernih kontracepcionih vakcina su skoro identi~ni. Imunokontracepcija se najjednostavnije mo`e definisati kao metoda kontrole ra anja koja koristi razli~ite imunske mehanizme u cilju prevencije trudno}e. Imunski mehanizmi, za koje se mo`e re}i da su u su{tini autoimunske prirode, mogu biti usmereni prema produktima i faktorima bilo koje faze mu{kog i `enskog reproduktivnog ciklusa. Kontracepciona imunizacija se mo`e izvesti antigenima kao {to su: (i) faktori kontrole i regulisanja produkcije gameta, (ii) faktori maturacije, kretanja i transporta gameta, (iii) membranski i transmembranski proteini gameta, (iv) faktori interakcije gameta (interakcija spermatozoid-zona pelucida, spermatozoid-oolema, reakcija fuzije gameta), (v) faktori transporta blastociste, (vi) faktori apozicije i nidacije, (vii) antigeni ranog konceptusa, (viii) hormonski derivati posteljice (hcg, progesteron), (ix) hormoni hipofize, hipotalamusa i gonada. 5 Istina je da imunokontracepcija jo{ uvek nije na{la svoje pravo mesto kao metoda kontrole reprodukcije ljudi, me utim u zemljama kao {to je Australija, Novi Zeland, SAD i Kanada, ova metoda dobija na zna~aju u kontroli populacija doma}ih i naro~ito divljih `ivotinja. Mnogi biolozi navode dobre rezultate kontrole razmno`avanja kontracepcionom vakcinacijom divljih `ivotinja kao {to su razne vrste jelena, ze~eva, divljih konja, divljih svinja i sl. Duckworth i sar. 6 navode iskustva u primeni kontracepcione vakcine kod novozelandske, endemske vrste Trichosurus vulpecula. Navedeni autori su primenili veoma jednostavnu i jeftinu kontracepcionu vakcinu u cilju populacione kontrole navedene vrste, koja se bazirala na sme{i spermatozoida Trichosurus vulpecula i Freunodovog adjuvansa. Mu`jaci i `enke su imunizovani subkutanom injekcijom (5X10 7 spermatozoida + Freundov adjuvans) u dva 9

10 navrata u intervalu od 4 do 12 nedelja. Imunizaciona procedura je proizvela antispermatozoidni odgovor kod 91,6% imunizovanih `ivotinja, dok je procenat infertilnih `ivotinja u grupi vakcinisanih iznosio 87,5%. 6 Nedavno je u SAD sprovedena studija imunokontracepcione vakcinacije belorepog jelena (Odocoileus virginianus) ~ija je brojnost ugrozila ravnote`u ekolo{kih sistema. Vakcinacija `ivotinja je sprovedena oralnim putem, {to je daleko jednostavnije i jeftinije od inokulacione vakcinacije injekcionim strelicama ispaljivanim iz vatrenog oru`ja. Oko `ivotinja je vakcinisano oralnim putem, dok je inokulacionom metodom vakcinisano oko jelena. Rezultati vezani za postignuti serumski titar antitela i procenat infertilnih `ivotinja kod oralno vakcinisanih jelena nisu se zna~ajno razlikovali u odnosu na `ivotinje vakcinisane inokulacionom metodom. 7 Jedna druga studija koja je sprovedena na `enkama populacije belorepog jelena imunizacijom pzp vakcinom (antigeni zone pelucide svinje), potvrdila je visok imunokontracepcioni u~inak ove procedure. Kontracepcioni u~inak vakcinacije je iznosio 89%, sa postepenim uspostavljanjem fertilnosti imunizovanih `enki u intervalu od 1 do 4 godine, uz mogu}nost efikasne revakcinacije i odr`avanja niske fertilnosti revakcinisanih `enki. Nakon {estogodi{njeg pra}enja vakcinisane populacije jelena, utvr eno je da je prira{taj u vakcinisanoj populaciji manji za 76% u odnosu na kontrolnu populaciju belorepog jelena. 5 Kontracepcione vakcine su primenjivane i na ljudima, ali uglavnom na dobrovoljcima u okviru istra`iva~kih projekata. Dosada- {nja saznanja prikupljena na osnovu projekata vezanih za divlje i doma}e `ivotinje, kao i saznanja dobijena ispitivanjem kontracepcionih vakcina na ljudima, govore u prilog velike efikasnosti ove procedure, relativno niske frekvencije komplikacija, velike pouzdanosti i reverzibilnosti, kao i niske cene izvo enja procedure. 2. TRADICIONALNE I KONTRACEPCIONE VAKCINE Tradicionalno shvatanje vakcine i vakcinacije, kako u stru- ~nim tako i u krugovima laika, uglavnom je bazirano na znanjima i iskustvima povezanim sa vakcinama protiv zaraznih bolesti. Izme u ostalog, ovo je posledica {iroko rasprostranjene svesti o efikasnosti, neophodnosti i korisnosti vakcinacije protiv zaraznih bolesti. 10

11 Me utim, kontracepciona vakcinacija se u nekim bitnim elementima razlikuje od tradicionalnih vakcinacionih procedura. (a) Su{tinska razlika izme u pomenutih imunizacionih procedura je sadr`ana u samim ciljevima koji se posti`u imunizacijom. Cilj vakcinacija protiv zaraznih bolesti je prevencija obolevanja ljudi i `ivotinja, suzbijanje epidemija i eradikacija zaraznih bolesti, dok je cilj kontracepcionih imunizacionih procedura kontrola prira{taja ljudi i `ivotinja na nivou jedinke, porodice i populacije. (b) Tradicionalne vakcine su bazirane na `ivim ili mrtvim uzro~nicima zaraznih bolesti ili njihovim toksinima, u svakom slu~aju bazirane su na stranim antigenima. Za razliku od tradicionalnih vakcina, kontracepcione vakcine su bazirane na antigenima spermatozoida, jajne }elije, konceptusa ili hormonima. S obzirom da se radi o tzv. self antigenima, odnosno o molekulima ~ije je prisustvo u organizmu fiziolo{ko, njihova imunogeni~nost je znatno manja od imunogeni~nosti antigena tradicionalnih vakcina. Zbog imunske tolerancije na self antigene imunizacija ovim antigenima je naj~e{}e ote`ana i zahteva specifi~niju imunizacionu proceduru kao i dodatnu obradu vakcinacionog antigena. (c) Ireverzibilna senzibilizacija na vakcinacioni antigen je jedna od najpo`eljnijih karakteristika tradicionalnih vakcina, tako da veliki broj ovih vakcina ostavlja trajni (do`ivotni) imunitet. Nasuprot ovome, mogu}nost desenzibilizacije i reverzibilnost fertilnosti u imunokontracepcionom smislu je veoma po`eljna karakteristika kontracepcione vakcine. Jedan od va`nijih faktora na koji se obra}a pa- `nja prilikom dizajniranja kontracepcionih vakcina je mogu}nost spontanog ili aktivnog poni{tavanja efekata vakcinacije POTENCIJALNI ANTIGENI KONTRACEPCIONIH VAKCINA Antigeni koji bi mogli da budu osnova kontracepcionih vakcina su svi molekuli proteinske ili glikoproteinske strukture koji imaju klju~nu ulogu u reproduktivnom procesu i ~ije blokiranje ili neutralisanje imunskim mehanizmima dovodi do infertiliteta. Danas je poznat veliki broj hormona, }elijskih receptora i proteinskih faktora maturacije i transporta gameta koji bi mogli imati ulogu antigenske osnove kontracepcione vakcine. Ovi antigeni se mogu klasifikovati u nekoliko najzna~ajnijih grupa: 11

12 (1) Antigeni epididimisa, semenih kesica i prostate koji u~estvuju u procesu maturacije spermatozoida. (2) Membranski proteini spermatozoida. (3) Hormoni koji u~estvuju u reproduktivnom procesu; GnRH, LH, FSH, progesteron, hcg i sl. (4) Membranski proteini ooleme, zone pelucide i verovatno korone radijate. (5) Antigeni trofoblasta i embriona VAKCINE SA PRE I POSTFERTILIZACIONIM EFEKTIMA Mehanizmi akcije kontracepcionih vakcina mogu biti bazirani na prefertilizacionim i postfertilizacionim efektima. Iz ove ~injenice proizilazi podela imunokontracepcionih vakcina na prefertilizacione i postfertilizacione. Strogo govore}i, sve vakcine ~iji su efekti postfertilizacioni nije mogu}e okarakterisati kao kontracepcione vakcine, zbog toga {to se mehanizmi njihove akcije ne zasnivaju na spre- ~avanju oplo enja. Ta~nije re~eno, mehanizmi dejstva tzv. postfertilizacionih vakcina temelje se na njihovoj abortogenoj aktivnosti. Bez obzira na ovu terminolo{ku nelogi~nost, ve}ina autora prihvata podelu kontracepcionih vakcina na prefertilizacione i postfertilizacione. Prefertilizacione vakcine su uglavnom bazirane na antigenima spematozoida, zone pelucide (ZP) ili jajne }elije. Mehanizmi akcije prefertilizacionih vakcina zasnivani su na inhibiciji maturacije, imobilizaciji, aglutinaciji i citolizi spermatozoida ili blokiranju spermatozoidnih, zonalnih i oocitnih receptora. Postfertilizacione vakcine su bazirane na antigenima ranog konceptusa, trofoblasta, embriona, postelji~nih hormona i sl. Kontracepcioni efekti posfertilizacionih vakcina su isklju~ivo abortogeni, bilo da spre~avaju nidaciju ili indukuju poba~aj tek nidiranog konceptusa (tabela 1) IMUNOKONTRACEPCIONI I/ILI MU[KARACA Paralelno sa izu~avanjem i dizajniranjem kontracepcionih vakcina namenjenih samo mu{karcima ili samo `enama odvija se proces dizajniranja univerzalnih kontracepcionih vakcina. Me utim, ve}ina autora smatra da su najinteresantnije vakcine koje bi bilo mogu}e primenjivati na `enama. Razlozi za ovakvo mi{ljenje nisu 12

13 samo tradicionalne prirode ve} i objektivne. S obzirom na dana{nji stil `ivota, `ene su znatno zainteresovanije za kontracepciju od mu{karaca i ose}aju se sigurnije ako "klju~ reprodukcije dr`e u svojim rukama". U kontracepcionom smislu kod `ena postoji mogu}nost imunizacije na najve}i broj antigena, pa ~ak i na antigene spermatozoida. Sa aspekta komplikacija kontracepcione imunizacije najprihvatljivijim se ~ini model imunizacije `ena antigenima koji poti~u iz mu{kog genitalnog trakta kao {to su spermatozoidni antigeni, jer je u tom slu~aju mogu}nost javljanja komplikacija imunizacije u vidu pokretanja autoimunskih mehanizama samo teoretska. Nasuprot ovome, sama priroda reproduktivnog procesa uskratila je mu{karce za mogu}nost kontracepcione imunizacije antigenima postfertilizacionih vakcina, antigenima ZP i oocite. Mogu}- nosti koje preostaju za potencijalnu kontracepcionu vakcinu namenjenu mu{karcima su vakcine bazirane na antigenima (faktorima) maturacije spermatozoida, membranskim antigenima spermatozoida i hormonima kao {to su FSH i LH (tabela 1). 5 Tabela 1. Poreklo kontracepcionog antigena, mogu}nost imunizacije mu{karaca i/ili `ena i vreme delovanja kontracepcionih mehanizama u odnosu na fertilizaciju Poreklo antigena Imunizacija Imunizacija Prefertilizacioni Postfertilizacioni mu{karaca `ena efekti efekti GnRH LH FSH hcg Progesteron Kumulus ooforus Zona pelucida Oolema Jajovod - + +/- +/- Prostata Semene kesice Epididimis Spermatozoidi Trofoblast Embrion

14 6. KONTRACEPCIONE PROCEDURE PASIVNOM IMUNIZACIJOM Osim aktivne imunizacije u cilju postizanja kontracepcionih efekata, danas se sve vi{e istra`uje mogu}nost pasivne imunizacije antitelima. Za razliku od aktivne imunizacije kada se imunizacija posti`e inokulacijom antigena, pasivna kontracepciona imunizacija se zasniva na administriranju specifi~nih tzv. antifertilizacionih antitela, koja su naj~e{}e monoklonska (MAb) i dobijena su industrijskim putem. Antigen ~ije se inaktivisanje posti`e pasivnom imunizacijom mo`e da bude bilo koji od pomenutih antigena sa kontracepcionim potencijalima (antigeni ZP, spermatozoida, oocite, hcg i sl.). U odnosu na proceduru aktivne imunizacije (vakcinacije), kontracepciona procedura pasivne imunizacije ima svoje dobre i lo{e strane. Najve}a prednost pasivne imunizacije je u strogom selekcionisanju ciljnog antigena ili ~ak epitopa antigena, administriranju monospecifi~nih antitela, maloj mogu}nosti kolateralnih o{te}enja tkiva i izostanku aktivacije }elijskog imuniteta. Kontrola reverzibilnosti ostvarenog infertiliteta je u slu~aju pasivne imunizacije sigurna i potpuna. S obzirom da je aktivnost administriranih antitela ograni~ena u vremenskom smislu, padom titra antitela ispod odre ene granice, fertilnost imunizovane jedinke je potpuna. Druga mogu}nost za ponovno uspostavljanje fertilnosti imunizovane jedinke sastoji se u tretmanu specifi~nim anti-antitelima (npr. anti-anti-zp antitela), koja mogu neutralisati antifertilizaciona antitela (u ovom slu~aju anti-zp antitela) i dovesti do ponovnog uspostavljanja fertilnosti. Najve}e primedbe koje se odnose na pasivnu imunizacionu kontracepciju, odnose se na znatno manji komfor ove procedure u odnosu na proceduru aktivne imunizacije. Naime, zbog potrebe za stalnim ponavljanjem pasivne imunizacije (svaka 2 do 3 meseca) i zbog neophodnosti permanentnog odr`avanja odre enog titra antifertilizacionih antitela, smatra se da imunizacija kontracepcionim vakcinama pru`a znatno vi{e udobnosti, odnosno obavezu revakcinacije svakih 6 do 12 pa i vi{e meseci. Osim toga, kontracepciona procedura pasivne imunizacije ne pru`a mogu}nosti masovne ili epidemijske imunizacije doma}ih i divljih `ivotinja. Ograni~enja u tom smislu su vi{estruka i odnose se na nemogu}nost primene rekombinantnih mikroorganizama i nemogu}nost oralne administracije antifertilizacionih, odnosno kontracepcionih antitela. Sa aspekta pouzdanosti, prednost se tako e daje proceduri aktivne imunizacije. Ovo se obja{njava mogu}no{}u imunizacije pa- 14

15 sivno imunizovanih jedinki na sama kontracepciona antitela, odnosno na mogu}nost produkcije anti-antifertilizacionih antitela (npr. antianti-zp antitela), koja bi umanjila u~inak pasivne imunizacije i ugrozila kontracepcione efekte i pouzdanost same procedure EKOLO[KI ASPEKTI IMUNOKONTRACEPCIJE U pojedinim regionima sveta postoji problem kontrole veli~ine populacija odre enih vrsta ki~menjaka. Nekontrolisana ekspanzija nekih vrsta divljih `ivotinja ne samo da ugro`ava poljoprivredna dobra, naselja i ljude, ve} i mogu}nost opstanka drugih vrsta i stabilnost ekosistema. Klasi~ne metode kontrole brojnosti populacija divljih `ivotinja hvatanjem u zamke, odstrelom, trovanjem i uvo enjem novih predatora u ekosistem, pokazale su se sporim, neefikasnim, neselektivnim, skupim i {tetnim za druge vrste ~iji je opstanak ve} ugro`en. Za razliku od klasi~nih metoda populacione kontrole imunokontracepcione procedure u ovaj problem uvode neke nove kvalitete kao {to su: (i) izbegavanje nehumanih postupaka kao {to je odstrel, trovanje i hvatanje u zamke, (ii) izbegavanje neselektivnosti u proceduri, {to je slu~aj sa kori{}enjem zatrovane hrane i uvo enjem nove predatorske vrste, (iii) kori{}enjem vakcina koje izazivaju ireverzibilni infertilitet, efekti na prira{taj populacije su relativno dugoro~ni, (iv) niska cena procedure koja se posti`e kori{- }enjem vakcina baziranih na kontagioznim rekombinantnim mikroorganizmima koji se u populaciji {ire po tipu epidemija, (v) minimalni uticaj na stabilnost ekosistema, (vi) relativno brzi efekti na reprodukcioni kapacitet populacije DISEMINIRAJU]E METODE IMUNOKONTRACEPCIJE Pod diseminiraju}im metodama imunokontracepcije podrazumevaju se sve one procedure bazirane na vakcinama sa `ivim rekombinantnim mikroorganizmima koji eksprimiraju kontracepcioni antigen, tako da se nakon imunizacije ili bolje re~eno inficiranja odre enog broja jedinki, mikroorganizam pro{iri i imunizuje ~itavu populaciju. Ovaj vid imunokontracepcije se jo{ naziva i vektorska imunokontracepcija i naro~ito je pogodan za primenu na populacijama sitnih glodara kao {to su mi{evi i pacovi. Pored prednosti koje pru`a vektorska imunokontracepcija kao {to su efikasnost, jednostavnost i niska cena procedure, postoje odre ene opasnosti i 15

16 potencijalne komplikacije koje ova metoda nosi sa sobom. U tom smislu naj~e{}e se pominje mogu}nost nekontrolisanog {irenja vektora na druge populacije tretirane vrste, nemogu}nosti vremenskog ograni~enja delovanja vektora, mutiranje vektora i njegovo {irenje na druge vrste i ljude ili ~ak zloupotreba imunokontracepcionih vektora i njihova primena u vojne svrhe. 8 16

17 IMUNOKONTRACEPCIONI TRETMAN AKTIVNA IM UNIZACIJA ORALNOM ILI INOKULACIONOM VAKCINOM PASIVNA IM UNIZACIJA INOKULACIJOM ANTITELA ANTIGENI MU[KOG GENITALNOG TRAKTA HORMONSKI ANTIGENI ANTIGENI KONCEPTUSA ANTIGENI OOCITE I PRATE]EG KOMPLEKSA IMUNIZACIJA MU@JAKA IM [ema 1. Mogu}nosti aktivne i pasivne imunizacije i upotrebe razli~itih antigena kao osnove kontracepcione vakcine. 17

18 II. IMUNSKA TOLERANCIJA, ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA I IMUNOKONTRACEPCIJA S obzirom da antigeni kontracepcionih vakcina predstavljaju self antigene, odnosno antigene ~ije je prisustvo i uloga u procesu reprodukcije fiziolo{ka pojava, mehanizmi delovanja kontracepcionih vakcina su veoma sli~ni mehanizmima koji se mogu sresti kod autoimunskih oboljenja organa reproduktivnog sistema. U tom smislu, mnogi autori navode pokretanje autoimunskih procesa na genitalnim organima jedinki imunizovanih kontracepcionim vakcinama kao najte`u i relativno ~estu komplikaciju imunokontracepcionih procedura. S druge strane, kod mnogih oblika infertiliteta dokazano je postojanje autoimunske komponente, koja u manjoj ili ve}oj meri doprinosi odr`avanju stanja infertilnosti. Iz navedenih razloga, radi lak{eg razumevanja mehanizama akcije imunokontracepcionih vakcina i razvijanja mogu}ih komplikacija posle imunizacije, neophodno je poznavati osnovne mehanizme: (i) prepoznavanja self i nonself antigena i uspostavljanja raznih oblika imunske tolerancije kao {to je prenatalna specifi~na imunska tolerancija, (ii) imunskog sistema mukoza, (iii) razvijanja autoimunskih procesa, (iv) dihotomije Th 1 i Th 2 tipa imunskog odgovora, njihov me usobni odnos i mogu}nosti modulacije Th 1 /Th 2 tipa imunskog odgovora IMUNSKA TOLERANCIJA (IT) Jedna od osnovnih odlika imunskog sistema je njegova sposobnost prepoznavanja vlastitih i stranih molekula odnosno antigena. Sistem prepoznavanja vlastitih antigena temelji se na nekoliko razli~itih mehanizama uspostavljanja imunske tolerancije, tako 18

19 da glavnu karakteristiku IT predstavlja sekundarna areaktivnost imunskog sistema na odre eni antigen. Mehanizmi IT uglavnom spre~avaju razvijanje imunske reakcije na vlastite antigene, {to ne isklju~uje mogu}nost uspostavljanja IT na strane antigene, gde dolaze u obzir ~ak i patogeni mikrobi. Sposobnost imunskog sistema da odgovori na odre eni antigen pre svega zavisi od: (i) stepena zrelosti imunskog sistema, (ii) puta uno{enja antigena, (iii) prirode antigena, (iv) koncentracije antigena i (v) trenutnog stanja reaktivnosti u kome se nalazi imunski sistem. 9,10,11 (i) Stepen zrelosti imunskog sistema su{tinski odre uje njegovu sposobnost za reagovanje na odre eni antigen. Imunski sistem fetusa se nalazi u fazi "u~enja" antigena koje }e u kasnijim fazama `ivota prepoznavati kao vlastite, {to zna~i da interakcija fetalnog imunskog sistema i bilo kojeg antigena dovodi do uspostavljanja IT i verovatno do`ivotne specifi~ne areaktivnosti u odnosu na kriti~ni antigen. (ii) Put uno{enja antigena je veoma bitan za tip, intenzitet i brzinu imunske reakcije. Uno{enje antigena subkutanom ili intraperitonealnom injekcijom rezultuje pokretanjem veoma intenzivnog imunskog odgovora, dok internalizacija antigena i.v. injekcijom ili preko sluzoko`a (respiratorna, digestivna, genitalna) dovodi do veoma slabog imunskog odgovora, dominacije Th 2 tipa odgovora ili uspostavljanja IT na kriti~ni antigen. (iii) Struktura i prostorna konformacija molekula uti~u na imunogeni~nost antigena. Molekuli koji imaju linearnu strukturu baziranu na jednoli~nom ponavljanju monomera kao {to je to slu~aj kod polisaharida, indukuju veoma slab imunski odgovor. Molekuli proteinske i glikoproteinske globularne strukture eksprimiraju veliki broj razli~itih epitopa i spadaju u veoma imunogeni~ne molekule koji indukuju jak imunski odgovor. Imunogeni~nost nekog molekula je direktno proporcionalna te`ini uspostavljanja IT na kriti~ni antigen. Interesantno je da se IT uspostavlja samo na "povr{inske" epitope globularnih molekula koji su pristupa~ni imunokompetentnim }elijama, dok je tolerancija na epitope globularnih molekula koji su sakriveni u "dubini" molekula vrlo slabo izra`ena ili ~ak potpuno odsutna. Ovaj fenomen je iskori{}en u slu~aju dizajniranja kontracepcione vakcine bazirane na molekulu nosa~a riboflavina, kada je globularni molekul riboflavina specijalnim tehnikama prakti~no "razvu~en" u linearni molekul {to je dovelo do otkrivanja velikog 19

20 broja epitopa i pove}anja imunogeni~nosti molekula nosa~a riboflavina. (iv) Koncentracija antigena mo`e da predstavlja jedan od odlu~uju}ih faktora pokretanja imunske reakcije prema kriti~nom antigenu ili uspostavljanja IT. Niske i visoke doze antigena rezultuju razvijanjem IT, dok doze antigena iz optimalne zone rezultuju adekvatnim imunskim odgovorom. Zona opitimalne doze antigena je dosta {iroka i na primeru imunizacije mi{eva gove im serumskim albuminima (BSA) iznosi od 10-6 do 1g albumina. Imunizacija mi{eva BSA dozama van optimalnog intervala rezultuje uspostavljanjem niskodozne ili visokodozne IT (grafikon 1). 200 % Intenzitet imunskog odgovora u relativnim jedinicama u odnosu na kontrolu. Optimalni odgovor 100 Niskodozna IT Kontrola Visokodozna IT 0 BSA(g) Grafikon 1. Intenzitet imunskog odgovora mi{a na BSA antigen u relativnim jedinicama zavisi od imunizacione doze antigena (v) Stanje reaktivnosti imunskog sistema (trudno}a, maligne bolesti, virusne infekcije, hormonski poreme}aji ili hormonska terapija) u momentu imunizacije je jedan od najmanje predvidljivih faktora koji zna~ajno odre uju tip, intenzitet i brzinu imunske reakcije. Trudno}a zna~ajno menja obrazac odvijanja ve}ine imunskih reakcija zbog dominacije Th 2 tipa odgovora u trudno}i. Imunizacija trudnice rezultuje znatno slabijim i prete`no humoralnim imunskim odgovorom u odnosu na imunizaciju negravidne kontrole. Sli~an obrazac imunoreaktivnosti postoji i u slu~ajevima kada se imunski sistem bori protiv malignog procesa ili kada je pod uticajem kortikosteroidnih preparata. Me utim, imunski sistem jedinki kod kojih postoji aktivna virusna infekcija odgovaraju na imunizaciju zna~ajno intenzivnijim imunskim odgovorom koji je prete`no celularnog tipa (Th 1 tip) u odnosu na kontrolu koja nije zara`ena virusom. 20

21 Fenomen zavisnosti intenziteta i tipa imunske reakcije na tre}i antigen od trenutnog stanja reaktivnosti imunskog sistema, obja{njava se specifi~nim citokinskim miljeom koji se razvija neposredno pre imunizacije kriti~nim antigenom. Trudno}a, maligne bolesti i kortikosteroidni preparati razvijaju specifi~ni citokinski milje u kome dominiraju citokini iz Th 2 grupe (IL-4, IL-6, IL-10, TGF- ), tako da je imunska reakcija koja se inicira na novoprispeli antigen prete`no Th 2 tipa, a u pojedinim situacijama i potpuno odsutna. Nasuprot ovome, virusne infekcije razvijaju citokinski milje u kome dominiraju citokini Th 1 grupe (IL-2, IL-12, IL-18, IFN-, TNF) {to imunsku reakciju na novoprispeli antigen ~ini intenzivnijom i sa dominiraju}om celularnom komponentom. 9,10,11 Ove zakonitosti mogu biti od zna~aja zbog ~injenice da su `eljeni efekti imunokontracepcione vakcinacije uglavnom posledica aktivacije Th 2 komponente imunskog odgovora odnosno produkcije antifertilizacionih antitela, dok aktivacija Th 1 komponente imunskog odgovora nakon kontracepcione vakcinacije dovodi do pokretanja autoimunskih procesa naj~e{}e na gonadama. Na sada{njem nivou poznavanja problematike IT identifikovano je nekoliko mehanizama koji bi mogli u~estvovati u inicijaciji i odr`avanju IT: (i) tolerancija indukovana interakcijom antigena i nezrelog imunskog sistema, (ii) tolerancija zasnovana na deleciji i/ili anergiji specifi~nog klona T limfocita perifernih limfati~nih organa adultnog organizma i (iii) tzv. bystander tolerancija koja je specifi~na za situacije kada se antigen unosi preko mukoza, ~ija specifi~na citokinska aktivnost doprinosi razvijanju periferne tolerancije. 9,10, TOLERANCIJA INDUKOVANA INTERAKCIJOM ANTIGENA I NEZRELOG IMUNSKOG SISTEMA Imunska tolerancija indukovana interakcijom nezrelog imunskog sistema i antigena prvi put je nau~no potvr ena (1945 g.) na primeru trudno}e goveda sa dizigotnim blizancima. Fetusi iz ove trudno}e imali su zajedni~ku (najverovatnije fuzionisanu) posteljicu sa verifikovanom interfetalnom cirkulacijom. Istra`ivanja koja su kasnije sprovedena na teladima iz navedenih trudno}a, pokazala su da unakrsna transplantacija ko`e izme u teladi ne rezultuje odbacivanjem transplantata, {to je definitivno potvrdilo mogu}nost uspostavljanja IT na strane antigene (u ovom slu~aju aloantigene) za vreme intrauterinog `ivota. Nekoliko godina kasnije Burnet i Fenner su promovisali teoretsko obja{njenje ovog fenomena iz koga je proi- 21

22 zi{la tzv. teorija timusne klonske selekcije, koja predstavlja jedan od temeljnih postulata moderne imunologije. Potpunu nau~nu verifikaciju fenomena tolerancije nezrelog imunskog sistema dali su Medawar, Billingham i Brent. Njihovi eksperimenti su bazirani na kori{}enju singenih `ivotinja koje su jo{ intrauterino tretirane alogenim lienalnim limfocitima. Transplantacija ko`e sa davaoca lienalnih limfocita na odrasle mi{eve koji su intrauterino tretirani lienalnim limfocitima nije pra}ena odbacivanjem transplantata, dok je kontrolna grupa mi{eva to ~inila sa uspehom. Ozra~ivanjem mi{eva koji ne odbacuju alotransplantat i njihovom rekonstrukcijom singenim limfocitima postignuto je da ove `ivotinje efikasno odbacuju alotransplantat ko`e, {to je definitivno potvrdilo IT uspostavljenu za vreme intrauterinog `ivota ({ema 2). 9,10,11 Inokulacija lienalnih limfocita soja B fetusima soja A Mi{evi soja B Transplantacija ko`e Mi{evi soja A Limfocitima tretirani fetusi 4 meseci posle okota Mi{evi soja C Mi{evi soja A Transplantacija ko`e Ozra~ivanje i rekonstrukcija limfocitima soja Transplantacija ko`e Odbacivanje transplantata C Mi{evi soja A Tolerancija transplantata B Odbacivanje transplantata B i C Mi{evi soja C Mi{evi soja B [ema 2. Tolerancija indukovana intrauterinim tretmanom mi{eva alogenim limfocitima i poni{tavanje efekata tolerancije zra~enjem i rekonstrukcijom singenim limfocitima 22

23 Za vreme intrauterinog `ivota, a kod glodarskih vrsta i za vreme ranog postnatalnog perioda, defini{u se klonovi T i B }elija sa specifi~nim antigenskim receptorima. T }elije razvijaju membransku formu receptora specifi~nih za razne antigene i MHC antigene, dok B }elije na svojoj membrani eksprimiraju specifi~ne imunoglobuline, koji u svojoj solubilnoj formi u stvari predstavljaju antitela. T i B }elije eksprimiraju antigenske receptore odnosno imunoglobuline specifi~ne samo za odre ene antigene, odnosno jedan od njihovih epitopa. Skup T ili B }elija koje su specifi~ne za strogo odre eni antigenski epitop, odnosno skup }elija adaptivnog imuniteta koje eksprimiraju iste antigenske receptore ili imunoglobuline naziva se T ili B }elijski klon. 9,10,11 S obzirom da su u embrionalnoj i ranoj fetalnoj fazi prisutni klonovi T limfocita najrazli~itije specifi~nosti, nametnulo se pitanje za{tite samih embrionalnih, fetalnih i kasnije adultnih tkiva od potencijalne autoimunske reakcije. Naime, u embrionalnoj (i ranoj fetalnoj kod glodarskih vrsta) fazi razvoja dokazano je prisustvo limfocitnih klonova specifi~nih za self antigene, dok u kasnoj fetalnoj fazi ovi klonovi nisu mogli biti dokazani ili su dokazani u veoma malom broju. Re{enje ove zagonetke pru`io je Burnet svojom teorijom timusne klonske selekcije. Prema ovoj teoriji klonovi limfocita koji su specifi~ni za self antigene podle`u procesu propadanja u timusu, koji je najverovatnije posredovan apoptoti~kim mehanizmima. Mnogo je manje verovatna pretpostavka da klonovi limfocita koji su specifi~ni za self antigene do`ivotno ostaju zarobljeni u timusu iza tzv. krvno-timusne barijere. 9,10,11 Burnetova teorija klonske selekcije dokazana je na mnogim eksperimentalnim modelima i u najrazli~itijim eksperimentalnim uslovima. Veliki broj autora uspeo je u poku{ajima uspostavljanja specifi~ne imunske tolerancije na razli~ite antigene jednostavnim inokulacionim tretmanom fetusa kriti~nim antigenom. Specifi~na imunska tolerancija ostvarena na ovaj na~in je potpuna, trajna i u zavisnosti od antigena naj~e{}e ireverzibilna. Ve}ina imunologa smatra da je smisao ovakvog odnosa nezrelog (embrionalnog i fetalnog) imunskog sistema i self antigena potpuno logi~an i jasan. Naime, imunski sistem u razvoju stvara klonove limfocita najrazli~itije specifi~nosti radi efikasnije odbrane od mikroba i tumora u postnatalnom `ivotu, a da se naknadno doga a selekcionisanje i uklanjanje klonova specifi~nih za self antigene u cilju spre~avanja razvijanja autoimunskih procesa. Teorija timusne klonske selekcije u potpunosti obja{njava ve}inu fenomena u vezi uspostavljanja specifi~ne imun- 23

24 ske tolerancije na self antigene koji se javljaju za vreme prenatalnog perioda, ali ovom teorijom nije mogu}e objasniti fenomene specifi~ne tolerancije u vezi sa tkivima i organima i njihovim antigenima koji se razvijaju, diferenciraju ili pojavljuju u postnatalnoj i adultnoj fazi razvi}a. Mnogi organi i tkiva nastavljaju i dovr{avaju svoj razvoj i sazrevanje posle ro enja, tako da je ovaj proces neminovno povezan sa pojavljivanjem novih, imunskom sistemu nepoznatih antigena. S obzirom da je proces klonske selekcije i u~enja imunskog sistema da raspoznaje self antigene zavr{en jo{ u prenatalnom periodu, organi kao {to su CNS, testisi, kornea, timus i neke endokrine `lezde izolovani su tzv. krvnim barijerama. Poznato je da ove barijere ne propu{taju imunokompetentne }elije, imunoglobuline i komplement. Dobro je dokumentovano postojanje krvno-mo`dane, timusne, testisne barijere, kao i posledice naru{avanja ovih barijera. O{te}enje krvno-mo`dane i drugih barijera dovodi do razvijanja autoimunskih oboljenja, kao {to je autoimunski encefalitis, orhitis i sl. 9,10, TOLERANCIJA ZASNOVANA NA DELECIJI I/ILI ANERGIJI KLONOVA PERIFERNIH LIMFOCITA Ovaj vid tolerancije se mo`e sresti u slu~ajevima transplantacije organa kada je transplantat idealno pre~i{}en od antigen prezentuju}ih }elija (APCs) i kao sigurnosni mehanizam koji prevenira razvijanje autoimunskih procesa u tzv. privilegovanim organima kao {to su testis i mozak. IT zasnovana na klonalnoj deleciji i anergiji je dokazana u trudno}i i kod pacijenata koji boluju od malignih obolenja, me utim nije poznato koliki je zna~aj ovog oblik IT u fenomenu gravidarne i onkolo{ke imunotolerancije. IT posredovana klonalnom anergijom i delecijom zasnovana je na ulozi kostimuliraju}ih signala APCs i B limfocita. Uloga kostimuliraju}eg signala predstavlja osnovu Bretcher-Cohnovog modela dvostrukog aktivacionog signala. APCs i somatske }elije eksprimiraju kompleks MHC molekul klase I + antigen i na taj na~in aktiviraju specifi~ni klon CTL, dok se preko kompleksa MHC molekul klase II + antigen aktivira specifi~ni klon Th }elija. MHC antigene klase II eksprimiraju samo specijalizovane APCs, tako da se regrutovanje specifi~nog klona Th }elija obavlja samo u prisustvu APCs. Th }elije vr{e prepoznavanje kompleksa MHC molekul klase II + antigen svojim CD4 receptorom, dok CTL vr{e prepoznavanje kompleksa MHC molekul klase I + antigen svojim CD8 receptorom. 9,10,11 24

25 IFN- MHC II+antigen (signal I) CD4 APCs B7 (signal II) CD28 MHC I+antigen (signal I) CD8 B B7 IL-4 IL-2 Th 1 CTL CD28 Citokini (proliferacija CTL i stimulacija APCs) IL-2 Th 1 IL-2 [ema 3. Mehanizmi kostimulacije I i II kostimuliraju}im signalom u imunskoj reakciji na strani antigen IFN- MHC II+antigen (signal I) CD4 APCs Nema ekspresije B7 liganda, nema II signala CD28 MHC I+antigen (signal I) CD8 B CD28 IL-4 IL-2 Th 1 CTL Th 1 Klonalna anergija IL-2 Klonalna anergija IL-2 [ema 4. Izostanak ekspresije B7 kostimuliraju}eg liganda sa posledi~nom anergijom Th, CTL i B limfocita Aktivacija CD4 odnosno CD8 receptora odgovaraju}im kompleksom MHC molekul + antigen predstavlja I signal aktivacije CTL i Th }elija. II signal aktivacije Th }elije, a verovatno i CTL, dobijaju preko B7 kostimuliraju}eg liganda koji se eksprimira na APCs. CTL i Th }elije ovaj molekul mogu da prepoznaju i ve`u svojim CD28 receptorom ({ema 3). 25

26 APCs mogu da eksprimiraju antigen u kontekstu MHC molekula bez ekspresije B7 kostimuliraju}eg liganda, tako da limfociti koji su primili I kostimuliraju}i signal u odsustvu II kostimuliraju}eg signala podle`u procesu apoptoze (klonalna delecija) ili ulaze u anergiju. Prisustvo II signala u odsustvu I kostimuliraju}eg signala nema nikakve efekte na aktivaciju limfocita ({ema 4). 9,10, BYSTANDER TOLERANCIJA S obzirom da su sluzoko`e veoma izlo`ene dejstvu mikroba i drugih antigena, obrada antigena na sluzoko`ama doprinosi boljoj za{titi samih sluzoko`a i organizma uop{te. Me utim, razvijanje klasi~ne antimikrobne imunske reakcije, ili aloimunske reakcije na sluzoko`ama genitalnog trakta, dovelo bi do toga da sluzoko`e budu pod stalnom inflamacijom, {to bi ugrozilo njihovu propustljivost i funkcionisanje. Verovatno iz ovih razloga, odgovor imunskog sistema sluzoko`a (MALT) je ograni~en na mehanizme koji efikasno {tite sluzoko`e od velikog broja antigena, ali ujedno imaju minimalni potencijal o{te}enja sluzoko`a i reme}enja njihove funkcije. Ukratko re~eno, ubla`en i "mekan" imunski odgovor na sluzoko`ama onemogu}ava klasi~nu imunsku reakciju na unete antigene koji su usko povezani sa nutritivnim, respiratornim, reproduktivnim i drugim potrebama organizma. Primarni mehanizmi kojima se ostvaruje mukozna tolerancija su delecija specifi~nih klonova limfocita, anergija limfocita i aktivna }elijska supresija imunskog odgovora. Primer mukozne tolerancije digestivnog trakta je najreprezentivniji za razumevanje mehanizama funkcionisanja MALT i fenomen mukozne tolerancije. 10,11 Osim toga, danas postoji veliki interes za razvijanjem kontracepcione vakcine koja bi se aplikovala oralnim putem, {to problematiku MALT u imunokontracepcionom smislu ~ini naro~ito interesantnom. Koncentracija antigena je najzna~ajniji faktor koji odre uje mehanizam tolerancije na antigen unet preko gastrointestinalne sluzoko`e. Niske doze antigena favorizuje supresiju, a visoke doze deleciju i anergiju limfocita. Aktivna supresija se ostvaruje stvaranjem regulatornih T }elija u GALT-u (imunski sistem gastrointestinalne sluzoko`e) koje migracijom dospevaju u periferne limfati~ne organe uzrokuju}i perifernu IT. Pretpostavlja se da je najva`niji na~in delovanja aktivne }elijske supresije posredovan supresorskim/imunomodulatornim citokinima, kao {to su TGF-, IL-4 i IL-10 ({ema 5). 10,11 26

27 GALT je karakteristi~an po tome {to favorizuje indukciju kako Th 2 }elija, tako i TGF- produkuju}ih T }elija. T }elije koje dolaze iz sluzoko`a lu~e IL-4 kao primarni faktor rasta T }elija, dok one koje dolaze iz drugih organa lu~e IL-2, koji je tako e faktor T }elijskog rasta. Kod oralne tolerancije dolazi do smanjenja reakcije pozne hipersenzitivnosti (DTH) na unete antigene hranom. DTH je posredovana Th 1 odgovorom, koji je mogu}e blokirati citokinima Th 2 odgovora. Mo}ni imunosupresivni i antiinflamatorni citokin TGF- igra zna~ajnu ulogu u funkciji digestivnog trakta jer deluje kao switching faktor za produkciju IgA u mukozi. TGF- produkuju CD4 + i CD8 + T }elije poreklom iz GALT-a i predstavlja zna~ajan medijator aktivne supresije u oralnoj toleranciji. Na primeru knockout TGF- deficijentnih mi{eva mogu}e je sagledati zna~aj ovog citokina za kontrolu imunske reakcije na self antigene. Sva tkiva TGF- deficijentnih mi{eva pokazuju znake autoimunske zapaljenjske reakcije koju je mogu}e efikasno suzbiti tretmanom ovih mi{eva samim TGF-. Drugi autori navode da je pove}avanje serumske koncentracije TGF- u tkivima pra}eno suzbijanjem eksperimentalnog autoimunskog encefalitisa, orhitisa, kao i simptoma nekih oblika enterokolitisa kod ljudi. 12,13,14 Veoma verovatnom se ~ini pretpostavka da su TGF- produkuju}e CD4 + T }elije poseban tip T }elija koje uklju~uju helperne funkcije }elija mukoze i svojstva negativne regulacije Th 1 i drugih }elija imunskog sistema. Iako je ranije postojalo mi{ljenej da su }elije kojima se mo`e preneti supresija posle oralnog davanja antigena na modelu eksperimentalnog alergijskog encefalitisa i uveitisa u stvari CD8 + }elije, danas se zna da i CD4 + i CD8 + regulatorne }elije u~estvuju u generisanju oralne tolerancije. Nedavno je pokazano da se u slu~aju CD8 + citotoksi~nog odgovora mo`e indukovati supresija davanjem antigena preko sluzoko`a, odnosno oralnom aplikacijom antigena na koji je ve} ustanovljen imunski odgovor. Peroralna imunizacija stimuli{e Th 2 odgovor, {to rezultuje imunskim odgovorom prete`no posredovanim antitelima. Me utim, visoke doze antigena ipak mogu da dovedu do supresije humoralnog odgovora koji se bazira na anergiji ili deleciji specifi~nih klonova. Oralna imunizacija mo`e suprimirati IgE odgovor, {to je na neki na~in paradoksalna pojava jer se radi o Th 2 tipu imunskog odgovora. Ova supresija je najverovatnije posredovana pove}anom aktivno{}u TGF- produkuju}ih }elija, za koje se zna da pripadaju subklasi T limfocita i da suprimiraju produkciju IgE. 27

28 Oralna imunizacija Mukoza GIT Suboptimalna doza antigena Prezentacija antigena na mukozi GIT Faktori indukovanja oralne tolerancije? Supraoptimalna doza antigena Sistemska prezentacija antigena Indukovanje regulatornih }elija: CD8 + TGF- sekretuju}ih, CD4 + Th 2 IL-4/IL-10 sekretuju}ih T }elija i drugih. Inaktivacija Th 1 }elija? Delecija Bystander supresija u ciljnim organima Inhibicija generisanja efektorskih }elija u limfoidnim organima Anergija Periferna tolerancija [ema 5. Niskodozna i visokodozna tolerancija posle oralne administracije antigena Imunoregulatorne }elije koje se aktiviraju nakon oralnog unosa antigena ili davanjem antigena preko drugih sluzoko`a, lu~e antiinflamatorne citokine koji doprinose preveniranju razvijanja inflamacije na sluzoko`ama. Da bi se aktivirali mehanizmi mukozne tolerancije nije neophodno identifikovati antigen koji je odgovoran za pokretanje autoimunskog procesa, ve} je dovoljna mukozna imunizacija bilo kojim antigenom koji pripada obolelom organu ili tkivu. Mukozna imunizacija antigenom pokre}e mehanizme produkcije 28

29 TGF-, koji svojom nespecifi~nom supresorskom prirodom dovodi do smirivanja inflamacije i simptoma autoimunskih bolesti. 12,15,16,17 U imunokontracepcionom smislu bystander tolerancija donosi izvesne probleme zbog mogu}nosti uspostavljanja IT na kontracepcioni antigen, ali i izvesne prednosti zbog mogu}nosti aktiviranja prete`no humoralnog imunskog odgovora prilikom mukozne aplikacije vakcine, {to zna~ajno smanjuje mogu}nost aktivacije specifi~nog T }elijskog imuniteta koji je usko povezan sa autoimunskim komplikacijama imunokontracepcionih procedura. Istra`ivanja detaljnih imunoregulatornih mehanizama MALT su veoma intenzivna, tako da je realno o~ekivati ustanovljavanje protokola imunizacije preko sluzoko`a koja mo`e dovesti do aktivacije samo Th 2 imunskog odgovora uz izbegavanje mogu}nosti uspostavljanja IT na vakcinacioni antigen. Nekoliko za sada nedovoljno istra`enih mogu}nosti bi se odnosilo na oralnu imunizaciju uz paralelni tretman niskim dozama kortikosteroidnih preparata ili citokinima kao {to su IFN-, IL- 5, IL-4 i IL MEHANIZMI IMUNSKE TOLERANCIJE PREMA ANTIGENIMA MU[KOG GENITALNOG TRAKTA Testisi svoj razvoj dovr{avaju za vreme postnatalnog `ivota, a spermatogeneza po~inje za vreme puberteta, tako da iz ovih razloga imunski sistem nije u prilici da "upozna" novonastale }elije, njihove antigene i faktore regulacije ovih procesa, kao self antigene. Bez obzira na ~injenicu da fetalna IT nije uspostavljena na mnoge antigene adultnog testisa, tkiva testisa i proces spermatogeneze nisu ugro`eni od strane imunskog sistema, zbog postojanja barijere krv-testis, koja prakti~no izoluje ova tkiva od nadzora imunokompetentnih }elija. Celularnu osnovu barijere krv-testis ~ine Sertolijeve i peritubularne }elije koje eksprimiraju veliki broj adhezionih molekula koji omogu}avaju veoma jaku i kompaktnu vezu izme u ovih }elija. Me utim, traumatski, zapaljenjski i infektivni procesi na testisima mogu da naru{e integritet barijere krv-testis i zapodenu ciklus autoimunskog oboljenja testisa, koje neminovno vodi u o{te- }enje procesa spermatogeneze i sterilitet. O opasnostima imunizacije spermatozoidnim antigenima najbolje govori podatak da imunizacija alogenim, pa ~ak i ksenogenim spermatozoidima kod eksperimentalnih `ivotinja mo`e dovesti do razvijanja antispermatozoidnih antitela i autoimunskog orhitisa. Teuscher i sar. 35 opisuju uspe{nu 29

30 imunizaciju `drebadi spermatozoidima i adjuvansom, koja je proizvela dobar antispermatozoidni odgovor sa zna~ajnim titrom antispermatozoidnih antitela uglavnom IgG klase. 35 Kod ljudi je prime- }eno da veliki procenat vazektomisanih pacijenata pokazuje relativno visok titar antispermatozoidnih antitela. Pretpostavlja se da do senzibilizacije na vlastite spermatozoide dolazi zbog ekstravazacije spermatozoida tokom vazektomije. 19,20 Osim barijere krv-testis, dokazan je ~itav niz drugih mehanizama koji doprinose boljoj za{titi procesa spermatogeneze i }elija koje u~estvuju u spermatogenezi od potencijalnog razvijanja autoimunske agresije. Neki od ovih faktora su prikazani na tabeli 2. Sainio-Pollanen i sar. 24 su dokazali potpuno odsustvo B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86) pozitivnih imunokompetentnih }elija u testisima normalnih BALB/c mi{eva, dok je u testisima NOD mi{eva dokazan zna~ajan broj CD80 i CD86 pozitivnih }elija. Najverovatnije iz ovih razloga NOD mi{evi spontano razvijaju autoimunski orhitis i druge autoimunske bolesti, dok kod BALB/c mi{eva to nije slu~aj. Ovi autori sugeri{u zaklju~ak da izostanak ekspresije kostimuliraju}ih liganda B7-1 i B7-2 na MHC eksprimiraju}im }elijama dovodi do anergije T helper CD4 + (Th) limfocita i do izostanka aktivacije autocitotoksi~nih CTL. Nausuprot ovome, B7 pozitivne APCs, aktivirane Th }elije i CTL su dominantne }elijske populacije zapaljenjskog infiltrata u testisima NOD mi{eva. 24 Ovi podaci ukazuju na ~injenicu da u tkivima testisa postoje populacije makrofaga i dendriti~nih }elija koje uspe{no presecaju puteve aktivacije Th }elija i dalju kaskadu razvijanja celularnog i humoralnog autoimunskog odgovora. U isto vreme, ovaj mehanizam uspe{no obja{njava rezultate produ`enog pre`ivljavanja alografta implantiranog u tkivo testisa ili epididimisa. 23 U epitelu epididimisa se mogu dokazati tzv. intraepitelni leukociti (IEL), ~ija se koncentracija ne razlikuje od koncentracije IEL u drugim epitelnim tkivima. Ve}ina studija svedo~i o tome da CD8 + IEL mogu efikasno suprimirati aktivnost CD4 + IEL, ~ime doprinose razvijanju fenomena "hla enja sluzoko`a", {to je veoma va`no za odr`avanje (ne)propustljivosti sluzoko`a i njihovu normalnu funkciju. Osim toga, u epitelu epididimisa dokazana je zna~ajna aktivnost TGF-, IL-4 i IL-10 sekretuju}ih limfocita. Smatra se da su op{te zakonitosti funkcionisanja MALT primenljive i na sluzoko`u epididimisa, uklju~uju}i i mehanizme bystander tolerancije. 25 Komponente komplementa C3 i C9 nisu dokazane u semenoj te~nosti ljudi, dok je prisustvo C3 komponente komplementa u 30

31 semenoj te~nosti zeca dokazano, ali njegova koncentracija iznosi svega 25% od serumske koncentracije ove komponente komplementa. U isto vreme inhibitori komplementa kao {to su CD46, CD55 i CD59 dokazani su na spermatozoidima, u semenoj te~nosti i sekretu epididimisa. 26 Tabela 2. Neki od faktora i mehanizama koji preveniraju razvijanje autoimunskog odgovora prema tkivima testisa 21,22,23,24 FIZI^KI FAKTORI (barijera krv-testis) ^vrsta me u}elijska veza izme u Sertolijevih }elija Peritubularne }elije OSTALI FAKTORI IMUNSKE TOLERANCIJE Intraluminalnom fagocitozom doprinose sekvestriranju i Makrofazi smanjivanju broja spermatozoidnih antigena CD8 T limfociti + >> CD4 + supresija imunskog odgovora u epididimalnom epitelu CD46, CD55, CD59 antigeni i klasterin na spermatozoidima Komplement smanjuju koncentraciju C3 i C9 komponente komplementa u semenoj te~nosti ne eksprimiraju B7 antigen {to uzrokuje T }elijski anergiju i/ili APCs klonalnu deleciju IL-10 i TGF- suprimiraju funkciju T limfocita Citokini Sertolijeve }elije IL-10 i IL-4 favorizuju Th 2 tip imunskog odgovora Eksprimiraju Fas Ligand (FasL) koji indukuju apoptozu aktiviranih T limfocita (klonalna delecija) Semena te~nost sadr`i nekoliko dokazanih faktora koji suprimiraju imunski odgovor i smatra se da u tom smislu najva`niju ulogu imaju prostaglandini (PGE) i TGF- 2. Faktori sa imunosupresornim efektima iz semene te~nosti su, izme u ostalog, dokazani na primeru inhibicije mitogenima indukovane blastne transformacije timocita. Naime, reakcija timocita pacova na aktivaciju fitohemaglutininom je za 50% ni`a u prisustvu semene plazme. 27 Sugihara i sar. 28 navode neobi~no visok stepen ekspresije Fas Liganda (FasL) na Sertolijevim }elijama. FasL indukuju apoptoti~ke procese aktiviranih T limfocita, tako da se pretpostavlja da ovaj mehanizam predstavlja zadnju liniju odbrane od autoimunskih procesa. Veliki zna~aj FasL je potvr en na gld/gld knockout FasL deficijentnim mi{evima, koji se odlikuju spontanim razvijanjem te{kih oblika autoimunskog orhitisa

32 2.1. IMUNOGLOBULINI I BARIJERA KRV-TESTIS Prisustvo antitela u lumenu epididimisa i semenih kanali}a nije dokazano. Nakon intravenske infuzije obele`enih antitela, dokazano je prisustvo ovih antitela u peritubularnom intersticijumu testisa, ali ne i u lumenu semenih kanali}a. Me utim, kod `ivotinja koje imaju autoimunski orhitis ili je on izazvan imunizacijom tkivom testisa i nekim adjuvansom, mogu}e je dokazati prisustvo antitela i unutar lumena semenih kanali}a. 25,29 Supkutana imunizacija pacova i mi{eva tetanusnim ili toksinom kolere, dovodi do sna`ne produkcije antitoksinskih antitela i ostvarivanja visokog titra ovih antitela u serumu eksperimentalnih `ivotinja. Me utim, koncentracija ovih antitela u tkivu testisa i semenoj te~nosti eksperimentalnih `ivotinja iznosi svega 1 do 3,9% vrednosti serumske koncentracije antitoksinskih antitela. Navedeni podaci ukazuju na postojanje izgra enih mehanizama kontrole prolaska antitela kroz barijeru krv-testis, koja je po svemu sude}i neselektivne prirode AUTOIMUNSKA REAKCIJA NA SPERMATOZOIDE 3.1. ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA (ASA) Antispermatozoidna antitela su direktni odraz autoimunskog oboljenja vezanog za mu{ki genitalni trakt. Nastaju kao posledica fizi~kih o{te}enja, naj~e{}e traume, hirur{kih intervencija, infekcija, disregulacije u domenu specifi~nih i nespecifi~nih supresorskih mehanizama, pa ~ak i poreme}aja kao {to je psihogena anejakulacija. 30,31 Istra`ivanja su pokazala da jednostrana hroni~na trauma testisa pacova u intervalu od 3 meseca dovodi do zna~ajnog skoka titra ASA i potpune infertilnosti tretiranih pacova. Ujedno je dokazana aktivacija celularnih autoimunskih mehanizama kod svih traumatizovanih `ivotinja, {to je prava retkost kada je pitanju spontano nastali autoimunski orhitis. 30 Almagor i sar. su utvrdili da se u serumima 31% pacijenata koji boluju od psihogene anejakulacije mogu dokazati ASA koja su specifi~na za antigene glave spermatozoida. 31 Kod 26% osoba sa paraplegijom ili kvadriplegijom registrovana su ASA i zna~ajno smanjenje produkcije spermatozoida, ali bez znakova autoimunskog oboljenja testisa. 33 U drugim studijama je utvr en zna~ajan titar ASA 32

33 kod 25% infertilnih mu{karaca. Najve}i broj seropozitivnih pacijenata je u anamnezi navodio povredu testisa ili apendektomiju. S obzirom da je udru`enost povreda testisa i imunoinfertiliteta dobro dokumentovana, apendektomija se u ovom istra`ivanju pojavljuje kao novi etiolo{ki faktor imunoinfertiliteta mu{karaca. Autori ovu pojavu obja{- njavaju zapaljenjskom reakcijom koja bi mogla da bude faktor pokretanja autoimunskog oboljenja testisa. 34 ASA naj~e{}e pripadaju IgG klasi antitela ~iji se titar u serumu ASA pozitivnih pacijenata odr`ava veoma dugo. Posle jednokratne imunizacije spermatozoidima, ASA se u serumu imunizovanih `ivotinja mogu dokazati u zna~ajnom titru i 20 nedelja nakon imunizacije. 35 Kada su u pitanju ASA koja se pojavljuju u kontekstu autoimunskog oboljenja testisa kod ljudi, njihovo prisustvo je mogu}e dokazati ~ak desetine godina kasnije, verovatno zbog hroni~ne antigenske stimulacije. ASA mogu da aglutini{u, imobili{u ili liziraju spermatozoide u prisustvu komplementa. Naj~e{}e se de{ava da ASA aglutini{u i imobili{u spermatozoide, dok se citotoksi~na aktivnost ASA posredovana komplementom ili imunokompetentnim }elijama vrlo retko sre}e. Kada su vezana za spermatozoide ASA ometaju prolazak spermatozoida kroz cervikalnu sluz. Me utim, spermatozoidi za ~iju membranu su vezana nekompletna antitela, odnosno F(ab) 2 fragmenti antitela ASA bez Fc fragmenta, neometano prolaze kroz cervikalnu sluz. Ovi podaci ukazuju na mehanizam akcije ASA koji je najverovatnije sadr`an u vezivanju Fc fragmenta ASA za solubilne Fc receptore iz cervikalne sluzi ili Fc receptore malobrojnih CD16 + }elija cervikalne sluzi. 36,37 de Almeida i sar. 38 navode da se u 88,7% ejakulata imunoinfertilnih mu{karaca mogu dokazati ASA koja pripadaju IgG ili IgA klasi antitela i da je ovaj nalaz u 97,6% slu~ajeva udru`en sa oslabljenom penetracijom spermatozoida kroz cervikalni mukus. 38 Isti autor smatra da kortikosteroidna terapija nije od velike pomo}i u le- ~enju infertiliteta u ~ijoj osnovi le`i imobilizacija spermatozoida posredovana ASA iz cervikalne sluzi. Kao proceduru izbora u ovom slu~aju ovaj autor predla`e intrauterinu ili ~ak intratubarnu inseminaciju. 36 Nasuprot ovom mi{ljenju, rezultati sprovedeni na imunoinfertilnim mu{karcima, gde je kao osnovni uzrok infertiliteta identifikovana imobilizacija spermatozoida u cervikalnoj sluzi posredovana ASA, kortikosteroidni tretman mu{karaca je znatno pobolj{ao penetrantnost spermatozoida kroz cervikalnu sluz i doveo do za~e}a

34 Fc receptor Spermatozoidni antigeni ASA Glava spermatozoida ASA [ema 6. Mehanizam ASA posredovane spermatozoidne aglutinacije I II Solubilni Fc receptor I M ASA Spermatozoidni antigeni II Cervikalna sluz Fc receptor na M [ema 7. Mehanizam ASA spermatozoidne imobiliziacije solubilnim Fc receptorom i Fc receptorom makrofaga 3.2. "PRIRODNA" ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA Imunska reakcija na spermatozoide, antigene semene te- ~nosti, }elije i tkiva "sa druge strane" barijere krv-testis uvek je autoimunske prirode. Mehanizmi pokretanja autoimunskih procesa vezanih za mu{ki genitalni trakt su sli~ni mehanizmima autoimunskih oboljenja drugih tkiva i organa. Rasprava o inicijalnim autoimunskim mehanizmima prevazilazi okvire ove publikacije, ali generalno se mo`e re}i da je su{tinski faktor pokretanja autoimunskih mehanizama vezanih za mu{ki genitalni trakt naru{avanje krv-testis barijere i slabljenje drugih mehanizama tolerancije na self 34

35 antigene. Faktori naru{avanja barijere krv-testis naj~e{}e su infekcije, povrede i hirur{ke intervencije, dok se faktori slabljenja IT naj- ~e{}e pojavljuju u vidu ekspresije B7 kostimuliraju}eg liganda na APCs, slabija ekspresija FasL, reme}enje MALT mehanizama, akceleracija Th 1 tipa imunskog odgovora sa prate}im skokom sekrecije citokina Th 1 grupe i sl. 5,21,36,37,38, % Prepubertalna grupa 4 Fertilne `ene Infertilne `ene Procenat pasa seropozitivnih ispitanica Procenat osoba sa titrom pasa ve}im od 1:16 u grupi seropozitivnih ispitanica Grafikon 2. U~e{}e pasa seropozitivnih ispitanica u grupi prepubertalne dece, fertilnih i infertilnih `ena 39,40,41 Kod ve}ine sisara dokazano je prisustvo cirkuli{u}ih "prirodnih" antispermatozoidnih antitela (pasa) koja nisu u direktnoj vezi sa autoimunskim oboljenjima niti fertilno{}u, mada se javljaju pre polne zrelosti, kako kod mu`jaka tako i kod `enki ve}ine eksperimentalnih `ivotinja. pasa su otkrivena kod 90% de~aka i devoj~ica jo{ u prepubertalnom periodu. U reproduktivno zreloj populaciji ljudi ova antitela se mogu dokazati kod oko 60% ispitanika. Jedna druga studija je tako e pokazala veliku u~estalost osoba seropozitivnih na pasa. U populaciji prepubertalnih de~aka i devoj~ica na eno je 68% seropozitivnih ispitanika, dok je u populaciji polno zrelih `ena koje su imale bar jednu trudno}u incidenca seropozitivnih ispitanica iznosila 79%. Potpuno neo~ekivano, me u infertilnim `enama incidenca seropozitivnih se kre}e oko 52%, ali je titar pasa kod svih seropozitivnih ispitanica bio ve}i od 1:16. Titar pasa koji je ve}i od 35

36 1:16 kod seropozitivnih fertilnih `ena je zabele`en u blizu 4% slu- ~ajeva, dok je ovaj titar pasa u prepubertalnoj grupi zabele`en kod svega 1% ispitanika (grafikon 2). Ovi podaci ukazuju na ~injenicu da samo prisustvo pasa najverovatnije nije kompromituju}i faktor fertilnosti, ukoliko njihov titar ne prelazi odre ene fiziolo{ke granice. Iz ovih podataka se mo`e zaklju~iti da se pasa mogu na}i kod ve}ine ljudi, i da titar pasa ispod 1:16 nije udru`en sa imunoreproduktivnim problemima. U isto vreme mo`e se re}i da titar pasa iznad 1:16 nosi veliki rizik za imunoinfertilnost (grafikon 2). 5,39,40,41 pasa pokazuju najve}i afinitet za antigene glave spermatozoida, naro~ito ako su spermatozoidi slabo pokretni i sa o~iglednim znacima starenja. Vitalni i progresivno pokretni spermatozoidi skoro da ne vezuju pasa. Neki autori pretpostavljaju da su pasa u stvari antitela razli~ite specifi~nosti koja se vezuju za spermatozoidne Fc receptore svojim Fc fragmentom. Druga mogu}nost je da su pasa antitela razli~ite specifi~nosti koja unakrsno reaguju sa spermatozoidima. U vezi sa navedenim postoje razmi{ljanja da pasa u~estvuju u selekciji i eliminisanju anomali~nih, slabo pokretnih i spermatozoida smanjene vitalnosti. 39,40,41 Specifi~nost pasa nije precizno utvr ena, ali se zna da ova antitela nisu specifi~na za antigene krvnih grupa i MHC antigene. Najverovatnije se radi o poliklonalnim antitelima, odnosno antitelima koja poti~u od ve}eg broja klonova plazmocita, tako da se i njihova specifi~nost odnosi na ve}i broj antigena semene te~nosti, spermatozoida i verovatno nekih tkiva testisa. pasa reaguju sa spermatozoidima, semenom te~no{}u i ekstraktima testisa, ali ne i sa ekstraktima drugih tkiva i organa. Interesantno je da pasa reaguju sa antigenima mikroorganizama kao {to su Staphylococcus, Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiela pneumoniae i Candida albicans. Podaci o unakrsnoj reaktivnosti pasa sa navedenim mikroorganizmima ukazuju na mogu}nost da su pasa u stvari primarno antimikrobna antitela koja unakrsno reaguju sa spermatozoidima. 5,39, ULOGA ASA U NEPLODNOSTI Imunski faktori u~estvuju sa oko 10% u odnosu na sve ostale faktore neplodnosti mu{karaca i `ena. 40 Prema drugim autorima autoimunski i antispermatozoidni faktori su odgovorni za 3 do 20% slu~ajeva infertilnosti mu{karaca

37 Neka istra`ivanja su pokazala prisustvo ASA u serumu kod 81% infertilnih mu{karaca i 74% njihovih partnerki. Kod 75% infertilnih mu{karaca na ena su ASA u semenoj te~nosti, dok 84% njihovih partnerki eksprimira ASA u cervikalnoj sluzi. 41 Meinertz i sar. 42 su u svojim istra`ivanjima na velikoj grupi infertilnih mu{karaca dokazali da se kod pribli`no 30% ispitanika mo`e dokazati jedna od vi{e formi ASA. Kod 26,7% ASA pozitivnih osoba dokazana je solubilna IgG forma ASA u semenoj te~nosti, dok je kod 23,6% ispitanika u semenoj te~nosti na ena IgA forma ASA. U 30% slu~ajeva ASA pozitivnih ispitanika, ova antitela su dokazana kao antitela vezana za spermatozoide, dok 18,6% ASA pozitivnih mu{karaca eksprimira aglutiniraju}a formu ASA (grafikon 3). 42 ASA negativni infertilni mu{karci 70% IgG u semenoj te~nosti 6% 7% 8% 9% Aglutinini IgA u semenoj te~nosti ASA vezana za spermatozoide Grafikon 3. Procentualno u~e{}e razli~itih formi ASA u odnosu na ukupan broj infertilnih mu{karaca 42 U grupi mu{karaca suspektnih na imunsku etiologiju infertilnosti kod 44% pacijenata je dokazano prisustvo ASA u ejakulatu, dok je kod 97,6% ASA pozitivnih pacijenata registrovana zna~ajno slabija sposobnost spermatozoida za penetraciju kroz cervikalnu sluz. 38 ASA mogu u zna~ajnoj meri kompromitovati ne samo fertilnost mu{karaca, ve} i `ena. Ranije se smatralo da su cervikalna sluz, uterusni i tubarni sekret primarno mesto delovanja ASA u `enskom genitalnom traktu. Iz ovih razloga, preovladavalo je mi{ljenje da zaobila`enje ovih barijera ve{ta~kom inseminacijom ili in vitro fertilizacijom, mo`e re{iti probleme imunoinfertilnih `ena. Me utim, 37

38 pokazalo se da ASA pored kompromitovanja usmerenog kretanja spermatozoida kroz `enski genitalni trakt, kompromituju vezivanje spermatozoida za zonu pelucidu i interakciju spermatozoida i oocite, ~ime onemogu}avaju oplo enje. Nove tehnike subzonalne inseminacije, odnosno arteficijelnog uvo enja spermatozoida do jajne }elije zna~ajno smanjuju mogu}nost neuspeha spermatozoidno-zonalne reakcije i donose izvestan napredak u le~enju imunoinfertiliteta. 43 Intracitoplazmatska fertilizacija je nova procedura kojom se u potpunosti elimini{u sve mogu}nosti imunskim mehanizmima kompromitovanog oplo enja. Radi se o proceduri direktnog injektiranja spermatozoida u oocitu, kojom se minimiziraju mogu}nosti ASA posredovanog blokiranja receptorske interakcije spermatozoida i ZP, kao i interakcije spermatozoida i oocite. 44 Neki autori navode relativni uspeh intratubarne inseminacije ispranim spermatozoidima imunoinfertilnih mu{karaca. Navodi se da je kod 43% parova ova procedura rezultovala uspostavljanjem trudno}e. Posmatrano u odnosu na broj ovulacija koje su bile potrebne za postizanje ovih trudno}a ovaj procenat je znatno manji i iznosi svega 24%. 43 Zouari i sar. 45 navode rezultate uporednog istra`ivanja populacija spermatozoida zdravih osoba koji in vitro mogu oploditi jajnu }eliju i populacija spermatozoida ASA pozitivnih osoba koji ne mogu oploditi jajnu }eliju. Motilitet, brzina, usmerenost kretanja, sposobnost pre`ivljavanja, akrozomalna reakcija i ostale karakteristike obe grupe spermatozoida su bile potpuno identi~ne, jedina razlika koja je prime}ena odnosila se na izra`ene lateralne pokrete glave (lateral head displacement - ALH) spermatozoida ASA pozitivnih osoba i znatno oslabljenu sposobnost prodiranja kroz ZP oocite. 45 Postoje radovi koji svedo~e o efikasnosti kortikosteroidne terapije kod imunoinfertilnih osoba. Robinson i sar. 46 navode da je kortikosteroidni tretman imunoinfertilnih ASA pozitivnih mu{karaca rezultovao trudno}om njihovih partnerki u 39,4% slu~ajeva, dok je procenat ostvarenih trudno}a u kontrolnoj, netretiranoj grupi imunoinfertilnih ASA pozitivnih mu{karaca bio svega 4,8%. 46 Opisan je slu~aj infertiliteta mu{karca koji je razvijen u kontekstu poliglandularnog autoimunskog sindroma sa zna~ajnim titrom ASA, koji je veoma povoljno odgovorio na kortikosteroidnu terapiju, padom titra ASA i pobolj{anjem svih parametara spermograma. Tri meseca nakon kortikosteroidne terapije titar ASA i parametri spermograma pokazivali su predterapijske vrednosti. 47 Interesantno je da kortikosteroidna supresija produkcije ASA nije u istoj meri efikasna kod `e- 38

39 na i mu{karaca. Naime, tretman kortikosteroidima podjednako suprimira produkciju ASA kod `ena i mu{karaca, dok je napredak u pogledu uspostavljanja fertilnosti ASA pozitivnih `ena skoro neprimetan u odnosu na efekte terapije kod mu{karaca. 36 Postoje dokazi o udru`enosti imunoinfertilnosti, prisustva ASA i autoimunskih oboljenja drugih organa. Baker i sar. 48 potvr uju udru`enost pojave ASA sa pojavljivanjem antitiroglobulinskih, antimikrozomalnih, antinuklearnih, antimitohondrijalnih i drugih auto-antitela u serumu imunoinfertilnih pacijenata. Va`no je napomenuti da autoimunska oboljenja drugih organa, a naro~ito `lezda sa unutra- {njim lu~enjem dodatno kompromituju ve} ugro`enu fertilnost ASA pozitivnih pacijenata. Pitanje primarnog oboljenja koje najverovatnije pokre}e generalizovani autoimunski proces je jo{ uvek otvoreno. Ve}ina autora smatra da se infertilnost posredovana autoimunskim mehanizmima u odre enom broju slu~ajeva razvija u kontekstu autoimunskih oboljenja drugih organa i tkiva UDRU@ENOST VAZEKTOMIJE I AUTOIMUNOSTI Kao posledica vazektomije i osloba anja velikog broja spermatozoidnih i antigena semene te~nosti, kod ve}ine vazektomisanih mu{karaca razvijaju se razni oblici autoimunskih reakcija. Postvazektomijska autoimunska reakcija je naj~e{}e humoralnog karaktera i usmerena je protiv antigena spermatozoida, semene te~nosti i testisa. Znatno re e, vazektomija mo`e da bude udru`ena sa oboljenjima kao {to su glomerulonefritis ili multipla skleroza. Kod manjeg broja vazektomisanih potvr en je porast titra antinuklearnih antitela. 36 Naj~e{}i oblik autoimunskih postvazektomijskih reakcija je pojava antispermatozoidnih antitela koja ozbiljno kompromituju fertilnost vazektomisanih pacijenata. U prvoj godini nakon vazektomije ASA su na ena kod 60-70% pacijenata, dok je 50% vazektomisanih mu{karaca ASA seropozitivno i 10 godina nakon vazektomije. 39,40 Kao posledica osloba anja spermatozoida u toku vazektomije oko 20% pacijenata razvija celularni oblik imunoreaktivnosti. Ovaj vid komplikacija se znatno re e razvija najverovatnije zbog velikog broja faktora iz semene te~nosti koji efikasno suzbijaju celularnu imunoreaktivnost usmeravaju}i je prema humoralnom tipu imunoreaktivnosti. Neki autori ovaj fenomen obja{njavaju prisustvom velikog broja limfocita u spermi (broj limfocita u ejakulatu je ve}i od 3X10 6 ) me u kojima dominira subpopulacija CD8 + supre- 39

40 sorskih limfocita. Glavna uloga ovih limfocita je supresija }elijske imunoreaktivnosti i supresija obrade i prezentacije antigena od strane APCs. Vazektomija nosi izvesne rizike od razvijanja autoimunskih bolesti na drugim organima, pa ~ak i od razvijanja bolesti imunih kompleksa. Opisan je primer gde je vazektomija sprovedena na majmunima koji su hranjeni aterogenom hranom ubrzala proces ateroskleroze, {to se obja{njava talo`enjem imunskih kompleksa na intimi krvnih sudova. Istra`ivanja sprovedena u ovom pravcu na vazektomisanim mu{karcima nisu potvrdila aterogeni u~inak vazektomije kod ljudi. 39, CITOKINI I FUNKCIJA TESTISA Kontrola procesa spermatogeneze pored gonadotropina i androgena uklju~uje i parakrine faktore kao {to su faktori rasta i citokini. Proces spermatogeneze sisara se sastoji iz tri faze: mitoti~ka proliferacija spermatogonija, mejoti~ka redukcija broja hromozoma i maturaciona faza do zrelih spermatozoida. U svakoj od navedene tri faze citokini imaju ulogu faktora rasta i/ili faktora diferencijacije i maturacije spermatozoida. Sekrecija IL-1 od strane Sertolijevih }elija je u tesnoj vezi sa njihovom fagocitnom funkcijom. Naime, produkcija i sekrecija IL- 1 od strane Sertolijevih }elija je uvek pove}ana kada postoji fagocitna aktivnost ovih }elija. Seminiferni epitel kao i Sertolijeve }elije sekretuju IL-6 kao odgovor na prisustvo FSH, mada je dokazana i bazalna produkcija ovog citokina od strane navedenih }elija. Egzogeni IL-6 inhibi{e spermatogenezu i to uglavnom mehanizmom inhibicije sinteze DNK u mejoti~koj fazi. 12,13 De i sar. 49 su pokazali da spermatociti iz faze pahiten i okrugle spermatide eksprimiraju mrna za TNF-, dok Sertolijeve }elije eksprimiraju receptore za TNF-. Ovi podaci bi mogli ukazati na aktivnu citokinsku komunikaciju izme u }elija spermatozoidne loze i Sertolijevih }elija. ]elije ranih faza spermatogeneze ne samo da sinteti{u TNF-, ve} i eksprimiraju receptor za TNF-. Aktivacija ovih receptora po dozno zavisnom modelu suprimira ekspresiju Fas liganda i na taj na~in odla`e apoptozu germinativnih }elija sprematozoidne loze. 49 Produkcija IFN- i od strane Sertolijevih }elija je tako e potvr ena, dok IFN- produkuju samo spermatide u ranoj fazi razvoja. Me utim, tretman mi{eva IFN- dovodi do atrofije testisa, smanjenja zapremine ejakulata, abnormalne morfologije sperma- 40

41 tozoida, smanjenja broja spermatozoida u ejakulatu i smanjenom fertilno{}u tretiranih mi{eva. 13,49 Koncentracija EGF (Epidermal Growth Factor) u serumu infertilnih mu{karaca je zna~ajno ni`a od koncentracije ovog citokina u serumu fertilnih mu{karaca. Serumska koncentracija EGF je u direktnoj korelaciji sa parametrima spermograma kao {to su zapremina ejakulata, pokretljivost i broj spermatozoida. Osim toga, utvr ena je i korelacija koncentracije serumskog EGF sa serumskom koncentracaijom hormona kao {to su testosteron, LH i FSH. Istra`ivanja sprovedena na tzv. knock out EGF deficijentnim mi{evima su pokazala klju~nu ulogu EGF za proces spermatogeneze. Naime, EGF deficijentni mi{evi su infertilni, zbog potpunog izostanka spermatogeneze. Isti autori su na potpuno druga~ijem eksperimentalnom modelu ponovo dokazali neophodnost prisustva EGF za odvijanje spermatogeneze. U eksperimentu sa pacivima kojima su hirur{kim putem odstranjene pljuva~ne `lezde dokazana je zna~ajno ni`a koncentracija serumskog EGF uz ozbiljno kompromitovanje spermatogeneze. Tretman ovih `ivotinja EGF popravlja spermatogenezu skoro do fiziolo{kih granica. Ovi interesantni podaci su otvorili prostor za nove spekulacije oko mogu}ih imunopatolo{kih mehanizama orhitisa kao komplikacije parotitisa. 12,13 Spermatogeneza je u istoj meri zavisna od prisustva PDGF (Platelet Derived Growth Factor) kao i od EGF. Kod PDGF deficijentnih mi{eva je na eno zna~ajno smanjenje volumena testisa, drasti~no smanjenje broja Leydigovih }elija i zastoj u procesu spermatogeneze. Rekonstrukcija soja PDGF deficiejntnih mi{eva ukr- {tanjem sa divljim mi{evima rezultuje normalizacijom produkcije PDGF, normalnim volumenom testisa i brojem Leydigovih }elija, kao i normalnim odvijanjem spermatogeneze

42 III. ANTIGENI SA IMUNOKONTRACEPCIONIM POTENCIJALOM 1. ADHEZIONI MOLEKULI SPERMATOZOIDA I OOLEME Oplo enje podrazumeva tzv. }elijsko-}elijsku fuziju oocite i spermatozoida. Ovaj proces omogu}ava ponovno uspostavljanje diploidnog broja hromozoma, aktivaciju jajne }elije, njenu transformaciju u somatsku }eliju i formiranje nove jedinke. Identifikacija proteina koji u~estvuju u procesu ostvarivanja spermatozoidno-oocitne veze i fuzije gameta veoma je va`na za potpuno razumevanje ovih fenomena. Saznanje da poreme}aji fuzije gameta mogu dovesti do nekih oblika infertiliteta kod ljudi ovoj problematici daju dodatni zna~aj i otvaraju nove mogu}nosti za dizajniranje kontracepcionih vakcina ~iji bi mehanizmi mogli biti usmereni na kompromitovanje spermatozoidno-oocitne interakcije. Hipoteza da je fuzija gameta zasnovana na interakciji komplementarnih molekula spermatozoidne i oocitne membrane, potvr ena je na velikom broju eksperimentalnih in vitro i in vivo modela. Pretpostavlja se da u procesu fuzije gameta veliku ulogu igraju }elijski adhezioni molekuli ili tzv. integrini. Doga aj fuzije gameta je samo mali deo procesa i mehanizama koji prethode uspe{nom oplo enju, tako da su svi koraci koji prethode fuziji gameta podjednako va`ni za oplo enje. Najva`niji koraci koji se mogu smatrati pripremnim fazama oplo enja podrazumevaju maturaciju gameta, transport gameta, prepoznavanje i interakciju spermatozoida i zone pelucide, interakciju spermatozoida i oocite i samo fuzionisanje gameta. Maturacija spermatozoida podrazumeva proces kapacitacije i prelazak u pobu eno stanje koje se karakteri{e ekspresijom }elijsko-}elijskih adhezionih liganda. 42

43 Fuzija membrana predstavlja jedan od klju~nih procesa u mnogim biolo{kim fenomenima kao {to su transport izme u organela, endo i egzocitoza, miogeneza i fertilizacija. 53 Unutra{nja akrozomalna membrana Plazma membrana Akrozomalni prostor Cumulus Oophorus Corona radiata Zona Pellucida Oocita Perivitelinski prostor Perivitelinska membrana Spolja{nja akrozomalna membrana Spermatozoid prodire kroz kumulu ooforus Unutra{nja akrozomalna membrana Enzimske vezikule Ekvatorijalni segment Vezikulacija akrozomalne membrane Spermatozoid prodire korz koronu radijatu Unutra{nja akrozomalna membrana Oolema Oocita Ekvatorijalni segment Unutra{nja akrozomalna membrana je otkrivena Perivitelinski prostor Zona pelucida Prodiranje spermatozoida kroz zonu pelucidu [ema 8. Razli~ite faze spermatozoidne aktivnosti za vreme prodiranja kroz prate}i kompleks oocite 43

44 U ve}ini slu~ajeva fuzija membrana je specifi~ni proces, {to podrazumeva prethodno prepoznavanje partnerske membrane sa kojom dolazi do fuzionisanja. Jednostavnije re~eno, fuzija membrana prilikom oplo enja podrazumeva obostrano prepoznavanje membrana spermatozoida i oocite, a u ve}ini slu~ajeva ovo prepoznavanje je species specifi~no, {to zna~i da komplementarnu vezu spermatozoid-oocita mogu ostvariti samo gameti jedinki iste vrste, u suprotnom oplo enje izostaje. 54 Veliki broj autora smatra da se veza izme u gameta ostvaruje preko komplementarnih molekula (membranskih receptora ili adhezionih molekula), ~ija se komplementarnost i specifi~nost mo`e uporediti sa komplementarno{}u veze antitelo-antigen. 55 Somatske }elije i gameti eksprimiraju nekoliko razli~itih grupa adhezionih molekula. U najzna~ajnije grupe ovih molekula spadaju integrini, selektini, kadherini, sindekani i ADAMs molekuli (metealoproteze). 56 Vezivanje spermatozoida za ZP, koje je u ve}ini slu~ajeva species-specifi~no, rezultuje akrozomalnom reakcijom i osloba anjem proteoliti~kih enzima koji najverovatnije omogu}avaju penetraciju spermatozoida kroz ZP. Kona~no spermatozoidni receptori reaguju sa komplementarnim molekulima na povr{ini oocite, ~ime se ostvaruje proces vezivanja spermatozoida sa oocitom, {to je prvi korak prema fuziji gameta i oplo enju ({ema 8). 49,50 Mnoga istra`ivanja su pokazala da je za proces oplo enja podjednako va`na receptorska interakcija izme u spermatozoida i ZP kao i receptorska interakcija izme u spermatozoida i oocite. 51,52 Prvi nivo ekspresije species specifi~nih receptora za ostvarivanje veze sa spermatozoidima lokalizovan je na ili u samoj ZP. Do ovih saznanja se do{lo na osnovu poku{aja interspecijesne oplodnje, kada je pokazano da se spermatozoidi jedne vrste mogu fuzionisati sa oocitom druge vrste, ali pod uslovom da je oocita oslobo ena ZP. Ukoliko oocita nije oslobo ena ZP spermatozoidi druge vrste ne mogu prebroditi ovu prepreku, verovatno zbog nemogu}nosti ostvarivanja receptorske veze sa adhezionim molekulima ZP. 57 Smatra se da glikoproteini ZP kao {to su ZP-1, ZP-2, ZP-3( i ) i ZP-4 igraju va`nu ulogu u ovim procesima. Drugi nivo ekspresije adhezionih molekula odgovornih za ostvarivanje receptorske veze sa spermatozoidom lokalizovan je na samoj oolemi. Neki od ovih molekula imaju species specifi~ni karakter, dok drugi pokazuju sposobnost unakrsne reakcije sa spermatozoidima razli~itih vrsta. 44

45 Fertilini su transmembranski molekuli sa osobinama ADAMs porodice molekula, ~ija je uloga prvenstveno sadr`ana u ostvarivanju spermatozoidno-oocitne veze. PH-20 i PH-30 molekuli se uglavnom eksprimiraju na unutra{njoj akrozomalnoj membrani, {to ih ~ini operativnim samo u postakrozomalnoj fazi opli enja. Anti-PH-30 MAb reaguju uglavnom sa spermatozoidima postakrozomalne faze i efikasno ometaju vezivanje spermatozoida za oocitu. 58 subjedinica PH-30 molekula sadr`i solubilnu sekvencu od pribli`no 50 aminokiselina za koju se pretpostavlja da u~estvuje u procesu prepoznavanja i vezivanja oocitnih receptora. Promena redosleda aminokiselina u ovoj sekvenci efikasno inhibi{e vezivanje spermatozoida za jajnu }eliju i fuzionisanje gameta. 59 Fertilini su otkriveni i na spermatozoidima ~oveka. Redosled aminokiselina PH-30 proteina ~oveka pokazuje 90% sli~nosti sa fertilinom majmuna, 56% sli~nosti sa fertilinom hr~ka i 55% sli~nosti sa mi{jim fertilinom integrini su membranski molekuli koji se mogu dokazati na }elijama trofoblasta, endometrijuma, spermatozoida i imunskih }elija. Integrini u~estvuju u ostvarivanju }elijsko-}elijske veze kao i ostvarivanju veze izme u }elija i ekstracelularnog matriksa. Imunohistohemijska istra`ivanja pomo}u anti- 1-integrinskih antitela, pokazala su da spermatozoidi u preakrozomalnoj fazi eksprimiraju veoma mali broj ovih proteina, dok spermatozoidi postakrozomalne faze eksprimiraju znatno ve}i broj 1-integrina. Ovo ukazuje na mogu}- nost da je uloga 1-integrina uglavnom sadr`ana u procesu vezivanja spermatozoida i oocite. 61 Istra`ivanja sprovedena na spermatozoidima infertilnih mu{karaca sa teratooligospermijom pokazala su znatno slabiju ekspresiju -1 integrina u pre i postakrozomalnoj fazi spermatozoida. 62 Fibronektin, vitronektin i laminin su adhezioni molekuli koji tako e doprinose spermatozoid-oocitnoj adhezionoj reakciji. Prisustvo ova tri adheziona molekula je potvr ena na spermatozoidnoj i oocitnoj membrani, dok blokiranje ovih molekula specifi~nim antitelima u in vitro uslovima dovodi do potpune inhibicije vezivanja spermatozoida za oolemu. Receptor za C3 komponentu komplementa i 2-integrin se eksprimiraju na oocitnoj membrani i u~estvuju u spermatozoidoocitnoj interakciji i to najverovatnije preko spermatozoidnih PH-20 i PH-30 molekula. Blokiranje 2-integrina i receptora za C3 komponentu komplementa specifi~nim MAb u in vitro uslovima inhibi{e 45

46 interakciju ljudskih spermatozoida i jajne }elije hr~ka oslobo ene zone pelucide. 63 Inhibitori komplementa CD35, CD46, CD55 i CD59 su dokazani na akrozomalnoj membrani spermatozoida. Nizak potencijal inhibicije komplementa aktiviranog ASA, ukazuje na ulogu ovih molekula koja nije strogo povezana sa inhibicijom komplementa. Na ovo ukazuju i podaci da anit-cd46 i anti-cd59 MAb inhibi{u vezivanje spermatozoida za oocitu i sam proces fuzionisanja gameta. 63,64 Anti-CD55 MAb blokiraju akrozomalnu reakciju spermatozoida {to ukazuje na zna~aj CD55 molekula za procese akrozomalne reakcije i penetracija spermatozoida korz ZP. Tabela 3. Najva`niji adhezioni molekuli i njihova distribucija na spermatozoidnoj membrani i oolemi CD Receptor Grupa Ligandi Spermatozoid Oolema Spermatozoid/oocita interakcija ß1 integrini CD49c/CD29 alpha 3 /ß 1 Integrin Fibronektin CD49d/CD29 alpha 4 /ß 1 Integrin Fibronektin CD49e/CD29 alpha 5 /ß 1 Integrin Laminin CD49f/CD29 alpha 6 /ß 1 Integrin Fibronektin/Vitronektin CD51/CD61 alpha V /ß 1 Integrin Vitronektin C proteini CD35 / RCA C3b/C4b CD11b/CD18 alpha m /ß 2 Integrin C3bi CD46 / RCA C3b/C4b CD55 / RCA C3b/C4b CD59 / C5b-8, C5b Kalmodulin spada u membranske molekule postakrozomalne reakcije, koji se najbolje eksprimiraju na unutra{njoj akrozomalnoj membrani. Molekuli kalmodulina u~estvuju u procesima fuzionisanja gameta, kao i u procesima koji slede nakon fuzije membrana gameta. Nedavno je potvr ena interakcija kalmodulina spermatozoidne membrane i citoplazmatskih receptora oocite. Na`alost, istra`ivanja interakcije spermatozoidne membrane i citoplazme oocite su u po- ~etnoj fazi, tako da je uloga kalmodulina u postfuzionoj fazi oplo enja prili~no nejasna

47 Kompozicija adhezionih moleklua ooleme je veoma sli~na sastavu adhezionih moleklula spermtaozoidne membrane. Za razliku od spermatozoida oocita ne eksprimira MHC antigene klase I, ali zato eksprimira sve tri izoforme Fc receptora (Fc -I, Fc -II i Fc - III), za koje je potvr eno da mogu vezati Fc fragment ASA vezanih za spermatozoide PUT RAZVOJA KONTRACEPCIONE VAKCINE Dizajniranje i razvoj kontracepcionih vakcina predstavlja seriju koraka koja ni izbliza ne li~i na razvijanje tradicionalnih vakcina. Ovaj proces ulju~uje: (1) identifikaciju molekula koji bi mogli predstavljati antigensku osnovu kontracepcione vakcine. Ovi molekuli su naj~e{}e produkti reproduktivnog trakta i igraju klju~nu ulogu u reproduktivnim procesima; (2) razvijanje tehnike dobijanja antigena u pre~i{}enom stanju koja podrazumeva nekoliko mogu}nosti: (i) izdvajanje DNK sekvence koja determini{e sintezu kriti~nog proteina i njegova sinteza tehnikom rekombinantne DNK, (ii) hemijska sinteza proteina i (iii) izolacija proteina iz prirodnih izvora; (3) proizvodnja i pre~i{}avanje antigena; (4) odre ivanje najmanje efikasne doze antigena; (5) testiranje imunogeni~nosti, sigurnosti i efikasnosti antigena na malim laboratorijskim `ivotinjama i primatima; (6) evaluacija mehanizama dejstava imunizacije; (7) testiranje imunogeni~nosti, sigurnosti i efikasnosti antigena na malom broju dobrovoljaca; (8) testiranje na velikom broju ljudi; (9) komercijalna primena kontracepcione vakcine. Prva faza razvoja kontracepcione vakcine, kao i sve ostale, sastoji se od vi{e me ukoraka. Ovo je mo`da najkomplikovanija i najte`a faza procesa, kojom su zapo~eli i zavr{ili se mnogi istra- `iva~ki projekti. U prvoj fazi istra`ivanja neophodno je identifikovati: (i) deo reproduktivnog procesa na koji treba delovati (npr. akrozomalna reakcija spermatozoida), (ii) molekul receptora (antigen) ~ija eliminacija ili blokada antitelima mo`e u potpunosti zaustaviti reproduktivni proces, (iii) biohemijsku strukturu antigena i (iv) tkivnu distribuciju antigena. 5 Detaljno opisivanje svih faza i podfaza ~itavog puta od izbora antigena do komercijalne primene kontracepcione vakcine prevazilazi okvire ove publikacije, kao i mogu}nosti i iskustvo autora. Na kraju, mo`e se re}i da je dizajniranje i razvijanje kontracepcione 47

48 vakcine dug i mukotrpan posao koji zahteva isklju~ivo timski i multidisciplinarni rad. 3. STANDARDI ZA IZBOR KONTRACEPCIONOG ANTIGENA Mnoge }elije i njihovi produkti uklju~eni su u reproduktivni proces sisara. Hormoni hipotalamusa, hipofize, posteljice i gonada imaju klju~nu ulogu u reproduktivnim procesima od gametogeneze pa do samog kraja procesa reprodukcije, odnosno ra anja potomstva. Ni{ta manji zna~aj se ne pridaje mno{tvu glikoproteina koji su naj~e{}e produkt sekrecije cervikalnih, uterusnih, tubarnih `lezdi ili epididimisa, prostate i semenih kesica, koji u~estvuju u procesima transporta gameta i njihove maturacije. Glikoproteini eksprimirani u vidu receptora na spermatozoidima, zoni pelucidi i oolemi, tako e su{tinski odre uju proces reprodukcije. Ukratko, spisak va`nih molekula za reprodukciju sisara je duga~ak i svaki od njih bi mogao biti antigenska osnova kontracepcione vakcine. Me utim, ve}ina ovih molekula ne zadovoljava neki od kriterijuma nu`no postavljenih pred antigene kontracepcione vakcine. Standardi koji se name}u pred budu}u kontracepcionu vakcinu su visoki i odnose se na efikasnost i pouzdanost vakcine, kao i na problematiku komplikacija koje uglavnom podrazumevaju pokretanje autoimunskih procesa kako na samim organima reproduktivnog sistema, tako i na drugim organima. Iz ovih razloga, strategija identifikacije potencijalnog antigena na kome bi se bazirala budu}a kontracepciona vakcina projektovala je mogu}e karakteristike idealnog vakcinacionog antigena. Kao proizvod ovih razmatranja definisane su osobine idealnog antigenskog kandidata imunokontracepcione vakcine kao {to su: - esencijalna uloga u reproduktivnom procesu, tako da neutralisanje ili blokiranje ovog antigena antitelima rezultuje uspostavljanjem infertilnosti. - dobra imunogeni~nost, {to zna~i postizanje visokog titra antitela posle vakcinacije i/ili revakcinacije. Najbolju imunogeni~nost pokazuju antigeni proteinske i glikoproteinske prirode. - visok stepen tkivne specifi~nosti, odnosno izostanak ekspresije antigena na ostalim organima i tkivima, {to smanjuje mogu}- nost kolateralnih o{te}enja drugih tkiva direktnim dejstvom antitela ili posredno pokretanjem autoimunskih procesa. - pristupa~nost i otkrivenost antigena, omogu}ava lak i brz pristup specifi~nim antitelima do kriti~nog antigena i njegovo neut- 48

49 ralisanje ili blokiranje (npr. antigeni postakrozomalne membrane spermatozoida se otkrivaju tek nakon akrozomalne reakcije). - puni kontracepcioni efekti se posti`u najni`im mogu}im titrom antitela. Ova ~injenica je va`na iz razloga {to se malim brojem antitela nagra uje i mali broj imunih kompleksa, tako da je opasnost od talo`enja imunih kompleksa u drugim tkivima i organima svedena na minimum. - mogu}nost primene kod mu`jaka i `enki (npr. antigenima zone pelucide nema smisla imunizovati mu`jake). - ve}ina imunizovanih jedinki reaguje uniformno, (postoje antigeni na koje razli~ite jedinke reaguju sa velikim stepen individualnosti). - imunizacijom se posti`e infertilnost svih ili ogromne ve}ine imunizovanih jedinki. - reverzibilnost infertilnosti (postoje antigeni koji prouzrokuju dugotrajnu ili ~ak ireverzibilnu infertilnost, uglavnom mehanizmima pokretanja autoimunskih procesa na gonadama). - minimalna mogu}nost pokretanja ne`eljenih reakcija, kao {to su alergijske, anafilakti~ke i autoimunske reakcije. - imunizacija ne ometa proces gametogeneze i steroidogeneze. - imunizacija ne remeti ritam menstrualnog ciklusa. - imunizacija ne smanjuje libido, (neke kontracepcione vakcine smanjuju libido i interesovanje za reprodukciju). - niska cena prozivodnje vakcine i same vakcinacije. Prema navedenom "spisku `elja" skoro da ne postoji antigen koji bi ispunio sve preduslove, ali i pored toga mo`e se govoriti o identifikaciji grupe antigena koja pribli`no ispunjava sve zadate uslove. Naime, radi se o proteinima koji se eksprimiraju na spermatozoidima i ~ija je uloga u spermatozoid-oocita-vezuju}im (SOB antigeni) procesima presudna. Mnoga istra`ivanja su potvrdila da je vezivanje spermatozoida za oocitu i sam proces oplodnje nemogu} u uslovima blokiranja ili bilo kakvog kompromitovanja funkcije SOB antigena. Ovi antigeni imaju glikoproteinsku ili proteinsku strukturu, veoma su imunogeni~ni i eksprimiraju se samo na zrelim spermatozoidima. Ekspresija SOB antigena na bilo kom drugom tkivu ili organu nije dokazana. S obzirom da se radi o spermatozoidnim antigenima postoji mogu}nost kontracepcionog imunizovanja mu`jaka i `enki. Infertilnost svih imunizovanih jedinki je potpuna i reverzibilna. Nije uo~eno razvijanje nikakvih alergijskih i autoimunskih 49

50 reakcija posle imunizovanja SOB antigenima. Promene hormonskog statusa imunizovanih `ivotinja, tako e nisu zabele`ene. Moderna metodologija rekombinantne DNK i `ivih vektora (bakterije i virusi) koji bi nosili rekombinantne SOB antigene omogu}ila je ostvarivanje ideje o oralnoj kontracepcionoj vakcinaciji i verovatno }e doprineti smanjenju tro{kova proizvodnje ovih vakcina. Jedan od nedavno otkrivenih SOB proteina, ozna~en kao YLP-12 antigen, zadovoljava ve}inu postavljenih kriterijuma. S obzirom da nema mnogo studija koje se bave YLP-12 antigenom, budu}a istra`ivanja }e odrediti njegovo pravo mesto u mno{tvu kandidata koji bi mogli predstavljati osnovu kontracepcione vakcine TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK (rdnk) Tehnologija rekombinantne DNK bazirana je na identifikaciji i izdvajanju gena koji determini{u sintezu kriti~nog molekula i inkorporisanje izdvojenog gena u genom bakterije, virusa ili gljivice. Posledice ovog genetskog in`injeringa su sinteza i sekrecija kriti~nog antigena od strane mikroorganizama i/ili njihova ekspresija na samim mikroorganizmima. Tehnologija rekombinantne DNK je unela revolucionarne pomake u svim sferama medicine, biologije, imunologije pa i imunokontracepcije. U imunokontracepcionom smislu mogu}nosti koje su otvorene ovom tehnologijom budu}im kontracepcionim vakcinama daju odlike koje nije mogu}e posti}i bilo kakvim unapre ivanjem klasi~nih kontracepcionih sredstava. Neki od novih kvaliteta koje tehnologija rekombinantne DNK (rdnk) unosi u sferu kontracepcionih vakcina su: (a) Otvaranje mogu}nosti dobijanja velikih koli~ina relativno ~istog antigena. (b) Pove}anje imunogeni~nosti eksprimiranih kontracepcionih antigena na mikroorganizmima. (c) Vakcinama baziranim na mikroorganizmima otvorena je mogu}nost oralne imunizacije. (d) Pokretanje prete`no humoralnog imuniteta i smanjenje u~e{}a komplikacija. ili ljudi imunizovani (inficirani) `ivim mikroorganizmima (vektorima) mogu inficirati druge jedinke i doprineti {irenju vektora u populaciji do epidemijskih razmera. (f) Kontracepciona vakcina bazirana na `ivim vektorima mo- `e se upotrebiti u vojne svrhe kao biolo{ko oru`je. 50

51 Tehnologija rekombinantne DNK poznatija je pod nazivom geneti~ko in`enjerstvo. To je postupak stvaranja rdnk i njeno propagiranje u `ivim }elijama. Osnovni postupci u tehnologiji rdnk su: isecanje odre enih delova DNK, stvaranje rekombinovane DNK, uvo enje rdnk u }eliju u kojoj }e se umno`avati i kontrolisano eksprimirati, identifikacija i selekcija }elijskih klonova sa rdnk, umno- `avanje tj. kloniranje unete DNK. Identifikacija SOB antigena Izolacija sekvence DNK za SOB antigene Ugra ivanje sekvence DNK u genom vektora Imunizacija `ivotinje `ivim vektorom Imunizovana `ivotinja produkuje antifertilizaciona antitela [ema 9. Identifikacija SOB antigena i gena koji ga determini{e, in`injering `ivog vektora (virus, bakterija, gljivica) i njegova upotreba kao imunokontracepcione vakcine Isecanje fragmenata DNK izvodi se pomo}u restrikcionih endonukleaza. To su bakterijske endonukleaze koje seku DNK na ta~no odre enim sekvencama nazvanim restrikciona mesta. Nes- 51