(Kappaphycus alvarezii) NUÔI TRỒNG TẠI CAM RANH, KHÁNH HÒA

Transcription

1 VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) NUÔI TRỒNG TẠI CAM RANH, KHÁNH HÒA INITIAL RESEARCH ON PURIFYING CARRAGEENAN EXTRACTED FROM Kappaphycus alvarezii SEAWEAD IN CAM RANH, KHANH HOA Vũ Ngọc Bội 1, Nguyễn Văn Ninh 2 1 Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang 2 Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh Tóm tắt Carrageenan là một polysaccharid được thu nhận từ rong sụn, có thành phần cấu tạo chủ yếu từ các gốc D-galactose và 3-6 anhydro galactose liên kết nhau bằng liên kết βd (1-4) và αd (1-3) galactosid luân phiên nhau [1]. Đáng chú ý, trong gốc D-galactose được sulphate hóa, dựa vào số nhóm sulphate và vị trí đính trên mạch carbon mà phân ra các loại tồn tại trong tự nhiên như: làm da, iota, kappa. Sử dụng phương pháp sắc ký cột trao đổi ion để tinh sạch carrageenan theo phân đoạn. Sau khi giữ carrageenan trên cột dùng dung dịch NaCl 3mol rửa giải thu phân đoạn có hàm lượng carrageenan cao nhất. Abstract Carrageenan is a linear polysaccharide extracted from Kappaphycus alvarezii seawead. Carrageenan is a large molecule being made up of 3.6-anhydro-D-galactose and D-galactose residues linked with alternating (1 3) linkages and (1 4) linkages. In addition, sulfate ester groups may be present on some or all galactose units. Depending on the position and the amount of sulfate ester groups, carrageenans can be classified according to Kappa, iota, or lambda carrageenans. Carrageenans can be purified by ion exchange chromatography. Carrageenans in the ion exchange column can be released by eluting the column with 3M NaCl solution. I. MỞ ĐẦU Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Maxwell Doty, 1972) được du trồng vào Việt Nam từ những năm 1993[1]. Hiện nay, rong sụn được nuôi trồng tại các tỉnh ven biển Việt Nam từ Đà Nẵng đến Kiên Giang; tại Khánh Hòa rong sụn được nuôi trồng nhiều ở Cam Ranh, vịnh Vân Phong, Ninh Hòa và xung quanh đảo Trường Sa. Rong sụn thường được trồng theo mô hình kết hợp với nuôi các loài thủy sản khác, đây là dạng mô hình nuôi trồng kết hợp đang được quan tâm phát triển ở nước ta hiện nay. Sản lượng rong sụn ở nước ta vào khoảng 3. tấn/năm, phần lớn rong sụn được phơi khô và xuất khẩu dạng nguyên liệu thô. Trên thế giới rong sụn được dùng làm nguyên liệu để thu nhận carrageenan. Carrageenan là polysaccharid được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như trong chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, và đặc biệt là dùng trong dược phẩm. Để có thể sử dụng carrageenan trong dược phẩm người ta đòi hỏi carrageenan phải có độ tinh sạch cao. Tuy vậy, với phương pháp xử lý, nấu chiết thông thường, carrageenan thu được thường chứa nhiều tạp chất như các lọai glucid khác, khoáng và có thể còn chứa cả một số tạp chất vật lý. Do vậy việc nghiên cứu tinh chế carrageenan nhằm loại bỏ các tạp chất để thu nhận carrageenan có độ tinh khiết cao là rất cần thiết trong công nghệ. 3

2 Trong bài báo này chúng tôi chỉ trình bày một phần nghiên cứu của chúng tôi về quá trình tinh sạch carrageenan để sử dụng cho lĩnh vực dược phẩm. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là carrageenan thu nhận từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii Maxwell Doty, 1972) nuôi trồng tại Khánh Hòa. Carrageenan thu nhận từ rong sụn theo quy trình nầu chiết như sau: Rong nguyên liệu Rửa sạch Xử lý KOH Trung hòa bằng acid acetic Rửa lại Nấu chiết Lọc Kết tủa bằng cồn Sấy khô Bao gói. Carrageenan khô thu được (Hình 1) dùng làm nguyên liệu cho quá trình tinh sạch sau này. Hình 1. Hình ảnh về carrageenan 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân tích hoá học - Xác định hàm lượng tro tổng số bằng phương pháp nung theo tiêu chuẩn TCVN [3]. - Xác định ni tơ tổng số theo phương pháp Kjeldal theo tiêu chuẩn TCVN [3]. - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry [3]. - Định lượng hàm lượng ion kim loại: Fe 2+, Cu 2+, bằng máy quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS) [9]. - Xác định hàm lượng galactose tổng số theo phương pháp Duebois (1956) so màu ở bước sóng nm, trên máy so mầu UV- Vis [4] Phương pháp tinh sạch carrageenan Chuẩn bị cột trao đổi ion: Cân 5g DEAE sephadex G5, ngâm làm trương nở trong nước cất, nhồi lên cột kích thước 6 x1,5cm và tiến hành cân bằng cột [2][4][6][5]. Cân 5g carrageenan thô hòa tan trong 1ml nước cất, lọc thu dịch trong và tiến hành bơm mẫu carrageenan lên cột. Đẩy carrageenan ra khỏi cột trao đổi bằng dung dịch rửa giải có nồng độ NaCl thay đổi từ,5 5 mol, tốc độ chạy cột 4ml/phút. Tách carrageenan theo 1 phân đoạn, chọn phân đoạn có hàm lượng carrageenan cao nhất để phân tích hàm lượng sulphate và hàm lượng 3-6 anhydro galactose có trong carrageenan. Loại muối ra khỏi carrageenan tinh sạch bằng cách kết tủa bằng ethanol 96%; Rửa tủa carrageenan bằng aceton Phương pháp xác định hàm lượng carrageenan Lấy 1ml mẫu thử thêm,5ml dung dịch thuốc thử toluidine blue,1mg/ml để 3 phút và so màu ở bước sóng 62nm. Dựa vào đường chuẩn tính hàm lượng carrageenan có trong mẫu [4] Phương pháp xác định hàm lượng sulphate có trong carrageenan Lấy 1ml dung dịch thử, thêm 1ml dung dịch HCl 6M, tiếp tục thêm 5ml sorbitol 7%, sau đó thêm 1mg BaCl 2 tinh thể và lắc đều, để khoảng 2 phút và so màu ở bước sóng 47 nm. Dựa vào đường chuẩn carrageenan để tính hàm lượng carrageenan có trong mẫu và đường chuẩn K 2 SO 4 để tính hàm lượng SO 4 có nồng độ từ 1-5µg/ml [4], [6] Phương pháp xác định hàm lượng 3-6 anhydro- galactose có trong carrageenan. Lấy 1ml dung dịch thử và 1ml recorcinol acetan, lắc đều và giữ ở 2 o C trong 4 phút. Sau đó tiếp tục nâng nhiệt của hỗn hợp lên 8 o C, trong khoảng 1 phút. Làm lạnh để đưa hỗn hợp về 5 o C và so màu trên máy UV-VIS ở bước sóng 555nm [4]. Dựng đường chuẩn galactose trong khoảng 1-5µg galactose /ml. 31

3 Dựa vào đường chuẩn galactose để xác định hàm lượng 3-6 anhydro- galactose có trong carrageenan. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tinh sạch carrageenan qua cột trao đổi ion DEAE sephadex Tiến hành tách carrageenan qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 cột 6 x1,5cm, nhiệt độ tách 6 o C. Sau khi nạp carrageenan lên cột, tiến hành rửa trôi các tạp chất không gắn trên cột như các ion kim loại, một số tạp chất khác bằng nước cất. Sau đó rửa giải carrageenan ra khỏi cột bằng dung dịch rửa giải có nồng độ NaCl thay đổi từ,5 5 mol, tốc độ chạy cột 4ml/phút, thu 1 phân đoạn. Kết quả tinh sạch carrageenan được biểu diễn ở hình 2. Từ hình 2 cho thấy, khi dùng nồng độ NaCl rửa giải thay đổi tuyến tính từ,5 5M, lần lượt hàm lượng carrageenan được tách ra biến đổi tương ứng với 1 đỉnh. Khi gradient nồng độ NaCl thay đổi từ,5 3M hàm lượng carrageenan đẩy ra khỏi cột trao đổi ion tăng theo nồng độ NaCl, tại nồng độ NaCl 3M hàm lượng carrageenan đẩy ra khỏi cột đạt giá trị cực đại, tiếp tục tăng nồng độ NaCl từ 3,5 5mol hàm lượng carrageenan tách ra khỏi cột giảm xuống rất nhanh. Như vậy nồng độ NaCl thích hợp cho quá trình rửa giải carrageenan ra khỏi cột cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 (cột 6 x1,5cm) là 3M. H à m lượn g ( m g / m l ),2 3,2 3,2 2,2 2,2 1,2 1,2 N a C l C a r r a g e e n a n 5, 5 5, 4, 5 4, 3, 5 3, 2, 5 2, 1, 5 1,, 5, N ồ n g độ N a C l ( m o l ) P h â n đ oạ n Hình 2. Sắc ký đồ quá trình tinh sạch carrageenan trên cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 (cột 6 x1,5cm) 3.2. Xác định hàm lượng sunfat trong carrageenan tinh chế Tính chất đặc biệt của carrageenan thể hiện ở nhóm chức sulphate (OSO - 3 ), đây là nhóm gắn liền trên mạch carbon của phân tử 32 carrageenan. Kết quả phân tích hàm lượng sulphate trong carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 được biểu diễn trên hình 3.

4 Hàm lượng(microgam/ml) NaCl Sulphate Nồng độ NaCl (mol) Hình 3. Sự biến đổi hàm lượng sulphate trong carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 (cột 6 x1,5cm) Từ kết quả phân tích ở hình 3 cho thấy, khi dùng muối NaCl để rửa giải carrageenan qua cột trao đổi ion, tương ứng với sự thay đổi của hàm lượng carrageenan tách ra khỏi khỏi cột thì hàm lượng sulphate trong carrageenan cũng có sự khác biệt ở một số phân đoạn. Trong các phân đoạn tách ra qua cột tương ứng với nồng độ NaCl rửa giải từ,5-1m, hàm lượng sulphate trong carrageenan cũng có sự biến đổi chút ít. Tuy vậy, tại phân đoạn tương ứng với nồng độ NaCl rửa giải 3M carrageenan có hàm lượng sulphate cao nhất, tương ứng với hàm lượng carrageenan tách ra cao nhất, đồng thời tiếp tục tăng nồng độ muối lên 3,5-5 mol thì hàm lượng sulphate giảm mạnh. Nhìn chung, trong 3 phân đoạn đầu hàm lượng sulphate biến đổi có khác biệt với sự tăng hàm lượng carrageenan, nhưng về sau biến đổi tương ứng với hàm lượng carrageenan Xác định hàm lượng 3-6 anhydro trong chế phẩm carrageenan Tính chất tạo gel của carrageenan thể hiện ở nhóm chức anhydro (-OH), đây là nhóm gắn trên mạch carbon tại vị trí số 3 và 6 của phân tử carrageenan. Kết quả nghiên cứu được biểu diễn ở hình 4. Hàm lượng(mg/ml),4,4,3,3,2,2,1,1, NaCl 3-6 anhydro Phân đọan Nồng độ NaCl (mol) Hình 4. Sự biến đổi hàm lượng 3-6 anhydro trong carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 (cột 6 x1,5cm) 33

5 Từ hình 4 cho thấy, hàm lượng 3-6 anhydro tăng theo chiều tăng hàm lượng carrageenan được đẩy ra, tại phân đoạn thứ 6, tức phân đoạn đoạn tương ứng với nồng độ NaCl rửa giải 3M, hàm lượng carrageenan được tách ra nhiều nhất, tương ứng với hàm lượng sulphate và hàm lượng 3-6 anhydro cao nhất. Nhìn vậy sự biến đổi hàm lượng 3-6 anhydro trong carrageenan tỷ lệ với sự biến đổi của hàm lượng carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 (cột 6 x1,5cm) Đánh giá độ sạch của chế phẩm carrageenan sau khi tinh sạch qua cột trao đội ion DEAE sephadex G5 Carrageenan được tạo thành từ các galactose mạch thẳng với mức độ sulphat hóa khác nhau nên thành phần monosaccharid trong carrageenan chủ yếu là galactose. Kết quả phân tích hàm lượng monosaccharid, hàm lượng các ion kim loại, và các tạp chất khác của carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 được trình bày ở bảng 1 và hình 5. Bảng 1. Kết quả xác định hàm lượng các tạp chất trong carrageenan tinh chế Hàm lượng Hàm lượng Mn 2+ (µg/g) Pb 2+ (µg/g) Zn 2+ (µg/g) Hg 2+ (µg/g) protein (µg/g) nitơ tổng số Vết Vết Vết Vết Vết 1 5 xylose 3,6-anhydro galactose 6-methyl galactose glucose galactose min Hình 5. Hàm lượng đường tổng số trong chế phẩm carrageenan tinh Nhận xét và thảo luận Kết quả phân tích thành phần các chất trong carrageenan tách ra ở bảng 1 và hình 5 cho thấy carrageenan sau khi tinh chế có độ tinh sạch cao không chứa các tạp chất chứa nitơ và các ion kim loại. Mặt khác, thành phần chủ yếu chế phẩm carrageenan chính là các loại đường galactose và các dẫn xuất của galactose như 6 34

6 methyl galactose hay 3,6 anhydro galactose. Hàm lượng các lọai monosaccharid có trong chế phẩm carrageenan (tính theo đơn vị phần trăm theo tổng số mol monosaccharid có trong mẫu) như sau: hàm lượng xylose 1,7%; 3,6 anhydro galactose 4,56%; 6-metyl galactose 2,9%; galactose 4,48%mol; glucose,3%mol. Mặt dù có sự xuất của glucose với hàm lượng,3%mol nếu so sánh với các thành phần khác có trong carrageenan thì thành phần này rất thấp. Do đó, có thể xem trong chế phẩm carrageenan sau tinh chế đạt tiêu chuẩn sạch dùng cho dược phẩm. IV. KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau: 1) Nồng độ muối NaCl thích hợp cho quá trình rửa giải carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 là 3M. 2) Hàm lượng sulphate và hàm lượng 3-6 anhydro trong carrageenan tách ra qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G5 có sự tương ứng với hàm lượng carrageenan tách ra. 3) Chế phẩm phẩm carrageenan sau tinh chế không chứa các tạp chất chứa nitơ, các ion kim loại đạt tiêu chuẩn sạch dùng cho dược phẩm. Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đề xuất sử dụng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân để phân tích cấu trúc của chế phẩm carrageenan sau tinh chế để biết cấu trúc phân tử của carrageenan thuộc dạng nào. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Fred Van De Velde, Gerhard A. De Ruiter (195), Wageningen Centre for Food Sciences and TNO Nutrition and Food Research Institute, Carbohydrate Technology Department, Present address NIZO food research, PO Box 2, 671 BA Ede, The Netherlands. 2. Heukeshoven J., Dernick R. (1985), Simplifled method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining, Electrophoresis, J. Jayaraman (1998), Laboratory manual in biochemistry, Wiley Eastern Limited. 4. Rodolpho M., Albano and Paulo, A. S. Mouriio (1986), Isolation, Fractionation, and Preliminary Characterization of a Novel Class of Sulphateed Glycans from the Tunic of Styelaplicata (Chordata Tunicata)*, The Journal Of Biological Chemistry - The American Society of Biological Chemists, Inc. 5. Rushizky, G.W., Bartos(1964), Chromatography of mixed oligonucleotides on DEAE-Sephadex, Biochemistry 3, pp Terho, T. T., Kartiala, K. (1971), Method for determination of the sulphate content of glycosaminoglycans, Anal. Biochem., 41: Đống Thị Anh Đào (1999), Nghiên cứu phân tích hàm lượng Carrageenan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) ở biển Ninh Thuận, Tạp chí Khoa học công nghệ, Hà Nội. 8. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (24), Chế biến rong biển, NXB. Nông nghiệp Tp.HCM 9. Nguyễn Thị Thu Vân (24), Phân tích định lượng, NXB. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh 35