VPLIV POGOSTO UPORABLJENIH ZDRAVIL V REVMATOLOGIJI NA VNETNI ODZIV GOJENIH ČLOVEŠKIH ENDOTELIJSKIH CELIC

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO DOLORES HRUŠOVAR VPLIV POGOSTO UPORABLJENIH ZDRAVIL V REVMATOLOGIJI NA VNETNI ODZIV GOJENIH ČLOVEŠKIH ENDOTELIJSKIH CELIC THE EFFECT OF COMMONLY USED MEDICATIONS IN RHEUMATOLOGY ON THE INFLAMMATORY RESPONSE OF CULTURED HUMAN ENDOTHELIAL CELLS DIPLOMSKA NALOGA UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2012

2 Diplomsko nalogo sem opravljala v Laboratoriju za imunologijo revmatizma na Kliničnem oddelku za revmatologijo Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana, pod mentorstvom prof. dr. Boruta Božiča in somentorstvom doc. dr. Snežne Sodin-Šemrl. Zahvala Zahvaljujem se mentorju, prof. dr. Borutu Božiču, za možnost opravljanja diplomskega dela na področju, ki me najbolj veseli, ter za vse strokovne nasvete pri pisanju diplomske naloge. Prav tako se zahvaljujem tudi somentorici, doc. dr. Snežni Sodin-Šemrl, za prijaznost, vzpodbudo in nasvete pri opravljanju eksperimentalnega dela. Posebno in iskreno se za vso pomoč, potrpežljivost, pripombe, vzpodbudo, usmerjanje pri delu ter za vse nadure, ki jih je občasno preživljala v moji družbi zahvaljujem Katji Lakota. Hvala za nenehno dobro voljo in optimizem. Zahvaljujem se tudi vsem zaposlenim v Laboratoriju za imunologijo revmatizma, ker so mi, ko je bilo potrebno, brez oklevanja priskočili na pomoč med opravljanjem eksperimentalnega dela. Prav tako se zahvaljujem tudi mami Lidiji in vsem svojim bližnjim, ki so mi tekom študija vedno stali ob strani. Zahvaljujem pa se tudi prijateljem, za vse lepe in zabavne trenutke, ki smo jih v študentskih letih preživeli skupaj. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno pod mentorstvom prof. dr. Boruta Božiča in somentorstvom doc. dr. Snežne Sodin-Šemrl. Ljubljana, november 2012 Predsednica komisije: izr. prof. dr. Marija Bogataj Član komisije: asist. dr. Nace Zidar II

3 KAZALO KAZALO III POVZETEK V ABSTRACT VI SEZNAM OKRAJŠAV VII 1. UVOD ATEROSKLEROZA Aterogeneza SISTEMSKE AVTOIMUNSKE BOLEZNI VNETJE Biosinteza prostaglandinov Serumski amiloid A NEKATERE KLJUČNE MOLEKULE, KI SODELUJEJO PRI PROCESU ATEROSKLEROZE Molekule z vplivom na iniciacijo ateroskleroze Molekule, ki sodelujejo v končni fazi ateroskleroze Nekatere druge molekule, ki sodelujejo pri vnetju ZDRAVILA, UPORABLJENA PRI REVMATIČNIH IN NEKATERIH KRONIČNIH BOLEZNIH Deksametazon Fluvastatin Inhibitorji dejavnika tumorske nekroze α (TNF-α inhibitorji) Kaptopril Metotreksat Nesteroidni antirevmatiki (NSAR) Rosiglitazon NAMEN, HIPOTEZA IN CILJI MATERIALI IN METODE 21 III

4 3.1 MATERIALI BIOLOŠKI MATERIAL ANALIZNI KOMPLETI REAGENTI APARATURE IN DROBNI LABORATORIJSKI MATERIAL METODE DELO S CELIČNIMI KULTURAMI IZOLACIJA NUKLEARNIH EKSTRAKTOV DOLOČANJE PPARγ TRANSKRIPCIJSKEGA FAKTORJA PANEL CITOKINOV ENCIMSKOIMUNSKA METODA ANALIZA RNA REZULTATI IN RAZPRAVA CITOKINSKI PANEL VNETNI ODZIV HCAEC NA STIMULACIJO S SAA ČASOVNA ODVISNOST IZRAŽANJA NEKATERIH GENOV VNETNI ODZIV HCAEC NA STIMULACIJO S SAA OB DODATKU ZDRAVIL DMARD IN KORTIKOSTEROIDI (METOTREKSAT IN DEKSAMETAZON) INHIBITORJI TNF-α ZDRAVILA ZA ZNIŽANJE HOLESTEROLA IN KRVNEGA TLAKA (FLUVASTATIN IN KAPTOPRIL) NSAR (DIKLOFENAK, MELOKSIKAM IN ETORIKOKSIB) ANTIDIABETIKI (ROSIGLITAZON) AKTIVNOST TRANSKRIPCIJSKEGA FAKTORJA PPARγ V HCAEC SKLEPI LITERATURA 70 IV

5 POVZETEK Približno 5 % svetovne populacije ima eno izmed kroničnih vnetnih avtoimunskih bolezni. Ti bolniki imajo večje tveganje za nastanek srčno-žilnih bolezni, do katerih pride zaradi napredovane ateroskleroze, ki je poglavitni vzrok srčno-žilnih bolezni in posledično smrti v zahodnem svetu. Njena značilna patofiziološka karakteristika je kronični vnetni proces arterijske stene. S pomočjo vnetja se iz telesa odstranijo patogene snovi, pride pa tudi do zacelitve tkiva. Namen naše naloge je bil preveriti vpliv zdravil za zdravljenje kroničnih vnetnih avtoimunskih in drugih kroničnih bolezni na človeške endotelijske celice koronarnih arterij (HCAEC). Celice smo po dodatku zdravil stimulirali s človeškim rekombinantnim serumskim amiloidom A (SAA), ki je pri njih izzval vnetje. Nato smo preverili vpliv zdravil na vnetne citokine, kemokine ter adhezivne molekule na proteinskem in mrna nivoju. Dobljeni rezultati so pokazali, da metotreksat in deksametazon, eni izmed najpogosteje uporabljenih zdravil v revmatologiji, zelo učinkovito znižata koncentracijo vseh vnetnih parametrov, razlikujeta pa se pri vplivu na inhibitor aktivatorja plazminogena 1 (PAI-1), kar je možni vzrok njunega različnega vpliva na pojav srčno-žilnih dogodkov. Inhibitorji faktorja tumorske nekroze-α na HCAEC delujejo različno. Certolizumab pegol koncentracijo večine vnetnih mediatorjev poveča, adalimumab pa jo zmanjša. Zdravili sta za razliko od ostalih zdravil neučinkoviti pri zaviranju izražanja mrna SAA po stimulaciji HCAEC s SAA. Fluvastatin in kaptopril nista protivnetni zdravili, vendar naši rezultati kažejo, da vnetje zelo uspešno zavirata. Fluvastatin se po učinkovitosti na celičnem modelu lahko primerja z zdravili iz skupine zdravil, ki modificirajo potek bolezni (DMARD). Tudi zdravila iz skupine nesteroidnih protivnetnih zdravil (NSAR) na celice ne delujejo enako. Meloksikam občutno poveča koncentracijo skoraj vseh vnetnih mediatorjev, etorikoksib in diklofenak pa jo učinkovito zmanjšata. Vendar pa meloksikam močno zniža koncentracijo PAI-1, kar je možni razlog za manjše število trombotičnih zapletov pri bolnikih, ki se zdravijo z meloksikamom, v primerjavi s tistimi, ki prejemajo diklofenak. Meloksikam tudi pomembno poveča izražanje PPARγ in na vnetje verjetno deluje tudi preko te signalne poti. Rosiglitazon na HCAEC deluje protivnetno, saj zniža koncentracijo vseh vnetnih molekul, vendar močno poveča koncentracijo PAI-1, kar bi lahko bil razlog za njegov umik iz prodaje. SAA poveča aktivnost PPARγ v enaki meri kot sintetični ligand PPARγ, rosiglitazon, in s tem potencialno vpliva na zmanjšanje vnetja. V

6 ABSTRACT About 5 % of the world s population suffers from autoimmune rheumatic diseases, which are associated with higher risks of cardiovascular diseases, secondary to accelerated atherosclerosis. Atherosclerosis is the main cause of cardiovascular diseases and deaths in the Western world. Its main pathophysiological characteristic is chronic inflammation of the arterial wall. Inflammation is a protective attempt by the organism to eliminate pathogens and it also leads to tissue repair. Our aim was to examine the effect of medications used for the treatment of autoimmune rheumatic and some other chronic diseases on human coronary artery endothelial cells (HCAEC). Cells were stimulated with human recombinant serum amyloid A following incubation with specific medications. We verified the effects of the medications on the inflammatory response of HCAEC at the protein and mrna levels. Our results show that medications, commonly used for the treatment of autoimmune rheumatic diseases - methotrexate and dexamethasone, both efficiently inhibited all the inflammatory markers, but differed in their effect on plasminogen activator inhibitor (PAI- 1). This may also be the reason for their differential effects on cardiovascular events. Tumor necrosis factor-α inhibitors have diverse effects on HCAEC. Certolizumab pegol induces the concentration of almost all inflammatory mediators and adalimumab inhibits them. Both medications unlike others, do not inhibit mrna expression of SAA after the stimulation of HCAEC with SAA. Fluvastatin and captopril are primarily not antiinflammatory medications, but we showed that they are both very successful as inhibitors of inflammation. At the cellular level, fluvastatin is as efficient as some DMARD in attenuating inflammation. The effects of different nonsteroidal antiinflammatory drugs on HCAEC are also very interesting. Meloxicam highly induces levels of almost all inflammatory mediators, while etoricoxib and diclofenac inhibit them. However, contrary to diclofenac, meloxicam inhibits the production of PAI-1 which may result in fewer thrombotic complications among patients in comparison to diclofenac. Meloxicam also induces PPARγ expression which may affect inflammation. Rosiglitazone inhibits all the inflammatory mediators, but it also induces PAI-1, which may be the reason for why it was suspended from the European market. SAA induces PPARγ activity as much as rosiglitazone, the synthetic ligand of PPARγ, which may result in inhibition of inflmmation, despite the fact, that it is a highly responsive acute phase protein. VI

7 SEZNAM OKRAJŠAV 15d-PGJ 2 15-deoksi-Δ12,14-prostaglandin J 2 cdna komplementarna deoksiribonukleinska kislina COX ciklooksigenaza CRP C reaktivni protein DMARD antirevmatiki, ki modificirajo potek bolezni DMSO dimetilsulfoksid ELISA encimskoimunski test na trdnem nosilcu (enzyme linked immunosorbent assay) FBS fetalni goveji serum GMC gladko mišične celice GM-CSF granulocitne in makrofagne kolonije stimulirajoči dejavnik HCAEC humane endotelijske celice koronarne arterije HDL lipoprotein visoke gostote HRP hrenova peroksidaza HUVEC humane endotelijske celice umbilikalne vene ICAM-1 intercelularna adhezijska molekula 1 IL-6 interlevkin 6 IL-8 interlevkin 8 LDL lipoprotein nizke gostote MI miokardni infarkt MMP matriks metaloproteinaze mrna informacijska ribonukleinska kislina NSAR nesteroidni antirevmatiki qpcr kvantitativna verižna reakcija s polimerazo PAI-I plazminogen aktivator inhibitor I PPARγ receptor, aktiviran s proliferatorjem peroksisomov γ RA revmatoidni artritis RT-PCR obratna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo SAA serumski amiloid A TNF-α dejavnik tumorske nekroze α VCAM-1 žilno-celična adhezijska molekula 1 VII

8 1. UVOD 1.1 ATEROSKLEROZA Ateroskleroza je kronična bolezen arterij mišičnega in elastičnega tipa, za katero je značilno napredujoče kopičenje lipidov, veziva, krvi in krvnih sestavin, netopnih kalcijevih soli in celičnih ostankov v intimi, ter spremljajoče vnetje, ki poleg intime zajame tudi medijo. V zahodnem svetu povzroči več smrti, kot katerakoli druga bolezen (1). Ateroskleroza je poglavitni vzrok srčno-žilnih bolezni in bolezni koronarne arterije, saj povzroča počasno oblikovanje maščobnih, ter nato vezivnih leh in zožitev premera arterij. Preoblikovanje žil vodi do trombotičnih zapletov, kot sta miokardni infarkt (MI) in kap. Znano je, da je ateroskleroza vnetna bolezen, saj je njena značilna patofiziološka karakteristika kronični vnetni proces arterijske stene. Ker ostali dejavniki tveganja, kot so hipertenzija, debelost in diabetes v populaciji naraščajo, je zelo pomembno, da poskušamo obvladati vnetno komponento ateroskleroze ter s tem zmanjšati smrtnost in izboljšati zdravje ljudi (2). Vnetni označevalci imajo pri iniciaciji in napredovanju ateroskleroze velik vpliv. Prve vnetne karakteristike aterosklerotičnih leh so evropski kirurgi odkrili že pred 200 leti, ateroskleroza pa je postala okarakterizirana kot vnetna bolezen leta 1999 (3) Aterogeneza Prvi dogodek pri nastanku ateroskleroze je aktivacija endotelija. Zdrav endotelij regulira tonus žil in njihovo zgradbo, ima antikoagulantne in fibrinolitične lastnosti, ter preprečuje zlepljanje trombocitov. Sprošča številne vazodilatacijske in vazokonstrikcijske substance. Najpomembnejši vazodilatatorji so dušikov oksid (NO), bradikinin in prostaciklini, pomembnejša vazokonstriktorja pa sta angiotenzin II in endotelin. Zaradi delovanja strižnih sil ali proaterogenih faktorjev, kot so spremenjeni lipoproteini in vnetni citokini, pride do aktivacije endotelija. Ob tem pride tudi do porušenja ravnotežja med vazokonstriktorji in vazodilatatorji, kar se nato lahko odrazi v endotelijski disfunkciji. Raziskave so pokazale, da je sama disfunkcija endotelija neodvisni napovedni znak za napredovanje ateroskleroze in pojav srčno-žilnih dogodkov (3). Po aktivaciji endotelija se na njegovi površini izrazijo adhezijske molekule, kot je na primer žilno-celična adhezijska 1

9 molekula 1 (VCAM-1). Pride do izločanja citokinov in kemokinov, ki privabljajo levkocite, ti pa preko adhezivnih molekul vstopijo v intimo. Monociti se zberejo na mestu ateroma, migrirajo v žilno steno, ter dozorijo v makrofage (4). Ti začnejo izražati odstranjevalne (ang. scavanger) receptorje, požirati spremenjene lipoproteine, ter se na koncu spremenijo v penaste celice (slika 1A). Pridružijo se jim tudi limfociti T. Aktivirani makrofagi v intimi proliferirajo, ter vzdržujejo, ali celo spodbujajo vnetje s sproščanjem rastnih faktorjev in citokinov, ki vplivajo na razmnoževanje in migracijo gladko mišičnih celic (GMC) v rastočo aterosklerotično leho (slika 1B). Vplivajo tudi na izražanje encimov, kot so metaloproteinaze matriksa (MMP), ki razgrajujejo arterijski zunajcelični matriks in z razgradnjo kolagena mehčajo fibrozni čep na površini ateroma, ter ga s tem naredijo dovzetnega za to, da poči. Zmanjša se tudi sama sinteza kolagena. Makrofagi in limfociti T izločajo tkivni faktor, ki je ena poglavitnih koagulantnih substanc. Če aterosklerotična leha poči, tkivni faktor ob stiku s krvjo povzroči nastanek tromba, ki je povzročitelj večine akutnih zapletov, ki nastanejo pri aterosklerozi (slika 1C) (5). Slika 1: Vloga vnetja v vseh stopnjah ateroskleroze. 1A: Zbiranje monocitov na mestu ateroma, njihova migracija v intimo in nastanek penastih celic. 1B: Proliferacija GMC in njihova migracija v intimo. 1C: Nastanek fibroznega čepa, ki lahko pod vplivom različnih citokinov poči. Ob stiku tkivnega faktorja s krvjo nastane tromb. (Prirejeno po (5)) Študije, ki so bile izvedene v zadnjem času, so pokazale da imajo številni vnetni označevalci napovedno vrednost za nastanek sprememb v žilju, ter imajo sinergistično delovanje z že znanimi faktorji tveganja za nastanek ateroskleroze, kot so dislipidemija, kajenje, debelost in hipertenzija. Oksidacija LDL in modifikacija ostalih lipoproteinov povzroči povečano izražanje vnetnih citokinov in drugih mediatorjev vnetja v žilah. Angiotenzin II lahko preko aktivacije vnetne kaskade in aterogeneze vodi do hipertenzije, hiperglikemija pri diabetesu pa je povezana s povečano produkcijo vnetnih citokinov, ki jih 2

10 proizvajajo žilne endotelijske celice. Pri debelosti adipozno tkivo proizvaja citokine kot sta dejavnik tumorske nekroze alfa (TNF-α) in interlevkin-6 (IL-6), ter tako spodbuja aterogenezo (6). Študije pa so pokazale tudi, da lahko z zavrtjem vnetnih mediatorjev aterosklerozo upočasnimo. Modifikacije znanih faktorjev tveganja lahko znižajo koncentracijo krožečih vnetnih mediatorjev in izboljšajo funkcijo endotelija (7). 1.2 SISTEMSKE AVTOIMUNSKE BOLEZNI Med sistemske avtoimunske bolezni prištevamo več kot 200 bolezni in sindromov. Revmatične bolezni brez prisotnosti vnetja, kot je osteoartroza, so pogostejše kakor vnetne sistemske avtoimunske bolezni in imajo boljšo prognozo. Približno 5 % populacije trpi za kroničnimi vnetnimi avtoimunskimi boleznimi, kamor spada tudi revmatoidni artritis (RA) (8). Bolniki, posebej tisti s poudarjeno vnetno komponento, imajo večje tveganje za nastanek srčno-žilnih bolezni, ter večjo smrtnost zaradi le-teh. Do njih pride zaradi napredovane ateroskleroze, ki je pogosto prisotna pri sistemskih avtoimunskih boleznih. Za njen nastanek so lahko odgovorni tradicionalni faktorji tveganja, ki so prisotni tudi pri zdravi populaciji, kot tudi drugi, na primer hiperkoagulabilno stanje krvi, zaradi česar obstaja večja možnost razvoja komplikacij, bolniki pa imajo pogosto tudi spremenjen serumski lipidni profil v aterogenega. Potrebno je upoštevati tudi kumulativno dozo prejetih kortikosteroidov, ki imajo učinke na nivo trigliceridov, metotreksata (poviša nivo homocisteina) in ostalih zdravil, saj je terapija pri revmatskih boleznih ponavadi doživljenjska. Pri revmatičnih bolnikih zasledimo vrsto protiteles, ki so jih povezali z razvojem ateroskleroze, poleg tega sami imunski kompleksi aktivirajo endotelijske celice (9, 10). V zadnjem desetletju se je močno povečalo razumevanje patofiziološkega ozadja teh obolenj, zato je prišlo do vpeljave številnih novih pristopov za zdravljenje. Danes so poleg antirevmatikov, ki modificirajo potek bolezni (disease modifying antirheumatic drugs DMARD), kot je metotreksat, v uporabi biološka zdravila, katerih tarča so različni citokini in celični receptorji, in s katerimi dosežemo remisijo pri približno 70 % bolnikov. Vendar pa je za izboljšanje kvalitete in trajanja življenja pacientov najpomembnejša zgodnja diagnoza, s katero preprečimo poškodbe posameznih organov, ki nastanejo tekom bolezni (8). 3

11 1.3 VNETJE Vnetje je aktiven odziv imunskega sistema na okužbo ali poškodbo. Lahko ima različne morfološke posebnosti, ki so odvisne od vnetnega povzročitelja, jakosti vnetnega dražljaja in lokacije v telesu. Nastanek vnetja je del naravnega imunskega odziva organizma. Na takšen način se iz telesa odstranijo patogene snovi, pride pa tudi do zacelitve tkiva in povrnitve njegove fiziološke funkcije. V akutni fazi vnetja, takoj po poškodbi, se razširijo žile, poveča pa se tudi njihova prepustnost. Aktivirajo se nevtrofilci, ki fagocitirajo patogene mikrobe in sproščajo mediatorje, ki prispevajo k vnetju. Sledijo jim monociti, ki nato dozorijo v vnetne makrofage in kasneje proliferirajo. Makrofagi izločajo citokine (IL- 1, IL-6, TNF-α), ki povzročijo vidne znake vnetja, kot so rdečina, toplota, otekanje in bolečina. Ko je vnetni stimulus odstranjen iz telesa s fagocitozo, se vnetna reakcija zmanjša in nato izgine. Med umiritvijo vnetja se granulociti izločijo, makrofagi in limfociti se vrnejo v stanje pred vnetjem, njihovo število pa se zmanjša. Izid akutnega vnetja je večinoma uspešna zacelitev tkiva, lahko pa pride tudi do nadaljevanja vnetja in disfunkcije v vnetnem odzivu, kar lahko vodi k brazgotinjenju in do izgube funkcije organa. Motnje v prekinitvi akutnega vnetnega odziva lahko vodijo k avtoimunosti, prehodu v kronično vnetje in obsežni poškodbi tkiva. Kronično vnetje je značilno za številne avtoimunske bolezni, kjer lastni antigeni neprestano aktivirajo celice T. Za razvoj kroničnega vnetja sta najpomembnejša citokina interferon γ (IFN-γ) in dejavnik tumorske nekroze α (TNF-α). Najpomembnejša lastnost IFN-γ je njegova zmožnost aktivacije makrofagov, njihovo nakopičenje pa pri kroničnem vnetju veliko prispeva k okvari tkiva v okolici, saj sproščajo hidrolitične encime in dušikove presnovke. TNF-α spodbudi žilne endotelijske celice k izražanju adhezivnih molekul, kar povzroči nakopičenje levkocitov v vnetišču in jih tudi aktivira, ter spodbudi mononuklearne fagocite k izločanju citokinov in kemokinov (11) (12). Prostaglandini imajo pomembno vlogo pri vnetnem odzivu. Njihova sinteza v vnetem tkivu je močno povečana, pripomorejo pa tudi k primarnim kliničnim znakom vnetja. 4

12 1.3.1 Biosinteza prostaglandinov Prostaglandini in tromboksan A 2 (TXA 2 ), ki jih skupaj imenujemo prostanoidi, nastanejo, ko aktivirana fosfolipaza A 2 iz plazemske membrane odcepi arahidonsko kislino, s katero je zaestren glicerol v fosfolipidih, gradnikih celičnih membran. Prostaglandin G/H sintetaza oziroma ciklooksigenaza (COX) jo nato lahko metabolizirata naprej. Nastajajo štiri osnovne vrste prostaglandinov: prostaglandin E 2, (PGE 2 ), prostaciklin (PGI 2 ), prostaglandin D 2 (PGD 2 ) in prostaglandin F 2α (PGF 2α ). Prisotni so vsepovsod, navadno pa posamezen celični tip proizvaja en ali dva dominantna produkta. Delujejo kot avtokrini in parakrini lipidni mediatorji in vzdržujejo homeostazo v telesu. Med akutnim vnetjem, tik pred prihodom levkocitov in infiltracijo imunskih celic, se njihova sinteza močno poveča, medtem ko je njihova produkcija v tkivu, kjer ni vnetja, navadno majhna. Posamezni prostaglandini se razlikujejo v svojih učinkih, vendar imajo kot skupina značilno protivnetno delovanje z vazodilatacijo, zvečano kapilarno permeabilnostjo in bolečino, potencirajo pa tudi delovanje drugih mediatorjev vnetja. Arahidonska kislina se pod vplivom lipoksigenaz lahko metabolizira tudi do levkotrienov (LT), ki delujejo podobno (zvečajo vaskularno permeabilnost in so močni kemotaktični agensi) (1, 12) ali do lipoksinov, ki delujejo protivnetno (13) Serumski amiloid A Serumski amiloid A (SAA) je družina visoko ohranjenih akutno-faznih proteinov, ki se sintetizirajo predvsem v jetrih, kot odziv na stimulacijo s citokini, kot so TNF-α, IL-1 in IL-6. Vendar pa SAA sintetizirajo tudi celice, ki imajo vlogo pri razvoju ateroskleroze, kot so gladke mišične celice (GMC), endotelijske celice, makrofagi in adipociti (14). SAA ima pri človeku relativno molekulsko maso približno 12 kda in je dolg aminokislin. SAA družina vsebuje dve inducibilni akutno fazni izoobliki, SAA-1 in SAA-2, ki so ju v preteklosti s skupnim imenom imenovali akutno-fazni SAA (A-SAA, danes imenovan SAA 1/2) in konstitutivno izoobliko SAA-4, ki je le 52 % podoben akutno-faznima (15). Izoobliko SAA-3 so pri ljudeh našli izraženo le v mlečnih žlezah in ni del akutno-faznega odziva organizma. Pri nastanku reakcije akutne faze se količina SAA lahko poveča za sto do tisočkrat in v krvi doseže koncentracijo tudi 1 mg/ml. V tem stanju lahko ostane do štiri dni po pričetku vnetja, koncentracija pa se na osnovno raven navadno vrne po enem do dveh tednih. Povečana produkcija SAA je vsota povečane transkripcije in povečane 5

13 stabilnosti mrna (14). Med akutno fazo vnetja SAA postane najbolj prevalenten apolipoprotein vezan na lipoprotein visoke gostote (HDL), kjer nadomesti apoai in predstavlja do 80 % proteinov, vezanih na HDL. Pri tem ima kompleks SAA/HDL večjo afiniteto za makrofage in manjšo za hepatocite. Kompleksiran SAA v makrofagu povzroči zavrtje encima acetil koencim A holesterol acetitransferaze (ACAT) in aktivacijo nevtralne holesterol ester hidrolaze (nceh), veča izražanje ATP-vezočega kasetnega transporterja 1 (ABCA1) in zvišuje še druge od ABCA neodvisne poti izločanja holesterola. Rezultat tega je večje izločanje ne-esterificiranega holesterola iz celice in manjše shranjevanje holesterolnih estrov. Tako naj bi imel SAA pospeševalno vlogo pri reverznem transportu holesterola, s čimer pomaga organizmu v akutni fazi in je zaščiten pri procesu ateroskleroze (16). Potrebno je omeniti tudi druge funkcije HDL delca, ki so v akuti fazi lahko spremenjene zaradi vezanega SAA. HDL ima antioksidativno in protivnetno aktivnost, deluje citoprotektivno ter igra vlogo v agregaciji in vazomotoriki. Sprememba teh funkcij HDL ima lahko patološke posledice. Znano je, da stanja s spremenjenim HDL (vnetje, infekcije, oksidativni stres, dislipidemije) spodbujajo napredovanje ateroskleroze. Mogoče je torej, da spremembe v HDL zaradi SAA igrajo vlogo v napredovanju ateroskleroze, kljub verjetni pomoči pri reverznem transportu holesterola (17). Vendar pa kljub vsem navedenim dejstvom še vedno ni dokončno pojasnjeno, kakšna je vloga SAA v razvoju ateroskleroze. Veliko raziskav povezuje bolezni, pri katerih je prisotno kronično vnetje, kot so metabolni sindrom, diabetes, RA in SLE s povečano koncentracijo SAA. Prav tako so te bolezni povezane s povečanim tveganjem za nastanek srčno-žilnih bolezni, ki jih ne moremo pojasniti s tradicionalnimi faktorji tveganja. Zvečane vrednosti SAA so dokazali pri nestabilni angini pektoris (18). Pri akutnem koronarnem sindromu SAA napoveduje umrljivost (19). SAA je tudi neodvisni napovedni dejavnik smrtnosti po MI (20). Biološki učinki SAA še vedno niso popolnoma raziskani, vendar bi naj imel nekatere potencialno aterogene lastnosti (14). Spodbuja kemotakso monocitov, fagocitov, T celic in mastocitov na mesto vnetja, ter stimulira produkcijo vnetnih citokinov, kot sta IL-1β in TNF-α, kemokinov (IL-8), vnetnega regulatorja nuklearnega faktorja-κb (NF-κB) ter produkcijo ciklooksigenaz v endotelijskih celicah, sinoviocitih in fibroblastih. SAA inducira zunajcelične MMP in kolagenaze, ki razgrajujejo zunajcelični matriks, kar lahko prispeva k nestabilnosti aterosklerotične lehe in pretrganju ateroma. Spodbujal naj bi tudi trombozo z vplivom na tkivni faktor (18). 6

14 1.4 NEKATERE KLJUČNE MOLEKULE, KI SODELUJEJO PRI PROCESU ATEROSKLEROZE Molekule z vplivom na iniciacijo ateroskleroze Interlevkin 6 (IL-6) Je kda velik multifunkcionalen citokin, ki ima pomembno vlogo pri regulaciji imunskega odziva, pri vnetju in hematopoezi. Motnje v njegovi regulaciji lahko vplivajo na nastanek imunsko pogojenih vnetnih bolezni, kot je RA (21). Izločajo ga različni celični tipi, kot so celice T in B, monociti, fibroblasti in endotelijske celice, v odziv na različne vnetne stimuluse. Je poglavitni stimulator nastanka večine proteinov akutne faze v jetrih. Ti so odgovorni za imunski odziv organizma preko aktivacije komplementa, spodbujanja nastanka protivnetnih citokinov in stimulacije kemotakse nevtrofilcev. IL-6 je vpleten tudi pri nastanku povišane telesne temperature, imel pa naj bi tudi eno ključnih vlog pri prehodu akutnega vnetja v kronično (22). IL-6 inducira nastanek drugih vnetnih označevalcev, predvsem C reaktivnega proteina (CRP). Ta stimulira produkcijo MMP, ki destabilizirajo aterosklerotične lehe ter monocitnega kemotaktičnega proteina 1 (MCP-1). CRP prav tako zmanjša aktivnost endotelijske sintetaze dušikovega oksida (enos), kar zmanjša od endotelija odvisno vazodilatacijo. IL-6 pa naj bi imel tudi nekaj protivnetnih lastnosti, kot je zaustavitev sinteze vnetnih citokinov IL-1 in TNF-α. Je dobro poznan dejavnik tveganja za nastanek srčno-žilnih bolezni. Povečan je pri stenozi koronarnih žil, njegove povečane koncentracije pa najdemo tudi v aterosklerotičnih lehah. Dokazano je, da je napovedni faktor za nastanek ishemičnih dogodkov (7, 23) Interlevkin 8 (IL-8) Je 8 10 kda velik vodotopen peptid, ki spada v družino kemokinov CXC. Proizvajajo ga skoraj vse celice z jedrom, vendar so njegov glavni vir aktivirani monociti in makrofagi, ki ga izločajo kot odziv na različne patofiziološke pogoje in druge vnetne citokine. Je močan kemoatraktant, povzroči pa tudi direktno migracijo nevtrofilcev, bazofilcev in limfocitov T na mesto vnetja ter sproščanje histamina in levkotrienov iz bazofilcev. Njegova posebnost je, da se na mestu akutnega vnetja pojavi hitro ob začetku imunskega odziva in tam ostane zelo dolgo, celo nekaj tednov (24). Pri RA njegova povečana koncentracija povzroči kopičenje nevtrofilcev v sinovijski tekočini in s tem prispeva k njenemu vnetju (25). Ker ima pomembno vlogo v imunskem odzivu in pri avtoimunosti, je v organizmu močno 7

15 reguliran. V normalnem tkivu je njegova količina zelo majhna ali celo nezaznavna. Njegove povečane vrednosti v organizmu so prav tako povezane s povečanim tveganjem za koronarno arterijsko bolezen. Produkcijo IL-8 povečajo IL-1, TNFα, IL-6, IFNγ, lipopolisaharidi (LPS), reaktivne kisikove spojine in celični stres. Glavna inhibitorja njegove produkcije sta IL-4 in IL-10 (26) Granulocitno-makrofagne kolonije stimulirajoči faktor (GM-CSF) GM-CSF je multifunkcionalen citokin, ki ga proizvajajo makrofagi, fibroblasti, endotelijske celice, alveolarne epitelijske celice in aktivirane celice T, kot odziv na vnetne citokine. Je mitogen in kemoatraktant. Spada med hematopoetske rastne dejavnike in je odgovoren za preživetje, proliferacijo, diferenciacijo in delovanje mieloidnih celic (27). V zadnjih letih je bilo ugotovljeno, da je tudi eden ključnih vnetnih citokinov med vnetno reakcijo in med odzivom na okužbo. Vpliva na nastanek granulocitov in monocitov iz matičnih celic, ki nato dozorijo v makrofage in dendritične celice, pri makrofagih tudi zavira apoptozo. Prav tako lahko GM-CSF aktivira fagocite in vpliva na njihovo delovanje (28). Ker je GM-CSF del imunskega odziva, se v velikih količinah nahaja v vnetih sklepih pri RA. Sodeluje pri sproščanju signalnih molekul (iz granulocitov in makrofagov), ki preko kaskade reakcij aktivirajo limfocite B in T, kar še poveča produkcijo vnetnih molekul. Zaradi njegove vloge pri vnetju in pri avtoimunskih boleznih je nevtralizacija GM-CSF postala nova možna tarča za zdravljenje RA in nekaterih drugih vnetnih bolezni (25) Adhezijske molekule Specifične interakcije med molekulami na površini levkocitov in molekulami na površini potencialnih tarč, so pomemben mehanizem medcelične komunikacije. Te molekule imenujemo adhezijske molekule in imajo pomembno vlogo pri vnetju in pri nastanku nekaterih neoplazem (29). So transmembranski glikoproteini, razdelimo pa jih v tri družine: selektine, imunoglobulinsko superdružino in integrine. Proces adhezije levkocitov na endotelij je sestavljen iz več korakov, njegov končni cilj pa je čvrsta adhezija tarčne molekule na endotelijske celice (30). a) Intercelularna adhezijska molekula 1 (ICAM-1) ICAM-1 poznana tudi kot skupek diferenciacije 54 (CD54) je transmembranski celični glikoprotein, ki je v fizioloških pogojih v majhnih količinah konstitutivno izražen na endotelijskih in epitelijskih celicah, levkocitih in fibroblastih. Zgrajen je iz petih 8

16 imunoglobulinskih domen (D1-D5), kratkega transmembranskega dela in C-terminalnega citoplazemskega dela. Vloga ICAM-1 je zagotavljanje adhezije med endotelijskimi celicami in levkociti po poškodbi, zato se njeno izražanje močno poveča ob stimulaciji s citokini, kot so IFN-γ, IL-1 in TNF-α, kar poveča adhezijo levkocitov na endotelijske celice na mestu vnetja (29). Izražanje ICAM-1 je dokazano povečano v aterosklerotičnih lehah, z njeno inhibicijo pa lahko aterogenezo upočasnimo (7). b) Žilno celična adhezivna molekula 1 (VCAM-1) VCAM-1, poznana tudi kot skupek diferenciacije 106 (CD106), povzroča adhezijo večine vnetnih celic, kot so monociti, limfociti, eozinofilci na endotelijske celice in privablja monocite na mesta, kjer se je proces ateroskleroze že začel (7). Vsebuje šest ali sedem imunoglobulinskih predelov, izražajo pa jo aktivirane endotelijske celice. Njeno ekspresijo prav tako, kot ekspresijo ICAM-1 povečajo nekateri citokini. Povečana ekspresija VCAM- 1 je značilna za številne bolezni, med drugim RA in aterosklerozo (29) Molekule, ki sodelujejo v končni fazi ateroskleroze Inhibitor aktivatorja plazminogena 1 (PAI-1) Inhibitor aktivatorja plazminogena 1, poznan tudi kot serpin E1, spada v skupino inhibitorjev serinskih proteaz in je 50 kda velik glikoprotein. Je inhibitor tkivnega in krvnega aktivatorja plazminogena (u-pa in t-pa), ki pretvarjata neaktiven plazminogen v aktiven plazmin, ta pa nato razgrajuje vezi fibrina v procesu fibrinolize. Zmanjšuje tudi od plazmina odvisno aktivacijo MMP (31). Povečane koncentracije PAI-1 v plazmi prispevajo k nastanku trombotičnih zapletov, kot sta MI in hipertromboza, kot tudi k nastanku fibrotičnih zapletov, kot je ateroskleroza. Odgovoren naj bi bil tudi za spodbujanje napredovanja žilnih bolezni. PAI-1 proizvajajo številne celice v telesu, kot so hepatociti, žilne endotelijske celice in GMC. Navadno je v plazmi prisoten v majhnih koncentracijah, njegova koncentracija pa se poveča pri stimulaciji s fibrotičnimi dejavniki, kot je tkivni rastni dejavnik β (TGFβ) in ob prisotnosti nekaterih vnetnih mediatorjev, kot so TNFα, IL- 1β in LPS (32). 9

17 1.4.3 Nekatere druge molekule, ki sodelujejo pri vnetju Ciklooksigenaza (COX) COX je bifunkcionalni encim, s ciklooksidazno in peroksidazno aktivnostjo. Nahaja se v dveh izooblikah, COX-1 in COX-2. Oba izoencima pripomoreta k avtoregulaciji in homeostazi nastanka prostanoidov in oba imata vlogo pri njihovem sproščanju ob vnetju. COX-1 je konstitutivna izoforma encima ciklooksigenaze, prisotna v večini tkiv. Je glavni vir prostanoidov, ki uravnavajo osnovne telesne funkcije, kot so homeostaza, citoprotektivna funkcija in vzdrževanje funkcije črevesnih epitelnih celic. COX-2 je inducibilna izoforma encima ciklooksigenaze. Pojavlja se na mestu vnetja in pri proliferativnih boleznih, njen nastanek pa stimulirajo vnetni mediatorji, hormoni in rastni dejavniki. Je torej pomemben vir nastanka prostanoidov pri vnetju kakor tudi pri raku (12) Receptor, aktiviran s proliferatorjem peroksisomov γ (PPARγ) PPARγ je transkripcijski faktor, ki ga aktivirajo ligandi. Spada v družino jedrnih receptorjev. Poznamo tri vrste receptorjev PPAR - α, β/δ in γ. Vsi igrajo pomembno vlogo pri metabolizmu, vendar vsak deluje drugače. Zgrajeni so iz domen, ki so podobne kot pri drugih članih družine nuklearnih receptorjev in vključujejo: N-terminalno AF1 trans aktivacijsko domeno, domeno za vezavo DNA in domeno za vezavo liganda, ki se nahaja na C terminalnem delu. PPARγ se nahaja v štirih izoformah, ki se izražajo v številnih tkivih in v endotelijskih celicah (γ4). Strukturno so podobni steroidnim in tiroidnim hormonskim receptorjem, stimulirajo pa jih majhni lipofilni ligandi, kot so na primer nasičene maščobne kisline, 15- deoksi-δ12,14-prostaglandin J 2 (15d-PGJ 2 ) in oksidiran LDL (2). Njihovi potencialni sintetični agonisti so tiazolidindioni (TZD) in substituirane karboksilne kisline. Imajo pomembno vlogo pri diferenciaciji adipocitov in pri rezistenci na inzulin. Ker pa se PPARγ izražajo tudi v žilnih endotelijskih celicah, gladkih mišičnih celicah, makrofagih in kardiomiocitih, ter ker imajo posamezniki z diabetesom tipa 2 povečano tveganje za nastanek srčno-žilnih bolezni, je srčno-žilna funkcija PPAR pod drobnogledom (33) (34). 10

18 1.5 ZDRAVILA, UPORABLJENA PRI REVMATIČNIH IN NEKATERIH KRONIČNIH BOLEZNIH Revmatični bolniki pri zdravljenju prejemajo kombinacije različnih zdravil. Najpogosteje so to zdravila iz skupine DMARD, nesteroidni antirevmatiki (NSAR), kortikosteroidi in inhibitorji TNFα. Poleg tega pogosto prejemajo še druga zdravila za kronične bolezni, ki imajo potencialno protivnetno delovanje (preglednica I, II). Preglednica I: Učinkovina, molska masa, molekulska formula, strukturna formula in tarča delovanja proučevanih zdravil, ter zdravila, registrirana v Sloveniji, ki to učinkovino vsebujejo. Učinkovina, molska masa in molekulska formula Zdravila Strukturna formula Tarča delovanja deksametazon C 22 H 29 FO 5 Mr = 392,5 g/mol Dexamethason Krka glukokortikoidni in mineralokortikoidni receptorji kaptopril C 9 H 15 NO 3 S Mr = 217,3 g/mol Kaptopril Krka Kaptopril Alkaloid angiotenzin konvertaza etorikoksib C 18 H 15 ClN 2 O 2 S Mr = 358,8 g/mol Arcoxia COX-2 11

19 meloksikam C 14 H 13 N 3 O 4 S 2 Mr = 351,4 g/mol metotreksat C 20 H 22 N 8 O 5 Mr = 454,4 g/mol Movalis Celomix Lormed Meloxan Mel. Arrow Mel. Mylan Methotrexat Ebewe Metotreksat Lederle Metoject (COX-1) COX-2 dihidrofolat reduktaza natrijev diklofenakat C 14 H 10 Cl 2 NNaO 2 Mr = 318,1 g/mol natrijev fluvastatinat C 24 H 25 FNNaO 4 Mr = 433,4 g/mol Naklofen duo Diclo Duo DicloJet Olfen Voltaren Lescol Fluvastatin Actavis Fluvastatin Mylan Galistat Vuyator (COX-1) COX-2 HMG-CoA reduktaza rosiglitazon C 18 H 19 N 3 O 3 S Mr = 357,428 g/mol / PPARγ 12

20 1.5.1 Deksametazon Uporablja se za zdravljenje revmatskih bolezni pri bolnikih, kjer z nesteroidnimi antirevmatiki (NSAR) nismo dosegli zadovoljivega učinka, ter za zdravljenje številnih drugih bolezni, povezanih s prekomernim imunskim odzivom organizma (35). Deksametazon je sintetični kortikosteroid z glukokortikoidnim delovanjem, ki deluje na celični ravni preko spreminjanja izraznosti številnih genov. Preko glukokortikoidnih receptorjev uravnavajo kortikosteroidi protivnetno in imunosupresivno delovanje ter glukozno homeostazo. Ker se glukokortikoidni receptorji nahajajo v vseh tkivih, hormoni delujejo na večino telesnih celic (35). Transkripcijska faktorja NF-κB in aktivatorski protein 1 (AP-1) sta najpomembnejša pri indukciji genov molekul, udeleženih pri vnetju ter poškodbi sklepov. Udeležena sta tudi pri nastanku številnih bolezni, povezanih s kroničnim vnetjem (ateroskleroza) in pri nastanku avtoimunskih obolenj, kot je RA. Glukokortikoidi z njima fizično reagirajo in na ta način blažijo vnetni odziv. Zavirajo nastajanje nekaterih vnetnih citokinov, kot so IL-6, IL-12 in TNF-α in stimulirajo nastanek protivnetnih citokinov, kot so IL-4, IL-10 in TGF-β (36). Zavirajo pa tudi delovanje fosfolipaze A 2 preko sinteze lipokortina-1 in s tem zmanjšajo nastanek levkotrienov ter prostaglandinov. Zavirali naj bi tudi samo ciklooksigenazo, kar še potencira njihovo protivnetno delovanje (37). Vendar pa je bilo ugotovljeno tudi, da velike koncentracije deksametazona povečajo ekspresijo adhezijskih molekul (ICAM, VCAM) in PAI-1 ter s tem vplivajo na koagulacijo. Dolgotrajna uporaba večjih koncentracij deksametazona zato poveča možnost za nastanek trombotičnih zapletov in nastanka srčno-žilnih bolezni (38) Fluvastatin Uporablja se za zdravljenje primarne hiperholesterolemije ali mešane dislipidemije, ter sekundarno za preprečevanje nastanka ishemičnih srčno-žilnih bolezni. Fluvastatin je kompetitiven zaviralec HMG-CoA reduktaze, ki je odgovorna za pretvorbo HMG-CoA v mevalonat, predstopnjo sterolov, med katere sodi tudi holesterol. Zaviranje biosinteze holesterola zmanjšuje količino holesterola v jetrnih celicah, kar spodbuja sintezo receptorjev LDL in povečuje privzem LDL-a. Končni rezultat teh mehanizmov je znižanje plazemske koncentracije holesterola (35). 13

21 Klinične raziskave so pokazale, da statini znižujejo smrtnost zaradi srčno-žilnih dogodkov in pogostost pojavljanja srčno-žilnih dogodkov, ki niso življenjsko ogrožajoči. Njihov pleiotropni efekt naj bi bil razlog za kardioprotektivno delovanje, ki ga imajo in za zmanjšanje vnetnega odziva organizma. Preko njega naj bi statini izboljšali endotelijsko funkcijo žil, zmanjšali vnetni odziv v njih in celo stabilizirali aterosklerotične lehe. Ti njihovi učinki naj bi bili pogojeni s sposobnostjo zaviranja sinteze izoprenoidov, ki je pomembna za celične signalne molekule, kot sta proteina G - Rho in Rac. Ta vplivata na številne celične procese, kot so apoptoza, celična diferenciacija in proliferacija. Statini prav tako inhibirajo proliferacijo GMC. Z inhibicijo sinteze izoprenoidov povečajo tudi ekspresijo enos, katere zmanjšane koncentracije so eden prvih znakov ateroskleroze. Statini lahko protivnetne učinke izkazujejo tudi z zmanjšanjem ekspresije endotelijskih adhezivnih molekul, kot so ICAM-1, VCAM-1 in E-selektin v aterosklerotičnih lehah. S povečanjem produkcije NO zmanjšajo tudi adhezijo levkocitov in njihovo migracijo v žilno steno. Zmanjšujejo pa tudi agregacijo trombocitov, saj povečajo koncentracijo trombomodulina in t-pa v žilah (39-41). Statini značilno znižajo koncentracijo CRP, neodvisno od znižanja koncentracije LDL holesterola ter inducirajo tudi transkripcijsko aktivnost PPARγ v makrofagih. Inhibirajo TNF-α in MCP-1, ter zavrejo transkripcijsko aktivnost NF-κB in AP-1 preko PPARα in PPARγ, njihova sočasna aplikacija s PPARγ agonisti pa naj bi vplivala na regresijo aterosklerotičnih leh. Preko PPARα in PPARγ statini povečajo tudi izražanje ABCA1 in CD36 mrna, kar vpliva na reverzni transport holesterola (42). Fluvastatin v terapevtski koncentraciji poveča izražanje COX-1 mrna in zniža izražanje COX-2 mrna, pri večjih koncentracijah pa zmanjša izražanje obeh izoencimov (43) Inhibitorji dejavnika tumorske nekroze α (TNF-α inhibitorji) Inhibitorji dejavnika tumorske nekroze α (TNF-α) so protivnetna zdravila, ki se uporabljajo za zdravljenje različnih vrst revmatoidnih obolenj. So monoklonska protitelesa, razlikujejo se po načinu izdelave in po zgradbi. V telesu se vežejo na TNF-α, ki sodeluje pri vnetjih in ga v velikih količinah najdemo pri bolnikih z RA, ter s tem ublažijo vnetje in druge simptome bolezni (preglednica II) (35). 14

22 Preglednica II: Pregled TNF α inhibitorjev glede na učinkovino, zgradbo in molekulsko ali molsko maso, ter zdravila, registrirana v Sloveniji, ki to učinkovino vsebujejo. Učinkovina Zdravilo Zgradba Molekulska ali molska masa adalimumab Humira Rekombinantno človeško antitnf IgG1 monoklonsko protitelo Mr = ,3 g/mol certolizumab pegol Cimzia Rekombinanten humaniziran Fab' fragment, konjugiran s polietilenglikolom Mr = 47,75 kda etanercept Enbrel Dimer receptorja TNFR2/p75 in Fc fragmenta IgG1 golimumab Simponi Človeško IgG1κ monoklonsko protitelo, proizvedeno z rekombinantno DNA metodo Mr = 51234,9 g/mol Mr = 147 kda TNF-α je 17 kda velik pluripotenten citokin, ki je v telesu prisoten v topni obliki, ali pa je vezan na celično membrano (44). Izločajo ga številne celice, na primer makrofagi, celice T in celice ubijalke, kot odziv na različne vnetne dražljaje. Odgovoren je za oblikovanje in posredovanje številnih bioloških učinkov. Pri majhnih koncentracijah spodbudi žilne endotelijske celice k izražanju površinskih adhezivnih molekul, aktivira vnetne levkocite in spodbudi mononuklearne fagocite k izločanju vnetnih citokinov in kemokinov. V velikih koncentracijah deluje kot endokrini hormon. TNF-α je udeležen v patogenezi RA. Njegovo transgensko izražanje povzroči razvoj artritisa, protitelesa proti TNF-α pa njegov nastanek preprečijo, kar kaže na to, da je eden ključnih citokinov pri nastanku RA (11). TNF-α inhibitorji imajo tudi velik vpliv na ožilje. Vplivajo na lipidni profil, zvečajo koncentracijo HDL holesterola, povečajo razmerje LDL/HDL, značilno zmanjšajo produkcijo CRP in IL-6, kar vpliva na zmanjšano tveganje za srčno-žilne zaplete pri 15

23 bolnikih s kroničnimi vnetnimi boleznimi. Prav tako se ob njihovi uporabi znižajo plazemske koncentracije nekaterih adhezijskih molekul (E-selektin, ICAM), s čimer se izboljša funkcija endotelija (45). Izboljšajo tudi celokupno debelino intime in medije pri aterosklerozi karotidne arterije (ccimt) in vplivajo na zatrditev arterije, ki ima veliko napovedno vrednost za nastanek srčno-žilnih dogodkov. Raziskave kažejo, da značilno zmanjšajo pojav MI in podaljšajo čas do nastanka prvega srčno-žilnega zapleta. V večini primerov je njihova kratkotrajna uporaba izboljšala endotelijsko funkcijo, vendar pa so ob dolgotrajni uporabi učinki izzveneli (46) Kaptopril Namenjen je zdravljenju vseh oblik arterijske hipertenzije, srčnega popuščanja, disfunkcije levega prekata in preprečevanju ledvične odpovedi pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo. Njegovo pozitivno delovanje na uravnavanje pritiska, in s tem posredno tudi na aterogenezo, je rezultat delovanja na reninsko-angiotenzinsko-aldosteronski sistem (35). Kaptopril je specifični kompetitivni zaviralec angiotenzin konvertaze (ACE), encima, ki se nahaja predvsem v endotelijskih celicah in pretvarja dekapeptid angiotenzin I v oktapeptid angiotenzin II, ki je močan vazokonstriktor (47). Angiotenzin II stimulira tudi izločanje aldosterona ter s tem prispeva k retenciji natrija in tekočine. Posledica inhibicije ACE je zmanjšana koncentracija angiotenzina II v plazmi ter povečana plazemska aktivnost renina, s čimer pride do izločanja natrija in vode iz telesa. ACE je identičen bradikinazi, zato kaptopril zmanjša tudi razgradnjo vazopresivnega peptida bradikinina, ki ima antihipertenzivne, antitrombogene, antiproliferativne in antifibriogene učinke. Bradikinin sodeluje tudi pri vnetju, saj aktivira endotelijske celice, kar poveča vazodilatacijo in žilno prepustnost, pri čemer pride do nastanka klasičnih simptomov vnetja (48). Molekulska formula kaptoprila ima podobnosti s formulo D-penicilamina - obe vsebujeta tiolno skupino, zato ima kaptopril tudi rahlo imunosupresivno delovanje, kar je ugodno pri zdravljenju RA (49). V nekaterih študijah je kaptopril znižal infiltracijo z vnetnimi celicami in vplival na koncentracije TNF-α, PGE 2, NO in MCP-1 v telesnih tekočinah, kar nakazuje na to, da naj bi kaptopril zaviral vnetje z vplivom na aktivacijo NF-κB (50). ACE inhibitorji povečajo tudi izražanje COX-2 v endotelijskih celicah, na COX-1 pa nimajo znanega učinka (51). 16

24 1.5.5 Metotreksat Je pogosto uporabljeno zdravilo za zdravljenje artritisa pri odraslih bolnikih, pri katerih so indicirana zdravila iz skupine DMARD in kadar zdravljenje z NSAR ne zadošča. Je antagonist folne kisline, ki spada v razred citotoksičnih sredstev - antimetabolitov. Deluje s pomočjo kompetitivne inhibicije encima dihidrofolat reduktaze. Ni še povsem znano, ali je učinkovitost metotreksata pri obvladovanju vnetnih bolezni posledica protivnetnega ali imunosupresivnega učinka (35). Njegov glavni protivnetni učinek je povečanje zunajcelične koncentracije adenozina, ki je endogen protivnetni mediator, na mestih vnetja (52). Metotreksat izkazuje ateroprotektivne lastnosti s preprečevanjem kopičenja penastih celic in s povečanjem števila ABCA1 transporterjev, ki pomagajo pri izločanju odvečnega holesterola, kar izboljša lipidni profil ter zmanjša možnost za nastanek srčno-žilnih bolezni pri RA (53). Novejše raziskave kažejo, da zavira tudi nastanek adhezijskih molekul ICAM-1 in VCAM-1 v žilnih endotelijskih celicah.(54) Nesteroidni antirevmatiki (NSAR) Ciklooksigenaza je encim, odgovoren za sintezo prostaglandinov. Poznamo dve izoobliki encima, COX-1 in COX-2. Zaradi neželjenih učinkov zaviranja COX-1 so novejša zdravila usmerjena v selektivno zaviranje COX-2, kar se kaže kot zmanjšanje gastrointestinalne toksičnosti in agregacije trombocitov. Vendar pa je pri tem prišlo do povečanega tveganja za nastanek srčno-žilnih dogodkov pri bolnikih (55). COX-2 je odgovorna tudi za sintezo 15d-PGJ 2, ki je endogeni ligand PPARγ in zavira aktivnost vnetnih transkripcijskih faktorjev NF-κB, STAT3 in AP-1 (56). Povečane količine COX-2 najdemo tudi v aterosklerotičnih lehah, po navadi v kombinaciji z MMP, ki vplivajo na mehčanje lehe in tudi sama aktivnost COX-2 naj bi pospeševala nastanek ateroskleroze (57). V mišjih modelih so selektivni COX-2 inhibitorji zmanjšali ali celo odpravili zgodnje aterosklerotične lehe (58). a) Etorikoksib Spada v drugo generacijo selektivnih inhibitorjev COX-2, imenovanih koksibi (35). Pomaga ublažiti bolečino in vnetje sklepov in mišic pri bolnikih z revmatološkimi obolenji. V območju kliničnih odmerkov je peroralni selektivni zaviralec COX-2 ima 106 večjo selektivnost za COX-2. Vendar pa se je izkazalo, da etorikoksib do določene mere zavira antiagregatorni učinek aspirina na trombocite (55). Zavira tudi aktivacijo 17

25 transkripcijskih faktorjev NF-κB in CREB, kar zniža ekspresijo inos in COX-2 vendar nima vpliva na AP-1 (59). b) Natrijev diklofenakat Je nesteroidni antirevmatik, derivat fenilocetne kisline, namenjen za zdravljenje vseh oblik revmatskih obolenj in lajšanju različnih bolečin (35). Ima večjo afiniteto do COX-2 in tako kot večina COX-2 selektivnih inhibitorjev povečuje možnost za nastanek MI (60). Zavre z rosiglitazonom posredovano aktivacijo PPARγ in zniža izražanje adhezijskih molekul ICAM-1, VCAM-1 in E-selektina v nekaterih endotelijskih celicah (61, 62). c) Meloksikam Je NSAR iz skupine enolne kisline, indiciran za simptomatsko zdravljenje osteoartroze, RA in ankilozirajočega spondilitisa. In vivo meloksikam močneje zavira biosintezo prostaglandinov na mestu vnetja, kot v želodčni sluznici in ledvicah, kar pomeni, da ima večjo afiniteto do COX-2 (35). V primerjavi z diklofenakom imajo bolniki, ki se zdravijo z meloksikamom, manj trombotičnih zapletov (63) Rosiglitazon Rosiglitazon se je uporabljal za zdravljenje sladkorne bolezni tipa 2 pri odraslih. Je selektivni agonist za jedrni receptor PPARγ in sodi v tiazolidindionsko (TZD) skupino antidiabetikov. Glikemijo zmanjšuje tako, da zmanjšuje rezistenco adipoznega tkiva, skeletnih mišic in jeter na inzulin (35). TZD so najbolj preučevani ligandi PPARγ receptorja, katerega naravni ligand je tudi 15d- PGJ 2. Delujejo tako, da se vežejo na jedrne PPAR receptorje v tarčnih genih in vplivajo na njihovo transkripcijo. Novejše raziskave kažejo, da ima rosiglitazon tudi protivnetne učinke. Znižuje ekspresijo vnetnih citokinov in usmerja diferenciacijo imunskih celic k protivnetnemu fenotipu (33). NF-κB je signalna molekula, ki spodbuja vnetni odziv, njegovi inhibitorji pa ga zavirajo. Opazili so, da se ob jemanju rosiglitazona zmanjša količina NF-κB in poveča količina NF-κB inhibitorjev (64). V različnih raziskavah je bilo ugotovljeno, da PPARγ agonisti znižajo koncentracije CRP, SAA, E-selektina, IL-6, MCP- 1, TNFα, in IL-1β in s tem tudi aktivacijo makrofagov (65, 66). Z znižanjem izražanja adhezijskih molekul VCAM-1 in ICAM-1 zmanjšajo vnetje v endotelijskih celicah. Ekspresija PPARγ v makrofagih vpliva na proces ateroskleroze. In vivo študije so 18

26 pokazale, da PPARγ agonisti povečajo izločanje holesterola iz makrofagov in zavrejo nastanek penastih celic. Povečajo tudi ekspresijo CD36, ki je odgovoren za prevzem oksidiranega LDL. TDZ zavirajo proliferacijo, fibrozo in migracijo žilnih GMC ter pospešujejo njihovo apoptozo, kar je prav tako pomemben proces pri nastanku ateroskleroze. Povečajo tudi stabilnost aterosklerotičnih leh, s povečanjem količine kolagena in zmanjšanjem koncentracije MMP2 in MMP9 (34). Kljub vsemu so rezultati kliničnih študij vpliva PPAR agonistov na MI in število smrti, povezanih s srčno-žilnimi boleznimi nasprotujoči (2). 19

27 2. NAMEN, HIPOTEZA IN CILJI Bolniki s sistemskimi avtoimunskimi boleznimi (kot npr. revmatoidni artritis (RA)) imajo povečano tveganje za aterosklerozo in posledično tudi za razvoj srčno-žilnih bolezni. Veliko raziskav povezuje bolezni, pri katerih je prisotno kronično vnetje, kot je RA, s povečano koncentracijo SAA. Ker so bolniki z RA tudi na doživljenjski terapiji z antirevmatiki, je bil namen diplomske naloge testirati najpogosteje uporabljena zdravila, ki jih uporabljajo in preveriti njihov vpliv na vnetni odziv SAA-stimuliranih humanih endotelijskih celic koronarne arterije. Naša hipoteza je sledeča: Zdravila, kot so DMARD, kortikosteroidi, TNFα inhibitorji, NSAR, zdravila za znižanje holesterola, krvnega tlaka in antidiabetiki, modulirajo vnetni odziv SAA-stimuliranih HCAEC v kulturi. Specifični CILJI: I. Določitev vplivov: 1. DMARD in kortikosteroidov (metotreksat in deksametazon) 2. TNFα inhibitorjev (certolizumab pegol, adalimumab, golimumab in etanercept) 3. zdravil za zniževanje holesterola ter krvnega tlaka (fluvastatin in kaptopril) 4. NSAR (diklofenak, meloksikam in etorikoksib) 5. antidiabetikov (rosiglitazon) na proteinske nivoje izločenih molekul IL-6, IL-8, GM-CSF, sicam-1, svcam-1 ter PAI-1 iz SAA-stimuliranih HCAEC, izmerjenih z metodo ELISA. II. Določitev vplivov opisanih zdravil na izražanje mrna molekul IL-6, VCAM- 1, SAA, COX-2 ter PPARγ iz SAA-stimuliranih HCAEC izmerjenih s qpcr. III. Primerjava odzivov s SAA stimuliranih HCAEC na različne skupine zdravil. Proučiti smo nameravali tudi mehanizme za aktivacijo endotelija, ki bi nam lahko dali vpogled, v do sedaj še neopisane učinke zdravil in SAA na zgodnji stadij razvoja ateroskleroze. Rezultati bi lahko bili pomembni predvsem za bolnike s sistemskimi avtoimunskimi boleznimi, ki imajo povečano tveganje za razvoj ateroskleroze. 20

28 3. MATERIALI IN METODE 3.1 MATERIALI BIOLOŠKI MATERIAL o rekombinantni liofiliziran človeški apo-serumski amiloid A, 1g/L, Peprotech, New Jersey, ZDA o človeške endotelijske celice koronarne arterije (human coronary artery endothelial cells (HCAEC)), Lonza, Walkersville, Maryland, ZDA o goveji serumski albumin brez esencialnih maščobnih kislin, BSA Cohn Fraction V, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, ZDA o serum govejega ploda (Fetal Bovine Sera, FBS), Lonza, Walkersville, Maryland, ZDA o gojišče za HCAEC, Lonza, Walkersville, Maryland, ZDA, (Preglednica III) Preglednica III : Sestava gojišča za človeške endotelijske celice koronarnih arterij (HCAEC). GOJIŠČE SESTAVINA GOJIŠČA KOLIČINA popolno gojišče za HCAEC s 5 % FBS popolno gojišče za HCAEC z 0 % FBS osnovno gojišče EBM-2 (Endothelial Cell Basal medium- 2) rekombinantni humani epidermalni rastni dejavnik (hegf) Hidrokortizon gentamicinijev sulfat in amfotericin B (GA-1000) rekombinantni humani fibroblastni rastni dejavnik (hfgf-b) rekombinantni humani žilni endotelijski rastni dejavnik (VEGF) dolgi R3 rekombinantni inzulinu podobni rastni dejavnik 1 (R3-IGF-1) askorbinska kislina 500 ml 0,5 ml 0,2 ml 0,5 ml 2 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml + serum govejega ploda (Fetal Bovine Sera, FBS) 25 ml 21

29 3.1.2 ANALIZNI KOMPLETI o analizni komplet za določanje človeškega IL-6 z encimskoimunsko metodo (Immunoassay Kit Human IL-6), Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA, ki vsebuje: rekombinantni človeški IL-6 (Hu IL-6 Standard); 3,8 pg/1,51 ml pufer za redčenje standarda ( Standard Diluent Buffer); 25 ml mikrotitrsko ploščo, prekrito z rekombinantnimi monoklonskimi protitelesi proti človeškemu IL-6 (Hu-IL-6 Antibody Coated-Wells (96WP)) rekombinantno monoklonsko protitelo proti človeškemu IL-6, konjugirano z biotinom (Hu-IL-6 Biotin Conjugate); 6 ml kompleks streptavidin hrenova peroksidaza (Streptavidin-Peroxidase (HRP)), 100x koncentrirana raztopina; 0,125 ml pufer za redčenje kompleksa streptavidin - peroksidaza (Streptavidin-Peroxidase (HRP) Diluent); 25 ml spiralni pufer 25 koncentrirana raztopina (Wash Buffer Concentrate); 100 ml kromogen tetrametilbenzidin (Stabilized Chromogen tetramethylbenzidine); 25 ml raztopina za zaustavitev reakcije (Stop Solution), H 2 SO 4; 25 ml o analizni komplet za določanje človeškega IL-8 z encimskoimunsko metodo (Immunoassay Kit Human IL-8), Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA, ki vsebuje: rekombinantni človeški IL-8 (Hu IL-8 Standard); 18,3 ng/1,83 ml ostale sestavine kompleta so enake kot pri analiznem kompletu za določanje človeškega IL-6 z encimskoimunsko metodo, prilagojene za IL-8 o analizni komplet za določanje človeškega svcam-1 z encimskoimunsko metodo (Immunoassay Kit Human svcam-1), Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA, ki vsebuje: rekombinantni človeški svcam-1 (Hu svcam-1 Standard); 870 ng/1,60 ml ostale sestavine kompleta so enake kot pri analiznem kompletu za določanje človeškega IL-6 z encimskoimunsko metodo, prilagojene za svcam-1 o analizni komplet za določanje človeškega GM-CSF z encimskoimunsko metodo (Immunoassay Kit Human GM-CSF), Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA, ki vsebuje: 22

30 rekombinantni človeški GM-CSF (Hu GM-CSF Standard); 600 pg/ml ostale sestavine kompleta so enake kot pri analiznem kompletu za določanje človeškega IL-6 z encimskoimunsko metodo, prilagojene za GM-CSF o analizni komplet za določanje človeškega PAI-1 z encimskoimunsko metodo (Immunoassay Kit Human PAI-1), Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA, ki vsebuje: rekombinantni človeški PAI-1 (Hu PAI-1 Standard); 7200 pg/1,830 ml ostale sestavine kompleta so enake kot pri analiznem kompletu za določanje človeškega IL-6 z encimskoimunsko metodo, prilagojene za PAI-1 o analizni komplet za določanje človeškega sicam-1 z encimskoimunsko metodo (Immunoassay Kit Human sicam-1), Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA, ki vsebuje: standard sicam-1 (sicam-1 Standard); 10 ng/ml analizni pufer (Assay Buffer 20 ), PBS z 1 % Tween 20 in 10% BSA, 5 ml; 0,20 ml monoklonska anti-sicam-1 protitelesa, konjugirana s hrenovo peroksidazo (HRP- Conjugated anti-sicam-1 monoclonal (murine) antibody), 60 koncentrirana raztopina; 0,125 ml mikrotitrsko ploščo, prekrito z monoklonskimi protitelesi proti človeškemu sicam-1 (Hu-sICAM-1 Antibody Coated-Wells (96WP)) spiralni pufer (Wash Buffer), PBS z 1 % Tween 20; 50 ml raztopino za redčenje vzorcev (Sample Diluent); 50 ml substrat (Substrat Solution); 15 ml raztopino za zaustavitev reakcije (Stop Solution), H 3 PO 4; 15 ml Modro in zeleno barvilo; 0,4 ml o komplet za izolacijo RNA (RNeasy Plus Micro Kit), Qiagen, Hilden, Nemčija lizirajoči pufer z gvanidinijevo soljo (RLT plus pufer) pufer za spiranje I (RW1 Buffer) pufer za spiranje II (RPE Buffer) voda brez RNAz kolone za odstranitev gdna (gdna eliminator Mini Spin Columns) kolone za RNA (RNeasy MinElute Spin Columns) 23

31 zbiralne epruvetke (Collection Tubes): 1,5 ml, 2 ml o komplet za reverzno transkripcijo (Reverse Transcription System), Promega, Madison, WI, ZDA reverzna transkriptaza AMV (AMV Reverse Transcriptase (High Conc.)) rekombinantni ribonukleazni inhibitor (Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor) začetni oligonukleotidi (Oligo(dT)15 Primer (0.5 μg/μl)) mešanica deoksiribonukleotidtrifosfatov (dntp Mixture, 10 mm) pufer za reverzno transkripcijo, 100 mm Tris-HCl, 500 mm KCl, 1 % Triton X-100 (Reverse Transcription 10 X Buffer) magnezijev klorid (MgCl 2, 25 mm) voda brez nukleaz o komplet za verižno reakcijo s polimerazo Power SYBR Green (Power SYBR Green PCR Master Mix), Applied Biosystems, Warrington, VB, ki vsebuje: SYBR Green barvilo številka I (SYBR Green I Dye) DNA polimerazo AmpliTaq Gold (AmpliTaq Gold DNA Polymerase) deoksiribonukleotidtrifosfat z deoksiuridintrifosfatom (dntps with dutp) pasivno referenco (Passive Reference) Pufer za optimizacijo (optimized buffer components) o panel A za določanje človeških citokinov (Human Cytokine Array Panel A), R&D Systems, Minneapolis, MN, ZDA, ki vsebuje: nitrocelulozno membrano z vezanimi protitelesi za detekcijo citokinov (Human Cytokine Array Panel A) pufer za analizo 4 (Array Buffer 4) pufer za analizo 5 (Array Buffer 5) pufer za spiranje, 25 x koncentrirana raztopina (Wash Buffer Concentrate (25 )) streptavidin-hrp mešanica protiteles za detekcijo citokinov (Detection Antibody Cocktail, Human Cytokine Array Panel A ) štiriprekatna posoda (4-Well Rectangular Multi-dish) 24

32 o komplet za izolacijo nuklearnih ekstraktov (Nuclear Extraction Kit), Cayman Chemical Company, Ann Arbour, MI, ZDA hipotoničen pufer, 10 koncentrirana raztopina (Nuclear Extraction Hypotonic Buffer (10 X)) ditiotreitol (1M) (Nuclear Extraction Dithiothreitol (1M)) s fosfatnim pufrom pufrana slanica (PBS), 10 koncentrirana raztopina (Nuclear Extraction PBS (10 )) fosfatazni inhibitorji, 50 koncentrirana raztopina (Nuclear Extraction Phosphatase Inhibitors (50X)) proteazni inhibitorji, 100 koncentrirana raztopina (Nuclear Extraction Protease Inhibitor Cocktail (100 X)) ekstrakcijski pufer, 2 koncentrirana raztopina (Nuclear Extraction Buffer (2 )) Nonidet P-40 (NP-40) Assay Reagent, 10 % raztopina NP-40 detergenta o Komplet za transkripcijsko aktivnost PPARγ (PPARγ Transcription Factor Assay Kit), Cayman Chemical Company, Ann Arbour, MI, ZDA Reagent A (Transcription Factor Reagent A) PPARγ pozitivna kontrola (Transcription Factor PPARγ Positive Control) vezavni pufer, 4 koncentrirana raztopina (Transcription Factor Binding Assay Buffer (4 X)) pufer za vezavo protiteles, 10 koncentrirana raztopina (Transcription Factor Antibody Binding Buffer (10 X)) PPARγ primarna protitelesa (Transcription Factor PPARγ Primary Antibody) pufer za spiranje, 400 koncentrirana raztopina (Wash Buffer Concentrate (400 X)) polisorbat 20 (Polysorbate 20) PPAR specifična kompetitorska dsdna (Transcription Factor PPAR Competitor dsdna) kozja in anti-zajčja protitelesa konjugirana s hrenovo peroksidazo (Transcription Factor Goat Anti-Rabbit HRP Conjugate) mikrotitrska plošča (Transcription Factor PPAR 96-Well Strip Plate) razvijalna raztopina (Transcription Factor Developing Solution) raztopina za zaustavitev reakcije (Transcription Factor Stop Solution) 25

33 o liofilizirani začetni oligonukleotidi (Small Sequence, Detection Primers), Applied Biosystems, Warrington, VB Nukleotidna zaporedja začetnih oligonukleotidov so navedena v preglednici IV. Preglednica IV: Nukleotidno zaporedje začetnih oligonukleotidov, uporabljenih v verižni reakciji s polimerazo v realnem času (qpcr). Gen Nukleotidno zaporedje začetnih oligonukleotidov T prileganja ( C) β aktin IL-6 IL-8 PPAR-γ COX-1 COX-2 SAA vcam-1 CLA-1 F: 5'-ATCTGGCACCACACCTCCTACAATGAGCTGCG-3' R: 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3' F:5'-GAGGCTCATTCTGCCCTCGAGCC-3' R:5'-CTGTCTGTGTGGGGCGGCTACA-3' F:5'-ACAAGAGCCAGGAAGAAACCACCGG-3' R:5'-GTGTTGGCGCAGTGTGGTCCAC-3' F: 5'-GGGATGTCTCATAATGCCATCA-3' R: 5'-CGCCAACAGCTTCTCCTTCT-3' F:5'-GACCCAGAGCTGCTGTTCGGTGT-3' R:5'-TCCGGCCAGCAATCTGGCGAG-3' F:5'-AAGCGAGGGCCAGCTTTCACCA-3' R:5'-CCAAAGACCTCCTGCCCCACAGC-3' F: 5'-CGAAGCTTCTTTTCGTTCCTT-3' R: 5'-CAGGCCAGCAGGTCGGAAGTG-3' F:5'-GGATTCTGTGCCCACAGTA-3' R:5'-CCTGGCTCAAGCATGTCATA-3' F:5'- GAACTTCTGGGCAAATGTGG-3' R:5'-TTCACAGAGCAGTTCATGGG-3' 59,0 61,0 60,9 60,2 61,2 61,2 50,0 60,0 58, REAGENTI o barvilo Coomassie Brilliant Blue, Sigma, St. Louis, ZDA o dimetil sulfoksid (DMSO), Antibioticos, Carlo Erba reagenti, Arese (MI), Italija o etanol, 96 %, Lex, Portorož, Slovenija o fiksir Kodak GBX, koncentrirana raztopina, Carestream Health, Rochester, NY, ZDA o razkužilo; Bode Chemie, Hamburg, Nemčija o raztopina za nevtralizacijo tripsina (Trypsin neutralising solution, TNS), Clonetics TM, Lonza, Walkersville, Maryland, ZDA o raztopina za zaščito celic ob zmrzovanju (Cryoprotective Medium), Lonza, Walkersville, Maryland, ZDA 26

34 o razvijalec Kodak GBX, koncentrirana raztopina, Carestream Health, Rochester, NY, ZDA o tekoči dušik (N 2 ), 200 bar, Linde Gras o tripsin 10 x raztopina (Trypsin/Versene EDTA), Cambrex, East Rutherford, New Jersey, ZDA o fosfatni pufer PBS in PBS-citrat (ph=7.4) (preglednica V) Preglednica V: Sestava pufrov PBS in PBS-citrat. PUFER SESTAVINA KOLIČINA PBS - citrat PBS NaCl 0,137M KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 H 2 O 0,0027 M 0,0065 M 0,0015 M do 1L + Na 3 citrat x 2H 2 O 0,0109 M o Arcoxia, 90 mg filmsko obložene tablete, Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Nizozemska o Cimzia 200 mg/ml, raztopina za injiciranje, UCB Pharma SA, Bruselj, Belgija o Dexamethason Krka 4 mg/1 ml, raztopina za injiciranje, Krka, tovarna zdravil, d. d., Novo mesto, Slovenija o Enbrel 50 mg/ml, raztopina za injiciranje, Pfizer Limited, Kent, Velika Britanija o Simponi 50 µg/0,5 ml, raztopina za injiciranje, Janssen Biologics B.V., Leiden, Nizozemska o Humira 40 mg/0,8 ml, raztopina za injiciranje, Abbott Biotechnology GmBH, Wiesbaden, Nemčija o Kaptopril Krka, 25 mg tablete, Krka, tovarna zdravil, d. d., Novo mesto, Slovenija o Lescol, 40 mg trde kapsule, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg, Nemčija o Methotrexat 2,5 mg tablete, Cyanamid International Corporation Limited, Zurich, Švica o Movalis, 15 mg tablete, Boehringer Ingelheim International GmbH, Ingelheim am Rhein, Nemčija o Naklofen duo, 75 mg kapsule, Krka, tovarna zdravil, d. d., Novo mesto, Slovenija o Rosiglitazon, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, ZDA 27

35 3.1.4 APARATURE IN DROBNI LABORATORIJSKI MATERIAL o aparatura za PCR v realnem času, Step One Real-Time PCR System, Applied Biosystems, Cambridge, Velika Britanija o aseptična komora z laminarnim pretokom zraka, LaminAir scan 1.2, Heto Holten, AllerØd, Danska o avtoklav A-11, Kambič Laboratorijska oprema, Semič, Slovenija o avtomatske pipete (10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl), Research, Eppendorf, Hamburg, Nemčija o avtomatski števec celic-countess, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA o celični inkubator, Heto-Holten Cellhouse 154, Astel, Francija o centrifuga 3K30, Sigma, Saint Louis, Missouri, ZDA o centrifuga 5430R, Eppendorf, Hamburg, Nemčija o centrifuga Universal 32R, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Nemčija o centrifugirne epruvete (15 ml, 50 ml), TPP, Trasadingen, Švica o čitalec mikrotitrskih plošč, Sunrise, Tecan, Männedorf, Švica o epruvetke 1,5 ml, Safe-Lock Tubes, Eppendorf, Hamburg, Nemčija o epruvetke 250 µl, PCR Tubes, Eppendorf, Hamburg, Nemčija o inverzni mikroskop, Eclipse TS100, Nikon, Japonska o mikrotitrske plošče Costar 3591 polysytrene medium binding, Corning Inc, New York, ZDA o multipipete (100 µl, 300 µl), Research, Eppendorf, Hamburg, Nemčija o nastavki za pipetiranje (10 µl, 200 µl, 300 µl in 1000 µl,), Eppendorf, Hamburg, Nemčija o pipete (10 µl, 100 µl, 1000 µl), Research, Eppendorf, Hamburg, Nemčija o pipete (10 µl, 100 µl, 1000 µl), Biohit Mechanical Pippetes, Biohit, Helsinki, Finska o plastenke za tkivne kulture 25, 75, 150 cm2, TPP, Trasadingen, Švica o stekelca za štetje celic, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA o spektrofotometer za mikrotitrske plošče, Sunrise Tecan, Tecan Tradin AC, Männedorf, Švica o sterilni filtri za enkratno uporabo, Minisart, velikost por 0,20 µm o stresalnik, Promax 1020, Heidolph zentrifugen, Tuttlingen, Nemčija o strgalo za celice (13 mm), TPP, Trasadingen, Švica o šest prekatne plošče TPP, Trasadingen, Švica 28

36 o UV/VIS enožarkovni spektrofotometer M501, Camspec, Leeds, Velika Britanija o kvarčna kiveta, QS, mm, Campsec, Cambrige, velika Britanija o vakuumska črpalka, Vacuum Pump XF , Millipore, Francija o vibracijski mešalnik, vrtinčnik, Vortex, Assister, Sondheim, Nemčija o vodna kopel, Water Bath TW8, Julabo, Seelbach, Nemčija 29

37 3.2 METODE DELO S CELIČNIMI KULTURAMI Eksperimente smo izvajali na celični kulturi primarnih človeških arterijskih endotelijskih celic (HCAEC). Celice, ki smo jih dobili, so bile v tretji pasaži, poskuse pa smo izvajali na celicah v peti ali šesti pasaži. Ker smo izvedli veliko poskusov, so bile celice različnih serij, kar pomeni, da so bile izolirane iz različnih ljudi. Vse poskuse smo izvajali v komori z laminarnim pretokom zraka, s čimer smo zagotovili čim večjo sterilnost. Komora se nahaja v laboratoriju za delo s celičnimi kulturami, kamor je vstop dovoljen le z ustrezno zaščitno opremo, ki smo jo oblekli v predprostoru, s čimer smo možnost kontaminacije celičnih kultur zmanjšali na minimum, prav tako pa nas oprema ščiti pred potencialno nevarnimi snovmi, s katerimi se lahko srečamo pri delu. Ves pribor, ki smo ga uporabljali, je bil sterilen. Pribor, za katerega sam proizvajalec ni jamčil, da je sterilen, smo avtoklavirali po predpisanem postopku, delovne površine in pripomočke za večkratno uporabo smo pred pričetkom in koncem dela obrisali s 70 % etanolom in razkužilom, v aseptični komori in v inkubatorju pa smo za razkuževanje uporabljali tudi UV lučko. Priprava gojišča, odmrzovanje, nasaditev in gojenje celic Preden smo celice vzeli iz tekočega dušika, smo pripravili ustrezne medije. Osnovnemu mediju za gojišče EBM-2 (Endothelial Cell Basal Medium-2) smo v aseptični komori dodali predpisano količino dodatkov in tako dobili popolno gojišče za HCAEC z 0 % FBS. Če smo temu mediju dodali še predpisano količino seruma govejega ploda (FBS), smo dobili popolno gojišče za HCAEC s 5 % FBS (preglednica III). Medij smo v vodni kopeli pred uporabo vedno segreli na 37 C. Celice so v posebnih zamrzovalnih plastenkah obdane z zamrzovalnim medijem, shranjene v tekočem dušiku. Na vsaki steklenički je napisana vrsta in približno število celic, številka pasaže celic in datum zamrznitve. Celice smo po tem, ko smo jih vzeli iz tekočega dušika, minuto ali dve segrevali v vodni kopeli, da se odtalijo. Nato smo jih pomešali s predhodno preračunano količino popolnega gojišča za HCAEC s 5 % FBS, segretega na 37 C in s suspenzijo napolnili prekate na plošči. Uporabljali smo šestprekatne plošče, površina enega prekata pa je 9,6 cm 2. V vsako vdolbinico smo odpipetirali 2 ml suspenzije. Gostota nasaditve celic je bila od 2000 do 5000 celic/cm 2, odvisno od tega, kako hitro smo hoteli, 30

38 da celice postanejo ustrezno prekrivne in od razpoložljive količine celic v zamrzovalnih plastenkah. Ploščo z nasajenimi celicami smo rahlo potresli in dali v inkubator (37 C, 5 % CO 2, 100 % relativna vlažnost). Po 4 urah smo gojišče odsesali, s čimer smo odstranili tudi celice, ki se niso prijele, in ga nadomestili s svežim (CA-PM s 5 % FBS). Celicam smo nato gojišče menjali vsak drugi dan, pri čemer smo jih vsakodnevno opazovali pod mikroskopom. Ko so dosegle % prekrivnost, smo na njih izvedli poskus. Izvedba poskusa in kolekcija celic Pred stimulacijo celic smo naredili načrt poskusa, ki smo mu nato sledili. Dve uri pred stimulacijo smo vsem celicam zamenjali gojišče in jim dodali predhodno segreto popolno gojišče CA-PM z 0 % FBS (2 ml/vdolbinico), s čimer smo preprečili vpliv FBS na rezultat. Neposredno pred stimulacijo smo ponovno zamenjali gojišče in spet dodali popolno gojišče CA-PM z 0 % FBS (1 ml/vdolbinico). Nato smo celicam najprej dodali izračunano količino pripravka iz zdravil (glej dalje), po določenem času - odvisno od lipofilnosti uporabljenega zdravila - vendar najpogosteje po dveh urah, pa še preračunano količino SAA, da smo dobili ustrezno koncentracijo SAA in zdravil v gojišču. Prekatom, ki so bili določeni za negativno kontrolo, nismo v gojišče dodali ničesar. Osnovno raztopino SAA (c = 1,0 mg/ml) smo pripravili po navodilih proizvajalca. Uporabljali smo različne serije istega proizvajalca. Plošče s celicami smo po dodatku zdravil in SAA vrnili v inkubator (37 C, 5 % CO 2, 100 % relativna vlažnost) za 2, 4, 8, 16 ali 24 ur, odvisno od načrtanega poskusa. Po koncu poskusa smo supernatante odpipetirali v avtoklavirane epruvetke ter jih 5 minut vrteli na 5000 g. Zgornjih 850 µl supernatanta smo prenesli v nove epruvetke, jih označili, ter shranili v zmrzovalnik na -20 C. Na celice, ki so ostale pritrjene v vdolbinicah, pa smo nalili 350 µl lizirajočega pufra iz analiznega kompleta za izolacijo RNA, jih s strgalcem postrgali in prenesli v avtoklavirane epruvetke ter shranili v skrinjo, na -80 C. Ker lizirajoči pufer vsebuje gvanidinijev tiocianat, ki prepreči encimsko aktivnost RNAz, so bile celice zaščitene pred razgradnjo RNA. Priprava zdravil za aplikacijo na celice Pred izvedbo poskusov smo v literaturi poiskali podatke o topilu, v katerem so učinkovine topne in njihovo topnost (preglednica VI). Uporabljena zdravila smo najprej raztopili v ustreznem mediju, ter jih filtrirali skozi sterilne filtre, z velikostjo por 0,20 µm. Poiskali 31

39 smo tudi podatke o koncentraciji učinkovin, uporabljenih v drugih raziskavah in pri drugih celičnih tipih, ki za celice dokazano niso toksične. S preračunom smo dobili količino učinkovine, raztopljene v ustreznem volumnu topilu, ki je ustrezala želeni koncentraciji učinkovine na celicah. Raztopljeno učinkovino smo nato aplicirali na celice. Preglednica VI: Učinkovina in uporabljeno zdravilo, topilo in topnost učinkovin v izbranem topilu, koncentracija učinkovine na celicah in uporabljena prostornina. Učinkovina in Topilo in topnost Koncentracija Uporabljen V uporabljeno zdravilo učinkovine na celicah (µm) (µl/1 ml medija) adalimumab: Humira 40 mg/0,8 ml, raztopina za injiciranje certolizumab pegol: Cimzia 200 mg/ml, raztopina za injiciranje deksametazon: Dexamethason Krka 4 mg/ ml, raztopina za injiciranje etanercept: Enbrel 50 mg/ml, raztopina za injiciranje / / / 5 5,9 / etorikoksib: Arcoxia, 90 mg filmsko obložene tablete DMSO: prosto golimumab: Simponi 50 µg/0,5 ml, raztopina za injiciranje kaptopril: Kaptopril Krka, 25 mg tbl. meloksikam: Movalis, 15 mg tablete metotreksat: Methotrexat 2,5 mg tablete natrijev diklofenakat: Naklofen duo, 75 mg kapsule natrijev fluvastatinat: Lescol, 40 mg trde kapsule rosiglitazon: rosigl. Cayman Chemicals / medij: 160 mg/ml 10 4,4 DMSO: 25 mg/ml 100 3,5 DMSO: topen 1 3,6 DMSO: 35 mg/ml 10 4 medij: prosto 10 10,3 DMSO: 25 mg/ml 30 4,3 32

40 Štetje celic Celice smo pred nadaljnjo analizo tudi prešteli, s čimer smo se prepričali, da nobeno od zdravil ni imelo citotoksičnega učinka. Za štetje smo uporabili Countess avtomatski števec celic. 10 µl vzorca smo premešali z 10 µl tripanskega modrila in 10 µl mešanice odpipetirali v odprtino na objektnem stekelcu ter ga vstavili v aparat. Z gumbom»zoom«smo prilagodili sliko, tako da so bile žive celice temne s svetlo sredino, mrtve celice pa so bile popolnoma temne, brez svetle sredine, saj je v njih vstopilo barvilo. S pritiskom na gumb»count cells«se prične avtomatsko štetje celic. Aparat nam poda celotno številčno koncentracijo celic, ter posebej tudi število živih in mrtvih celic v vzorcu IZOLACIJA NUKLEARNIH EKSTRAKTOV Nuklearne ekstrakte smo izolirali po navodilih proizvajalca iz 75 mm posode. Celice smo dali v ohlajeno 15 ml epruvetko, ter jih 5 minut centrifugirali na 300 g pri 4 C. Nato smo jih resuspendirali v 5 ml ledeno hladnega PBS raztopina s fosfataznimi inhibitorji (Nuclear Extraction PBS 10 / destilirana voda / Nuclear Extraction Phosphatase Inhibitors 50 ), ter ponovno 5 minut centrifugirali na 300 g pri 4 C. Ves postopek smo še enkrat ponovili. Celicam smo dodali 500 µl ledeno hladnega hipotoničnega pufra (Nuclear Hypotonic Buffer 10 / destilirana voda / Nuclear Extraction Phosphatase Inhibitors 50 / Nuclear Extraction Protease Inhibitors 100 ), premešali s pipetiranjem in usedlino resuspendirali v ohlajeni 1,5 ml epruvetki. Celice smo 15 minut inkubirali na ledu, da so nabreknile, jim dodali 100 µl reagenta 10 % Nonidet P-40 Assay Reagent in premešali s pipetiranjem ter jih 30 s centrifugirali na 4 C. Supernatant, ki vsebuje citosolno frakcijo smo prenesli v novo, ohlajeno epruvetko in shranili na -80 C. Usedlino smo resuspendirali v 50 µl ledeno hladnega ekstrakcijskega pufra in 15 s vrtinčili pri najvišji hitrosti. Epruvetko smo nato na ledu nežno zibali 15 minut, vrtinčili 30 s pri najvišji hitrosti in ponovno 15 minut zibali na ledu. Na koncu smo ekstrakte še 10 minut centrifugirali pri g na 4 C, supernatante alikvotirali v nove, ohlajene epruvetke in jih, če nismo takoj nadaljevali s poskusom, shranili na -80 C DOLOČANJE PPARγ TRANSKRIPCIJSKEGA FAKTORJA Pred odprtjem smo komplet segreli na sobno temperaturo in pripravili CTFB (Complete Transcription Factor Binding Assay Buffer) pufer. V eno luknjico smo dali: 73 µl UltraPure Water 33

41 25 µl 4 transcription Factor Binding Assay Buffer 1 µl Reagent A 1 µl 300 mm DTT Napipetirali smo: BLK 100 µl CTFB NSB 100 µl CTFB C1 80 µl CTFB+10 µl Transcription Factor PPAR Specific Competitor dsdna + 10 µl neznanega vzorca S1-S44 90 µl CTFB + 10 µl nuklearnega ekstrakta PC 90 µl CTFB + 10 µl pozitivne kontrole Pokrito ploščo smo inkubirali čez noč na 4 C ali dve uri na sobni temperaturi. Ugotovili smo, da smo boljše rezultate dobili pri dvourni inkubaciji na sobni temperaturi. Po inkubaciji smo vdolbinice izpraznili in jih 5 sprali z 200 µl pufra za spiranje. Razredčili smo primarna protitelesa PPARγ (1:100 v 1 ABB) in dodali 100 µl v vse vdolbinice, razen v slepo. Inkubirali smo 1 h pri sobni temperaturi in vdolbinice ponovno 5 sprali s spiralnim pufrom. Razredčili smo kozja in anti-zajčja protitelesa konjugirana s hrenovo peroksidazo in dodali 100 µl v vse vdolbinice, razen v slepo, ter ponovno inkubirali 1 h pri sobni temperaturi. Vdolbinice smo ponovno sprali in v vsako dodali 100 µl raztopine za razvijanje transkripcijskega faktorja. Inkubirali smo 45 minut na sobni temperaturi z rahlim zibanjem in zaščiteno pred svetlobo. Dodali smo 100 µl raztopine za zaustavitev reakcije in v roku 5 minut izmerili absorbanco pri 450 nm PANEL CITOKINOV Uporabili smo komercialno dostopen komplet, pri katerem so na nitrocelulozno membrano vezana protitelesa proti 36 citokinom, kemokinom in proteinom akutne faze vnetja. Protitelesa na membrani vežejo specifična protitelesa iz dodanega vzorca, detekcija pa poteka po principu kemiluminescentne reakcije (slika 2). Slika 2: Citokinski panel po nanosu supernatanta iz netretiranih HCAEC in celic, stimuliranih s SAA. 34

42 Pred uporabo smo vse reagente segreli na sobno temperaturo. V prekat smo za vsak vzorec najprej odpipetirali 2 ml pufra, ki preprečuje nespecifično vezavo drugih molekul, dodali nitrocelulozno membrano z naborom citokinov in jo ob zibanju eno uro inkubirali na sobni temperaturi. Med tem smo pripravili vzorce. 800 µl našega vzorca smo dodali, 500 µl pufra 4 in 200 µl pufra 5. Vzorcu smo nato dodali še 15 µl rekonstruirane mešanice z biotinom konjugiranih protiteles, premešali in na sobni temperaturi inkubirali eno uro. Iz prekata smo odsesali prejšnji pufer, ter membrano potopili v vzorec, ki smo ga pripravili, ter inkubirali čez noč na 2-8 C z rahlim stresanjem. Naslednji dan smo membrane potopili v 20 ml spiralnega pufra in jih 10 minut zibali na stresalniku, postopek smo ponovili 3, med tem pa smo prekate temeljito umili in posušili. Vanje smo nato odpipetirali 1,5 ml predhodno redčenega kompleksa streptavidin-hrenova peroksidaza ter jih 30 minut stresali pri sobni temperaturi. Nato smo jih ponovno 3 sprali s spiralnim pufrom, nanesli kemiluminescentni reagent ter membrane s fotografskim filmom slikali v različnih časovnih presledkih (slika 2) ENCIMSKOIMUNSKA METODA Encimskoimunska metoda (ELISA) je biokemijska metoda za kvalitativno in kvantitativno določanja protiteles ali antigenov v vzorcu, ki jo odlikujeta hitrost in visoka analizna občutljivost. Če želimo določiti količino iskane molekule v vzorcu, moramo najprej pripraviti umeritveno krivuljo s pomočjo dodanega standarda in predpisanih redčenj letega. Za določevanje naših tarčnih molekul smo uporabljali metodo sendvič ELISE. V supernatantu smo določali prisotnost šestih različnih molekul, citokinov IL-6 in GM-CSF, kemokina IL-8, adhezivnih molekul sicam in svcam, in proteaznega inhibitorja PAI-1, ki so nam služili kot pokazatelji vnetnega odziva celic ob dodatku zdravil in SAA. Natančen postopek analiz je predstavljen v preglednici VII. Vzorce smo pred uporabo odmrznili, segreli na sobno temperaturo, premešali in pred nanosom po potrebi redčili z dodanim pufrom za redčenje. Princip metode je v vseh primerih enak. Specifična primarna monoklonska protitelesa so pritrjena na dno mikrotitrske plošče, kamor smo odpipetirali ustrezno količino vzorca. Drugo specifično monoklonsko protitelo, ki je usmerjeno proti drugemu epitopu iskane molekule, je označeno z biotinom. Na biotin se z močno nekovalentno vezjo veže še kompleks streptavidin hrenova peroksidaza (HRP). Encim peroksidaza nato kvantitativno pretvori substrat, ki ga dodamo, v modro obarvan produkt, 35

43 ki po dodatku žveplove (VI) kisline (STOP solution) postane rumen in ga lahko spektrofotometrično določimo. Z vmesnimi spiranji preprečimo nespecifično vezavo protiteles, zato je intenziteta obarvanja v vsaki vdolbinici mikrotitrske ploščice sorazmerna koncentraciji iskanega proteina v vzorcu. S pomočjo umeritvene krivulje iz znanih koncentracij standardov, na koncu dobimo koncentracijo iskanega proteina v našem vzorcu. Preglednica VII: Pregled postopka pri encimskoimunskem testu na trden nosilcu za določanje koncentracije IL-6, IL-8, sicam-1, svcam-1, PAI-1 in GM-CSF. Postopek IL-6 ELISA IL-8 ELISA nanos standardov in vzorcev na mikrotitrsko ploščo 100 µl 50 µl sicam-1 ELISA najprej 2 spereš svcam- 1 ELISA 100 µl 100 µl PAI-1 ELISA GM-CSF ELISA 100 µl+ 120 min inkubacije na sobni T 50 µl spiranje / / / / 4-krat / nanos biotina s protitelesi 50 µl 50 µl / 50 µl 100 µl 150 µl inkubacija (sobna T) 120 min 90 min / 37 C 120 min, 120 min 90 min spiranje 4-krat 4-krat / 4-krat 4-krat 4-krat nanos kompleksa streptavidin-hrp 100 µl 100 µl HRP konjugat 50 µl 100 µl 100 µl 100 µl inkubacija 30 min 30 min 120 min 30 min 30 min 30 min spiranje 4-krat 4-krat 3-krat 4-krat 4-krat 4-krat nanos substrata 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl inkubacija v temi 30 min 30 min 10 min 30 min 15 min 30 min nanos STOP raztopine 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl merjenje absorbance 450 nm 450 nm 450 nm 450 nm 450 nm 450 nm S supernatantom, ki smo ga dobili po 24 h stimulaciji HCAEC s SAA in z zdravili, smo nato z metodo ELISA izvedli analizo količine izločenih molekul. Supernatante smo morali ustrezno redčiti, da smo prišli v območje detekcije metode (preglednica VIII) 36

44 Preglednica VIII: Koncentracija standarda v analiznem kompletu ter redčitve samih zdravil in zdravil v kombinaciji s SAA. ELISA C standarda Redčenjezdravila Redčenje- zdravila+saa IL pg/ml / in 1:10 1:50 IL pg/ml / in 1:10 1:50 GM-CSF 500 pg/ml 1:2 1:2 PAI pg/ml 1:80 in 1:50 1:80 in 1:50 sicam-1 10 ng/ml / / svcam-1 75 ng/ml 1:2 1: ANALIZA RNA Vpliv stimulacije celic s SAA in z učinkovinami smo poleg proteinskega preverili tudi na nivoju informacijske RNA (mrna). Za razliko od encimskoimunskega testa, kjer smo koncentracijo nastalih proteinov navadno merili po 24 urah, saj za njihovo sintezo celica potrebuje nekaj časa in se akumulirajo v supernatantu, so poskusi, pri katerih smo analizirali RNA, trajali od 2-8 ur, ker se RNA za mnoge gene po 24 urah že razgradi. RNA iz celic smo izolirali s pomočjo kompleta za izolacijo RNA po priloženih navodilih proizvajalca (glej naprej), količino in čistost izolirane RNA pa smo določili spektrofotometrično iz razmerja absorbanc pri 260 in 280 nm. RNA je občutljiva na delovanje RNAz, ki pa jih s hlajenjem na ledu upočasnimo, zato smo tudi poskrbeli, da je bila izolacija izvedena v najkrajšem možnem času. Po izolaciji smo izvedli reverzno transkripcijo, s čimer smo RNA pretvorili v komplementarno DNA (cdna), ki je bolj stabilna in smo jo namesto na -80º C lahko shranjevali na -10º C. Na koncu smo izvedli še kvantitativno reakcijo s polimerazo v realnem času (qpcr), s čimer smo določili izražanje tarčnih genov v celicah. Da ne bi prišlo do onesnaženja vzorca, smo pri delu uporabljali posebno določen prostor, rokavice in pipetne nastavke s sterilnimi filtri. Izolacija RNA RNA smo izolirali iz celic z analiznim kompletom za izolacijo RNA (RNeasy Plus Micro kit) po navodilih proizvajalca. Komplet vsebuje kolono z membrano, ki veže RNA, proteine, DNA in druge nečistote pa speremo iz vzorca. Na koncu z dodatkom vode brez RNaz izperemo RNA iz membrane. 37

45 Celični lizat, shranjen na -80 C smo najprej odtalili in močno vrtinčili. Lizat smo prenesli na posebno kolono, s katero smo iz lizata odstranili DNA, ki vsebuje celoten genski material, zaradi česar bi kasneje prišlo do napačnih rezultatov pri verižni reakciji s polimerazo. Ker so nas zanimali le določeni tarčni geni, ki so se izražali pod pogoji, v katerih je bil izveden poskus, smo iz celice izolirali le celoten nabor molekul mrna. Lizat smo 30 s centrifugirali na g in kolono zavrgli. Vzorcu smo dodali 350 µl 70 % EtOH, kar obori RNA in dobro premešali s pipetiranjem. Prenesli smo ga na drugo kolono (Rneasy MinElute spin column), jo postavili v 2 ml zbiralno epruvetko in centrifugirali 30 s na g. Tekočino smo zavrgli in na kolono nanesli 700 µl pufra Buffer RW1, zaprli pokrovček in centrifugirali 30 s na g. Zavrgli smo tekočino in na kolono nanesli 500 µl pufra Buffer RPE, nežno zaprli pokrovček in ponovno centrifugirali 30 s na g. Zavrgli smo tekočino in na kolono nanesi 500 µl 80 % EtOH, zaprli pokrovček in centrifugiraj 2 min na g. Kolono smo prenesli v novo 2 ml zbiralno epruvetko in odprto kolono centrifugirali na maksimalni hitrosti 2 min, da je izhlapel ostanek etanola. Zbiralno epruvetko smo zavrgli. Kolono smo prenesli v novo označeno 1,5 ml epruvetko, dodali 14 µl vode brez RNaz direktno na sredino membrane in centrifugirali 1 min na maksimalni hitrosti. Naredili smo še redčitev RNA za merjenje absorbance. Epruvetke z RNA smo zamrznili na -80 C ali neposredno nadaljevali s pretvorbo RNA v cdna. Določanje koncentracije RNA Količino RNA smo določili spektrofotometrično z merjenjem absorbance pri 260 in 280 nm. Vzorec, ki vsebuje 40 µg/ml RNA, ima pri 260 nm vrednost absorbance 1. Da bi določili količino izolirane RNA, smo 2,3 µl vzorca RNA redčili s 67,7 µl vode brez RNaz, s čimer smo raztopino RNA razredčili 30 krat. Iz izmerjene absorbance in ustrezne redčitve smo izračunali količino RNA v vzorcu po enačbi 1: količina RNA v vzorcu 40 µg/ml faktor redčenja Enačba 1: Izračun količine RNA v vzorcu na podlagi izmerjene absorbance. A 260 -izmerjena absorbanca vzorca pri 260 nm. Čistost RNA smo približno ocenili iz razmerja absorbanc vzorca RNA pri 260 in 280 nm. S tem lahko ocenimo prisotnost nečistot, ki absorbirajo v UV spektru, kot so na primer proteini in DNA. Po dosedanjih izkušnjah razmerje med 1,7 in 2,0 pomeni relativno dobro čistost RNA, izolirane po izbrani poti. 38

46 Reverzna transkripcija Z reverzno transkripcijo (RT) smo pretvorili enoverižno RNA, ki je zelo občutljiva na delovanje RNaz in jo hitro razgradijo, v bolj stabilno komplementarno DNA (cdna). Encim reverzna transkriptaza najprej prepiše verigo RNA v cdna in nato razgradi RNA. Reakcijski mešanici za RT (14,4 µl), ki je predstavljena v preglednici VII smo dodali raztopino RNA, ki vsebuje 1 µg RNA in vodo brez RNAz, do skupne prostornine 15,6 µl ter vzorec uporabili v reakciji RT. Reakcija RT je potekala pod naslednjimi pogoji: 30 minut pri 43 C 30 minut pri 53 C 5 minut pri 94 C. cdna smo shranili na -20 C ali pa takoj nadaljevali s PCR v realnem času. Preglednica IX: Sestava in vloga sestavin v reakcijski mešanici za reverzno transkripcijo. dntp deoksiribonukleotidtrifosfati, AMV RT encim reverzna transkriptaza virusa ptičje mieloblastoze. Sestavina Vloga Količina za 1 vzorec 10x RT pufer vzdržuje ph 3 µl dntp gradniki nove verige 3 µl MgCl 2 oligo dt Mg 2+ je kofaktor encima AMV RT oligonukleotidni začetniki 6 µl 1 µl inhibitor RNaz zaviranje RNaz 0,75 µl AMV RT voda brez nukleaz + vzorec z 1 µg RNA encim, odgovoren za izgradnjo cdna dopolni prostornino reakcijske mešanice 0,6 µl 0,05 µl 14,4 µl vir RNA 15,6 µl 30 µl 39

47 Verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qpcr) Verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qpcr) nam omogoča pomnoževanje točno določenega fragmenta in hkrati spremljanje količine DNA v vzorcu v posameznem ciklu. Uporabili smo jo za določitev izražanja naslednjih genov v celicah: IL-6, IL-8, SAA, COX-1, COX-2, PPARγ in VCAM-1. Pripravili smo reakcijsko mešanico, ki je natančno opisana v preglednici X. Komercialno dostopna mešanica vsebuje vse potrebne elemente za potek reakcije: termostabilno DNA-polimerazo za pomnoževanje, deoksiribonukleotidtrifosfate (dntp) in barvilo Sybr Green I za detekcijo, ki fluorescira, ko se interkalira v dvojno vijačnico. Mešanici smo dodali še začetne oligonukleotide, ki so odgovorni za pomnoževanje izbranega gena in vodo brez nukleaz. Preglednica X: Sestava reakcijske mešanice za qpcr Sestavina Power Sybr Green PCR Master Mix 12,5 µl oligonukleotidni začetnik F (10 pmolov/µl) 0,5 µl oligonukleotidni začetnik R (10 pmolov/µl) 0,5 µl voda brez nukleaz 10,5 µl Količina za en vzorec cdna smo pred analizo iz 30 µl z vodo brez nukleaz razredčili na 120 µl, da smo namesto 1 µl v vdolbinice lahko odpipetirali 4 µl in s tem močno zmanjšali napako zaradi pipetiranja. Tako pripravljeno reakcijsko mešanico smo nanesli v vdolbinice na ploščici (21 µl/vdolbinico) in ji dodali cdna (4 µl/vdolbinico), v primeru slepe kontrole pa 4 µl vode brez nukleaz. Pripravili smo tudi standarde, kar je povzeto v naslednji preglednici XI: Preglednica XI: Redčitev standardov za qpcr. (ST 1 je sestavljen iz 20 µl DNA iz različnih vzorcev.) Standard Faktor Redčitev Uporabimo ST 1 1:1 (1) / ST 2 1:2 (0,5) 10 µl ST1+10 µl H 2 O ST 3 1:4 (0,25) 10 µl ST2+10 µl H 2 O ST 4 1:8 (0,125) 10 µl ST3+10 µl H 2 O ST 5 1:16 (0,062) 10 µl ST4+10 µl H 2 O 4 µl + 21 µl PCR Master Mix 40

48 Uporabili smo računalniški program StepOne (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, ZDA), s pomočjo katerega smo pred pričetkom pomnoževanja določili razporeditev vzorcev, standardov in slepih kontrol na ploščici vse smo vedno nanašali v dvojnikih ter pogoje reakcije. Najprej se reakcijska mešanica 10 minut segreva na 95 C. Sledi 40 ciklov, od katerih je vsak cikel sestavljen iz treh korakov: v prvem koraku (15 sekund, 95 C) se cdna denaturira v drugem koraku (1 minuta, temperatura prileganja oligonukleotidnih začetnikov) se oligonukleotidni začetniki prilegajo na odsek cdna v tretjem koraku (1 minuta, 60 C) se veriga cdna pomnoži Računalniški program je v vsakem ciklu izmeril fluorescenco vzorca in izrisal krivuljo, ki podaja odvisnost fluorescence signala posameznega vzorca od časa. Na eksponentnem delu krivulje smo določili linijo fluorescenčnega praga, ki predstavlja tisto flourescenco, ki je značilno večja od fluorescence ozadja. Za vsak vzorec smo nato določili tisti cikel (Ct), v katerem je fluorescenca vzorca presegla nastavljeno linijo fluorescenčnega praga. Vrednosti Ct so obratno sorazmerne z začetnim številom kopij tarčne cdna, kar pomeni, da več, kot je v vzorcu začetnih molekul DNA, hitreje se preseže pražna vrednost. Podatke, ki smo jih dobili, smo obdelali s pomočjo računalniškega programa QGENE. V tabele smo vnesli podatke o tarčnem in referenčnem genu, program pa je izračunal relativno izražanje tarčnih genov v HCAEC, glede na referenčni gen. Referenčni gen, v našem primeru β-aktin, se v endotelijskih celicah izraža enakomerno in neodvisno od zunanjih dražljajev. Program nam je najprej iz naklona standardne krivulje (graf odvisnosti Ct od logaritma začetne količine DNA v standardu) za vsako reakcijo izračunal učinkovitost pomnoževanja (E), nato pa še normalizirano izražanje tarčnega gena glede na referenčni gen (enačba 2). Normalizirano izražanje = Enačba 2: Normalizirano izražanje tarčnega gena glede na referenčni gen. Po obdelavi podatkov smo dobili graf, ki prikazuje na β-aktin normalizirano, povprečno izražanje tarčnega gena v vsakem vzorcu. 41

49 5. REZULTATI IN RAZPRAVA Ateroskleroza je kompleksna, kronična bolezen, na katero vplivajo številni faktorji tveganja. Za njo so značilni mnogi procesi, vključno s kopičenjem lipidov v žilni steni in kroničnim vnetjem. Proces ateroskleroze se prične s poškodbo endotelija in konča s tvorbo strdka, ko endotelij razkrije pod njim ležečo leho (52). Ker je pri bolnikih z RA večja verjetnost za razvoj tako ateroskleroze, in kasneje tudi srčno-žilnih bolezni, je relevantno proučevati vpliv zdravil, ki jih uporabljajo bolniki z RA, na potencialno modulacijo spodbujenih vnetnih parametrov endotelnih celic koronarne arterije. Za proučevanje vnetnega odziva HCAEC smo najprej pregledali nabor 36 različnih citokinov, kemokinov in proteinov akutne faze vnetja pri nestimuliranih HCAEC in HCAEC stimuliranih s SAA. 5.1 CITOKINSKI PANEL Na nitrocelulozno membrano, ki se nahaja v reakcijskem kompletu, so nanesena protitelesa proti nekaterim najpogostejšim vnetnim mediatorjem, ki specifično vežejo določeno tarčo. Večja je količina tarčne molekule v vzorcu, večji in intenzivneje obarvan je krog, ki se pojavi po slikanju membrane s fotografskim filmom. Rezultate smo nato z denzitometrijo pretvorili v relativne vrednosti glede na pozitivno kontrolo (slika 3). Ugotovili smo, da HCAEC ob stimulaciji s SAA povečajo produkcijo G-CSF, GM-CSF, GRO-α, ICAM-1, IL-6, IL-8, IL-23, IL-27, MCP-1, MIF IN PAI-1. Glede na to, da smo dobili največje razlike v rezultatih med nestimuliranimi celicami in SAA-stimuliranimi HCAEC prav pri adhezivni molekuli ICAM-1, citokinoma IL-6 in GM-CSF ter kemokinu IL-8, smo se odločili, da bomo podrobneje pogledali odziv HCAEC v kombinaciji s SAA in zdravili na izločanje teh molekul (z dodatkom VCAM-1) ter inhibitorja serinske proteaze PAI-1, ki ga sicer v enaki meri izločajo tudi nestimulirane celice. V razvoj ateroskleroze so vpletene tudi druge molekule kot so od rasti odvisni onkogen α (GRO-α), kemokin, ki naj bi imel vpliv na destabilizacijo aterosklerotične lehe, monocitni kemotaktični protein 1 (MCP-1), ki vpliva na nalaganje monocitov v žilno steno pri procesu ateroskleroze in na oksidacijo holesterola ter inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF), ki ima številne učinke, med drugim tudi spodbuja proliferacijo endotelijskih celic (7, 67, 68). Tudi te citokine HCAEC izločajo v večjih količinah, vendar 42

50 RV (%) njihovih učinkov v sklopu našega raziskovalnega dela nismo preverjali, vsekakor pa bi jih bilo smiselno vključiti v nadaljnje poskuse. 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 IZRAŽENI CITOKINI B SAA Slika 3: Citokini izraženi v netretiranih HCAEC(B) in v HCAEC ob dodatku 1000nM SAA (SAA). RV relativna vrednost, glede na pozitivno kontrolo. 5.2 VNETNI ODZIV HCAEC NA STIMULACIJO S SAA Vnetni odziv celic lahko ovrednotimo na različne načine. Najpogosteje ga določamo preko izločanja molekul, za katere je že znano, da imajo vlogo v procesu vnetja. Vnetni odziv v endotelijskih celicah lahko določamo preko povečanega izražanja adhezijskih molekul (ICAM-1, VCAM-1, E selektin), SAA, različnih interlevkinov (IL-1, IL-6, IL-8), prostaglandinov in drugih dejavnikov. Po predhodnih podatkih je bilo jasno, da bo pri metodi ELISA največja koncentracija proteinov v supernatantu po 24 urah stimulacije, saj pri metodi izmerimo celokupno količino nastalih proteinov, ki s časom seveda tudi narašča. Izražanje mrna različnih molekul pa ob istem času ni enako intenzivno. Da bi vedeli, kako smiselno oblikovati poskuse za analizo izražanja genov, smo najprej preverili, kdaj se geni posameznih molekul ob stimulaciji s SAA najbolj izražajo. Rezultate smo dobili podane relativno na negativno kontrolo, ki so jo predstavljale nestimulirane celice (B). 43

51 PPAR γ (AE) COX-1 (AE) COX-2 (AE) IL-6 (AE) VCAM-1 (AE) ČASOVNA ODVISNOST IZRAŽANJA NEKATERIH GENOV Izražanje gena za IL-6 je bilo največje po štirih urah, nato pa je produkcija padla, vendar je bilo glede na ostale proučevane molekule, relativno na β-aktin, njegovo izražanje veliko tudi po 24 urah (slika 4-1). Adhezivna molekula VCAM-1 pa se po več kot štirih urah ni več izražala, zato smo načrtovanje nadaljnjih poskusov glede na to prilagodili (slika 4-2). 60,00 1 1,00E ,00 20,00 0, čas (h) B SAA 5,00E-04 0,00E čas (h) B SAA Slika 4: Izražanje genov za IL-6 (1) in VCAM-1 (2), v odvisnosti od časa stimulacije HCAEC s SAA (1000 nm). B nestimulirane celice SAA celice, stimulirane s SAA AE arbitrarne enote SAA je na izražanje transkripcijskega faktorja PPARγ (slika 5-1) vplival po 2 urah stimulatorno, po 24 urah pa SAA inhibira mrna PPARγ. Pri vmesnih časih 4 in 8 ur pa so molekulo celice izražale približno enako pri stimulaciji s SAA kakor tudi brez nje, kar kaže na to, da sam SAA na njihovo izražanje takrat ni imel večjega vpliva. Ciklooksigenaza-1 (COX-1) je konstitutivna izoforma encima, konstantno prisotna v večini tkiv. Encim se je v HCAEC približno enakomerno izražal prvih osem ur, potem pa je njegovo izražanje padlo za več kot polovico (slika 5-2). Nestimulirane celice (B), so ga vseskozi izražale približno enako, kot celice stimulirane s SAA. 2,00 1,50 1,00 0,50 1 B SAA 1,5 1 0,5 2 B SAA 6,00 4,00 2,00 3 B SAA 0, čas (h) čas (h) 0, čas (h) Slika 5: Izražanje genov za PPARγ (1), COX-1 (2) in COX-2 (3), v odvisnosti od časa stimulacije HCAEC s SAA (1000 nm). B nestimulirane celice SAA celice, stimulirane s SAA AE arbitrarne enote 44

52 Pričakovan pa je vpliv SAA na izražanje COX-2 v HCAEC, ki se sicer izraža le ob vnetju. COX-2 se je v SAA-stimuliranih HCAEC izražala veliko bolj intenzivno, kot v nestimuliranih. Izražanje je bilo največje dve uri po dodatku SAA, nato pa je s časom upadalo in se po 24 urah zmanjšalo skoraj za štirikrat (slika 5-3). Kot kaže, je inducibilna COX-2 izoforma hitro odzivna in najbolj aktivna v prvih urah po izpostavitvi vnetnemu dražljaju (SAA). Ti podatki so podobni objavljenim podatkom od Zhao in sodelavcev (69), kjer je bilo mrna izražanje COX-2 sicer najvišje pri 4h. 5.3 VNETNI ODZIV HCAEC NA STIMULACIJO S SAA OB DODATKU ZDRAVIL Ker smo v topilu raztapljali zdravila v obliki tablet, ali pa so bila zdravila v obliki raztopine za injiciranje, pripravki, ki smo jih aplicirali na celice, poleg učinkovine vsebujejo tudi pomožne snovi, ki bi v manjši meri lahko vplivale na dobljene rezultate. Vendar pa je zelo malo verjetno, da bi pomožne snovi iz registriranega zdravila imele tako močan vnetni ali protivnetni učinek, da bi prekrile osnovno delovanje učinkovine, zato v nadaljevanju lahko govorimo o vplivu posameznih učinkovin na vnetni odziv HCAEC DMARD IN KORTIKOSTEROIDI (METOTREKSAT IN DEKSAMETAZON) Metotreksat je zdravilo iz skupine DMARD, ki se za zdravljenje RA uporablja najpogosteje, zelo pogoste pa so tudi njegove kombinacije z biološkimi zdravili. Mehanizmi njegovega delovanja in njegovi učinki so kompleksni, vendar v koncentracijah, v katerih se uporablja za zdravljenje RA deluje protivnetno, preko sproščanja adenozina (52, 70). Deksametazon se za zdravljenje RA uporablja že od leta 1948 in je prav tako zelo pogosto predpisano zdravilo (38). Deluje tako, da fizično reagira s transkripcijskim faktorjem NF-κB, ki je vpleten v regulacijo imunskega in vnetnega odziva pri sesalcih (71). V literaturi najdemo podatke, da je pri bolnikih, ki se zdravijo z metotreksatom (ki velja za enega najvarnejših zdravil za zdravljenje RA) manj možnosti za nastanek srčnožilnih bolezni, medtem ko je tveganje za njihov nastanek, predvsem pri dolgotrajni uporabi večjih koncentracij glukokortikoidov, povečano (2)(72). Vendar pa v literaturi nismo 45

53 c (pg/ml) C (pg/ml) zasledili podatkov o vplivu metotreksata in deksametazona na HCAEC. Izvedli smo poskus, kjer smo preverili njun vpliv na s SAA-stimulirano produkcijo nekaterih vnetnih mediatorjev in drugih molekul udeleženih pri nastanku ateroskleroze. HCAEC smo tretirali z 1 µm koncentracijo metotreksata, oziroma s 5 µm koncentracijo deksametazona, ki za same celice nista toksični, in odgovarjata koncentraciji v serumu bolnikov, ki prejemajo terapevtske odmerke zdravil (54). Produkcijo proteinov smo po 24 urah preverili z metodo ELISA. Ugotovili smo, da je metotreksat zmanjšal s SAA stimulirano produkcijo IL-6 za 34 %, deksametazon pa za 33 % (slika 6) IL C (pg/ml) 4000 IL-6 Slika 6: Koncentracija IL-6 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku deksametazona in metotreksata. Koncentracija GM-CSF se ob dodatku metotreksata zmanjša za 21 %, ob dodatku deksametazona pa za 28 % (slika 7) GM-CSF Slika 7: Koncentracija GM-CSF v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku deksametazona in metotreksata. Rezultati nam kažejo, da je njuno delovanje na produkcijo citokinov precej podobno. Za tretjino zmanjšata produkcijo IL-6, ki ima pomembno vlogo pri vnetju, saj sproži nastanek in sproščanje številnih vnetnih mediatorjev in dokazano poveča možnost nastanka srčno-žilnih bolezni. Tudi njuno zmanjšanje produkcije GM-CSF je izredno pomembno. V zadnjem času ta vnetni citokin pridobiva na pomembnosti, glede njegove vloge pri vnetju, ker prav tako vpliva na sproščanje molekul, ki ga pospešujejo. Naši rezultati so v 46

54 c (ng/ml) c (ng/ml) c (pg/ml) c (pg/ml) skladu s študijami, ki so bile narejene na drugem tipu endotelijskih celic (HUVEC) in so pokazali, da deksametazon zniža produkcijo IL-6 in nekoliko tudi IL-8 (73). Njun vpliv na produkcijo kemokina je nekoliko manjši. Metotreksat je količino IL-8 zmanjšal za 18 %, deksametazon pa za 10 % (slika 8). Iz rezultatov je razvidno, da imata oba večji učinek na vnetne citokine in preko zaviranja produkcije IL-8 najbrž ne pripomoreta k zmanjšanju vnetja in k tveganju za nastanek srčno-žilnih bolezni IL IL-8 Slika 8: Koncentracija IL-8 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku deksametazona in metotreksata. Največji vpliv sta obe učinkovini imeli na adhezijske molekule. Produkcija VCAM-1 je ob dodatku metotreksata manjša za 42 %, ob dodatku deksametazona pa za 47 % (slika 9). To seveda znatno prispeva k procesu ateroskleroze, saj zmanjšanje izražanja adhezivnih molekul dokazano upočasni aterogenezo. Metotreksat je v nekaterih študijah zavrl s TNF-α inducirano ekspresijo ICAM-1 in VCAM-1 v HUVEC (54), medtem, ko so Kerchian in sodelavci pri njih dokazali, da je deksametazon v večjih koncentracijah povečal TNF-α stimulirano ekspresijo genov adhezijskih molekul (ICAM-1, VCAM-1 in E-selektin), vendar je v manjši - 1µM koncentraciji povečal le produkcijo E selektina (38) VCAM VCAM-1 Slika 9: Koncentracija svcam-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku deksametazona in metotreksata. 47

55 (AE) c (pg/ml) Ugotovili smo tudi pozitivne učinke metotreksata na produkcijo PAI-1, ki ga tudi nestimulirane HCAEC izločajo v velikih količinah. Stimulacija celic s SAA ne vpliva na njegovo produkcijo. Povečane koncentracije PAI-1 povzročijo aterosklerotične zaplete, metotreksat pa zmanjša njegovo produkcijo tako pri stimuliranih, kot nestimuliranih celicah. Proizvodnja je v celicah, katerim je v gojišče dodan metotreksat, približno 32 % manjša, medtem ko je deksametazon povečal njegovo koncentracijo tako v stimuliranih kot nestimuliranih HCAEC, in sicer za približno 20 % (slika 10). Pri našem poskusu se pri produkciji PAI-1 učinkovini torej najbolj razlikujeta in mogoče je, da je to razlog njunega različnega vpliva na tveganje za nastanek srčno-žilnih bolezni. c (pg/ml) PAI PAI-1 Slika 10: Koncentracija PAI-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku deksametazona in metotreksata. Glukokortikoidi dokazano vplivajo na razvoj trombotičnih procesov. V nižjih koncentracijah naj bi zavirali arterijsko trombozo z zaviranjem agregacije trombocitov, medtem ko naj bi v večjih koncentracijah inhibirali fibrinolizo. Na zaviranje fibrinolize naj bi vplivali z zmanjšanjem aktivnosti t-pa in povečanjem koncentracije PAI-1, kar se je izkazalo tudi pri našem poskusu (38). 1,00E-03 5,00E-04 0,00E+00 SAA Slika 11: Izražanje genov za SAA po 24 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku metotreksata. AE arbitrarne enote 48 Preverili pa smo tudi izražanje mrna SAA ob stimulaciji s SAA, ki so ga Lakota in sodelavci v HCAEC prvič pokazali in tako nakazali prisotnost pozitivne povratne zanke (74). Z naraščanjem izražanja gena za SAA lahko narašča tudi izločanje SAA iz celic. Izločen SAA lahko prispeva k

56 aktivaciji celic s SAA, kar lahko vodi v kronični ireverzibilni krog vnetja in aktivacijo endotelijskih celic ter s tem lahko pripomore k razvoju in pospeševanju ateroskleroze. Metotreksat je izražanje SAA zmanjšal kar za 44 %, kar pomembno vpliva k zmanjšanju vnetja (slika 11). Številne klinične študije dokazujejo značilno zmanjšanje tveganja za nastanek srčno-žilnih bolezni s smrtnim izidom pri bolnikih z RA, ki se zdravijo z metotreksatom (pregled v 69). Njegova zgodnja uporaba upočasni potek bolezni, zniža pa tudi tveganje za kolateralno škodo, kot je nastanek ateroskleroze. Glede na dobljene rezultate metotreksat zniža produkcijo vseh mediatorjev, prisotnih pri vnetju oziroma kasneje, pri nastanku ateroskleroze. Deksametazon prav tako zniža večino vnetnih mediatorjev, vendar pa poveča koncentracijo PAI-1, kar je lahko tudi eden od razlogov za povečano pojavljanje trombotičnih zapletov pri bolnikih z RA, ki se zdravijo z večjimi dozami glukokortikoidov INHIBITORJI TNF-α Pri zdravljenju RA se je za zelo učinkovito metodo izkazalo usmerjeno ciljanje posameznih citokinov s specifičnimi zdravili, na primer uporaba protiteles proti faktorju tumorske nekroze α (TNF-α). Blokada TNF-α zmanjša izražanje vnetnih molekul in kemotaktičnih citokinov na endoteliju in posledično zmanjša prehajanje vnetnih celic v sinovijsko tekočino vnetih sklepov (75). Inhibitorji TNF-α so se izkazali za veliko prednost pri zdravljenju RA, saj so številne študije pokazale, da močno ublažijo bolečino in pozitivno vplivajo na izboljšanje funkcije prizadetih sklepov. Vendar pa v literaturi še ni zadostnih podatkov o njihovem vplivu na srčno-žilne bolezni, predvsem ob dolgotrajni uporabi. Nekatere študije nakazujejo, da naj bi zmanjšali tveganje za nastanek srčno-žilnih bolezni že zaradi samega zaviranja TNF-α, ki ima dokazan pleiotropni učinek in učinkuje tudi na srčno-žilni sistem. Mogoče je tudi, da TNF-α inhibitorji stabilizirajo aterosklerotične lehe in preprečijo njihovo predrtje (76). TNF-α protitelesa lahko reagirajo tudi s Fc receptorji na celici in tudi z membransko vezanim TNF-α, ki prav tako lahko sproži aktivacijo celic. Za naš poskus smo na začetku izbrali štiri najpogostejša biološka zdravila za zdravljenje RA in sicer Cimzio (certolizumab pegol), Humiro (adalimumab), Simponi (golimumab) in Embrel (etanercept). Koncentracija vseh štirih učinkovin na celicah je bila 100 µm. 49

57 c (pg/ml) Izkazalo se je, da učinkovine, z izjemo certolizumab pegola, na produkcijo IL-6 vplivajo približno enako. V kombinaciji učinkovin s SAA smo opazili rahlo zvišanje njegove produkcije (približno 13 %), certolizumab pegol pa je njegovo produkcijo povečal za 43 % (slika 12). Izbrana biološka zdravila, z izjemo certolizumab pegola, na celičnem nivoju bistveno ne vplivajo na koncentracijo IL-6. Glede na rezultate, certolizumab pegol njegovo produkcijo celo poveča, s čimer vnetje še potencira in je zato morda bolj aterogene narave od ostalih učinkovin. Popa in sodelavci so ugotovili, da so se koncentracije IL-6 in CRP v serumu bolnikov, ki se zdravijo z adalimumabom signifikantno zmanjšale, izboljšal pa se jim je lipidni profil, zato so sklepali na pozitiven vpliv inhibitorjev TNF-α na srčno-žilne bolezni (77). Naši rezultati kažejo, da izbrana biološka zdravila preko produkcije IL-6 na endotelijske celice nimajo bistvenega vpliva. c (pg/ml) IL GM-CSF Slika 12: Koncentracija IL-6 in GM-CSF v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku inhibitorjev TNF-α. Glede na dobljene rezultate smo se odločili, da bomo za nadaljnje poskuse uporabljali le certolizumab pegol, ki je pri tem poskusu močno izstopal, ker pa je učinek ostalih učinkovin na produkcijo IL-6 tako podoben, smo si med njimi izbrali adalimumab, ostalih dveh učinkovin pa nismo več uporabljali. Za razliko od IL-6 sta učinkovini zmanjšali produkcijo drugega citokina - GM-CSF. Adalimumab je bil pri tem uspešnejši, saj jo je zmanjšal za 37 %, certolizumab pegol pa le za 15 % (slika 12). Ponovno se je izkazalo, da so učinki adalimumaba pri morebitnem vplivu na pojav srčno-žilnih bolezni ugodnejši, saj je njegovo znižanje danega vnetnega citokina več kot enkrat večje od certolizumab pegola, ki glede na rezultat preko zaviranja GM-CSF na aterosklerozo nima nobenega vpliva. 50

58 c (pg/ml) IL-8 Slika 13: Koncentracija IL-8 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku inhibitorjev TNF-α. Opazna razlika med učinkovinama je nastala tudi pri vplivu na kemokin IL-8. Adalimumab je njegovo produkcijo zavrl za slabih 30 %, medtem ko jo je certolizumab pegol povečal za slabih 20 % (slika 13). Ponovno se je izkazalo, da adalimumab na endotelijske celice vpliva protivnetno, certolizumab pegol pa, glede na rezultate, vnetje še spodbuja. Učinkovini pa se razlikujeta tudi pri vplivu na produkcijo VCAM-1. Adalimumab je njeno količino zmanjšal kar za 55 %, medtem ko certolizumab pegol nanjo ni imel večjega učinka, oziroma jo je rahlo povečal in sicer za 6 % (slika 14). Adalimumab količino adhezivne molekule zmanjša za več kot polovico, kar na celičnem nivoju nedvomno lahko prispeva k zmanjšanju tveganja za nastanek ateroskleroze in srčno-žilnih bolezni. Uporaba certolizumab pegola se je iz tega vidika ponovno izkazala za manj ustrezno. V eni izmed študij je bilo dokazano, da inhibitorji TNF-α zmanjšajo koncentracijo adhezivnih molekul E selektin, VCAM-1 in ICAM-1 v serumu, vendar imajo najmanjši vpliv ravno na VCAM- 1, zato bi bilo morda smiselno narediti dodaten poskus in preveriti vpliv zdravil na produkcijo preostalih dveh adhezivnih molekul (75). Pri vplivu na PAI-1 pa se je razmerje med učinkovinama obrnilo in se je za boljšo izbiro izkazal certolizumab pegol. V nestimuliranih celicah je njegovo produkcijo zmanjšal za kar 39 % in v SAA-stimuliranih za 35 %. Adalimumab je njegovo produkcijo povečal za 11 % v nestimuliranih celicah in zmanjšal za 12 % v stimuliranih, kar pomeni, da v celoti na PAI-1 ni imel večjega učinka (slika 15). Glede na dobljene rezultate imajo bolniki, ki se zdravijo s certolizumab pegolom (na celičnem nivoju) verjetno manjše tveganje za nastanek trombotičnih zapletov, v primerjavi s tistimi, ki dobivajo adalimumab, ki na tveganje nima bistvenega vpliva. 51

59 (AE) (AE) c (ng/ml) c (pg/ml) VCAM PAI-1 Slika 14: Koncentracija svcam-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku inhibitorjev TNF-α. Slika 15: Koncentracija PAI-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku inhibitorjev TNF-α. 2,00E-04 1,50E-04 1,00E-04 5,00E-05 0,00E+00 Slika 16: Izražanje genov za IL-6 po 24 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku inhibitorjev TNF-α. AE arbitrarne enote 8,00E-04 6,00E-04 4,00E-04 2,00E-04 0,00E+00 IL-6 SAA Slika 17: Izražanje genov za SAA po 24 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku inhibitorjev TNF-α. AE arbitrarne enote 52 Pogledali smo tudi vpliv učinkovin na izražanje gena za IL-6. Izvedli smo qpcr analizo in ugotovili, da certolizumab pegol po 24 urah poveča ekspresijo gena za 16 %, adalimumab pa jo za 30 % zmanjša (slika 16). Dobljeni rezultati se za certolizumab pegol skladajo z rezultati, ki smo jih dobili pri metodi ELISA, saj je tam močno povečal koncentracijo IL-6. Kot kaže, pa se ekspresija gena za IL-6 ob dodatku adalimumaba po 24 urah že zmanjša in je glede na koncentracijo IL-6 v supernatantu očitno večja v prvih urah po aplikaciji, nato pa za razliko od certolizumab pegola upade in produkcija citokina se zmanjša. Zanimivo pa je, da nobena od učinkovin ni vplivala na ekspresijo SAA ob stimulaciji HCAEC s SAA, kar je iz vidika zmanjšanja vnetja nedvomno slabost (slika 17).

60 Glede na dobljene rezultate o vplivu izbranih bioloških zdravil na morebitni pojav ateroskleroze, se je za boljšo izbiro izkazalo zdravilo z učinkovino adalimumab, ki je znižalo večino vnetnih molekul, vendar je bilo pri tem manj uspešno kot večina drugih uporabljenih učinkovin. Dopustiti pa je potrebno tudi možnost, da je vsaj do nekaterih razlik med učinkovinama prišlo tudi zaradi vpliva pomožnih snovi v zdravilu, s katerim smo poskus dejansko izvedli. Veliko raziskav predvideva, da naj bi imeli inhibitorji TNF-α na pojav srčno-žilnih bolezni pozitiven učinek, vendar še vedno ni znano, kaj je glavni razlog za to. Za certolizumab pegol se je pri našem poskusu izkazalo, da vnetje na celičnem nivoju in posledično aterosklerozo lahko celo pospešuje, vendar pozitivno vpliva na produkcijo PAI ZDRAVILA ZA ZNIŽANJE HOLESTEROLA IN KRVNEGA TLAKA (FLUVASTATIN IN KAPTOPRIL) Fluvastatin in kaptopril primarno nista protivnetni učinkovini, vendar pa je vedno več dokazov, da imata oba tudi protivnetne učinke (39) (50). Fluvastatin je inhibitor HMG- CoA reduktaze in s tem znižuje koncentracijo holesterola v krvi. Dokazano zmanjšuje pogostost pojavljanja srčno-žilnih bolezni in z njimi povezano smrtnost (78). Vedno več je tudi podatkov, da je zelo učinkovito protivnetno zdravilo, saj med drugim zmanjša sproščanje vnetnih citokinov in povzroči nitrozilacijo COX-2 (ki zato - podobno kot po acetilaciji z acetilsalicilno kislino) proizvaja epi-lipoxin (39). McCarey in sodelavci so ugotovili, da bi statini lahko bili potencialno učinkoviti pri zdravljenju RA, saj se je aktivnost bolezni ob njihovi uporabi zmanjšala (79). Kaptopril je inhibitor encima angiotenzin konvertaze (ACE) in spada v prvo skupino inhibitorjev ACE. Vsebuje tiolno skupino, ki je naslednje generacije ne vsebujejo več, zato ima več antioksidantnih lastnosti. Njegova molekulska formula je podobna formuli D- penicilamina, zato naj bi izboljšal simptome RA, česar pri ostalih ACE inhibitorjih ni opaziti (80). Kaptopril se v osnovi uporablja za zniževanje krvnega pritiska, s čimer direktno vpliva na aterogenezo. Protivnetne učinke kaptoprila gre pripisati njegovemu zaviranju aktivacije NF-κB, o njegovem vplivu na sproščanje molekul, povezanih z vnetjem pri HCAEC pa nismo zasledili nobenih podatkov. Ker obe zdravili prejema veliko bolnikov, smo se odločili preveriti njun potencialen vpliv na zaviranje vnetja in 53

61 c (pg/ml) c (pg/ml) c (pg/ml) posledičnega nastanka ateroskleroze. Koncentracija na celicah je bila pri obeh učinkovinah 10 µm. Učinkovini močno vplivata na produkcijo citokinov v stimuliranih celicah HCAEC. Njun učinek na IL-6 je podoben, saj fluvastatin njegovo koncentracijo zmanjša za 39 %, kaptopril pa za 46 %. Znižanje GM-CSF je pri fluvastatinu še opaznejše, saj njegovo produkcijo zniža za kar 72 %, kaptopril pa za 32 % (slika 18). Zanimivo je, da nobena od učinkovin primarno ni namenjeno zdravljenju vnetja, vendar sta pri zmanjšanju citokinskega odziva na vnetni dražljaj, v našem primeru SAA-stimulirane HCAEC uspešnejši kot učinkovine, ki so temu v osnovi namenjene, kot so metotreksat, deksametazon in inhibitorji TNF-α IL GM-CSF Slika 18: Koncentracija IL-6 in GM-CSF v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku fluvastatina in kaptoprila IL-8 2h 4h 8h 24h t Slika 19: Koncentracija IL-8 v supernatantu v odvisnosti od časa pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku fluvastatina in kaptoprila. (čas t) B SAA fluvastatin fluvastatin+saa kaptopril kaptopril+saa Pri ugotavljanju njunega vpliva na izločanje kemokina smo se odločili, da bomo preverili tudi časovno odvisnost njegovega nastajanja v celicah. Iz rezultatov je razvidno, da celice potrebujejo nekaj ur za produkcijo IL-8 (slika 19), saj je njegova količina opazno večja šele po 24 urah. Vendar pa učinkovini na samo produkcijo IL-8 nimata večjega vpliva, saj jo zmanjšata zgolj za nekaj več kot 10 %, kar je iz rezultatov lepo razvidno v vseh časovnih obdobjih. Medtem ko obstaja veliko 54

62 c (ng/ml) c (ng/ml) podatkov o tem, da fluvastatin znižuje izražanje in koncentracijo IL-6 tako v cirkulaciji, kot v HUVEC, podatkov o njegovem vplivu na IL-8 nismo zasledili. Pri vplivu na adhezijsko molekulo VCAM-1 sta se učinkovini močno razlikovali. Fluvastatin je njeno produkcijo zmanjšal kar za 50 %, kaptopril pa le za 22 % (slika 20). Rezultati so v skladu s številnimi študijami, ki dokazujejo, da fluvastatin zmanjša izražanje adhezivnih molekul VCAM-1 in ICAM-1,-v HUVEC, inducira pa tudi enos, kar močno izboljša funkcijo endotelija in zmanjša vnetje (39). Ker je zmanjšanje koncentracije VCAM-1 zelo izrazito, lahko sklepamo, da fluvastatin preko tega mehanizma vpliva na zmanjšanje možnosti za nastanek ateroskleroze. Kaptopril na produkcijo adhezivnih molekul nima takšnega vpliva VCAM h 4h 8h 24h t ICAM-1 B SAA fluvastatin fluvastatin+saa kaptopril kaptopril+saa Slika 20: Koncentracija svcam-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku fluvastatina in kaptoprila. Slika 21: Koncentracija sicam-1 v supernatantu v odvisnosti od časa pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku fluvastatina in kaptoprila. (čas t) Pri zaviranju izločanja druge adhezivne molekule, ICAM-1 fluvastatin ni bil tako učinkovit, kot pri VCAM-1. Znižal jo je zgolj za 13 %, kaptopril pa je imel na njo podoben vpliv, kot na VCAM-1, saj je njeno produkcijo v stimuliranih celicah znižal za 25 % (slika 21). Je pa iz rezultatov razvidno, da celice ICAM-1 začnejo proizvajati bistveno prej, kot IL-8, saj je po 8 urah stimulacije celic s SAA koncentracija ICAM-1 v supernatantu že dokaj velika. V predhodnem poskusu smo ugotovili, da HCAEC gene za VCAM-1 izražajo zgolj štiri ure po stimulaciji s SAA, nato pa se izražanje ustavi (slika 4-2). Morda bi bilo smiselno preveriti tudi izražanje mrna ICAM-1. 55

63 (AE) (AE) (AE) c (pg/ml) PAI-1 Slika 22: Koncentracija PAI-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm) ob dodatku fluvastatina in kaptoprila. deluje podobno kot deksametazon. PAI-1 je v naši študiji kontrolna molekula, saj SAA v HCAEC nanj nima nikakršnega vpliva. Sami učinkovini (brez dodatne stimulacije) njegovo izločanje v supernatant HCAEC rahlo zvišata. Fluvastatin njegovo produkcijo poveča za 19 %, v kombinaciji s SAA pa jo zmanjša za 15 % (slika 22). Kaptopril njegovo produkcijo sam poveča za 26 % in v kombinaciji s SAA za 16 %. Kaptopril na produkcijo PAI-1 Sicer naj bi statini inducirali trombomodulin in koncentracijo tpa v HUVEC, ter zmanjšali koncentracijo TF, s čimer pozitivno vplivajo na koagulabilnost krvi (39). Kaptopril naj bi v gladkih mišičnih celicah zavrl aktivnost PAI-1, vendar v našem primeru njegovo izločanje v HCAEC rahlo poviša (81). Preverili smo tudi izražanje nekaterih genov ob dodatku obeh učinkovin (slika 23). Poskus je trajal dve uri, saj smo ugotovili, da je izražanje COX-2 takrat največje. 2,50E-03 2,00E-03 1,50E-03 1,00E-03 5,00E-04 0,00E+00 PPARγ 2,00E-01 1,50E-01 1,00E-01 5,00E-02 0,00E+00 COX-2 8,00E-02 6,00E-02 4,00E-02 2,00E-02 0,00E+00 IL-6 Slika 23: Izražanje genov za PPAR-γ, COX-2 in IL-6 po 2 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku fluvastatina. AE arbitrarne enote Fluvastatin je njegovo izražanje znižal za 36 %, kar je skladno s podatki iz literature, dobljenimi pri HUVEC (43). Verjetno je, da so protivnetni učinki fluvastatina v HCAEC v večji meri odvisni od njegovega vpliva na COX-2. Izražanje mrna PPARγ je fluvastatin rahlo znižal tako v nestimuliranih, kot v stimuliranih HCAEC. V literaturi najdemo podatke, da naj bi fluvastatin povečal aktivacijo PPARγ v makrofagih, vendar je njegov 56

64 (AE) (AE) (AE) učinek na HCAEC očitno drugačen (42). Je pa fluvastatin močno (kar za 68 %) znižal izražanje mrna IL-6. Glede na to, da smo z metodo ELISA ugotovili, da je koncentracija samega proteina na koncu manjša za približno 40 %, je fluvastatin očitno najbolj učinkovit v prvih urah po aplikaciji, nato pa njegov učinek pada. Učinki kaptoprila na izražanje genov po dveh urah še niso bili tako izraženi (slika 24). 3,00E-03 2,00E-03 1,00E-03 0,00E+00 PPARγ 2,00E-01 1,50E-01 1,00E-01 5,00E-02 0,00E+00 COX-2 8,00E-02 6,00E-02 4,00E-02 2,00E-02 0,00E+00 IL-6 Slika 24: Izražanje genov za PPAR-γ, COX-2 in IL-6 po 2h v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku kaptoprila. AE arbitrarne enote Za razliko od fluvastatina je blago povečal izražanje PPARγ, izražanje COX-2 pa je zmanjšal za 26 %. Na izražanje IL-6 kaptopril po dveh urah ni imel nobenega učinka, ker pa je koncentracijo izločenega proteina vseeno občutno zmanjšal, njegovi učinki na proteinskem nivoju očitno nastopijo kasneje. Glede na rezultate imata obe učinkovini pomembne protivnetne učinke. Obe občutno znižata produkcijo vnetnih citokinov in s tem zmanjšata možnost za nastanek srčno-žilnih bolezni. Fluvastatin na to vpliva tudi z zmanjšanjem ekspresije COX-2 in se glede na naše rezultate lahko primerja s protivnetnimi zdravili NSAR (DIKLOFENAK, MELOKSIKAM IN ETORIKOKSIB) V to skupino spadajo zdravila, ki na vnetje učinkujejo preko zaviranja encima ciklooksigenaze. So izjemno pogosto uporabljena zdravila, saj imajo protivnetno in protibolečinsko delovanje. Bolniki s sistemskimi avtoimunskimi boleznimi so pogosto na doživljenjski terapiji z zdravili iz te skupine. Nesteroidne antirevmatike (NSAR) razdelimo v dve skupini. V prvo skupino spadajo neselektivni inhibitorji ciklooksigenaze (inhibitorji COX), kamor spadata tudi diklofenak in meloksikam. Ti zavirajo tako COX-1, kot COX 2, kar ima številne negativne posledice, kot so poškodbe gastrointestinalnega (GIT) trakta. Da 57

65 c (pg/ml) c (pg/ml) bi omilili neželene učinke neselektivnih COX inhibitorjev so razvili selektivne COX-2 inhibitorje, koksibe. Pri njihovi uporabi se je vpliv na GIT sicer zmanjšal, vendar pa so številne klinične raziskave pokazale povečano tveganje za nastanek srčno-žilnih dogodkov. Nekatera zdravila iz te skupine so bila zaradi tega razloga celo umaknjena iz prometa. Koncentracija COX-2 se v telesu drastično poveča v odgovor na vnetne mediatorje. Proizvajati prične prostaglandine, levkotriene in tromboksane, mediatorje, ki so vpleteni v nastanek vnetja in bolečine (60). COX-2 je odgovorna tudi za sintezo 15d-PGJ 2, ki je endogeni ligand PPARγ in zavira aktivnost vnetnih transkripcijskih faktorjev. Pri našem poskusu smo se osredotočili na tri različna, za zdravljenje RA pogosto uporabljena zdravila iz skupine NSAR. Vsa tri imajo večjo afiniteto do COX-2, vendar je selektivni COX-2 inhibitor le etorikoksib. Koncentracija diklofenaka na celicah je znašala 10 µm, etorikoksiba in meloksikama pa 100 µm. Rezultati, ki smo jih dobili, so bili izjemno zanimivi. Meloksikam je skoraj v vseh primerih deloval popolnoma nasprotno od ostalih dveh učinkovin. Rezultati so bili konstantni, čeprav so bile analize narejene v različnih časovnih obdobjih, pri različnih serijah celic in zdravila. Meloksikam je v nasprotju s pričakovanjem močno povečal izražanje vnetnih citokinov. Produkcija IL-6 je narasla za 230 %, GM-CSF pa za 170 %. Ostali dve učinkovini sta delovali tako, kot smo predvidevali, in produkcijo IL-6 zmanjšali, etorikoksib za 38 %, diklofenak pa kar za 60%. Obe sta tudi zmanjšali produkcijo GM-CSF in sicer za približno 30 % (slika 25). Pri zmanjševanju citokinskega odziva sta bili učinkovini približno tako učinkoviti, kot deksametazon in metotreksat IL GM-CSF Slika 25: Koncentracija IL-6 in GM-CSF v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. 58

66 c (pg/ml) c (ng/ml) c (pg/ml) IL-8 Slika 26: Koncentracija IL-8 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. Meloksikam je enako kot na citokine deloval na IL-8 in njegovo produkcijo povečal za 270 %. Etorikoksib je njegovo koncentracijo zmanjšal za 21%, diklofenak pa za 18% (slika 26), kar je prav tako primerljivo z učinkom metotreksata in deksametazona. Ponovno pa smo ugotovili, da učinkovine veliko bolj vplivajo na produkcijo citokinov v primerjavi s kemokini, tako kot večina proučevanih učinkovin. Učinkovine, z izjemo meloksikama, so močno znižale koncentracijo VCAM-1. Etorikoksib jo je znižal za 55 %, diklofenak pa za 63 %. Meloksikam je bil pri tem manj uspešen in je njeno produkcijo zmanjšal za 21 % (slika 27). Se je pa tako, kot pri fluvastatinu ponovno izkazalo, da ima diklofenak, ki je močno znižal VCAM-1, na ICAM-1 manjši vpliv in je njeno produkcijo znižal za 38 % (slika 27). Naši rezultati so potrdili rezultate iz literature na drugem tipu endotelijskih celic, kjer je diklofenak znižal ekspresijo vseh adhezijskih molekul (61). Podatkov o njihovem vplivu na HCAEC do sedaj v literaturi nismo našli VCAM ICAM-1 Slika 27: Koncentracija svcam-1 in sicam-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. Zelo zanimivi so bili učinki NSAR na produkcijo PAI-1. Meloksikam je izločanje proteina iz HCAEC močno znižal, sam za kar 65 % in v kombinaciji s SAA za 25%. Etorikoksib je koncentracijo v kombinaciji s SAA znižal za 10 %, diklofenak pa jo je povečal za 30 % (slika 28). Meloksikam je iz tega vidika izjemno ugodno zdravilo, saj zmanjša možnost 59

67 (AE) (AE) c (pg/ml) PAI-1 Slika 28 : Koncentracija PAI-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. trombotičnih zapletov. Koksibi, pri katerih je veliko raziskav poročalo o povečanju tveganja za nastanek SŽ dogodkov, na njihov nastanek očitno ne vplivajo preko delovanja na PAI-1, saj nanj v HCAEC nimajo bistvenega vpliva. Diklofenak pa produkcijo PAI-1 občutno poveča, kar bi lahko bil razlog za njegov vpliv na povečanje tveganja za nastanek MI (60). Tudi na nivoju izražanja genov smo potrdili nasproten trend delovanja meloksikama, saj je po dveh urah prav tako pospešil ekspresijo IL-6 in sicer za trikrat, kar je v skladu z rezultati, dobljenimi pri metodi ELISA. Diklofenak po dveh urah zmanjša ekspresijo IL-6 za 47 % (slika 29). Meloksikam v nasprotju s predvidevanji resnično močno poveča produkcijo vnetnih citokinov in s tem pospešuje vnetje. 8,00E-02 6,00E-02 4,00E-02 2,00E-02 0,00E+00 IL-6 8,00E-02 6,00E-02 4,00E-02 2,00E-02 0,00E+00 IL-6 Slika 29: Izražanje gena za IL-6 po 2 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. AE arbitrarne enote Ekspresijo PPARγ je diklofenak močno zmanjšal (za 54 %), meloksikam pa povečal (slika 30), v nestimuliranih celicah kar za štirikrat, kar je možen razlog njegovega protivnetnega delovanja, ki ga kljub našim rezultatom očitno ima, saj je pri nas zelo pogosto predpisano zdravilo za zdravljenje revmatskih obolenj. Smo pa v literaturi zasledili študije, ki nakazujejo, da diklofenak izniči agonistične učinke antidiabetika rosiglitazona ob vezavi na PPARγ in deluje kot kompetitivni antagonist, s čimer kontradiktorno poveča intenzivnost vnetja (60). Naši rezultati lahko ponudijo razlago za te ugotovitve (slika 30). 60

68 (AE) (AE) (AE) (AE) (AE) 3,00E-02 2,00E-02 1,00E-02 0,00E+00 PPARγ 3,00E-03 2,00E-03 1,00E-03 0,00E+00 PPARγ Slika 30: Izražanje gena za PPARγ po 2 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. AE arbitrarne enote Tudi na izražanje samega encima COX-2 učinkovini delujeta nasprotno. Meloksikam v kombinaciji s SAA le to poveča za 37 %, v nestimuliranih celicah pa kar za 85 %. Diklofenak izražanje za 53 % zmanjša (slika 31). S tem diklofenak, deluje na zmanjšanje vnetja tudi preko zmanjšanja ekspresije in produkcije encima COX-2, kar je njegov osnovni namen, medtem ko meloksikam glede na naše podatke po dveh urah ekspresijo COX-2 še poveča in s tem svojemu osnovnemu namenu nasprotuje na celičnem modelu HCAEC (slika 31). 8,00E-01 6,00E-01 4,00E-01 2,00E-01 0,00E+00 COX-2 2,00E-01 1,50E-01 1,00E-01 5,00E-02 0,00E+00 COX-2 Slika 31: Izražanje gena za COX-2 po 2 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. AE arbitrarne enote 1,00E-03 5,00E-04 0,00E+00 SAA Slika 32: Izražanje gena za SAA po 24 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku nesteroidnih antirevmatikov. AE arbitrarne enote) 61 Sta pa etorikoksib in meloksikam po 24 urah zavrla ekspresijo SAA ob stimulaciji s SAA, etorikoksib kar za 75 %, kar pomeni, da je pri tem najučinkovitejši od vseh proučevanih zdravil, meloksikam pa za 44 %. To seveda pri obeh zdravilih pripomore k zmanjšanju vnetja (slika 32).

69 Iz rezultatov lahko sklepamo, da sta diklofenak in etorikoksib učinkovini, ki vnetje zavirata preko zmanjšanja izražanja številnih vnetnih mediatorjev. So pa skrb vzbujajoči rezultati o vplivu meloksikama na vnetje v HCAEC, saj ga glede na naše rezultate močno pospešuje tako na mrna, kot na proteinskem nivoju. Vendar pa ima za razliko od ostalih dveh učinkovin veliko prednost v tem, da zmanjša koncentracijo PAI-1 in poveča ekspresijo PPARγ. Iz rezultatov je tudi razvidno, da zdravila, čeprav spadajo v isto skupino nesteroidnih antirevmatikov vnetje očitno zmanjšujejo preko različnih mehanizmov, saj na HCAEC ne delujejo enako ANTIDIABETIKI (ROSIGLITAZON) Veliko študij se v zadnjih letih posveča proučevanju transkripcijskega faktorja PPARγ in njegovim učinkom, saj je bilo ugotovljeno, da igra izjemno pomembno vlogo pri vnetnem odzivu. PPARγ zavre ekspresijo nekaterih vnetnih citokinov in diferenciacijo imunskih celic usmeri v protivnetne fenotipe. Vedno več je tudi študij, ki proučuje vpliv PPARγ na pojav srčno-žilnih bolezni, posebej na aterosklerozo. Ugotovljeno je bilo, da je ekspresija PPARγ med formacijo aterosklerotične lehe močno povečana. In vitro študije dokazujejo, da imajo PPARγ in njegovi agonisti ateroprotektivno vlogo preko vpliva na vnetje, proliferacijo in lipidni metabolizem v makrofagih, endotelijskih celicah in GMC. Tiazolidindioni (TZD), v osnovi antidiabetične učinkovine, ki izboljšujejo občutljivost perifernih tkiv na inzulin, kamor spada tudi rosiglitazon, so sintetični ligandi PPARγ. Eden izmed njegovih naravnih ligandov je 15-deoksi-Δ12,14-prostaglandin J 2 (15d-PGJ 2 ), ki smo ga prav tako uporabili pri poskusu. PPARγ uravnavajo številne mehanizme celične signalizacije, ki so povezani s SŽ dogodki, vendar pa so rezultati kliničnih študij o vplivu TZD na aterosklerozo kljub pozitivnim rezultatom pri poskusih in vitro še vedno nasprotujoči in nedokončni (82). Rosiglitazon, katerega koncentracija na celicah je bila 30 µm, je v SAA stimuliranih celicah znižal produkcijo IL-6 za 20 % in GM-CSF za 37 % (slika 33). 62

70 c (ng/ml) c (pg/ml) c (pg/ml) c (pg/ml) c (pg/ml) 3000,0 2000,0 1000,0 0,0 IL GM-CSF IL-8 Slika 33: Koncentracija IL-6, GM-CSF in IL-8 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku rosiglitazona. V monocitih PPARγ oziroma njegovi agonisti zmanjšajo ekspresijo genov za IL-6, TNF-α in IL-1β, vendar pa pri HCAEC znižanje IL-6 ni bilo zelo opazno (2). Je pa rosiglitazon znatno znižal produkcijo drugega vnetnega citokina, GM-CSF, kar nedvomno pripomore k zmanjšanju vnetja. Na produkcijo IL-8 rosiglitazon ni imel nikakršnega vpliva (slika 33). Glede na ta rezultat lahko sklepamo, da protivnetni učinki PPARγ agonistov v endotelijskih celicah niso povezani z vplivom na sproščanje kemokinov. Rosiglitazon je znižal količino VCAM-1 v supernatantu s SAA stimuliranih HCAEC za 35 % (slika 34). Rezultate lahko vsaj delno pripišemo tudi temu, da aktiviran PPARγ v endotelijskih celicah zmanjša ekspresijo genov za AP-1 in NF-κB (82) VCAM PAI-1 Slika 34: Koncentracija svcam-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku rosiglitazona. Slika 35: Koncentracija PAI-1 v supernatantu po 24 urah pri nestimuliranih celicah (B) in po stimulaciji HCAEC s SAA (1000 nm), ob dodatku rosiglitazona. Rosiglitazon pa je močno, kar za 46 %, povečal produkcijo PAI-1 (slika 35), kar znatno poveča tveganje za nastanek MI in tromboze. Po vpogledu v literaturo smo ugotovili, da so PPAR-γ agonisti dokazano povečali produkcijo PAI-1 v HUVEC, kar bi lahko bil eden izmed razlogov povečanega tveganja za nastanek MI in smrti zaradi srčno-žilnih 63

71 (AE) (AE) dogodkov, ki jih povezujejo z uporabo rosiglitazona (82). Evropska agencija za zdravila (EMA) je leta 2010 izdala zahtevo za suspenz dovoljenja za promet z zdravili za antidiabetike, ki vsebujejo rosiglitazon. Izvedene so bile dodatne klinične študije o srčnožilni varnosti teh zdravil, ki so bila nato dokončno umaknjena iz prodaje (83). Na nivoju izražanja genov smo pri poskusu, ki smo ga izvedli, dobili zelo zanimive rezultate. Poskus smo izvedli tako, da smo 18 ur pred dodatkom rosiglitazona (30 µm) ali 15d-PGJ 2 (3µM), na celice aplicirali SAA ter ju na celicah nato skupaj pustili še dve uri, nato pa smo poskus končali. Rezultat, ki nas je najbolj presenetil, je bila skoraj popolna redukcija izražanja gena za IL-6 tako ob dodatku rosiglitazona, kot 15d-PGJ 2 (slika 36). Iz rezultata lahko sklepamo, da v prvih dveh urah po aktivaciji PPARγ v endotelijskih celicah delujejo učinkoviti mehanizmi, ki zavrejo ekspresijo IL-6, ki pa kasneje izzvenijo, saj znižanje koncentracije IL-6 v supernatantu HCAEC ni občutno manjše. Vsekakor bi bilo smiselno izvesti še nadaljnje poskuse, s katerimi bi poskusili raziskati mehanizme, ki vplivajo na to ekspresijo. Na ekspresijo gena za PPARγ sam SAA ni imel učinka (slika 36). Se je pa njegova ekspresija 3,5 povečala ob dodatku rosiglitazona, nekaj manj pa ob dodatku 15d-PGJ 2. Pokazali smo, da TZD in endogeni ligandi PPARγ v endotelijskih celicah dejansko zvišajo njegovo ekspresijo, medtem ko SAA sam na njo ne vpliva bistveno. 4,00E-03 3,00E-03 2,00E-03 1,00E-03 0,00E+00 IL-6 6,00E-05 4,00E-05 2,00E-05 0,00E+00 PPARγ Slika 36: Izražanje gena za IL-6 in PPARγ v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku PPARγ agonistov. (R - rosiglitazon; PGJ 2-15-deoksi-Δ12,14-prostaglandin J 2 ) AE arbitrarne enote Oba PPARγ agonista sta močno znižala ekspresijo genov za VCAM-1, 15d-PGJ 2 kar za trikrat, vendar oba rahlo povečata ekspresijo COX-2, ki sta jo denimo fluvastatin in kaptopril zavrla (slika 37). 64

72 (AE) (AE) (AE) COX-2 VCAM-1 3,00E-04 2,00E-04 1,00E-04 0,00E+00 1,00E-06 5,00E-07 0,00E+00 Slika 37: Izražanje genov za COX-2 in VCAM-1 v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku PPARγ agonistov. (R - rosiglitazon; PGJ 2-15-deoksi-Δ12,14-prostaglandin J 2 ) AE arbitrarne enote Je pa rosiglitazon kar za 59 % znižal ekspresijo SAA ob stimulaciji s SAA po 24 urah (slika 38), pri tem je bil od njega uspešnejši le meloksikam. To pomeni, da ima poleg domnevno negativnih vplivov na srčno-žilni sistem, zaradi katerih je bil rosiglitazon umaknjen iz prodaje, nedvomno tudi protivnetne lastnosti, ki bi jih bilo smiselno podrobneje proučiti. 8,00E-04 6,00E-04 4,00E-04 2,00E-04 0,00E+00 SAA Slika 38: Izražanje gena za SAA po 24 urah v nestimuliranih HCAEC (B), ob stimulaciji s SAA (1000 nm) in ob dodatku rosiglitazona. AE arbitrarne enote 5.4 AKTIVNOST TRANSKRIPCIJSKEGA FAKTORJA PPARγ V HCAEC Naši rezultati so pokazali, da PPARγ agonisti zmanjšajo vnetne učinke SAA, v literaturi pa smo zasledili podatek, da SAA zviša aktivnost PPARγ v hepatocitih (84), zato smo se v nadaljevanju osredotočili na aktivnost PPARγ v endotelijskih celicah. Podatkov o aktivnosti PPARγ v njih v literaturi nismo našli. Uporabili smo rosiglitazon v koncentraciji 30 µm in 1000 nm SAA. Najprej smo iz celic izolirali nuklearne ekstrakte, nato pa v njih preverili aktivnost PPARγ. Nameravali smo preveriti ali rosiglitazon, sintetični agonist PPARγ, v HCAEC poveča aktivnost PPARγ. Prvi poskus smo izvedli po štirih urah in ugotovili, da rosiglitazon za dvakrat poveča aktivnost PPARγ v endotelijskih celicah (slika 39). Ker nismo vedeli, kdaj 65

73 A A A je, ob stimulaciji z rosiglitazonom, aktivnost PPARγ največja, smo preverili tudi časovno odvisnost njene aktivnosti ob dodatku rosiglitazona. Izkazalo se je, da je aktivnost resnično največja štiri ure po dodatku PPARγ, nato pa začne padati (slika 40). Aktivnost PPARγ Aktivnost PPARγ B rosiglitazon 0 B rosigl. 4h rosigl. 8h rosigl. 22h Slika 39: Aktivnost PPARγ po štirih urah v nestimuliranih HCAEC (B) in ob dodatku rosiglitazona. A absorbanca Slika 40: Aktivnost PPARγ v nestimuliranih HCAEC (B) in v odvisnosti od časa stimulacije z rosiglitazonom. A absorbanca Nato smo preverili vpliv SAA na aktivnost PPARγ in ugotovili, da jo v nasprotju s pričakovanji za 33 % poveča (slika 41) in sicer prav tako najbolj po štirih urah, nato pa aktivnost upade. SAA ima iz tega vidika pozitiven vpliv na vnetje, saj ima PPARγ, kot smo že dejali, pri njegovem zaviranju predvidoma pomemben vpliv Aktivnost PPARγ B Li in sodelavci so preverili vpliv SAA na aktivnost PPARγ v hepatocitih (84). Njihovi rezultati so prav tako pokazali, da SAA aktivnost PPARγ v hepatocitih poveča, vendar je bilo povečanje aktivnosti PPARγ po stimulaciji s SAA veliko bolj intenzivno, kot pri HCAEC, kar kaže na to, da ima PPARγ v drugih celičnih tipih predvidoma večjo vlogo, kot v endotelijskih celicah, saj se celice na stimulacijo odzivajo intenzivneje. Pri zadnjem poskusu smo primerjali aktivacijo PPARγ s SAA v prisotnosti in odsotnosti rosiglitazona. Razvidno je, da SAA vpliva na aktivnost PPARγ v približno enaki meri, kot rosiglitazon (slika 42). SAA 2h SAA 4h SAA 16h SAA24h Slika 41: Aktivnost PPARγ ob dodatku SAA (1000 nm) v odvisnosti od časa. A absorbanca 66

74 A Njuna kombinacija pa na celice očitno ne deluje sinergistično, saj aktivnost PPARγ ostane na enakem nivoju, kot ob dodatku vsakega stimulatorja posebej. S tem smo torej potrdili, da ima SAA tudi nekatere potencialno protivnetne lastnosti, ki jih izkazuje s povečanjem aktivacije PPARγ, transkripcijskega faktorja, ki preko različnih mehanizmov deluje protivnetno. Če povzamemo, smo pri naših poskusih prišli do številnih zanimivih ugotovitev, ki v literaturi še niso bile objavljene. Pokazali smo, da sta pri zniževanju koncentracije IL-6 med najuspešnejšimi učinkovinami fluvastatin in kaptopril, katerih primarna uporaba ni namenjena blaženju vnetja. Izkazalo se je tudi, da učinkovine v nekaterih primerih bolj kot na IL-6 delujejo na GM-CSF. Ta citokin naj bi imel celo pomembnejšo vlogo pri nastanku avtoimunskih bolezni, kot IL-6, zato je njegovo zmanjšanje pri revmatičnih bolnikih lahko zelo pozitivno. Na IL-8 so vse učinkovine razen adalimumaba delovale v občutno manjši meri kot na citokine. Večinoma so bile vse učinkovine zelo uspešne pri zniževanju koncentracije adhezivne molekule VCAM-1, najuspešnejši pri tem pa je bil diklofenak. Na inhibitor serinske proteaze PAI-1 so učinkovine delovale zelo različno. Njegovo koncentracijo je najbolj povečal rosiglitazon, kar morda pripomore k neželenim učinkom, zaradi katerih je bil tudi umaknjen iz prodaje. Najbolj pa je koncentracijo PAI-1 znižal meloksikam, ki sicer v naši študiji s HCAEC v negativnem smislu odstopa od ostalih učinkovin, in preko določenih mehanizmov vnetje močno pospešuje. Pri tem mu je malo podoben tudi certolizumab pegol. Ugotovili smo, da je bil pri zaviranju izražanja mrna SAA po stimulaciji HCAEC s SAA poleg inhibitorjev ciklooksigenaze zelo učinkovit tudi rosiglitazon, ki ima, kot se je izkazalo, vseeno nekatere protivnetne lastnosti. Ugotovili pa smo tudi, da SAA povečuje aktivnost transkripcijskega faktorja PPARγ celo v enaki meri kot njegov sintetični ligand rosiglitazon in s tem poleg že znanih vnetnih lastnosti SAA izkazuje tudi nekatere protivnetne. Pri naši diplomski nalogi smo nakazali nekatere mehanizme, preko katerih različne učinkovine lahko vplivajo na vnetje. Model vnetja HCAEC bi lahko služil za proučevanje potencialnih pozitivnih kakor tudi negativnih učinkov zdravil na razvoj ateroskleroze in srčno-žilnih bolezni. Slika 42: Aktivnost PPAR-γ ob dodatku SAA (1000 nm) in rosiglitazona. A absorbanca Aktivnost PPARγ SAA rosiglitazon rosigl.+saa