UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO UROŠ STANIČ

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO UROŠ STANIČ RAZGRADNJA NEKATERIH ZDRAVILNIH UČINKOVIN IN NJIHOVIH METABOLITOV V SIMULIRANIH POGOJIH ČIŠČENJA ODPADNIH VODA DEGRADATION OF SELECTED PHARMACEUTICALS AND THEIR METABOLITES IN SIMULATED WASTE WATER TREATMENT CONDITIONS DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana, 2010

2 Diplomsko delo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo in na Odseku za znanosti o okolju Instituta Jožef Stefan pod mentorstvom prof.dr. Marije Sollner Dolenc in somentorstvom doc.dr. Ester Heath. Mentorici prof.dr. Mariji Sollner Dolenc se zahvaljujem za pomoč in usmerjanje v času diplomskega dela. Somentorici doc.dr. Ester Heath in dr. Tini Kosjek se iskreno zahvaljujem za pomoč, svetovanje, potrpljenje in podporo tekom celotnega dela. Za pomoč pri laboratorijskem delu se zahvaljujem Silvi Perko. Za dodatno pomoč pa se zahvaljujem še Mihi Avberšku in Renatu Babiču. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelal pod mentorstvom prof.dr. Marije Sollner Dolenc in somentorstvom doc.dr. Ester Heath. Ljubljana, september 2010

3 VSEBINA 1 POVZETEK SEZNAM OKRAJŠAV UVOD ZDRAVILNE UČINKOVINE KOT OKOLJSKA ONESNAŽILA ZDRAVILNE UČINKOVINE IN NJIHOVA UPORABA LASTNOSTI IN DELOVANJE PREUČEVANIH SPOJIN LETNA PORABA ZDRAVILNIH UČINKOVIN ZDRAVILNE UČINKOVINE V OKOLJU DOLOČANJE OSTANKOV ZDRAVILNIH UČINKOVIN V ODPADNI VODI BIOLOŠKO ČIŠČENJE ODPADNIH VOD POGOJI ČIŠČENJA ODPADNIH VOD FIZIKALNO-KEMIJSKI PARAMETRI MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV ODPADNE VODE NAMEN DELA MATERIALI IN METODE MATERIALI METODE PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV IZKORISTEK EKSTRAKCIJE IN KALIBRACIJA PILOTNA ČISTILNA NAPRAVA IN VZORČENJE DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE ANALIZNI POSTOPEK DOLOČANJA ANALITOV V VZORCIH REZULTATI IN RAZPRAVA IZKORISTKI EKSTRAKCIJE IN LINEARNOST ANALIZNE METODE MEJA ZAZNAVNOSTI ANALIZNE METODE DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE MASNI SPEKTRI PREUČEVANIH SPOJIN ODSTRANJEVANJE ZDRAVILNIH UČINKOVIN ODSTRANJEVANJE METABOLITOV PRIMERJAVA ODSTRANJEVANJA V SKLOPLJENIH IN AEROBNIH REAKTORJIH SKLEP LITERATURA

4 1 POVZETEK Zdravilne učinkovine in mnogi njihovi presnovki so biološko aktivne spojine, ki po uporabi v humani ali veterinarski medicini po različnih poteh preidejo v okolje. Številne raziskave so potrdile njihovo prisotnost v odpadnih, površinskih in podtalnih vodah, zato smo lahko njihovemu vplivu posredno izpostavljeni z uživanjem pitne vode. Naraščajoča poraba zdravilnih učinkovin je v začetku devetdesetih let prejšnjega stoletja pripeljala do začetka obsežnejšega preučevanja njihovega vpliva na okolje. V diplomskem delu smo preučevali odstranjevanje izbranih zdravilnih učinkovin in njihovih presnovkov v pilotni čistilni napravi pod aerobnimi in anoksičnimi pogoji ter v sklopljenem sistemu anoksični-aerobni reaktor. Z merjenjem vrednosti različnih kemijskih parametrov (amonij, nitrat, nitrit, ortofosfat, kemijska in biokemijska potreba po kisiku) smo potrdili procesa nitrifikacije v aerobnih ter denitrifikacije v anoksičnih pogojih. Kot modelne spojine smo izbrali nesteroidne protivnetne učinkovine ibuprofen, naproksen, ketoprofen in diklofenak, antiepileptik karbamazepin, klofibrinsko kislino, humani presnovek lipidnega regulatorja klofibrata, presnovka karbamazepina akridin in akridon ter 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on, presnovek diklofenaka. Visoka letna poraba učinkovin je potrdila smiselnost njihovega izbora. Spojine smo iz vodnih vzorcev izolirali z ekstrakcijo na trdnem nosilcu, pri tem smo raztopinam dodali interna standarda devteriran ibuprofen za zdravilne učinkovine ter 9-kloroakridin za presnovke. Sledila je derivatizacija z N- metil-n-(tercbutildimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamidom. Ločbo in analizo smo izvedli s plinskim kromatografom z masno spektrometričnim detektorjem. Izkoristki ekstrakcije so bili za vse spojine višji od 76 %. Odstranjevanje ibuprofena, naproksena, ketoprofena in akridina v aerobnih pogojih je bilo več kot 90-odstotno, medtem ko so se ostale spojine odstranjevale v manjši meri. V anoksičnih pogojih sta se najbolje odstranjevala naproksen (87 %) in akridin (64 %), ostale spojine so se odstranjevale manj kot 13-odstotno. V sklopljenih sistemih so se ibuprofen, naproksen in ketoprofen statistično značilno bolje odstranjevali kot v posameznih reaktorjih, medtem ko za druge spojine tega ne moremo trditi. 2

5 ABSTRACT Pharmaceuticals and many of their metabolites are biologically active substances that are used in human and veterinary medicine and subsequently reach the environment through different pathways. Numerous studies have confirmed their presence in wastewater, surface and subterranean water, thus we can be subject to their influence indirectly through consuming drinking water. In the beginning of the 1990s, the increase in consumption of pharmaceutical products led to the widespread study of their influence on the environment. In our work, we have studied the elimination of selected pharmaceuticals and their metabolites in a pilot wastewater treatment plant under aerobic and anoxic conditions and in the coupled anoxic-aerobic reactor system. By measuring various chemical parameters (ammonia, nitrate, nitrite, orthophosphate, chemical and biochemical oxygen demand) we have confirmed the processes of nitrification in aerobic conditions and denitrification in anoxic conditions. The model substances used were the non-steroidal anti-inflammatory drugs ibuprofen, naproxen, ketoprofen and diclofenac, the antiepileptic carbamazepine, clofibric acid, the human metabolite of the lipid regulator clofibrate, the metabolites of carbamazepine acridine and acridone, and 1-(2,6-dichlorophenyl)indolin-2-one, a metabolite of diclofenac. The substantial yearly consumption of the pharmaceuticals justified our selection. We have used solid phase extraction to isolate the compounds from the water samples, adding the internal standards deuterated ibuprofen and 9-chloroacridine (for pharmaceuticals and metabolites respectively) in the process. This was followed by derivatization with N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)-2,2,2-trifluoroacetamide. We have used gas chromatography coupled with a mass spectrometry detector to perform the separation and analysis. The extraction efficiency was above 76% for all studied compounds. The elimination of ibuprofen, naproxen, ketoprofen and acridine in aerobic conditions was over 90%, while other compounds were eliminated in a lesser degree. In anoxic conditions, only naproxen (87%) and acridine (64%) were eliminated substantially, the elimination of all other compounds was below 13%. The elimination of ibuprofen, naproxen and ketoprofen was greater in the coupled system than in individual reactors to a statistically significant degree, while we could not confirm the same for other compounds. 3

6 2 SEZNAM OKRAJŠAV OKRAJŠAVA BPK 5 COX DKFI DMS GC GC-MS KPK LC LLE LOD MS MTBSTFA RSD SCAN SD SIM SPE SPME TBDMS TBMS TOC POMEN biokemijska potreba po kisiku v petih dneh ciklooksigenaza (cyclooxygenase) 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on dimetilsilil plinska kromatografija (gas chromatography) plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo (gas chromatography- mass spectrometry) kemijska potreba po kisiku tekočinska kromatografija (liquid chromatography) ekstrakcija tekoče-tekoče (liquid-liquid extraction) meja zaznavnosti (limit of detection) masna spektrometrija (mass spectrometry) N-metil-N-(tercbutildimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamid relativna standardna deviacija snemanje čez celotno masno območje standardna deviacija snemanje izbranih ionov (selected ion monitoring) ekstrakcija na trdnem nosilcu (solid phase extraction) mikroekstrakcija na trdnem nosilcu (solid phase microextraction) terc-butildimetilsilil terc-butilmetilsilil celotni organski ogljik (total organic carbon) 4

7 3 UVOD 3.1 ZDRAVILNE UČINKOVINE KOT OKOLJSKA ONESNAŽILA ZDRAVILNE UČINKOVINE IN NJIHOVA UPORABA Zdravilo je vsaka snov ali kombinacija snovi, ki se uporablja za zdravljenje ali preprečevanje bolezni pri ljudeh in živalih, oz. se dajejo, da bi se ponovno vzpostavile, izboljšale ali spremenile fiziološke funkcije prek farmakološkega, imunološkega ali presnovnega delovanja ali da bi se določila diagnoza (1). Številne novo odkrite zdravilne učinkovine so tekom dvajsetega stoletja imele velikanski vpliv na družbo, predvsem na znatno podaljšanje pričakovane življenjske dobe in kakovosti življenja posameznika. Mnoge, v preteklosti smrtonosne bolezni, kot so npr. nekatere bakterijske infekcije, so postale le manjša skrb za javno zdravje. Povečana pričakovana življenjska doba pa je pripeljala tudi do večje pojavnosti npr. rakavih obolenj, nevrodegenerativnih in avtoimunih bolezni, posledica česar je povečana potreba po zdravstveni oskrbi (in zdravilnih učinkovinah) ter vse večji stroški javnega zdravstva (2). Poleg želenih pa imajo zdravilne učinkovine praviloma tudi neželene učinke, ki so lahko bolj ali manj škodljivi. Te se skuša tekom razvoja, predkliničnih in kliničnih študij opredeliti in čim bolj zmanjšati. Pomembno vlogo ima farmakovigilanca, tj. spremljanje in poročanje o neželenih učinkih zdravil v četrti, t. i. postregistracijski (marketinški) fazi kliničnih preskušanj, kjer lahko pride do pojava toksičnosti zaradi dolgoročne izpostavitve, kar je včasih težje ovrednotiti v časovno krajših prvih treh fazah (2). Zdravilne učinkovine so kompleksne, biološko aktivne spojine, med katerimi vlada velika raznolikost tako po fizikalno-kemijskih kot po bioloških lastnostih. Delimo jih lahko glede na delovanje ali pa glede na kemijsko strukturo. Večinoma gre za lipofilne snovi, kar olajša prehajanje bioloških membran, vendar pa ovira njihovo izločanje. Zato so pogosto podvržene metabolični transformaciji, ki jo delimo v dve fazi: - fazo I, v kateri pride do uvedbe ali izpostavitve funkcionalne skupine, najpogosteje so to reakcije oksidacije, ter - fazo II, v kateri pride do konjugacije z endogenimi spojinami, npr. glukuronsko kislino, kar poveča njihovo vodotopnost in tako pospešuje izločanje. 5

8 To lahko izkoriščamo pri načrtovanju zdravilnih učinkovin v primeru predzdravil, kjer pride do metabolične pretvorbe biološko neaktivnih v aktivne spojine. V nekaterih primerih pa imajo lahko metaboliti celo večjo aktivnost in so bolj toksični od osnovne spojine (2, 3, 4) LASTNOSTI IN DELOVANJE PREUČEVANIH SPOJIN V okviru diplomskega dela smo preučevali ibuprofen, naproksen, ketoprofen, diklofenak in njegov metabolit 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on, klofibrinsko kislino (aktiven metabolit klofibrata) ter karbamazepin in njegova metabolita akridin in akridon. Ibuprofen, naproksen, ketoprofen in diklofenak uvrščamo med nesteroidne protivnetne učinkovine (NSAID). Prvi trije so derivati propanojske kisline, diklofenak pa je derivat fenilocetne kisline. Delujejo kot neselektivni inhibitorji encima ciklooksigenaza (COX). COX katalizira pretvorbo arahidonske kisline v prostaglandine in tromboksane. V telesu se pojavlja v treh oblikah: - COX-1 je konstitutiven encim, ki se normalno pojavlja v večini tkiv in sodeluje pri homeostazi, npr. agregaciji trombocitov, zaščiti gastrointestinalnega trakta ter regulaciji pretoka skozi ledvice, - COX-2 je inducibilen encim, kar pomeni, da se izraža le ob določenih dražljajih (rastni faktorji, citokini, oksidativni stres, razne poškodbe ipd.) in sodeluje pri vnetnem procesu ter pojavu povišane telesne temperature. Izjemoma se v nekaterih tkivih (možgani, ledvice) nahaja tudi konstitutivno, vendar njegova vloga v teh primerih še ni pojasnjena, - COX-3 se nahaja konstitutivno v možganih, srcu in aorti (2, 4). Neselektivni inhibitorji ciklooksigenaze delujejo tako na COX-1 kot na COX-2. Imajo protivnetno in protibolečinsko delovanje ter znižujejo povišano telesno temperaturo. Običajne indikacije so revmatična obolenja, glavobol, postoperativna bolečina, putika, dismenoreja ipd. Najbolj pogost neželen učinek je iritacija gastrointestinalnega trakta, ki v hujših primerih lahko privede celo do ulkusne razjede in je posledica inhibicije COX-1. Drugi neželeni učinki so motnje pretoka krvi v ledvicah in strjevanja krvi (4). Klofibrinska kislina je aktiven metabolit klofibrata, ki nastane po hidrolizi esterske skupine učinkovine. Klofibrat uvrščamo med fibrate. Ti znižujejo nivo plazemskih lipidov, med drugim znižajo nivo VLDL (posledično tudi trigliceridov) in LDL ter zvišujejo koncentracijo HDL. Delujejo kot agonisti jedrskih receptorjev PPARα. Glavni učinki so 6

9 povečanje transkripcije genov za lipoproteinsko lipazo (ta hidrolizira lipide v lipoproteinih) in povečanje privzema LDL v jetrih, med drugim pa vplivajo tudi na izboljšanje glukozne tolerance in znižujejo plazemski nivo C-reaktivnega proteina. Med neželene učinke sodi miozitis, ki se sicer pojavi redko, vendar v hujših oblikah lahko pride celo do rabdomiolize z mioglobinurijo in akutno odpovedjo ledvic. Do tega največkrat pride pri ljudeh s poslabšano funkcijo ledvic. Klofibrat tudi poveča verjetnost nastanka žolčnih kamnov in se zato največkrat uporablja pri bolnikih, ki jim je bil odstranjen žolčnik (4). Karbamazepin sodi med najbolj uporabljane antiepileptične učinkovine. Deluje na napetostno odvisne natrijeve kanalčke, in sicer se veže na kanalčke v inaktiviranem stanju. S tem prepreči prehod kanalčkov iz inaktiviranega v mirujoče stanje ter tako zmanjša število kanalčkov na voljo za tvorbo akcijskega potenciala, saj depolarizacija nevrona poveča število kanalčkov v inaktiviranem stanju. Ta sposobnost diskriminacije med različnimi stanji kanalčka omogoča, da preferenčno blokira vzdraženje celic, ki generirajo veliko število akcijskih potencialov. Za epileptične napade je značilno visokofrekvenčno sproščanje električnih impulzov skupine nevronov v možganih, zato se karbamazepin lahko uporablja za zdravljenje in preprečevanje epileptičnih napadov, učinkovit je predvsem pri parcialnih in tudi tonično-kloničnih napadih. Druge indikacije so npr. trigeminalna nevralgija in bipolarne motnje. Med neželene učinke sodijo slabost, vrtoglavica, ataksija, zadrževanje vode (posledično hipernatriemija) ter različne gastrointestinalne in kardiovaskularne motnje. Verjetnost pojava neželenih učinkov je sicer manjša kot pri drugih antiepileptikih. Karbamazepin je tudi močan induktor jetrnih mikrosomalnih encimov in tako lahko pospešuje presnovo številnih drugih zdravilnih učinkovin (npr. varfarina, oralnih kontraceptivov, kortikosteroidov itd.) ter s tem zmanjša njihov učinek (4). 7

10 Na slikah 1 6 so predstavljene strukturne formule preučevanih spojin in nekaterih njihovih metaboličnih produktov. Slika 1: Ibuprofen in nekateri njegovi biotransformacijski produkti ter pogoji, pod katerimi pride do njihovega nastankaa Slika 2: Ketoprofen Slika 3: Naproksen 8

11 Slika 4: Klofibrat in njegov humani metabolit klofibrinska kislina Slika 5: Diklofenak in njegov biotransformacijski produkt 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on Slika 6: Karbamazepin in njegova biotransformacijska produkta akridin in akridon 9

12 Na Sliki 7 je predstavljena predlagana pot metabolične razgradnje karbamazepina do akridina in akridona, ki poteče pod vplivom mikroorganizmov. Najprej poteče oksidacija do 10,11-epoksi derivata, sledi kontrakcija sedemčlenskega obroča do šestčlenskega, nastane akridin-9-karbaldehid. Po odcepu karbonilne skupine nastane akridin, po nadaljnji hidroksilaciji pa 9-hidroksiakridin, ki je enolna tavtomerna oblika akridona. Slika 7: Predlagana pot razgradnje karbamazepina do akridina in akridona (5) 10

13 3.1.3 LETNA PORABA ZDRAVILNIH UČINKOVIN V Preglednici II so navedene ocenjene letne porabe zdravilnih učinkovin v Nemčiji (leto 2001) in Sloveniji (leto 2006). Slednje smo izračunali iz števila izdanih receptov zdravil za posamezno učinkovino (Preglednica I). Diklofenak in naproksen sta med najpogosteje predpisanimi zdravilnimi učinkovinami, ibuprofen, ketoprofen in karbamazepin pa so tudi med pogostejšimi v svojih skupinah glede na indikacije. Klofibrat v Sloveniji ni registriran. Preglednica I: Število izdanih receptov (Rp) v RS v letu 2008 (6) Spojina Rp Spojina Rp ibuprofen enalapril naproksen omeprazol ketoprofen klofibrat - diklofenak atorvastatin acetilsalicilna kisl amoksicilin paracetamol amoksicilin in zav. lakt.b karbamazepin Preglednica II: Ocenjena letna poraba zdravilnih učinkovin v Nemčiji (7) in Sloveniji Spojina Porabljena masa v Nemčiji (t/leto) Porabljena masa v RS (t/leto) ibuprofen 128 (1,55 g/preb.) 0,93 (0,47 g/preb.) naproksen - 4,07 (2,04 g/preb.) ketoprofen - 0,41 (0,21 g/preb.) diklofenak 49 (0,59 g/preb.) 1,65 (0,83 g/preb.) karbamazepin 78 (0,95 g/preb.) 1,56 (0,78 g/preb.) klofibrinska kislina (0,18 0,25 g/preb.) - 11

14 3.1.4 ZDRAVILNE UČINKOVINE V OKOLJU Vse večja poraba zdravilnih učinkovin je v začetku devetdesetih let 20. stoletja pripeljala do začetka preučevanja njihovega vpliva na okolje (Environmental Risk Assessment, ERA), podobno kot se je to že izvajalo za toksične snovi. Zdravilne učinkovine, ki se uporabljajo v humani in veterinarski medicini, lahko po različnih poteh pridejo v površinske oz. podtalne vode in so posledično lahko prisotne tudi v pitni vodi (8), kar je prikazano na Sliki 8. Slika 8: Poti vnosa zdravil za humano medicino v vodno okolje Zdravilne učinkovine, ki se uporabljajo v humani medicini, in njihovi presnovki se prek urina in fecesa izločajo v kanalizacijo in pridejo do čistilnih naprav. Pri nekaterih spojinah pride do razgradnje v čistilnih napravah, druge spojine (oz. njihovi presnovki) pa so odpornejše na razgradnjo in bodisi neovirano prehajajo v površinske vode bodisi ostajajo v blatu, odvisno od njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti. Če se blato nato uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne učinkovine preidejo v prst in od tod tudi v podtalnico. Vir zdravilnih učinkovin v okolju je lahko tudi neprimerno odlaganje neuporabljenih zdravil (8). Večina zdravilnih učinkovin, ki se uporabljajo v veterini, konča v gnojnici in tako prehaja v prst. Del se jih tudi prek urina in fecesa pašnih živali direktno izloča v zemljo, od koder lahko ogrožajo podtalnico. V ribogojstvu se zdravilne učinkovine, ki se dodajajo hrani, uvajajo neposredno v vodo. Ta prehaja v lokalne čistilne naprave in če se blato iz leteh uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne učinkovine preidejo v prst. Nekateri antibiotiki (npr. streptomicini) se uporabljajo v sadjarstvu in čebelarstvu (8). 12

15 Čistilne naprave so verjetno edina možnost za odstranjevanje zdravilnih učinkovin, zato je pomembno preučevanje kroženja in razgradnje spojin med samim procesom čiščenja. Pri biotransformaciji zdravilnih učinkovin imajo največjo vlogo encimske reakcije. Te so običajno zelo kompleksne, obsegajo različne poti (vzporedne, kompetitivne), lahko prihaja tudi do indukcije ali inhibicije procesov. Pogosto nastane več razgradnih produktov, ki lahko: - ohranijo lastnosti matične spojine, - izkazujejo večjo toksičnost od matične spojine, - vodijo v sinergistične ali aditivne farmakološke efekte z drugimi prisotnimi spojinami, - izgubijo farmakološko aktivnost (9). Nekatere spojine so težko razgradljive in se lahko kopičijo v okolju, npr. sulfametoksazol, klofibrinska kislina, eritromicin ipd. Mnoge lahko tudi povzročijo akutne ali kronične negativne reakcije tako na ekosistemih kot na ljudeh. Hormoni, npr. estrogen, lahko v koncentracijskem območju zgolj ng L -1 vplivajo na razmnoževanje ali spolni razvoj, npr. feminizacijo samcev rib (10). Preglednica III predstavlja izmerjene koncentracije preučevanih spojin v odpadnih, površinskih in pitnih vodah v različnih državah. Vidimo lahko, da so vsebnosti v odpadni vodi približno 5 10-krat višje kot v površinskih vodah. V pitni vodi so navadno prisotne v 1000-krat nižjih koncentracijah, izstopata pa predvsem ZDA in Nemčija, ki imata med omenjenimi državami največ prebivalcev in posledično tudi največjo porabo ter obremenitev okolja. Opazimo lahko visoke koncentracije karbamazepina in klofibrinske kisline, obe spojini se namreč slabo razgrajujeta in se kopičita v okolju. Preglednica IV predstavlja uspešnost odstranitve izbranih zdravilnih učinkovin v pilotnih čistilnih napravah pod različnimi pogoji čiščenja. Najbolje se odstranjujejo ibuprofen, naproksen in ketoprofen, medtem ko se diklofenak, karbamazepin in klofibrinska kislina odstranjujejo v manjši meri. Naproksen se kot edina spojina dobro odstranjuje tudi v anaerobnih pogojih. 13

16 Preglednica III: Vsebnost preučevanih spojin v odpadni (Codp), površinski (Cpov) ter najvišja izmerjena vsebnost v pitni (Cpit max ) vodi v nekaterih državah, a koncentracije na iztoku, b koncentracije na vtoku (3, 10, 11, 12, 13) Spojina ibuprofen Codp (µg L -1 ) 0,05 3,35 a 8,8 14,3 b Cpov (µg L -1 ) 0,05 0,28 do 0,005 Cpit max (ng L -1 ) 3 8, ,6 0,017 0,313 do 0,009 0,2 ketoprofen 8 do 0,015 3 diklofenak 0,005 1,59 a 0,005 0, do 0,033 2,5 0,21 0,7 b 0,009 0,282 karbamazepin do 6,9 a do 1,1 klofibrinska kislina 0,46 1,56 a 0,017 0,025 b ,2 do 0,056 0,005 0, ,3 država Nemčija Finska ZDA Švedska Francija Švedska Slovenija Francija Finska Francija Nemčija Francija Švedska Slovenija Nemčija ZDA Francija Nemčija Italija Švedska Preglednica IV: Uspešnost odstranitve v pilotnih čistilnih napravah, ana. Anaerobna razgradnja, anox. Anoksična razgradnja Spojina Uspešnost odstranitve (%) Vir ibuprofen ana. (14) (7) (7) (3) naproksen ana. (14) (7) (7) ketoprofen (13) anox. diklofenak ana. (14) (7) (7) (3) (7) 0 ana. (7) anox. karbamazepin < 40 klofibrinska kislina 2 6 (3) anox. (3) 14

17 3.1.5 DOLOČANJE OSTANKOV ZDRAVILNIH UČINKOVIN V ODPADNI VODI Določanje vsebnosti zdravilnih učinkovin in njihovih biotransformacijskih produktov v okolju zahteva identifikacijo in kvantifikacijo sledov v kompleksnih vodnih medijih (npr. odpadna voda) ter različnih trdnih vzorcih (npr. blato, usedline). Analizne tehnike morajo zato biti specifične za določene snovi, da jih lahko ločimo od številnih nečistot in omogočati zaznavo zelo majhnih količin. Za pravilno določanje zdravilnih učinkovin se tako po derivatizaciji uporablja različne sklopljene sisteme, npr. LC/MS/MS ali GC/MS/MS (7). Ker so vzorci pogosto preveč kompleksni, razredčeni ali nezdružljivi s kromatografskim sistemom, da bi omogočali neposredno injiciranje, je potrebna ustrezna priprava (15). Priprava vzorcev in analiza poteka v več stopnjah: - vzorčenje, - izolacija in koncentriranje, - derivatizacija, - ločba in identifikacija. Vzorčenje Vzorčenje je pomemben korak v analiznem postopku, pri katerem je pomembno upoštevati spremenljivost samega vira glede na letni čas (poletje, zima), dan v tednu (delovnik, vikend), meteorološke in geografske značilnosti ipd. Za določanje splošne obremenitve je priporočljivo proporcionalno vzorčenje (časovno ali pretočno), za določanje najvišjih koncentracij pa večkratno trenutno vzorčenje. Pomembna je tudi mikrolokacija vzorčnega mesta (npr. blizu bolnišnic, industrije), zato je za splošno sliko potrebno zbiranje na več različnih mestih. Ravno tako pa je zelo pomembno shranjevanje samih vzorcev pri primernih pogojih (npr. v zamrzovalniku, z dodatkom dezinfekcijskih sredstev ipd.), da ne pride do razgradnje analitov pred analizo (7). Izolacija in koncentriranje Postopki izolacije zdravilnih učinkovin morajo biti enostavni, hitri in poceni, morajo imeti kvantitativne izkoristke izolacije za izbrano spojino. Za izolacijo organskih spojin iz vodnih vzorcev najpogosteje uporabljamo ekstrakcijo in adsorpcijo (15). 15

18 Ekstrakcijo tekoče-tekoče (LLE), kjer se spojine porazdelijo med dve fazi (organsko topilo voda) glede na svoje fizikalno-kemijske lastnosti, je povečini zamenjala ekstrakcija na trdnem nosilcu (SPE). Ta ima pred LLE številne prednosti: - višji izkoristki, - večja selektivnost, specifičnost in ponovljivost, - ni nastanka emulzij, - zmanjšana poraba velikokrat strupenih organskih topil, - skrajšan čas priprave vzorca, - možnost avtomatizacije. Pri SPE se spojine porazdelijo med tekočo in trdno fazo, do katere naj bi imele večjo afiniteto. Ključna je izbira primerne stacionarne trdne faze (adsorpcijskega sredstva), saj ta določa parametre, kot so selektivnost, afiniteta in kapaciteta za vezavo. Večinoma gre za silikate z vezanimi ogljikovodikovimi verigami (C8 do C18), ki določajo polarnost, ionske izmenjevalce ali različne polimere, npr. kopolimer divinilbenzena in vinilpirolidona (7,15). Mikroekstrakcija na trdnem nosilcu (SPME) je največkrat neposredno povezana z analiznim instrumentom (GC-MS). Pri SPME se uporabljajo kolone iz silikatnih vlaken, prevlečene s tankim filmom polimerne stacionarne faze, ki se za določen čas pomočijo v vodni vzorec. Prednosti SPME v primerjavi z SPE so manjši volumen vzorca, enostavna avtomatizacija in visoko koncentriranje. Slabosti pa sta omejena kapaciteta in pogosto prenizka občutljivost za okoljske vzorce (7). Derivatizacija Plinska kromatografija se uporablja za ločbo termično stabilnih hlapnih organskih spojin. Veliko spojin, še posebej tistih z visoko molekulsko maso in/ali polarnimi funkcionalnimi skupinami, ni stabilnih pri visokih temperaturah oz. ne prehajajo v plinsko fazo. Temu se lahko izognemo z derivatizacijo teh spojin, tj. pretvorbo v nepolarne, termično stabilne in hlapne oblike (15). Derivatizacijski reagent je sestavljen iz nepolarnega organskega dela, ki omogoča hlapnost, vpliva pa tudi na obseg derivatizacije zaradi steričnih in elektronskih efektov, ter reaktivne skupine (15). 16

19 Med najbolj razširjenimi metodami derivatizacije je tvorba trimetilsililnih (TMS) estrov in etrov, reagenti, ki se za to uporabljajo, so npr. N-metil-N-(tercbutildimetilsilil) trifluoroacetamid (MTBSTFA), N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamid (MSTFA) in N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoracetamid (BSTFA). Reakcija siliranja (splošna shema je predstavljena na Sliki 9) poteka v brezvodnih pogojih, na uspešnost reakcije pa vplivajo izbor sililnega reagenta, topila in temperature (15). Slika 9: Splošna shema reakcije siliranja Ločba in identifikacija Za ločbo analitov se najpogosteje uporabljajo različne kromatografske metode. Glede na mobilno fazo ločimo: - plinsko kromatografijo (GC), kjer je mobilna faza inerten plin, - superkritično tekočinsko kromatografijo (SFC), kjer je mobilna faza plin (tekočina) nad kritičnimi pogoji (temperaturna in tlak), - tekočinsko kromatografijo (LC), kjer je mobilna faza tekočina nizke viskoznosti (15). Pri GC in LC se spojine med ponavljajočim se procesom sorpcije in desorpcije porazdelijo med stacionarno in mobilno fazo glede na njihovo afiniteto do ene ali druge. Ločba je posledica različnega časa zadrževanja na stacionarni fazi (15). Plinsko kromatografijoo pogosto uporabljamo pri analizi vzorcev odpadnih vod. Stacionarna faza je lahko tekoča ali trdna. Mobilno fazo predstavlja inerten plin, ki za razliko od ostalih kromatografskih metod ne interagira z molekulami analita. Kot nosilni plin se uporabljajo helij, argon, dušik ipd (15, 16). Aparaturo za plinsko kromatografijo sestavljajo: - injektor, ki služi vnosu vzorca v kromatografsko kolono. Temperatura mora biti dovolj visoka, da se vzorec takoj uplini. Poznamo dva načina vnosa,»split«, 17

20 kjer se vzorec razdeli na dva dela in manjši potuje naprej v kolono, ter»splitless«, kjer vzorec v celoti potuje v kolono, - kolona, kjer poteka kromatografska ločba spojin. Poznamo polnjene in kapilarne kolone. Polnjene kolone so navadno dolge 2 3 m in imajo premer 2 4 mm, plast stacionarne faze je debela 0,05 1 µm. Kapilarne kolone so daljše (tudi do 100 m) in tanjše (premer 0,15 0,53 mm) od polnjenih ter učinkovitejše (z njimi dosežemo boljšo ločbo), - detektor, ki služi za zaznavo analitov. Idealni detektor ima primerno občutljivost, dobro stabilnost in ponovljivost, linearni odziv pri velikem koncentracijskem razponu, hiter odziv, ki mora biti neodvisen od pretoka, podoben odziv za vse vrste analitov in mora biti enostaven za uporabo. Med najpogosteje uporabljanimi detektorji pri GC so plamensko ionizacijski detektor (FID), detektor na toplotno prevodnost (TCD) in masno spektrometrični detektor (MSD) (16). Zadrževalni čas spojin na koloni je pri GC funkcija izbora stacionarne faze in temperature, zato je pomemben izbor kromatografske kolone in temperaturnega programa peči, v kateri se nahaja kolona. Temperaturni program sestavlja niz sprememb temperature v peči, vključuje tako dele, ko je temperatura konstantna, kot dele, ko temperatura kontrolirano narašča. Na izbor začetne in končne temperature vplivajo temperature, pri katerih se eluirajo komponente. Hitrost rasti temperature je kompromis med željo po skrajšanju časa analize in ohranitvijo minimalne sprejemljive ločljivosti. Na to vplivata v glavnem kompleksnost vzorca in razlike med temperaturami vrelišč posameznih komponent (15). Sklopitev plinskega kromatografa z masno spektrometričnim detektorjem (GC-MSD) omogoča identifikacijo spojin v kompleksnih zmeseh in ločbo med strukturno zelo podobnimi spojinami. GC-MS omogoča tudi določanje struktur razgradnih produktov zdravilnih učinkovin. Masni spektrometer loči ione v plinski fazi glede na razmerje masa/naboj (m/z) (16). Ionizacijo spojin lahko dosežemo na različne načine, najpogosteje se uporabljata ionizacija z elektroni (EI) in kemijska ionizacija (CI). EI je najbolj razširjena metoda pri analizi organskih molekul. Molekuli tu dovedemo energijo s trkom z elektroni, dobimo radikalski kation oz. molekulski ion (M +. ali M +, Enačba I), z enim prostim elektronom. 18

21 Običajno uporabljamo energijo elektronov 70 ev. Večina organskih spojin ima sicer energijo ionizacije med 8 in 15 ev, tako da odvečna kinetična energija vodi v izrazito fragmentacijo, ki je značilna za posamezno spojino in jo lahko najdemo v različnih podatkovnih bazah (17) Enačba 1 Detekcija ločenih ionov lahko poteka na dva načina, SCAN snemanje čez celotno masno območje, za kar so potrebne višje koncentracije, omogoča pa npr. zaznavo novih razgradnih produktov, ali SIM selektivno snemanje določenih ionov. 3.2 BIOLOŠKO ČIŠČENJE ODPADNIH VOD Biološko čiščenje odpadnih vod je posnemanje naravnih procesov samočiščenja s pomočjo mikroorganizmov in je del izboljšanja kakovosti okolja zaradi onesnaževanja, ki nastane v gospodinjstvih, industriji, kmetijstvu ipd. Glede na vir nastanka, ki vpliva na njihove sestave, odpadne vode ločimo na: - komunalno odpadno vodo, ki nastaja v gospodinjstvih, - tehnološko odpadno vodo, ki nastaja po uporabi v industriji, kmetijstvu, obrtni dejavnosti, ter hladilne tekočine, ki odtekajo iz objektov za predelavo, skladiščenje in odlaganje odpadkov, - padavinsko odpadno vodo. S preprečevanjem onesnaževanja okolja začnemo že pri samem viru, tj. s preprečevanjem, da določene snovi sploh pridejo vanjo, kljub temu pa nekatere snovi končajo v odpadni vodi in te moramo do določene mere odstraniti. Za to se poslužujemo vrste fizikalnih, kemijskih in bioloških postopkov, ki se med seboj dopolnjujejo (18). Na Sliki 10 je predstavljena shema različnih postopkov čiščenja odpadne vode in njihove funkcije. 19

22 Slika 10: Postopki čiščenja odpadne vode in njihova funkcija Osnovni cilj čiščenja odpadnih vod je zadostiti zakonskim zahtevam, ki upoštevajo naslednje: - preprečitev bolezni, - preprečevanje onesnaženja vodovodov, - odstranitev vseh onesnaženih izpustov v plovne vode, - vzdrževanje čistih voda za razmnoževanje in preživetje vodnih organizmov, - zaščita kopaliških vod, - zaščita ekosistemov, - obvarovanje voda (18). Med parametre, s katerimi ovrednotimo odpadne vode, spadajo: - temperatura, od katere je odvisna hitrost bioloških procesov, - barva, ki je odvisna od prisotnih snovi, sveža odpadna voda je siva, 20

23 - vonj, ki je prav tako odvisen od prisotnih snovi, posebno tistih z močnim in značilnim vonjem, - motnost, ki jo merimo s turbidimetrom, kaže pa na prisotnost suspendiranih snovi, - nihanja v pretoku, ki so odvisna od velikosti kanalizacijskega sistema, življenjskih navad prebivalstva itd., - usedljivost, ki nam pove o snoveh, ki se ob mirovanju vode usedejo, - kot indikator bakterij za patogene organizme se uporabljajo meritve celotnih fekalnih koliformnih bakterij (E. Coli, enterokoki, streptokoki), ki sicer niso patogene, so pa številnejše in odpornejše na dezinfekcijo od večine patogenih bakterij, - virusi, njihova prisotnost se včasih uporablja za oceno učinkovitosti dezinfekcije, saj so odpornejši nanjo kot večina bakterij, - mikroskopski pregled, ki nam posreduje informacijo o bioloških lastnostih in nam pomaga pri kontroli procesa, - ph, ki je merilo za kislost ali bazičnost raztopine, - alkaliteta, ki je merilo sposobnosti vode, da nevtralizira kislino, - trdne snovi, ki jih določamo z izparevanjem, služijo nam pri kontroli procesa, - biokemijska potreba po kisiku v 5 dneh (BPK 5 ), s katero določamo množino kisika, ki je potrebna za stabilizacijo vzorca v 5 dneh; BPK 5 je osnova za določanje obremenitve in projektiranje čistilne naprave, - kemijska potreba po kisiku (KPK), ki temelji na kemijski oksidaciji, zagotovi hitro oceno celotne organske snovi v vzorcu, - celotni organski ogljik (TOC) je alternativni parameter za oceno BPK 5, z njim določimo količino organsko vezanega ogljika v vzorcu, - dušik, ki se pojavlja v 4 oblikah (organski dušik, amoniak, nitrat, nitrit), prisotne oblike pa kažejo na nivo stabilizacije organskih snovi, - fosfor, ki se pojavlja v različnih oblikah (ortofosfat, polifosfat, organsko vezan fosfor) in je osnovni element za rast in razmnoževanje mikroorganizmov, - klor, ki se običajno uporablja pri dezinfekciji in se uporablja pri kontroli le-te, - sulfidi, še posebej vodikov sulfid, ki je povezan z neprijetnimi zdravstvenimi učinki in povzroča korozijo kanalizacijskih cevi, - maščobe, olja, masti, specifični polutanti, npr. fenoli, formaldehid, - toksičnost (18). 21

24 3.2.1 POGOJI ČIŠČENJA ODPADNIH VOD Biološka razgradnja suspendiranih ali raztopljenih organskih snovi lahko poteka pri različnih oksidacijsko redukcijskih pogojih: - pri aerobnih pogojih se organsko razgradljive snovi odstranjujejo v prisotnosti raztopljenega kisika do CO 2 in vode, - pri anoksičnih pogojih, kjer je kisik prisoten le v minimalnih koncentracijah, običajno pa le v vezani obliki (kot nitrat ali nitrit); v anoksičnih pogojih poteka redukcija nitratnih in nitritnih ionov do elementarnega dušika, - pri anaerobnih pogojih, kjer kisik ni prisoten ne v elementarni ne v vezani obliki (kot nitrat ali nitrit) ), pride najprej do pretvorbe v enostavnejše komponente (nižje maščobne kisline) ter na koncu do metana (19). Aerobna razgradnja in nitrifikacija Pri procesu aerobne razgradnje heterotrofni mikroorganizmi v prisotnosti raztopljenega kisika, ki služi kot akceptor elektronov, pretvorijo organske snovi do ogljikovega dioksida in vode, nastala energija pa se porabi pri tvorbi biomase (Slika 11). Za uspešen potek čiščenja mora biti vseskozi prisotna zadostna količina raztopljenega kisika (najmanj 0,5 mg L -1 ). Slika 11: Shema presnove aerobnih heterotrofov 22

25 Ob prisotnosti avtotrofnih mikroorganizmov se amonijev dušik oksidira do oksidacijskega stanja +3 (nitrita) in kasneje do +5 (nitrata), tj. poteče proces nitrifikacije (Slika 12). Avtotrofni organizmi kot vir ogljika uporabljajo CO 2 (ter njegovi ionski obliki CO 2-3 in HCO - 3 ), porabljajoo pa lahko tudi amoniak in raztopljene nitrate (19). Slika 12: Shema presnove aerobnih avtotrofov Nitrifikacija je dvostopenjski proces, kjer pride do oksidacije amoniaka prek nitrita do nitrata. Pretvorba poteka pod vplivom nitrifikacijskih avtotrofnih bakterij iz rodov Nitrosomonas, ki oksidirajo amoniak do nitrita, in Nitrobacter, ki oksidirajo nitrit do nitrata. Za pretvorbo ogljikovega dioksida v celični ogljik je potrebna energija in ker je te reakcije proizvedejo sorazmerno malo, je populacija nitrifikatorjev v aktivnem blatu majhna. So tudi zelo občutljivi na nenadna povečanja dotoka odpadnih snovi. Večja starost blata zagotovi večje število nitrifikatorjev. Na Sliki 13 je prikazana shema nitratnega cikla v odpadni vodi. 23

26 Slika 13: Nitratni cikel v odpadni vodi Zgornjo shemo lahko tudi ponazorimo z naslednjimi enačbami: 2NH 3O 2 2NO 4H 2H O Enačba 2 2NO O 2NO Enačba 3 Skupna reakcija: 2NH 4O 2NO 4H 2H O Enačba 4 24

27 Anoksična razgradnja in denitrifikacija Proces anoksične razgradnje je podoben aerobnemu, le da tu mikroorganizmi uporabljajo kisik iz nitratov in nitritov namesto prostega kisika, ki ne sme biti prisoten. Nastajajo elementarni dušik, ogljikov dioksid in voda, poteče torej denitrifikacija (Slika 14). Nujno potreben je še zunanji vir lahko razgradljivega ogljika (karbonat) (18). Slika 14: Anoksična razgradnja (denitrifikacija) Pri denitrifikaciji gre, v nasprotju z nitrifikacijo, za redukcijo dušikovega atoma iz oksidacijskih stanj +5 oz. +3 do 0, torej elementarnega dušika. Ker v raztopini ni prisotnega prostega kisika, denitrifikacijski mikroorganizmi za razgradnjo organskih snovi kot vir kisika uporabijo nitrate in nitrite, reakcije lahko ponazorimo z naslednjima enačbama: 2NO org.snovi 2NO CO H O Enačba 5 2NO org.snovi 2N CO OH Enačba 6 Anaerobna razgradnja Anaerobna razgradnja poteka, če ni prisotnega kisika v prosti ali vezani (nitrat, nitrit) obliki. V prvi stopnji anaerobni heterotrofni mikroorganizmi pretvorijo organske spojine v nižje maščobne kisline, nato pa v vodo, metan in ogljikov dioksid, tvori se tudi biomasa (Slika 15). Kisik mikroorganizmi dobivajo bodisi iz organskih spojin bodisi iz sulfatov (SO 2-4 ), ne sme pa biti prisotnega raztopljenega kisika, saj ta zavira delovanje anaerobnih mikroorganizmov (19). 25

28 Slika 15: Shema presnove anaerobnih heterotrofov Za anaerobno razgradnjo sta pomembna dva tipa bakterij, ki med seboj delujeta vzajemno, kislinske ter metanogene bakterije. Kislinske bakterije pretvarjajo organske snovi v nižje maščobne kisline, ki jih metanogene bakterije uporabljajo za svoj razvoj in jih razgradijo do metana. Za optimalno razgradnjo je torej pomembno vzdrževanje ravnotežja med kislinskimi in metanogenimi bakterijami (primerna temperatura, ph in obremenitev z blatom, Slika 16). Slika 16: Vzdrževanje ravnotežja med kislinskimi in metanogenimi bakterijami FIZIKALNO-KEMIJSKI PARAMETRI Kemijska sestava odpadne vode nam lahko nudi informacije o njenih lastnostih in o procesih čiščenja, ki jim je bila podvržena. S kemijsko analizo lahko določimo naslednje parametre: ph, kemijsko in biokemijsko potrebo po kisiku (za slednjo je inkubacijski čas 5 dni), dušikove in fosforjeve spojine, kloride, sulfide, celoten organski ogljik, redoks potencial, specifična onesnažila itd. Več o samem poteku meritev je opisano v poglavju

29 Temperatura in ph Hitrost bioloških procesov je odvisna od temperature. Pri poviševanju temperature mikroorganizmi pospešujejo razgradnjo organskih snovi in porabo kisika. Ker pa je pri višji temperaturi topnost kisika manjša, prav tako pa pri previsokih temperaturah lahko pride tudi do odmiranja nekaterih bakterijskih vrst, je vzdrževanje primerne temperature zelo pomembno. Optimalno območje za delovanje mikroorganizmov je med 15 in 25 C. Temperatura se spreminja tudi glede na letni čas. ph je prav tako zelo pomemben parameter pri biološkem čiščenju odpadne vode, saj so mikroorganizmi dovolj aktivni le v območju ph 6,5 9. Zunaj tega območja je aktivnost zelo upočasnjena oz. se lahko celo ustavi. Na ph so še posebej občutljive reakcije nitrifikacije, le-te lahko ph znižajo (Enačba 4) tudi do te mere, da je biološka aktivnost inhibirana. Surova odpadna voda ima ph približno 8. Velika odstopanja od te vrednosti lahko kažejo na prisotnost industrijskih ali nekomunalnih izpustov (18). Kemijska potreba po kisiku (KPK) Določanje KPK temelji na kemijski oksidaciji in nam lahko zagotovi hitro oceno celotne organske snovi v vzorcu (razgradljive in nerazgradljive). Postopek nam da rezultat v nekaj urah (običajno 3 4), namesto v 5 dneh kot pri BPK 5. Rezultati KPK so običajno višji kot pri BPK 5, razmerje med njima pa je med čistilnimi napravami različno, zato obe meritvi opravljamo vzporedno. Razmerje se spreminja tudi od vtoka do iztoka. Razmerje KPK/BPK 5 je za surovo vodo običajno 2 : 1, v dobro stabiliziranem sekundarnem odtoku pa to narase tudi do 10 : 1 (18). Biokemijska potreba po kisiku v petih dneh (BPK 5 ) Z merjenjem BPK 5 določamo množino kisika, ki je potrebna za biološko razgradnjo (stabilizacijo) vzorca v petih dneh, posredno pa množino organske snovi, ki je v vzorcu na voljo za razgradnjo, s tem pa tudi prihodnji vpliv iztoka na vodotok. Biološka aktivnost je odvisna od temperature, dokončna razgradnja pa zahteva okoli 20 dni, zato je poskus standardiziran na 5 dni pri temperaturi 20 C. Množina, potrebna za oksidacijo ogljikovih organskih spojin (ne dušika), imenujemo ogljikov BPK (CBPK). V nadaljevanju poteče še druga faza oksidacije, nitrifikacija, kjer amonij prehaja v nitrit in nitrat. BPK 5 je osnova za določanje obremenitve in projektiranje čistilne naprave (18). 27

30 Dušikove spojine Dušik se v odpadni vodi pojavlja v štirih oblikah: organski dušik, amonij (v prosti ali ionizirani obliki), nitrit in nitrat. Oblike dušika, prisotne v vzorcu, kažejo na nivo stabilizacije (surova odpadna voda ima navadno višji nivo organskega in amonijevega dušika ter nižji nivo nitrata in nitrita) (18). Spremembe in porazdelitev dušika nam lahko dajo informacijo o pogojih, v katerih poteka proces v posameznem delu čistilne naprave (poglavje 3.2.1). Običajno koncentracijsko območje dušika v surovi odpadni vodi je mg L -1 za celotni dušik, 8 35 mg L -1 za organski ter mg L -1 za amonijev dušik. Nitrit in nitrat sta običajno prisotna v neznatnih koncentracijah. Za določanje organskega in amonijevega dušika uporabljamo Kjeldahlovo metodo: 1. razgradnja proteinov s H 2 SO 4, običajno pod vplivom katalizatorjev, tvorba (NH 4 ) 2 SO 4, 2. dodatek NaOH, sproščanje amoniaka, 3.»zajetje«amoniaka z dodatkom prebitka H 3 BO 3, tvorba amonija, 4. povratna titracija presežka H 3 BO 3 z Na 2 CO 3. Fosforjeve spojine Fosfor se v odpadni vodi pojavlja v različnih oblikah, kot ortofosfat, polifosfat ali organsko vezan fosfor in je osnovni element za biološko rast in razmnoževanje. Za to je najprimernejši ortofosfat. Previsoke količine fosforja v površinskih vodah vodijo do čezmerne rasti alg in evtrofikacije. V komunalni odpadni vodi so običajne koncentracije celotnega fosforja med 2 in 20 mg L -1, od tega je 1 5 mg L -1 organskega ter 1 15 mg L -1 neorganskega fosforja (18). 28

31 3.2.3 MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV ODPADNE VODE Preglednica V prikazuje zakonsko določene mejne vrednosti nekaterih parametrov odpadne vode v Republiki Sloveniji (20, 21). Preglednica V: Mejne vrednosti za nekatere parametre v RS Parameter Mejna vrednost za iztok v vode Mejna vrednost za iztok v kanalizacijo Enota Količina izpuščene nevarne snovi temperatura C ph 6,5 9 6,5 9,5 amonijev mg L -1 dušik nitritni dušik 1,0 10 mg L g/leto nitratni dušik * - mg L -1 celotni fosfor 1,0 2,0 - mg L -1 TOC 30 - mg L -1 KPK mg L -1 BPK mg L -1 Za izračun mejnih vrednosti nitratnega dušika in sulfata v iztoku v vode (*) uporabljamo naslednjo enačbo: MVK=, ( ) ( ) Enačba 7 kjer je: - MVK: mejna vrednost koncentracije nitratnega dušika za odvajanje odpadne vode neposredno v vode na vodovarstvenem območju, izražena v mg L -1, - MVK(1r): mejna vrednost koncentracije nitratnega dušika ali sulfatov za površinsko vodo prvega kakovostnega razreda, ki je za nitratni dušik 5 mg L -1 oziroma za sulfate 150 mg L -1, - Q(V): srednji nizki pretok vodotoka, izražen v s -1 in - Q: največji 6-urni povprečni pretok odpadne vode, ki se odvaja v vodotok pri polni obremenitvi vira onesnaževanja, izražen v s -1. Pri neposrednem odvajanju odpadne vode v vodotok ne glede na izračunano vrednost koncentracija nitratnega dušika ne sme presegati vrednosti 30 mg L -1, koncentracija sulfatov pa vrednosti 1000 mg L

32 4 NAMEN DELA Odpadna voda vsebuje številne okolju potencialno nevarne snovi, ki lahko porušijo ravnotežje v naravi, zato jih je treba odstraniti oz. čim bolj zmanjšati njihovo vsebnost. Med te sodijo tudi ostanki zdravilnih učinkovin, ki imajo v okolju lahko zelo dolgo razpolovno dobo in se posledično akumulirajo. V odpadnih in okoljskih vodah se navadno nahajajo v koncentracijskem območju od ng L -1 do µg L -1. Cilj diplomskega dela je določiti in primerjati odstranjevanje posameznih zdravilnih učinkovin v aerobnih in anoksičnih pogojih v pilotni čistilni napravi ter v sklopljenem sistemu anoksični-aerobni reaktor. Kot modelne spojine bomo uporabili nesteroidne protivnetne učinkovine ibuprofen, naproksen, ketoprofen in diklofenak, antiepileptik karbamazepin, klofibrinsko kislino, ki je metabolit antihiperlipidemika klofbirata, metabolita karbamazepina akridin in akridon ter metabolit diklofenaka 1-(2,6- diklorofenil)indolin-2-on. Njihovo odstranjevanje bomo spremljali v pilotnih čistilnih napravah. Za izolacijo bomo uporabili ekstrakcijo na trdnem nosilcu (SPE), čemur bo sledila derivatizacija, tj. pretvorba v za kromatografsko ločbo primernejšo obliko. Ločbi s plinsko kromatografijo bo sledila detekcija z masnim spektrometrom, s čimer bomo potrjevali istovetnost spojin. Za kvantitativno določanje spojin bomo pred začetkom ekstrakcije v vzorce dodali znano količino internega standarda. V sklopljenih sistemih bomo določali tudi količino hranil (amonij, nitrit, nitrat, fosfat, kemijska in biokemijska potreba po kisiku) v posameznih reaktorjih in spreminjanje njihove vsebnosti glede na pogoje čiščenja. S primerjavo rezultatov odstranjevanja učinkovin v posameznih in sklopljenih reaktorjih bomo skušali ugotoviti, ali je odstranjevanje v sklopljenem sistemu statistično značilno učinkovitejše kot v posameznih reaktorjih. Dobljene rezultate pa bomo primerjali tudi z literaturnimi podatki. 30

33 5 MATERIALI IN METODE 5.1 MATERIALI Spojine, ki smo jih uporabljali pri delu: - ibuprofen, čistosti 98 % (CAS ), proizvajalca Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija, - klofibrinska kislina, čistosti 97 % (CAS ), Sigma-Aldrich, - naproksen, čistosti 98 % (CAS ), Sigma-Aldrich, - ketoprofen, čistosti 98 % (CAS ), Sigma-Aldrich, - diklofenak, natrijeva sol (CAS ), Sigma-Aldrich, - karbamazepin, čistosti 99 % (CAS ), Acros Organics, New Jersey, ZDA, - akridin, čistosti > 97 % (CAS ), Sigma-Aldrich, - akridon, čistosti > 98 % (CAS ), Sigma-Aldrich, - 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on (serijska št ), Chemosyntha MV, Meulebeke, Belgija, - devteriran ibuprofen, 99,4 % devteriran (št. K379P25), C/D/N Isotopes, Quebec, Kanada (interni standard pri določanju zdravilnih učinkovin), - 9-kloroakridin, čistosti 97 % (CAS ), Sigma-Aldrich (interni standard pri določanju metabolitov), - N-metil-N-(tercbutildimetilsilil) trifluoroacetamid (MTBSTFA, CAS ), Acros Organics (derivatizacijsko sredstvo). Topila, ki smo jih uporabljali pri delu: - metanol Baker Ultraresi-Analyzed, čistosti min. 99,8 % (CAS ), proizvajalca Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Nizozemska, - etilacetat Baker Ultraresi-Analyzed, čistosti min. 99,6 % (CAS ), Mallinckrodt Baker B.V., - destilirana voda. Nakisanje vodnih raztopin preučevanih spojin smo izvedli s 37-odstotno raztopino klorovodikove kisline (CAS ), proizvajalca Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija. 31

34 Za filtriranje smo uporabljali steklene filtrirne papirje MN-GF-2, premera 55 mm, proizvajalca Macherey-Nagel GmbH & Co., Düren, Nemčija, ter membranske filtrirne papirje Nylon 66 Mebranes, premera 47 mm in velikosti por 0,45 µm, proizvajalca Supelco, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA. Pri ekstrakciji smo uporabljali nosilce OASIS HLB 3 cm 3 proizvajalca Waters Corporation, Milford, Massachussetts, ZDA, s specifično površino 768 m 2 /g, povprečnim premerom por 84 Å, celotnim volumnom por 1,26 cm 3 /g ter povprečno velikostjo delcev 29,2 µm. Za določanje parametrov v pilotni čistilni napravi smo uporabili naslednje teste in reagente: - Nitra Ver 5 Nitrate Powder Pillow, proizvajalca Hach, Düsseldorf, Nemčija, - Nitri Ver 3 Nitrite Powder Pillow, Hach, - reagent Rochelle Salt PVA Reagent, Hach, - reagent Nessler Reagent for Food and Waste Analysis, Hach, - reagenta amino kislina in molibdat, Hach, - zmes H 2 SO 4 /Ag 2 SO 4, Hach, - natrijev hidroksid, Hach. Za pripravo hranilnega medija za pilotno čistilno napravo smo uporabili naslednje snovi: - kvasni ekstrakt, Sigma-Aldrich, - kazein pepton, Sigma-Aldrich, - mesni ekstrakt, Sigma-Aldrich, - amonijev acetat, Honeywell Riedel-de Haën, Hannover, Nemčija, - amonijev klorid, Merck, Darmstadt, Nemčija, - kalijev hidrogenfosfat, Merck, - kalijev dihidrogenfosfat, Merck, - kalcijev karbonat, Merck, - magnezijev karbonat, Merck, - natrijev klorid, Scharlau Chemie, S.A., Barcelona, Španija, - železov (II) sulfat heptahidrat, Merck. 32

35 5.2 METODE PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV Raztopine standardov preučevanih spojin smo pripravili tako, da smo v 100 ml merilno bučko natehtali 10 mg vsake posamezne spojine ter jo dopolnili do oznake z metanolom. Raztopino metabolitov smo nato zaradi manjše hitrosti raztapljanja akridona še dodatno tri ure stresali na stresalniku pri sobni temperaturi. Tako pripravljene raztopine so nam služile tako za izdelavo umeritvenih krivulj standardov kot za določanje izkoristkov ekstrakcije ter za dodatek v reaktorje, v katerih smo določali eliminacijo preučevanih spojin. Pri delu smo uporabljali dva interna standarda, devteriran ibuprofen, ki smo ga uporabljali pri določanju zdravilnih učinkovin ter 9-kloroakridin, ki smo ga uporabljali pri določanju metabolitov. Raztopino devteriranega ibuprofena smo pripravili tako, da smo 2,5 mg spojine natehtali v 50 ml merilno bučko in jo z metanolom dopolnili do oznake. Tako pripravljeno raztopino smo označili z IS 0. Raztopino IS 0 smo nato razredčili v razmerju 1/50, in sicer tako, da smo 1 ml odpipetirali v 50 ml bučko, ki smo jo z metanolom dopolnili do oznake. Novo raztopino smo označili z IS in to smo tudi uporabljali pri analizi vsebnosti zdravilnih učinkovin v vzorcih ter pri izdelavi umeritvenih krivulj in določanju izkoristkov ekstrakcije. V posamezni vzorec smo dali 0,5 ml raztopine IS, kar znaša 0,5 µg devteriranega ibuprofena. Raztopino 9-kloroakridina smo pripravili tako, da smo 3,0 mg spojine natehtali v 50 ml bučko in jo z metanolom dopolnili do oznake. Tako pripravljeno raztopino smo uporabljali pri določanju vsebnosti metabolitov v vzorcih, za izdelavo umeritvenih krivulj ter določanju izkoristkov ekstrakcije, in sicer po 0,5 ml raztopine, kar znaša 30 µg 9-kloroakridina. 33

36 5.2.2 IZKORISTEK EKSTRAKCIJE IN KALIBRACIJA Pri ugotavljanju izkoristka ekstrakcije na trdnem nosilcu ter izdelavi umeritvenih krivulj smo uporabili raztopine, izdelane po postopku, opisanem pod 5.2.1, ter iztok iz reaktorja R0 (5.2.3). Izkoristek ekstrakcije smo določili tako, da smo najprej v 6 čaš dali po 200 ml iztoka R0, od tega smo v 3 dali po 1 ml metanolne raztopine zdravilnih učinkovin in njihovih izbranih metabolitov ter nato izvedli ekstrakcijo vseh šestih. Po končani ekstrakciji smo v preostale (prazne) tri paralelke dodali po 1 ml raztopine preučevanih spojin. Interni standard smo prav tako dodali po ekstrakciji. Nato smo vse analizirali po postopku, opisanem v poglavju Izkoristek ekstrakcije (Enačba 8) smo določili kot razmerje med povprečnim odzivom (površino pod krivuljo) paralelk, v katere smo analite dodali po ekstrakciji (Ā po ekstrakciji ), s povprečnim odzivom paralelk, v katere smo analite dodali pred ekstrakcijo (Ā pred ekstrakcijo ): % ekstrakcije= Enačba 8 Umeritvene krivulje smo izdelali tako, da smo za zdravilne učinkovine in za metabolite pripravili raztopine v iztoku R0 s koncentracijskim območjem 0,5 µg L µg L -1. Interni standard smo dodali pred ekstrakcijo, pripravljene raztopine pa smo ekstrahirali in analizirali po postopku, opisanem v poglavju

37 5.2.3 PILOTNA ČISTILNA NAPRAVA IN VZORČENJE Delovanje biološke čistilne naprave smo posnemali v pilotnih bioreaktorjih. Shema aerobnega reaktorja je prikazana na Sliki 17. Slika 17: Shema aerobnega reaktorja Skupna prostornina posameznega reaktorja je 4,7 L, od tega je 4 L mokrega volumna. Vsak reaktor vsebuje standardno centrifugalno mešalno črpalko, ki omogoča reciklažo blata. V aerobne reaktorje smo namestili tudi standardne akvarijske prezračevalnike (porozne kamne), ki omogočajo dovajanje kisika, medtem ko jih anoksični reaktorji ne vsebujejo. Anoksične reaktorje smo tudi zaščitili pred svetlobo z aluminijasto folijo. Vtočno cev smo namestili v vsebnik, v katerega smo polnili hranilno raztopino, sestava lete je prikazana v Preglednici VI. Črpanje hranilne raztopine je potekalo s hitrostjo 2 L/dan. 35

38 Preglednica VI: Sestava hranilne raztopine Snov Masa / 20 L (g) Koncentracija (mg L -1 ) kvasni ekstrakt 2,6 130 kazein pepton 2,6 130 mesni ekstrakt 2,6 130 CH 3 COONH 4 6, NH 4 Cl 0,8 40 K 2 HPO 4 0,48 24 KH 2 PO 4 0,16 8 CaCO 3 2,0 100 MgCO 3 2,0 100 NaCl 0,8 40 FeSO 4 7H 2 O 0,1 5 V reaktorje smo poleg hranilne raztopine dodajali tudi po 1 ml metanolne raztopine zdravilnih učinkovin oz. metabolitov (pripravljenih po postopku, opisanem v poglavju 5.2.1) s koncentracijo 10 mg/100 ml, kot je prikazano v Preglednici VII, tako da je bila končna koncentracija spojin 50 µg L -1. Reaktorja R0 in A0 sta služila kot kontroli in zato vanju nismo dodajali preučevanih spojin. Preglednica VII: Osnovne značilnosti reaktorjev Reaktor Vrsta presnove Analiti Koncentracija v 2 L (µg L -1 ) R0 aerobna kontrola 0 R1 aerobna zdravilne učinkovine 50 R2 aerobna zdravilne učinkovine 50 R3 aerobna metaboliti 50 R4 aerobna metaboliti 50 A0 anoksična kontrola 0 A1 anoksična zdravilne učinkovine 50 A2 anoksična metaboliti 50 36

39 V prvem delu raziskave smo preučevali odstranjevanje analitov v posameznih reaktorjih, tj. ločeno aerobno in anoksično razgradnjo. Sprva smo v reaktorje tri tedne brez vzorčenja dodajali hranilno raztopino in v njej raztopljene analite, da bi se biomasa adaptirala na preiskovane spojine. Tri dni pred vzorčenjem smo v reaktorjih dnevno zamenjali hranilno raztopino, saj so nekatere hranilne snovi slabše topne in smo se s tem v dobršni meri izognili morebitnemu vplivu neraztopljenih snovi, izognili pa smo se tudi razgradnji na vtoku. Vzorčenje smo izvedli tako, da smo 1 ml metanolnih raztopin zdravilnih učinkovin oz. metabolitov dali v merilno bučko ter s hranilnim medijem dopolnili do oznake (skupaj 2 L). Del tako pripravljene raztopine smo uporabili kot vzorec vtoka, preostanek pa polnili v reaktorje. Vzorce z volumnom ml smo filtrirali s filtrirnim papirjem z velikostjo por 0,45 µm, 200 ml filtrata pa nato ekstrahirali in analizirali po postopku, opisanem v poglavju V drugem delu smo preučevali odstranjevanje preiskovanih spojin tudi v sklopljenih sistemih, kjer smo uporabili sklopitev anoksičen-aeroben reaktor (A1-R2 in A2-R3). Sklopitev smo izvedli tako, da smo iztok anoksičnega reaktorja uvajali v vsebnik za aerobni reaktor, preiskovane spojine pa smo dajali le v vtok anoksičnega reaktorja. Sklopitev je prikazana na Slikah 18 in 19. Dva tedna smo uvajali hranilno raztopino in analite brez vzorčenja, da se je koncentracija v vmesnem vsebniku stabilizirala, ter nato izvajali vzorčenje po enakem postopku, kot je opisano zgoraj. Slika 18: Shema sklopitve anoksičnega in aerobnega reaktorja 37

40 črpalka za anoksični reaktor črpalka za aerobni reaktor anoksični reaktor vsebnik za anoksični reaktor aerobni reaktor vmesni vsebnik za aerobni reaktor Slika 19: Sklopitev anoksičnega in aerobnega reaktorja DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE Pri sklopljenih reaktorjih smo določili tudi koncentracije nekaterih kemijskih parametrov na vtoku, v vmesnem vsebniku ter na iztoku. Vzorce smo pred meritvami najprej razredčili v razmerju 1/20 (5 ml smo dali v 100 ml merilno bučko in jo dopolnili z deionizirano vodo do oznake). Dobljene rezultate za amonijev, nitratni in nitritni dušik ter za fosfate smo tako morali pomnožiti z 20. Določanje amonijevega dušika (NH 3, NH + 4 ) Amonij smo določali tako, da smo v vzorce (v 25 ml kivetah) najprej dodali 1 ml reagenta Rochelle Salt PVA Reagent ter nato še 1 ml reagenta Nessler Reagent for Food and Waste Analysis. Ob prisotnosti amonija je prišlo do tvorbe intenzivnega rumeno oranžnega obarvanja. Koncentracijo amonija smo določili spektrofotometrično pri valovni dolžini 425 nm, kot slepi vzorec smo uporabili deionizirano vodo, ki smo ji dodali oba reagenta. Kemijsko je Nesslerjev reagent kalijev tetrajodomerkurat(ii) (K 2 [HgI 4 ]) v raztopini KOH. Ob prisotnosti amonija pride do naslednje reakcije (Enačba 9): NH + 2[HgI ] + 4OH HgO Hg(NH )I + 7I + 3H O Enačba 9 38

41 Določanje nitratnega dušika (NO - 3 ) Nitrate smo določali s hitrim testom z uporabo blazinic Nitra Ver 5 Nitrate Powder Pillow, ki vsebujejo kadmijeve granule, obdelane v raztopini bakrovega sulfata, ter sulfanilamid in reagent za diazotiranje N-(1-naftil)etilendiamin. Celotno vsebino le-te damo v vzorec in 1 minuto stresamo. Pride do redukcije nitratov in tvorbe modrega azo barvila. Po 5 minutah izmerimo absorbanco pri 400 nm. Kot slepi vzorec nam služi deionizirana voda z dodanim reagentom. Določanje nitritnega dušika (NO - 2 ) Nitrite smo določali podobno kot nitrate s hitrim testom z uporabo blazinic Nitri Ver 3 Nitrite Powder Pillow, ki vsebujejo sulfanilamid in reagent za diazotiranje N-(1-naftil)- etilendiamin dihidroklorid. Po dodatku vsebine blazinice vzorce pretresemo. Pride do tvorbe rožnatega azo barvila. Po 20 minutah izmerimo absorbanco pri 507 nm. Kot slepi vzorec nam služi deionizirana voda z dodanim reagentom. Določanje ortofosfata (PO 3-4 ) Ortofosfat je le ena izmed oblik fosforja, ki se nahajajo v odpadnih vodah. Določali smo ga tako, da smo v vzorec dodali najprej 1 ml amino kisline, nato 1 ml molibdatnega reagenta ter vse skupaj pretresli. Pride do tvorbe rumeno obarvanega kompleksa amonijevega fosfomolibdata (Enačba 10). Po 10 minutah smo izmerili absorbanco pri 530 nm, kot slepi vzorec nam je služila deionizirana voda z dodanima reagentoma. PO +12(NH ) MoO +24H (NH ) PO 12MoO +21NH +21H O Enačba 10 Kemijska potreba po kisiku (KPK) KPK smo določili tako, da smo 2 ml nerazredčenih vzorcev dali v viale, ki so vsebovale zmes H 2 SO 4 in Ag 2 SO 4. Po dvournem segrevanju in nato ohladitvi na sobno temperaturo smo izmerili absorbanco pri 620 nm. Kot slepi vzorec nam je služila deionizirana voda, ki smo jo dali v viale in prav tako 2 uri segrevali. 39

42 Biokemijska potreba po kisiku v petih dneh (BPK 5 ) Za vsak vzorec smo opravili dve vzporedni meritvi. Pri prvi smo uporabili 250 ml nerazredčenega vzorca, končni rezultat pa smo pomnožili s faktorjem 5, pri drugi pa 164 ml vzorca s faktorjem 10. Vzorec smo skupaj z magnetnim mešalom dali v zatemnjeno steklenico in vanjo namestili gumijast tulec, v katerega smo dali dve tabletki natrijevega hidroksida. Ta je reagiral z nastajajočim CO 2, ki bi brez dodatka NaOH nakisal vzorec, kar bi lahko privedlo do propada mikroorganizmov. Steklenico smo nato zaprli z zamaškom z manometrom ter pustili na mešalu. Po petih dneh smo odčitali vrednost BPK 5. Slika 20: Določanje BPK 5 z manometrično metodo ANALIZNI POSTOPEK DOLOČANJA ANALITOV V VZORCIH Učinkovitost odstranjevanja zdravilnih učinkovin in njihovih metabolitov v aerobnih in anoksičnih pogojih smo preučevali s pomočjo sistema aerobnih in anoksičnih bioreaktorjev, ki so simulirali delovanje komunalne čistilne naprave. Učinkovitost njegovega delovanja smo določili z razliko v vsebnosti analitov na vtoku in iztoku. Shema uporabljenih analiznih postopkov je prikazana na Sliki 21 in zajema pripravo vzorca (dodatek internega standarda, nakisanje), nanašanje vzorca na SPE kolono, eluiranje, koncentriranje eluata, derivatizacijo in analizo s plinskim kromatografom z masno spektrometričnim detektorjem. 40

43 Slika 21: Shema analiznegaa postopka za določanje analitov Izolacija Preiskovane spojine smo iz vodnih vzorcev izolirali z ekstrakcijo na trdnem nosilcu (SPE). Pri tem smo uporabili napravo Vacuum Manifold Processing Station (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, ZDA), ki je prikazana na Sliki

44 Slika 22: Sistem za ekstrakcijo na trdnem nosilcu Sprva smo izvedli kondicioniranje kolon, in sicer smo jih najprej omočili s 3 ml etilacetata, nato dodali 3 ml metanola (ker se meša tako z etilacetatom kot z vodo) in na koncu še 3 ml matričnega topila vodovodne vode (nakisane s 37% HCl do ph 2 3 pri izolaciji zdravilnih učinkovin). Da se izognemo dekondicioniranju, smo poskrbeli, da je kolona ves čas ostala omočena. Pri kondicioniranju smo aktivirali funkcionalne skupine ekstrakcijskega nosilca. V nadaljevanju smo izvedli nanos 200 ml vzorcev. Z rahlim podtlakom (cca. 2 mm Hg), ki smo ga ustvarili z vodno črpalko, smo prek cevke črpali vzorce. Hitrost pretoka skozi kolono smo nastavili na 2 3 ml/min. Po končanem nanosu smo kolone sprali z matričnim topilom in jih nato 60 min sušili pri podtlaku cca. 15 mm Hg. Končna točka sušenja je bila, ko je nosilec ponovno postal sipek. Po sušenju smo izvedli še elucijo s štirikrat po 0,5 ml etilacetata. Pri tem nismo uporabljali vodne črpalke, saj smo želeli počasen pretok prek kolone. Dobljena 2 ml smo najprej z dušikom skoncentrirali na približno 1 ml, ki smo ga nato kvantitativno prenesli v 42