UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA KAJA ANTONČIČ

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA KAJA ANTONČIČ VPLIV RAZLIČIC TOKSINA CDTBAKTERIJE AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS NA PREŢIVELOST PRODUCENTSKIH BAKTERIJ DIPLOMSKO DELO LJUBLJANA, 2015

2

3 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA DVOPREDMETNI UČITELJ: BIOLOGIJA, GOSPODINJSTVO KAJA ANTONČIČ Mentor: doc.dr. Matej BUTALA VPLIV RAZLIČIC TOKSINA CDTBAKTERIJE AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS NA PREŢIVELOST PRODUCENTSKIH BAKTERIJ DIPLOMSKO DELO LJUBLJANA, 2015

4 ZAHVALA Zahvaljujem se mentorju doc. dr. Mateju Butali, za pomoč pri diplomskem delu in dosledno izvajanje mentorstva, kakršnega si ţeli vsak študent. Za spremljanje in pomoč pri laboratorijskem delu se zahvaljujem tudiasistentu Davorju Obradoviću. Velika zahvala gre moji mami Tanji, ki mi je študij omogočila,in drugim članom druţine, prijateljem in prijateljicam za spodbudo pri študiju. Na koncu bi se zahvalila še svojim kolegicam na fakulteti, ki so mi bile vedno pripravljene pomagati in so vsaka po svoje sooblikovale moja študijska leta.

5 POVZETEK V diplomskem delu sem predstavila pomen ustne higieneza nastajanje zobnega plakain s tem povezano teorijo temeljnega kamna predvsem pri razvoju parodontoze. Poudarek naloge je na lastnostih bakterijeaggregatibacter actinomycetemcomitans in toksinu Cdt, ki ga omenjena bakterija sintetizira. Namen diplomske naloge je bil sproţiti sintezo različice rekombinantnega toksina CdtB in preveriti vpliv toksina na bakterijsko rast. Za cilj smo si zadali izvedbo testa za analizo vpliva različice toksina CdtB na preţivelost producentske bakterije Escherichia coli. Uporabili smo metodo veriţne reakcije s polimerazo in druge osnovne molekularno biološke tehnike. Dokazali smo, da posamezna varianta toksina CdtB različno vpliva na rast producentskih bakterij in da različica in ne divji tip toksina Cdt prepreči rast bakterije Escherichia coli. ABSTRACT In my diploma I am presenting oral hygiene, dental plaque formation and in association with that, keystone pathogen hypothesis for periodontitis development.the characteristics of bacterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans, which is strongly connected to periodontal disease and its Cdt toxin are described. The purpose of the diploma, was to determine the effect of the synthesis of recombinant Cdt toxinand its varianton the growth of the producing bacteria. The aim wasto implement a test to analyze the effect of recombinant CdtB toxin variants on the survival of the producingescherichia coli. To accomplish this, we applied basic molecular-biology techniques. We showed that we can discriminate between the CdtB toxin according to the count of the colony forming, and that the toxin variant, but not the wild type CdtB toxin prevent growth of theescherichia coli. KLJUČNE BESEDE: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, toksin Cdt, parodontalna bolezen, zobni plak KEY WORDS: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cdt toxin, periodontal disease, dental plaque

6 KAZALO VSEBINE 1. UVOD USTNA HIGIENA Zobni plak Nastajanje zobnega plaka Spremembe v mikrobni sestavi oralnega biofilma Zobna gniloba Teorija temeljnega kamna Hipoteza temeljnega patogena na primeru parodontoze Parodontoza Razvrstitev parodontalnih bolezni Bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans Toksin Cdt Sinteza in sekrecija toksina Cdt Vstop aktivne komponente CdtB v jedro Apoptoza, povzročena s Cdt Test preţivelosti producentskih bakterij V delu uporabljene metode Priprava kompetentnih celic in transformacija Rezultati ZAKLJUČEK IN SKLEPI VIRI IN LITERATURA... 24

7 KAZALO SLIK Slika 1: Shematski prikaz bakterij, ki oblikujejo arhitekturo zobnega plaka v ustni votlini (povzeto po Kolenbrander idr., 2010)... 5 Slika 2: Model vpliva molekule AI2 na tvorbo zobnega plaka (povzeto po Kolenbrander idr., 2010)... 6 Slika 3: Tvorba biofilma iz treh oralnih bakterij. Posnetek pridobljen s konfokalno mikroskopijo (povzeto po Kolenbrander idr., 2010)... 8 Slika 4: Modela poteka infekcije. (A) Infekcija s P. gingivalis in (B) infekcija z bakterijo S. typhimurium (povzeto po Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012) Slika 5: Kategorije parodontalne bolezni (povzeto po Armitage, 2004) Slika 6: Posnetek bakterij A. actinomycetemcomitans, pridobljen z elektronsko mikroskopijo (povzeto po Dennis Kunkel Microscopy, 2008) Slika 7: Struktura holotoksina Cdt, določena z rentgensko kristalografijo, bakterije Haemophillus ducreyi. Podenota CdtA modro, CdtC rdeče in CdtB zeleno (povzeto po Nešić, Hsu in Stebbins, 2004) Slika 8: Model sinteze in sekrecije AaCdt pri bakteriji E. coli (povzeto po DiRienzo, 2014) 18 Slika 9: Model razvrščanja toksina Cdt v evkariontski celici (povzeto po DiRienzo, 2014). 19 Slika 10: Transformante s plazmidnim konstruktom za divji tip (desno) ali njegovo različico toksina CdtB (levo), (plošči, prikazani spodaj) ali hkrati še s plazmidom plyss (plošči, prikazani zgoraj)... 22

8 1. UVOD Sevi bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitanssintetizirajo toksin Cdt, ki toksično deluje na nekatere celice evkariontov. Bakterija je oportunistični oralni patogen, ki je močno povezana z nastankom in razvojem parodontoze. V preteklem letu so pri dveh pacientih s parodontozo v Sloveniji odkrili seva z zapisom za identično različico toksina Cdt(Obradović, Gašperšič, Seme, Maček in Butala, 2014). Toksin Cdt ali angleško»cytolethal distending toxin«je podrazred superdruţine toksinov AB. Sintetizirajo ga Gram-negativne bakterije, kot so Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Cdt toksin te baktije lahko skrajšamo kot AaCdt), Campylobacter jejuni Escherichia coli, Haeophilius ducreyi,helicobacter hepaticus, Providencia alcalifaciens, Shigella boydii in Shigella dysenteriae. Toksin Cdt je holotoksin, zgrajen iz podenote A, B in C. V večini primerov okuţenih kultur CdtB povzroča lome dvojne vijačnice DNA tarčnih celic, kar aktivira kontrolne točke celičnega cikla in vodi v prenehanje rasti ter celično smrt (DiRienzo, J. M., 2014). V diplomski nalogi bom predstavila ustno higieno in v povezavi z njo nastajanje zobnega plaka terustnih bolezni. Razloţila bom teorijo temeljnega kamna na primeru razvoja parodontoze in opisala različne vrste oziroma oblike parodontalne bolezni. Osredotočila se bom na bakterijo Aggregatibacter actinomycetemcomitans in toksin Cdt.Prikazala bom,kako poteka njegova sinteza in izločanje iz celice, korake v procesu zastrupitve ter vpliv Cdt na celično smrt. V zaključku bom predstavila izvedbo testa vpliva toksina Cdt na preţivelost producentskih bakterij. Cilj diplomske naloge je predstaviti parodontozo in vpliv bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitans na razvoj te bolezni ter izvedba testa za analizo vpliva različic toksina Cdt na rast producentske celice Escherichiacoli. Diplomska naloga bo temeljila na dveh raziskovalnih vprašanjih oziroma hipotezah: Sevi bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitanssintetizirajo številne virulenčne dejavnike, s katerimi vplivajo na razvoj parodontoze. Derivat divjega tipa toksina Cdt bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitansprepreči rast producentske bakterije Escherichia coli. 1

9 Glede na zastavljeni hipotezi v delubom predstavila vsebino strokovne literature o vplivu bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitansna razvoj parodontoze in robusten test za ločevanje med dvema oblikama toksina CdtB. 2

10 2. USTNA HIGIENA Oralno zdravje je stanje brez kroničnih ustnih in obraznih bolečin, oralnega raka ter raka na grlu, ustnih ran, prirojenih okvar, kot je razcepljena ustnica, parodontalne bolezni, zobne gnilobe, izpadanja zob in drugih motenj, ki vplivajo na ustno votlino (Coker, Ploeg, Kaasalainen in Fisher, 2013). Dobra higiena ust in zob vpliva na preprečevanje mnogih obolenj, katera pogosto niso direktno vezana zgolj na ustno votlino. Najpogostejša obolenja ust in zob, kot sta karies in parodontalna bolezen, sta med drugim posledica tudi slabe ustne higiene. Ustrezna ustna higiena pa ne ohranja le zdravja zob in ustne votline, temveč tudi drugih organov, kot so srce, krvne ţile, ledvice in sklepi. Preprečevanje kariesa in parodontalnih bolezni vključuje pravilno in redno umivanje zob in ustne votline ter redne preglede pri zobozdravniku. Poleg tega je priporočljivo tudi odstranjevanje zobnega plaka z zobno nitko in občasna uporaba ustne vodice(ljaljević, Matijević, Terzić, Andjelić in Mugoša, 2010). 2.1 Zobni plak Ustna votlina s svojimi področji, kot so površina zob, prostori med zobmi, prostor med dlesnijo in zobom, jezik, lična ter nebna sluznica in slina, predstavlja posebno okolje, ki ga naseljujejo specifične populacije mikroorganizmov normalne ustne flore. Bakterijske zobne obloge ali zobni plak so organiziran skupek čvrsto pritrjenih bakterijskih kolonij na površini zob in v obzobnem ţepu. Med imunskim sistemom telesa in bakterijami, ki sestavljajo zobni plak, se ob pravilni in redni ustni higieni vzpostavi ravnoteţno stanje, ki ohranja zdravje zob in obzobnih tkiv (Kolenbrander, Palmer, Periasamy in Jakubovics, 2010). Ker pa je ustna votlina ves čas podvrţena spremembam in prilagoditvam zaradi neučinkovitega odstranjevanja oblog, vnašanja hrane in vstopa novih mikroorganizmov, se spreminja tudi ravnoteţje med odzivom gostitelja in mikroorganizmi, kar lahko vodi v povečanje deleţa patogenih bakterij v zobnem plaku.ta lahko v neugodnih razmerah povzroča bolezni ne samo v ustni votlini, temveč tudi na drugih delih telesa (Gašperšič, 2009).Zobni plak sestavljajo metabolno aktivne, neaktivne in mrtve celice (Peterson idr., 2014). Ustni mikrobiom odraslega posameznika torej predstavlja zelo usklajeno skupnost vrst, izbrano za preţivetje v izjemno tekmovalnem in zahtevnem okolju s pogostimi spremembami 3

11 v prehranskih hranilih, kisiku, temperaturi, ph in energijskem metabolizmu. Faktorji, ki vplivajo na sestavo oralnega mikrobioma, so genetski, imunološki, vedenjski in okoljski.molekularne analize so pokazale, da v ustni votlini ljudi najdemo več kot 700 vrst bakterij, medtem ko je v zdravih ustih vsakega posameznika prisotnih od 100 do 200 različnih vrst (Paster, Olsen, Aas in Dewhirst, 2006). Kolenbrander idr.(2010) ustno votlino primerjajo z otokom, unikatnim okoljem v človeškem telesu, za katerega je značilna skoraj konstantna prisotnost tekoče vode, kratkoročna, vendar ekstremna nihanja temperature, izpostavljena trdna površina (zobje) in velike razlike v dostopnosti ogljika in dušika. Posledično ustna votlina predstavlja edino ekološko nišo za številne bakterije, izolirane iz ust. Zobni plak lahko v grobem delimo na supragingivalni biofilm, lociran na izpostavljeni sklenini, in subgingivalni biofilm, ki se nahaja pod dlesnijo in znotraj parodontalnega ţepa oziroma sulkusa (Kolenbrander idr., 2010). Določene vrste bakterij v zobnem plaku iz enostavnih sladkorjev tvorijo kislino, kar zniţa vrednost ph mikrookolja in predstavljajo glavni faktor za demineralizacijo zobne površine. Dostopnost ogljikovih hidratov v prehrani je torej pomembna za začetek in razvoj biofilma. Nadalje, nekatere bakterije, npr. bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans, sinetizirajo številne virulentne dejavnike, ki vplivajo na zdravje dlesni (Peterson idr., 2014). 2.2 Nastajanje zobnega plaka Model kolonizacije bakterij v ustih(slika 1) prikazuje, da zgodnji kolonizatorji prepoznavajo receptorje na površini zob in dlesni in so namenjeni pričvrstitvi drugih bakterij na površini zob. Pritrditev mikrobnih celic na imobilizirane bakterije imenujem koadhezija, vezavo bakterij v suspenziji pa koagregacija. Zgoraj opisane interakcije interakcije omogočijo razvoj zobnega plaka. Prvotno bakterije Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis in Streptococcus sanguinis veţejo na komplementarne receptorje na prevleki zobne površine. Pozni kolonizatorji, kot so na primer Fucobacterium nucleatum, Prevotella denticola, Aggregatibacter actinomycetescomitans in Porphyromonas gingivalis se nato vključijo v biofilm preko koagregacije z vezavo na predhodno vezane bakterije. Pomembno 4

12 pri tem je, da sevi bakterij lahko interacirajo le s posameznimi ali mnogimi,genetsko različnimi bakterijami.(kolenbrander idr., 2010). Zobna površina predstavlja substrat, ki omogoča sledenje in karakterizacijo zgodnjih vrst zobnega plaka in določanje večvrstnih skupnosti. Sklenino bakterije redko kolonizirajo v prvih osmih urah po čiščenju, v tem času pogosto zasledimo skupnosti vrst iz rodov aktinomicet, streptokokov in velionela. Slika 1: Shematski prikaz bakterij, ki oblikujejo arhitekturo zobnega plaka v ustni votlini(povzeto po Kolenbrander idr., 2010) Začetni kolonizatorji izkoristijo unikatne karakteristike, ki omogočajo oblikovanje zobnega plaka. Predstavljajo temelje za ponovno rast biofilma po vsakem čiščenju zob in ustne votline. Ker sevi Fusobacterium nucleatum koagregirajo z začetnimi, zgodnjimi in poznimi kolonizatorji, predstavljajo tako imenovani most znotraj biofilma, povezavo med sevi bakterij v biofilmu. Bakterije pa znotraj biofilma tudi komunicirajo, ena izmed bolje opisanih je signalna molekula zaznavanja celične gostote, molekula AI2, ki ima osrednjo vlogo pri signaliziranju med vrstami in je pomemben del razvoja biofilma(slika 2) (Kolenbrander idr., 2010). 5

13 Začetniki Patogeni K on ce nt ra cij a AI 2 (p M ) Vzajemnost in začetna bakterijska rast (1. in 2. stopnja) Prehodna bakterijska rast (3. stopnja) Tok Tok Tok 1.stopnja 2. stopnja 3. stopnja Ovojnica sline Zobna površina Razrast patogenih bakterij (4. stopnja) Tok 4. stopnja Slika 2: Model vpliva molekule AI2 na tvorbo zobnega plaka (povzeto po Kolenbrander idr., 2010) Primarni kolonizatorji, streptokoki in aktinomicete (slika 2), se odzivajo na najniţjo koncentracijo AI2 (pod 100 pm), da uskladijo rast zgodnjega biofilmaprvotno vezanim bakterijam na ustno sluznico, ki prekriva sklenino, se pridruţijo sevi iz rodu veilonela (2. stopnja). Ko se masa začetnikov zaradi njihove celične delitve poveča, se zveča koncentracija AI2, kar izboljša komunikacijo s prehodnimi bakterijskimi vrstami, kot so fusobacteria (3. stopnja). Ko je koncentracija AI2 v zobnem plaku najvišja (4. stopnja), se lahko razrastejo tudi patogeni(kolenbrander idr., 2010). Oralni mikroorganizmi, ki se ne morejo pričvrstiti na površino, potujejo skupaj s slino iz ust navzdol po prebavnem traktu. Ravno zaradi tegavelika večina oralnih bakterij sintetizira proteine in kemične agense, ki jim omogočijo pritrjevanje na trdne površine, prekrite z ustno sluznico, kot so zobje in epitelno tkivo. Pozni kolonizerji pa izkoriščajo koagregacijo z drugimi bakterijami, torej sintetizirajo molekule, ki jim omogočajo specifičen kontakt z genetsko raznolikimi mikroorganizmi. Koagregacija ali koadhezija bakterij je posledica 6

14 specifične interakcije med genetsko različnimi celicami, na primer med oralno bakterijo Capnocytophaga gingivalis in Actinomyces israelii. Odtod izhaja dejstvo, da sta tako kohezija kot tudi koagregacija pomembna mehanizma za rast in stabilnost večvrstnega biofilma(kolenbrander idr., 2010). Ščetkanje in nitkanje zob odstrani večino mikrobov zobnega plaka, lokalna koncentracija AI2 je za tiste, ki ostanejo, izrazito zmanjšana,potem pa se proces vrne v 1. stopnjo, ko začetniki spet prevladujejo. Prva in druga stopnja predstavljata stanje zdravja, ki ga z rutino in dosledno ustno higieno lahko vzdrţujemo. Če se redna ustna higiena ne izvaja, pride do sestave skupnosti, prikazane v stopnji 3 in 4, ki izzovejo vnetje dlesni, to pa lahko vodi do nastanka parodontoze (Kolenbrander idr., 2010). 2.3 Spremembe v mikrobni sestavi oralnega biofilma Spremembe mikrobne sestave supragingivalnega biofilma pogosto povzročijo streptokoki, ki fermentirajo ogljikove hidrate z nizko molekulsko maso do kislin, kot so acetat, format in laktat. Velik pritok sline sicer vzdrţuje vrednost ph zobne površine nad 6.0, med uţivanjem hrane in pijače pa postane koncentracija ogljikovih hidratov z nizko molekulsko maso visoka, ko zaradi intenzivnega bakterijskega metabolizma lokalni ph pade do 5. To je kritična vrednost, pri kateri pride do raztapljanja sklenine, kar vodi v karies oziroma zobno gnilobo. Ko so prehranski ogljikovi hidrati izčrpani, ph naraste in preneha raztapljanje sklenine (Kolenbrander idr., 2010). V subgingivalnem biofilmu pod dlesnijo gingivalna tekočina pronica do površine korenin zoba in tvori tekočo fazo, ki je po svoji sestavi podobna serumu. Drugačna je tudi sestava mikroflore, saj je raznolikost vrst zelo velika.nekatere izmed teh anaerobnih bakterij štejejo med parodontopatogene, na primer Porphyromonas gingivalis, ki povzročajo parodontozo. Te bakterije zavrejo gostiteljev obrambni sistem inzvečajo vnetje tkiv. Pri zdravih posameznikih prevladujejo zgodnji kolonizerji, med tem ko so parodonto-patogeni prisotni v relativno majhnem številu. Slaba ustna higiena spremeni okolje in spodbuja povečano biomaso parodontopatogenov, kar vodi v odstopanje dlesni ter izpadanje zob (Kolenbrander idr., 2010). 7

15 Slika 3 predstavlja konfokalni posnetek vzajemnih skupnosti Fusobacterium nucleatum (rdeče), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (zeleno) in Veillonella sp. (modro), ki so oblikovane kot večvrstna omreţja, zrasla v slini, v 18 urah. Razviden je intimen znotrajvrstni celični kontakt. Bakterijske celice so obarvane z vrstno-specifičnim imunoglobulinom G, konjugiranim s fluorom (Kolenbrander idr., 2010). Slika 3: Tvorba biofilma iz treh oralnih bakterij.posnetek pridobljen s konfokalno mikroskopijo(povzeto po Kolenbrander idr., 2010) 2.4 Zobna gniloba Karies ali zobna gniloba je ena najbolj razširjenih kroničnih bolezni na svetu. Posamezniki so vse ţivljenje dovzetni za to bolezen. Je primarni vzrok bolečin v ustih in lahko vodi v izgubo zob. V zgodnjih fazah ga lahko zaustavimo in spremenimo, vendar zaradi neustrezne nege pogosto napreduje in zob popolnoma uniči. Karies se oblikuje skozi časpo zapleteni interakciji med bakterijami, ki proizvajajo kislino, fermentirajočimi ogljikovimi hidrati in številnimi dejavniki gostitelja, kot so zobje in slina. Pojavlja se tako na zobni kroni kot na korenini zoba, razvije pa se lahko ţe v zgodnjem otroštvu kot agresivna zobna gniloba mlečnih zob pri dojenčkih in malčkih. Znaki demineralizacije so vidni na trdnih zobnih tkivih, sama bolezen pa se začne na površini bakerijskega biofilma oziroma zobnega plaka, ki pokriva površino zob. Zelo zgodnje spremembe sklenine s tradicionalnimi kliničnimi tehnikami in radiografičnimi metodami ni mogoče zaznati. Luknja v zobu je nadaljevanje tega procesa in predstavlja napredovanje bolezni. Demineralizacijo lahko v zgodnjih stopnjah zaustavimo z vnosom kalcija, fosfata in fluorida. Zadnji deluje kot katalizator v difuziji kalcija in fosfata v zob, kar povzroči remineralizacijo kristalnih struktur v leziji. Napredovanje, zaustavitev in sprememba zobne gnilobe je odvisna od ravnoteţja med omenjenima procesoma. Kariozne lezije se razvijejo, kjer oralni biofilmi ostanejo in zorijo na 8

16 zobeh daljše obdobje. Zobno gnilobo na sklenini najprej opazimo kot lezije belih pik oziroma majhnih območij podpovršinske demineralizacije pod zobnim plakom. Karies na površini korenin je podoben tistemu na sklenini, vendar pri njem za razliko lahko pride do zmehčanja površine, kar bakterijam v zgodnji fazi razvoja omogoča globlji prodor v tkivo. Diagnoza kariesa poteka kot vizualni pregled zobnih površin. Mednarodni trend v obvladovanju zobne gnilobe se oddaljuje od kirurškega modela in se pribliţuje k pristopu preprečevanja, kar pomeni nadzor samega začetka in napredovanja procesa v času posameznikovega ţivljenja. Sami lahko za oskrbo poskrbimo z uporabo fluoridne zobne paste(selwitz, Ismail in Pitts, 2007). Tveganje za razvoj kariesa vključuje fizične, biološke, okoljske, vedenjske dejavnikein dejavnike, vezane na ţivljenjski slog. Med zadnje štejemo visok odstotek kariogenih bakterij, nezadostno izpostavljenost fluoridu in dotok sline, slabo ustno higieno, neprimerne metode hranjenja dojenčkov in revščino. Pomanjkanje sline povzroča katastrofalne posledice, kot je hitro napredujoči karies, ki prizadene več področij v ustni votlini. Pomembno je tudi, da zobozdravniki ozaveščajo tveganja za nastanek kariesa (Selwitz, Ismail in Pitts, 2007). 3.Teorija temeljnega kamna V arhitekturi je»keystone«ali temeljni kamen osrednji podporni kamen na vrhu oboka (Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012).Predstavlja zadnji del konstrukcije in drţi vse kamne v pravilnem poloţaju, kar oboku omogoča nositi teţo(webster, 2007).Izraz seuporablja tudi za označevanje bioloških vrst, ki imajo nesorazmerno velike učinke na skupnosti glede na njihovo številnost, o katerih menijo, da tvorijo temelj za strukturoskupnosti ekosistema. Koncept obravnava moţnost prevlade ene od vrst mikroorganizmov v mikrobni zdruţbi in s tem porušitev, disbiozo ekosistema v biofilmu. Identifikacija takšnih vrstomogoči boljši vpogled v dinamiko mikrobnih zdruţbin njihovo prepletanje z gostiteljem ali okoljem. Pomembno je pojasniti mehanizme, ki vzdrţujejo ali motijo homeostazo, kar vodi v disbiozo. Ključni mikroorganizem, ki podpira in stabilizira disbiotične mikrooganizme, povezane z boleznijo, poimenujemo»keystone pathogen«ali temeljni patogen. Ti za razliko od dominantnih patogenov sproţijo vnetje tudi, ko tvorijomanjšinski deleţ mikrobne druţbe, a hkrati zatirajo razrast primarnih kolonizatorjev. 9

17 Njihova identifikacija omogoči terapije proti omenjenem naboru bakterij, ki sproţijo in promovirajo disbiozo(hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012). Na sliki 4 je predstavljen nastanek disbioze ob prisotnosti ključnega patogena. Kljub nizkemu številu bakterijporphyromonas gingivalis v ustni votlini lahko ta bakterija vodi v disbiozo, to pa lahko vodi do vnetja dlesni oziroma parodontoze. Nadalje v primeru, ko vnetje povzroči prevladujoči patogen, na primer Salmonella enterica, sevi te bakterije izkoristijo nastalo stanje in vplivajo na zgradbo mikrobne zdruţbe komenzalov v črevesju. S. typhimuriumlahko postane prevladujoča bakterija inspodbuja vnetje(hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012). Porphyromonas gingivalis»ključni patogen«vnetje Okvarjeno ubijanje levkocitov Normalno stanje mikroorganizmov v ustih S. typhimurium Dominantni patogen Disbiotično stanje mikroorganizmov v ustih Od dopolnila odvisno vnetje in izpadanje zob Vnetje Normalno stanje mikroorganizmov v črevesu Nadvlada S. typhimurium in zmanjšana raznovrstnost mikroorganizmov Slika 4: Modela poteka infekcije. (A) Infekcija s P. gingivalis in (B) infekcija z bakterijo S. typhimurium(povzeto po Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012) 3.1 Hipoteza temeljnega patogena na primeru parodontoze Parodontalna bolezen je vnetje, ki prizadene parodont in hkrati poveča pacientovo tveganje za razvoj ateroskleroze, sladkorne bolezni in revmatoidni artritis. Čeprav imajo ključno vlogo pri nastanku in razvoju te bolezni mikroorganizmi, je primarno gostiteljev vnetni odgovor tisti, ki 10

18 poškoduje tkivo. Sestava mikrobne zdruţbe se spremeni ob stanju bolezni, kar lahko interpretiramo na dva načina. Tolahkorazumemo kot znak, da je v etiologijo parodontitisa vpletena specifična patogena bakterija.lahko pa namiguje na to, da je bolezen povzročena z disbiozo normalne mikrobne zdruţbe v ustni votlini, kar vodi v spremembe v odnosu gostitelja in mikroorganizmado vnetja. Pri identifikaciji specifičnih parodontalnih patogenovso tri vrste (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola in Tannerella forythia), ki sestavljajo tako imenovani rdeči kompleks in so pogosto izolirane skupaj ter močno povezane z obolelimi področji ust(hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012). Hipoteza, da patogeni spremenijo normalno mikrobno komenzalno floro v ustih, je podprta tudi z dejstvi, da bakterije kot A. actinomcetemcomitans in P. gingivalissintetizirajo imunosupresivne molekule. Ti bakteriji sta razvili napredne strategije za izognitev komponentam gostiteljevega obrambnega mehanizma. Bakterija oslabi prirojeno odpornost tako, da spremeni rast in razvoj celotnega biofilma. Posledično bi ti bakteriji lahko bili temeljna patogenaparodontalnega biofilma, ki izzove bolezen(hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012). 4. Parodontoza Parodontoza ali parodontalna bolezen je kronična infekcija, pri kateri imajo ključno vlogo bakterije v ustni votlini. Bolezen prizadene podporne strukture zob, če je nenadzorovana, pa vodi v rahljanje in izpadanje zob. Prepoznavamo jo kot povečano globino sulkusa dlesni, nastanku parodontalnih ţepkov in izgubo parodontalne pritrditve na alveolarno kost. Parodontitis je pogosto povezan z vnetjem dlesni, ki lahko vključuje spontano krvavenje tkiv dlesni. Diagnoza bolezni vključuje klinični pregled s sondo oziroma pregled mehkega tkiva dlesni okoli zob. Drugi postopek pa je tako imenovana radiografična preiskava, torej pregled pacientovih rentgenskih posnetkov, katerim določijo količino izgubljene kosti okrog zob. V šestdesetih letih je parodontoza veljala za počasi napredujočo kronično bolezen, ki jo je teţko zatreti. Tudi mladostni parodontitis, ena izmed oblik parodontalne bolezni, je danes široko razširjen v populaciji. Stalni zobje, zlasti sekalci in prvi stalni kočniki, ki zrastejo v otroštvu, lahko izpadejo v dobi zgodnje odraslosti. Diferenciacija kliničnih mikrobnih podskupin znotraj parodontoze je privedla do opisa in prepoznave različnih bakterij za parodontalno bolezen. Za obliko hitro uničujočega parodontitisa pri odraslih je značilna bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans(tanner, 2014). 11

19 V Sloveniji je kronični parodontitis pogost, saj bolezen pri 50 letih prizadene ţe več kot 40 % populacije(obradović, Gašperšič, Seme, Maček in Butala, 2014). 4.1 Razvrstitev parodontalnih bolezni Sistem razvrščanja parodontalnih bolezni in stanj iz leta 1999 navaja sedem večjih kategorij, od katerih se kategorije 2 6 imenujejo destruktivne parodontalne bolezni, ker je njihova škoda nepovrnljiva (Armitage, 2004).Nekaj primerov iz sedmih kategorij bolezni je predstavljenih na sliki 5. Slika 5: Kategorije parodontalne bolezni(povzeto po Armitage, 2004) Slika 5 prikazuje (A) kronični parodontitis, ki je povezan s slabo ustno higieno: vnetje, poškodbe dlesni in vpliv bolezni na zasidranost zob v dlesni. To je pogosta bolezen ustne votline, ki jo sestavlja kronično vnetje parodontalnih tkiv. Povzroči ga kopičenje obilne količine zobnega plaka (Armitage G. C., 1999). Simptomi vključujejo rdečico ali krvavenje dlesni ob ščetkanju ali uporabi zobne nitke, otekanje dlesni, slab zadah in okus po kovinah. Vnetje je pogosto neboleče, vendar krvavenja kljub temu ne gre zanemariti, saj bolezen lahko napreduje. Pomemben dejavnik tveganja predstavlja tudi kajenje, zato zobozdravniki glede 12

20 zdravljenja bolezni poleg dobre ustne higiene priporočajo tudi prenehanje kajenja (Heitz- Mayfield idr., 2003). (B) Napredovani lokalizirani agresivni parodontitis (LAP), poškodbe dlesni lokalizirane. (C) Generalizirani agresivni parodontitis (GAP), večja območja vnetja in bakterijskega plaka in zobnega kamna, zvečana izguba zobne kosti je opaţena pri vseh zobeh. Agresivni parodontitis se pojavlja manj pogosto in splošno prizadene mlajše paciente kot kronični parodontitis. LAP in GAP se ne razlikujeta zgolj v obsegu, temveč tudi v etiologiji in patogenezi. Zdravljenje vključuje mehanično terapijo, zdruţeno z antibiotiki (Albandar in Tinoco, 2002). (D) Parodontitis v povezavi s sistemsko boleznijo, oseba z Downovim sindromom, območja močnih vnetij dlesni. (E) Nekrotizirajoči ulcerozni gingivitis, prisotne boleče lezije na dlesnih. Ponavadi nenaden nastop te bolezni, zato diagnozi pogosto dodajajo izraz akuten (Munksgaard, 2008). (F) Nekrotizirajoči ulcerozni gingivitis pri zdravem posamezniku. (G) Parodontalni absces so lokalizirani gnojni odseki dlesni (Hupp, Ellis in Tucker, 2008). 5.Bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans Znanstvena klasifikacija (Nørskov-Lauritsen in Killian, 2006) bakterije A. actinomycetemcomitans (slika 6): Kraljestvo: Bakterije Deblo: Razred: Proteobakterije Gamaproteobakterije Red: Druţina: Rod: Vrsta: Pasteurellales Pasteurellaceae Aggregatibacter actinomycetemcomitans Slika 6: Posnetek bakterij A. actinomycetemcomitans, pridobljen z elektronsko mikroskopijo (povzeto po Dennis Kunkel Microscopy, 2008) 13

21 Aggregatbacter actinomcetemcomitans je po Gramu-negativna, negibljiva, fakultativno anaerobna, paličasta bakterija. Pogosto jo povezujemo z lokaliziranim agresivnim parodontitisom, čeprav jo povezujejo tudi z nekaterimi okuţbami srca in oţilja. Ob primarni izolaciji iz tkiva imajo kolonije grobo teksturo zvezdaste oblike(nørskov-lauritsen in Killian, 2006). Ob naknadnih sub-kultivacijah kultura postane gladke okrogle oblike. Bakterija nosigenetske zapise za virulentne dejavnike, ki ji omogočajo, da se ogne imunskemu odzivu gostitelja in poškoduje celice obzobnega tkiva. Med virulentne dejavnike te bakterije uvrščamo tudi levkotoksine, citotoksin Cdt, lipopolisaharide, površinske antigene, ki omogočajo kolonizacijo, in determinante odpornosti proti antibiotikom(africa, Nel in Stemmet, 2014).Levkotoksin povzroči razpad človeških levkocitov in eritrocitov, medtem ko citotoksin CdtB ustavi celični cikel številnih evkariontskih celic, kar vodi v celično smrt ali apoptozo (Obradović idr., 2014).Med sevi te bakterije obstajajo razlike v nivoju sinteze določenega virulentnega dejavnika, npr. sev JP2 je v primerjavi z drugimi sevi zmoţen proizvesti znatno višje količine levkotoksina inima močan vpliv na nastanek agresivne oblike parodontitisa(äberg, Haubek, Kwamin, Johansson in Claesson, 2014). Obstaja vsaj 6 serotipov (a f) te bakterije. Serotipi se genotipsko razlikujejo zlasti v prisotnosti številnih otokov patogenosti, ki nosijo zapis za dejavnike virulence, v gostitelju pa se običajno stabilizira le po en serotip. Razporeditev določenih serotipov po svetu je različna. Serotip b je prisoten zlasti v ZDA, pri bolnikih z agresivnim parodontitisom, serotip cpa je razširjen na Kitajskem, Japonskem, v Koreji in Turčiji. Na Finskem, Švedskem in Danskem so enakomerno razširjeni serotipi a, b in c. Razporeditev glede na zemljepisni poloţaj je odvisna od zmoţnosti prilagoditve posameznih sevov bakterije na genetske raznolikosti med populacijami ljudi (Obradović idr., 2014). Do zdaj je ustna votlina ljudi edini poznani naravni habitat bakterije A. actinomycetemcomitans, ki poleg zobnih oblog kolonizira tudi druge predele ustne votline in je lahko del normalne ustne flore. Zaradi dejavnikov virulence, ki povzročajo razvoj nekaterih oblik parodontalne bolezni, je ozdravitev parodontoze odvisna od odstranitve sevov bakterije A. actinomycetemcomitans, ki nosijo zapis za virulentne dejavnike. Najuspešnejši postopek zdravljenja predstavlja kombinacija mehanske odstranitve zobnih oblog in antibiotika amoksicilina, metronidazola ali antibiotikov iz skupine tetracilinov. Do zdaj poznamo 14 celotnih genomov A. actinomycetemcomitans,iz katerih je razvidno, da je organizacija in 14

22 zastopanost genov v genomih zelo različna, kar nakazuje na visoko plastičnost genoma te bakterije(obradović idr., 2014). Človeško telo predstavlja za mikroorganizme okolje z zelo ugodnimi pogoji, kot so stabilna temperatura, zaloga hrane in dostop do kisika. V resnici pa je ţivljenje patogenov, npr. bakterije A. actinomycetemcomitans,zmoţnost njihovega preţivetja in razmnoţevanja znotraj gostitelja zelo stresno. Imunski sistem in okolje,v katerem bakterije ţivijo in tudi preţivijo, predstavljajo omejitve za rast mikroorganizmov. Obrambni sistem se je skozi milijone let razvil, da gostitelja obvaruje pred vdorom tujih organizmov, predvsem patogenov. Prvo obrambo gostitelja ne predstavlja imunski sistem, temveč fizične in kemične ovire gostitelja in komenzalna mikrobna flora. Zunanja plast koţe sestavlja suha plast keratiniziranih mrtvih celic, skozi katere ni lahko prodreti. Poleg tega komenzali na površinah človeškega telesa preprečujejo pritrditev patogenov. Druga ovira, ki preprečuje bakterijsko invazijo, pa je ţelodčni ph, ki je tako ekstremen, da večina ţivljenjskih oblik z njim ni kompatibilna. Posledično morajo bakterije razviti specialne prilagoditve, da se prilagodijo na te razmere v okolju. Poseben primer je črevo, ki patogenom predstavlja drugačen izziv. Hrane je obilno, vendar tekmovalnost med več kot 3000 vrstami predstavlja velik stresni faktor. Vrste pa imajo druga od druge tudi koristi. Tudi gostitelj v tej zgodbi ni pasivni opazovalec, njegova vloga je pomembna, saj ima posameznik unikatno sestavo mikrobne skupnosti. Ko mikroorganizmom uspe napasti gostiteljevo tkivo in se ustaliti na mestu infekcije, so stresni pogoji še vedno prisotni. Prvi cilj je pridobiti dovolj hranil, ki jih je za potrebe gostiteljevih celic dovolj, vendar so omejene na evkariontske celice. Dostopnost ţeleza je za mikroorganizme zelo omejena in povzroča velik stres. Največjo groţnjo pa predstavlja imunski sistem s fagociti in antimikrobni peptidi, ki bakterije ubijejo v sekundi. Gostitelj pa lahko aktivira tudi prilagodljiv imunski sistem ali popolno mobilizacijo antimikrobnega oroţja. Dejstvo je, da se sčasoma bakterijam vedno uspe prilagoditi na ekstremno okolje, in prav stres je tisti evolucijski pritisk, ki poganja prilagoditev. Najboljši primer teh je adaptacija na zdravila. Odpornost mikroorganizmov na antibiotike ni stvar prihodnosti, temveč se dogaja v tem trenutku in predstavlja naravni fenomen. Neustrezna uporaba antimikrobnih zdravil, slabo preprečevanje okuţb je naklonjena selekciji odpornih sevov in njihovem širjenju(van Strijp, 2014). Bakterija A. actinomycetemcomitans kot modelni patogen omogoča raziskave parodontoze. Kako pogosto naseljuje subgingivalni biofilm pacientov s kroničnim parodontitisom v Sloveniji, pa še ni raziskano. Obradović idr. (2014)so s presečno raziskavo ugotavljali 15

23 pogostost naseljevanja subgingivalnega biofilma A. actinomycetemcomitans in prisotnosti posameznih serotipov te bakterije, izolirane pri slovenskih bolnikih s kroničnim parodontitisom. Raziskali so tudi, kako pogosto sta prisotna virulentna dejavnika levkotoksin in citotoksin Cdt. 30 vključenim bolnikom, napotenim na zdravljenje parodontoze v UKC,so diagnosticiralizmerni do napredovalni parodontitis. Ugotovili so, da bakterija A. actinomycetemcomitansnaseljuje subgingivalni zobni plak sedemnajstih bolnikov. Analiza pomnoţkov genomske DNA je pokazala, da 60% izolatov predstavlja serotip c, medtem ko so preostale dejavnike virulence (ltxa, flo-1, cdta, cdtb in cdtc) odkrili pri vseh izolatih. Med izolati niso identificirali seva JP2, vendar v skladu z dosedanjimi ugotovitvami menijo, da med posamezniki obstajajo druge genske specifičnosti sevov bakterije A. actinomycetemcomitans.kljub pogostosti kroničnega parodontitisa v Sloveniji je sestava bakterijskega biofilma slabo poznana. Pri vseh bakterijskih izolatiha. actinomycetemcomitans so ugotovili, da imajo izolati zapis za vse testirane virulentne dejavnike. To nakazuje, da so sevi A. actinomycetemcomitans pri slovenskih bolnikih s kroninim parodontitisom visoko virulentni. Identifikacija krajše različice gena za katalitsko podenoto toksina Cdt (cdtb), najdena pri dveh izolatih, nakazuje na specifike sevov A. actinomycetemcomitans. Krajša različica naj bi imela spremenjeno aktivnost glede na divji tip toksina, kar lahko vpliva na virulentnost izolatov(obradović idr., 2014). 6. Toksin Cdt Toksikologija je veda, ki se ukvarja s preučevanjem strupov, identifikacijo zdravil, učinkovin in drugih snovi, ki jim je bila oseba izpostavljena iz različnih razlogov. Poleg tega toksikologija preučuje tudi škodljive učinke strupov in zdravil na telo (Bertino A. J., 2008). Toksin Cdt ali angleško»cytolethal distending toxin«uvrščamo med toksine AB. Toksine Cdt sintetizirajo po Gramu-negativne bakterije, kot so A.actinomycetemcomitans, Campylobacter jejuni Escherichia coli, Haeophilius ducreyi,helicobacter hepaticus, Providencia alcalifaciens, Shigella boydii in Shigella dysenteriae. Podenota A, CdtB, je encim s povprečno molekulsko maso 29 kda, medtem ko je komponenta B sestavljena iz dveh podenot, CdtA (23 kda) in CdtC (21 kda), ki kooperativno sodelujeta pri vezavi holotoksina CdtABC na površino tarčnih celic (slika 7).CdtC med endocitozo olajša vstop CdtB v celico. CdtB si utre pot proti jedru z degradacijo, povezano z endoplazmatskim retikulumom (ERAD) ki ji sledi translokacija skozi jedrno membrano. V jedru CdtB povzroči lome dvojne vijačnice 16

24 DNA tarčnih celic, kar vodi v inhibicijo celičnega cikla in prenehanje rasti ter smrt celice(dirienzo, 2014). Slika 7: Struktura holotoksina Cdt, določena z rentgensko kristalografijo, bakterije Haemophillus ducreyi. Podenota CdtA modro, CdtC rdeče in CdtB zeleno (povzeto ponešić, Hsu in Stebbins, 2004) 6.1 Sinteza in sekrecija toksina Cdt Podenote toksina Cdt se sestavijo znotraj celice (periplazmatski prostor) in se izločijo kot biološko aktiven holotoksin iz celice (slika 8). Hidrofobna signalna zaporedja na posamezni podenoti usmerijo podente skozi plazmalemo.prekurzorski proteini so v periplazmi procesirani s signal peptidazo I in II. AaCdtA vsebuje motiv za vezavo lipidov (lipobox), LVAC, blizu mesta cepitve na amino-terminalnem koncu proteina. Korak cepitve spusti lipocdta iz celične membrane in tako se hidrofobna podenota zasidra v notranji sloj zunanje membrane. Vsepodenote se v holotoksin sestavijo na zunanji membrani. Nastali hidrofilni holotoksin se kopiči v okolju zunaj bakterije, dokler ne prepozna specifičnega receptorja na površini tarčne celice(dirienzo, 2014). 17

25 Slika 8: Model sinteze in sekrecije AaCdt pri bakteriji E. coli(povzeto po DiRienzo, 2014) 6.2 Vstop aktivne komponente CdtB v jedro Tako kot pri drugih toksinih AB je veriga A tista, ki holotoksinu daje biološko aktivnost in mora biti transportirana skozi plazmalemo v tarčno celico. Predvsem podenota CdtA je pomembna za vezavo holotoksina na receptor evkariontske celice (slika 9). Poleg prepoznave specifičnega receptorja je drugi pomemben element vezave Cdt na celico vpletenost območja na plazmalemi, poznanega kot lipidni raft. Lipidni rafti so samoorganizirani deli lipidnega dvosloja, bogati s sfingolipidi,holesterolom in proteini,in so namenjeni specifičnim biološkim funkcijam. Po vezavi na receptor, lociran na lipidnem raftu, ostane podenota CdtA na površini. Nadalje z endocitozo vstopita podenoti B in C, ki z endosomi dostavijo kompleks v Golgijev aparat. Podenota CdtB se s pomočjo retrogradnega transporta premakne iz 18

26 Golgijevega aparata v endoplazmatski retikulum. CdtB najverjetneje stopi v jedro skozi komplekst jedrnih por in v jedru deluje genotoksično (DiRienzo, 2014). Slika 9: Model razvrščanja toksina Cdt v evkariontski celici(povzeto po DiRienzo, 2014) 6.3 Apoptoza, povzročena s Cdt Apoptoza je programirana celična smrt. Raznoliki dejavniki in draţljaji lahko sproţijo signalne poti, ki vodijo v apoptozo celic po intrinzični ali ekstrinzični poti. Ekstrinzična pot vključuje aktivacijo receptorjev smrti, medtem ko intrinzično ali mitohondrijsko pot lahko aktivira več draţljajev, ki izzovejo celični stres. V nekaterih primerih lahko ekstrinzično pot aktivira določena učinkovina, ki poškoduje DNA. Bakterijski toksini, kot tudi Cdt, lahko med infekcijosproţijo apoptozo celic gostitelja. Protein p53 nadzoruje celične procese, skupaj z zaustavitvijo celične rasti pri apoptozi, diferenciaciji in popravljanju DNA. Njegov status je medključnimi dejavniki, ki določajo občutljivost evkariontskih celic na apoptozo, kar je kritično za apoptozo, sproţeno od genotoksina. Toksin Cdt lahko sproţi apoptozo v celicah zelo različnih tipov. Mednje spadajoneproliferajoče primarne celice fibroblastnega, endotelnega in hematopoetskega izvora, CD4+ T celice, CD14+ monociti in vzpostavljene celične linije epitelnih, endotelnih in hematopoetskih rodbin(jinadasa, Bloom, Weiss in Duhamel, 2011). 19

27 7. Test preživelosti producentskih bakterij Kot ţe zgoraj navedeno, so Obradović idr. (2014) prepoznali izolata s nukleotidnim zapisom za krajšo različico genotoksina CdtB v primerjavi z zapisom, najdenem pri divjem tipu. Derivat je za 219 nukleotidov krajši od nukleotidnega zapisa divjega tipa. V praktičnem delu naloge smo analizirali preţivelost bakterij Escherichia coli z zapisom za posamezno od različic CdtB. Uporabili smo plazmidni konstrukt, ki ima gen za različico CdtB po uravnavi promotorja, ki je šibko aktiven med normalno rastjo bakterij. Hoteli smo preveriti, ali toksina različno vplivata na preţivetje producentske bakterije. Glede na to, da se je derivat toksina ohranil kar pri dveh izolatih, predvidevamo, da je pomemben za patogenezo. Posledično menimo, da je krajša različica toksina še vedno in celo bolj aktivna od divjega tipa toksina. Hipotetično tako lahko predvidimo, da derivat divjega tipa toksina Cdt bakterije A. actinomycetemcomitansprepreči rast producentske bakterije E. coli. 7.1 V delu uporabljene metode V delu uporabljeni bakterijski sev in plazmidi Pri delu smo uporabili sev BL 21 (DE3) bakterije E. coli z genotipom F - ompt gal dcm lon - hsds B (r B m - B ) λ(de3). Sev ima v gen int vstavljen fragment DNA, z zapisom za RNApolimerazo faga T7, s promotorjem lacuv5. V tem sevu se konstitutivno in šibko izraţa polimeraza T7. Z dodatkom IPTG lahko dodatno sproţimo prepisovanje RNA-polimeraze T7. Tako se izrazijo rekombinantni proteini, ki so zapisani na vektorjih pod kontrolo promotorja T7. Sev ima okvarjena tudi gena lon in ompt, z zapisom za proteazi (Mizusawa in Ward, 1982), kar nam omogoči stabilnost sintetiziranega rekombinantnega proteina. Pogosto se v sev BL 21 (DE3) z vstavljenim ekspresijskim plazmidom transformira tudi plazmid plyss (odpornost proti kloramfenikolu), ki omogoči zavrtje bazalne ekspresije promotorja T7 s produkcijo lizocima T7, naravnega inhibitorja T7 RNA polimeraze (PortEco, 2011). V študiji smo kot ekspresijski plazmid uporabili phis, z zapisom za različici toksina CdtB. V sevu brez plyss se je toksin sintetiziral v nizkih koncentracijah, a je bila njegova sinteza zavrta v sevu s plazmidom plyss. 20

28 Bakterijska gojišča Tekoče gojišče LB pripravimo tako, da enemulitru destilirane vode dodamo 10 g kazeinskega hidrolizata, 10 g NaCl in 5 g kvasnega ekstrakta. Sledi 15-minutna sterilizacija v avtoklavu pri 121 C. Tekoče gojišče LBApCm, ki ga pripravimo tako kot osnovno tekoče gojišče LB. Ohlajenemu gojišču po avtoklaviranju dodamo 100 µg/ml ampicilina (LBAp) in 34 µg/ml kloramfenikola (LBCm). Trdno gojišče LB (Luria-Bertani) pripravimo tako, da zmesi za pripravo tekočega gojišča dodamo 15 g agarja na en liter gojišča. Sledi avtoklaviranje in hlajenje ter vlivanje v sterilne petrijevke. Trdno gojišče LBApCm, ki ga pripravimo tako kot osnovno trdno gojišče LB. Ohlajenemu gojišču (50 C) po avtoklaviranju dodamo 100 µg/ml ampicilina (LBAp) in 34 µg/ml kloramfenikola (LBCm). Gojišče aseptično razlijemo v sterilne petrijevke. Gojišče SOB (ang.»super Optimal Broth«) vsebuje 20 g triptona, 5 g kvasnega ekstrakta, 0,5 g NaCl, 10 ml 250 mm KCl in 5 ml 2 M MgCl. 7.2Priprava kompetentnih celic in transformacija Bakterijske celice Bl21 (DE3),zrasle pri 37 C, in s 180 obrati na minuto, smo čez nočprecepili (1: 100, v/v) v sveţe, 50-mililitrsko gojišče LB. Bakterijsko rast smo spremljali do optične gostote 0,4 izmerjene pri 600 nm. Celice smo nato posedli s centrifugiranjem pri 4000xg v ohlajeni centrifugi (Eppendorf) na 4 C. Vsi nadaljnji koraki priprave kompetentnih celic ali transformacije so potekali na ledu. Celice smo dvakrat resuspendirali v 50 mm CaCl 2, 10 mm Tris-HCl (ph 7,0), 10-odstotni (w/v) glicerol, da smo pripravili kompetentne celice. Celice smo takoj uporabili za transformacijo plazmida phis z genom za različico toksina CdtB brez lastnega promotorja pod uravnavo promotorja T7 oziroma, kjer navedeno, hkrati še s plazmidom plyss. Transformacijo smo izvedli s toplotnim šokom. 50 µl kompetentnim celic smo dodali 1 µl plazmidne DNA in reakcijsko zmes inkubirali na ledu 30 minut. Nato smo celice izpostavili 42 C za 90 s in jih nato hranili 3 minute na ledu. Transformantam smo nato dodali 400 µl gojišča LB in jih inkubirali s stresanjem pri 37 C za 50 minut. Transformante smo nacepili na agarne plošče z dodanim ampicilinom (100 µg/ml) v primeru celic z phiscdtb (krajši ali daljši) ter na agarnih ploščah Ap (100 µg/ml), Cm (50 µg/ml) v primeru celic s plazmidoma phiscdtb in plyss. Transformante smo dokumentirali s fotoaparatom (Nikon). 21

29 7.4 Rezultati Rezultati na sliki 10 prikazujejo, da transformante z različico toksina CdtB divjega tipa rastejo normalno, a v primeru toksina s krajšo razliico CdtB zrastejo le transformante, ki imajo vstavljen tudi plazmid plyss, ki zavre sintezo genotoksina. Ti rezultati močno nakazujejo, da posamezna varianta toksina CdtB različno vpliva na rast producentskih bakterij E. coli. S tem smo potrdili drugo zastavljeno hipotezo. Slika 10: Transformante s plazmidnim konstruktom za divji tip (desno) ali njegovo različico toksina CdtB (levo), (plošči, prikazani spodaj) ali hkrati še s plazmidom plyss (plošči, prikazani zgoraj) Test je bil izveden v dveh ponovitvah, prikazane so reprezentativne slike plošč. 22

30 8. ZAKLJUČEK IN SKLEPI V diplomski nalogi sem opisala ustno higienoinv povezavi z neustrezno higienonastajanje zobnega plaka in zobne gnilobe. Poudarila sem pomenbakterije A. actinomycetemcomitansin toksina Cdt na razvoj parodontoze. Prikazala sem, kako poteka sinteza in sekrecija toksina Cdt, korake v procesu zastrupitve, vpliv Cdt na celično smrtin razvoj parodontoze. S tem sem potrdila hipotezo, da virulentni dejavniki A. actinomycetemcomitans značilno vplivajo na bolezni v ustni votlini. Da bi zavrgla ali potrdila drugo zastavljeno hipotezo, sem izvedla test preţivelosti transformant z zapisom za kratko ali daljšo razliico citotoksina CdtB. Dokaţemo, da dobimo transformante celic, ki sintetizirajo CdtB divjega tipa, a ne tistih, ki sintetizirajo krajšo različico toksina. Ta rezultat nakazuje, da je samo produkt gena CdtB, ki je za 219 baznih parov krajši od gena divjega tipa, toksičen za producentske celice E coli. S tem sem potrdila drugo zastavljeno hipotezo. Od odkritja toksina Cdt leta 1987 je razumevanje ekologije bakterijskih vrst, ki toksin sintetizirajo izjemno naraslo. Hkrati pa se je izboljšala tudi molekularna biologija celične genotoksičnosti, povzročene s Cdt. Prispevek omenjenega toksina pri začetku in trajanju infekcije in bolezni pa še vedno ni popolnoma razumljen (Jinadasa, Bloom, Weiss in Duhamel, 2011). Posledično so študije lastnosti oralnih bakterij in razumevanje biokemije njihovih produktov pomembne, da bi razumeli biologijo teh bakterij in z njim povezane ustne bolezni. 23

31 VIRI IN LITERATURA Äberg, C. H., Haubek D., Kwamin, D., Johansson, A. in Claesson, R. (2014). Leukotoxic activity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans and periodontal attachment loss. Plos one, 9 (8), Africa, C., Nel, J. in Stemmet, M. (2014). Anaerobes and bacterial vaginosis in pregnancy; Virulence factors contributing to vaginal colonsation. International Journal of Environmental Research and Public Health, 71(7), Albandar, J. M. in Tinoco, E. M. (2002). Global epidemiology of periodontal diseases in children and young persons. Periodontology 2000, 29, Armitage, G. C. (1999). Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Annals of Periodontology, 4(1), 1 6. Armitage, G. C. (2004). Periodontal diagnoses and classification of periodontal diseases. Periodontology 2000, 34, Bertino, A. J. (2008). Forensic Science: Fundamentals and Investigations. Mason: South- Western Cengage Learning. Blackwell Munksgaard. (2008).V Lindhe, J., Lang, N.P. in Karring, T. (ur) Clinical periodontology and implant dentistry. 5, Coker, P., Ploeg, J., Kaasalainen, S. in Fisher, A. (2013). A concept analysis of oral hygiene care in dependent older adults. Journal of advanced nursing69 (10) DiRienzo, J. M. (2014). Uptake and processing of the cytolethal distending toxin by mammalian cells. Toxins, 6, Gašperšič, R. (2009). Oskrba ustne votline pri parodontalnih boleznih in drugih ustnih boleznih. V Zbornik prispevkov Ustna nega vloga zdravstvene nege za zdravje ustne votline(str ) Ljubljana: Sekcija medicinskih sester v vzgoji in izobraţevanju. Hajishengallis, G., Darveau, R. P. in Curtis, M. A. (2012). The keystone-pathogen hypothesis. Nature reviews, 10,

32 Heitz-Mayfield, L. J. in drugi. (2003). Clinical course of chronic periodontitis. II. Incidence, characteristics and time of occurrence of the initial periodontal lesion. Journal of Clinical Periodontology, 30 (10), Hupp, J. R., Ellis, E. in Tucker, M. R. (2008). Contemporary oral and maxillofacial surgery.mosby Elsevier, 5, 293. Jinadasa, R. N., Bloom, S. E., Weiss, R. S. in Duhamel, G. E. (2011). Microbiology, 157, Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S. in Jakubovics, N. S. (2010). Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nature Reviews, 8, Ljaljević, A., Matijević, S., Terzić, N., Andjelić, J. in Mugoša, B. (2012). Značaj odrţavanja oralne higijene za zdravlje usta i zuba. Vojnosanitetski pregled, 69(1), Nørskov-Lauritsen, N. in Kilian, M. (2006). Reclassification of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus paraphrophilus and Haemophilus segnis as Aggregatibacter actinomycetemcomitans gen. nov., comb. nov., Aggregatibacter aphrophiluscomb. nov. and Aggregatibacter segnis comb. nov., and emended description of Aggregatibacter aphrophilus to include V factor-dependend and V factorindependent isolates. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56(9), Nešić, D., Hsu, Y. in Stebbins C. E. (2004). Assembly and function of a bacterial genotoxin. Nature, 429, Obradović, D., Gašperšič, R., Seme, K., Maček, P. in Butala, M. (2014). Genotipska karakterizacija sevov oportunističnega patogena Aggregatibacter actinomycetemcomitans pri slovenskih bolnikih s kroničnim parodontitisom, preliminarna raziskava. Zobozdravstveni vestnik, 69 (1/2), Paster, B. J., Olsen, I., Aas, J. A. & Dewhirst, F. E. (2006).The breadth of bacterial diversity in the human periodontal pocket and other oral sites. Periodontology , Peterson, S. N., Snesrud, E., Liu, J., Ong, A. C., Kilian, M., Schork, N. J. in Bretz, W. (2013). The dental plaque Microbiome in health and disease. Plos one, 8(3),