PROIZVODNJA OCETNE KISLINE*

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŽIVILSKA TEHNOLOGIJA PROIZVODNJA OCETNE KISLINE* Janez Zaviršek, Kristina Zidar, Veronika Zubin, Vesna Zupančič (študentje tretjega letnika študija Živilske tehnologije) prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Paš (mentorja) Ljubljana, 2001 * Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

2 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 2 POVZETEK Ocetna kislina imenovano tudi etanojska kislina (CH 3 COOH) in je pomembna karboksilna kislina. Je čista, brezbarvna tekočina. Čista 100% ocetna kislina imenujemo tudi ledocetna kislina, ker zmrzuje v led že pri 16,6 C. Po vsem svetu poznajo ocetno kislino kot kis, če jo pridobimo s fermentacijo etanola s pomočjo ocetnokislinske bakterije. Mikroorganizmi, v tem primeru bakterija, pripadajo rodu Acetobacter. Ocetna kislina je glavna karakteristična komponenta kisa, saj njena koncentracija pogojuje jakost kisa. V kisu jo je približno 4-6,5%. Poznamo tri načine pridobivanja kisa: Orleanski proces, Boerhaavejeva metoda in submerzna ali potopna metoda. Kis največ uporabljamo kot začimbo za vlaganje sočivja in gob in za uravnavanje kisline v predelanih živilih. Razen tega, da pridobivamo ocetno kislino kot kis, je ogromne količine pridelamo tudi sintetično. Etilni alkohol se spremeni z oksidacijo v ocetno kislino. Glavni proizvajalci sintetične ocetne kisline so Združeni narodi, Zahodna Evropa, Japonska, Kanada in Mehika. Ocetnokislinske bakterije so po Gram-u negativne, obligatno aerobne bakterije, ki jih delimo v dva rodova: Acetobacter in Gluconobacter. Te bakterije imajo zmožnost oksidacije alkoholov in sladkorjev. Rod Acetobacter je že dolgo v uporabi za pridobivanje kisa, saj etanol pretvori v ocetno kislino. Oksidacija etanola poteka preko dveh zaporednih stopenj: oksidacije etanola v acetaldehid ter acetaldehida v acetat. Reakciji katalizirata encima alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza. Celokupna reakcija se glasi: 2 CH 3 CH 2 OH + O 2 2 CH 3 COOH + 2 H 2 O. SUMMARY Acetic Acid also called Ethanoic Acid (CH 3 COOH), the most impotant of the carboxylic acids. It's a clear colorless, corrosive liquid. Pure 100% acetic acid is called glacial acetic acid, becouse it freezes to an ice-like solid at 16,6 C. There are three basic methods for making vinegar: the Orleans process, the Boerhaave method, and submerged fermentation. Vinegar controlling the growth of microorganisms; and enhancing flavors. Besides that produced as vinegar, vast amounts of acetic acid are prepared synthetically. Ethyl alcohol is converted industrially to acetic acid by oxidation. The major producers of synthetic acid are courrently the United States, Western Europe, Japan, Canada and Mexico. The acetic acid bacteria are Gram-negative and obligately aerobic bacteria consisting of two genera: Acetobacter and Gluconobacter. This bacteria are characterized by the strong activities to oxidized alcohols and sugars. Becouse of this activities, Acetobacter strains have been used since historic ages for the vinegar fermentation. The oxidation of ethanol proceeds according to the basic equation: 2 CH 3 CH 2 OH + O 2 2 CH 3 COOH + 2 H 2 O. Acetic acid is produced by the twostep process. The first step is the oxidation of ethanol to acetaldehyde, the second is the oxidation of acetaldehyde to acetate. The reactions are catalyzed by enzymes: alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase.

3 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 3 KAZALO VSEBINE 1.UVOD ZGODOVINA BIOPROCESA Biološka proizvodnja Orleanski proces Proizvodnja z imobilizirano kulturo Starejša metoda Novejša metoda Submerzni način Kemijska proizvodnja MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA Taksonomija ocetnokislinskih bakterij 6 3.2Izolacija in identifikacija ocetnokislinskih bakterij Metode identifikacije Pogoji, ki vplivajo na rast ocetnokislinskih bakterij Koncentracija ocetne kisline Voda Hranila Kisik Etanol Bakteriofagi Industrijsko uporabljeni rodovi Izboljšanje aktivnosti ocetnokislinskih bakterij BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA Aerobni proces Alkoholna fermentacija Ocetnokislinska fermentacija Etanol Sladkor Acetat Ogljikovi hidrati Dušik Rastni faktorji Fiziologija Anaerobni proces BIOINŽINIRSKE OSNOVE PROCESA Uvod Pripravljalni postopki Postopki priprave za submerzni postopek pridobivanja ocetne kisline Postopki priprave za pridobivanje kisa z uporabo površinske kulture Postopki priprave za proizvodnjo z imobilizirano kulturo Potek bioprocesov Potek submerznega postopka pridobivanja ocetne kisline Potek pridobivanja ocetne kisline z uporabo površinske kulture Potek pridobivanja ocetne kisline z imobilizirano kulturo Zaključni postopki Postopki bistrenja Postopki konzerviranja EKOLOŠKI VIDIK BIOPROCESA Izpostavljanje in razširjenost Učinki na zdravje Varstvo in preprečevanje Učinki na okolje UPORABA BIOPROIZVODA V PROIZVODNJI HRANE Uporaba ocetne kisline Uporaba kisa REFERENCE. 20

4 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 4 1. UVOD Ocetna kislina je najstarejša organska kislina, ki so jo odkrili pri kisanju vina. V naravi je zelo razširjena, nekaj v obliki estrov, nekaj proste. Latinsko ime zanjo je Acidum aceticum (acetum = lat. ocet ), njene soli pa so acetati. Po nomenklaturi IUPAC pa je to etanojska kislina, soli etanoati. Je brezbarvna čista tekočina. Tabela 1: Fizikalne in kemijske lastnosti ocetne kisline Struktura CH3COOH Ionizacijska konstanta 1' pri 25 C pka 4' 76 Tališče -8' 5 C Vrelišče 118 okus Kisel vonj Oster Čista 100% ocetna kislina imenujemo tudi ledocet, ker zamrzuje v led že pri 16,5 C. Ocetna kislina je naravna kislina, vendar jo uporabljajo v industrijah pridelano iz nafte. Njena industrijska uporaba je zelo široka, saj z njeno pomočjo izdelujemo različne vrste: -kovinskih acetatov; uporaba v tiskalnih postopkih -vinil acetatov; v proizvodnji plastike in umetnih vlaken -celuloze acetatov; glavna sestavina v fotografskih filmih in tekstilu -hlapni organski estri; npr. etil in butil acetati, so topila barv, rastlinskih smol, lakov - Ocetna kislina je tudi dodatek v bencinu, uporabljajo jo pogosto v kozmetiki npr: v lotionih za beljenje kožnih pegic, v vodicah za roke in barvah za lase. OCETNA KISLINA Vinil acetat Klor ocetna kislina Anhidrid Acetatni ester Tekstil farmacevtski kis Soli Vinilna plastika barve lepila Farmacija Plastika Topila Nevtralizerji fungicidi mesni konzervansi Laki acetat tekstilna vlakna foto filmi Shema 1: Uporaba ocetne kisline (Cheryan, 1997)

5 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 5 Velike količine ocetne kisline uporabljamo kot kis. Francoska beseda za kis = vinagire in dobesedno pomeni»kislo vino«. Besedo uporabljajo Francozi tudi za druge kisle tekočine, ki temeljijo na alkoholu. Kis pridobivamo na različne načine, najboljše vrste kisa pa nastanejo po Orleanskem procesu. Da nastane kvaliteten kis, je potrebno kontrolirati hitrost in temperaturo kisanja. Če ne spremljamo pravilno sam potek, se proces kisanja lahko konča z izgubo arome ali pa se reakcija bakterij nadaljuje in povzroči neprijetno grenak okus. 2. ZGODOVINA BIOPROCESA V preteklosti so ocetno kislino uporabljali v medicini in verjetno je bila prvi znani antibiotik. V večini človeške zgodovine so jo pridobivali s fermentacijo sladkorja v etilni alkohol in njegovo poznejšo oksidacijo v ocetno kislino s pomočjo mikroorganizmov. Leta 1864 je francoski fizik Louis Pasteur dokazal, da je bakterija Acetobacter tista, ki je sposobna oksidirati alkohol v ocetno kislino Biološka proizvodnja Orleanski proces Orleanski proces velja za najstarejšo metodo. V sod velik približno 200 litrov vlijemo drozgo (120 litrov), ki je sestavljena iz vina in ostalih alkoholnih komponent. Na začetku dodamo tudi manjšo količino oz. ostanek že narejenega kisa iz prejšnje šarže, ki vsebuje kisno bakterijo. Na površini se po določenem času namnoži ocetnokislinska bakterija, ki tvorijo film. Tej mreni pravimo tudi klobuk ali kisova matica, naredi pa se tam, kjer ima omogočen največji dostop do kisika. Te opne ne smemo sprati navzdol, zato so sodi opremljeni s posebnimi lijakom, ki omogoča dotakanje od spodaj in ne površinsko. Nad nivojem tekočine je izvrtanih več luknjic, ki omogočajo prezračevanje. Vse luknjice so prekrite s tkanino, gazo, ki preprečuje dostop insektom (jeguljica, vinska mušica). Oskrbeti moramo še konstantno optimalno temperaturo od 28 do 30 C. Po treh ali štirih mesecih se proces spreminjanja alkohola v ocetno kislino počasi zaključuje. Ko koncentracija ocetne kisline doseže približno 5% odtočimo kis skozi pipo na dnu sodčka. V našem primeru pustimo litrov za naslednji proces. Dotočimo isto količino vina, kot jo odtočimo. Opisani postopek je dobil ime po francoskem kralju Orleansu, kjer so ga že v 16. stoletju uporabljali za industrijsko proizvodnjo kisa. Danes se uporablja le za lastne potrebe v gospodinjstvih in za prodajo v manjših količinah. Glavna slabost Orleanskega procesa glede na ostalo tehnologijo je v tem, da je dolgotrajen. Poleg tega je pri tem postopku za kisarne večjih zmogljivosti potrebna tudi velika proizvodnja površina in večje število zaposlenih ljudi. Vendar pa obstajajo tudi številne prednosti. Oprema je preprosta in relativno poceni ter potreba po energiji zanemarljiva. Podobni načini proizvodnje bi bili zato najbolj primerni v državah, kjer so nizke cene zemljišč in delovne sile. Kljub dejstvu, da z Orleanskim postopkom lahko dobimo izdelek najboljše kvalitete, je na ta način pridobljen samo majhen delež svetovne proizvodnje kisa.

6 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije Proizvodnja z imobilizirano kulturo Starejša metoda V drugi polovici 17. Stoletja je danski tehnolog, Herman Boerhaave ugotovil, da je količina nastale ocetne kisline v proizvodnji kisa enaka površini, ki je izpostavljena zraku. Izboljšanje je zato temeljilo na večji površini in boljšem prezračevanju. Prva metoda, ki je upoštevala ti dejstvi je izgledala takole: Dva lesena soda z dvojnim dnom so napolnili z gozdnimi peclji in tanjšimi vejicami vinske trte, preko katerih so vsakodnevno pretakali kisano tekočino iz enega soda v drugega. S tem so dosegli povečanje stične površine med bakterijskim filmom in substratom, izboljšano prezračevanje ter znatno skrajšan čas metode Novejša metoda Gornji sistem je doživel številne izboljšave. Kapljalni proces je površinska fermentacija v kateri je mikrobna populacija pritrjena na primerno oporo (leseni ostružki,..) Tekočina se nič več ne pretaka iz soda v sod, temveč kontinuirano kroži od dna generatorja na vrh, kjer ponovno kaplja navzdol preko polnila z adherirano kulturo, počasi pronica zopet do dna, dokler reakcija ni končana. Etanol se 88-90% spremeni v ocetno kislino, ostal substrat pa uporabimo v proizvodnji biomase ali pa preprosto izhlapi. Prednosti te metode so; nizka cena, preprosta kontrola, visoka koncentracija ocetne kisline, ne zavzema velikih površin. Slabosti pa; cena lesenih ostružkov, dolg začetni čas ter izguba etanola pri izhlapevanju Submerzni način Naslednji tehnološko naprednejši korak je nastal leta 1949, ko sta Ebner in Hromatkar uporabila submerzno biotehnološko tehniko za oksidacijo etanola v ocetno kislino. Startna koncentracija alkohola in ocetne kisline je natančno določena. Dobro prezračevanje je obvezno, saj v največji količini določa sam potek kisanja. Ko je v tekočini biotehnološkega postopka dosežena koncentracija etanola na zastavljeno vrednost, izločijo določeno vrednost kisa iz bioreaktorja. Sledi polnjenje z novo drozgo do začetnih koncentracij za naslednji cikel. Praznjenje je hitro, polnjenje pa počasno pri konstantni temperaturi in mešanju. S tem preprečimo, da se bakterije ne poškodujejo ali celo odmrejo. Tudi pena škodljivo vpliva nanje, zato uporabljajo mehanski odstranjevalec pene. 2.2.Kemijska proizvodnja Leta 1916 je bila potreba po sintetičnem pridobivanju ocetne kisline mnogo večja od biološke. Pridobivamo jo po reakciji 1: CH 2 =CH 2 + H 2 O CH 3 -CHO + O 2 CH 3 -COOH acetilen acetaldehid ocetna kislina Reakcija 1: Pretvorba acetilena v ocetno kislino

7 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 7 Prednost kemijske sinteze je velika proizvodnja koncentrirane ocetne kisline, slabosti pa je več in to so: potreba po visoki temperaturi, tlaku, nevarnost eksplozije, visoka cena katalizatorjev, odvisnost neobnovljivih surovih materialov, onesnaževanje. Tako proizvedeno ocetno kislino uporabljamo predvsem v industrijske namene in ne živilske. Proizvodnja od takrat narašča, kar nam pove zgovoren podatek, da je med v ZDA narastla za celih 18%. 3. MIKROBIOLOŠKE OSNOVE PROCESA 3.1 Taksonomija ocetnokislinskih bakterij Ocetnokislinske bakterije so po Gramu negativne, mikro metrov dolge, elipsoidne ali paličaste bakterije. Imajo flagele, kar jim omogoča hitro premikanje. So obligatni aerobi, ki proizvajajo pigmente ali celulozo. Zmožne so mutiranja in z lahkoto spremenijo obliko. Najpomembnejša sposobnost ocetnokislinskih bakterij je oksidacija etanola v ocetno kislino. To njihovo lastnost človek že tisočletja uporablja za izdelovanje različnih vrst kisa (vinski, jabolčni, alkoholni, rižev, sladni in drugi). Prvi, ki je ločil različne vrste ocetnokislinskih bakterij je bil Hansen, leta 1879 ( Bacterium aceti, Bacterium pasteurianum, Bacterium kützingianum). Kasneje so ocetnokislinske bakterije uvrstili v družino Acetobacteriaceae in znotraj družine v rodova Acetobacter in Gluconobacter (De Ley s sod., 1984). Le-ta med seboj razlikujemo po sposobnosti oksidacije acetata in laktata do CO 2 in H 2 O. To sposobnost imajo le vrste rodu Acetobacter, ne pa vrste iz rodu Gluconobacter. Med obema rodovoma ocetnokislinskih bakterij pa obstaja tudi značilna razlika v velikosti PCRproduktov medgenskih regij 16S-23S rdnk (število in velikost nukleotidov), kar nam omogoča hitro razlikovanje obeh rodov. (Trček, 1999) Znotraj rodu Acetobacter danes razlikujemo vrste: A. aceti, (Beijerinck, 1898) A. diazotrophicus, (Gillis s sod., 1989) A. hansenii, (Gossele s sod., 1983) A. liquefaciens, (Gossele s sod., 1983) A. methanolicus, (Uhling s sod., 1986; Urakami s sod., 1989; Sievers s sod., 1994) A. pasteurianus, (Beijerinck, 1916) A. xylinus, (Yamada, 1983) A. europaeus, (Sievers s sod., 1992) A. intermedius, (Boesch s sod., 1998) A. oboeediens, (Sokollek s sod., 1998) A. pomorum, (Sokollek s sod., 1998) znotraj rodu Gluconobacter pa vrste: G. asaii, (Mason in Claus, 1989) G. frateurii, (Yamada in Akita, 1984) G. oxydans (De Ley, 1961) G. cerinus. (Mason in Claus, 1989). Razmišljanja znanstvenikov vodijo tudi v pridobitev ocetne kisline z anaerobno fermentacijo glukoze s Clostridium thermoaceticum.

8 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije Izolacija in identifikacija ocetnokislinskih bakterij Mikrobno naravo proizvodnje kisa je prvi odkril Künitz, leta Izoliral je ocetnokislinske bakterije in tako dokazal, da inokulum kisa vsebuje majhne organizme razporejene v verigah. Industrijski proces pridobivanja kisa se še vedno začne z inokulumom, ki vsebuje nedefinirane mikroorganizme iz prejšnjega oksidacijskega cikla. Pri izolaciji teh mikroorganizmov pa se pojavi problem, saj kulture filtrata iz industrijskega acetatorja za rast potrvbujejo gojišče z določenim phjem in nekaterimi drugimi začetnimi pogoji. Pri zahtevanih pogojih pa mikroorganizmi preplavijo posodo s starter kulturo, kar otežuje njihovo identifikacijo. Hitro razmnoževanje jim omogoča kratka lag faza, toleranca na etanol in dokaj visoke koncentracije ocetne kisline ter druge ugodne lastnosti za razmnoževanje. Vzrok za to, da avtorji opisujejo različne vrste ocetnokislinskih bakterij, ki naj bi bile odgovorne za proizvodnjo kisa, je zagotovo v uporabi različnih izolacijskih gojišč in postopkov izolacije, ki ne dajejo enakih možnosti za rast vsem vrstam iz ocetnokislinske populacije, v uporabi različnih vrst kisa, kisa iz različnih geografskih področij in v različnih odstotkih ocetne kisline v vzorcih kisa v času izolacije bakterij. In ravno zaradi težav pri izolaciji teh bakterij iz kisa bi bilo nujno razviti tehniko, ki bi omogočila direktno identifikacijo vrst iz ocetnokislinske populacije v bioreaktorju za proizvodnjo kisa. To bi omogočilo spoznavanje vrst v populaciji ocetnokisllinskih bakterij iz različnih stopenj oksidacije etanola v ocetno kislino in pripomoglo k boljšemu poznavanju bioprocesa proizvodnje kisa. (Trček, 1999) Metode identifikacije Ocetnokislinske bakterije lahko identificiramo z analizo profila plazmidov (Davies s sod.,1981). Plazmidi so okrogle, ekstrakromosomske DNK molekule, katerih profil je zelo specifičen za določeni rod bakterij. Razlike plazmidnih profilov predstavljajo osnovo tehniki za identifikacijo mikroflore. Raziskave zadnjih let so pokazale, da se profili plazmidov določenega rodu, tudi po petih letih mirovanja, ne spremenijo. V zadnjem času je bila za identifikacijo bakterijskih vrst uspešno uporabljena regija med genoma za 16S in23s rrnk. Za hitro razlikovanje rodov Acetobacter in Gluconobacter pa obstaja značilna razlika v velikosti PCR-produktov medgenskih regij 16S-23S rdnk. Medvrstno razlikovanje rodu Acetobacter pa omogoča razlika v restrikcijskih mestih medgenskih regij 16S-23S rdnk (Trček, 1999). Za identifikacijo genov ocetnokislinskih bakterij, pa so uporabne manipulacijske tehnike DNK, ki temeljijo na gostiteljskemu vektorju. (Beppu, 1993) 3.3 Pogoji ki vplivajo na rast ocetnokislinskih bakterij Koncentracija ocetne kisline Ocetnokislinske bakterije imajo relativno visoko toleranco na kislost (veliko rodov je zmožnih rasti pri ph nižjem od 5), tako da jih kislina ki jo proizvedejo ne ubije. So pa občutljive na hitre spremembe v koncentraciji ocetne kisline, ki poškodujejo bakterije. Zaželjene so bakterije s čim višjo toleranco kislosti. Naraščanje totalne koncentracije ocetne kisline ima na rastno krivuljo ocetnokislinskih bakterij večji vpliv pri kontinuirnem postopku kot pri semikontinuirnem postopku. (Ebner s sod., 1996)

9 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije Voda Paziti moramo, da voda ki jo dodajamo pri procesu nastanka kisa ne vsebuje snovi, ki uničujejo bakterije (Cl, ozon ). (Ebner s sod., 1996) Hranila Za izdelavo alkoholnega kisa z do 15% ocetne kisline, potrebujejo ocetnokislinske bakterije glukozo, kalij, natrij, magnezij, kalcij, amonijev fosfat, sulfate, kloride in še nekatere druge minerale. Ti dodatki so potrebni za optimalni nastanek ocetne kisline. (Ebner s sod., 1996) Kisik Uporaba čistega kisika ali zraka bogatega s kisikom lahko rahlo poškoduje ocetnokislinske bakterije. (Ebner s sod., 1996) Etanol Ocetnokislinske bakterije se prav tako poškodujejo, če primanjkuje etanola. (Ebner s sod., 1996) 3.4 Bakteriofagi Acetobacter specifični bakteriofagi, vidni pod elektronskim mikroskopom, naj bi bili odgovorni za probleme pri industrijskem postopku pridobivanja ocetne kisline (Teuber s sod.,1987). Postopek se upočasni, skoraj nikoli pa se ne ustavi popolnoma. Vsi fagi, ki so bili izolirani pri ocetnokislinski proizvodnji imajo enako strukturo. Imajo dolge repe in izometrične glave, tako da jih uvrščamo v Bradley-evo A skupino in v družino Myoviridae (Ackermann, 1987). 3.5 Industrijsko uporabljeni rodovi Industrija kisa je vedno uporabljala ocetnokislinsko bakterijo, ki v večini primerov ni bila pridobljena iz čistih kultur.industrijski postopek pridobivanja kisa se začne s cepljenjem s»cepljivim kisom«oz. mikrobiološkimi ostanki prejšnjega procesa kisanja. Pridobivanje ocetne kisline lahko traja več let brez prekinitve ali povečanja efektivnosti, če so zagotovljeni primerni pogoji. Iz industrijske rabe je znano, da se lastnosti ocetnokislinske bakterije, ki je izolirana, lahko zelo spremenijo. Bakterija pokaže lastnosti, ki so predvsem posledica privajanja na določeno koncentracijo ocetne kisline. Industrija kisa se zanima predvsem za uporabo vrste ocetnokislinske bakterije, ki tolerira visoke koncentracije ocetne kisline, zahteva malo hranil, preveč ne oksidira oblikovane ocetne kisline in ima zmožnost večje proizvodnje. (Ebner s sod., 1996) 3.6 Izboljšave aktivnosti ocetnokislinskih bakterij V interesu industrije je proizvajati kis s čim višjimi odstotki ocetne kisline. Eden izmed pristopov, ki bi lahko izboljšal naravno produktivnost proizvodnih sevov, je zagotovo povečanje števila kopij genov za alkohol- in aldehid-dehidrogenazo v genomu seva. Transformacija A. aceti subsp. xylinus z rekombinantnim plazmidom, z genom za aldehid dehidrogenazo, je povečala produktivnost seva na dvakratno vrednost in maksimalno koncentracijo ocetne kisline na 1.4-kratno v primerjavi s

10 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 10 sevom brez rekombinantnega plazmida (Fukaya s sod., 1989). Tako bi bilo mogoče s povečanjem števila kopij gena za acetaldehid dehidrogenazo (Thurner s sod., 1997) v A. europaeus ta tehnološki parameter še izboljšati. Za tak eksperiment je nujno potrebno imeti določena delovna orodja, med katerimi so tudi vektorji prenosa teh genov. Za genetsko izboljšavo Acetobacter vezi je rekombinacija DNA zelo uporabna. Rod, ki ga vzgajamo pri 37 C in 4% koncentraciji ocetne kisline, in rod, ki ni zmožen rasti pri 35 C in 5% koncentraciji ocetne kisline, sta bila sferično nanešena in zmešana. Dobljeni produkti so rasli pri 37 C in 5% koncentraciji ocetne kisline. Pri teh pogojih oba prejšnja rodova nista bila zmožna rasti. Raziskave pridobivanja ocetne kisline pri visokih koncentracijah le te, so stalno v teku v laboratorijih Heinrich Frings GmbH&co., z namenom, da bi povečali toleranco vezi napram ocetni kislini. Te kulture so dobavljene tovarnam ocetne kisline po vsem svetu. 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA Ocetno kislino lahko pridobivamo s kemično sintezo iz naftnih komponent in kemikalij s tremi kemijskimi reakcijami: oksidacija acetaldehida, oksidacijo hidroogljika in karbonizacijo metanola. Drugi način pridobivanja ocetne kisline je po biološki poti z aerobnim ali anaerobnim procesom. Kis je blaga raztopina ocetne kisline. Ocetna kislina je produkt delovanja ocetnokislinskih bakterij, ki so sposobne etanol v raztopini oksidirati do ocetne kisline. Za tvorbo ocetne kisline je potreben etanol, ki ga s svojim metabolizmom iz sladkorja proizvedejo kvasovke. Prva stopnja je tako produkcija etanola iz ogljikovih hidratov, v drugi stopnji pa se etanol oksidira do ocetne kisline. V industrijski proizvodnji ocetne kisline je v navadi uporaba nenaravnega etanola kot surovega materiala. V tem primeru prva stopnja procesa, pretvorba ogljikovih hidratov ob prisotnosti kvasovk, ni potrebna. Dogajanje pri katerem dobimo iz raztopin, ki vsebujejo sladkorje, v dveh stopnjah ocetno kislino, ponazarja shema 2. Shema 2: Shematični prikaz produkcije kisa (Adams, 1985)

11 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 11 Po teoretičnih izračunih dobimo 0.67 g ocetne kisline (0.51 g etanola) na 1g glukoze (Encyclopedia of Microbiology, 2000). V praksi sta za 1% ocetne kisline v končnem izdelku potrebna vsaj 2% sladkorja v surovini (Adams, 1985). Prva faza, ki jo izvajajo mikroorganizmi je produkcija etanola iz raztopine, ki vsebuje sladkorje. ph vrednosti v kislem območju (med 4 in 5) ter relativno velika začetna koncentracija sladkorja (okoli 10%) ustvarjajo pogoje, ki omogočajo prevlado kvasne mikroflore nad ostalimi prisotnimi mikroorganizmi. Med fermentacijo se ph vrednost niža, povečuje pa se koncentracija etanola, kar ima inhibitorni učinek na mnoge mikroorganizme. Zaradi nastajanja CO 2 se postopoma vzpostavijo anaerobni pogoji, kar povzroči odmrtje morebitno prisotnih obligatno aerobnih mikroorganizmov. Trdimo lahko torej, da alkoholno fermentacijo v celoti izvedejo kvasovke (Adams, 1985). Alkoholna fermentacija je spontana, vendar ima slabe izkoristke, saj lahko sladkor namesto za nastajanje etanola za svoj razvoj izkoriščajo tudi drugi mikroorganizmi kot so mlečnokislinske bakterije, zato v kisarnah pogosto uporabljajo različne tehnike inokulacije kvasovk. V nekaterih primerih inokulum predstavlja biomasa, ki je po fermentaciji prehodne šarže ostala na stenah posode. Sodobne kisarne pa seveda sadni sok cepijo s čistimi kulturami kvasovk, ki so jih vzgojili sami ali pa kupili v različnih oblikah (aktivne v tekočih gojiščih, posušene, stisnjene). Največkrat so uporabljeni različni sevi Saccharomyces cerevisiae (Adams, 1985). Alkoholna fermentacija oziroma pretvorba heksoz v etanol, ki jo izvaja Saccharomyces cerevisiae, kemijsko opišemo z enačbo, ki jo predstavlja shema 3. C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 monosaharid etanol ogljikov dioksid Shema 3: Pretvorba heksoze v etanol po Gay-Lusacu (Adams, 1985) Etanol ne nastane direktno iz glukoze, temveč iz piruvata. Tega kvasovke tvorijo iz glukoze v zaporedju več reakcij, ki jim skupno pravimo Embdem-Mayerhoff-Parsova pot razgradnje glukoze. Teoretično iz 1g glukoze pri alkoholni fermentaciji nastane 0,511g etanola. Ta teoretična vrednost ni nikoli dosežena zaradi tvorbe nekaterih drugih metabolitov (Bluhm, 1983). Proces je anaeroben, poteka pri temperaturi med 30 in 32 C, med njegovim potekom pa se sproščajo tudi večje količine energije (cca. 239 kj/mol glukoze, od česar cca. 30% uskladiščijo kvasne celice v ATP, ostalo pa se sprosti v okolico kot toplota). Čas trajanja alkoholne fermentacije je odvisen od večjih dejavnikov, večinoma pa je zaključena v 48 do 72 urah. (Adams, 1985) 4.1. Pridobivanje ocetne kisline iz etanola po aerobni poti Med bioprocesom pridobivanja ocetne kisline se etanol skoraj kvantitativno oksidira do ocetne kisline. Običajni izplen je med 95 in 98%, ostanek je običajno izgubljen v izhajajočem plinu. Istočasno se primeren vir šestih ogljikovih atomov (zaželjena glukoza) oksidira. Končna produkta te 2 CH 3 CH 2 OH + O 2 2 CH 3 COOH + 2 H 2 O etanol kisik ocetna kislina voda Shema 4: Pretvorba etanola v ocetno kislino. (Saeki s sod., 1997)

12 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 12 oksidacije sta CO 2 in H 2 O. Celokupno reakcijo prikazuje shema 4. Take oksidacijske reakcije vključujejo nepopolno oksidacijo alkohola, katero spremlja kopičenje oksidacijskega produkta v rastnem mediju. (Saeki s sod., 1997) Faktorji, ki vplivajo na potek procesa Etanol Oksidacija etanola s strani ocetnokislinskih bakterij poteka preko dveh zaporednih stopenj. Prva stopnja je oksidacija etanola v acetaldehid, druga stopnja pa oksidacija iz acetaldehida v acetat. Reakciji katalizirata alkohol dehidrogenaza (ADH) in aldehid dehidrogenaza (ALDH). Encima sta vezana na zunanjo površino periplazmične membrane in katalizirata oksidacijske reakcije v periplazmičnem prostoru (prostor med citoplazemsko membrano in t.i. zunanjo membrano celične stene pri Gramm negativnih bakterijah).v obeh so prisotni citokromski elementi, ki sodelujejo pri prenosu elektronov. Njuna funkcija je povezana z dihalno verigo organizma. Alkohol dehidrogenaza je bila izolirana iz različnih ocetno kislinskih bakterij. Dokazano je bilo, da vsebuje pyrroloquinoline quinone (PQQ) kot tudi hem C kot prostetični skupini. Pokazano je bilo, da je alkohol dehidrogenaza ocetnokislinskih bakterij direktni donor elektronov ubikinonom v citoplazemskih membranah. Potemtakem je etanoloksidazna dihalna veriga pri ocetnokislinskih bakterijah sestavljena iz samo treh komponent alkohol dehidrogenaza, ubikinon in terminalna oksidaza. Dehidrogenaze quinoproteinov, glukoze, alkohola in aldehida, sodelujejo pri oksidaciji sladkorjev, kar jih povezuje z elektronskim transportnim sistemom v membrani oksidativnih bakterij. Alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza izolirana iz A. polyoxogenes sp. nov. roda, ustvarjenega v tovarni kisa, kažeta večjo produkcijo kisa in večjo toleranco do ocetne kisline kot rodovi izolirani iz naravnih surovin. V nasprotju z alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza pridobljenih iz A. aceti in G. suboxydans, so bili encimi A. polyoxogenes dokaj stabilni. Zgleda, da je ta visoka stabilnost delno povezana z možnostjo, sposobnostjo A. poloxogenes, da proizvajajo visoke koncentracije ocetne kisline. Kemizem oksidacije etanola v ocetno kislino ponazarja shema 5. (Ebner s sod., 1996) Shema 5: Shematični prikaz kemizma oksidacije etanola v ocetno kislino (Lafon-Lafourcade, 1983)

13 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije Sladkor Acetobacter razgrajuje sladkorje z heksoze monofosfatno potjo (HMP) in ciklom trikarboksilnih kislin, medtem ko je glikoliza šibka ali je sploh ni. Encimi Enter-Doudoroffove poti so prisotni pri Glukonobacter in Acetobacter xylinum. Ti dve bakteriji sta znani po njuni sposobnosti za direktno oksidacijo sladkorjev, alkoholov in steroidov. ( Ebner s sod., 1996 ) Acetat Rodovi Acetobacter so sposobni oksidirat acetat tako dobro kot laktat, četudi ob prisotnosti ali odsotnosti etanola z uporabo encimov cikla trikarboksilnih kislin. ( Ebner s sod., 1996 ) Ogljikov dioksid Acetobacter potrebuje za svojo rast CO 2. Ta se vgrajuje v celične snovi, kjer je približno 0,1% celotnega ogljika prihaja iz CO 2. Iz katabolizma CO 2 prihaja zelo majhna vendar merljiva količina ocetne kisline. (Ebner s sod., 1996) Dušik Če je prisoten vir organskega ogljika, lahko določeno število ocetnokislinskih bakterij uporablja amoniak kot edini vir dušika. Nekateri rodovi potrebujejo prisotnost aminokislin, nekateri potrebujejo kofaktorje kot so vitamini ali purini. Ni poznanih esencialnih aminokislin. (Ebner s sod., 1996) Rastni faktorji Potreba po rastnih faktorjih je odvisna od zalog ogljika. Nekateri rodovi potrebujejo kot raste faktorje p-aminobenzojsko kislino, niacin, thiamin ali pantotensko kislino. Nekateri rodovi Acetobacter ob prisotnosti glukoze ne potrebujejo vitaminov. Vendar ima kombiniran dodatek glutationina z Naglutamatom komulativen efekt na rast Acetobakter aceti. Pyrroloquinoline quinone (PQQ), prostetična skupina pri ocetnokislinskih bakterijah, kaže zanimiv rastno-stimulativen efekt za različne mikroorganizme. Eden od dveh učinkov pyrroloquinoline quinona je bila stimulacija obeh rastnih krivulj in celotnega celičnega donosa le z sledovi pyrroloquinoline quinona kot esencialnega rastnega faktorja. Drugi učinek pyrroloquinoline quinona, ki je bil splošno opažen, je bila redukcija lag faze pri mikrobni rasti, toda brez povečanja krivulje rasti pri sledeči eksponentni fazi ali pri totalnem celičnem doprinosu pri stacionarni fazi. V kulturnih gojiščih so skoraj vsi rodovi mikroorganizmov proizvedli pyrroloquinoline quinon. (Ebner s sod., 1996) Fiziologija Seštevek etanola (vol%) in ocetne kisline (g na 100 ml) imenujemo totalna ali skupna koncentracija, ker je vsota dveh drugače nerazdružljivo merljivih količin in nam poda maksimalno koncentracijo ocetne kisline, ki jo lahko dobimo z zaključenim procesom. Ob odsotnosti izgub zaradi izhlapevanja in prekomerne oksidacije je skupna koncentracija konstantna tekom celotnega procesa acetifikacije. Etanol tako pogojuje maksimalno koncentracijo ocetne kisline v končnem produktu.

14 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 14 Med komercialno uporabo večine aerobnih mikroorganizmov je v navadi pustiti inokulum v fermentatorju določen čas, do nekaj dni, brez aeracije preden prenesemo v glavni fermentator. Pri pridobivanju ocetne kisline je aplikacija te procedure nemogoča. Narejeni so bili ekstenzivni testi, upoštevajoč škodljiv učinek ocetnokislinskih bakterij na prekinitev aeracje kot funkcije skupne koncentracije, ocetnokislinske koncentracije, stopnje acetifikacije in trajanja prekinitve aeracije. Daljša je prekinitev aeracije in višja je totalna koncentracija kaše, večji je efekt. Pri skupni koncentraciji 5% prekinitev aeracije za 2-8 min vodi do enake poškodbe kot prekinitev za sek pri skupni koncentraciji 11-12%. Pri konstantni skupni koncentraciji se škoda povečuje s povečanjem koncentracije ocetne kisline in s povečanjem stopnje acetifikacije. Prekinitev dotoka kisika prav tako povzroči oster padec aktivnosti vključenih encimov, alkohol in aldehid dehidrogenaze. Produkcija specifičnega celičnega materiala je ekstremno nizka. V razmerah industrijske produkcije ocetne kisline so mikroorganizmi podvrženi znatnemu stresu zaradi visoke koncentracije ocetne kisline in omejene količine kisika. Visoka poraba kisika do 70% je lahko dosežena v industrijski proizvodnji. Varčna, zmerna uporaba zraka je zelo pomembna zaradi hlapnosti etanola in ocetne kisline. Uporaba čistega kisika oz. zraka bogatenega s kisikom lahko rahlo poškoduje bakterijo. Ocetnokislinske bakterije se prav tako poškodujejo, če pride do pomanjkanja etanola. Ta nastopi takrat, ko je proces pridobivanja ocetne kisline prenesen na točko, kjer je bil ves etanol oksidiran in je dodatek sveže drozge, ki vsebuje etanol odložen. To je analogno poškodbam, ki nastanejo zaradi prekinitve dotoka kisika in je tudi primarno odvisno od skupne koncentracije in trajanja pomanjkanja etanola. Pri semikontinuiranem procesu ob naraščanju koncentracije ocetne kisline ni bilo padca specifične rastne krivulje, ta se pojavi pri naraščanju skupne koncentracije. Specifična rastna krivulja pade iz 0,49 h -1 pri 5% na 0,16 h -1 pri 11%. V kontinuiranih kulturah pri skupni koncentraciji 12% specifična krivulja rasti pade iz 0,027 h -1 pri 4,5% etanola na 0,006 h -1 pri 1% etanola. Obstaja velika odvisnost med nastajanjem specifičnih produktov in koncentracijo ocetne kisline v kontinuiranih procesih pri 7% skupni koncentraciji. Maksimalnem nastajanju specifičnega produkta sledi rasti-pripisan mehanizem tako dolgo, kot je koncentracija ocetne kisline pod 3%. Pri višji koncentraciji ocetne kisline od 7%, mora bit upoštevan dodaten rasti nepripisan faktor. Polnjenje fermentorja mora biti izvedeno z drozgo enake skupne koncentracije in s hitrim mešanjem, ker lahko lokalno formiran visok koncentracijski gradient poškoduje bakterije. Naslednji cikel prične brez lag faze. Istočasno moramo vzdrževati konstantno temperaturo, ker ponavljajoče spremembe temperature povzročajo podobne poškodbe. Prekomerna oksidacija je nezaželjena oksidacija ocetne kisline v CO 2 inh 2 O, ki mora bit preprečena s stalno prisotnostjo etanola in vzdrževanjem skupne koncentracije na visokem nivoju. V trickle fermentatorju je to težje doseči kot v submerzijskih fermentatorjih. (Ebner s sod., 1996) 4.2. Anaerobni proces Ocetno kislino lahko pridobimo tudi z anaerobno fermentacijo sladkorjev. Produkcija temelji na uporabi mikroorganizmov iz roda Clostridium, ki so sposobni glukozo, ksilozo in druge heksoze ter pentoze skoraj kvantitativno pretvorit v acetat. Clostridium thermoaceticum je sposoben pretvoriti sladkor s petimi ogljikovimi atomi v acetat po enačbi, ki je prikazana s shemo 6. 2 C 5 H 10 O 5 5 CH 3 COOH sladkor acetat Shema 6: Pretvorba sladkorja v acetat po anaerobni poti. (Cheryan M., 2000)

15 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 15 Teoretično bi ta metabolna pot morala privesti do višje stopnje ocetne kisline za enoto glukoze. Glavna ideja za raziskovanje v laboratorijih je bila v potencialni rabi obnovljivih virov kot so surovi materiali, ni pa primerna za proizvodnjo hrane. 5. BIOINŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA 5.1 Uvod Pri opisovanju proizvodnje ocetne kisline ki je precej sorodna proizvodnji kisa smo te dve proizvodnji povezali in jih tudi opisali eno s pomočjo druge in obratno. Proizvodnjo ocetne kisline ali tudi kisa lahko prvotno razdelimo v dve veliki skupini in sicer na tako imenovano domačo in industrijsko proizvodnjo. Industrijsko proizvodnjo lahko nato razdelimo še naprej na več različnih postopkov. In sicer pridobivanje ocetne kisline s pomočjo destilacije suhega lesa, pridobivanje ocetne kisline s katalitično oksidacijo etanola oziroma acetaldehida, prdobivanje kisa z uporabo površinske kulture, pridobivanje kisa z uporabo imobilizirane kulture, submerzni postopek pridobivanja kisa in še nekateri drugi specialni postopki. V naši seminarski nalogi bomo podrobneje opisali submerzni postopek pridobivanja kisa in s tem tudi kot glavni produkt ocetno kislino, medtem ko bomo ostalim postopkom namenili le nekaj besed. 5.2 Pripravljalni postopki Postopki priprave za submerzni postopek pridobivanja ocetne kisline Pri tem postopku se uporabljajo submerzni bioreaktorji in sicer med najpogostejše uvrščamo Frings Acetator iz družbe Heinricha Frings, GmbH & Co. iz Bonna. Proizvedeni so iz nerjavečega jekla, nekateri pa iz lesa. Vse napeljave in armature pa so prav tako iz nerjavečega jekla ali pa umetnih mas (plastike,...). Za konstantno spremljanje razmer je Frings Acetator opremljen še z Frings Alkograph, ki konstantno meri količino etanola v acetatorju po opisu Ebnerja in Enenkla, (1966). Ker pa je Alkograph meril z določenim zamikom so razvili izpopolnjeno napravo imenovano Frings Alkosens. Le ta temelji na tehnologiji sodobnih biosenzorjev z lastnostjo da je bil časovni zamik merjenja precej skrajšan. Ker pa je bila potrebna ponovna kalibracija Frings Alkosens ob vsaki spremembi koncentracije ocetne kisline je tudi to vodilo v razvoj še sodobnejšega Frings Alkosens II. Ta je še bolj izpopolnjen in vsebuje večplastno membrano, novejšo tehnologijo senzorjev in posodobljeno računalniško opremo, ki omogoča popolnoma automatiziran proces kontrole kontinuirne, polkuntinuirne, enofazne in dvofazne fermentacije. Pomemben je tudi aerator v bioreaktorju, ta je avtovsesalnega tipa in se nahaja na dnu, sestavljen pa je iz motorja in turbine ki jo obkroža stator. Turbina vrteča se z od obr/min, vsrkuje zrak in ga prepušča v tekočino skozi številne radialno razporejene luknje, ki so v nasprotni smeri rotacije. Ob tem pa nastaja tudi pena, zato je pomembno tudi, da je bioreaktor opremljen tudi z mehanskim razbijalcem pene.

16 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije Postopki priprave za pridobivanje kisa z uporabo površinske kulture Pri uporabi postopka za pridobivanje ocente kisline z uporabo površinske kulture je le ta glavni pojem postopka. Postopek je drugje po svetu tudi imenovan Orleanski postopek, pri katerem mirkofloro v sloju na površini substrata vzdržujemo aktivno. Vendar je proces polkontinuiren, kar pomeni da je potrebno za vsako šaržo ustvariti nov sloj mikroflore. Biorektor je v tem primeru posoda ki je najpogosteje iz lesa in ima na dnu pritrjeno pipo za odtakanje produkta. Na vrhu ima odprtino zamašeno z bombažem in v njej je tudi lij s cevjo ki vodi globoko proti dnu bioreaktorja za inokulacijo kulture. Posoda ima ob strani nekje blizu vrha tudi odprtino za opazovnje zaprto s steklom in zračnik prekrit z muslinom. Pogosto je vgrajen tudi merilec nivoja substrata v bioreaktorju, ki pa običajno ne izmeri substrata nad 75% volumna bioreaktorja, ker je taka tudi zahteva postopka. Postopek je precej star in so ga v večini primerov zamenjali novejši postopki, nekateri avtorji pa celo menijo da si ta postopek lahko ogledamo le še v muzeju (Conner in Allgeier,1976). Postopek precej uporabljajo še vedno na Japonskem, saj je proizvodnja cena kisa dosti nižja, vendar pa je ta postopek zelo počasen in je zato primernejši za gospodinjsko in domačo proizvodnjo. Res pa je tudi, da je kakovost kisa pridobljenega po tem postopku dosti boljša kot pri submerznem Postopki priprave za proizvodnjo z imobilizirano kulturo Zapisi o tem postopku izvirajo nekje iz druge polovice 17. stoletja, vendar je ta postopek sedaj dosti bolj posodobljen pri katerem je znatno skrajšan čas proizvodnje. Za biotehnološki postopek se uporablja cilindrični leseni bioreaktor ali tako imenovani generator, za nosilce pa različne keramične materiale. Biotehnološka raztopina se v generatorju pretaka od dna navzgor, kjer se jo razškropi preko polnila z adherirano kulturo na keramiki in počasi pronicala zopet do dna (Adams,1985). Po lesenih se kasneje tudi pojavijo tudi bioreaktorji iz nerjaveče pločevine. Zaradi korozivnosti morajo biti tudi vse komponente generatorja iz nerjaveče pločevine ali pa umetnih mas in to je tudi dovolj velik razlog zakaj so se ohranili leseni bioreaktorji tako dolgo. Bioreaktorji iz nerjaveče pločevine pa so lahko napolnjeni tudi z bukovimi oblanci, po katerih prav tako biotehnološko raztopino pršimo z vrha navzdol. Z uporabo merilnikov lahko posodobimo tudi ta proces do polavtomatskega, kljub temu pa cel cikel traja približno 7 dni. Pri tem postopku prihaja tudi do precej velikih izgub kisa zaradi hlapenja in sicer tudi do 20%. 5.3 Potek bioprocesov Potek submerznega postopka pridobivanja ocetne kisline Je glavni postopek pridobivanja ocetne kisline po svetu. Proces vodimo polkontinuirno z začetno koncentracijo ocetne kisline med 7 in 8%, etanola pa je 5%. Ko se koncentracija alkohola zniža na 0,1 do 0,3% se določen del kisa odtoči čim hitreje da se ne porabi ves alkohol, vendar le ta ne sme presegati več kot polovico celotnega volumna. Mankajoči volumen substrata se nato počasi nadomesti z novim substratom pri močnem mešanju, konstantni temperaturi in koncentracijah 0 do 2% ocetne kisline ter 12 do 15% alkohola. Dotakanje tega substrata se konča ko je dosežena želena skupna koncentracija alkohola, kar pa omogoča hitrejše namnoževanje bakterij. Dotok je nameščen neposredno nad aeratorjem, da je zagotovljeno takojšne in učinkovito mešanje s celotno vsebino acetatorja. Tako se cikli nato ponavljajo nekje od 24 do 48 ur s 94% izkoristkom pri pretvorbi etanola v ocetno kislino (Adams, 1985).

17 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 17 Pri procesu moramo paziti na zračenje, ki je zelo pomembno saj že kratek čas brez zračenja lahko pomeni zaustavitev procesa. Proti penjenju pa uporabljamo mehanske razpenilce, ki so pritrjeni na zgornji del bioreaktorja. Pomembni pa so zato, ker bi sicer prišlo do zmanjšanje prenosa kisika in s tem zaviranja biotehnološkega procesa in tudi ob prevelikem penjenju pa se tudi povečuje možnost kontaminacije z nezaželjenimi mikroorganizmi (Adams, 1985) Potek pridobivanja ocetne kisline z uporabo površinske kulture Postopek je v svetu znan tudi pod imenom»orleanski proces«po Francoskem kralju Orleansu, ki je ta postopek že v 14. stoletju uporabljal za industrijsko proizvodnjo kisa. Proces poteka v enem samem bioreaktorju. Optimalni začetni pogoji za potek biotehnološkega procesa pa so pri 2 do 3% ocetne kisline, 20 do 30 g/l alkohola in globini drozge 100mm. Pri delno napolnjenem sodu, nato biotehnološki proces doseže 4,5% ocetne kisline, zato je potrebno del kisa odstraniti, in dotoči svež substrat (Higashide, 1992). Da se površinski sloj mikroflore tem manj poškoduje pa bioreaktorju dodan poseben lijak ki omogoča dotakanje substrata od spodaj in ne na površino. Ena taka šarža se običajno izprazni po 80 dneh in nato se lahko napolni nova. Okus tako proizvedenega kisa je boljši od vseh ostalih metod in postopkov, vendar zaradi dolgega procesa proizvodnje se ga v industrijski uporabi ne uporablja več, le na Japonskem se še vedno s to metodo proizvede od 60 do 70% vsega kisa Potek pridobivanja ocetne kisline z imobilizirano kulturo Pri tem postopku se torej uporablja bioreaktor imenovan generator, ki ga še vedno precej uporabljajo tudi v industriji. Z zunanjim toplotnim menjalnikom omogočamo reguliranje temperaturnega optimuma ki je med 28 in 35 o C. Zadostna količina zraka ki znaša od 0,8 do 0,9 m 3 /h pa zagotavlja umetno ampak kvalitetno prezračevanje z dna generatorja. Ob uporabi določenih merilnikov, lahko vodimo proces tudi polavtomatsko in sicer ob začetni koncentraciji alkohola od 4 do 5% na približno končno koncentracijo 0,3%. Ko je ta koncentracija dosežena je proces ustavljen, nato se del kisa odčrpa ter nadomesti s svežim substratom. To pomeni kratko bakterijsko lag fazo, vendar pa je značaj proizvodnje zato polkontinuiren. Cikel običajno traja 7 dni, precej pa je odvisen od izpopolnjenosti generatorja. 5.4 Zaključni postopki Pri postopkih z ocetno kislino oziroma kisom po končani acetifikaciji, gre za največkrat za konzervirne postopke, izboljšave estetike in metod pakiranja ter shranjevanja. Z naravnimi biotehniološkimi postopki proizvodnje ocetne kisline dobimo koncentracijo ocetne kisline med 10 in 15% in ker je destilacija za proizvodnjo višjih koncentracij zelo zahtevna, se zato koncentriranje ocetne kisline pogosto izvaja z zmrzovanjem in odstranjevanjem ledenih kristalov vode (Adams, 1985) Postopki bistrenja Pri tem postopku se najpogosteje želimo znebiti prisotnih bakterij v surovem kisu ki nam povzročajo motnost. Tega problema nam pri uporabi površinske kultivacije ni potrebno reševati, nastopi pa pri proizvodnjo ocetne kisline z generatorjem. Pri tem se običajno uporablja filterno stiskalnico z diatomejsko zemljo. Pri kisu pridobljenem s submerzno kultivacijo, kjer je biomasa suspendirana v njem, pa je potrebno bistrenje z različnimi sredstvi kot so ribji mehur, kazein

18 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije 18 največkrat pa se uporablja bentonit. V zadnjem času pa se uporablja precej tudi bistrenje z ultrafiltracijo Postopki konzerviranja Kis običajno pasteriziramo pred polnenjem v embalažo s tem se tudi izognemo nastanku motnosti v embaliranem kisu. Pasterizacija poteka lahko pri različnih temperaturah z različnim časom in istim doseženim učinkom smrtnosti mikroorganizmov. Inaktivacijo mikroorganizmov pa tudi lahko izvedemo z žveplanjem, ki je uradno dovoljeno in prav tako določeno s pravilnikom (Ebner in Follmann, 1983). 6. EKOLOŠKI VIDIK BIOPROCESA 6.1. Škodljivi učinki ocetne kisline ter njeno preprečevanje Vsako leto pridelajo več milijonov ton industrijske ocetne kisline. Povsod jo razširijo predelana živila, nekateri kozmetični izdelki in bencinski hlapi. Delavci v tekstilni in papirni industriji in delavci, ki izdelujejo plastične snovi in delavci pri delu s topili so ji pogosto izpostavljeni na delovnih mestih. Seveda utrpi njihovo zdravje velike posledice. Toksikološke lastnosti ocetne kisline ob navadnem izpostavljanju niso znane v podrobnostih. Velike količine v zraku dražijo oči, grlo in zavirajo osrednje živčevje. Ocetna kislina hudo vzdraži sluznico, kožo in oči. Razlita po koži izzove vnetje in kožne razjede. Koncentrirana ocetna kislina, ki pride po nezgodi v oči, lahko pronica skozi roženico in povzroči oteklino šarenice. Majhna količina koncentrirane hudo ožge žrelo, če jo človek popije. Dolgoročno izpostavljanje velikim količinam ocetni kislini je povzročilo pri ljudeh potemnitev kože, bronhitis, kronično vneto žrelo in zobne okvare. Na domu se človek le redko sreča s škodljivimi količinami ocetne kisline. V industriji pa jo povsod uporabljajo. Svetujejo, da se človek natančno pouči, kako se ji lahko izogne. Ocetna kislina v mestnem zraku prispeva pri nastajanju smoga, ker olajša nastajanje ozona, pomembnega onesnaževalca mestnega zraka. Ocetna kislina je največ uporabljena v živilski industriji kot kis. Danes je možna proizvodnja kisa brez kakršnegakoli onesnaževanja okolja. Izpušni plin vsebuje alkohol, ocetno kislino in etil acetat. Te izpušne pline hladijo z mrzlo vodo, kolikor je le mogoče. Zaradi absorbcije preostanka hlapov, čistimo še z vodo, ki je reciklirana in se kasneje uporablja za pripravo drozge. Surov kis vsebuje bakterije, ki morajo biti odstranjene- filtriranje. Danes večina tovarn uporablja»cros-flow«filtracijo, brez pomoči raznih filtrov. Zelo majhne količine trdnih snovi, ki jih proizvedejo ocetnokislinske bakterije, ostane po postopku čiščenja še vedno prisotnih v vodi ~ 100g na 1000 l kisa. V tovarnah, kjer predstavlja kis eno glavnih komponent in ga uporabljajo praktično v vseh proizvodih, (npr. vlaganje sadja in zelenjave) imajo poseben način shranjevanja odpadnega kisa. Kis je kisla tekočina in če bi vso to tekočino izpirali v vodo, bi prišlo do velikega onesnaženja in porušenja naravnega ravnovesja. Če pogledamo to s kemijskega stališča, se kisla voda v stiku z bazično nevtralizira. To pa je tudi eden od načinov s katerim se večje tovarne poslužujejo pri odlaganju tekočih odpadkov. Eta, največja slovenska tovarna, ki se ukvarja z vlaganjem sadja in zelenjave,odlaga odpadno kislo vodo v t.i. egalizacijski bazen. Ta bazen si deli z neko tekstilno tovarno v njeni bližini, katera odlaga alkalno vodo. Vodo iz egalizacijskega bazena potem še dodatno očiščijo oz. reciklirajo. Ta postopek je poceni, vendar pa nimajo vse tovarne te možnosti reševanja perečega vprašanja onesnaževanja okolja.

19 Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE 7.1. Uporaba ocetne kisline Ocetna kislina je naravna kemična spojina v jabolkih, siru, kakavu, grozdju, mleku, pomarančah, peteršilju, breskvah, vrtnih jagodah, borovnicah, ipd. Čisto ocetno kislino ne uporabljamo pogosto v prehrambeni industriji, čeprav je priznana kot varna-gras (Generally Recognized As Safe). Kot tako jo največ uporabljamo kot aromo in zakisovanje v proizvodih kot; narezano, konzervirano sadje in zelenjave, majoneze, kečap, omake, solatni prelivi. Čista ocetna kislina je bolj pomembna v drugih industrijah (kemijska, tekstilna, kozmetična,..) 7.2. Uporaba kisa Mnogo širšo uporabo ocetne kisline v prehrambeni industriji predstavlja kis. Kis je razredčena raztopina ocetne kisline proizvedena v bioprocesu oksidacije etanola s pomočjo ocetnokislinskih bakterij, pri določenih pogojih. V industriji se najbolj pogosto uporablja submerzni način izdelovanja kisa. Nedvomno se pretežni del proizvedenega kisa uporabi v prehrani. Ostrina kisline in aroma, ki prispevajo ostale sestavine kisa, dajeta jedem svežino in bogatejši okus. Ker je kis dobro topilo za eterična olja zelišč in dišav, je osnovna sestavina različnih omak. Kis najdemo tudi v množici drugih živil, kot so ajvar in drugi zelenjavni namazi, majoneza, kečap, vložena zelenjava, kot začimba za meso, perutnino, ribe, dušene jedi, juhe, itd. Nekateri siri vsebujejo tudi izdelke, katerim je dodan kis. Vlaganje zelenjave v kis je poleg sušenja na soncu, soljenja in dimljenja ena od tradicionalnih metod konzerviranja hrane. Pomembna lastnost te tehnike je, da se osnovne senzorične lastnosti precej izgubijo, kljub temu pa je končni izdelek zelo okusen, zaradi česar se ta metoda veliko uporablja. Prednost pred modernejšimi postopki konzerviranja pa je nizka cena. Že 0.1% nedisocirane ocetne kisline inhibira rast večine bakterij, ki povzročajo zastrupitve, ter sporogenih bakterij, 0.3% pa tudi že zavira rast mikotoksikogenih plesni. Učinek ocetne kisline se poveča ob dodatku soli in drugih snovi, ki znižujejo vodno aktivnost. V takih pogoji so sposobni preživetja le redki mikroorganizmi. Antimikrobni učinek ocetne kisline ne temelji samo na nizkem ph,ampak je tudi posledica prisotnosti neioniziranih lipofilnih molekul ocetne kisline. Ugotovili so, da koncentracija ocetne kisline, ki predstavlja 3.6% vseh hlapnih sestavin izdelka, že zagotavlja zadovoljiv učinek konzerviranja. Taka živila so stabilna daljše časovno obdobje, vendar bodo imela zelo kisel okus. Pred uporabo mora kis nekaj časa odležati, da pridobi aromatične snovi.s kisom lahko odstranimo tudi vodni kamen, madeže na armaturah in povečamo čistilni učinek delovnih površin. V industrijsko razvitih državah je poraba kisa na prebivalca nekaj čez 2 litra letno preračunano na kis s 5% ocetne kisline.