ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL PLODOV RAZLIČNIH GENOTIPOV MALINJAKA (Rubus idaeus L.)

Transcription

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE Anita BREZNIK ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL PLODOV RAZLIČNIH GENOTIPOV MALINJAKA (Rubus idaeus L.) MAGISTRSKO DELO Maribor, 2018

2 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE KMETIJSTVO Anita BREZNIK ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL PLODOV RAZLIČNIH GENOTIPOV MALINJAKA (Rubus idaeus L.) MAGISTRSKO DELO Maribor, 2018

3 POPRAVKI:

4 IV Komisija za zagovor in oceno magistrskega dela: Predsednik: red. prof. dr. Branko KRAMBERGER Mentor: izr. prof. dr. Janja KRISTL Član (somentor): izr. prof. dr. Metka ŠIŠKO Lektorica: Anja Kramberger, dipl. slov. (UN) Magistrsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Datum zagovora:

5 V Antioksidativni potencial plodov različnih genotipov malinjaka (Rubus idaeus L.) UDK: :577.1(043)=163.6 Maline so bogat vir antioksidantov, med katere spadajo rastlinski sekundarni metaboliti. Te spojine preprečujejo oksidacijo plodov, do katere lahko pride zaradi vpliva okolijskih dejavnikov in delovanja mikroorganizmov. Namen naloge je bil raziskati vpliv genotipa malinjaka (Rubus idaeus L.), sušenja svežih plodov z zamrzovanjem in toplotne obdelave plodov pri pripravi nektarja na antioksidativni potencial. V raziskavo smo vključili plodove 19 različnih genotipov malinjaka. Antioksidativni potencial v metanolnih ekstraktih svežih in posušenih plodov ter nektarja smo merili z ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-metodami. Rezultate smo podali v µmol Trolox ekvivalenta (TE)/g suhe snovi (SS). Najvišji antioksidativni potencial je bil izmerjen pri divjem genotipu malinjaka, sledili so še primitivni in kultivirani genotipi. V ekstraktih plodov, ki so bili sušeni z zamrzovanjem, so bile ABTS-, DPPH- in FRAP-vrednosti višje kot v ekstraktih svežih plodov, vrednosti ORAC pa so pokazale drugačen trend. V ekstraktih nektarja so bile ABTS-, DPPHin FRAP-vrednosti nižje kot v ekstraktih svežih plodov. Znižanje antioksidativnega potenciala med termično obdelavo je lahko posledica izgube naravno prisotnih antioksidantov. Antioksidativni potencial ekstraktov svežih plodov, izmerjen z ABTS-metodo, močno in značilno korelira z vrednostmi, izmerjenimi z DPPH- in FRAP-metodo. Med ORAC-, ABTS-, FRAP- ali DPPH-vrednostmi ni značilne korelacije. Ključne besede: malinjak (Rubus idaeus L.), antioksidativni potencial, sveži plodovi, plodovi, sušeni z zamrzovanjem, nektar OP: XI, 52 s., 9 pregl., 7 graf., 1 slika, 57 ref. Antioxidant Activity of Different Raspberry Fruit Genotypes (Rubus idaeus L.) Raspberries are a good source of antioxidant molecules. These compounds are a group of secondary metabolites that prevent the fruit from oxidation due to environmental factors and microbiological attacks. The objective of this investigation was to evaluate the effects of raspberry genotype (Rubus idaeus L.), freeze-drying and thermal treatment on antioxidant activity. Fruits of 19 different raspberry genotypes were included in our investigation. Antioxidant activity was measured in metanolic extracts of fresh and liophilized berries and in extracts prepared from nectar using ABTS, DPPH, FRAP and ORAC assays. The results were expressed in μmol of Trolox equivalent (TE)/g of dry matter (SS). The highest antioxidant activity occurred in the wild genotype, followed by the primitive and cultivated genotypes. The ABTS, DPPH and FRAP values for the extracts of freeze-dried fruits were higher than their values for the extracts of fresh fruits. ORAC values showed the opposite trend. The ABTS, DPPH and FRAP values for the extracts of

6 VI nectar were lower than for the extracts of fresh fruits. Reduction of the antioxidant activity during thermal treatment could be due to the loss of naturally occurring antioxidants. The ABTS values for the extracts of fresh fruits showed strong and significant correlation with DPPH and FRAP values. No correlations were observed between ORAC and ABTS, FRAP or DPPH values. Key words: raspberry (Rubus idaeus L.), antioxidant activity, fresh sample, freeze-dryed sample, nectar NO: XI, 52 P., 9 Tab., 7 Graph, 1 Pict., 57 Ref.

7 VII Kazalo vsebine 1 UVOD PREGLED OBJAV Malinjak (Rubus idaeus L.) Znanstvena klasifikacija in razširjenost malin Sorte malin Hranilne snovi v malinah in zdravilni učinki Predelava malin Antioksidativni potencial Metode za merjenje antioksidativnega potenciala Antioksidativni potencial plodov malinjaka Vpliv predelave plodov in skladiščenja na antioksidativni potencial MATERIAL IN METODE DELA Vzorčenje Uporabljene aparature, reagenti in raztopine Priprava vzorcev za meritve Sušenje z zamrzovanjem in mletje vzorcev Priprava svežih malin Priprava nektarja Ekstrakcija vzorcev Merjenje antioksidativnega potenciala ABTS + radikal DPPH -radikal FRAP-metoda ORAC-metoda... 29

8 VIII 3.5 Statistična obdelava podatkov REZULTATI Z RAZPRAVO Vpliv genotipa na AOP Vpliv sušenja z zamrzovanjem na antioksidativni potencial Vpliv priprave nektarja na antioksidativni potencial Primerjava rezultatov, dobljenih z ABTS-, FRAP-, DPPH- in ORAC-metodo SKLEPI VIRI... 45

9 IX Kazalo preglednic Preglednica 1: Podrobnejši opis nekaterih pomembnejših enkrat rodnih sort (Koron 2014) Preglednica 2: Podrobnejši opis nekaterih pomembnejših dvakrat rodnih sort (Koron 2014)... 6 Preglednica 3: Vsebnost nekaterih mineralov v 100 g kaše rdečih malin (Rios de Souza in sod 2014) Preglednica 4: Prednosti in slabosti ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-metode (Hidalgo in Almajano 2017, Schleiser in sod. 2002, Karadag in sod. 2009) Preglednica 5: Vzorci različnih genotipov malinjaka Preglednica 6: Uporabljene kemikalije za kemijske analize in proizvajalci Preglednica 7: Priprava mikrotitrske plošče za meritve antioksidativnega potenciala z ORAC-metodo Preglednica 8: Povprečne vrednosti antioksidativnega potenciala ekstraktov plodov primitivnih in kultiviranih genotipov in standardni odmik (µmol TE/g SS) Preglednica 9: Pearsonov korelacijski koeficient antioksidativnega potenciala, izmerjenega po štirih metodah Kazalo slik Slika 1: Genotip Grad Pivola (levo) in genotip Samodiva (desno)... 20

10 X Kazalo grafikonov Grafikon 1: Vrednosti antioksidativnega potenciala za ekstrakte svežih in posušenih plodov malin ter nektarja, izmerjene z ABTS-metodo. Vrednosti so podane v µmol TE/g SS Grafikon 2: Vrednosti antioksidativnega potenciala za ekstrakte svežih in posušenih plodov malin ter nektarja, izmerjene z DPPH-metodo. Vrednosti so podane v µmol TE/g SS Grafikon 3: Vrednosti antioksidativnega potenciala za ekstrakte svežih in posušenih plodov malin ter nektarja, izmerjene s FRAP-metodo. Vrednosti so podane v µmol TE/g SS Grafikon 4: Vrednosti antioksidativnega potenciala za ekstrakte svežih in posušenih plodov malin ter nektarja, izmerjene z ORAC-metodo. Vrednosti so podane v µmol TE/g SS Grafikon 5: Povprečne vrednosti, izmerjene z ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-metodo v ekstraktih svežih in posušenih plodov. Iste črke označujejo neznačilne razlike pri stopnji značilnosti p < 0, Grafikon 6: Povprečne ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-vrednosti ekstraktov svežih plodov in nektarja

11 XI OKRAJŠAVE ABTS 2,2'-azobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil FRAP Ferric Reducing Antioxidants Power ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity AAE Ascorbic Acid Equivalents TE Trolox ekvivalent SS Suha snov

12 1 1 UVOD Sodoben način življenja in slabe prehranske navade so razlog, da se pojavlja vedno več bolezni. Pestra in uravnotežena prehrana pozitivno vpliva na naše zdravje (Pal 2010), pomembno vlogo imata zlasti zelenjava in sadje, saj vsebujeta veliko vitaminov, mineralov in balastnih snovi ter malo maščob. Med najbolj pomembno oz. zdravo sadje štejemo jagodičevje, ki popestri in obogati naš jedilnik. Veliko študij dokazuje, da uživanje jagodičevja pozitivno vpliva na zdravje (Rios de Souza in sod. 2014). Pripisujejo mu protivnetni učinek, preprečevanje rasti rakavih celic, zaviranje procesa staranja, preprečevanje bolezni srca in ožilja, odlično vpliva tudi na čiščenje in razstrupljanje telesa (God in sod. 2010, Bodi Eko 2014). Jagodičevje, med katerega sodijo tudi plodovi malinjaka, maline, vsebuje veliko spojin, ki imajo antioksidativni učinek. Antioksidanti so spojine, ki jih uvrščamo med rastlinske sekundarne metabolite. Plodove varujejo pred oksidacijo, do katere lahko pride zaradi okoljskih dejavnikov, kot so svetloba, kisik in delovanje mikroorganizmov (Hidalgo in Almajamo 2017). Med antioksidante štejemo vitamine, polifenole, antocianine, karotenoide, terpenoide in flavonoide (Korošec 2000). Antioksidantom literatura pripisuje mnoge pozitivne učinke na naš organizem, zato smo v okviru magistrskega dela raziskali antioksidativni potencial plodov 19 različnih genotipov (primitivnih in kultiviranih) malinjaka, ki smo jih v ta namen vzorčili v času fiziološke zrelosti. Analizirali smo sveže plodove in plodove, sušene z zamrzovanjem (posušene plodove), ter nektar, ki smo ga pripravili iz svežih plodov. Za merjenje antioksidativnega potenciala smo uporabili ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-metodo. Na osnovi rezultatov smo podali genotipe z najvišjim in najnižjim antioksidativnim potencialom. Postavili smo naslednje hipoteze: 1. primitivni genotipi malinjaka imajo višji antioksidativni potencial kot kultivirani, 2. sušenje z zamrzovanjem ne bo bistveno

13 2 vplivalo na vsebnost antioksidantov in značilne razlike med antioksidativnim potencialom ekstraktov svežih plodov in ekstraktov plodov, sušenih z zamrzovanjem, ne pričakujemo. Pri pripravi nektarja maline skupaj z dodano vodo in sladkorjem segrejemo na 80 C. Iz tega izhaja naša 3. hipoteza: ker termična obdelava plodov vpliva na kemijsko sestavo, v ekstraktih nektarja pričakujemo nižji antioksidativni potencial kot v ekstraktih svežih plodov.

14 3 2 PREGLED OBJAV 2.1 Malinjak (Rubus idaeus L.) Malinjak (Rubus idaeus L.) je pomembna kultivirana rastlinska vrsta in pomembno jagodičevje v mnogih državah. Njegova letna proizvodnja stalno narašča in trenutno presega 0,5 milijona ton na leto, njegove glavne pridelovalke pa so Rusija, Poljska, ZDA, Srbija in Ukrajina (Kryževičiūte in sod. 2016). Malinjak raste v gozdovih, posekih, grmovnatih mestih in ustaljenih gruščih, in sicer od nižine do subalpinskega pasu (Martinčič in sod. 1999). Malinjak raste pri zmernih temperaturah, na območjih s mm padavin letno. Ustrezajo mu zračne lege, primerne so predvsem sončne južne, jugozahodne in jugovzhodne lege. Malinjak zahteva lahka do srednje težka globoka in zračna tla. Je samooplodna ali delno samooplodna rastlina. Rastlina je medonosna, saj cvetovi tvorijo veliko nektarja (Štampar in sod. 2005), plodovi pa so veliki do 2,5 cm in so rdeče, rumene ali črne barve (Flowerdew 1998) Znanstvena klasifikacija in razširjenost malin Rod Rubus je zelo obširen, saj obsega kar 500 vrst (Krüssmann 1986, Nikolić in Milivojević 2010). Malinjak je doma v Evropi in Aziji (Flowerdew 1998). Krajnčič (2007) navaja, da je razširjen po vsej Evropi, v vseh predelih ZDA, v Kanadi, na Aljaski, v Turčiji, na Kavkazu, v vzhodni in zahodni Sibiriji, v Koreji in na Japonskem. Malinjak (Rubus idaeus L.) sodi v (Martinčič in sod. 1999): - rod Rubus, - družino Rosaceae (rožnice), - red Rosales (šipkovci), - razred Magnoliopsida (dvokaličnice),

15 4 - deblo Magnoliophyta (kritosemenke), - kraljestvo Plantae (rastline) Sorte malin Malino kot divjo rastlino so v prehranske in zdravilne namene uporabljali že stari Grki in Rimljani. Leta 1826 so v londonskem časopisu opisali 23 sort malin. V Veliki Britaniji so sredi dvajsetega stoletja skrižali sorti 'Malling exploit' in 'Malling promis', v Združenih državah Amerike pa sorto 'Willamette' (Štampar in sod. 2005). Plodovi malin so lahko svetlo rdeče, rdeče, temno rdeče, purpurne, črne in rumene barve. Masa plodu večine kultiviranih sort rdeče maline znaša 3 6 g (Nikolić in Milivojević 2010). Med ekonomsko pomembnejše sorte sodijo enkrat rodne sorte, kot so 'Glen ample', 'Meeker', 'Tulameen', 'Willamette', 'Malling exploit', in dvakrat rodne, kot so 'Autumn bliss', 'Heritage', 'Polka' in druge. Razraščenost, oblika plodov, čas zorenja in velikost pridelka za nekatere sorte je navedena v Preglednicah 1 in 2. Rumene maline so nastale z mutacijo vrst Rubus idaeus, R. strigosus in R. occidentalis. Rast in rodnost sta srednje bujni. Plodovi so bledo- do zlatorumene barve, so zelo trdni, vendar se pogosto drobijo. Po okusu so rumene maline podobne rdečim. Večina rumenih sort je dvakrat rodnih (Štampar in sod. 2005).

16 5 Preglednica 1: Podrobnejši opis nekaterih pomembnejših enkrat rodnih sort (Koron 2014). Sorta Rast Plod Čas zorenja Pridelek 'Glen ample', Anglija, Srednje bujna do bujna. Srednje velik do velik, svetlo rdeč, okroglo stožčast, Zgodnja, v sredini junija. Velik do zelo velik. čvrst, dobrega okusa, z močneje izraženo kislino. 'Meeker', ZDA, Bujne, Srednje velik do velik, Konec junija Srednje velik pokončne in visoke. okrogle stožčaste oblike, svetleče rdeč, čvrst, aromatičen, dober po okusu. (srednje zgodaj). 'Rubaca' Srednje bujna Srednje velik do velik in Srednje pozna Velik. (niniane), Nemčija, do bujna, visoka in pokončna. okrogle stožčaste oblike, srednje intenzivno rdeče obarvan in aromatičen ter dober po okusu. sorta (zori konec junija), ki zori zelo sočasno. 'Tulameen', Bujne in Zelo velik, dolg in stožčast, Pozno (druga Velik. Kanada, pokončne rasti. svetleče rdeč, čvrst in obstojen, okus je zelo dober in skladen. polovica junija), zori zelo dolgo. 'Willamette', ZDA, Bujna in pokončna, Srednje velik in prisekano stožčast, temno rdeč in Zgodaj (v sredini junija). Srednje velik do velik. trnasta. aromatičen, zelo prijeten in skladen okus. 'Malling Srednje bujna in Velik, podolgovat in Sredi junija. Velik. exploit'. pokončna. stožčast, svetlo rdeč, prijetnega sladko-kislega okusa, precej aromatičen. 'Glen clova' (Škotska). Zelo bujna. Srednje velik in stožčast, svetlo rdeče barve, trden, sladko-kisli okus. Sredi junija. Srednje velik.

17 6 Preglednica 2: Podrobnejši opis nekaterih pomembnejših dvakrat rodnih sort (Koron 2014). Sorta Rast Plod Čas zorenja Pridelek 'Autumn bliss' (blissy), Velika Srednje bujna, srednje visoka in Srednje velik do velik, prisekano Prvič zori zelo zgodaj (sredi Srednje velik do velik. Britanija. pokončna. stožčast, intenzivno rdeč, čvrst, aromatičen, blagega okusa, sladko-kisel in srednje dober. junija), drugič pa v začetku avgusta. 'Heritage', ZDA, Bujna in pokončna. Srednje velik, Zori pozno. Velik stožčast in živo rdeč, svetleč in trden, zelo dober okus. 'Himbo top' Zelo bujna. Velik, stožčast in Drugič začne zoreti Velik. (rafzaqu), Švica. svetleče rdeč, nekoliko manj čvrst, obstojen, po okusu dober. sredi avgusta in obiranje traja do deset tednov. 'Polka', Poljska, Srednje bujna do bujna. Srednje velik do velik, stožčast, trden, svetlo do temno rdeč, zelo dober okus. Prvič zori zelo zgodaj (sredi junija), drugič zori v začetku avgusta. Velik Hranilne snovi v malinah in zdravilni učinki Kemijska sestava sadja je odvisna od vrste, sorte, gojenja, regije, vremenskih pogojev, zrelosti, časa spravila in pogojev shranjevanja (Rios de Souza in sod. 2014).

18 7 Plodovi malin vsebujejo 77,4 90,9 % vode, 0,4 1,2 % beljakovin, 0,5 % maščob, 4,4 10,7 % sladkorjev, od katerih prevladujeta glukoza in fruktoza, nekaj je saharoze, 1,5 7,4 % celuloze, 0,5 2,8 % pektinov, 2,7 % pentozanov, 0,9 2,8 % kislin (največ citronske in jabolčne, malo salicilne, v sledovih vsebujejo tudi mravljično kislino), čreslovine, cianin (pigment) in druga barvila. Vsebujejo tudi sledove eteričnega olja, provitamina A, vitamina B in C, nikotinsko kislino, mineralne snovi, med katerimi so natrij, kalij, kalcij, magnezij, železo, baker in fosfor (Petauer 1993). Flowerdew (1998) navaja, da vsebujejo tudi vitamin B2 in B3. V Preglednici 3 so podane vsebnosti pomembnejših mineralov v rdečih malinah (Rios de Souza in sod. 2014). Avtorji navajajo, da je v le-teh vsebnost vlage v povprečju 88,60- odstotna in da so minerali v rdečih malinah dober vir antioksidantov. Preglednica 3: Vsebnost nekaterih mineralov v 100 g kaše rdečih malin (Rios de Souza in sod. 2014). Element Količina (mg/100 g svežega vzorca) P 5,70 K 71,84 Ca 1,14 Mg 15,96 Zn 0,37 Fe 1,06 Črne maline vsebujejo veliko biološko pomembnih spojin, kot so polifenoli, flavonoidi (antocianini), tanini, fenolne kisline in lignin, vitamini A, E in C, karotenoidi, fitohormoni in minerali. Obarvanost plodov je posledica akumulacije antocianinov. Črne maline sodijo med najbogatejše prehranske vire antocianinov (Xiao in sod. 2017, Novak 2015), ki skupaj s fenolnimi kislinami lahko upočasnijo staranje telesa, preprečujejo hiperglikemijo in zmanjšujejo postprandialni krvni sladkor (Xiao in sod. 2017).

19 8 Antikancerogen in protivnetni učinek sadja in jagodičevja je dobro poznan. Raziskave so pokazale, da ekstrakti številnih rastlin v celičnih strukturah preprečujejo razmnoževanje rakavih celic. Rdeče maline sodijo med najbolj učinkovito jagodičevje pri preprečevanju rasti rakavih celic. Antioksidanti varujejo celice pred mutagenezo in začetno stopnjo kancerogeneze, njihova vloga pri uničevanju že transformiranih celic pa je manj znana. Raziskave antioksidativnega potenciala in antiproliferativnega delovanja (zaviranje tvorb in razvoja rakavih celic) 13 različnih vrst jagodičevja so pokazale, da so rdeče maline med najbolj učinkovitimi pri preprečevanju širjenja petih različnih tipov rakavih celic. Poleg antioksidativnega vpliva vsebuje vsak ekstrakt malin tudi številne snovi, ki omogočajo preživetje celic in njihovo replikacijo (God in sod. 2010) Predelava malin Uporaba malin v prehranske namene in farmacevtske proizvode hitro narašča. Plodove malinjaka konzumiramo sveže ali zamrznjene, večino pa jih predelamo. Maline uporabljamo za izdelovanje sladoledov, hladnih mlečnih napitkov, nadevov za palačinke ali prelivov za puding. Naredimo lahko malinov sok, marmelade, džeme, uporabimo jih lahko tudi za želatino in sirupe (Koron 2014). Prav tako lahko pripravimo šerbet (osvežujoča pijača iz razredčenega sadnega soka), malinovo vino in čaj (Flowerdew 1998). Maline lahko tudi posušimo z zamrzovanjem (liofiliziramo), pri čemer se popolnoma ohrani hranilna vrednost in oblika plodov (Koron 2014). Zaradi visoke vsebnosti antocianinov bi lahko ekstrakte malin uporabljali kot naravno barvilo (Chen in sod. 2013). Novaković in sod. (2011) so preiskovali vpliv različnih načinov sušenja na antioksidativni potencial in na vsebnost fenolov v malinah, konkretno v kultivarju 'Willamette'. Uporabili so konvektivno (zračno) sušenje, osmotsko sušenje in sušenje z zamrzovanjem, pri tem so potrdili superiornost sušenja z zamrzovanjem. Konvektivno sušenje povzroči manjše spremembe, osmotska dehidracija pa signifikantno zmanjša vsebnost fenolnih spojin in antioksidativni potencial.

20 9 Ishiwata in sod. (2004) so v ekstraktih različnega sadja (jabolko, banana, češnja, jagoda idr.) merili vsebnost fenolov in antioksidativni potencial. Višji antioksidativni potencial so izmerili za sušeno sadje kot pa za ustrezno sveže sadje. 2.2 Antioksidativni potencial Prosti radikali so atomi ali skupine atomov, ki imajo nesparjen elektron, so zelo reaktivni in injicirajo nize verižnih reakcij. V organizmu nastajajo pri običajnem celičnem metabolizmu in lahko imajo pozitivne in negativne učinke. Pozitivno vlogo imajo pri pridobivanju energije, sintezi biološko pomembnih molekul in pri prenosu signalov med celicami, medtem ko se negativni učinki kažejo kot poškodbe membran, modifikacije proteinov in poškodbe DNA (Amić 2008). Antioksidanti so spojine, ki»lovijo«proste radikale in lahko upočasnijo ali preprečijo oksidacijske procese, ki nastanejo pod vplivom atmosferskega kisika ali reaktivnih kisikovih zvrsti. Vključeni so v obrambni mehanizem organizmov, živila pa ščitijo pred oksidacijo (kvarjenjem) (Pisoschi in Negolecu 2011). Glede na način delovanja oziroma glede na zaviranje oksidacije ločimo primarne, sekundarne in terciarne antioksidante. Primarni antioksidanti nastajajo v organizmu in imajo vlogo preprečevanja nastanka prostih radikalov. Sekundarni nevtralizirajo novonastale proste radikale, preprečujejo, da bi se vključili v verižne reakcije in da bi tvorili nove proste radikale. Terciarni antioksidanti popravljajo poškodbe v strukturi celic, ki jih povzročijo prosti radikali (Raspor in sod. 2000). Antioksidativni potencial je neposredno povezan s kemijsko sestavo in je seštevek delovanja različnih antioksidantov, in sicer vitaminov, polifenolov, antocianinov, karotenoidov, terpenoidov in flavonoidov (Korošec 2000). Predvsem skupni fenoli, skupni flavonoidi in antocianini imajo visoko stopnjo korelacije z antioksidativnim potencialom (Chen in sod. 2013).

21 10 Najmočnejši antioksidant med vodotopnimi vitamini je vitamin C (askorbinska kislina), ki kot reducent sodeluje v številnih bioloških procesih, pomemben pa je tudi za sintezo kolagena in karnitina ter za metabolizem maščobnih kislin. Kot koencim sodeluje pri številnih reakcijah hidroksiliranja in aminiranja. Najbogatejši vir vitamina C sta sadje in nekatera zelenjava. Vitamin E, ki je topen v maščobah, pa sodeluje pri preprečevanju spontane oksidacije močno nenasičenih spojin, zlasti polinenasičenih maščobnih kislin. Preprečuje tudi oksidacijo membranskih lipidov in drugih biološko aktivnih spojin, kot so npr. vitamin A, ubikinon, hormoni in encimi (Pandel Mikuš in Poljšak 2005). Fenoli so pomembne biološko aktivne spojine, ki imajo kot sekundarni metaboliti v rastlinah pomembno vlogo pri opraševanju in privlačnosti za ptice, rastline varujejo pred UV-svetlobo, odvračajo herbivorje in jih varujejo pred patogeni. Fenolne spojine so prisotne v vseh delih rastlin (Chen in sod. 2013). Glede na kemijsko strukturo lahko fenolne spojine okvirno razdelimo v štiri skupine: enostavni fenoli, fenolne kisline (povezane z barvo, senzorično kakovostjo, organoleptičnimi lastnostmi plodov), fenilpropanoidi in flavonoidi, ki jih lahko nadalje razdelimo na flavone, flavonole, katehine in antocianine (Chen in sod. 2013). Antocianini so odgovorni za barvo sadja in zelenjave, vplivajo pa na organoleptične lastnosti živil (Dragišić Maksimović in sod. 2013). Antocianinski profil in vsebnost posameznih antocianinov lahko služita za identifikacijo sort malinjaka (Chen in sod. 2013) Metode za merjenje antioksidativnega potenciala Za merjenje antioksidativnega potenciala v živilih so bile razvite številne metode. Med najpogosteje uporabljene spadajo ABTS, FRAP, DPPH, ORAC, TRAP in nekatere druge. Antioksidanti lahko reducirajo radikale primarno po dveh mehanizmih, in sicer s prenosom elektrona in vodikovega atoma (Ozgen in sod. 2006).

22 11 Metode, ki jih uporabljamo za merjenje antioksidativnega potenciala, se med seboj razlikujejo po času in mehanizmu reakcije, oksidantih, ciljni vrsti, pogojih reakcije in izražanju rezultatov. V oceno skupnega antioksidativnega potenciala je potrebno vključiti prispevek lipofilnih in hidrofilnih sestavin vzorca (Karadag in sod. 2009). Vidrih in Kač (2000) metode, s katerimi merimo antioksidativni potencial, delita na direktne in indirektne. Med direktne metode sodita ORAC-metoda in določanje antioksidativnega potenciala z ß-karotenom; med indirektne pa ABTS-, DPPH- in FRAPmetoda. Direktne metode so bolj občutljive in natančne in temeljijo na proučevanju vpliva dodanega antioksidanta na potek verižne oksidacije določenega substrata s prostimi radikali. Indirektne metode so pogostejše in bolj primerne za rutinsko analizo. Merijo sposobnost antioksidantov za lovljenje tistih prostih radikalov, ki niso direktno povezani z oksidacijsko razgradnjo (Roginsky in Lissi 2005). Metoda ABTS je med najbolj razširjenimi indirektnimi metodami določanja antioksidativnega potenciala. Pri oksidaciji med ABTS in kalijevim persulfatom se tvori zeleno-modro obarvan kationski radikal ABTS +, ki ima absorpcijski maksimum pri valovni dolžini 734 nm. ABTS +-radikal se v prisotnosti antioksidantov reducira, kar vodi do razbarvanja. Metoda je primerna za določanje hidrofilnih in lipofilnih antioksidantov (Roginsky in Lissi 2005). ABTS meri antioksidativni potencial starševske spojine in reakcijskih produktov, ki lahko znatno prispevajo k ABTS-vrednosti (Karadag in sod. 2009). DPPH (difenilpikrilhidrazil radikal) je stabilen organski radikal, ki ima vijolično barvo in absorpcijski maksimum pri 520 nm. Elektron je enakomerno delokaliziran preko cele molekule. Pri reakciji z antioksidantom sprejme elektron ali vodikov atom, pri čemer se reducira in nastane molekula difenilpikrilhidrazina, ki ni reaktivna. Ko se DPPH -radikal reducira, se razbarva do bledo rumene barve. Reakcija poteče z aromatskimi amini, glutationom, vitaminom E in polihidroksi aromati (Karadag in sod. 2009). DPPH ne reagira s tistimi aromatskimi kislinami in flavonoidi, ki na obroču B nimajo -OH skupin ali pa imajo samo eno -OH skupino (Roginsky in Lissi, 2005).

23 12 FRAP-metoda (»Ferric reducing antioxidant power«) je osnovana na sposobnosti antioksidantov, da donirajo elektron in reducirajo rumen železov tripiridiltriazin kompleks (Fe (III) TPTZ) v moder železov kompleks (Fe (II) TPTZ). Reakcija poteka v kislem mediju. Intenziteto absorpcije modro obarvanega kompleksa merimo pri valovni dolžini 593 nm (Karadag in sod. 2009). Z metodo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) določamo učinkovitost lovljenja kisikovih radikalov. Pri metodi uporabimo protein β-fikoeritrin, ki naravno fluorescira, in ga uporabimo kot tarčo, na katero delujejo peroksilni radikali. Izvor peroksilnih radikalov je AAPH. Po dodatku AAPH se fikoeritrin oksidira, posledično pa se zmanjša njegova fluorescenca. Antioksidanti bi naj zaščitili β-fikoeritrin pred oksidacijo. Metoda ORAC ne meri skupnega antioksidativnega potenciala, saj meri le antioksidativni potencial proti peroksilnim radikalom (Ou in sod. 2002). Nekatere prednosti in pomanjkljivosti posameznih metod so navedene v Preglednici 4.

24 13 Preglednica 4: Prednosti in slabosti ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-metode (Hidalgo in Almajano 2017, Schleiser in sod. 2002, Karadag in sod. 2009). Metoda Prednosti Slabosti ABTS Preprosta za izvedbo, široko ph območje, omogoča merjenje hidrofilnih in lipofilnih antioksidantov, ABTS je topen v vodnem in organskem mediju. Kratek reakcijski čas lahko da nepravilne rezultate; številne fenolne spojine potrebujejo dolg reakcijski čas, da dosežejo končno točko, ABTS + reagira z OH skupinami na aromatskih obročih spojin, ne glede na to, ali te prispevajo k antioksidativni aktivnosti ali ne. DPPH Enostavna, hitra, poceni in dostikrat uporabljena metoda, DPPH je stabilen radikal. Ozko ph območje, DPPH je topen samo v organskem mediju, antioksidativni potencial pri določeni vsebnosti vode v vzorcu pade, ker del DPPH koagulira, in za reakcijo z antioksidanti ni dostopen. FRAP Eden najhitrejših testov, zelo uporaben za rutinske analize, enostaven, poceni, robusten, ne zahteva specializirane opreme. Vsi donorji elektrona, ki imajo nižji redoks-potencial kot redoks-par Fe (III)/Fe (II), lahko reducirajo Fe (II). Če gre za spojine, ki niso antioksidanti, bodo FRAPvrednosti previsoke. Antioksidanti (npr. glutation), ki lahko učinkovito reducirajo prooksidante, niso sposobni reducirati Fe 3 +. ORAC Radikali se obnašajo podobno kot avtentični radikali, vključene so variacije vrednosti s časom, primerne za vzorce s kompleksno sestavo in reakcijsko kinetiko; uporaba različnih generatorjev prostih radikalov ali oksidantov. Visoka variabilnost rezultatov, merimo lahko samo hidrofilne antioksidante. Floegel in sod. (2011) navajajo, da je ABTS-metoda primernejša za merjenje antioksidativnega potenciala hrane, še posebej sadja, zelenjave in pijač, kot DPPH. Podatki, ki so jih pridobili iz baze podatkov (USDA-ORAC-baza podatkov), kažejo, da

25 14 vrednosti ABTS močno korelirajo z vrednostmi ORAC. Raziskava je pokazala, da je metoda ABTS za živila rastlinskega izvora, ki vsebujejo hidrofilne in lipofilne antioksidante in visoko pigmentirane spojine, ustreznejša kot DPPH. Thaipong in sod. (2006) niso našli korelacijske povezave med antioksidativnim potencialom, izmerjenim s FRAP- in ORAC-metodo za 927 liofiliziranih vzorcev zelenjave. Pri sirku in njegovih proizvodih so dobili visoko korelacijo med vrednostmi, izmerjenimi z ABTS-, DPPH- in ORAC-metodo. ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORACmetoda so dale primerljive rezultate pri merjenju antioksidativnega potenciala metanolnih ekstraktov guave Antioksidativni potencial plodov malinjaka Rdeče maline imajo visok antioksidativni potencial, in sicer zaradi visoke vsebnosti antocianinov in drugih fenolnih spojin. Vsebnost fenolnih spojin in antioksidativni potencial sta odvisna od okoljskih dejavnikov in genetike. Rdeče maline so komercialno pomemben pridelek in jih gojijo v vseh klimatsko zmernih regijah po svetu, v pretežni meri jih konzumira lokalno prebivalstvo. Velika večina komercialno pomembnih modernih kultivarjev rdečega malinjaka izvira iz hibridov ali selekcije divjih malinjakov. Severna Turčija je eden od pomembnejših centrov germplazme (živih genetskih virov) divjih vrst malinjaka. Rdeče maline rastejo na visoki nadmorski višini (nad 1000 m) in potrebujejo vlažna tla, v nekaterih primerih imajo plodovi divjih rastlin rdečega malinjaka drugačno kemijsko sestavo in drugačen okus kot kultivirane rastline. Veliko raziskovalcev navaja, da ima večina divjih speciesov višji antioksidativni potencial, bogatejši okus, atraktivnejšo barvo in prijetnejši vonj (Çekiç in Özgen 2010). Çekiç in Özgen (2010) sta preučevala 14 divjih akcesij rdečega malinjaka, ki rastejo v gorskih območjih severne Turčije na nadmorski višini m. V raziskavo sta vključila tudi komercialna kultivarja 'Heritage' in 'Tulameen'. Namen njune raziskave je bil primerjati antioksidativni potencial plodov divjih in kultiviranih malinjakov, pri tem sta

26 15 ugotovila, da je teža plodov kultiviranih akcesij malinjaka veliko večja kot teža plodov divjih akcesij. Vsebnost suhe snovi znaša pri plodovih malinjaka 16,6 23,3 %. Divje akcesije imajo plodove temnejše rdeče barve, plodovi kultiviranih malinjakov pa so svetlejši. Signifikantne razlike so se pojavile v vsebnosti skupnih fenolov, antocianinov in v antioksidativnem potencialu. Avtorja poročata, da imajo nekatere divje akcesije malinjaka višji antioksidativni potencial, boljše pomološke značilnosti in tudi višjo hranilno vrednost v primerjavi z obstoječimi udomačenimi kultivarji. Med divjimi akcesijami malinjaka je bila signifikantna variabilnost antioksidativnega potenciala, vsebnosti skupnih fenolov, antocianinov, organskih kislin in sladkorjev. Genotipi z višjo vsebnostjo fenolnih spojin so imeli tudi višji antioksidativni potencial. Rezultati, dobljeni z ABTS-metodo, so se dobro ujemali z rezultati, dobljenimi po FRAP-metodi (korelacijski koeficient je znašal 0,81). FRAP-vrednosti so v plodovih divjih akcesij malinjaka znašale od 11,2 µmol TE/g svežega vzorca do 19,7 µmol TE/g svežega vzorca. Pri kultivarju 'Heritage' je vrednost znašala 18,1 µmol TE/g svežega vzorca in pri kultivarju 'Tulameen' 14,4 µmol TE/g svežega vzorca. ABTS-vrednosti ekstraktov plodov divjih akcesij rdečih malin so bile med 8,9 µmol TE/g in 21,5 µmol TE/g svežega vzorca. Pri kultivarjih 'Heritage' in 'Tulameen' pa sta bili izmerjeni vrednosti 17,5 µmol TE/g in 12,9 µmol TE/g svežega vzorca (Çekiç in Özgen 2010). Potrošniki zahtevajo zdravo, dietno sadje, bogato z antioksidanti, kar bi moralo biti vodilo za žlahtnitelje novih kultivarjev. V raziskavi, ki so jo opravili Rios de Souza in sod. (2014), so antioksidativni potencial ekstraktov plodov rdečih malin izmerili z ABTS-metodo. Povprečna vrednost za vse analizirane genotipe malin je bila 6,27 ± 0,02 µmol/g svežega vzorca. Kryževičiūte in sod. (2016) so z ABTS-metodo izmerili antioksidativni potencial v ekstraktih malin, ki so jih pripravili s polarnim (metanol) in nepolarnim topilom (heksan). Uporabili so klasično ekstrakcijo in ekstrakcijo s superkritičnim CO2. Navajajo, da imajo polarne frakcije (metanolni ekstrakti) občutno višje vsebnosti antioksidantov. Najvišjo vrednost so izmerili, ko je ekstrakcija potekala pri temperaturi 30 C 15 min (561 µmol TE/g), najnižjo pa pri temperaturi 70 C 15 min (308 µmol TE/g).

27 16 Portal za zdravje (2010) objavlja, da je antioksidativni potencial svežih malin dobljen po ORAC-metodi 4,882 µmol TE/100 g vzorca. Bobinaite in sod. (2012) so v metanolnih ekstraktih različnih kultivarjev malin določali odstotek inhibicije DPPH-radikala, pri tem so dobili vrednosti od 41,5 % (kultivar 'Benefis') do 82,4 % (kultivar 'Bristol'). Odstotek inhibicije DPPH-radikala črnih malin je bil 33 % višji od povprečne vrednosti vseh analiziranih kultivarjev rdečih malin. Na antioksidativni potencial plodov malin vpliva več dejavnikov, in sicer sorta malinjaka (Chen in sod. 2013), osvetlitev in stopnja zrelosti plodov. Maline v polni zrelosti imajo višji antioksidativni potencial in višjo vsebnost antocianinov kot maline v fazi 50-odstotne zrelosti (ko so plodovi svetlo rdeči). Plodovi, pobrani v zeleni fazi (5- in 20-odstotna zrelost), kažejo višji antioksidativni potencial in vsebnost skupnih fenolov kot plodovi, pobrani v fazi 50-odstotne zrelosti (Wang in sod. 2009). Rios de Souza in sod. (2014) so v metanolnih ekstraktih različnih sadežev (robide, rdeče maline, jagode, sladke češnje in borovnice) z metodo ABTS in DPPH določali antioksidativni potencial. Po metodi ABTS vrednost antioksidativnega potenciala v ekstraktu rdečih malin znaša 6,27 µmol TE/g svežega vzorca. Najvišji antioksidativni potencial so imele robide (13,23 µmol TE/g svežega vzorca), sledile so češnje (8,83 µmol TE/g svežega vzorca), jagode (7,87 µmol TE/g svežega vzorca), rdeče maline in borovnice (5,88 µmol TE/g svežega vzorca). Antioksidativni potencial rdečih malin, izmerjen z metodo DPPH, je bil 4960,58 EC50 g svežega vzorca/g DPPH. Najvišji antioksidativni potencial po DPPH-metodi so imele robide, sledile so jim jagode, rdeče maline, češnje in borovnice. Fan in sod. (2011) so analizirali 11 različnih vrst sadja (jagodo, borovnico, glog, kivi, rdečo malino idr.), ki raste na hladnejšem območju Kitajske. Primerjali so vsebnosti skupnih fenolov, flavonoidov, antocianinov in antioksidativni potencial. Ekstrakcijska tekočina je vsebovala aceton in vodo. Med vsemi analiziranimi vzorci sadja so imele najvišji antioksidativni potencial maline.

28 Vpliv predelave plodov in skladiščenja na antioksidativni potencial Veliko raziskav je preučevalo vpliv različnih načinov sušenja na vsebnost biološko aktivnih snovi v sadju, zelenjavi in zeliščih. Izgube teh snovi so lahko od 0- do 100- odstotne, odvisno od načina in pogojev sušenja ter vrste rastlinskega materiala (Chen in Mujumdar 2007). V primerjavi s klasičnim sušenjem poteka sušenje z zamrzovanjem pri nizkih temperaturah in na ta način ohranja vsebnost številnih spojin, ki pri višjih temperaturah razpadejo. Sablani in sod. (2011) ter Novaković in sod. (2011) poročajo o višjem antioksidativnem potencialu plodov malinjaka, sušenih z zamrzovanjem, v primerjavi s svežimi plodovi. Prvi avtorji so uporabili ABTS-metodo, drugi pa metodo DPPH. Raziskava, ki so jo opravili Si in sod. (2015) je prišla do nasprotnih ugotovitev, saj so bile ABTS-, DPPH- in FRAPvrednosti plodov, sušenih z zamrzovanjem, nižje od vrednosti svežih plodov. Patel in sod. (2016) so raziskovali vpliv sušenja na antioksidativni potencial guave. Sušenje je ena izmed tehnik, ki podaljša rok trajanja. V raziskavi so za sušenje plodov uporabili pečico, osmotsko dehidracijo in sušenje z zamrzovanjem. Postopki sušenja statistično značilno vplivajo na vsebnost polifenolov in flavonoidov. Vsebnost fenolov in flavonoidov je statistično značilno višja v svežih plodovih, sledijo plodovi, posušeni v pečici, liofilizirani plodovi in nazadnje osmotsko dehidrirani plodovi. Tehnologije sušenja vplivajo na fitokemično sestavo guave in njeno antioksidativno sposobnost. Uporaba sušenja v zelo hitro pokvarljivem sadju pa ne samo, da ohranja hranilno vrednost sadja, ampak tudi ohranja antioksidativni potencial. Veliko raziskav je bilo narejenih o vplivu toplotne obdelave na vsebnost biološko aktivnih snovi v sadju (Sablani in sod. 2010, Arancibia-Avila in sod. 2012). Predelava sadja in zelenjave bi naj tako znižala vsebnost biološko aktivnih snovi (Arancibia-Avila in sod. 2012). Blanširanje jagodičevja pred vkuhavanjem kompota ima različen vpliv na vsebnost

29 18 antocianinov, fenolov in antioksidativni potencial. Blanširanje (2 min pri 95 C in nato ohlajanje na 38 C) borovnic značilno zniža vsebnost skupnih antocianinov, nima pa značilnega vpliva na vsebnost skupnih fenolov in na antioksidativni potencial. V blanširanih malinah se vsebnost antocianinov značilno zviša, skupni fenoli se znižajo, antioksidativni potencial pa se zviša, vendar spremembe niso značilne. Borovnice, ki jih pred pripravo soka blanširamo, imajo podoben antioksidativni potencial (ABTS-metoda) kot sveži plodovi. Antioksidativni potencial borovničevega soka, pripravljenega iz neblanširanih borovnic, pa je značilno nižji kot v svežih plodovih. Pri malinah se antioksidativni potencial soka, pripravljenega iz blanširanih in svežih plodov, bistveno ne razlikuje. V primerjavi s svežimi plodovi se zniža, velikost zmanjšanja pa je odvisna od sorte (Sablani in sod. 2010). Kim in Padilla-Zakour (2004) poročata, da predelava in segrevanje med proizvodnjo marmelad znižata vsebnost skupnih fenolov, antocianinov in antioksidativni potencial. V raziskavi sta ugotovila, da se pri predelavi svežih malin v marmelado ohrani več kot 73 % skupnih fenolov in več kot 65 % antioksidativnega potenciala. Dokazala sta, da so pri malinah razlike v antioksidativnem potencialu svežih plodov malinjaka in marmelade statistično značilne. Wang in Lin (2000) sta merila vsebnost skupnih fenolov in antioksidativni potencial sokov, ki so bili pripravljeni iz plodov in listov različnih vrst sadja (robid, rdečih malin, jagod ). Plodovi (zeleni, rožnati in komercialno zreli) so bili pobrani v različnih stopnjah zrelosti. ORAC-vrednost za malinov sok, ki je bil pripravljen iz popolnoma zrelih plodov, je znašala od 40 do 55,5 µmol TE/g SS. Priprava soka je znižala ORAC-vrednosti za sveže plodove malin od 37.1 do µmol TE/g SS. Zreli plodovi črnih malin in robid imajo višji antioksidativni potencial kot rdeče maline, jagode pa nižjega. Zafrilla in sod. (2001) so raziskali vpliv predelave rdečih malin v džem na vsebnost posameznih fenolnih spojin in antioksidativni potencial. Spremljali so tudi spremembe v času skladiščenja džema. Antioksidativni potencial so merili z DPPH-metodo. Vsebnost flavonolov se je s predelavo nekoliko zmanjšala, bolj izrazito pa se je zmanjšala v času

30 19 skladiščenja. Derivati elaginske kisline so ostali stabilni pri predelavi in tudi med šestmesečnim skladiščenjem džema. Vsebnost proste elaginske kisline se je med skladiščenjem povečala za trikrat. Avtorji zvišanje vsebnosti elaginske kisline pripisujejo sproščanju le-te iz elagitaninov med termično obdelavo. Vpliv toplotne obdelave na antioksidativni potencial zelenjave so raziskovali Chipurura in sod. (2010). Zelenjava je bila različno toplotno obdelana: kuhana s paro, konvencionalno kuhana, blago segrevana, pol sušena, konvencionalno kuhana skupaj s pripravo v mikrovalovni pečici idr. Prišli so do ugotovitev, da se med predelavo vsebnost antioksidantov zmanjša. Pri kuhanju zelenjave je eden od razlogov, da spojine prehajajo v vodo in na ta način vplivajo na antioksidativni potencial. Mikrovalovna pečica ima večji vpliv na zmanjšanje antioksidativnega potenciala kot druge metode. Polifenoli, npr. elaginska kislina, kvercetin-3-glukozid, derivati kvercetina idr., so v sveže pobranih plodovih malin na začetku skladiščenja prisotni v visokih koncentracijah. Med skladiščenjem se njihova vsebnost drastično zmanjšuje. Maline, ki so bile pobrane pri 50- odstotni ali višji stopnji zrelosti (na podlagi raziskave Wanga in sod.), so med skladiščenjem dosegle primerljivo vsebnost sladkorjev, antocianinov, fenolov in antioksidativni potencial kot maline, ki so bile pobrane v času polne zrelosti. Antioksidativni potencial za sveže vzorce malin, izmerjen po metodi ORAC, se je gibal med 30 in 65 µmol TE/g svežega vzorca (Wang in sod. 2009).

31 20 3 MATERIAL IN METODE DELA 3.1 Vzorčenje Vzorčenje 19 genotipov malinjaka (med katerimi so bili nekateri primitivni, nekateri kultivirani, eden pa divji) je potekalo v genski banki in botaničnem vrtu v okviru posestva FKBV v Hočah. Rastline so bile izpostavljene podobnim okoljskim pogojem; niso bile gnojene z umetnimi gnojili in niso bile tretirane z nobenim sredstvom. Za raziskave so bili uporabljeni plodovi posameznega genotipa malin, ki smo jih pobrali v času njihove primerne fiziološke zrelosti (Slika 1). Odbrali smo različno število vzorčenih rastlin posameznega genotipa, ki uspevajo na isti lokaciji in so tretirani na enak način, saj vsak genotip ni zastopan z enakim številom rastlin. Opis genotipov, ki smo jih vključili v raziskavo, je podan v Preglednici 5. V analize smo vključili samo zdrave plodove. Slika 1: Plodovi primitivnega genotipa Grad Pivola (levo) in kultiviranega genotipa 'Samodiva' (desno) (Breznik 2017). Plodove smo pobirali od julija do oktobra in jih do priprave za kemijske analize shranili na -75 C. Tretjino zamrznjenih plodov smo pred kemijskimi analizami posušili z zamrzovanjem in jih nato zmleli, uporabili smo tudi tretjino svežih plodov, iz tretjine vzorcev pa smo pripravili še nektar. Vse vzorce smo do kemijskih analiz hranili v zamrzovalniku pri -75 C.

32 21 Preglednica 5: Vzorci različnih genotipov malinjaka. Vzorci Genotip Divja/primitivna/kultivirana Čas zorenja Rodnost 1 Grad Pivola Primitivna Julij, drugič konec avgusta Dvakrat rodna 2 'Glen Ample' Kultivirana Zgodaj (v sredini junija) Enkrat rodna 3 Vila Pivola Primitivna Julij, drugič konec avgusta Dvakrat rodna 4 Vila Pivola Primitivna Julij, drugič konec avgusta Dvakrat rodna 5 Hočko Pohorje Divja Druga polovica junija Enkrat rodna 6 'Himbo' Kultivirana Drugič začne zoreti sredi avgusta Dvakrat rodna 7 Anja, Moškajnci Kultivirana Prvič rodijo junija, drugič Dvakrat rodna septembra oz. oktobra 8 'Meeker' Kultivirana Srednje zgodaj (konec junija) Enkrat rodna 9 'Samodiva' Kultivirana / Enkrat rodna 10 'Latham' Kultivirana / / 11 Anita, debelejši Kultivirana Konec junija, drugič konec avgusta Dvakrat rodna genotip 12 Anita, drobni Primitivna Julija Enkrat rodna genotip 13 Anita, beloplodna Kultivirana Junija prvič, drugič konec avgusta Dvakrat rodna 14 'Himbo' Kultivirana Drugič začne zoreti sredi avgusta Dvakrat rodna 15 'Heritage' Kultivirana Pozno Dvakrat rodna 16 'Royality' Kultivirana / Enkrat rodna 17 'Erika' Kultivirana Od sredine julija do konca Dvakrat rodna septembra 18 Genotip iz Primitivna Druga polovica junija Enkrat rodna Jurkloštra 19 Genotip iz Velike Primitivna Druga polovica junija Enkrat rodna nedelje 20 JJR Kultivirana / / 21 'Heritage' Kultivirana Pozno Dvakrat rodna 22 Nr26TR Kultivirana / / /-Ni podatka

33 Uporabljene aparature, reagenti in raztopine Za hranjenje, ekstrakcijo plodov malinjaka in meritve antioksidativnega potenciala smo uporabljali naslednje aparature: - zamrzovalno omaro (Forma Scientific, -86 C FREEZER), - liofilizator (CHRIST, ALPHA 1 2 LO), - mlin za mletje posušenih vzorcev (FRITSCH puluerisette 14), - mlin za mletje svežih vzorcev (Retsch, GRINDOMIX, GM200), - indukcijsko ploščo (za pripravo nektarja) etis, - tehtnico (AT261 DeltaRange, Mettler Toledo), - ultrazvočno kopel (BANDELIN SONOREX, RK 103 H, Nemčija), - centrifugo (ROTANTA 460 R, Hettich ZENTRIFUGEN), - spektrofotometer (VARIAN Cary 50 BIO), - čitalec mikrotitrskih ploščic (TECAN, Infinite M1000 Pro), - aparat za vakumiranje (SmartVac STATUS), - elektronsko pipeto (Handy Step ELECTRONIC, BRAND), - rotacijski stresalnik (PHOENIX Instrument RS-VA10). Kemikalije, ki smo jih uporabljali za pripravo raztopin, so zbrane v Preglednici 6.

34 23 Preglednica 6: Uporabljene kemikalije za kemijske analize in proizvajalci. Uporabljena kemikalijaokrajšava Uporabljena kemikalija - polno ime Proizvajalec Trolox (±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna Sigma-Aldrich, Danska kislina DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Sigma-Aldrich, Nemčija TPTZ 2,4,6-tris (2-piridil) -s-triazin Sigma-Aldrich, Švica AAPH 2,2'-azobis (2-metilpropionamidin) Sigma-Aldrich, Nemčija dihidroklorid Metanol Metanol puriss p. a., ACS reagent Sigma-Aldrich, Francija CH 3COOH Ocetna kislina Sigma-Aldrich, Nemčija ABTS 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- Sigma-Aldrich, Kanada sulfonska kislina) diamonijeva sol K 2O 8S 2 Kalijev persulfat Sigma-Aldrich, Nemčija FeCl 3 6H 2O Železov(III) klorid heksahidrat Sigma-Aldrich, Nemčija) C 20H 10Na 2O 5 Fluorescin (dintrijeva sol) Sigma-Aldrich, ZDA HCl Klorovodikova kislina Sigma-Aldrich, Nemčija NaCH 3COO Natrijev acetat Fluka, Švica Na 2HPO 4 2H 2O Natrijev hidrogenfosfat(v) dihidrat Sigma-Aldrich, Nemčija NaH 2PO 4 H 2O Natrijev dihidrogenfosfat(v) monohidrat, ACS reagent Sigma-Aldrich, Nemčija Priprava raztopin in reagentov: Za ekstrakcijo vzorcev smo uporabili 80 % metanol z dodatkom ocetne kisline (1 %). Raztopina ABTS + Raztopino ABTS + smo pripravili tako, da smo v 10-mililitrsko bučko z nekaj ultra čiste vode raztopili 6,62 mg K2O8S2. Nato smo zatehtali še 38,4 mg ABTS in ga dodali v bučko ter dopolnili z vodo do oznake. Raztopino smo postavili v temo na sobni temperaturi in jo pustili stati ur. Koncentracija pripravljene raztopine ABTS + je znašala 7 mmol/l in

35 24 je nasploh obstojna 5 dni, če jo hranimo pri 4 C. Pred meritvami smo raztopino ABTS + redčili z 80 % metanolom, da smo dobili raztopino z absorbanco 0,70±0,20. Raztopina DPPH Raztopino DPPH smo pripravljali vedno svežo, tik pred meritvami. V 100-mililitrsko bučko smo natehtali 4 mg DPPH in jo dopolnili s čistim metanolom do oznake. Raztopina FRAP FRAP-reagent smo pripravili vedno svež, tik pred meritvami. Pripravili smo ga tako, da smo zmešali acetatni pufer, TPTZ in FeCl3 6H2O v razmerju acetatni pufer: TPTZ : FeCl3 6H2O = 10:1:1. Acetatni pufer s koncentracijo 300 mm smo pripravili v 100-mililitrski bučki tako, da smo zatehtali 0,31 g NaCH3COO in dodali 1,6 ml CH3COOH ter bučko dopolnili z vodo do oznake. TPTZ smo pripravili v 25-mililitrski bučki. Zatehtali smo 78 mg TPTZ in bučko dopolnili s 40 mm HCl. 25 ml FeCl3 x 6H2O smo pripravili v 25- mililitrski bučki tako, da smo zatehtali 135 mg FeCl3 6H2O in bučko dopolnili z vodo do oznake. 40 mm HCl smo pripravili v 50-mililitrski bučki, in sicer tako, da smo odpipetirali 197 µl HCl in bučko dopolnili z vodo do oznake. Fosfatni pufer Pripravili smo ga tako, da smo zatehtali 35,6 g Na2HPO4 x 2H2O in ga raztopili v 1 litru destilirane vode. Nato smo 14,0 g NaH3PO4 raztopili v 1 l destilirane vode, da smo dobili 0,2 M raztopino. Z merilnim valjem smo odmerili 810 ml 0,2 M Na2HPO4 in 190 ml 0,2 M NaH3PO4 ter z destilirano vodo dopolnili do 2 l; ph raztopine je bil 7,4. Raztopina AAPH Raztopino AAPH smo pripravili z raztapljanjem 0,166 g AAPH v 4 ml fosfatnega pufra. Hranili smo jo na ledu, 5 7 minut pred injiciranjem pa smo jo segreli v vodni kopeli na 37

36 25 C. Raztopina fluorescina Osnovno raztopino fluorescina smo pripravili v 100-mililitrski bučki tako, da smo zatehtali 50 mg fluorescina in bučko dopolnili s fosfatnim pufrom do oznake. Odpipetirali smo 1 ml osnovne raztopine fluorescina in ga redčili v 100 ml fosfatnega pufra s ph 7,4. Vedno svežo delovno raztopino fluorescina smo pripravili v 100-mililitrski bučki tako, da smo odpipetirali 614 µl redčene raztopine fluorescina in bučko dopolnili s pufrom. Standardna raztopina Trolox (sintetični analog vitamina E) Osnovno standardno raztopino Trolox smo glede na posamezne metode različno pripravili: Za meritve z ABTS- in FRAP-metodo: v 10-mililitrski bučki smo z dodatkom ekstrakcijske raztopine raztopili 25 mg Troloxa. Koncentracija pripravljene raztopine je bila 10 mmol/l. Raztopino smo zavarovali pred svetlobo. Takšna raztopina je obstojna do enega meseca, če jo hranimo pri -20 C. Za meritve z DPPH-metodo smo prav tako pripravili standardno raztopino Trolox s koncentracijo 10 mmol/l, le da smo jo raztopili v čistem metanolu. Za ORAC-metodo smo v fosfatnem pufru pripravili raztopino Trolox s koncentracijo 2 mmol/l. Standardne raztopine Trolox za umeritveno krivuljo Iz osnovne standardne raztopine Trolox smo pripravili pet delovnih raztopin, in sicer: Za meritve z ABTS- in DPPH-metodo smo pripravili raztopine s koncentracijami Trolox 50 µmol/l, 100 µmol/l, 200 µmol/l, 300 µmol/l in 350 µmol/l oziroma 50 µmol/l, 100 µmol/l, 200 µmol/l, 300 µmol/l in 400 µmol/l. Pripravili smo jih z ustreznim redčenjem osnovne standardne raztopine Trolox. Raztopine Trolox za ABTS-metodo so bile redčene z ekstrakcijsko raztopino, za DPPH-metodo pa z metanolom. Umeritvena krivulja za meritve s FRAP-metodo je bila pripravljena v koncentracijskem območju od 50 µmol/l do 700 µmol/l in za ORAC-metodo med 6,3 µmol/l in 100 µmol/l. Osnovna standardna raztopina

37 26 je bila redčena z ekstrakcijsko raztopino (FRAP) oziroma s fosfatnim pufrom (ORAC). 3.3 Priprava vzorcev za meritve Sušenje z zamrzovanjem in mletje vzorcev Sveže vzorce smo en teden sušili z zamrzovanjem pri 50 C in podtlaku 0,070 mbar. Sledilo je mletje vzorcev in pakiranje v krioviale. Vzorce smo pred in po sušenju stehtali, da smo določili vsebnost vlage. Krioviale smo vakuumsko zapakirali in jih hranili pri -75 C Priprava svežih malin Sveže maline smo zmleli v mlinu. Zmleto vsebino smo hranili v centrifugirkah na -75 C Priprava nektarja Nektar smo pripravili po receptu Innerhoferja (2015). Najprej smo maline zmleli v mlinu, enako kot sveže vzorce. Nato smo na 1 kg svežih malin dodali 1 l vode in 140 g sladkorja. Razmerja med posameznimi sestavinami smo ustrezno zmanjšali glede na razpoložljive količine malin. Vse skupaj smo segreli na 80 C. Še vroče smo nalili v steklenice in nepredušno zaprli. Naslednji dan smo nektar prelili v centrifugirke in ga hranili do ekstrakcije na -75 C.

38 Ekstrakcija vzorcev Ekstrakcijo smo izvedli tako, da smo najprej natehtali 0,4000 g (posušeni vzorci), 1,200 g (sveži vzorci) oziroma 2,400 g (nektar) vzorca in mu dodali 4 ml ekstrakcijske raztopine. Vzorce smo premešali na rotacijskem stresalniku in jih postavili za 15 minut na ultrazvočno kopel (4 C). Nato smo jih centrifugirali 20 min pri 10 C in 8500 obratih na minuto. Supernatant (bistri del) smo odlili v 10-mililitrsko bučko. K preostanku smo dodali 4 ml ekstrakcijske raztopine, premešali in postopek ekstrakcije ponovili. Supernatanta smo združili v 10-mililitrski bučki in jo dopolnili z ekstrakcijsko raztopino. Ekstrakte smo do analiz hranili v zamrzovalniku. Vsak vzorec smo pripravili v dveh ponovitvah. 3.4 Merjenje antioksidativnega potenciala Za merjenje antioksidativnega potenciala v ekstraktih svežih in posušenih plodov malinjaka in v ekstraktih nektarja smo uporabili ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC- metodo ABTS + radikal V 1,5 ml epice smo odpipetirali 50 µl standardne raztopine Trolox z različnimi koncentracijami, 50 µl predhodno redčenega vzorca, 50 µl ekstrakcijske raztopine (slepi vzorec) in 50 µl ekstrakcijske raztopine za kontrolni vzorec. Vsem raztopinam, razen slepemu vzorcu, smo dodali 1 ml razredčene raztopine ABTS +. Slepemu vzorcu smo dodali 1 ml 80-odstotnega metanola. V vsako epico smo nato dodali 1 ml ABTS-raztopine in dobro premešali. Vzorce smo postavili v temo in jih na sobni temperaturi pustili stati 6 minut (Rios de Souza 2014). Nato smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 734 nm. Vsak vzorec smo pripravili v dveh ponovitvah, absorbanco vsake ponovitve pa smo

39 28 izmerili dvakrat. Izračun za zmanjšanje intenzitete absorbance, ki smo ga povzeli po Zavratniku (2011), je sledeč: Izračun za zmanjšanje absorbance (ΔA) delovnih raztopin Trolox in ekstraktov vzorcev plodov malinjaka smo izračunali glede na kontrolni vzorec po Enačbi (1): A (kontrolni vzorec)-a (x) ΔA = 100 (1) A (kontrolni vzorec) Podatke smo vnesli v program Microsoft Excel in narisali umeritveno krivuljo, tako da smo na x-os nanesli koncentracije delovnih raztopin Trolox, na y-os pa pripadajoče vrednosti zmanjšanja absorbance v odstotkih. Koncentracije Trolox v ekstraktih plodov malinjaka (µmol/l) smo izračunali iz enačbe premice za umeritveno krivuljo. Rezultate smo podali v µmol Trolox ekvivalentu (TE)/g suhe snovi (SS) DPPH -radikal Najprej smo v epruvete odpipetirali 0,1 ml pripravljene slepe raztopine za slepi vzorec, 0,1 ml slepe raztopine za kontrolni vzorec, 0,1 ml delovne raztopine z različno koncentracijo Trolox ter 0,1 ml redčenega vzorca. K slepemu vzorcu smo dodali 3,9 ml čistega metanola, h kontrolnemu vzorcu, delovnim raztopinam standardov in k ekstraktom vzorcev pa smo dodali 3,9 ml sveže pripravljene raztopine DPPH. Ko smo dodali reagent, smo vse epruvete premešali in jih postavili v temo, kjer smo jih pustili na sobni temperaturi stati 30 minut (Bobinaite in sod. 2012). Nato smo na spektrofotometru pri valovni dolžini 515 nm izmerili absorbance kontrolnega vzorca, delovnih raztopin Trolox in ekstraktov plodov malinjaka. Vsak vzorec smo merili v dveh ponovitvah, vsako ponovitev pa smo za meritve z DPPH pripravili dvakrat. Zmanjšanje absorbance delovnih raztopin Trolox in ekstraktov plodov malinjaka smo izračunali na enak način kot pri metodi ABTS. Na enak način smo

40 29 narisali tudi umeritveno krivuljo in rezultate podali v µmol Trolox ekvivalentu (TE)/g SS FRAP-metoda V epruvete smo odpipetirali 0,1 ml ekstrakcijske raztopine za slepi vzorec, 0,1 ml raztopin z različno koncentracijo Trolox ter 0,1 ml redčenega vzorca. V vse epruvete smo dodali 3 ml raztopine FRAP-reagenta. Epruvete smo premešali in jih pokrili s parafilmom. Nato smo jih postavili v temo in jih na sobni temperaturi pustili stati 10 minut. Sledile so meritve absorbanc pri valovni dolžini 593 nm (Çekiç in Özgen 2010). Izmerili smo absorbance delovnih raztopin Trolox in ekstraktov plodov malinjaka. Rezultate smo podali v µmol-trolox-ekvivalentu (TE)/g SS ORAC-metoda Za meritve smo uporabili mikrotitrske plošče (ThermoFischer Scientific-Nunclon 96 Flat Bottom Black Polystyrol) s 96 vodnjaki. Najprej smo v vse zunanje vodnjake (razen v spodnjo vrstico) odpipetirali 250 µl vode. Nato smo po trikrat odpipetirali 25 µl delovne raztopine z različno koncentracijo Trolox. V štiri vodnjake smo odpipetirali 25 µl redčenega ekstrakta vzorca, v šest vodnjakov pa 25 µl pufra (slepi vzorec). V spodnjo vrstico smo odpipetirali 50 µl fosfatnega pufra (Preglednica 7). Nato smo v vse vodnjake, razen v tiste z vodo, odpipetirali 150 µl delovne raztopine fluorescina. Ploščo smo pokrili in jo dali v spektrofotometer (Microplate reader), ki je bil segret na 37 C. Po 10 minutah inkubacije smo v vse vodnjake, razen v tiste z vodo, dodali 25 µl AAPH-reagenta, ki smo ga na vodni kopeli segreli na 37 C, in pričeli z meritvami. Pred vsako meritvijo so bile raztopine premešane (nastavitev instrumenta). Fluorescenco smo merili pri valovni dolžini vzbujanja 485 nm in emisije 538 nm. Meritve so potekale 90 minut v časovnih intervalih 60 s (Wang in sod. 2009).

41 30 Preglednica 7: Priprava mikrotitrske plošče za meritve antioksidativnega potenciala z ORAC-metodo A H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O B H 2O Std 1 Std1 Std 1 Vz 1 Vz 1 Vz 2 Vz 2 Vz 3 Vz 3 Sl H 2O C H 2O Std 2 Std 2 Std 2 Vz 1 Vz 1 Vz 2 Vz 2 Vz 3 Vz 3 Sl H 2O D H 2O Std 3 Std 3 Std3 Vz 4 Vz 4 Vz 5 Vz 5 Vz 6 Vz 6 Sl H 2O E H 2O Std 4 Std 4 Std 4 Vz 4 Vz 4 Vz 5 Vz 5 Vz 6 Vz 6 Sl H 2O F H 2O Std 5 Std 5 Std 5 Vz 7 Vz 7 Vz 8 Vz 8 Vz 9 Vz 9 Sl H 2O G H 2O Vz 10 Vz 10 Vz 10 Vz 7 Vz7 Vz 8 Vz 8 Vz 9 Vz 9 Sl H 2O H H 2O P P P P P P P P P P H 2O Vz vzorec, Std standard, Sl slepa, P pufer Izračuni: Najprej smo izračunali neto površino (AUC) delovnih raztopin Trolox, ekstraktov vzorcev in slepih vzorcev po Enačbi 2: AUC = 0.5+(R2/R1)+(R3/R1)+(R4/R1) (Rn/R1), (2) kjer je R1: fluorescenca v prvi minuti, R2: fluorescenca v drugi minuti, Rn: fluorescenca v zadnji minuti. Nato smo od neto površine delovnih raztopin Trolox odšteli neto površino slepega vzorca (Enačba 3): Neto AUC = AUCtrolox AUCslepa. (3) Umeritveno krivuljo smo narisali tako, da smo na abscisno os nanesli koncentracije delovnih raztopin Trolox, na ordinatno os pa pripadajoče vrednosti neto površin delovnih

42 31 raztopin Trolox, kjer je neto površina slepega vzorca že odšteta. Prav tako smo neto površino slepega vzorca odšteli od neto površine posameznih ekstraktov vzorcev. Te površine smo vstavili v enačbo umeritvene krivulje in izračunali koncentracijo Trolox v ekstraktih plodov malinjaka. Rezultate smo podali v µmol TE/g SS. 3.5 Statistična obdelava podatkov Izmerjene parametre (absorbanco in fluorescenco) smo vnesli v program Microsoft Excel 2007, jih uredili in izračunali antioksidativni potencial v ekstraktih vzorcev. Nato smo podatke statistično obdelali s programom SPSS Statistic Predpostavili smo, da so vzorci neodvisni. S Shapiro-Wilkovim testom (α=0,05) smo preverili, če so vzorci po skupinah normalno porazdeljeni. Razliko med antioksidativnim potencialom primitivnih in kultiviranih genotipov malinjaka smo preverjali s t-testom za neodvisne vzorce (α=0,05). S Pearsonovim korelacijskim koeficientom smo ugotavljali, ali med antioksidativnim potencialom za različne skupine (sveži, posušeni in nektar vzorci), dobljenim z različnimi metodami (ABTS, DPPH, FRAP in ORAC), obstaja linearna povezava. Z ANOVO smo ugotavljali, ali je antioksidativni potencial odvisen od načina obdelave vzorca, homogenost varianc med obravnavanji pa smo testirali z Levenovim testom homogenosti varianc. V nadaljevanju smo s pomočjo t-testa za neodvisne vzorce primerjali antioksidativni potencial svežih in posušenih ter svežih in nektar vzorcev, in ker sta primerjavi odvisni, smo izračunali prilagojeno stopnjo tveganja 0,05/2 = 0,025, ki jo je predlagal Bonferroni. To pomeni, da bodo razlike statistično značilne pri 5-odstotnem tveganju, ko bo sig 0,025.

43 32 4 REZULTATI Z RAZPRAVO 4.1 Vpliv genotipa na AOP V nalogo smo vključili 15 kultiviranih, 6 primitivnih in en divji genotip malin. Primitiven genotip definiramo kot genotip, ki smo ga prinesli iz divjine in ga kultivirano gojimo, medtem ko je divji genotip nekultiviran in raste na prvotnih območjih. Kultivirani so vsi genotipi, katerih sadike smo kupili in jih kultivirano vzgajamo. V naši raziskavi je bilo osemnajst genotipov rdečih malin, en genotip pa je bil belo ploden. Antioksidativni potencial smo izmerili v ekstraktih svežih plodov in plodov, sušenih z zamrzovanjem, ter v ekstraktih nektarja po štirih metodah (ABTS, DPPH, FRAP in ORAC). Rezultati so prikazani v Grafikonih 1, 2, 3 in 4. V Prilogi 1 in 2 pa so navedene povprečne ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-vrednosti in standardni odklon meritev dveh ekstraktov plodov posameznega genotipa malinjaka. V ekstraktih svežih plodov primitivnih kultivarjev so bile ABTS-vrednosti od 154 (genotip Grad Pivola) do 243 µmol TE/g SS (genotip iz Velike Nedelje), DPPH-vrednosti od 90 (genotip iz Jurkloštra) do 197 µmol TE/g SS (genotip iz Velike Nedelje), FRAP-vrednosti od 95 (Vila Pivola) do 215 µmol TE/g SS (Anita, drobni genotip) in vrednosti, izmerjene z ORAC-metodo, od 60 (Vila Pivola) do 298 µmol TE/g SS (genotip iz Velike Nedelje). ABTS-, DPPH-, FRAP- in ORAC-vrednosti ekstraktov svežih plodov kultiviranih genotipov so bile med 53 (Nr26TR) in 186 µmol TE/g SS ('Himbo'), 30 (Nr26TR) in 153 µmol TE/g SS ('Meeker'), 51 (Nr26TR) in 165 µmol TE/g SS ('Himbo') ter med 59 (Anja, Moškajnci) in 375 µmol TE/g SS ('Himbo'). Izmed vseh analiziranih genotipov ima najnižji antioksidativni potencial beloplodna malina (Anita, beloplodna). Sklepamo lahko, da k antioksidativnemu potencialu malin znatno prispevajo antocianini, ki v beloplodni malini niso prisotni. Med kultiviranimi genotipi malinjaka je imel najvišji antioksidativni potencial kultivar 'Himbo'. Na kemijsko sestavo plodov vplivajo okolje, genetika, podnebje (Çekiç in Özgen 2010),

44 33 sorta, regija, zrelost, čas spravila in pogoji shranjevanja (Rios de Souza in sod. 2014). Na rezultate pri merjenju antioksidativnega potenciala pa lahko vplivajo ekstrakcijski pogoji in reakcijski časi, ki jih uporabimo pri posamezni metodi. Zaradi zgoraj navedenega je primerjava vrednosti različnih raziskav le okvirna. Çekiç in Özgen (2010) sta za merjenje antioksidativnega potenciala uporabila FRAPmetodo. FRAP-vrednosti za plodove divjih akcesij malinjaka so bile v območju 11,2 19,7 µmol TE/g svežega vzorca. Divji genotip s Hočkega Pohorja, ki je bil vključen v našo raziskavo, je to vrednost presegel za skoraj 3-krat (57,31 µmol TE/g svežega vzorca). Çekiç in Özgen sta analizirala tudi kultivar 'Heritage'. Vrednosti FRAP in ABTS sta znašali 18,1 in 17,5 µmol TE/g svežega vzorca. Naše vrednosti za isti kultivar so višje, in sicer 29,7 µmol TE/g svežega vzorca po FRAP- in 32,5 µmol TE/g svežega vzorca po ABTS-metodi. Ker gre za isti kultivar, so razlike verjetno povezane z geografsko lokacijo in posledično s klimatskimi in pedološkimi dejavniki. ORAC-vrednosti lahko primerjamo s podatki, ki jih navajata Wang in Lin (2000). Avtorja sta v svoji raziskavi ugotovila, da se za maline vrednosti ORAC gibljejo od 7,8 do 33,7 µmol TE/g svežega vzorca (izraženo na suho snov od 37.1 do µmol TE/g vzorca). Najvišjo ORAC-vrednost smo izmerili v svežih plodovih divjega genotipa Hočko Pohorje (416 µmol TE/g SS) in najnižjo za plodove kultivarja 'Latham' (52,5 µmol TE/g SS). Od rdečih genotipov je imel najnižjo ORAC-vrednost 'Latham' (52,5 µmol TE/g SS). ORACvrednosti plodov nekaterih genotipov naše raziskave so primerljive z navedbami Wanga in Lina (2000), saj je imela večina naših genotipov višji antioksidativni potencial.

45 34 Grafikon 1: Vrednosti antioksidativnega potenciala za ekstrakte svežih in posušenih plodov malin ter nektarja, izmerjene z ABTS-metodo. Vrednosti so podane v µmol TE/g SS. Grafikon 2: Vrednosti antioksidativnega potenciala za ekstrakte svežih in posušenih plodov malin ter nektarja, izmerjene z DPPH-metodo. Vrednosti so podane v µmol