UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI PROTEINOV AKR1B1 IN AKR1B10 PRI RAKU ENDOMETRIJA DETECTION OF PROTEINS AKR1B1 AND AKR1B10 IN ENDOMETRIAL CANCER

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ALE KET UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI PROTEINOV AKR1B1 IN AKR1B10 PRI RAKU ENDOMETRIJA DETECTION OF PROTEINS AKR1B1 AND AKR1B10 IN ENDOMETRIAL CANCER UNIVERZITETNI TUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2013

2 Diplomsko delo sem opravil na In titutu za biokemijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Janka Kosa, univ. dipl. kem. in somentorstvom prof. dr. Tee Lani nik Ri ner, univ. dipl. kem. Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Janku Kosu in somentorici prof. Tei Lani nik Ri ner za pomo pri diplomskem delu. Velika zahvala gre tudi asist. dr. Neli Hevir za pomo in nasvete pri delu v laboratoriju. Iskrena hvala moji dru ini za potrpe ljivost in podporo skozi ves as tudija. Hvala tudi vsem prijateljem, ki so mi kakorkoli pomagali na poti do diplome. IZJAVA Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom prof. dr. Janka Kosa, univ. dipl. kem. in somentorstvom prof. dr. Tee Lani nik Ri ner, univ. dipl. kem. ALE KET KOMISIJA ZA ZAGOVOR: predsednik: prof. dr. Albin Kristl, mag. farm. lan: doc. dr. Jo ko Cesar, mag. farm. 2

3 KAZALO VSEBINE KAZALO SLIK...4 KAZALO GRAFOV...4 KAZALO TABEL...4 POVZETEK...5 ABSTRACT...6 SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC UVOD RAK ENDOMETRIJA Dejavniki tveganja in za ite Klini na slika in diagnoza Zdravljenje Vloga hormonov VNETNI PROCESI IN RAK ENDOMETRIJA RETINOJSKA KISLINA IN RAK ENDOMETRIJA ENCIMI IZ NADDRU INE ALDO-KETO REDUKTAZ Poddru ina AKR1B NAMEN DELA MATERIALI IN METODE POLIAKRILAMIDNA GELSKA ELEKTROFOREZA Reagenti Postopek PRENOS WESTERN Reagenti Postopek Slika 4: Prenos proteinov z gela na membrano (prenos western) DETEKCIJA Z OJA ANO KEMILUMINISCENCO (ECL) BARVANJE MEMBRANE BARVANJE GELA IMUNOHISTOKEMIJA Reagenti Postopek REZULTATI IN RAZPRAVA DETEKCIJA PROTEINOV

4 4.2 IMUNOHISTOKEMIJSKO BARVANJE PROTEINOV SKLEP LITERATURA KAZALO SLIK Slika 1: Vloga encima AKR1B1 pri biosintezi prostaglandinov in aktivaciji NF- B Slika 2: Vloga encima AKR1B10 pri biosintezi retinojske kisline Slika 3: Aparatura za elektroforezo (Mini-Protean II Bio-Rad) Slika 4: Prenos proteinov z gela na membrano (prenos western) Slika 5: Reakcija detekcije z oja ano kemiluminiscenco Slika 6: Detekcija proteinov AKR1B1 in AKR1B Slika 7: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 7, 8, 10 in Slika 8: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 18, 19, 20 in Slika 9: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 22, 23, 24 in Slika 10: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 26, 27, 30 in Slika 11: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 32, 33, 34 in Slika 12: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 38, 40, 42 in KAZALO GRAFOV Graf 1: Prikaz koli ine proteinov AKR1B1 v kontrolnem in tumorskem tkivu Graf 2: Prikaz razmerja proteinov AKR1B1 v tumorskem in kontrolnem tkivu Graf 3: Prikaz koli ine proteinov AKR1B10 v kontrolnem in tumorskem tkivu Graf 4: Prikaz razmerja proteinov AKR1B10 v tumorskem in kontrolnem tkivu KAZALO TABEL Tabela I: Rezultati imunohistokemijskega barvanja vzorcev raka endometrija

5 POVZETEK Rak endometrija (rak materni ne sluznice) je etrta najpogostej a oblika raka pri enskah v Zahodni Evropi in ZDA. Pojavlja se predvsem pri enskah v obdobju po menopavzi. Nekontrolirano vnetje, povezano s povi ano koncentracijo prostaglandinov (PG) v endometrijskem tkivu, lahko vodi do razvoja raka endometrija. Prostaglandini stimulirajo celi no proliferacijo, celi no adhezijo, migracijo in angiogenezo ter s tem pospe ijo rast tumorjev. Retinojska kislina ima za itno vlogo, saj preko receptorjev RAR in RXR pomaga pri diferenciaciji celic. Protein AKR1B1 je udele en v reakcijah nastanka vnetnih mediatorjev, saj deluje kot prostaglandin sintaza, ki pretvarja PGH2 v PGF2. Z redukcijo aldehida 4- hidroksinonenala, ki nastane s peroksidacijo lipidov, AKR1B1 posredno stimulira NF- B, kar lahko vodi v aktivacijo citokinov in vnetnih mediatorjev, kot je ciklooksigenaza-2 (COX-2). Protein AKR1B10 katalizira redukcijo retinala v retinol in tako posredno prepre uje nastanek retinojske kisline, ki je vklju ena v uravnavanje celi ne proliferacije in diferenciacije. AKR1B10 katalizira tudi redukcijo izoprenil aldehidov. S tem uravnava prenilacijo GTP-az ter tako vpliva na proliferacijo in apoptozo celic. V okviru diplomske naloge smo prou ili prisotnost AKR1B1 in AKR1B10 v tumorskem in kontrolnem endometriju. V 30 parih vzorcev proteinov, izoliranih iz tumorskega in kontrolnega tkiva endometrija smo z metodami poliakrilamidne gelske elektroforeze, prenosa western in z detekcijo s specifi nimi protitelesi ugotavljali prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10. Zaznali smo statisti no zna ilno ni jo koli ino obeh proteinov v tumorskih vzorcih. Z imunohistokemijskim barvanjem smo prisotnost obeh proteinov potrdili tudi na celi ni ravni. AKR1B1 in AKR1B10 se nahajata v citoplazmi epitelijskih celic rakavega endometrija. 5

6 ABSTRACT Endometrial cancer is the fourth-most-common cancer in women in western Europe and USA. The majority of cases occur in post-manopausal women. Uncontrolled inflammation, associated with increased production of prostaglandins (PG) in endometrial tissue, can lead to development of endometrial cancer. The prostaglandins stimulate cell proliferation, cell adhesion, cell migration and angiogenesis and therefore accelerate tumor growth. Retinoid acid by binding to the retinoic acid receptor (RAR) and the retinoid X receptor (RXR) stimulates cell differentiation, and thus has protective role. Enzyme AKR1B1is involved in synthesis of inflammatory mediators and it acts as a PG synthase that convert PGH2 to PGF2. AKR1B1 catalyzes the reduction of lipid peroxidation products, such as 4-hydroxynonenal (HNE) and indirectly stimulates transcription factor NF- B, which then stimulates expression of cytokines and inflammatory mediators, such as cyclooxygenease-2 (COX-2). Enzyme AKR1B10 catalyzes the reduction of retinals to retinols and indirectly prevents synthesis of retinoid acid, which is involved in cell proliferation and cell diferentiation. AKR1B10 catalyzes also reduction of isoprenyl aldehydes and is involved in prenylation of small GTPases, which regulate cell proliferation and apoptosis. In this research we analyzed presence of AKR1B1 and AKR1B10 in samples of cancerous and adjacent noncancerous endometrial tissues. We investigated the AKR1B1 and AKR1B10 protein levels in 30 paired samples by SDS PAGE electrophoresis, western blot analysis and chemiluminiscence detection. Both protein levels were significantly decreased in tumorous tissues, compared to controls. We confirmed presence of both proteins in endometrial cancer also at the cellular level with immunohistochemical staining. AKR1B1 and AKR1B10 were located predominantly in the cytoplasm of the epithelial cells of cancerous endometrial tissue. 6

7 SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC AKR aldo-keto reduktaze COX-2 FIGO ciklooksigenaza-2 International Federation of Gynecology and Obstetrics GTP gvanozin trifosfat HER-2/neu»Human Epidermal Growth Factor Receptor 2«HRP HSD hrenova peroksidaza hidroksisteroid-dehidrogenaza NADPH reducirana oblika nikotinamid adenin dinukleotid fosfata PBS PG fosfatni pufer (phosphate buffered saline) prostaglandin PPIA peptidil prolil izomeraza A (ciklofilin A) PTGS prostaglandin endoperoksid sintaza PVDF poliviniliden difluorid NaDS TEMED natrijev dodecil sulfat (sodium dodecyl sulfate) N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin TBS TRIS Tris pufer trihidroksietilaminoetan TTBS Tween Tris pufer 7

8 1. UVOD 1.1 RAK ENDOMETRIJA Rak endometrija (rak materni ne sluznice) je etrta najpogostej a oblika raka pri enskah v Zahodni Evropi in ZDA. Najpogosteje se pojavlja pri enskah v obdobju po menopavzi (1). Pribli no 10 % primerov raka endometrija je dedno pogojenih in so pogosto povezani z dedno obliko nepolipoznega raka debelega revesa. Za to obliko najpogosteje zbolijo enske v mlaj i dobi. Okrog 90 % primerov raka endometrija pa je sporadi nih. Te lahko na osnovi klini no-patolo kih lastnosti razdelimo v dve skupini (1,2). V prvo skupino uvr amo od estrogenov odvisne primere raka endometrija (tip I), ki predstavljajo pribli no 80 % vseh sporadi nih primerov raka. Pojavljajo se pri enskah v obdobju pred in po menopavzi in imajo dobro napoved pre ivetja (1,2). Pogosto so povezani s hiperplazijo endometrija in z izra anjem receptorjev za estrogene in progesteron. Ta oblika raka se najpogosteje razvije v povezavi z debelostjo, s policisti nim ovarijskim sindromom ali z nadomestno estrogensko terapijo brez progestinov. Histolo ko je ve ina tumorjev tipa I endometrioidnih ter mucinoznih adenokarcinomov in so dobro diferencirani (3,4,5). V drugo skupino uvr amo ostalih 20% sporadi nih primerov raka, ki niso povezani z estrogeni in se razvijejo v atrofi nem endometriju kot intraepitelijski adenokarcinomi (tip II). So slabo diferencirani in se pojavljajo kot serozni papilarni in svetloceli ni adenokarcinomi. Tip II se pojavlja povpre no 5-10 let pozneje kot tip I, zaradi infiltracije v miometrij ima slab o napoved pre ivetja in je zelo agresiven (3, 5, 6). Pri tipu I se pogosto pojavljajo mutacije in metilacije promotorske regije genov, ki so odgovorni za popravljanje napak pri prepisovanju DNA, mutacije onkogena K-RAS, tumor zavirajo ega gena PTEN in gena -katenina, ki vzdr uje normalno adhezijo celic. Pri tipu II pa se pojavlja anevploidnost, mutacije tumor zavirajo ega gena P53 ter pomno evanje in prekomerno izra anje onkogena HER-2/neu (5). 8

9 1.1.2 Dejavniki tveganja in za ite Dejavniki tveganja: - nadomestna hormonska terapija brez progestinov, - zgodnja prva menstruacija, - pozna menopavza, - neplodnost, - debelost (po menopavzi se androstendion v ma evju pretvarja v estron), - diabetes, - nepravilno delovanje jaj nikov, - zdravila (tamoksifen) (5, 7, 8). Dejavniki za ite: - nose nost (povi ana sinteza progesterona), - kombinirani peroralni kontraceptivi s progestini, - kajenje (8, 9) Klini na slika in diagnoza Pribli no 80 % primerov raka endometrija se pojavi pri enskah v obdobju po menopavzi, ostalih 20 % pa pri enskah pred menopavzo. Najpomembnej i simptom je krvavitev. Pri % ensk, ki imajo po menopavzi te ave s krvavitvijo, diagnosticirajo rak endometrija. Standardni diagnosti ni postopek pri krvavitvah je frakcionirana kireta a, ki je invaziven kirur ki poseg (3). Pri nejasnih primerih se opravita histeroskopija in ciljana biopsija sprememb na endometriju. FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) je leta 1988 sprejel pravila za kirur kopatolo ko dolo anje stadija endometrijskega karcinoma. Najpomembnej a prognosti na dejavnika sta stopnja diferenciacije in globina invazije v miometrij. Stadij I (malignom je omejen na telo maternice) - Ia G1,2,3 tumor omejen na endometrij - Ib G1,2,3 tumor zajema manj kot polovico miometrija 9

10 - Ic G1,2,3 tumor zajema ve kot polovico miometrija Stadij II (malignom zajema telo maternice in vrat) - IIa G1,2,3 zajema cervikalne leze - IIb G1,2,3 prodira v cervikalno stromo Stadij III (tumor je raz irjen zunaj maternice, znotraj medenice in/ali retroperitonealno) - IIIa G1,2,3 zajema serozo uterusa in/ali adnekse in/ali je pozitivna peritonealna citologija - IIIb G1,2,3 metastazira v no nico - IIIc G1,2,3 metastaze v medeni nih in/ali paraaortnih bezgavkah Stadij IV (oddaljeno metastaziranje) - IVa 1,2,3 invazija v sluznico mehurja ali rektuma - IVb oddaljene metastaze in/ali raz iritev bolezni zunaj male medenice in/ali v ingvinalne bezgavke Na podlagi prognosti nih dejavnikov lahko bolnice z endometrijskim karcinomom razdelimo v manj in bolj ogro eno skupino. V prvi je (stadij Ia, Ib) je nevarnost ponovitve bolezni manj a in pre ivetje bolj e kot v drugi (stadij II) (10). 10

11 Zdravljenje Na in zdravljenja raka endometrija izbiramo glede na stadij bolezni, histolo ki tip in diferenciranost tumorskih celic. Glede na klini no-patolo ke karakteristike razdelimo rak endometrija v dve skupini. V prvi skupini so primeri z nizkim tveganjem (stadij I, brez invazije v miometrij), v drugi skupini pa primeri z visokim tveganjem (kasnej i stadiji). Na podlagi te delitve dolo imo tudi strategijo zdravljenja (3, 10). Pri primerih, ki spadajo v prvo skupino, se najpogosteje izvede kirur ki poseg (abdominalna histerektomija). Standardna je kirur ka odstranitev maternice z adneksi, z odstranitvijo medeni nih bezgavk in z odvzemom vzorca za citolo ko analizo. Ta na in zdravljenja se lahko opravi pri pribli no 80 % rakavih bolnic (3, 10). Pri primerih z visokim tveganjem je najbolj uveljavljen kirur ki poseg abdominalne histerektomije s postoperativno kemoterapijo in obsevanjem (3, 10) Vloga hormonov Rak endometrija je povezan s prekomernim delovanjem estrogenov ob zmanj anem delovanju progesterona. Pri tem lahko pride do napak pri podvajanju DNA in nadalje do hiperplazije endometrija. Pomen estrogenov potrjujejo primeri raka endometrija pri enskah, pri katerih je hormonsko nadomestno zdravljenje potekalo z zdravili z estrogeni brez dodatka progestagenov ali pri bolnicah z rakom dojk, ki so jih zdravili z agonisti receptorjev za estrogene. Estrogeni imajo namre mitogeno delovanje, progesteron pa delovanju estrogenov nasprotuje in usmerja celice v diferenciacijo (5). 11

12 1.2. VNETNI PROCESI IN RAK ENDOMETRIJA Nekontrolirano vnetje lahko vodi do razvoja raka endometrija, ki je povezan s povi ano koncentracijo prostaglandinov v endometrijskem tkivu. Prostaglandini stimulirajo celi no proliferacijo, celi no adhezijo, migracijo in angiogenezo ter s tem pospe ijo razvoj tumorjev endometrija (1, 11). Prostaglandini nastanejo iz arahidonske kisline, ki se spro a iz celi nih fosfolipidov s pomo jo encima fosfolipaze A2. Naprej se ob prisotnosti encimov PTGS1 in PTGS2 pretvori v PGG2, ta pa se reducira v PGH2, ki je nestabilen intermediat in se pretvori s pomo jo razli nih encimov v prostaglandine PGD2, PGE2 in PGF2. Eden od encimov, ki katalizira redukcijo PGH2 v PGF2, je tudi AKR1B1 (12). Pri raku endometrija so zaznali prisotnost prostaglandina E in F (PGE2 in PGF2 ) (13). PGF2 preko FP receptorja s protein-kinazno aktivnostjo stimulira transkripcijski faktor NF- B, ki nadalje stimulira izlo anje citokinov in vnetnih mediatorjev. AKR1B1 stimulira transkripcijski faktor NF- B tudi posredno, saj katalizira sintezo konjugata aldehida 4- hidroksinonenala (HNE), ki nastane s peroksidacijo lipidov, z glutationom (GS-HNE) v njegovo reducirano obliko (GS-DHN). Med vnetnimi mediatorji je tudi ciklooksigenaza-2 (COX-2), ki sodeluje pri sintezi prostaglandinov iz arahidonske kisline (14). S protivnetnimi zdravili (NSAID) inhibiramo ciklooksigenazo-2 in s tem zmanj amo vnetje (15). Encim AKR1B1 je tako vpleten v sintezo PGF2 in vnetni proces, njegove vloge pri razvoju raka endometrija pa e niso prou evali (1) RETINOJSKA KISLINA IN RAK ENDOMETRIJA Do razvoja rakavih celic lahko pride tudi zaradi pomanjkanje retinojske kisline (16). Retinojska kislina ima za itno vlogo, saj preko receptorjev RAR (receptor retinojske kisline) in RXR (retinoidni X receptor) pomaga pri diferenciaciji celic. AKR1B10 katalizira redukcijo all-trans retinala in 9-cis retinala v retinol. Reakcijo v obratno smer katalizira encim alkohol dehidrogenaza (ADH). Retinal se z aldehid dehidrogenazo (ALDH) oksidira v retinojsko kislino, ki preko receptorjev RAR in RXR stimulira diferenciacijo celic. Retinojska kislina se nadalje z encimom CYP26A metabolizira v 4- OH-retinojsko kislino. Prisotnost proteina AKR1B10 je povezana s pomanjkanjem retinojske kisline, z zmanj ano zasedenostjo obeh receptorjev pa se zmanj a tudi diferenciacija celic. Za itno vlogo retinojske kisline v tkivu endometrija ka ejo tudije, 12

13 pri katerih retinojska kislina in agonisti receptorja RAR inhibirajo rast endometrijske celi ne linije Ishikawa, retinojska kislina pa tudi stimulira diferenciacijo slabo diferencirane CAC-1 tumorske celi ne linije endometrija. Tudi inhibitorji CYP26A delujejo antitumorsko, kar nadalje potrjuje za itno vlogo retinojske kisline. Encim AKR1B10 je tako povezan z zmanj anim za itnim delovanjem retinojske kisline, vendar pa njegove vloge pri razvoju raka endometrija zaenkrat e niso prou evali (1). 1.4 ENCIMI IZ NADDRU INE ALDO-KETO REDUKTAZ Aldo-keto reduktaze (AKR) uvr amo v naddru ino monomernih encimov, ki katalizirajo redukcijo aldehidov in ketonov v razli nih fiziolo kih substratih kot so lipidi, steroidi, prostaglandini in retinoidi. Ob prisotnosti NAD(P)H katalizirajo redukcijo aldehidov in ketonov v primarne in sekundarne alkohole. Razdelimo jih v petnajst dru in, ki imajo med seboj manj kot 40 % identi nih aminokislin. Dru ine pa nato razdelimo v poddru ine, predstavniki le-teh morajo imeti med seboj ve kot 60 % identi nih aminokislin. Dru ine ozna imo z arabsko tevilko za kratico (AKR1-15), poddru ine pa s rko za to tevilko (AKR1B, AKR1C ) (17, 18) Poddru ina AKR1B Predstavniki te poddru ine so aldoza-reduktaze in katalizirajo redukcijo aldehidov v alkohole. Najbolj raziskana med njimi sta encima AKR1B1 in AKR1B10. Encim AKR1B1 sodeluje pri redukciji glukoze med hiperglikemijo in je povezan s po kodbami tkiv pri diabetesu. Zato za prepre evanje te av z diabetesom razvijajo ve inhibitorjev tega encima. Rekombinantni encim AKR1B1 deluje tudi kot prostaglandinsintaza, ki pretvarja PGH2 v PGF2. V zadnjih letih se pogosto poro a o vpletenosti AKR1B1 v vnetne procese. Z redukcijo GS-HNE v GS-DHN, AKR1B1 posredno stimulira NF- B, kar lahko vodi v aktivacijo citokinov in vnetnih mediatorjev, kot je COX-2. Prav tako je encim AKR1B1 vpleten v razvoj raka jeter, dojk, jaj nikov in materni nega vratu. Mo no je izra en v normalnem endometriju, v miometriju maternice in materni nem vratu. AKR1B1 ima visoko kataliti no u inkovitost kot PGF2 sintaza in naj bi bil odgovoren za pove ano sintezo PGF2 v sekretorni fazi menstruacijskega ciklusa, ko je bila zaznana 13

14 najvi ja koncentracija PGF2. Pove ana sinteza PGF2 in PGE2 ima pomemben vpliv na menstruacijo. Prvi deluje kot vazokonstriktor in povzro a kontrakcije miometrija, drugi pa kot vazodilatator. Zmanj ano razmerje PGF2 /PGE2 se opazi pri enskah z mo nimi menstrualnimi krvavitvami, kar je lahko povezano z ni jo aktivnostjo AKR1B1 ali z zni ano aktivnostjo PGE2 sintaze. AKR1B1 tako katalizira reakcije, ki vodijo do povi anih koncentracij vnetnih mediatorjev. Ti pa povzro ajo proliferacijo celic, njihovo migracijo in angiogenezo, kar vodi v hitrej o rast in razvoj rakavih celic (1, 19). 14

15 Slika 1: Vloga encima AKR1B1 pri biosintezi prostaglandinov in aktivaciji NF- B. AKR1B1 sodeluje pri redukciji GS-HNE v GS-DHN, ki aktivira fosfolipazo C (PLC) in protein kinazo C (PKC), s tem pa aktivira transkripcijski faktor NF- B in tako stimulira izlo anje vnetnih mediatorjev. AKR1B1 sodeluje tudi pri pretvorbi PGH v PGF2, ki aktivira FP receptor, ta pa nadalje aktivira z mitogenom aktivirano protein kinazo (MAPK), ki stimulira delovanje transkripcijskega faktorja NF- B (prirejeno po 1). Encim AKR1B10 ima v primerjavi z AKR1B1 71 % identi nih aminokislin. AKR1B10 je prisoten v tankem in debelem revesu ter v rakavih celicah plju, jeter, dojk, debelega revesa, materni nega vratu in endometrija (1). Ker je njegova koncentracija povi ana pri razli nih vrstah raka, naj bi se protein AKR1B10 uporabljal tudi kot tumorski ozna evalec, najpogosteje pri raku jeter in plju (16). Predvsem pri kadilcih je lahko njegova povi ana koncentracija zgodnji znak za odkrivanje raka na plju ih. AKR1B10 so zaznali tudi v serumu, kar ka e na mo nost njegove uporabe za neinvazivno diagnostiko (20). 15

16 Encim AKR1B10 katalizira redukcijo izoprenil aldehidov in s tem preko prenilacije GTPaz vpliva na proliferacijo in apoptozo celic Prav tako encim AKR1B10 zelo u inkovito katalizira redukcijo retinala v retinol. Tako prepre uje nastanek retinojske kisline, ki preko receptorjev RAR in RXR uravnava celi no proliferacijo in deferenciacijo. Ob pomanjkanju retinojske kisline, primanjkuje ligandov, ki bi se vezali na oba receptorja, zato je diferenciacija celic ustavljena (1). Slika 2: Vloga encima AKR1B10 pri biosintezi retinojske kisline. AKR1B10 katalizira redukcijo all-trans retinala in 9-cis retinala v retinol. Reakcijo v obratno smer katalizira encim alkohol dehidrogenaza (ADH). Retinal se z aldehid dehidrogenazo (ALDH) oksidira v retinojsko kislino, ki preko receptorjev RAR in RXR stimulira diferenciacijo celic. Retinojska kislina se nadalje s CYP26A metabolizira v 4-OH-retinojsko kislino. Visoka koncentracija encima AKR1B10 je povezana s pomanjkanjem retinojske kisline, z zmanj ano zasedenostjo obeh receptorjev pa se zmanj a tudi diferenciacija celic (prirejeno po 1). 16

17 2. NAMEN DELA Namen diplomske naloge je ugotoviti prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 v rakavem tkivu endometrija. Primerjali bomo njuno prisotnost v rakavem in kontrolnem tkivu bolnic z rakom endometrija z metodo prenosa western in imunohistokemijskim barvanjem. Rak endometrija je povezan s pove ano celi no proliferacijo zaradi povi ane koncentracije estrogenov in z zmanj ano celi no diferenciacijo zaradi zni ane koncentracije progesterona ter retinojske kisline. Povezujemo ga tudi z vnetnim odzivom in s povi ano koncentracijo prostaglandinov. Encima AKR1B1 in AKR1B10 sodelujeta pri sintezi prostaglandinov ter retinojske kisline in sta potencialno vpletena v razvoj raka endometrija. 17

18 3. MATERIALI IN METODE 3.1.POLIAKRILAMIDNA GELSKA ELEKTROFOREZA Reagenti 10 % lo ilni gel 8,1 ml destilirane H 2 O 5,0 ml 1,5 M Tris-HCl, ph 8,8 6,7 ml 30 % akrilamid/bis akrilamid 200 µl 10 % SDS vzor ni pufer 10 µl TEMED 200 µl amonijev persulfat (APS) koncentrirni gel 6,1 ml destilirane H 2 O 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8 1,3 ml 30 % akrilamid/bis akrilamid 100 µl 10 % NaDS 10 µl TEMED 100 µl amonijev persulfat (APS) Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS vzor nega pufra je analitska metoda za lo evanje proteinov na osnovi njihove molekulske mase. Natrijev dodecilsulfat (NaDS) je anionska povr insko aktivna molekula, ki se ve e na proteine in jih denaturira. V prisotnosti NaDS dobijo proteini negativen naboj. Naboj je odvisen od njihove molekulske mase, saj se ve e povpre no ena molekula NaDS na dva aminokislinska ostanka. Razmerje naboj/masa pa je tako enako pri vseh proteinih. S polimerizacijo akrilamida in bisakrilamida nastane zamre en gel, v katerem nato poteka lo itev proteinov. Njihova hitrost potovanja je obratno sorazmerna z njihovo velikostjo. 18

19 3.1.2 Postopek Za elektroforezo smo uporabili Mini-Protean II elektrofotezno aparaturo proizvajalca Bio- Rad. Aparaturo smo sestavili po navodilih proizvajalca. Najprej smo pripravili 10 % lo ilni gel in ga vlili med stekelca. Preko njega smo nalili 20 % etanol, ki prepre i izsu itev gela med njegovim strjevanjem, ki je trajalo pribli no 35 min. S filter papirjem smo odstranili etanol in na strjeni lo ilni gel nalili 4 % koncentrirni gel, ki smo ga pripravili medtem. Vstavili smo glavni ek in spet po akali pribli no 35 min, da se je gel strdil. Odstranili smo glavni ek, nosilec z gelom prenesli v kadi ko in prelili z elektroforeznim pufrom. Vzorce smo pripravili tako, da smo volumnom vzorcev, ki so vsebovali 30 µg proteinov, dodali vodo do 10 µl in 6 µl SDS vzor nega pufra. Nato smo jih centrifugirali in inkubirali pri sobni temperaturi 10 min. Vzorec Ishikawe smo segrevali v termobloku pri 95 C 15 min, da so se proteini denaturirali. Vse vzorce in proteinske standarde (BioRad in ABCAM) smo nanesli na gel. Elektroforeza je potekala pribli no 40 minut pri napetosti 200 V. Slika 3: Aparatura za elektroforezo (Mini-Protean II Bio-Rad) (21) 19

20 3.2 PRENOS WESTERN S to metodo smo prenesli proteine z gela na PVDF membrano. Najprej smo pripravili pufer za prenos in ga ohladili. Koncentrirni gel smo odstranili, lo ilnega pa dali v pufer za prenos. Nato smo izrezali membrano. Membrano smo aktivirali tako, da smo jo 15 sekund namakali v MeOH, 2 minuti v bidestilirani vodi in na koncu vsaj 5 minut v pufru za prenos. V ta pufer smo namo ili tudi krpice, ki so prilo ene aparaturi. Pripravili smo»gel sendvi «. S rne proti beli strani smo polo ili krpico, karton ek, gel, aktivirano membrano in krpico. Kaseto smo polo ili v Mini Trans-Blot aparaturo, ki smo jo imeli v kadi ki in jo hladili z ledom. Preko kasete smo nalili ohlajen pufer za prenos. Prenos je potekal 1 h pri 108 V Reagenti - pufer za prenos (3,03 g Tris, 14,4 g glicin, 200 ml metanol (20 %), do 1 l mili Q) % MeOH - bidestilirana voda - 10 x TBS (24,2 g Tris, 292,2 g NaCl, do 1 l destilirana voda) - 0,1 % TTBS (100 ml 10 x TBS, 1 ml Tween 20, do 1 l destilirana voda) - 5 % mleko - PVDF membrana (Millipore Corporation, Billerica, MA,USA) - primarna protitelesa: kun ja poliklonska primarna protitelesa: proti AKR1B1 (ab62795, 1:5000) in proti AKR1B10 (ab96417, 1:5000) - sekundarna protitelesa: kozja proti kun ja IgG+IgM (1:10 000) konjugirana s hrenovo peroksidazo (HRP) Postopek Membrano smo med rahlim stresanjem blokirali 1 h v 5 % mleku. Nato smo jo 4 krat spirali po 5 minut z 0,1 % pufrom TTBS. ez no smo membrano pri 4 C inkubirali s primarnimi protitelesi. Naslednji dan smo membrano spirali 4-krat po 5 minut z 0,1 % pufrom TTBS in jo 2 uri inkubirali s sekundarnimi protitelesi. Nato pa smo jo spet 4-krat sprali po 5 minut z 0,1 % pufrom TTBS. 20

21 Slika 4: Prenos proteinov z gela na membrano (prenos western) (22) 3.3 DETEKCIJA Z OJA ANO KEMILUMINISCENCO (ECL) Reagent: The RapidStepTM ECL Reagent (Calbiochem, Millipore Corporation, USA) Membrano smo postavili v petrijevko, jo enakomerno orosili z reagentom in po akali 1 minuto. Reagent je vseboval vodikov peroksid in luminol. Reakcija oksidacije luminola pote e v prisotnosti vodikovega peroksida in hrenove peroksidaze (HRP), ki je bila vezana na sekundarnih protitelesih. Luminol je po oksidaciji razpadel in oddal svetlobo, ki smo jo na filmu zaznali kot temno liso. S kemiluminiscenco poimenujemo kemijsko reakcijo, pri kateri se energija sprosti v obliki svetlobe. 21

22 Slika 5: Reakcija detekcije z oja ano kemiluminiscenco. Po oksidaciji luminola, v prisotnosti vodikovega peroksida in hrenove peroksidaze, nastane svetloba (23). 3.4 BARVANJE MEMBRANE Membrano smo za 5 minut potopili v raztopino Ponceau (12,5 ml 100 % ocetne kisline, 225 ml dd H 2 O, 12,5 mg ponceau S) in stresali. Nato smo jo sprali z destilirano vodo in jo skenirali (kvantifikacija). Na koncu smo jo e 2-krat po 5 min sprali z 0,1 % pufrom TTBS. 3.5 BARVANJE GELA Gel smo za 5 minut polo ili v barvilo Comassie Brilliant Blue (0,1 % Coomassie Blue R- 250, 40 % metanol, 10 % ocetna kislina) in ga spirali v 7 % ocetni kislini. Nato smo ga posneli. 22

23 3.6 IMUNOHISTOKEMIJA Reagenti - ksilen % etanol - 96 % etanol - 80 % etanol - 70 % etanol - bidestilirana voda - T-PBS (8,2 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g NaH 2 PO 4, 0,2 g KH 2 PO 4, do 1 l bidestilirana voda) - 30 % vodikov peroksid - 0,01 M Na-citrat, ph=6 - kozji serum 1:20 - primarna protitelesa: kun ja proti AKR1B1 1:100 in proti AKR1B10 1:200 - sekundarna protitelesa: kozja proti kun ja 1:100 - PAP (kompleks peroksidaza proti peroksidaza): kun ja PAP protitelesa 1:500 - mi ja protitelesa proti ciklofilinu A (Abcam, ab58144, 1:1000), - 0,05 TRIS/HCl, ph=7,4 - FastTM 3,3'-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich). - hematoksilin - Pertex Vzorce parafinskih tkiv rakavega endometrija smo dobili na Ginekolo ki kliniki Univerzitetnega klini nega centra v Ljubljani Postopek Vzorce in kontrole smo postavili v stojalo. V digestoriju smo stojalo 2-krat po 5 minut potopili v kadi ki s ksilenom, da smo odstranili parafin. Potem smo vzorce po 5 minut potapljali v padajo e koncentracije alkoholov (100 % etanol, 96 % etanol, 80 % etanol, 70 % etanol), potem e v bidestilirano vodo, na koncu pa e za 5 minut v pufer T-PBS. Vzorce 23

24 smo nato za 40 minut potopili v raztopino 0,9 % H 2 O 2 v T-PBS. Za tem smo jih 5 minut spirali s T-PBS. V kadi ko smo nalili 0,01M Na-citrat s ph 6,00 in jo ovili s plasti no folijo, na vrhu pa naredili odprtino, skozi katero smo potem med segrevanjem dolivali Nacitrat in skozi katero je izhajala para. Kadi ko smo postavili v mikrovalovno pe ico in segrevali pri konstantnem vrenju. Sledilo je 30 minutno ohlajanje pri sobni temperaturi in 5 minutno spiranje s T-PBS. Vsako stekelce z vzorcem smo obrisali s papirnato brisa o in jih polo ili v vodoraven polo aj v vla no komoro. Na vsako stekelce smo nanesli 100 µl kozjega seruma in jih prekrili s parafilmom, katlo pa pokrili s pokrovom, da se vzorci ne bi posu ili. Vzorce smo inkubirali 1 uro pri sobni T. Nato smo odstranili parafilm, jih 5 minut spirali s pufrom T-PBS in obrisali s papirnato brisa o. Sledilo je nana anje 100 µl primarnih protiteles na vzorce, na kontrole pa 100 µl kozjega seruma. Vzorce smo inkubirali preko no i v hladni sobi. Naslednji dan smo vzorce 2-krat po 5 minut spirali s T-PBS, obrisali stekelca, nanesli 100 µl sekundarnih protiteles, jih pokrili s parafilmom in inkubirali eno uro pri sobni temperaturi. Nato smo vzorce spirali 2-krat po 5 minut s T-PBS, obrisali stekelca in s pipeto na vsak vzorec nanesli 100 µl raztopine PAP protiteles. Inkubirali smo 30 minut, nato smo 2-krat po 5 minut spirali s T-PBS. Sledilo je barvanje vzorcev z barvilom DAB (20 µl/1 ml substrata), ki se v prisotnosti H 2 O 2 in peroksidaze obarva rjavo. Po akali smo, da se je vzorec obarval, oziroma najve 15 minut in jih potem takoj polo ili v bidestilirano vodo, da smo prekinili reakcijo. Nato smo jih spirali 5 minut v bidestilirani vodi, 45 sekund v hematoksilinu, 30 sekund v navadni vodi in e 1 minuto v navadni vodi. Sledila je dehidracija. Vzorce smo potapljali v kadi ke za 5 minut v nasprotnem vrstnem redu kot pri rehidraciji. Najprej v bidestilirani vodi, nato pa v 70 % etanolu, 80 % etanolu, 95 % etanolu, 100 % etanolu in 2-krat v ksilenu. Vzorce smo nato posu ili, na vsakega nanesli kapljico Pertex in pokrili s krovnim stekelcom. Vzorce smo opazovali pod svetlobnim mikroskopom pri 100x in 400x pove avi, s pomo jo programa Axiovision Rel 4.8, in glede na obarvanost sklepali na vsebnost AKR1B1 in AKR1B10. 24

25 4. REZULTATI IN RAZPRAVA 4.1 DETEKCIJA PROTEINOV Na gele, ki smo jih predhodno pripravili sami, smo nanesli 30 parov vzorcev proteinov, izoliranih iz normalnega in tumorskega endometrija (volumen, ki ustreza 30 µg proteinov). Na vsak gel pa smo nanesli tudi vzorce proteinov, izoliranih iz placente in celi ne linije Ishikawa, ki so nam slu ili kot kontrola ter proteinski standard, ki je vseboval proteine znanih molekulskih mas (Abcam+Biorad). Sledila je gelska elektroforeza in prenos na membrano. Po prenosu smo gele obarvali v barvilu Coomassie brilliant blue, razbarvali v ocetni kislini in jih posneli. Po barvanju gelov smo opazili, da je veliko proteinov ostalo na gelu, kar pomeni, da se niso vsi prenesli na membrano. Pobarvali smo tudi membrane in ugotovili, da je na membranah zadostna koli ina proteinov za nadaljnjo detekcijo. Membrane smo inkubirali s primarnimi in sekundarnimi protitelesi. Detekcija AKR1B1 in AKR1B10 na membranah je potekala z oja ano kemiluminiscenco. Detektirali smo tudi primerjalni protein ciklofilin A, ki nam je slu il za normalizacijo dobljenih rezultatov. 25

26 a) b) c) d) e) Slika 6: Detekcija proteinov AKR1B1 in AKR1B10 v proteinskih vzorcih raka endometrija in kontrolnega tkiva. (a) gel po prenosu, (b) membrana po prenosu, (c) detekcija proteina ciklofilina, (d) detekcija AKR1B1, (e) detekcija AKR1B10. 26

27 Detekcijo smo opravili z napravo Fujifilm LAS4000 (Fujifilm, Japan). Lisi proteinov AKR1B1 oz. AKR1B10 v placenti sta bili na vseh membranah najmo nej i, sledili pa sta lisi teh proteinov v celi ni liniji Ishikawa. Lise na membrani smo ovrednotili s programom Multi Gauge (Fujifilm software). Program poda rezultate kot volumen lise, ki odra a koncentracijo merjenega proteina. Nekaj te av smo imeli s tremi membranami (161, 162 in 163), na katerih smo najprej zaznali zelo ibke signale. Po ponovnem inkubiranju s primarnimi in sekundarnimi protitelesi smo dobili zadovoljive rezultate. Dobljene rezultate smo najprej obdelali v programu Microsoft Excel (Microsoft Office). Koli ino merjenega proteina smo delili z interno kontrolo (IK=(Ish+P)/2). IK= interna kontrola Ish= volumen lise proteina AKR1B1 oz. proteina AKR1B10 v celi ni liniji Ishikawa P= volumen lise proteina AKR1B1 oz. proteina AKR1B10 v placenti Te rezultate pa smo delili z vrednostjo ciklofilina, ki je primerjalni protein in tako normalizirali koncentracijo proteina. Nato smo koncentracijo proteina v tumorskih celicah delili s koncentracijo proteina v kontrolnih celicah in tako dobili njuno razmerje. Te rezultate smo obdelali v statisti nem programu GraphPad Prism Software version 5.00 for Windows. Statisti no zna ilno razliko med tumorskim in kontrolnim tkivom smo ocenili z Wilcoxonovim neparametri nim testom za pare s stopnjo zaupanja 95 % (p = 0,05). Uporabili smo vrednosti razmerja AKR1B1/PPIA in AKR1B10/PPIA. Stopnja zaupanja za protein AKR1B1 je bila 0,0378, za protein AKR1B10 pa 0,0023. Razlika v koli ini proteinov je v obeh primerih statisti no zna ilna, saj je p 0,05. Koli ina proteina AKR1B1 je bila v tumorskem tkivu vi ja kot v kontrolnem tkivu v devetih vzorcih od tridesetih, koli ina proteina AKR1B10 pa le v sedmih vzorcih od tridesetih. Na i rezultati torej ka ejo, da je koli ina obeh proteinov v ve ini vzorcev tumorskega tkiva ni ja kot v vzorcih kontrolnega tkiva. 27

28 AKR1B1/PPIA 10 1 p=0, proteini K T Graf 1: Prikaz koli ine proteinov AKR1B1 v kontrolnem in tumorskem tkivu 10 2 AKR1B1 razmerje proteinov v tumorskem / kontrolnem tkivu pari vzorcev Graf 2: Prikaz razmerja proteinov AKR1B1 v tumorskem in kontrolnem tkivu 28

29 AKR1B10/PPIA 10 1 p=0,0023 proteini K T Graf 3: Prikaz koli ine proteinov AKR1B10 v kontrolnem in tumorskem tkivu 10 1 AKR1B10 razmerje proteinov v tumorskem / normalnem tkivu pari vzorcev Graf 4: Prikaz razmerja proteinov AKR1B10 v tumorskem in kontrolnem tkivu 29

30 4.2 IMUNOHISTOKEMIJSKO BARVANJE PROTEINOV Z imunohistokemijskim barvanjem 24 parafinskih rezin raka endometrija smo ugotavljali prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 e na celi ni ravni. Na parafinske rezine tumorskih vzorcev smo nana ali kozji serum, primarna kun ja protitelesa za dolo anje AKR1B1 in AKR1B10 ter sekundarna kozja proti kun ja protitelesa, na kontrolne vzorce pa le kozji serum. e bi se kontrola obarvala, bi bil to znak nespecifi nosti, vendar do tega ni pri lo. Za barvilo smo uporabili 3,3'-diaminobenzidin (DAB). Pod mikroskopom (Carl-Zeiss, Jena) smo si pri 100x in 400x pove avi ogledali tudi vzorce, barvane s hematoksilinom in eozinom, pri katerih smo opazovali histologijo rakavega tkiva. Ocenili smo intenziteto obarvanja in na a opa anja predstavili v razpredelnici. Oba proteina sta prisotna predvsem v citoplazmi epitelijskih celic raka endometrija. 30

31 Preglednica l: Rezultati imunohistokemijskega barvanja vzorcev raka endometrija Obarvanost lez smo ocenili s tevilom plusov ( -, ni obarvanja; +, slabo obarvanje; ++, zmerno obarvanje; +++, mo no obarvanje) Vzorec AKR1B1 AKR1B10 T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T

32 Slika 7: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 7, 8, 10 in 13. Pri vseh tirih vzorcih smo zaznali prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10. 32

33 Slika 8: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 18, 19, 20 in 21. Le v vzorcu 19 smo zaznali nekoliko slab o prisotnost proteina AKR1B10. 33

34 Slika 9: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 22, 23, 24 in 25. V vzorcih 24 in 25 smo zaznali nekoliko slab o prisotnost obeh proteinov. 34

35 Slika 10: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 26, 27, 30 in 31. Vzorec 26 se je obarval nekoliko slab e, v vzorcu 27 pa obeh proteinov nismo zaznali. 35

36 Slika 11: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 32, 33, 34 in 35. Proteina AKR1B1 in AKR1B10 smo zaznali v vseh vzorcih. 36

37 Slika 12: Imunohistokemijsko barvanje vzorcev 38, 40, 42 in 44. Le v vzorcu 40 smo zaznali nekoliko ni jo koncentracijo proteina AKR1B1. 37

38 5. SKLEP Namen te diplomske naloge je bil ugotoviti prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 v rakavem tkivu endometrija in v kontrolnem tkivu. Z analizo western smo v 30 parih vzorcev proteinov izoliranih iz rakavega in kontrolnega tkiva dolo ali koncentracijo AKR1B1 in AKR1B10. Pri statisti ni obdelavi smo uporabili Wilcoxonov test in ugotovili statisti no zna ilno zni ano koncentracijo AKR1B1 in AKR1B10 v rakavem tkivu v primerjavi z njuno koncentracijo v kontrolnem tkivu. V obeh primerih smo dobili p 0,05. Tako smo ugotovili, da je v primerjavi z rakavim tkivom v na em primeru koncentracija obeh proteinov vi ja v okolnem, kontrolnem tkivu, v katerem se je proces kancerogeneze verjetno e za el. Predvidevamo, da bi oba proteina lahko uporabili kot tumorska ozna evalca v za etni fazi razvoja raka endometrija. Na e kontrolno tkivo je predstavljal okolni endometrij bolnic z rakom, zato bi bilo v prihodnje zanimivo primerjati prisotnost obeh proteinov v rakavem tkivu in v tkivu oseb z benigno boleznijo endometrija. Prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 smo preverili tudi na celi ni ravni z imunohistokemijskim barvanjem 24 parafinskih rezin tumorskega tkiva endometrija. Ugotovili smo, da sta proteina prisotna prete no v citoplazmi epitelijskih celic. V prihodnje bi bilo smiselno prisotnost proteinov AKR1B1 in AKR1B10 preveriti tudi v parafinskih rezinah kontrolnega endometrija bolnic z rakom in parafinskih rezinah endometrija oseb z benigno boleznijo endometrija. 38

39 6. LITERATURA 1. Lani nik Ri ner T: Enzymes of the AKR1B and AKR1C subfamilies and uterine diseases. Front. Pharmacology 2012; 3(34): Ryan A J, Susil B, Jobling T W, Oehler M K: Endometrial cancer. Cell Tissue Res. 2005; 322: Shiozawa T, Konishi I: Early endometrial carcinoma: clinicopathology, hormonal aspects, molecular genetics, diagnosis, and treatment. Int. J. Clin. Oncol. 2006; 11: Sherman M E: Theories of endometrial carcinogenesis: a multidisciplinary approach. Modern Pathology 2000; 13(3): Lani nik Ri ner T, inkovec J: Vloga hidroksisteroid-dehidrogenaz pri uravnavanju aktivnosti estrogenov in progestagenov: primer raka endometrija in endometrioze. Medicinski razgledi 2004; 43: Liu F S: Molecular carcinogenesis of endometrial cancer. Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology 2007; 46(1): Akhmedkhanov A, Zeleniuch-Jacquotte A, Toniolo P: Role of exogenous and endogenous hormones in endometrial cancer. Review of the evidence and research perspectives. Ann N Y Acad. Sci. 2001; 943: Henderson B E, Feigelson H S: Hormonal cancerogenesis. Carcinogenesis 2000; 21: Karageorgi S, Hankinson S E, Kraft P, De Vivo I: Reproductive factors and postmenopausal hormone use in relation to endometrial cancer risk in the Nurses' Health Study cohort Int. Journal of Cancer 2010; 126: tabuc B, Primic- akelj M, Klemen i M, Pi kur J: Rak rodil. SEMINAR In memoriam dr. Du ana Reje. Zveza slovenskih dru tev za boj proti raku 2008; Genç S, Attar E, Gürdöl F, Kendigelen S, Bilir A, Serdaroglu A: The effect of COX-2 inhibitor, nimesulide, on angiogenetic factors in primary endometrial carcinoma cell culture. Cin. Exp. Med. 2007; 7: Catalano R D, Wilson M R, Boddy S C, Jabbour H N: Comprehensive expression analysis of prostanoid enzymes and receptors in the human endometrium across the menstrual cycle. Molecular Human Reproduction 2011; 17(3):

40 13. Wallace A E, Sales K J, Catalano R D, Anderson R A, Williams A R W, Wilson M R, Schwarze J, Wang H, Rossi A G, Jabbour H N: Prostaglandin F2 -F-prostanoid receptor signaling promotes neutrophil chemotaxis via chemokine (C-X-C Motif) ligand 1 in endometrial adenocarcinma. Cancer Res. 2009; 69(14): Wallace A E, Gibson D A, Saunders P T K, Jabbour H N: Inflammatory events in endometrial adenocarcinoma. Journal of Endocrinology 2010; 206: Brasky T M, Moysich K B, Cohn D E, White E: Non-steroidal anti-inflammatory drugs and endometrial cancer risk in the VITamins And Lifestyle (VITAL) cohort. Gynecologic Oncology 2013; 128: Ruiz F X, Porte S, Pares X, Farres J: Biological role of aldo-keto reductases in retinoic acid biosynthesis and signaling. Frontiers in Pharmacology 2012; 58(3): Ruiz X F, Moro A, Gallego O, Ardevol A, Rovira C, Petrash M J, Pares X, Farres J: Human and rodent aldo-keto reductases from AKR1B subfamily and their specifity with retinalaldehyde. Chemico-Biological Interactions 2011; 191: Mindnich R D, Penning T M: Aldo-ketoreductase (AKR) superfamily: Genomics and annotation. Hum. Genomics 2009; 3(4): Bresson E, Boucher-Kovalik S, Chapdelaine P, Madore E, Harvey N, Laberge P Y, Leboeuf M, Fortier M A: The human reductase AKR1B1 qualifies as the primary prostaglandin F synthase in the endometrium. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011; 96(1): Luo D, Huang M C, Ma J, Gao Z, Liao D, Cao D: Aldo-keto reductase family 1, member B10 is secreted through a lysosome-mediated non-classical pathway. Biochem. J. 2011; 438; Blotting-Equipment-(Cells-and-Power-Supplies)