IZOLOVANJE, KARAKTERIZACIJA I ULOGA KOMPLEKSA TRANSFERINA SA VEZUJUĆIM PROTEINOM 3 ZA FAKTORE RASTA SLIČNE INSULINU

Transcription

1 UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Goran M. Miljuš IZOLOVANJE, KARAKTERIZACIJA I ULOGA KOMPLEKSA TRANSFERINA SA VEZUJUĆIM PROTEINOM 3 ZA FAKTORE RASTA SLIČNE INSULINU doktorska disertacija Beograd, 2015

2 UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Goran M. Miljuš Izolovanje, karakterizacija i uloga kompleksa transferina sa vezujućim proteinom 3 za faktore rasta slične insulinu doktorska disertacija Beograd, 2015

3 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Goran M. Miljuš Isolation, characterisation and the role of complexes formed between transferrin and insulin-like growth factor-binding protein 3 Doctoral Dissertation Belgrade, 2015.

4 Mentor: Mentor: dr Marija Gavrović-Jankulović, redovni profesor Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Olgica Nedić, naučni savetnik Institut za primenu nuklearne energije, Univerzitet u Beogradu Članovi komisije: dr Marija Gavrović-Jankulović, redovni profesor Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Olgica Nedić, naučni savetnik Institut za primenu nuklearne energije, Univerzitet u Beogradu dr Milan Nikolić, docent Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu Datum odbrane doktorske teze:

5 Obrazovanje je majmoćnije oružije koje možete upotrebiti da menjate svet Nelson Mandela Eksperimentalni deo ove doktorske disertacije urađen je u Odeljenju za metabolizam instituta INEP, Univerziteta u Beogradu, u okviru projekata pod rukovodstvom dr Olgice Nedić, naučnog savetnika INEP-a. Svom mentoru, dr Olgici Nedić, dugujem najveću zahvalnost prvenstveno zbog znanja i iskustva koje mi je nesebično prenosila tokom mog naučnog usavršavanja. Posebno joj se zahvaljujem na svesrdnoj pomoći koju mi je pružala tokom izrade svakog dela ove disertacije. Izuzetna mi je čast i privilegija što sam deo njenog naučnoistraživačkog tima, koji pod (roditeljskim) nadzorom dr Olgice Nedić podseća na pravu porodicu. Posebno se zahvaljujem dr Mariji Gavrović-Jankulović, redovnom profesoru Hemijskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, na interesovanju za moj rad od samog početka. Veliko hvala za korisne savete i sugestije, kao i za pomoć prilikom konačne izrade ove doktorske disertacije. Veliku zahvalnost dugujem i dr Milanu Nikoliću, docentu Hemijskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, na svim predlozima koji su omogućili da ova disertacija bude finalno prikazana u najboljem mogućem obliku. Iskreno i od srca se zahvaljujem mojim kolegama iz Laboratorije, sa kojima delim i više od prostora u kome radimo. Hvala na podršci, savetima, raspravama i lepom druženju Dragana R., Dragana L., Miloše, Ana i Nikola. Hvala svim kolegama iz INEPa sa kojima posao nije bio samo posao, nego i lepši deo dana. Mojoj majci Milki, ocu Miloradu i bratu Slobodanu reći hvala za podršku i ljubav koju su mi pružili i omogućili da izrastem u osobu kakva sam danas, nije dovoljno. Hvala Vam! I naravno, mojoj Jeleni dugujem najviše. Za sve što smo zajedno prošli, i što ćemo zajedno proći, za svaki trenutak kada mi je pružala podršku i uputila kritiku, i što je pokazala razumevanje za sve moje poteze u životu. HVALA TI! Goran Miljuš

6 Izolovanje, karakterizacija i uloga kompleksa transferina sa vezujućim proteinom 3 za faktore rasta slične insulinu IZVOD Sistem faktora rasta, po strukturi i funkciji, sličnih insulinu ( insulin-like growth factor - IGF) obuhvata elemente sa primarnom ulogom u regulaciji rasta, razvoja, diferencijacije ćelija kako u fiziološkim, tako i u patofiziološkim uslovima. Pored dva funkcionalna peptidna hormona, IGF-I i IGF-II, ovaj sistem sadrži molekule koji regulišu ispoljavanje njihove fiziološke funkcije. Regulatorni elementi IGF sistema su: vezujući proteini (IGFBP-1 do -6), receptori za IGF molekule: IGF-1R, IGF-2R, insulinski receptor (IR), hibridni receptor IGF-R/IR, kao i specifične proteaze. Nakon proteolize IGFBP, funkcija IGF-I/II se ispoljava interakcijom sa IGF specifičnim receptorima na površini ćelija. U kompleksu sa IGFBP-3 se nalazi 70-75% IGF peptida. Pored primarne uloge nosača IGF molekula, IGFBP-3 učestvuje i u brojnim interakcijama nezavisno od IGF. IGFBP- 3 poseduje više strukturnih domena što ga čini sposobnim za vezivanje za druge molekule i pokretanje signalnih puteva i mehanizama nezavisnih, a nekad i suprotnih, dejstvu IGF peptida poput stimulacije rasta ćelija ili pokretanja apoptotskih procesa. Jedan od partnera koji interaguje sa IGFBP-3 je transferin (Tf), glavni transporter jona gvožđa u krvi. Iako se za postojanje kompleksa IGFBP-3/Tf znalo i ranije, rezultati ove disertacije predstavljaju prvi prikaz strukturnih i funkcionalnih osobina ovih kompleksa, kao i sagledavanje njihove moguće uloge. U ovoj disertaciji je opisan optimizovan postupak za izolovanje kompleksa iz fizioloških uzoraka (seruma i tkiva), navedene su strukturne karakteristike kompleksa IGFBP-3/Tf, faktori koji utiču na njihovo formiranje, određena je koncentracija kompleksa u serumu zdravih odraslih osoba i osoba sa poremećajem u metabolizmu gvožđa, dokazana je neophodnost jona gvožđa za formiranje kompleksa i analizirana je subćelijska raspodela kompleksa u tkivu debelog creva (zdravog i tumorskog). U radu je ispitan uticaj: anemije, visoke koncentracije gvožđa i tumora debelog creva, na koncentraciju i strukturu kompleksa. Za tumor debelog creva je karakteristična sistemska anemija, praćena akumulacijom gvožđa u samom tumorskom tkivu. Na model sistemu tumora debelog creva ispitana je važnost puta internalizacije IGFBP-3 preko kompleksa sa Tf, odnosno posredstvom transferinskog receptora (TfR). Nađeno je da je koncentracija kompleksa IGFBP-3/Tf kod zdravih ljudi 241 ± 62 μg/l i da se u ovoj formi nalazi 5-7% ukupnog IGFBP-3. Kod različitih patofizioloških stanja sa poremećajem u metabolizmu gvožđa utvrđeno je da formiranje kompleksa primarno zavisi od koncentracije gvožđa, potom koncetracije IGFBP-3, ali i proteina uključenih u metabolizam gvožđa, poput feritina. Kod IGFBP-3/Tf kompleksa analiziranih u uzorcima seruma dobijenih od pacijenata sa tumorom debelog creva primećen je izmenjen način

7 glikozilovanja i povećan stepen oksidacije molekula, kao i jača interakcija sa metalnim jonima. Eksperimenti na uzorcima tkiva su pokazali da je stepen kolokalizacije IGFBP- 3/Tf/TfR izrazito visok na membranama tumorskih ćelija, što ukazuje da se internalizacija IGFBP-3 kod ovog tkiva pretežno vrši putem Tf-TfR interakcije. Pojačana ekspresija TfR na površini ćelija tumora predstavlja kompenzaciju za umanjeno prisustvo IGFBP-3 u cirkulaciji, te internalizacija ovim putem obezbeđuje ispoljavanje pro-apoptotske funkcije IGFBP-3 molekula. Ključne reči: IGFBP-3, transferin, kompleksi, jon gvožđa, transferinski receptor, metabolizam gvožđa, tumor debelog creva Naučna oblast: Biohemija Uža naučna oblast: Biohemija proteina UDK broj:

8 Isolation, characterisation and the role of complexes formed between transferrin and insulin-like growth factor-binding protein 3 ABSTRACT The insulin-like growth factor (IGF) system plays an important role in the regulation of cell growth, development and differentiation, in both physiological and pathophysiological condition. Beside two peptide hormones IGF-I and IGF-II, this system includes the following regulatory elements: six IGF-binding proteins (IGFBP-1 to -6), specific receptors for IGF (IGF-1R and IGF-2R), insulin receptor (IR), hybrid receptor (IGF-R/IR) as well as IGFBP specific proteases. When IGFBPs are proteolytically cleaved, IGF-I/II are able to exert their physiological function by interacting with specific receptors on the cell surface. Approximately 70-75% of the total IGFs, are transported in circulation in the form of ternary complexes with IGFBP-3. Besides being the principal carrier of IGF molecules, IGFBP-3 was reported to exert a number of activities which are IGF-independent. Due to its structural sub-domain organisation, this molecule is able to interact with binding partners other than IGFs, and consequently activate mechanisms and signaling cascades with independent or even opposite effects to those of IGF-I/II, such as apoptosis. One of these binding partners is transferrin (Tf), the principal iron transporter in the blood. Although the existence of IGFBP-3/Tf complexes has already been reported, the results presented in this thesis offer the first complete structural and functional characterisation of the complexes, together with the analysis of their potential role. The fully optimised method for the isolation of intact IGFBP-3/Tf complexes from serum and tissue samples has been described, some structural characteristics have been defined, the effect of iron and other factors on the formation of complexes was studied, their concentration in sera from healthy persons and patients with impaired iron metabolism disorders was measured, as well as their subcellular distribution in colon tissue (healthy and tumor tissue). The formation and concentration of IGFBP-3/Tf complexes in persons with anemia, persons with very high iron concentration or patients with colorectal carcinoma (CRC) have also been investigated. The emphasis was made on samples from patients with CRC, a disease accompanied by systemic anemia and increased iron accumulation in cancer cells. CRC was a model system for the analysis of IGFBP-3 internalisation via Tf-TfR pathway. The concentration of IGFBP-3/Tf complexes in healthy adults was measured to be 241 ± 62 μg/l, which makes up to 5-7% of the total IGFBP-3. The results have shown that in impaired iron metabolism, the formation of complexes is highly dependent on the iron concentration, then IGFBP-3 concentration, as well as the concentration of other proteins involved in iron metabolism, such as ferritin. IGFBP-3/Tf complexes isolated form serum

9 obtained from CRC patients, demonstrated altered glycosylation pattern, increased protein oxidation and a higher affinity for metal ions. Experiments with tissue samples revealed high co-localisation of IGFBP-3/Tf/TfR, especially on the membranes of cancer cells, confirming that the internalisation of IGFBP-3 in CRC pathology is predominatly mediated by the Tf-TfR interaction. The increased presence of TfR on the surface of cancer cells compensates for the reduced IGFBP-3 in the circulation, thus enabling IGFBP-3 internalisation and the expression of its pro-apoptotic role. Key words: IGFBP-3, transferrin, iron ion, complexes, transferrin receptor, iron metabolism, colorectal carcinoma Scientific field: Biochemistry Special topic: Biochemistry of proteins UDC number:

10 SKRAĆENICE ADAM - dizintegrin i metalo-proteazni enzim α2m - alfa-2-makroglobulin ALS - podjedinica nestabilna u kiselini ASA - američka asocijacija anesteziologa Asn- asparagin Bad - Bcl-povezani smrtonosni protein Bax - Bcl-povezani X protein Bcl - regulatorni protein apoptoze B-ćelijskog limfoma BMI - Body Mass Index BP - pufer za blokiranje BSA - albumin goveđeg seruma CK - kazein kinaza CNBr - cijanogen bromid CRC - colorectal cancer - kolorektalni kancer DAPI - 4,6-diamidino-2-fenilindol DEAE - dietilaminoetil DJ - denzitometrijska jedinica DNAPK - DNK proteinska kinaza DNK - dezoksiribonukelinska kiselina DNP - dinitrofenil hidrazin DSL - Diagnostics System Laboratory EC50 - efektivna koncentracija koja dovodi do inaktivacije 50% ukupnog broja ćelija/molekula ECL - lektin iz Erythrina cristagalli ECL - pojačana hemiluminiscencija ECM - vanćelijski matriks EDTA - dinatrijum-etilendiamin-tetrasirćetna kiselina

11 EE - EDTA elucija ELISA - imunoenzimski test Fuc - fukoza GAG - glikozamino glikani GH - hormon rasta GlcNAc - N-acetil-glukozamin Hb - hemoglobin HBD - heparin-vezujući domen HFE - hefestin HRP - peroksidaza iz rena HyR - hibridni receptor IAC - imunoafinitetna hromatografija IDA - iminodisirćetna kiselina IEP - imunoelektroforeza IGF - faktor rasta sličan insulinu IGFBP - vezujući protein za faktor rasta sličan insulinu IGF-R - receptor za faktor rasta sličan insulinu IgY - imunoglobulini žumanceta IHC - imunohistohemija Ileu - izoleucin IMAC - imobilizovana metal-afinitetna hromatografija INEP - institut za primenu nukealrne energije IP - imunoprecipitacija IR - insulinski receptor kb - kilobaza KBC - kliničko-bolnički centar kda - kilodalton Lac - laktoza LAC - lektin-afinitetna hromatografija

12 LCA - lektin iz Lens culinaris Leu - leucin LRP - protein povezan sa lipoproteinom LTBP - latentni TGF vezujući protein MAL - lektin iz Maackia amurensis Man - manoza MBD - metal-veujući domen MCF - Michigan Cancer Foundation MES - 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina MMP - matriksna metalo-proteinaza MS - masena spektormetrija NaA - natrijum acetat NaF - natrijum fluorid NF-B - jedarni faktor kapa B NLS - sekvenca za usmeravanje ka jedru NP - neutralizacioni pufer NSILA - nepotisnuta aktivnost slična insulinu NTA - nitrilotrisirćetna kiselina PAGE - poliakrilamidna gel elektroforeza PBS - rastvor fosfatnog pufera PHA-E - lektin iz Phaseolus vulgaris PHA-L - letin iz Phaseolus vulgaris PSA - prostata specifični antigen PZU - pufer za uzorke RAR - receptor retinolne kiseline RCA-I - lektin iz Ricinus communis RGD - tripeptid Arg-Gly-Asp RIA - radio-imuno esej ROS - reaktivne kiseonične vrste

13 RxR - retinolnii X receptor SDS - natrijum-dodecil-sulfat SELDI - surface-enhanced laser desorption ionization Ser - serin SF - faktor sulfacije SNA - lektin iz Sambucus nigra SPA - sinapinska kiselina s-wga - lektin iz Triticum vulgaris TBST - Tween rastvor tris pufera TCA - trihlorsirćetna kiselina TEMED - N,N,N,N tetrametilen-diamin Tf - transferin TfR - transferinski receptor TGF - transformišući faktor rasta TIBC - vezujući kapacitet ukupnog gvožđa TNF - faktor nekroze tumora TOF - vreme preleta TRIS - Tris(hidroksimetil)-aminometan UEA - lektin iz Ulex europaeus WGA - lektin iz Triticum vulgaris

14 Sadržaj 1. Uvod Pregled literature IGF sistem IGF peptidi IGF receptori IGF vezujući proteini IGFBP Struktura IGFBP Post-translacione modifikacije IGFBP Uloga IGFBP Transferin Struktura Tf Uloga Tf Povezanost metaboličkih puteva u kojima učestvuju IGFBP-3 i Tf Metabolizam gvožđa i njegove promene Tumor i metabolizam gvožđa Materijal i metode Osnovne hemikalije Puferi i rastvori Afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima (IMAC) Lektinska afinitetna hromatografija (LAC) Imunoafinitetna hromatografija (IAC) na IgY koloni Preparativna imunoafinitetna hromatografija SDS-PAGE i imunoblot SELDI-TOF/MS Solubilizacija ćelijskih membrane Lektin blot Derivatizacija proteina sa dinitrofenil hidrazinom (DNP) Imunohistohemija Smole... 36

15 3.4 Antitela Imunodijagnostički kompleti Biohemijski reagensi Uređaji i aparati Uzorci seruma Serumi zdravih osoba Serumi osoba sa povećanom koncentracijom gvožđa Serumi osoba sa smanjenom koncentracijom gvožđa Serumi pacijenata sa dijagnostikovanim kolorektalnim karcinomom Serumi profesionalnih sportista Uzorci tkiva Hromatografske metode Lektinska afinitetna hromatografija (LAC) Imunoafinitetna hromatografija (IAC) na smoli sa imobilizovanim IgY antitelima Preparativna imunoafinitetna hromatografija za izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa Elektroforetske metode Imunoelektroforeza (IEP) SDS poliakrilamidna gel-elektroforeza i Western imunoblot Lektinski blot Testovi vezivanja liganda Denzitometrijska obrada rezultata Imunoprecipitacija proteinskih kompleksa Masena spektrometrija SELDI-TOF (Surface-enhanced laser desorption ionization - time of flight) Ultrafiltracija Izolovanje ćelijskih membrane i citosola iz tkiva debelog creva Derivatizacija karbonilnih grupa proteina dinitrofenil hidrazinom (DNP) Imunohistohemijska (IHC) detekcija proteina Statistička obrada podataka Cilj istraživanja Rezultati i diskusija... 53

16 5.1 Izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma zdravih osoba Ispitivanje specifičnosti antitela Afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima (IMAC) za izolovanje kompleksa IGFBP-3/Tf iz seruma Lektinska afinitetna hromatografija (LAC) za izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma Imunoafinitetna hromatografija za izolovanje kompleksa IGFBP-3/Tf iz seruma Preparativna imunoafinitetna hromatografija za izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma Imunoelektroforeza za izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma Karakterizacija izolovanog IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma zdravih osoba Značaj metalnog jona za stvaranje i interakcije IGFBP-3/Tf kompleksa Ispitivanje glikana na izolovanim IGFBP-3/Tf kompleksima Ispitivanje nekih fizičko-hemijskih karakteristika izolovanog IGFBP-3/Tf kompleksa metodom SELDI-TOF MS Ispitivanje prisustva karbonilnih grupa na izolovanim IGFBP-3/Tf kompleksima Određivanje koncentracije IGFBP-3/Tf kompleksa u serumu zdravih odraslih osoba Uticaj intenzivne fizičke aktivnosti na koncentraciju kompleksa IGFBP-3/Tf u serumu zdravih osoba Ispitivanje fiziološke uloge kompleksa IGFBP-3/Tf Ispitivanje interakcije IGFBP-3/Tf kompleksa sa receptorima na zdravom tkivu debelog creva Ispitivanje promene strukture i distribucije IGFBP-3/Tf kompleksa kod osoba u određenim patofiziološkim stanjima Isptivanje promene koncentracije IGFBP-3/Tf kompleksa u cirkulaciji osoba sa izmenjenim metabolizmom gvožđa Isptivanje promene strukture IGFBP-3/Tf kompleksa i reaktivnosti IGFBP- 3 u cirkulaciji osoba sa tumorom debelog creva Ispitivanje promene strukture i distribucije IGFBP-3/Tf kompleksa u tkivu debelog creva pacijenata sa tumorom Zaključci Literatura... 95

17

18 1. Uvod

19 Kontrola procesa rasta, mitoze, razvoja i diferencijacije ćelija, kao i oporavka tkiva, se odvija pod uticajem sistema faktora rasta sličnih insulinu ( insulin-like growth factors, IGF). IGF sistem predstavlja evolutivno staru funkcionalnu celinu koju čine dva peptidna hormona (IGF-I i IGF-II), šest vezujućih proteina (IGFBP-1 do IGFBP-6), receptori (IGF-1R, IGF-2R, insulinski, IR i hibridni receptor, IR/IGF-1R) i specifične proteaze. Uloga IGF molekula ostvaruje se vezivanjem za receptore na površini ćelija, koji zatim pokreću ćelijske signalne procese. Mnoga tkiva sintetišu IGF molekule, a njihov transport, čuvanje i usmeravanje obavljaju IGFBP. U cirkulaciji se nalaze IGF peptidi pretežno poreklom iz jetre, u binarnim i tercijarnim kompleksima sa IGFBP, a u slobodnoj formi je jako mali deo (oko 1%). IGF-I i IGF-II u slobodnoj formi su fiziološki aktivni. Dostupnost receptorima, preko kojih ispoljavaju svoje efekte, regulisana je na tri nivoa: koncentracijom određenog IGFBP, mogućnošću prelaska IGFBP kroz određene fiziološke barijere i afinitetom IGFBP. Koncentracija IGFBP najviše zavisi od stepena sinteze u specifičnim ćelijama, a u manjoj meri od brzine uklanjanja. Slobodu kretanja IGFBP reguliše oblik u kome se nalaze (binarni ili tercijarni kompleksi) i, u izvesnoj meri, posedovanje domena koji omogućavaju specifične interakcije sa drugim molekulima. Afinitet prema IGF zavisi od primarne strukture IGFBP i post-translacionih modifikacija. Oslobađanje IGF iz kompleksa sa IGFBP događa se kad afinitet IGFBP postane manji od afiniteta receptora za IGF. U fiziološkim uslovima, proteoliza i druge post-translacione modifikacije IGFBP obezbeđuju ove promene. Glavni vezujući protein IGF sistema i glavni nosilac IGF-I/-II molekula u cirkulaciji je IGFBP-3. Zajedno sa IGF ligandom i podjedinicom nestabilnom u kiselini ( acid-labile subunit, ALS) stvara tercijarne komplekse mase oko 150 kda. U ovoj vrsti kompleksa se nalazi % ukupnih IGF-I/-II, što IGFBP-3 čini glavnim regulatorom dejstva IGF. Tercijarni kompleksi su depoi IGF, pošto ne mogu izaći van krvnih sudova, produžavaju poluživot liganda, štiteći ih od proteaza, i transporteri su IGF po organizmu. IGFBP-3 može da interaguje sa pojedinim sastojcima vanćelijskog matriksa ( extracellular matrix, ECM), omogućavajući usmeravanje i koncentrovanje faktora rasta na mestima povrede ili remodelovanja tkiva. Pošto je afinitet IGFBP-3 prema IGF oko sto puta veći od afiniteta receptora, njegova sposobnost hvatanja slobodnih IGF sprečava spontano vezivanje IGF za receptore, što je posebno važno u situacijama kada treba ograničiti aktivnost IGF. IGFBP-3 je, prema tome, glavni inhibitor dejstva IGF kod različitih tumora. 2

20 Pored funkcija koje su direktno vezane za IGF, IGFBP-3 ispoljava veći broj uloga nezavisnih od IGF. On može direktno podsticati rast, diferencijaciju i preživljavanje ćelija nakon interakcije sa određenim membranskim proteinima. Ipak, osnovna samostalna uloga IGFBP-3, suprotna ulozi IGF, jeste pro-apoptotska. Dvojaka uloga IGFBP-3 se ne može objasniti samo funkcionalnim karakteristikama IGFBP-3 molekula, koje su neposredna posledica njegove strukture; dodatno obajašnjenje treba tražiti u karakteristici molekula da, pored sposobnosti vezivanja IGF, stupa u specifične interakcije sa drugim molekulima, kao posredni rezultat strukture ovog molekula, kako u cirkulaciji, tako i u vanćelijskim i unutarćelijskim prostorima. Ove interakcije su odgovorne za različite obrasce ponašanja IGFBP-3, dovode do promene u strukturi i orijentaciji, i mogu predstavljati raskršća koja usmeravaju specifičnu aktivnost IGFBP-3. Jedan od partnera u stvaranju kompleksa sa IGFBP-3 u cirkulaciji je molekul transferina (Tf). Tf je ključni faktor u regulaciji metabolizma gvožđa, pošto je njegov glavni transportni protein. Koncentracija gvožđa u cirkulaciji i tkivima se menja u skladu sa fiziološkim potrebama (povećana fizička aktivnost, trudnoća), ili u skladu sa patološkim promenama u metabolizmu gvožđa (anemija, hipoksija, bolest jetre, tumor). Transport gvožđa se do ćelije korisnice odvija posredstvom Tf, koji se na samoj ćelijskoj membrani vezuje za Tf receptor (TfR) i internalizuje u ćeliju. Iako je poznato da IGFBP-3 formira komplekse sa Tf, oni su malo izučavani i njihova uloga nije poznata. Rezultati ove doktorske disertacije ukazali su na faktore koji definišu uslove stvaranja kompleksa IGFBP-3/Tf, izmerena je koncentracija kompleksa u cirkulaciji, ispitan je i standardizovan postupak njihovog izolovanja (iz seruma i tkiva), analizirane su strukturne karakteristike kompleksa i utvrđena je važnost metalnog jona (posebno jona gvožđa) za njihovo formiranje. Dalje je ispitan efekat izmenjene potrebe organizma za gvožđem (kod profesionalnih sportista), kao i efekat izmenjenog metabolizma gvožđa (kod anemija i velike koncentracije gvožđa) na stvaranje kompleksa. Posebno su analizirani kompleksi IGFBP-3/Tf kod pacijenata sa tumorom debelog creva ( colorectal carcinoma, CRC), za koje je karakteristična sistemska anemija i ćelijska akumulacija gvožđa u tumoru. Pored karakterizacije kompleksa formiranih u cirkulaciji, ispitana je njihova lokalizacija u tkivu debelog creva kod pacijenata sa CRC, u cilju izučavanja mogućeg značaja putanje internalizacije IGFBP-3/Tf preko TfR. Pošto je otkriveno više membranskih proteina koji mogu interagovati sa IGFBP-3, cilj je bio da se uvtrdi koliki je značaj TfR za unutarćelijski transport IGFBP-3. Rezultati koji su dobijeni doprineli su 3

21 boljem razumevanju mesta IGFBP-3/Tf u biohemijskim procesima u organizmu, posebno onim vezanim za metabolizam gvožđa. Za konačnu potvrdu uloge ovog kompleksa, neophodni su dodatni eksperimenti sa različitim tipovima ćelija i/ili tkiva. 4

22 2. Pregled literature

23 2.1 IGF sistem Sistem faktora rasta sličnih insulinu (IGF) podrazumeva multifunkcionalni sistem u čijem su sastavu dva peptidna hormona (IGF-I i IGF-II), receptori (IGF-1R i IGF-2R), šest vezujućih proteina (IGFBP-1 do IGFBP-6) i proteaze specifične za IGFBP [1, 2]. Zbog strukturne i funkcionalne homologije IGF sa insulinom, IGF sistem je usko povezan sa insulinom, insulinskim receptorima (forme IR-A i IR-B) i hibridnim receptorima (HyR, IR/IGF-1R). Svi navedeni molekuli (Slika 1) zajednički regulišu ćelijski rast, diferencijaciju i proliferaciju, proces apoptoze i ćelijsku migraciju. Zbog homologije sa insulinom, IGF molekuli se vezuju za IR i utiču na metaboličke procese i energetski balans u organizmu, ali sa daleko manjom potentnošću. Svoju aktivnost IGF sistem ispoljava od embrionalne faze do kraja života, s tim da svaki životni period karakteriše veća, odnosno manja, aktivnost pojedinih elemenata sistema. Slika 1. Šematski prikaz elemenata IGF sistema u širem smislu. Slika je prilagođena iz [16] IGF peptidi Kada su otkriveni sredinom prošlog veka [3], peptidi su označavani kao faktori sulfatacije ( sulphatation factors, SF) ili faktori slični insulinu čija se aktivnost ne može potisnuti ( non-supresible insulin-like activity, NSILA) [4-6], ali i kao posrednici dejstva hormona rasta ( growth hormone, GH), odnosno somatomedini [7, 8]. Dugo godina nije uočeno da je reč o istim molekulima, kao i da postoje dva tipa, IGF-I i IGF- II. Stepen homologije ova dva peptidna hormona je oko 70% (Slika 2), a između njih i 6

24 insulina je oko 50% [9]. IGF-I i IGF-II se sastoje od jednolančanih peptida od 70, odnosno 67 aminokiselinskih ostataka [10], molekulskih masa 7649 Da [11], odnosno 7469 Da [12, 13]. Peptidni lanci su organizovani u pet domena: B, C, A, D i E (redom od N kraja). Homologija sa molekulom insulina je u domenima B, C i A, dok se domen E proteolitički odvaja tokom sazrevanja IGF-II. Slika 2. Struktura molekula IGF-I, IGF-II i insulina. Homologi domeni IGF-I i IGF-II su obojeni plavo, crveno i roze, IGF-I i insulina tirkizno, a IGF-II i insulina narandžasto. (Izvor 3D prikaza molekulskih struktura i strukturnog preklapanja: Glavno mesto sinteze ovih faktora je jetra, ali ih sintetišu i mnoga druga tkiva [14, 15]. Sinteza IGF poreklom iz jetre je pod uticajem GH [1, 16] i dejstvo je pretežno endokrino, dok oni nastali u drugim tkivima deluju uglavnom autokrino i parakrino [12]. IGF-I je primarni faktor rasta u post-natalnom i odraslom periodu života, dok je IGF-II glavni faktor rasta tokom unutarmateričnog razvoja embriona [17]. O ulozi IGF- II se malo zna u kasnijem periodu života. Pretpostavlja se da ima značaja u određivanju dugovečnosti organizma, ali ne i na koji način [18]. IGF molekuli su potentni mitogeni i ispoljavaju anaboličko dejstvo stimulišući sintezu DNK [10, 19, 20]. Oni su ujedno i inhibitori/blokatori apoptotskih procesa [21-23]. IGF peptidi podstiču pokretljivost ćelija aktivacijom aktina [13] ili signalnih puteva odgovornih za kretanje [24, 25]. Koliko je 7

25 ova karakteristika poželjna kod zdravog rasta ćelija i tkiva, toliko je negativna kod metastatskog širenja tumora. Radi povećanja metastatskog potencijala, neke ćelije tumora same luče IGF, koji autokrino stimuliše pokretljivost i dalje razmnožavanje [26]. Sve navedene funkcije IGF se ostvaruju posredstvom interakcija sa membranskim receptorima IGF receptori Receptori IGF sistema su transmembranski i ima ih četiri: IGF-1R, IGF-2R, IR i HyR [27]. Afinitet receptora za IGF-I, IGF-II i insulin je različit. IGF-1R vezuje IGF-I sa najvećim afinitetom, šest puta manji afinitet ima prema IGF-II, a sto puta manji prema insulinu [16]. IGF-2R gotovo isključivo vezuje IGF-II [28]. IR vezuje insulin sa velikim afinitetom, u zavisnosti od izoforme može vezati i IGF-II sa velikim afinitetom, a IGF-I vezuje daleko slabije [29]. Na kraju, HyR vezuje IGF peptide sa većim afinitetom nego insulin [30]. IGF-1R i IR su homologi receptori i pripadaju familiji proteina tirozin kinazne aktivnosti [31-34]. Sastoje se iz dve α i dve β subjedinice, koje grade heterotetramerni protein [35-37]. IR postoji u dve izoforme: izoforma A (IR-A), koja je pretežno zastupljena u fetalnom i tumorskom tkivu, i izoforma B (IR-B), koja je šire zastupljena [38]. Afinitet IR-A prema IGF-II je vrlo veliki i približan afinitetu prema insulinu [39]. IGF molekuli vezani za IR aktiviraju metaboličke procese kao insulin [40]. Vezivanjem IGF za IGF-1R aktiviraju se procesi sinteze i popravke oštećene DNK [41, 42], ćelijska proliferacija i diferencijacija [43, 44], kao i metabolizam glukoze [45]. Inaktivacijom ovog receptora dolazi do zastoja u rastu [46]. U tkivima koja zahtevaju veći unos energije, veća je koncentracija IR i IGF-1R i veći je udeo HyR [47]. HyR(A) ima afinitet prema IGF-I i IGF-II sličan kao IGF-1R, a efekti aktivacije su sličniji efektu aktivacije IR. Sa druge strane, afinitet HyR(B) je veliki za IGF-I (EC50 1,5 nm), višestruko manji za IGF-II (EC50 10 nm) i skoro zanemarljiv za insulin (EC50 > 100 nm) [30]. IGF-2R je jednostruki polipeptidni lanac koji gradi transmembranski receptor [48] i ne ispoljava tirozin kinaznu aktivnost. Vanćelijski domen poseduje vezujuća mesta za IGF-II i ligande koji sadrže manoza-6-fosfatne (M6P) ostatke [49-51]. Vezivanje IGF-II i M6P liganda se uglavnom ne odigrava istovremeno, zbog konformacionih promena receptora nakon vezivanja jednog liganda i sternih smetnji. Nakon internalizacije, IGF- 8

26 2R usmerava IGF-II i molekule koji poseduju M6P ka lizozomima u cilju degradacije [51, 52]. Osnovna uloga IGF-2R je regulisanje (uklanjanje) koncentracije IGF-II u cirkulaciji, bez dodatne ćelijske signalizacije. Vrlo je važna ravnoteža u ekspresiji IGF- 1R i IGF-2R, a posebno na ćelijama tumora [53, 54]. Smanjeno prisustvo IGF-2R omogućava pojačanu stimulaciju IGF-1R i rast tumora [52], što je dalo povoda da se IGF- 2R proglasi tumorskim supresorom IGF vezujući proteini Za razliku od insulina, čije se lučenje i sinteza regulišu koncentracijom glukoze u cirkulaciji, sinteza IGF se odvija neprekidno i njihova koncentracija u cirkulaciji je relativno velika ( ng/ml), veća nego insulina (0,5-5 ng/ml) [55]. Sinteza IGF je regulisana fiziološkim potrebama rasta, razvoja ili oporavka, a pod uticajem je drugih hormona, citokina i ishrane [56-58]. Kao što je već rečeno, samo slobodni IGF peptidi su fiziološki aktivni, a stepen slobode kontrolišu IGFBP. Svih šest vezujućih proteina gradi binarne komplekse sa IGF, dok IGFBP-3 i IGFBP-5, u prisustvu ALS, grade i tercijarne komplekse. IGFBP se sastoje od aminokiselinskih ostataka, vezuju IGF peptide sa većim afinitetom nego receptori [59-62] i ispoljavaju veliki stepen strukturne homologije, do 60% u pojedinim domenima [14, 63, 64]. U strukturi svakog IGFBP mogu se prepoznati tri domena: N terminalni, C terminalni i centralni ( linker, L) domen (Slika 3). U svakom IGFBP postoji signalna sekvenca za izlučivanje čija je dužina, u zavisnosti od IGFBP, aminokiselinskih ostataka [61]. Dok su N i C domeni očuvani u svim IGFBP i sadrže većinu cisteinskih ostataka (10-12 u N domenu i 6-8 u C domenu), u centralnom domenu su ključne razlike između IGFBP (samo 15% homologije među molekulima) [65]. Za vezivanje IGF odgovorni su N i C domeni, koji formiraju džep visokog afiniteta [66-72]. 9

27 Slika 3. Strukturni domeni i karakteristike IGFBP. Preuzeto i prilagođeno iz [61]. Najveća razlika između IGFBP je u L domenu, u kome se događaju posttranslacione promene, od kojih su najčešće proteoliza, glikozilovanje i fosforilovanje [2, 73]. Proteoliza IGFBP je opšta pojava, događa se u trenutku kada je potrebno osloboditi IGF i smanjiti afinitet IGFBP prema njemu [14]. Poluživot slobodnih IGF molekula je oko 14 minuta, a u kompleksima sa IGFBP časova [74]. Kao što je već navedeno, najveći deo IGF se nalazi u tercijarnim kompleksima sa IGFBP-3 i ALS, te se ovi kompleksi smatraju glavnim čuvarima i depoom liganda [75]. Za razliku od tercijarnih kompleksa (masa oko 150 kda), binarni kompleksi IGF/IGFBP (masa oko kda) mogu proći endotelnu barijeru krvnih sudova i transportovati IGF do mesta delovanja, gde ih otpuštaju [76]. Pošto je tema ove doktorske teze IGFBP-3 i njegove interakcije, podaci o karakteristikama i promenama drugih IGFBP biće dati samo u osnovnim crtama (Tabele 1-3). U Tabeli 1 je navedeno da pojedini IGFBP imaju isti afinitet za oba liganda, dok drugi sa većim afinitetom vezuju IGF-II [59, 77]. IGFBP-1 i IGFBP-2, odnosno IGFBP- 3 i IGFBP-5, imaju veću međusobnu sličnost nego drugi IGFBP. 10

28 Tabela 1. Pregled osnovnih karakteristika IGFBP molekula. Prilagođeno iz [59]. Br. AK Masa molekula (kda) Strukturna karakteristika NLS * Afinitet prema IGF molekuli ma Potenciranje /inhibiranje IGF aktivnosti IGFBP ,3 RGD* - I = II -/+ IGFBP ,4 RGD, HBD* - I < II - IGFBP ,7 HBD, N- glikozilovanje + I = II -/+ IGFBP ,9 2 cisteina više, N- glikozilovanje - I = II - IGFBP ,5 HBD + I < II + IGFBP ,8 HBD, 2 cisteina manje, O- glikozilovanje - I < II - *RGD: tripeptid Arg-Gly-Asp, odgovoran za vezivanje za integrine, HBD: heparinbinding domain, MBD: metal-binding domain, NLS: nuclear-localisation sequence, +/-: dejstvo zavisi od post-translacione modofikacije Što se post-translacionih modifikacija tiče, najveći broj različitih promena se sreće kod IGFBP-3, dok su kod ostalih IGFBP prisutne samo pojedine modifikacije. Zbirni pregled ovih modifikacija dat u Tabeli 2. Takođe, posledice ovih promena nisu jednake. Svi IGFBP su podložni proteolizi, a neki od fragmenata nastali ovim putem mogu ispoljiti samostalna dejstva mimo signalizacije posredstvom IGF receptora [78-83]. O posttranslacionim modifikacijama IGFBP-3 biće više reči kasnije. Tabela 2. Post-translacione modifikacije IGFBP molekula Post-translaciona modifikacija IGFBP Proteoliza Svi [78-83] Fosforilovanje IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-5 [2, 61, 73] N-glikozilovanje IGFBP-3, IGFBP-4 [2, 61, 73] O-glikozilovanje IGFBP-5, IGFBP-6 [2, 61, 73] Glikovanje IGFBP-3 [ ] Metilovanje IGFBP-3? [162] Oksidacija IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-5 [162, 164] 11

29 Transglutaminovanje IGFBP-1 [368] Ubikvitinovanje IGFBP-3 [165] Sekvence odgovorne za interakcije IGFBP sa drugim molekulima se nalaze uglavnom u C domenu. Fiziološke uloge IGFBP koje ne zavise od prethodnog vezivanja IGF i koje ne obuhvataju aktivaciju IGF receptora, potiču od interakcija C domena sa drugim vezujućim partnerima [61, 84-86]. Na ovaj način pojedini IGFBP mogu direktno podstaći ili inhibirati rast ćelija, kao i stimulisati apoptozu, ćelijsku adheziju ili migraciju [61, 62, 65, 87]. Kao što se vidi iz Tabele 3, većina IGFBP ima mali broj vezujućih partnera, osim IGFBP-3. O interakcijama IGFBP-3 će biti više detalja naknadno u tekstu. Tabela 3. Interakcije IGFBP molekula sa drugim proteinima Interagujući protein IGFBP Heparin IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-5, IGFBP-6 [61] Kolagen IGFBP-3 [362] Fibrinogen, fibrin IGFBP-3 [364] Fibronektin IGFBP-3 [365] Plazminogen IGFBP-3 [366] Transferin IGFBP-3 [120, 200] Laktoferin IGFBP-3 [240] Kaveolin IGFBP-3 [ ] Glikozaminoglikani IGFBP-3 [111, 162] Importin β IGFBP-3, IGFBP-5 [63, 203] Alfa-2-makroglobulin IGFBP-1, IGFBP-2 [369] Inhibitor aktivatora plazminogena 1 IGFBP-5 [370] Trombospondin IGFBP-5 [371] Vitronektin IGFBP-5 [372] Humanin IGFBP-3 [179] Integrini IGFBP-1, IGFBP-2 [87] 12

30 2.2 IGFBP-3 IGFBP-3 je najzastupljeniji IGFBP u cirkulaciji, sa većim brojem ispitanih i dokazanih funkcija, kako onih vezanih za IGF molekule, tako i samostalnih. Koncentracija IGFBP-3 zavisi od pola, starosti, rase, ishrane, energetskog unosa, unosa alkohola, od telesne mase i fizičke aktivnosti. Koncentracija IGFBP-3 je najveća u periodu rasta (kod dece je 0,9-4,3 mg/l, u pubertetu 2,4-10,0 mg/l), opada u odraslom dobu (3,3-7,8 mg/l) i dalje se smanjuje sa starenjem [88, 89]. Kod žena je koncentracija IGFBP-3 veća nego kod muškaraca, a razlika potiče od uticaja polnih hormona [89, 90, 91]. Ishrana bogata proteinima i sa većim energetskim sadržajem povećava koncentraciju IGFBP-3 [92], dok je unos alkohola smanjuje [88, 90]. IGFBP-3 je učesnik u reakcijama i mehanizmima kontrole koji, kao krajnji rezultat, mogu imati suprotne efekte. Sa jedne strane, IGFBP-3 kao čuvar i kontrolor aktivnosti IGF podstiče ćelijski rast, diferencijaciju i preživljavanje [93], dok, sa druge strane, pokreće signalne puteve ćelijske apoptoze. U cirkulaciji, IGFBP-3 je transportni molekul, a na nivou tkiva ispoljava svoju aktivnost direktno (uglavnom pro-apoptotsku), vezivanjem za ćeliju. Samostalni uticaj IGFBP-3 je ređe indirektan, na način koji reguliše druge faktore koji indukuju apoptozu [94-97]. Do pre dvadesetak godina o IGFBP-3 se govorilo samo kao o nosaču IGF, a zatim se otvorilo novo polje koje je otkrivalo sve više samostalnih uloga IGFBP-3 i sve veći broj interakcija sa drugim proteinima. O ulozi IGFBP-3 kompleksa se relativno malo zna, a još manje o mehanizmima koji regulišu njihovo stvaranje. Prema tome, IGFBP-3 može imati mitogenu i anaboličku funkciju, kao i pro-apoptotsku, a velika je nepoznanica šta je prekidač koji usmerava njegovu aktivnost ka proliferaciji, odnosno ka apoptozi ćelija Struktura IGFBP-3 Kod ljudi, neglikozilovana zrela forma IGFBP-3 je protein mase 28,7 kda i sastoji se od 264 aminokiselinska ostatka [98]. Gen za IGFBP-3 nalazi se na hromozomu 7p i dužine je 8,9 kb. Ovaj gen je eksprimiran u velikom broju tkiva, ali je transkripcija najintenzivnija u Kupferovim i sinusoidnim ćelijama endotela jetre [60, ]. Domeni odgovaraju sledećim aminokiselinskim nizovima: N domen 1-87, L domen i C domen N i C domeni sadrže 12 i 6 cisteinskih ostataka, koji su ključni za nastanak tercijarne strukture, odnosno za prostorno formiranje domena [ ]. 13

31 N i C domeni IGFBP-3 stvaraju džep u koji se smešta IGF [ ], a pojedinačno nemaju veliki afinitet za IGF. L domen ne sadrži cisteinske ostatke, modifikuje se post-translaciono i, u izvesnoj meri, može učestvovati u interakcijama sa drugim molekulima, kao što je heparin ( heparin-binding domain, HBD, aminokiselinski ostaci ). Afinitet ovog vezujućeg mesta za heparin je znatno manji (oko tri puta) od afiniteta vezujućeg mesta u C domenu [111]. Iako manjeg afiniteta, interakcija L domen/heparin može inhibirati formiranje tercijarnog kompleksa IGF/IGFBP-3/ALS [112, 113], što se pokazalo važnim u ECM ili na površini ćelija kad je potrebno osloboditi IGF [114, 115]. Osim HBD, u C domenu se nalazi i sekvenca za usmeravanje IGFBP-3 ka jedru ( nuclear-localisation sequence, NLS) [63, 116], domen koji može vezati metalne jone ( metal-binding domain, MBD) [117], kao i sekvence odgovorne za interakcije sa kaveolinom [ ] i transferinom [120] Post-translacione modifikacije IGFBP-3 U Tabeli 2 su navedene do sada otkrivene post-translacione modifikacije IGFBP- 3. Neke od njih su ključne za funkcionisanje IGFBP-3, dok su druge od manjeg značaja. O najvažnijim modifikacijama će biti više reči, dok će druge biti samo spomenute. Nakon sinteze proteinskog lanca IGFBP-3 (28,7 kda), najveći broj kopija ovog molekula podleže glikozilovanju i napušta ćeliju kao glikoprotein u dve izoforme masa oko 40 i 45 kda. IGFBP-3 poseduje tri moguća mesta N-glikozilovanja locirana u L domenu: Asn 89, Asn 109 i Asn 172 [121, 122]. Na svako od ovih mesta se može dodati oko 4-4,5 kda ugljenohidratnih ostataka. Pod fiziološkim uslovima, dva mesta su uvek glikozilovana, a treće u manjem broju molekula [122]. Kada je potpuno glikozilovana polovina molekula, imunoblotom se IGFBP-3 detektuje kao dublet od kda, sa sličnom zastupljenošću obe izoforme. Ovakva situacija se najčešće sreće kod zdravih odraslih osoba. Glikozilovanje povećava stabilnost IGFBP-3 [114, 123], ali ne utiče na vezivanje IGF ili na njegovo lučenje van ćelije [122, 124, 125]. Prilikom ispitivanja uticaja glikoformi IGFBP-3 na apoptozu, dobijeni su kontradiktorni rezultati. Prema jednoj grupi istraživača, glikozilovane forme su potentnije [ ], dok prema drugima između glikoformi nema razlike [128]. U eksperimentima sa ćelijama tumora dojke, pokazano je da manje glikozilovana forma IGFBP-3 podstiče autofagiju i preživljavanje ćelija tumora [129]. 14

32 Molekul IGFBP-3 poseduje veliki broj serinskih i tirozinskih ostataka, koji su moguća mesta fosforilovanja [61]. U fiziološkim uslovima, fosforilovanje se događa samo na Ser 111 i Ser 113 [98, 130], pod dejstvom dve kinaze. Kazein kinaza 2 (CK-2) se nalazi u jedru i citosolnim ćelijskim odeljcima [131]. Fosforilovanje IGFBP-3 posredstvom CK-2 ne utiče na njegov afinitet za IGF, niti za molekule na ćelijskoj površini, već podstiče sintezu DNK zajedno sa IGF [132, 133]. Prema tome, fosforilovanje IGFBP-3 enzimom CK-2 inhibira njegovu pro-apoptotsku ulogu i stimuliše mitogeni efekat. Sa druge strane, fosforilovanje IGFBP-3 pod dejstvom proteinske kinaze koja zavisi od DNK (DNAPK) aktivira njegovu pro-apoptotsku ulogu [134]. Na ćelijama tumora prostate je pokazano da, inhibicijom DNAPK, IGFBP-3 gubi sposobnost vezivanja za partnere u jedru, koji su ključni za pokretanje apoptotskih procesa [135]. Proteolizom IGFBP-3 nastaje nekoliko fragmenata, od koji je glavni onaj od oko 30 kda (ostali su manji i nastaju iz njega). On je redovno prisutan u cirkulaciji zdravih osoba. U pojedinim fiziološkim stanjima, kao što je trudnoća, on može biti dominantna forma IGFBP-3 [136]. Ovaj fragment nije potpuno izgubio sposobnost vezivanja IGF, ali mu je afinitet znatno smanjen i ne može interagovati sa ALS [125]. Proteolizom IGFBP- 3 u samom tercijarnom kompleksu se smanjuje afinitet za IGF, ali to ne dovodi nužno do oslobađanja IGF [ ]. U blizini IGF receptora najčešće dolazi do preuzimanja liganda od strane receptora, pošto je njegov afinitet za IGF veći od afiniteta delimično proteolizovanog IGFBP-3, odnosno kompleksa. Proteoliza IGFBP-3 se odigrava u brojnim kataboličkim stanjima: postoperativno [140, 141], kod teških oboljenja [142, 143], kod dijabetesa tip 1 [ ] i tip 2 [138] i u najvećem broju stanja koja karakteriše inflamacija, infekcija, neuhranjenost. Proteaze IGFBP-3 se svrstavaju u dva tipa: matriksne metaloproteaze (MMP) i serinske proteaze [147, 148]. Dobro je izučeno dejstvo MMP-7, koja se eksprimira u ćelijama tumora debelog creva, ali ne i u normalnoj stromi. Enzim proteolizuje IGFBP-3, smanjuje mu afintet za IGF, kome olakšava interakciju sa IGF-1R i time podstiče ćelijsku proliferaciju [149]. Interesantno je da se neki fragmenti IGFBP-3 samostalno vezuju za membranske proteine i time pokreću apoptotske procese [128, 150]. Kod osoba sa velikom telesnom masom uočena je korelacija između povećane količine IGFBP-3 fragmenata u cirkulaciji i povećane insulinske rezistencije [151]. Osim MMP-7, kao IGFBP-3 proteaze su potvrđeni plazmin i trombin [152, 153], katepsini L, D i G [154, 155], kalikrein 2, specifični antigen za prostatu (PSA) [156, 157] 15

33 i ADAM 12-S [158]. Poznato je da do proteolize može doći dejstvom i drugih enzima čiji identitet još nije utvrđen (tzv. serumske proteaze). IGFBP-3 podleže i drugim post-translacionim modifikacijama. Glikovanje ili neenzimsko glikozilovanje IGFBP-3 uočeno je kod pacijenata sa dijabetesom tip 2 [ ]. Ova promena menja afinitet IGFBP-3 prema ligandima, ali ne u meri koja bi značajno ugrozila funkcionisanje IGF sistema. Metilovanje IGFBP-3 je spomenuto samo u jednom radu, bez tumačenja mogućih fizioloških posledica [162]. Oksidacijom IGFBP- 3 nastaju oligomeri povezani disulfidnim vezama [163]. Kod pacijenata sa tumorom debelog creva, uočen je povećan stepen oksidacije IGFBP-3, preko povećanog prisustva karbonilinih grupa [164]. Ubikvitinovanjem se u jedru IGFBP-3 usmerava ka proteazomu u cilju degradacije [165]. Ovom modifikacijom se reguliše poluživot IGFBP-3 u jedru, koji je znatno kraći nego u cirkulaciji. Pretpostavka je da se ovim mehanizmom kontroliše i pro-apoptotska uloga IGFBP Uloga IGFBP-3 Ulogu IGFBP-3 treba sagledati u dva potpuno nezavisna pravca (Slika 4). Slika 4. Uloga IGFBP-3. Preuzeto i prilagođeno iz [98]. Dugo godina se IGFBP-3 smatrao isključivo regulatorom dejstva IGF [ ]. Pošto je njegova koncentracija u cirkulaciji puta veća od koncentracije ostalih IGFBP [59], zauzima mesto glavnog IGFBP [61]. Već je rečeno da je uloga IGFBP-3 16

34 pretežno inhibitorna u pogledu aktivnosti IGF peptida, jer ih vezuje afinitetom većim od afiniteta receptora [162]. Sa druge strane, post-translacione modifikacije slabe vezu IGFBP-3 i IGF, dok interakcije sa drugim molekulima (npr. iz ECM) usmeravaju njihovo kretanje i nakupljanje na mestima povećane potrebe za rastom i popravkom tkiva, što sve zajedno dovodi do predaje IGF receptorima [123, 170, 171]. U slučaju vezivanja kompleksa IGFBP-3/IGF za površinu ćelije, on ne dostavlja IGF direktno IGF receptorima [172], već se smanjuje afiniteta za IGF i olakšava prelaz na receptore [130]. Stav da su sve funkcije IGFBP-3 usmerene isključivo ka kontroli aktivnosti IGF, promenjen je zahvaljujući istraživanjima Valentinisa i saradnika pre dve decenije [173]. Oni su pokazali da povećana ekspresija IGFBP-3 inhibira rast fibroblasta sa poremećajem u sintezi IGF-1R, nezavisno od dejstva IGF. Od tog trenutka, istraživačko polje na temu IGFBP-3 se znatno proširilo i usmerilo ka ulogama nezavisnim od IGF/IGF-R. Pošto se tema ove doktorske teze odnosi na jednu od tih uloga, u narednom poglavlju će one biti detaljnije opisane Interakcije i dejstva IGFBP-3 nezavisna od IGF sistema Vrlo intenzivno se istražuju interakcije i uloge IGFBP-3 nezavisne od ostalih članova IGF sistema [61, 98, 162, 174]. Na Slici 5 prikazani su interagujući segmenti i ključne aminokiseline u strukturi IGFBP-3, a u Tabeli 3 su nabrojani proteini koji grade komplekse sa IGFBP-3. Pokazalo se da IGFBP-3, nezavisno od IGF sistema, a nakon vezivanja za druge molekule, može podstaći ćelijsku proliferaciju i preživljavanje u izmenjenom (nepovoljnom) okruženju [107]. Takođe, u kombinaciji sa drugim molekulima i kao odgovor na spoljašnje ili unutrašnje signale stresa, može pokrenuti pro-apoptotske procese i inhibirati ćelijski rast [107]. Pored ovih, otkrivene su i druge interakcije čiji je fiziološki značaj još uvek nepoznat: sa proteinima plazme i ćelijskih membrana, sa unutarćelijskim transporterima i receptorima u jedru (Tabela 3). Iz svega navedenog se može zaključiti da je IGFBP-3, u fiziološkom smislu, jedan od najvažnijih molekula raskršća na kome se ukrštaju putevi rasta i preživljavanja sa jedne strane i ćelijske smrti sa druge. Od daljih istraživanja se očekuje da otkriju koji su faktori presudni za održavanje ravnoteže ili usmeravanje ka jednom od ova dva pravca. Smatra se da je osnovna samostalna uloga IGFBP-3, ipak, pro-apoptotska [95, 98, 162, 165, 175]. Vezivanjem za površinu ćelija, IGFBP-3 najčešće inhibira dalji rast [176, 17

35 177]. Na velikom broju ćelijskih linija je pokazano da transfekcija IGFBP-3 pokreće apoptozu, ispoljavajući autokrini/parakrini efekat [ ]. Jedan od načina ispoljavanja ovog efekta jeste povećana ekspresija pro-apoptotskih proteina (Bax i Bad) u odnosu na anti-apoptotske proteine (Bcl-X i Bcl-2) [182]. Drugi način dejstva IGFBP-3 je uočen kod ćelija tumora dojke, gde aktivira kaspazu 3, takođe pokretača apoptoze [183]. Pošto se apoptotski procesi mogu pokrenuti unutrašnjim (mitohodrijalnim) ili spoljašnjim (receptorskim) putem [184, 185], istraživalo se kojim putem deluje IGFBP-3. Otkrićem specifičnog IGFBP-3 receptora [175, 186] i daljeg puta aktivacije kaspaza 7 i 8, pretpostavilo se da je put dejstva IGFBP-3 u stimulaciji apoptoze spoljašnji. Međutim, postoje izvesne kontradiktornosti u rezultatima, a u drugim eksperimentima su konstatovani i unutrašnji putevi aktivacije. Za sada nema jasnog tumačenja mehanizma dejstva IGFBP-3. Treći put pro-apoptotskog dejstva IGFBP-3 jeste inhibicija NF-κB transkripcionog faktora [187, 188]. Ovaj faktor podstiče anti-apoptotsku zaštitu i ćelijsku proliferaciju, a povećano je eksprimiran kod određenih vrsta tumora [189, 190]. Na ćelijama tumora debelog creva je konstatovano da IGFBP-3 inhibira aktivnost NF-κB posredstvom TNF receptora [187, 191]. Iako je pro-apoptotska uloga IGFBP-3 označena kao u osnovi nezavisna od IGF, pojedina istraživanja su ukazala na njegovo suprotno dejstvo. U eksperimentima sa glatkomišićnim ćelijama i ćelijama tumora debelog creva, pokazano je da se stimulacijom TGFβ može povećati ekspresija IGFBP-3, što dalje dovodi do rasta ćelija [192, 193]. Takaoka i saradnici su, na ćelijama tumora jednjaka, otkrili da IGFBP-3 samostalno pokreće sintezu irnk i podstiče rast ćelija [194], dok su Martin i saradnici uočili isti efekat radeći sa MCF-10A epitelnim ćelijama i ćelijama tumora dojke [174]. Dodatno je pokazano da IGFBP-3 ima i pro-angiogeni efekat na prekursore endotelnih ćelija, stimulišući njihovu migraciju i diferencijaciju u endotelne ćelije, kao i rast i oporavak tkiva posle ishemične povrede [195, 196]. Mehanizam dejstva IGFBP-3 kao faktora proliferacije nije poznat, kao i uticaji koji ga opredeljuju za tu ulogu, ali se pretpostavlja da su uključene komponente ECM i stanje stresa. 18

36 Slika 5. Interagujući domeni IGFBP-3. Preuzeto i prilagođeno iz [162]. 19

37 Većina dosadašnjih saznanja o IGFBP-3 aktivnosti upućuje na postojanje interagujućih partnera na samoj ćelijskoj površini. Postojanje signalne sekvence na IGFBP-3 podupire stav da se najveći deo, ako ne i celokupna količina sintetisanih molekula, izlučuje van ćelije, a potom internalizuje da bi ispoljila neko od svojih dejstava [120]. Osim specifičnog receptora za IGFBP-3 (IGFBP-3-R) [175, 186], otkriveni su i drugi molekuli na ćelijama koji vezuju IGFBP-3 (Slika 5) [61, 98, 162]. Osim IGFBP-3 oni prepoznaju i druge ligande. U toj grupi se nalazi receptor za protein srodan lipoproteinima, koji je ujedno i receptor za alfa-2-makroglobulin ( lipoprotein-related protein, LRP-1/α2M), zatim receptor za TGFβV [197, 198], kaveolin [118, 119, 199], TfR [120, 200], površinski glukozaminoglikani (GAG) [111, 162], kao i za sada neidentifikovan receptor na ćelijskim linijama tumora dojke MCF-7 i Hs578T [201]. Otkriće sekvence koja omogućava prolaz IGFBP-3 u samo jedro (NLS) [202], označilo je otvaranje još jednog pravca u istraživanju IGF nezavisne uloge IGFBP-3, da bi ubrzo njegovo prisustvo u jedru bilo potvrđeno [63, 116]. Schedlisch i saradnici [63, 203] su identifikovali importin-β i heterodimer importin α-β kao partnere koji, nakon internalizacije IGFBP-3, obezbeđuju njegovu translokaciju do jedra. Taj mehanizam je potvrđen i u drugim eksperimentima [127]. Kao vezujući partneri u jedru su označeni: retinoidni X receptor (RXR) [204], receptor retinolne kiseline (RAR) [205] i transkripcioni faktor Nur77 [206]. Pokazano je da interakcija IGFBP-3 sa RXR pokreće proces apoptoze [165, 207]. Iako je u izvesnoj meri poznat mehanizam dejstva IGFBP-3 na nivou jedra, ostalo je nepoznato šta ga kontroliše u fiziološkim i patofiziološkim uslovima. Ispoljavanje bilo koje od navedenih uloga, pored sistemskih i lokalnih okolnosti i potreba, zavisi i od koncentracije IGFBP-3. Na njegovu sintezu utiču hormoni, citokini, farmaceutici, genetički i faktori okoline. Osnovni regulator sinteze IGFBP-3 je GH, koji je podstiče [208, 209]. Koncentracija IGFBP-3 je manja kod osoba sa smanjenim lučenjem GH [210, 211] i povećana kod osoba sa akromegalijom ili preteranim lučenjem GH [212]. Stvaranje IGFBP-3 podstiču insulin [208], pro-apoptotski molekuli TGFβ [ ], retinolna kiselina [ ], TNFα [ ] i vitamin D [ ], kao i farmaceutici u kategoriji anti-estrogena i anti-androgena [219, 222, 223]. Još jedan pozitivan regulator sinteze IGFBP-3 je tumor supresorski gen p53 [224, 225], koji se aktivira kod ćelija koje su pretrpele oštećenja, sa ciljem zaustavljanja daljeg razvoja tumorskih ćelija. 20

38 Na smanjenje koncentracije IGFBP-3 se može uticati na više nivoa: transkripcionom, translacionom i post-translacionom. Na prvom nivou se utiče metilovanjem i histonskom modifikacijom DNK [226]. Ovo se događa u različitim patofiziološkim stanjima (uključujući tumorska) u cilju utišavanja gena važnih za odbranu organizma, kao što je p53 [ ], pa i IGFBP-3. Utišavanje gena za IGFBP- 3 konstatovano je kod tumora želuca, debelog creva, dojke, jajnika, bubrega i hepatocelularnog karcinoma [ ]. Nedavno istraživanje je pokazalo da se mesto metilovanja DNK nalazi u neposrednoj blizini sekvence čiju transkripciju reguliše insulin [235], čime su povezani metilovanje DNK, sinteza IGFBP-3 i uticaj insulina. Postoje i drugi negativni transkripcioni regulatori [236, 237], a na post-translacionom nivou smanjenje koncentracije IGFBP-3 se događa uglavnom kao posledica poptune proteolize. 2.3 Transferin Osnovna uloga Tf je transport jona gvožđa (u obliku Fe 3+ ), od koga zavisi ćelijsko preživljavanje, transport kiseonika i procesi zasnovani na prenosu elektrona [238]. U organizmu se nalazi 3-4 g gvožđa, a oko 0,1% je u cirkulaciji [239]. Tf pripada transferinskoj porodici proteina zaduženih za transport gvožđa u koju se, osim njega, ubrajaju laktoferin, ovotransferin, melanotrasferin i drugi analozi [240]. Sinteza Tf se primarno odvija u hepatocitima [241], ali ga eksprimiraju i Sertolijeve [242, 243] i ćelije epididimusa [244], oligodendroglialne [245] i ćelije nekih tumora [246, 247]. Osim u plazmi, Tf je prisutan u žuči, cerebrospinalnoj i amnionskoj tečnosti, mleku i limfi [248]. Koncentracija Tf u plazmi je relativno konstantna tokom života (3-4 g/l) [249]. 21

39 2.3.1 Struktura Tf Tf je glikoprotein mase kda, u zavisnosti od stepena glikozilovanja [250, 251]. On je treći najzastupljeniji protein u cirkulaciji, posle albumina i imunoglobulina, a njegova fiziološka koncentracija je 2-4 g/l [252]. Tf čini jedan proteinski lanac od 679 aminokiselinskih ostataka podeljen na dva domena slične veličine: aminokiseline čine N domen, a C domen. U svakom od ovih domena može se vezati po jedan jon gvožđa [253] (Slika 6). Slika 6. Struktura transferina sa mestima vezivanja jona gvožđa. Izvor 3D strukture molekula: Mehanizam vezivanja i otpuštanja jona gvožđa je složen i uključuje seriju reakcija protonovanja, prisustvo pomoćnih jona, helatora, interakciju između domena Tf i strukturnu promenu molekula [254]. U molekulu Tf postoje četiri mogućavezujuća mesta za jone gvožđa, ali zbog konformacionih ograničenja, moguće je istovremeno vezivanje najviše dva jona. Prema tome, u cirkulaciji postoji Tf zasićen sa dva jona gvožđa, poluzasićen sa jednim jonom u C ili N domenu i nezasićen (apo-tf) [255]. Kod zdravih ljudi, u proseku jedna trećina Tf molekula nosi po jedan jon gvožđa [256]. Takođe, kod zdravih ljudi udeo drugih proteina nosača gvožđa u plazmi je zanemarljiv, te se koncentracija Tf može smatrati pokazateljem ukupnog kapaciteta vezivanja gvožđa ( total iron-binding capacity, TIBC). 22

40 Tf je N-glikozilovan, isključivo u C domenu, na aminokiselinskim ostacima Asn 413 i Asn 611 [ ]. Na Slici 7 su prikazana mesta vezivanja glikana i jona gvožđa. Slika 7. Mesta vezivanja glikana i jona gvožđa u molekulu Tf. (Preuzeto i prolagođeno iz [257] Uloga Tf Tf transportuje jone gvožđa do mesta njihovog korišćenja. Slobodni jon gvožđa je izuzetno toksičan s obzirom da podstiče stvaranje slobodnih radikala i reaktivnih kiseoničnih vrsta ( reactive oxygen species, ROS) u Fentonovoj reakaciji [260, 261]. Kroz stvaranje i transformaciju većeg broja ROS (hidroperoksidi, peroksil i alkoksil radikali), slobodno gvožđe posredno izaziva oksidaciju proteina, lipida i DNK [262]. Iz ovih razloga je važno jone gvožđa prenositi kroz cirkulaciju u redoks neaktivnoj formi. Tf, prema tome, nema samo transportnu, već i zaštitnu ulogu, sprečavajući štetno dejstvo gvožđa. Tf predaje gvožđe ćelijama u cilju podsticanja rasta, a to čini nakon vezivanja za TfR na njihovim površinama. Tf može vezati i druge metalne jone u organizmu, što se pokazalo vrlo važnim za fiziološki transport tih jona, ali i za saniranje posledica trovanja metalnim mikroelementima [ ]. 23

41 Višak slobodnog gvožđa podstiče rast patogenih mikroorganizama i razvoj bakterijske infekcije, pa se molekulu Tf pripisuje i anti-mikrobna uloga [250, 267]. Patološka stanja koja karakteriše povećana koncentracija (slobodnog) gvožđa (hemohromatoza, otkazivanje rada jetre, kardiovaskularna oboljenja ili hematološki maligniteti) su često praćena bakterijskim infekcijama [250, 267]. Bilo je pokušaja da se davanjem apo-tf pacijentima podstakne vezivanje slobodnih jona gvožđa i time utiče na suzbijanje infekcije [250, ]. Značaj Tf u transportu i dostavi gvožđa ćelijama u fazi rasta je dokazan na velikom broju različitih linija [ ] Interakcija Tf sa TfR TfR je dimerni transmembranski glikoprotein, eksprimiran na gotovo svim ćelijama [ ]. Tf se vezuje za TfR na površini ćelija u fazi aktivne deobe [281]. Kompleks Tf/TfR se internalizuje i transportuje do endozoma, gde se, uz aktivno učešće protonske pumpe, snižava ph na 5,5 i oslobađa gvožđe iz kompleksa [282]. Pod kiselim uslovima, konformacija TfR je takva da Tf molekul ostaje vezan za njega, a kompleks se vraća do ćelijske membrane, gde se Tf izbacuje i vraća u cirkulaciju. Ciklus se ponavlja kada Tf veže nove jone gvožđa (Slika 8). A B 24

42 Slika 8. Interakcija Tf i TfR (A), internalizacija kompleksa Tf/TfR i recirkulacija Tf (B). Izvor 3D strukture: slika preuzeta i prilagođena iz [431]. Postoje dva tipa receptora, TfR1 i TfR2 [279, 280]. TfR1 je eksprimiran skoro na svim ćelijama, a TfR2 je pretežno prisutan na ćelijama jetre [280]. Stepen ekspresije TfR zavisi od tipa ćelije. Ćelije koje se sporo dele imaju izuzetno malu ekspresiju TfR, dok kod ćelija koje se brzo dele (kakve su i tumorske) njihov broj može dostići i kopija po ćeliji [247]. Zahvaljujući specifičnosti i dinamici interakcije Tf-TfR, ovaj mehanizam je privukao pažnju mnogih istraživača, koji su ispitivali mogućnost korišćenja interakcije za ciljanu dostavu terapeutskih metalnih jona, lekova, proteina i gena [277]. Kao što je ranije rečeno, u normalnim fiziološkim uslovima samo trećina Tf molekula u cirkulaciji je zasićena jonima gvožđa, dok se za ostatak Tf mogu vezati drugi metalni joni (čak tridesetak različitih) [263]. Koristeći ovu karakteristiku, ciljano je vezivan i dostavljan izotop jon galijuma ( 67 Ga 3+ ) ćelijama, što se pokazalo korisnim u terapiji tumora kod kojih je povećana ekspresija TfR [263, 283]. Vezivanjem toksina difterije za Tf stvoren je kompleks koji je korišćen u terapiji malignog tumora mozga, kod pacijenata koji su bili otporni na konvencionalne metode lečenja [284]. Kompleksi Tf sa lekovima paklitaksel, doksorubicin ili hlorambucil su, takođe, primenjivani u terapiji [ ]. U slučaju većih molekula, terapeutskih peptida ili gena, kompleks se formirao ugradnjom terapeutika u sam molekul Tf ili pravljenjem vektorskih nosača gena [288, 289]. Tf 2.4 Povezanost metaboličkih puteva u kojima učestvuju IGFBP-3 i Zajedničko za IGF sistem i Tf je da podstiču rast i anabolizam. IGFBP-3 učestvuje u tim procesima, kada obavlja ulogu IGF nosača. Kada obavlja samostalnu funkciju, IGFBP-3 se može naći u ulozi stimulatora ćelijskog rasta, ali i u ulozi pro-apoptotskog faktora. Sa druge strane, iako se Tf uglavnom sagledava kao pozitivan molekul koji transportuje jone gvožđa i štiti organizam od neželjenih oksidativnih reakcija, kod određenog broja tumora je zapaženo nagomilavanje gvožđa u ćelijama [290]. Otkriće kompleksa IGFBP-3/Tf [200] otvorilo je nova pitanja [61, 162], te je njegovo detaljnije izučavanje u toku. Prilikom izrade ove doktorske disertacije, postavljeno je nekoliko pitanja, na koja su odgovori traženi kroz izvedene eksperimente: 25

43 (a) u kojim procesima bi kompleks IGFBP-3/Tf mogao učestvovati?, (b) na koji način bi on mogao doprineti metabolizmu, a da to već ne čine IGFBP- 3 i Tf pojedinačno?, (c) da li je neka specifičnost u metabolizmu gvožđa razlog za ovo udruživanje?, (d) ima li razlike u zastupljenosti i karakteristikama kompleksa u stanjima izmenjenog metabolizma gvožđa? i (e) gde je mesto TfR u odnosu na druge vezujuće strukture za IGFBP-3 na površini ćelija? Metabolizam gvožđa i njegove promene Gvožđe se u organizam unosi putem hrane (uglavnom u obliku Fe 3+ ), a dnevna potreba je oko 1-2 mg [291]. U dvanaestopalačnom crevu se apsorbuje posredstvom transportera dvovalentnih metalnih jona, koji su prisutni na enterocitima (uz prethodnu enzimsku redukciju Fe 3+ do Fe 2+ u lumenu creva) [292, 293]. Nakon apsorpcije, na bazolaterlanoj membrani gvožđe se ponovo oksiduje (dejstvom hefestina, HFE) i vezuje za Tf [294, 295]. U poglavlju je opisano na koji način se transportuju joni gvožđa i kako dospevaju u ćelije (Slika 8). Oni se dalje ugrađuju u proteinske komplekse, u skladu sa vrstom ćelije, njenom potrebom i ulogom. Najveći deo jona gvožđa u organizmu ulazi u sastav enzima i hemoglobina [296, 297]. Višak gvožđa preuzima feritin u jetri, koji može vezati do 4500 jona [298]. Iz ovog depoa se gvožđe preuzima (i ponovo vezuje za Tf) u slučaju smanjene apsorpcije, povećane potrebe ili neočekivanog gubitka. Povećana potreba za gvožđem, u fiziološkim uslovima, sreće se kod profesionalnih sportista. Kod ove populacije se menjaju koncentracije i lučenja mnogih hormona i citokina, uključujući GH, insulin, IGF peptide i njihove vezujuće proteine, u cilju intenziviranja anaboličkih procesa [299]. Veliki broj studija je urađen na sportistima, međutim, dobijeni su kontradiktorni rezultati po pitanju promena koncentracije pojedinih elemenata IGF sistema [ ]. Opšti zaključak bi bio da vrsta treninga (pretežno aeroban ili aneroban), vrsta opterećenja (vežbe snage ili izdržljivosti), dužina profesionalnog bavljenja sportom, sama sportska disciplina (tok izvođenja, dinamika igre...), kao i telesna masa utiču na krajnji ishod promena i prilagođavanja IGF sistema. Ovaj zaključak važi i za promene samog IGFBP-3 [91, 305, 306]. Kod sportista je, do sada, ispitivana isključivo uloga IGFBP-3 u okviru aktivnosti IGF sistema, ne i njegova samostalna funkcija. 26

44 Povećana potreba za gvožđem kod sportista nastaje, pre svega, zbog povećane potrebe za kiseonikom, a bolje snabdevanje kiseonikom povećava aerobnu izdržljvost [307, 308]. Kod njih je izmerena veća koncentracija hemoglobina (Hb), usled dodatno stimulisane eritropoeze [309]. Kod ekstremnih fizičih napora, može se sresti nedostatak Hb, ukoliko unos i metabolizam gvožđa ne mogu pratiti potrebe organizma [310]. Radi sticanja celokupne slike o metabolizmu gvožđa, potrebno je pratiti koncentracije Hb, Tf, feritina, gvožđa, TIBC, eventualno rastvorne forme TfR u cirkulaciji [ ] i određivati hematološke parametre, kao što su broj eritrocita i sadržaj Hb po eritrocitu. Patološko povećanje koncentracije gvožđa u cirkulaciji (hemohromatoza) može nastati kao posledica poremećaja u bilo kom delu metaboličkog puta, a poremećaji mogu biti nasledni i stečeni [315]. Nasledna hemohromatoza podrazumeva izmenu gena za neki od faktora uključenih u apsorpciju ili transport gvožđa, a najčešći oblik je posledica mutacije na genu za protein HFE [ ]. Povećana koncentracija gvožđa usled prekomerne apsorpcije se prvo reguliše dodatnim vezivanjem gvožđa za feritin, a u nemogućnosti da se ukloni, gvožđe se taloži u nekim organima gde izaziva oksidativna i druga oštećenja. Stečena ili sekundarna hemohromatoza se može javiti kod učestalih transfuzija i kao posledica hroničnog oboljenja jetre (ciroza, alkoholno oboljenje, hronični hepatitis, steatoza) [320]. Oboljenje jetre, a posebno cirozu, prati i smanjena sinteza Tf, što može dodatno doprineti povećanju slobodnog gvožđa [321]. Povećana koncentracija gvožđa u cirkulaciji, bez patoloških posledica, primećena je kod osoba koje unose previše vitamina C, pošto on podstiče njegovu apsorpciju [322]. Anemija, usled nedostatka gvožđa, pogađa najviše decu, stare osobe i mlađu žensku populaciju [323]. Nedostatak gvožđa se odražava na koncentraciju Hb, a smanjenje Hb je, zapravo, najpouzdaniji dokaz anemije. Mnogi faktori mogu narušiti homeostazu gvožđa izazivajući anemiju [ ]: (a) loša ishrana (osim gvožđa, nedovoljni unos vitamina B12 i C), (b) problemi u apsorpciji gvožđa (na nivou transportera i usled intestinalne infekcije u kojoj mikroorganizmi koriste vitamin B12 ili oštećuju crevnu mukozu), (c) oboljenje jetre (nedostatak Tf, višak feritina), (d) unutrašnje ili nekontrolisano menstrualno krvarenje i neki drugi faktori. Na genetski izazvane anemije, koncentracija gvožđa uglavnom ne utiče. Česti su slučajevi anemije sa povećanom koncentracijom gvožđa u cirkulaciji pošto organizam, u nemogućnosti da zadovolji potrebu za kiseonikom (nemogućnost sinteze Hb ili Tf, mutirani Hb), nekontrolisano šalje signal za povećanu apsorpciju gvožđa [ ]. 27

45 2.4.2 Tumor i metabolizam gvožđa Kao što je na početku poglavlja rečeno, IGF sistem i Tf su važni ne samo za rast zdravih, već i tumorskih ćelija [332]. IGF-I i IGF-II su izuzetno potentni mitogeni tumorskih ćelija [333], a dokazana je pozitivna korelacija između koncentracije IGF-I u cirkulaciji i rasta različitih vrsta tumora [ ]. Studije o povezanosti IGFBP i njihove IGF nezavisne uloge u rastu ili inhibiciji rasta tumora su donele kontradiktorne zaključke [345]. Do sada, najčvršći dokazi idu u prilog pro-apoptotskom dejstvu IGFBP-3 na tumorske ćelije. Karakteristično za neke tumore je unutarćelijsko nakupljanje gvožđa. Pojava je primećena kod tumora debelog creva, jetre, dojke, pankreasa [346, 347]. Nije razjašnjeno da li nakupljanje prethodi tumorskoj transformaciji ili je njena posledica. U slučaju da prethodi, moglo bi se pretpostaviti da gvožđe, izazivajući stvaranje ROS koji oštećuju DNK, učestvuje u etiologiji tumora [ ]. Takođe je konstatovano da gvožđe inhibira odbrambene mehanizme ćelija [348], kao i da ga ćelije tumora intenzivno koriste kao nutritivni element u cilju rasta i razmnožavanja [348]. Povećana potreba tumorskih ćelija za gvožđem praćena je povećanom ekspresijom TfR na površini ćelija [351, 352]. Ujedno, intenzivan metabolizam i deoba ćelija dovode do stanja lokalne hipoksije, što je signal za povećanu angiogenezu u tumorskom tkivu [353] i povećan dotok hranljivih sastojaka. Krajnji rezultat ovih promena može biti velika koncentracija gvožđa u ćelijama tumora i nedostatak u cirkulaciji. Ovakvo stanje može dovesti do sistemske anemije iako se ukupna telesna količina gvožđa ne mora značajno izmeniti. U zavisnosti od tipa tumora, anemija može biti pojačana krvarenjem, lošom apsorpcijom, lošom ishranom usled tegoba pri jelu ili gubitka apetita. Iako je anemija najčešći pratilac tumora, posebnu situaciju predstavlja dugotrajna povećana koncentracija gvožđa koja može dovesti do stradanja jetre i pojave hepatocelularnog karcinoma [ ]. Kombinacijom svih navedenih podataka može se zaključiti da je za rast tumora važan jon gvožđa, da tumor povećano eksprimira TfR i da internalizuje IGFBP-3. Svakako je interesantno utvrditi šta se događa sa kompleksom IGFBP-3/Tf kod tumora, što je bio predmet izučavanja u ovoj doktorskoj disertaci 28

46 3. Materijal i metode

47 3.1 Osnovne hemikalije Za potrebe ove doktorske disertacije, korišćene su hemikalije nabavljene od sledećih proizvođača: Beolab, Beograd Etanol Tween-20 Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA Proteinski standardi za elektoforezu Low range molecular mass markers Proteinski standardi za SELDI-TOF/MS ProteinChip all-in-one protein standards II Sinapinska kiselina (SPA) Trifluorosirćetna kiselina (TFA) Diagnostic System Laboratories, Webster, USA Rekombinantni IGFBP-3 ICN Biomedicals, Costa Mesa, USA Akrilamid Natrijum-azid (NaN3) Tris(hidroksimetil)-aminometan (Tris) INEP, Beograd 125 I-IGF-I 125 I-IGF-II KODAK, Paris, France Hemikalije za razvijanje i fiksiranje rentgen filmova Rentgen film MXB (100 NIF 13 18) 30

48 Merck, Darmstadt, Germany Brom-fenol plavo Glacijalna sirćetna kiselina Natrijum-dihidrogenfosfat Natrijum-hidrogenfosfat Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, USA Nitrocelulozna membrana (0,45 μm), Whatman Protran Pierce, Minneapolis, USA ECL reagens Pierce Biotechnology, Rockford, USA Komplet za imunoprecipitaciju (IP) - Pierce Coimmunoprecipitation kit Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin-etansulfonska kiselina (HEPES) Amonijum-persulfat Cijanogen-bromid, CNBr Coomassie Brilliant Blue R-250 boja Dinitro-fenilhidrazin Etanolamin Fukoza (Fuc) Glicin Goveđi serumski albumin (BSA) Kazein Koktel inhibitora proteaza Laktoza (Lac) Manoza (Man) Metil-α-glukopiranozid Metil-α-manopiranozid N,N' metilen-bisakrilamid 31

49 N,N,N,N tetrametilen-diamin (TEMED) N-acetil-glukozamin (GlcNAc) Natrijum-dodecil-sulfat (SDS) Ponso S boja Saharoza Trihlorsirćetna kiselina (TCA) Triton X-100 Vodonik peroksid (H2O2), 30% rastvor Zorka Pharma, Šabac Bakar(II)-hlorid Cink(II)-hlorid Dinatrijum-etilendiamin-tetrasirćetna kiselina (EDTA) Glicerol Gvožđe(III)-hlorid Hlorovodonična kiselina Kalcijum-hlorid (CaCl2) Ksilen Magnezijum-hlorid (MgCl2) Mangan-hlorid (MnCl2) Metanol Natrijum-acetat (NaA) Natrijum-amonijum fosfat (NaAF) Natrijum-bikarbonat Natrijum-borat Natrijum-hidroksid Natrijum-hlorid (NaCl) Natrijum-karbonat Nikl(II)-hlorid Vector Laboratories, Burlingame, UK HRP-Avidin konjugat VectaShield Antifade Mounting medijum sa DAPI bojom za ćelijska jedra 32

50 U Tabeli 4 su navedeni korišćeni imobilizovani lektini i njihova specifičnost. Tabela 4. Lektini i njihova specifičnost. Lektin Poreklo Glikanska specifičnost SNA Sambucus Siaα(2,6)Gal, Siaα(2,6)GalNAc nigra N-glikani RCA-I Ricinus Galβ(1,4)GlcNAc communis N-glikani PHA-E PHA-L WGA s-wga MAL ECL UEA LCA Phaseolus vulgaris Phaseolus vulgaris Triticum vulgaris Triticum vulgaris Maackia amurensis Erythrina cristagalli Ulex europaeus Lens culinaris Galβ(1,4)GlcNAcβ(1,2)Man Komleksni glikani Galβ(1,4)GlcNAcβ(1,2)[Galβ(1,4)GlcNAcβ(1,6)]Man Kompleksni glikani GlcNAcβ(1,4)GlcNAcβ(1,4)GlcNAc, Manβ(1,4)GlcNAcβ(1,4)GlcNAc N- i O-glikani GlcNAcβ(1,4)GlcNAc Ne vezuje sijalinsku kiselinu (Sia) Siaα(2,3) Galβ(1,4)GlcNAc Fucα(1,2)Gal α-man >α-glc, α-glcnac Pored imobilizovanih lektina korišćeni su i lektini konjugovani sa biotinom: SNA, ECL, RCA, MAL i PHA-E. 33

51 3.2 Puferi i rastvori (grupisani prema primenjenim metodama) (IMAC) Afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima MES pufer (osnovni) - 50 mm MES (2-(N-morfolino)-etansulfonska kiselina)/0,5 M NaCl, ph 5,5 Fosfatni pufer (FP) - 0,2 M, ph 8,0 Boratni pufer (BP) - 0,1 M, ph 10,0 Rastvor 0,1 M EDTA Lektinska afinitetna hromatografija (LAC) HBS puferi (osnovni) za: ConA (pufer A) - 20 mm HEPES/0,5 M NaCl/0,08% NaN3/1 mm CaCl2/1 mm MgCl2 / 1 mm MnCl2, ph 7,5 LCA (pufer B) - 10 mm HEPES/0,08% NaN3/0,1 mm CaCl2 / 0,01 mm MnCl2, ph 7,5 RCA-I, WGA i s-wga (pufer C) - 10 mm HEPES/0,15 M NaCl/0,08% NaN3, ph 7,5 ECL, SNA i UEA (pufer D) - pufer C + 0,1 mm CaCl2, ph 7,5 PHA-E (pufer E) pufer C + 0,1 mm CaCl2+ 0,01 mm MnCl2, ph 8,0 PHA-L (pufer F) pufer C + 0,1 mm CaCl2+ 0,01 mm MnCl2, ph 7,5 Neutralizacioni pufer (NP) - 2 M Tris-HCl, ph 8, Imunoafinitetna hromatografija (IAC) na IgY koloni TBS pufer - 10 mm Tris-HCl/1 M NaCl, ph 7,4 Elucioni pufer (EP) - 0,1 M glicin-hcl, ph 2,5 Neutralizacioni pufer (NP) - 1 M Tris-HCl, ph 8, Preparativna imunoafinitetna hromatografija Boratni pufer - 0,1 M /75 mm NaCl, ph 8,5 Biakarbonatni pufer - 0,1 M /0,5 M NaCl Pufer za ispiranje - 50 mm FP/0,15 M NaCl, ph 7,2 Elucioni puffer (EP) - 0,1 M Tris-HCl, ph 3,7 34

52 Neutralizacioni pufer (NP) - 2 M Tris-HCl, 8, SDS-PAGE i imunoblot PBS - 50mM Na2HPO4/NaH2PO4/0,15 M NaCl, ph 7,5 Pufer za uzorke (PZU) - 0,125 M Tris-HCl/4% (m/v) SDS/20% glicerol/0,01% bromfenol-plavo, ph 6,8 Pufer za elektroforezu - 25 mm Tris-HCl/0,19 M glicin/0,1% SDS, ph 8,3 Pufer za elektrotransfer (pufer za blotovanje ) - 25 mm Tris-HCl/0,19 M glicin/20% metanol, ph 8,3 TBST pufer: 10 mm Tris-HCl/0,15 M NaCl/0,1% Tween-20, ph 7, Imunoprecipitacija TBS pufer - 2,5 mm Tris/0,15 M NaCl/1 mm EDTA/1% NP-40/5% glicerol, ph 7,4 Neutralizacioni pufer (NP) - 2 M Tris-HCl, ph 8, SELDI-TOF/MS PBS - 50 mm FP/0,15 M NaCl, ph 7,2 Pufer za blokiranje (BP) - 0,5 M Tris-HCl, ph 8,0 Pufer za vezivanje proteina za IMAC30 čip (PVIM) - 0,1 M FP/0,5 M NaCl, ph 7,0 Pufer za vezivanje proteina za Q10 čip (PVQ) - 50 mm NaAF, ph 7,0 Pufer za vezivanje proteina za CM10 čip (PVCM) - 50 mm NaA, ph 5,0 Rastvor SPA - 50% SPA u rastvoru acetonitril/voda/tfa (50/49,9/0,1%) Solubilizacija ćelijskih membrane 0,25 M rastvor saharoze u destilovanoj vodi Koktel inhibitora proteaza HBS - 50 mm HEPES/0,9% NaCl/0,1% NaN3, ph 7,5 1% Triton X-100 u HBS Lektin blot TBS pufer - 0,15 M NaCl/10mM Tris-HCl, ph 7,4 35

53 3% rastvor BSA u TBS puferu Rastvor biotinilovanog lektina - 1/5000 u TBST puferu Rastvor HRP-avidina - razblaženje 1: Derivatizacija proteina sa dinitrofenil hidrazinom (DNP) 10% rastvor TCA 0,01 M rastvor DNP u 2M HCl Rastvor za ispiranje etanol/etil-acetat (1/1) 2% rastvor SDS u 0,1 M FP, ph 8, Imunohistohemija PBS pufer - 50 mm FP/0,15 M NaCl, ph 7,5 90% rastvor etanola 70% rastvor etanola 5% rastvor kazeina 1% rastvor H2O2 u etanolu 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) u okviru VectaShield Antifade Mounting medijuma 3.3 Smole AminoLink Plus Coupling Resin, u okviru kompleta Co-Immunoprecipitation kit, Pierce Biotechnology, Rockford, USA DEAE-sefaroza, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany IDA agaroza, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany IAC smola - Proteomelab IgY-12 High Capacity Proteome Partitioning kit, Beckman Coulter, Fullerton, USA Lektin-agaroza smole navedene u Tabeli 4, Vector Laboratories, Burlingame, UK Sefaroza 4B, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 3.4 Antitela Primarna: Poliklonska anti-igfbp-3 antitela (kozija), Diagnostic Systems Laboratory, Webster, USA 36

54 Poliklonska anti-igfbp-3 antitela (kozija), Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA Poliklonska anti-tf antitela (ovčija), INEP, Beograd Poliklonska anti-tfr antitela (zečija), Abcam, Cambridge, UK Poliklonska anti-tfr antitela (zečija), Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA Polikolonska anti-dnp antitela (zečija), Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany Sekundarna: AlexaFluor 488 IgG antitela (magareća) spram koze, Molecular probes, Invitrogen TM, Eugene, USA AlexaFluor 555 IgG antitela (kozija) spram kunića, Molecular probes, Invitrogen TM, Eugene, USA Biotinilovana IgG antitela (konjska) spram koze, Vector Laboratories, Burlingame, UK HRP-konjugovana IgG antitela (svinjska) spram koze, Biosource, Camarillo, USA HRP-konjugovana IgG antitela (magareća) spram kunića, Pierce Biotechnology Inc., Rockford, USA HRP-konjugovana IgG antitela (kozija) spram kunića, AbD Serotec, Oxford, UK 3.5. Imunodijagnostički kompleti ELISA komplet za određivanje IGFBP-3, Abcam, Cambridge, UK ELISA komplet za određivanje feritina, Abcam, Cambridge, UK Imunoturbidimetrijski test za određivanje transferina, Human GmbH, Wiesbaden, Germany RIA komplet za određivanje IGF-I, INEP, Beograd 3.6. Biohemijski reagensi Komercijalni reagensi za određivanje koncentracije gvožđa, ukupnog kapaciteta vezivanja gvožđa (TIBC), proteina i albumina, Human GmbH, Wiesbaden, Germany 37

55 3.7 Uređaji i aparati U radu su korišćeni sledeći uređaji i aparati: Centrifuga MiniSpin plus, Eppendorf Centrifuga LC-321, Tehtnica Filtri za ultrafiltraciju od 10 kda, 30 kda i 100 kda, Microcon, Millipore Frakcioni kolektor HeliFrac, Pharmacia Gama brojač Wallac Wizard, PerkinElmer Kinetor MR-1, LKB Konelab 20 biohemijski analizator, Thermo Scientific Kombionovani ph/konduktometar InoLab 720, WTW Kriotom Leica CM1850, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Magnetna mešalica ARE, Velp Maseni spektrometar ProteinChip SELDI-TOF, serija 4000, Bio-Rad Laboratories Mikroskop za imunofluorescentnu detekciju (Carl Zeiss Axio Imager 1.0) sa AxioCam HR kamerom (Carl Zeiss) ili sa Canon A640 digitalnom kamerom (Canon Inc.) Sistem za elektroforezu Mini-PROTEAN Tetra Cell, Bio-Rad Laboratories Spektrofotometar Ultrospec 2000, Pharmacia Ultracentrifuga, Beckman Coulter Vaga analitička B6, Mettler Vaga tehnička, Chyo Victor ELISA čitač 3 V, PerkinElmer Vortex ZX3, Velp 3.8 Uzorci seruma U eksperimentima su korišćeni uzorci seruma odraslih ljudi. Pošto je cilj istraživanja bila analiza kompleksa za čije je formiranje važno prisustvo jona gvožđa, IGFBP-3 i transferina, korišćeni su uzorci seruma zdravih ljudi i pacijenata sa poremećajem u metabolizmu gvožđa ili izmenjenim potrebama za njim, kao i osoba koje su pored promena u metabolizmu gvožđa imale i promene u koncentraciji i metabolizmu IGFBP-3. Dozvole za prikupljanje i korišćenje uzoraka u sprovedenim istraživanjima su dobijene od etičkih komiteta INEP-a i KBC-a Bežanijska Kosa. 38

56 3.8.1 Serumi zdravih osoba Sakupljeni su serumi dobrovoljnih davaoca, n=112 (56 muškaraca i 56 žena), starosti godina, BMI kg/m 2. Na osnovu usmenog anketiranja i naknadne analize osnovnih biohemijskih i hematoloških parametara, utvrđeno je da se ova grupa uzoraka može smatrati kontrolnom. Venska krv je izvađena ujutru, posle 12 h gladovanja. Nakon 40 min stajanja na sobnoj temperaturi, serum je izdvojen centrifugiranjem na 1000 x g 10 minuta, alikvotiran i čuvan na -40 C. Serumi su korišćeni u periodu od 2 meseca. Kontrolna grupa osoba i seruma za pojedine eksperimente je formirana tako da parametri poput starosti i BMI osoba budu slični onima iz eksperimentalne grupe Serumi osoba sa povećanom koncentracijom gvožđa Sakupljeni su serumi ljudi (n=39, starosti godina, BMI kg/m2) čija je koncentracija gvožđa bila znatno iznad referentne granice (muškarci: μmol/l, žene: 7-27 μmol/l),. Izabrani su uzorci u kojima je izmerena koncentracija gvožđa bila veća od 35 μmol/l, ali pored ove karakteristike, ostali standardni biohemijski parametri su bili u referentnim opsezima i same osobe nisu imale dijagnozu nekog oboljenja (npr. hemohromatozu) kao posledice povećanog sadržaja gvožđa u serumu Serumi osoba sa smanjenom koncentracijom gvožđa Korišćeni su serumi osoba (n=55, starosti godina, BMI kg/m 2 ) sa anemijom, koja je potvrđena preko većeg broja biohemijskih (koncentracija gvožđa, transferina, feritina, TIBC) i hematoloških parametara (koncentracija hemoglobina, sadržaj hemoglobina po eritrocitu),. U radu su analizirani uzorci u kojima je koncentracija gvožđa bila manja od 4,5 μmol/l Serumi pacijenata sa dijagnostikovanim kolorektalnim karcinomom Pacijenti (n=97: 54 muškarca i 43 žene, starosti godina, BMI kg/m 2 ) sa kolorektalnim karcinomom (CRC) su dijagnostikovani i praćeni u Kliničko-bolničkom centru (KBC) Bežanijska kosa,. Kod ovih pacijenata, pored osnovnog patološkog stanja, bila je izražena anemija izazvana teškoćama u ishrani, poremećenom crevnom apsorpcijom, rektalnim krvarenjem i/ili radioterapijom. Prema ASA (American Society of Anesthesiologists) ocenjivanju fiziološkog stanja organizma (preoperativno) [432], ovi 39

57 pacijenti su svrstani u III (62 pacijenta), odnosno IV kategoriju (35 pacijenata). Kategorija III ukazuje na ozbiljno sistemsko oboljenje, a kategorija IV je najteža i ukazuje na ozbiljno sistemsko oboljenje koje je konstantna opasnost po život. Svi pacijenti su bili predviđeni za hiruršku intervenciju (resekciju debelog creva), a njihovi uzorci seruma su uzeti ujutru, na dan zakazane operacije Serumi profesionalnih sportista Poznato je da profesionalni sportisti imaju povećanu metaboličku potrebu za gvožđem, u skladu sa povećanom potrebom za kiseonikom i izloženošću kataboličkim stanjima tokom treninga i takmičenja, kao i da se IGF sistem menja usled intenzivnog vežbanja. Sakupljeni su uzorci profesionalnih igračica rukometa ženskog rukometnog kluba iz Kragujevca (1. rukometna liga Srbije, u režimu profesionalnog treninga 3-5 godina), n=17, starosti godina, BMI kg/m 2. Uzorci seruma su sakupljeni po završenoj redovnoj sezoni takmičenja i nakon jednomesečne intenzivne pripreme u kampu. Svaka sportiskinja je radila test opterećenja trčanjem na traci, tokom koga je mereno VO2. Ujutru je vađena krv, nakon 12 h gladovanja i u venu su im postavljene braunile. Drugi uzorak krvi je izvađen tokom testa opterećenja, kad je dostignuto individualno maksimalno iskorišćenje kiseonika, VO2max. Treći uzrak je uzet nakon završetka testa opterećenja i oporavka (10 minuta nakon drugog uzorkovanja). Rukometašice su test opterećenja izvodile pod kontrolom trenera i lekara, nezavisno od ispitivanja urađenih u ovom radu. Ideja je bila da se utvrdi da li stepen fizičke utreniranosti (pre i posle priprema) kod profesionalnih sportista utiče na parametre IGF sistema tokom testa opterećenja. 3.9 Uzorci tkiva Tkivo debelog creva je korišćeno na dva načina: za direktno izolovanje proteina i za pravljenje parafinskih isečaka. Uzorci su dobijeni iz KBC Bežanijska kosa, od pacijenata od kojih su dobijeni i uzorci seruma, n=37 (22 muškarca i 15 žena), starosti godina, BMI kg/m 2. Prema ASA klasifikaciji, 26 slučajeva je klasifikovano kao kategorija III, a 11 kao kategorija IV. Iako je početni broj pacijenata sa dijagnostikovanim oboljenjem bio znatno veći (poglavlje 3.8.4), uzorci tkiva su uzeti samo od pacijenata kod kojih je izvedena intervencija uklanjanja većeg dela creva (dužina reza 3-40 cm), pošto je za izolovanje proteina bio potreban barem gram tkiva. Od svakog 40

58 pacijenta su uzeta dva uzorka tkiva, u roku od 1 h postoperativno, neposredno nakon histopatološke diferencijacije na tumorsko i netumorsko tkivo (diferencijaciju je radio patolog u KBC Bežanijska kosa, za potrebe klinike). Tkiva su istog dana podvrgnuta daljoj obradi i izolovanju proteina. U tkivnim preparatima je utvrđivano prisustvo IGFBP- 3, Tf i Tf receptora. (IMAC) 3.10 Hromatografske metode Afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima U kolonu za hromatografiju nanet je 1 ml agaroze sa imobilizovanom iminodisirćetnom kiselinom (IDA). Ispiranje matriksa je izvršeno destilovanom vodom. U skladu sa potrebama eksperimenta, kolona je sukcesivno zasićena rastvorima jona metala (0,1 M, 1,0 ml) u formi hlorida i to: Cu 2+, Ni 2+, Fe 3+, Mg 2+ i Zn 2+. Nevezani joni metala su isprani sa 10 ml destilovane vode i 10 ml 0,1% rastvora sirćetne kiseline. Matriks je uravnotežen u MES puferu (poglavlje 3.2.1) pre nanošenja uzorka (100 μl seruma u 900 μl MES pufera), koji je na koloni recirkulisan 1 h, na sobnoj temperaturi. Nevezani materijal je ispran sa 10 ml MES pufera, dok je frakcija vezanih proteina eluirana sa 10 ml FP, a zatim sa 10 ml EDTA rastvora. Nakon eluiranja, kolona je regenerisana sa 10 ml BP (poglavlje 3.2.1), pre nanošenja drugog metalnog jona. Ovaj postupak je ponavljan za 30 uzoraka seruma zdravih osoba i sve navedene metalne jone Lektinska afinitetna hromatografija (LAC) Za lektinsku afinitetnu hromatografiju su korišćene agarozne smole sa imobilizovanim lektinima (Tabela 4). Kolone sa smolom (2 ml) su uravnotežene u odgovarajućim HBS puferima (poglavlje 3.2.2). Inkubacija uzoraka (100 μl seruma u 900 μl odgovarajućeg HBS pufera) je rađena recirkulacijom na kolonama u trajanju od 1 h, na sobnoj temperaturi. Nakon završene inkubacije, nevezani proteini su isprani sa 20 ml odgovarajućeg HBS pufera. Specifično vezani proteini su eluirani u dve faze, i to: 1. rastvorom haptenskog ugljenog hidrata u 15 ml odgovarajućeg HBS pufera, ph 7,5 i 2. rastvorom haptenskog ugljenog hidrata u 7 ml sirćetne kiseline, ph 3,0. 41

59 Specifične su bile kolone sa PHA-E- i PHA-L-agarozom, sa kojih je eluiranje bilo jednofazno, uz 10 ml 1,0 M sirćetne kiseline. Haptenski ugljeni hidrati korišćeni za eluiranje sa kolona su bili: 1. 0,5 M Lac za SNA-agarozu, 2. smeša 0,2 M metil-α-glukopiranozida i 0,2 M metil-α-manopiranozida za ConA- i LCA-agarozu, 3. 0,2 M Lac za RCA-I- i ECL-agarozu, 4. 0,5 M GlcNAc za WGA- i s-wga-agarozu i 5. 0,1 M Fuc za UEA-agarozu. Eluirane frakcije proteina su neutralisane sa NP, ph 8,9, dijalizovane naspram 0,15 M NaCl preko noći na 4 C i skoncetrovane do 1 ml ultrafiltracijom. Ovom metodom je ispitana mogućnost izolovanja kompleksa IGFBP-3/Tf iz seruma zdravih osoba posredstvom interakcije njihovih glikana sa lektinima Imunoafinitetna hromatografija (IAC) na smoli sa imobilizovanim IgY antitelima Za hromatografiju na mikrospin kolonama je korišćena smola sa imobilizovanim IgY antitelima, koja su bila specifična za 12 najzastupljenijih proteina plazme: albumin, IgG, transferin, fibrinogen, IgA, α2-makroglobulin, IgM, α1-antitripsin, haptoglobin, orozomukoid, apolipoprotein A-I i apolipoprotein A-II. Na 500 μl smole u koloni nanošeno je 20 μl uzorka seruma razblaženog u 480 μl osnovnog TBS pufera (poglavlje 3.2.3). Uzorci su inkubirani na rotacionoj mešalici, u trajanju od 15 minuta, na sobnoj temperaturi. Nevezani proteini su uklonjeni sa kolone centrifugiranjem na 2000 g u trajanju od 30 s, nakon čega je kolona ispirana 2 puta sa po 500 μl TBS pufera istom procedurom. Eluiranje vezanih proteina sa smole je urađeno elucionim puferom (2 100 μl) uz centrifugiranje (2000 x g u trajanju od 30 s). Nakon eluiranja, uzorak i sama kolona su neutralisani puferom za neutralizaciju ph 8,0, a kolona je dalje isprana osnovnim puferom (3 200 μl) pre nanošenja sledećeg uzorka. Ovom metodom su analizirani uzorci seruma zdravih osoba i osoba sa promenama u metabolizmu gvožđa. 42

60 Preparativna imunoafinitetna hromatografija za izolovanje IGFBP- 3/Tf kompleksa U cilju izolovanja veće količine IGFBP-3/Tf kompleksa iz uzoraka seruma, imunoafinitetna hromatografija je urađena koristeći veću zapreminu smole sefaroze 4B (50 ml) koja je aktivirana primenom CNBr, prema proceduri koju su razvili Korpela i Ryan [373, 374]. Sefaroza 4B je inkubirana u rastvoru CNBr (koncentracije 40 mg/ml) u bikarbonatnom puferu, ph 11 tokom 10 min. Nakon inkubacije, matriks je intenzivno ispran boratnim i bikarbonatnim puferima (poglavlje 3.2.4), a zatim je dodat rastvor anti- Tf antitela, frakcija IgG (50 mg). Vezivanje antitela je izvedeno na 4 C, preko noći. Matriks je intenzivno ispran sa PBS, preostale slobodne reaktivne grupe su blokirane rastvorom etanolamina i ponovljeno je intenzivno ispiranje sa PBS. Na ovako pripremljeni matriks sa imobilizovanim anti-tf antitelima, nanet je uzorak seruma (100 μl), recirkulisan tokom 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim ostavljen na koloni preko noći na 4 C. Nevezani proteini su isprani sa PBS, a specifično vezani su eluirani sa EP (poglavlje 3.2.4) i rastvori neutralisani. Prisustvo proteina u frakcijama utvrđeno je merenjem apsorbance na 280 nm. Varijacija ove imunoafinitetne hromatografije je bio postupak koji je uključivao preinkubaciju uzorka seruma (na 4 C preko noći) sa radioaktivno obeleženim ligandom (poglavlje 3.12). Dalji tok ispiranja i eluiranja je izveden po prethodno opisanom postupku. Prisustvo radioaktivne komponente u frakcijama utvrđeno je merenjem radioaktivnosti na gama brojaču Elektroforetske metode Imunoelektroforeza (IEP) Metodom IEP je ispitana mogućnost međusobnog razdvajanja IGFBP-3, Tf i IGFBP-3/Tf kompleksa, odnosno mogu li se kompleksi izolovati kao imunoprecipitati u 1% agaroznom gelu. U kružne otvore za uzorke naneto je 5 μl seruma i proteini su razdvojeni elektroforetski pod standardnim uslovima (jačina struje 20 ma, napon 100 V, na 4 C, 105 minuta). Po završenoj elektroforezi, u kanale je naneto 100 μl odgovarajućih primarnih antitela razblaženih u PBS. Ploča sa gelom je ostavljena u vlažnoj komori, na sobnoj temperaturi, 24 h. Antitela su difundovala kroz gel i izazivala imunoprecipitaciju imunoaktivnih proteina iz seruma. Na ovaj način su analizirani serumi zdravih osoba, 43

61 osoba sa poremećajem u metabolizmu gvožđa i pacijenata sa kolorektalnim karcinomom (po 10 uzoraka iz svake grupe) SDS poliakrilamidna gel-elektroforeza i Western imunoblot U zavisnosti od eksperimenta, uzorci seruma, solubilizati membrana i citosoli ćelija, frakcije specifično vezanih proteina sa kolona posle imunoprecipitacije, eluati sa IMAC kolona, ultrafiltrati i uzorci sa lektinskih kolona su ispitani metodom SDS-PAGE. Prema standardnoj proceduri [375] elektroforetsko razdvajanje proteina iz uzoraka je vršeno na 8% ili 10% gelu u neredukujućim ili redukujućim (10% 2-merkaptoetanol) uslovima. Uzorci seruma su razblaživani u PBS (poglavlje 3.2.5) u odnosu 1:40 i dodatno u PZU puferu u odnosu 1:1. Ostali uzorci su razblaživani samo u PZU puferu u odnosu 1:1. Elektroforeza je rađena pod naponom od 200 V, pri jačini struje od 120 ma, na sobnoj temperaturi tokom 45 minuta. Elektroforetski razdvojeni proteini su elektrotransferom preneti na nitroceluloznu membranu. Da bi se sprečilo nespecifično vezivanje antitela za membranu, ona je inkubirana u 5% rastvoru odmašćenog mleka u 10 mm TBST na sobnoj temperaturi u trajanju od 45 minuta. Membrana je isprana sa TBST, inkubirana sa primarnim antitelima u 1% odmašćenom mleku u TBST na 4 C preko noći, ponovo isprana i inkubirana sa sekundarnim antitelima. Za detekciju imunoreaktivnih proteina je korišćen hemiluminescentni HRP supstrat luminol (kao deo ECL reagensa) i autoradiografija Lektinski blot Metoda lektinskog blot-a je korišćena za detekciju glikoproteina razdvojenih postupkom SDS-PAGE. Nakon elektrotransfera proteina na nitroceluloznu membranu, slobodna mesta na membrani su blokirana primenom 3% BSA rastvora u TBST, preko noći, a zatim su dodavani rastvori biotinilovanih lektina u istom puferu. Usledila je inkubacija u rastvoru HRP-avidina (poglavlje 3.2.9) i rastvoru ECL. Metodom lektin blota su analizirani glikani izolovanih IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma zdravih ljudi i pacijenata sa kolorektalnim karcinomom. 44

62 3.12 Testovi vezivanja liganda Korišćene su dve vrste vezujućih testova za ligande, uz primenu radioaktivno obeleženog liganda IGF-I ili IGF-II: afinitetna hromatografija i ligand blot. Za potrebe ligand afinitetne hromatografije, na CNBr-aktiviranu agarozu imobilizovana su anti-tf antitela, a uzorak seruma (100 μl) je inkubiran sa 125 I-IGF-I/II ( cpm). Uzorak seruma je nanet na kolonu i inkubiran na 4 C preko noći. Nevezani proteini su isprani sa 50 mm PBS, ph 7,2, a vezani sa EP, ph 3,7. Cilj ovog eksperimenta je bio da utvrdi mogu li imobilizovana anti-tf antitela vezati merljive količine IGFBP-3/Tf kompleksa, a praćenje vezivanja je bilo preko interakcije IGFBP-3 sa radioaktivno obeleženim ligandom. U eluatima je merena radioaktivnost na gama brojaču. Za potrebe ligand blot-a, proteini su razdvojeni elektroforetski, preneti na nitroceluloznu membranu i inkubirani u rastvoru 125 I-IGF-I/II ( cpm). Nakon inkubacije i ispiranja, membrana je analizirana autoradiografski Denzitometrijska obrada rezultata Svi rezultati dobijeni metodom blot-a analizirani su denzitometrijski, koristeći program Image Master Total Laboratory v2.01 (Amersham BioSciences, Buckinghamshire, USA). Izmerene brojčane vrednosti su izražene u denzitometrijskim jedinicama (DJ) Imunoprecipitacija proteinskih kompleksa Korišćen je komercijalni komplet za imunoprecipitaciju, koji se zasniva na primeni epoksi aktivirane agaroze za imobilizaciju antitela. Za potrebe ove doktorske disertacije, kompleksi IGFBP-3/Tf su izolovani dvostepenom imunoprecipitacijom. Prema priloženom uputstvu proizvođača, na 20 μl suspenzije smole u mikrospin kolonama imobilizovano je 5 μg primarnih antitela (anti-igfbp-3 ili anti-tf). Na kolone su nanošene tri vrste uzoraka: 10 μl seruma razblaženog u 190 μl TBS, 50 μl membranske frakcije tkiva (solubilizat) ili citosola u 150 μl TBS. Uzorci su inkubirani na 4 C preko noći. Nevezani proteini su isprani TBS puferom (3 x 500 μl) uz centrifugiranje na 2000 g u trajanju od 30 s. Eluiranje vezanih proteina je urađeno sa ukupno 110 μl ( x 50 μl) EP, ph 2,8 uz centrifugiranje, a eluati su neutralisani sa NP, ph 8,9. U cilju izolovanja kompleksa, neutralisana eluirana frakcija sa jedne kolone 45

63 je propuštana kroz drugu. Isprobane su obe varijante u smislu redosleda kolona. Imunoprecipitacijom su izolovani kompleksi iz svih grupa seruma i tkiva Masena spektrometrija SELDI-TOF (Surface-enhanced laser desorption ionization - time of flight) Masena spektrometrija je korišćena za analizu strukturnih karakteristika i fizičkohemijskih svojstava IGFBP-3/Tf kompleksa. SELDI-TOF metod, za razliku od osnovne masene spektrometrije koja podrazumeva fragmentaciju molekula i dalju analizu, uključuje još jedan korak, a to je interakcija (vezivanje) molekula sa matriksom koji ima specifične karakteristike. Za ispitivanje IGFBP-3/Tf kompleksa izolovanih imunoprecipitacijom iz seruma i tkiva, korišćeni su čipovi IMAC 30, Q10, H50, CM10 i PS20, u skladu sa propisanom procedurom proizvođača čipova. IMAC30 je čip kod koga u prvoj fazi dolazi do interakcije proteina sa metalnim jonima imobilizovanim na površini čipa (heliranim grupama nitrilo-triacetatne kiseline, NTA). Pri analizi proteinskih kompleksa, za površinu čipa su vezani joni Cu 2+, Ni 2+, Fe 3+, Mg 2+ i Zn 2+ u formi hlorida. Q10 čip se koristi za vezivanje i ispitivanje negativno naelektrisanih molekula, pošto na površini sadrži kvaternerne amonijum grupe koje interaguju sa ostacima Asp, Glu, terminalnim karboksilnim grupama i fosfatnim grupama. Koristeći ovaj čip, ispitane su razlike u naelektrisanju IGFBP-3/Tf kompleksa koji su poticali iz različitih grupa uzoraka. CM10 je čip koji se koristi za ispitivanje pozitivno naelektrisanih molekula. Karboksilne grupe na površini čipa prepoznaju Lys, His i Arg ostatke, kao i terminalnu amino grupu. H50 je čip za koji se vezuju proteini preko svojih hidrofobnih delova, jer su metilenski nizovi na površini čipa. PS20 je čip čija je površina derivatizovana dajući epoksi grupe za koje se kovalentno mogu vezati proteini. Za potrebe ove disertacije, imobilizovana su anti- IGFBP-3, odnosno anti-tf antitela i izolovanim kompleksima IGFBP-3/Tf je omogućeno da interaguju gradeći imune komplekse na čipu pre jonizacije i fragmentacije. Ideja je bila da se ispita uticaj promena fizičko-hemijskih karakteristika kompleksa, usled promene u metabolizmu gvožđa i/ili prisustva tumora, na njegovu imunoreaktivnost. 46

64 Svaka vrsta čipa je aktivirana i isprana na način koji je propisao proizvođač pre nanošenja uzorka. Nakon propisane inkubacije, čipovi su ispirani, sušeni, nanet je sloj sinapinske kiseline (poglavlje 3.2.7) i uzorci su dalje podvrgnuti jonizaciji i fragmentaciji. Spektri su čitani u opsegu m/z, primenjeno je 8815 laserskih snopova po reaktivnoj površini čipa, uz energiju lasera od 6000 nj. Spektri su čitani i analizirani koristeći program Ciphergen Express 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Hercules) Ultrafiltracija Za potrebe pojedinih eksperimenata, proteini su koncentrovani ultrafiltracijom ili su razdvajani primenom filtera u cilju izolovanja proteina određenih molekulskih masa. Korišćena su molekulska sita (poglavlje 3.7) čije su pore zadržavale molekule masa većih od 10 kda, odnosno 30 ili 100 kda. Proces ultrafiltracije (brzina i vreme centrifugiranja) je izveden u skladu sa procedurom propisanom od strane proizvođača. creva 3.17 Izolovanje ćelijskih membrane i citosola iz tkiva debelog Uzorci tumorskog i netumorskog tkiva debelog creva su u roku od 1 h dopremljeni na ledu iz KBC Bežanijska Kosa do INEP-a (poglavlje 3.9). Tkivo je intenzivno isprano ledenim PBS (u cilju uklanjanja tragova krvi), isečen je epitelni sloj kod netumorskog tkiva (analizirani tumori su epitelnog porekla) i svaki uzorak je pojedinačno homogenizovan i dalje obrađen. Homogenizacija je urađena u vodenom rastvoru 0,25 M saharoze, u koju su dodati proteazni inhibitori (poglavlje 3.2.8), teflonskim homogenizerom, u ledenom kupatilu. Centrifugiranjem na 600 g na 4 C 10 minuta su odbačeni delovi nehomogenizovanog tkiva. Supernatant je dalje izcentrifugiran na x g (na 4 C, 1 h) u ultracentrifugi. Dobijeni supernatant je sadržao citosolnu frakciju, a talog, u kome su zaostale ćelijske membrane, je ispran ledenim HEPES puferom, ph 7,4 (poglavlje 3.2.8) i resuspendovan u istom puferu kome je dodat Triton X-100 (1%). Solubilizacija membrana je izvedena na sobnoj temperaturi, stalnim mešanjem suspenzije u toku 1 h. Centrifugiranjem na x g (4 C, 90 min) odvojen je supernatant u kome su se nalazile solubilizovane ćelijske membrane. 47

65 3.18 Derivatizacija karbonilnih grupa proteina dinitrofenil hidrazinom (DNP) Prisustvo karbonilnih grupa na proteinima, nastalih kao posledica okisdativnih procesa kod zdravih, a posebno kod pacijenata izloženih oksidativnom stresu (što je slučaj kod tumora), određivano je spektrofotometrijski i metodom imunoblota nakon derivatizacije sa DNP. Iz uzorka seruma zapremine 0,5 ml (radne koncentracije 10 mg/ml, dobijene razblaživanjem u dejonizovanoj vodi) staloženi su proteini sa 0,25 ml 10% TCA (poglavlje ). Nakon centrifugiranja na 1500 x g 5 minuta, supernatant je odbačen, a na talog je odpipetirano 0,25 ml 0.01 M rastvora DNP u 2 M HCl. Suspenzija je intenzivno mešana na magnetnoj mešalici do potpune homogenizacije, na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 minuta. Proteini su ponovo istaloženi dodatkom 0,5 ml rastvora TCA, suspenzija je centrifugirana, a talog ispran dva puta rastvorom etanol/etilacetat (1/1, 1 ml), uz intenzivno mešanje i dodatno centrifugiranje, radi uklanjanja slobodnog DNP reagensa. Talog je, na kraju, rastvoren u 1,5 ml 2% ratvora SDS, na 37 C tokom 10 minuta, uz povremeno mućkanje u cilju potpune homogenizacije. Apsorbanca rastvora je merena spektrofotometrijski, na 370 nm, koristeći 2 M HCl kao slepu probu. Identičan eksperiment je izveden bez DNP reagensa i nespecifični signal je oduzet od specifičnog. Za tkivne uzorke, početna koncentracija proteina je bila 1 mg/ml. Derivatizovani proteini su ispitivani i metodom imunoblot-a (poglavlje ) koristeći anti-dnp antitela Imunohistohemijska (IHC) detekcija proteina Za imunohistohemijsku detekciju IGFBP-3/Tf kompleksa u uzorcima tkiva korišćeni su parafinski preparati koji su pripremljeni u KBC Bežanijska Kosa. Isečci parafinskih preparata debljine 5 μm su napravljeni i fiksirani na mikroskopske pločice u INEP-u. Postupak IHC detekcije je bio standardan (poglavlje ). Parafinski isečci su deparafinisani u ksilolu (10 minuta) i rehidratisani u etanolu. Aktivnost endogenih peroksidaza je blokirana 1% rastvorom H2O2 u etanolu, na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Isečci su ispirani u 70% etanolu i destilovanoj vodi. Nespecifično vezivanje je blokirano inkubacijom u 5% kazeinu, 20 minuta. 48

66 Za eksperimentalno dokazivanje kolokalizacije proteina, isečci tkiva su prvo inkubirani u rastvoru kozjih anti-igfbp-3 antitela, na sobnoj temperaturi, u trajanju od 1 h u vlažnoj komori. Nakon ispiranja sa PBS, isečci su inkubirani sa anti-kozjim sekundarnim antitelima konjugovanim sa fluorescentnom bojom AlexaFluor 488, na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori, 30 minuta. Po završenoj inkubaciji, isečak je ispran PBS puferom, ponovljeno je blokiranje 5% kazeinom i izvedena je inkubacija u rastvoru kunićevih anti-tfr antitela. Kao sekundarna su ovaj put korišćena anti-kunićeva antitela konjugovana sa bojom AlexaFluor 555. Nakon još jednog intenzivnog ispiranja sa PBS, preparati su fiksirani ProLong Gold Antifade reagensom. Osim ispitivanih kompleksa, u kontrolne svrhe su detektovana i jedra, bojenjem sa DAPI reagensom (poglavlje ). Preparati su analizirani fluorescentnim mikroskopom, uz upotrebu specifičnih filtera (poglavlje 3.7) Statistička obrada podataka Statistička obrada podataka urađena je u programu SPSS 16.0 (IBM, New York, USA). Kao statistički značajne razlike između grupa uzimani su podaci čija je statistička značajnost bila izražena kao p<

67 4. Cilj istraživanja

68 Dosadašnja saznanja u pogledu funkcije IGFBP-3 pretežno se odnose na ulogu IGFBP-3 kao posrednika u dejstvu IGF peptida [ ]. Utvrđeno je da IGFBP-3 ispoljava i dejstva koja ne zavise od prethodnog vezivanja IGF liganada, ali to polje istraživanja je nedovoljno ispitano. Nekoliko studija je pokazalo da IGFBP-3 može direktno interagovati sa biomolekulima iz cirkulacije i membranskim proteinima, međutim, značaj tih interakcija je ostao nepoznat [98, 162]. O fiziološkoj kontroli interakcija gotovo da nema podataka. Iako za formiranje određenih asocijacija nije neophodno prisustvo IGF u kompleksu sa IGFBP-3, još uvek nije utvrđeno da li vezan IGF ligand utiče na procese i signalne puteve koji se dalje aktiviraju [84]. Cilj ove disertacije je bio da ispita jednu od međumolekulskih interakcija IGFBP-3 i to sa transferinom. Zadaci rada bi se mogli sažeti na sledeći način: da se ispita prisustvo kompleksa koji se formiraju između IGFBP-3 i transferina (IGFBP-3/Tf) u cirkulaciji, da se utvrdi na koji način koncentracija kompleksa zavisi od koncentracije polaznih komponenti, da se ispita značaj prisustva metalnog jona za formiranje kompleksa (i vrste jona), da se analizira uticaj promene u metabolizmu gvožđa na stepen stvaranja kompleksa, da se utvrdi reaktivnost kompleksa sa transferinskim receptorom (TfR) na membrani ćelija debelog creva, zdravog tkiva i tumora (kao model sistemu), da se analizira stepen kolokalizacije IGFBP-3 i Tf u/na ćelijama debelog creva, da se ispitaju strukturne karakteristike kompleksa IGFBP-3/Tf i njihove promene sa (pato)fiziološkim promenama u metabolizmu gvožđa, odnosno pojavom tumora i da se, na kraju, predloži moguća uloga kompleksa u organizmu. Relativno je mali broj istraživanja na temu samostalne fiziološke uloge IGFBP-3 (mimo IGF regulacije), koja su urađena na uzorcima ljudi. Najviše je rađeno sa ćelijskim kulturama i uzorcima glodara [95, 98, 162, 177, 180]. Pokazalo se, međutim, da IGF sistem nije isti u različitim životinjskim vrstama (pre svega na nivou ćelijske i tkivne ekspresije i lokalizacije). Deo rezultata (i zaključaka) do kojih se došlo radeći sa 51

69 glodarima se nije potvrdio na ljudima. U ovoj disertaciji su korišćeni uzorci tkiva ljudi, te je potencijalni značaj i primenljivost rezultata za medicinsku praksu veći. 52

70 5. Rezultati i diskusija

71 5.1 Izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma zdravih osoba Ispitan je veći broj pristupa za izolovanje kompleksa IGFBP-3/Tf, koristeći različite fizičko-hemijske metode, zasnovane pretežno na afinitetnim interakcijama [ ]. U narednih nekoliko poglavlja su prikazani dobijeni razultati Ispitivanje specifičnosti antitela Pre nego što se pristupilo izolovanju i karakterizaciji IGFBP-3/Tf kompleksa ispitana je imunoreaktivnost anti-igfbp-3 i anti-tf antitela. Stvarajući kompleks, ova dva proteina imaju ograničene površine i epitope kojima se mogu vezati za antitela, te je bilo potrebno potvrditi da antitela dovoljno dobro prepoznaju komponente u kompleksu. Fiziološka koncentracija Tf je znatno veća nego IGFBP-3, a Tf je i veći molekul od IGFBP-3, te su mogući problemi u detekciji pre bili očekivani na nivou IGFBP-3 nego Tf. Iz tog razloga se krenulo u ispitivanje sa jednim anti-tf antitelom i dva anti-igfbp- 3 antitela. Pošto kompleksi imaju masu oko 110 kda, praćeno je prisustvo proteinske trake na toj masi. Rezultati imunoblota su prikazani na Slici 9. Slika 9. Testiranje specifičnosti antitela proizvođača (A) DSL i (B) Santa Cruz prema IGFBP-3 molekulu i antitela prema Tf molekulu (C) proizvedenih u INEP-u. Elektroforeza serumskog uzorka je rađena u neredukujućim uslovima, na 8% gelu. Pokazano je da sva tri antitela prepoznaju IGFBP-3/Tf komplekse. Na IGFBP-3 imunoblotu, protein sa najmanjom molekuskom masom (oko 30 kda) odgovara 54

72 fragmentu i/ili neglikozilovanom obliku IGFBP-3 (oba su prisutna u cirkulaciji), dva proteina masa oko kda odgovaraju monomeru IGFBP-3, koji se javlja kao dublet dve glikoforme ravnopravno zastupljene kod zdravih osoba (Slika 9A), traka koja se javlja na masi iznad markera za 66 kda odgovara dimeru IGFBP-3 (Slika 9A), a kompleks IGFBP-3/Tf se nalazi u zoni između markera od 97 i 116 kda. Signal blizu starta potiče od većih agregata IGFBP-3 ili asocijacija sa drugim proteinima iz seruma. Što se Tf imunoblota tiče, detektovani su fragment na 45 kda, monomer na oko 70 kda, IGFBP-3/Tf kompleks na oko 110 kda i molekuli na većim masama, slično kao na IGFBP-3 imunoblotu. Anti-IGFBP-3 antitelo proizvođača DSL je bolje razlikovalo dve izoforme IGFBP-3, pa je ono dalje korišćeno za imunoblot. Kao što će biti prikazano u idućim poglavljima, anti-igfbp-3 antitelo proizvođača Santa Cruz Biotechnology je pokazalo bolje rezultate u eksperimentima imunoprecipitacije, a uspešnost imunoprecipitacije je potvrđivana imunoblotom sa DSL antitelom Afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima (IMAC) za izolovanje kompleksa IGFBP-3/Tf iz seruma Kao što je već rečeno, IMAC se koristi za izolovanje molekula koji imaju negativno naelektrisane grupe, što je slučaj sa proteinima [376, 377]. Imajući u vidu dodatne karakteristike IGFBP-3 i Tf, odnosno da mogu direktno vezati metalne jone, testiranje IMAC kao prve metode za izolovanje kompleksa IGFBP-3/Tf je bio logičan izbor. Pošto oba proteina mogu vezati gvožđe [117, 238], metoda je testirana sa imobilizovanim Fe 3+ jonima. Prisustvo kompleksa na približno 110 kda u nevezanim i specifično eluiranim frakcijama je praćeno preko IGFBP-3 i Tf imunoblota (na Slici 10 prikazani su tipični profili imunoreaktivnih proteina). 55

73 Slika 10. Imunoblot vezane (V) i nevezane (N) frakcije posle IMAC koristeći matriks sa imobilizovanim Fe 3+ jonima. Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti- IGFBP-3 (A), odnosno anti-tf antitelima (B). Prema rezultatima imunoblota, može se zaključiti da imobilizovani metalni jon prepoznaje sve imunoreaktivne proteinske vrste IGFBP-3 i Tf. Prema tome, IMAC metoda se ne može koristiti za odvajanje IGFBP-3/Tf kompleksa od monomernih komponenti i njihovih fragmenata iz seruma Lektinska afinitetna hromatografija (LAC) za izolovanje IGFBP- 3/Tf kompleksa iz seruma Metoda LAC se zasniva na vezivanju glikomolekula, pre svega glikoproteina, koji u svojoj strukturi imaju šećernu komponentu prepoznatljivu od strane imobilizovanog lektina [378, 379]. Pošto su IGFBP-3 i Tf glikoproteini, sa relativno velikim sadržajem ugljenohidratnog dela [122, 258], ideja je bila da se ispita mogućnost selektivnog vezivanja kompleksa za određeni broj lektina. Naime, stvaranjem kompleksa se moglo očekivati da pojedini glikani budu nedostupni za interakciju sa lektinima, što bi poslužilo za diferencijalno izolovanje. Na osnovu literaturnih podataka, odabrano je 11 lektina koji su najčešće korišćeni za analizu ugljenohidratnih komponenti serumskih proteina [380, 381]. Korišćeni lektini su navedeni u poglavlju 3.1 (Tabela 4). Prisustvo imunoreaktivnih proteina u nevezanim i eluiranim frakcijama je praćeno imunoblotom. Rezultati IGFBP-3 i Tf imunoblota su pokazali da je, od 11 lektina, 6 prepoznalo IGFBP-3, a 5 Tf iz seruma (Slika 11, reprezentativni profili imunoreaktivnih proteina). 56

74 Slika 11. Imunoblot vezanih frakcija posle LAC koristeći lektine čiji je identitet naveden na samoj slici. Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3 (A), odnosno anti-tf antitelima (B). Ni jedan od lektina, koji su uspešno vezali monomere IGFBP-3 i Tf, nije prepoznao i vezao (barem ne u merljivim količinama) kompleks IGFBP-3/Tf. Takođe, u nevezanim frakcijama (koje ovde nisu prikazane) detektovano je prisustvo svih imunoreaktivnih vrsta. Pored toga što je kompleksa relativno malo, pretpostavka je da su glikani u kompleksu možda manje dostupni lektinima u LAC ili je (što je verovatnije) afinitet lektina prema monomerima IGFBP-3 i Tf znatno veći od afiniteta prema glikanima u IGFBP-3/Tf kompleksu. Zaključeno je da se metoda LAC ne može koristiti za razdvajanje kompleksa od ostalih srodnih molekulskih vrsta Imunoafinitetna hromatografija za izolovanje kompleksa IGFBP- 3/Tf iz seruma Pošto se pokazalo da su afinitetne tehnike koje se zasnivaju na vezivanju za metalni jon ili za lektin neupotrebljive za izolovanje kompleksa IGFBP-3/Tf, sledeća metoda koja je testirana se zasnivala na imunoafinitetnom prepoznavanju [382], odnosno imunoafinitetna hromatografija (IAC). Korišćen je komercijalni komplet IgY- ProteomeLab, koji je sadržao smolu na kojoj su imobilizovana, pored ostalih, anti-tf antitela. Ideja je bila da se utvrdi da li se kompleks IGFBP-3/Tf može vezati za anti-tf antitela, pa naknadno odvojiti od slobodnog Tf ili, alternativno, da li kompleks ostaje u nevezanoj frakciji, pa se može naknadno odvojiti od IGFBP-3. Kao i u prethodnim 57

75 eksperimentima, prisustvo IGFBP-3 i Tf u nevezanim i vezanim frakcijama je utvrđivano imunoblotom (Slika 12, reprezenatativni profili imunoreaktivnih proteina). Slika 12. Imunoblot vezane (V) i nevezane (N) frakcije posle IAC koristeći matriks IgY- ProteomeLab, sa imobilizovanim anti-tf antitelima. Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3 (A), odnosno anti-tf antitelima (B). Rezultati su pokazali da je monomer IGFBP-3 bio, uglavnom, prisutan u nevezanoj frakciji, dok su se u vezanoj frakciji nalazili monomer i fragment Tf, kompleksi IGFBP-3/Tf, kao i imunoreaktivni molekul (sa oba antitela) mase veće od mase kompleksa. Interesantno je bilo konstatovati da je ova smola vezala samo izoformu Tf koja je bila više glikozilovana, dok je forma manje mase ostala nevezana [258, 259]. IGFBP-3 imunoblot vezane frakcije je prepoznao u tragu IGFBP-3. Pošto afinitetna kolona, prema specifikaciji porizvođača, nije imala antitela specifična za IGFBP-3, može se pretpostaviti da je IGFBP-3 u vezanoj frakciji poticao iz kompleksa sa proteinima koji su se specifično vezali za kolonu (a do otpuštanja je došlo tokom postupka eluiranja u kiseloj sredini ili tokom pripreme uzorka za elektroforezu). Iako testirana IAC metoda nije razdvojila komplekse IGFBP-3/Tf od ostalih imunoreaktivnih vrsta, ukazala je na prednost imunoafinitetnog pristupa u odnosu na druge tehnike. Odlučeno je da se dalje u radu ispitaju mogućnosti izolovanja kompleksa primenom nekoliko imunoafinitetnih metoda. 58

76 5.1.5 Preparativna imunoafinitetna hromatografija za izolovanje IGFBP- 3/Tf kompleksa iz seruma Prethodno iskustvo sa IAC, uz upotrebu komercijalne smole sa imobilizovanim različitim antitelima, uključujući i anti-tf, podstaklo je dalji pokušaj izolovanja kompleksa (zajedno sa Tf) ovom metodom. Frakcija IgG izolovana iz anti-tf seruma je imobilizovana na sefarozu 4B koja je aktivirana reagensom CNBr, a zatim je propušten serum. Sa specifično eluiranim frakcijama je urađena standardna SDS-PAGE i IGFBP-3 imunoblot, ali nije bilo jasno vidljivih traka. Urađen je, zatim, dot blot sa anti-igfbp-3 i Tf antitelima, koji je dao signale, čime je potvrđeno prisustvo ova dva molekula u eluatima (Slika 13A). Pošto bi jedan od razloga za slab signal u imunoblotu bila mala količina eluiranih proteina, izmerena je apsorbanca na 280 nm u eluiranim frakcijama (Slika 13B), što je potvrdilo izuzetno malu količinu proteina. Iako ovaj pristup nije bio obećavajući za izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa, dodatno je urađena IAC posle inkubacije uzorka seruma sa radioaktivno obeleženim ligandom 125 I-IGF-I/II, da se proveri da li se kompleks IGFBP-3/Tf uopše vezao za smolu. Merenjem radioaktivnosti u eluiranim frakcijama potvrđeno je prisustvo 125 I-IGF/ IGFBP-3/Tf kompleksa, ali u tragu (Slika 13C). 59

77 Slika 13. Dot blot vezane frakcije posle preparativne IAC koristeći matriks sa imobilizovanim anti-tf antitelima. Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3, odnosno anti-tf antitelima (A). Prisustvo proteina u vezanoj frakciji je praćeno merenjem A280 (B), a kompleksa 125 I-IGF/IGFBP-3/Tf merenjem gama radioaktivnosti (C). Prinos eluiranih proteina u ovoj IAC je bio jako mali, a mogući razlog za ovakav rezultat je nepovoljna orijentacija anti-tf antitela prilikom imobilizacije za smolu. Smola aktivirana reagensom CNBr vezuje amino grupe proteina što su, u slučaju antitela, to i N- terminalni krajevi na kojima su antigen vezujuća mesta [383, 384]. Na osnovu ovog eksperimenta je zaključeno da anti-tf antitela koja su korišćena mogu vezati IGFBP-3/Tf komplekse i poslužiti za imunoafinitetno izolovanje, ali da je za dobar prinos neophodno koristiti smolu koja je aktivirana na način kojim se ne imobilizuju antitela prevashodno preko N-terminalnih amino grupa Imunoelektroforeza za izolovanje IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma Metodom imunoelektroforeze (IEP) su proteini prvo elektroforetski razdvojeni, a zatim detektovani imunoprecipitacijom u samom gelu specifičnim antitelima [385]. Cilj je bio da se ispita mogućnost detekcije i izolovanja IGFBP-3/Tf kompleksa iz imunoprecipitiranih traka. Imunoprecipitati nastali upotrebom anti-igfbp-3 i anti-tf antitela su bili različiti, po položaju, obliku i količini. Sa Slike 14A (reprezenatativni uzorci) se može videti da postoji segment IGFBP-3 precipitacione linije koji je u oblasti gela gde nema precipitata sa anti-tf antitelima, pa je odlučeno da se potencijalno prisustvo IGFBP-3/Tf kompleksa traži u tom segmentu. Delovi gela označeni na Slici 14A kao uzorci 1 i 2 su isečeni i analizirani metodom IGFBP-3 imunoblota. Na Slici 14B se vidi da su u ovim uzorcima prisutni neki IGFBP-3 molekulski oblici, ali da ni jedan nije kompleks IGFBP-3/Tf (pretežno dimeri i fragmenti i/ili neglikozilovani IGFBP-3). 60

78 Slika 14. Imunoelektroforegram proteina seruma koji su prepoznati u interakciji sa anti- IGFBP-3, odnosno anti-tf antitelima (A). Segmenti imunoprecipitacione linije sa anti- IGFBP-3 antitelom, 1 i 2, su analizirani metodom imunoblota sa anti-igfbp-3 antitelom (B). Iako su se mogli dalje analizirati još neki segmenti imunoprecipitata, na osnovu ovih prvih rezultata je zaključeno da je verovatnoća izolovanja samo kompleksa IGFBP- 3/Tf na ovaj način mala i prešlo se na sledeći imunoafinitetni pristup Imunoprecipitacija IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma Koristeći sva dosadašnja eksperimentalna iskustva, a posebno sa IAC, pristupilo se izolovanju kompleksa IGFBP-3/Tf koristeći imunoafinitetni princip, ali uz upotrebu komercijalne smole u okviru Co-Immunoprecitation kompleta reagenasa, koja je deklarisana za namensku imobilizaciju antitela. Za ovu smolu je navedeno da je raspored aktivnih grupa takav da imobilizacija antitela daje mogućnost prepoznavanja epitopa kako na pojedinačnim proteinima, tako i na proteinima u okviru kompleksa [386]. Ovaj postupak izolovanja izveden je uz centrifugiranje smole (a ne na koloni), te je nazvan imunoprecipitacija. 61

79 Prema uputstvu proizvođača su imobilizovana anti-tf i obe vrste anti-igfbp-3 antitela. Serumi su ostavljeni da interaguju sa imunoafinitetnim smolama, a specifično vezani proteini su eluirani i analizirani metodom SDS-PAGE i imunoblota. Pokazalo se da sva imobilizovana antitela prepoznaju svoje specifične epitope i to na svim molekulskim formama, uključujući i IGFBP-3/Tf komplekse. Dalje je urađena dvostruka imunoprecipitacija, tako što su eluati posle prvog koraka ostavljeni da interaguju sa smolom na kojoj je bila druga vrsta antitela. Isprobane su sve kombinacije i konstatovano je da se kombinacijom u kojoj se prvo izoluju Tf imunoreaktivni proteini, a zatim IGFBP- 3 primenom Santa Cruz antitela, dobijaju najčistiji preparati IGFBP-3/Tf kompleksa. IGFBP-3 imunoblot sa anti-igfbp-3 antitelima (proizvođača DSL) izolovanog kompleksa IGFBP-3/Tf je prikazan na Slici 15 (zajedno sa uzorkom polaznog seruma). Slika 15. Imunoblot kompleksa IGFBP-3/Tf izolovanog imunoprecipitacijom (IP) i proteina seruma (S) sa anti-igfbp-3 antitelom. Pored kompleksa IGFBP-3/Tf, koji se prema očekivanju nalazi na masi oko 110 kda, na imunoblotu su detektovani i molekuli većih masa, kao i tragovi proteina na masi oko 30 kda (verovatno fragmenti nastali tokom izolovanja kompleksa). Denzitometrijska analiza je pokazala da je zastupljenost kompleksa IGFBP-3/Tf na oko 110 kda u odnosu na celokupan signal oko 80%, što je najveći do sada postignut stepen čistoće izolovanih IGFBP-3/Tf kompleksa. Identitet imunoreaktivne trake na većoj masi je ostao 62

80 nepoznanica. Činjenica je da je ta proteinska forma interagovala sa anti-igfbp-3 i anti- Tf antitelima (nije posledica nespecifičnih interakcija sekundarnih antitela, što je testirano). Moglo bi se pretpostaviti da je reč o dimeru kompleksa ili asocijaciji sa neravnopravnim brojem IGFBP-3 i Tf podjedinica, ali za to trenutno nema dokaza. U svakom slučaju, preparat dobijen dvostrukom imunoprecipitacijom je u daljem radu smatran izolatom kompleksa IGFBP-3/Tf i korišćen je za kvantitativnu i kvalitativnu analizu kompleksa. 5.2 Karakterizacija izolovanog IGFBP-3/Tf kompleksa iz seruma zdravih osoba kompleksa Značaj metalnog jona za stvaranje i interakcije IGFBP-3/Tf Poznato je da je Tf glavni transportni protein za jone gvožđa u cirkulaciji [251], a pored gvožđa je sposoban da veže i druge metalne jone [263, 264]. Tf, prema tome, učestvuje u homeostazi fizioloških metalnih jona, obezbeđuje njihov transport i rezervoar, a može imati i ulogu u detoksifikaciji, uklanjajući ih iz cirkulacije [250, 267]. Kinetičke studije su pokazale da različiti joni mogu ispoljiti alosterni efekat prilikom vezivanja za Tf. Naime, prisustvo vezanog jona Cr 3+ ili Ni 2+ za Tf podstiče vezivanje jona gvožđa [387]. Takođe je eksperimentalno pokazano da se ćelijska internalizacija Tf odvija drugačijom brzinom u prisustvu različitih jona [263], što je važno za unutarćelijski transport i koncentrovanje određenih vrsta jona. Kod zdravih ljudi je oko 30% Tf u cirkulaciji zasićeno jonima gvožđa [256], što ostavlja mogućnost drugim metalnim jonima da se vežu i transportuju u organizmu. Molekul IGFBP-3 ima domen sposoban da veže jone metala, MBD [117]. Fiziološki značaj ove interakcije je još uvek nepoznat. Nezavisno od interakcije sa metalnim jonima, pokazano je da povećano prisustvo jona Cd 2+ u cirkulaciji utiče na smanjenje koncentracije IGFBP-3 i IGF-I [388]. Sa druge strane, višak jona Zn 2+, koji je neophodan za sintezu elemenata IGF sistema, ne povećava njihovu sintezu [388]. Singh i saradnici [117] su utvrdili da IGFBP-3 može vezati jone Fe 3+, Fe 2+, Co 2+, Ni 2+, Mg 2+ i Mn 2+, ali ne i Ca 2+. U slučaju vezivanja Ni 2+ jona, pokazali su da prisustvo IGF-I u kompleksu sa IGFBP-3 blokira vezivanje ovog jona, a pojavu su objasnili kao posledicu 63

81 konformacione nepristupačnosti MBD regiona u molekulu IGFBP-3. Upravo je ova strukturna karakteristika IGFBP-3 predložena da se iskoristiti u terapiji tumora metalnim jonima. Vezivanjem različitih metalnih jona za MBD u IGFBP-3, oni bi se učinili dostupni ćeliji nakon interakcije IGFBP-3 sa svojim vezujućim partnerima na površini ćelije [118, 389, 390]. IGFBP-3 vezan za ćelije ovim putem pokreće mehanizme apoptoze na način koji ne zavisi od IGF peptida. Ustanovljeno je da je za internalizaciju IGFBP-3 posredstvom (ne)specifičnih receptora važan C region IGFBP-3, u kome se nalazi i MBD [120, 391]. U skladu sa svim navedenim, razmišljano je o metalnom jonu kao važnom faktoru za stvaranje kompleksa IGFBP-3/Tf, kao i o mogućem uticaju kompleksa na metabolizam metalnih jona, odnosno na mitogene/metaboličke procese u koje je uključen IGFBP-3. Da bi se stekao uvid u značaj metalnog jona, kako za samu interakciju IGFBP-3 i Tf, tako i za interakciju već formiranog kompleksa i metalnog jona, urađena je serija eksperimenata koristeći različite metalne jone. Ispitivan je uticaj jona Fe 3+ /Fe 2+ kao osnovnog fiziološkog liganda molekula Tf, Cu 2+ i Ni 2+, za koje je utvrđeno da se u značajnoj meri vezuju za Tf [263], kao i Mg 2+ i Zn 2+, koji su uobičajeni kofaktori proteina [392, 393] i samim tim prisutni u organizmu u velikim koncentracijama. U prvoj grupi eksperimenata je testiran uticaj navedenih metalnih jona imobilizovanih na matriksu (IMAC) na vezivanje kompleksa IGFBP-3/Tf. Specifično eluirani proteini su analizirani imunoblotom sa anti-igfbp-3 antitelom (Slika 16, reprezenatativni profili imunoreaktivnih proteina). Kada su na matriksu bili imobilizovani joni gvožđa, afinitetno je vezana i eluirana najveća količina kompleksa IGFBP-3/Tf. Identičan profil je dobijen sa Fe 2+ i Fe 3+ jonima. Pošto su eksperimenti urađeni pod atmosferskim uslovima, vrlo je verovatno da se Fe 2+ oksidovao do Fe 3+ u toku rada. U slučaju imobilizovanih jona Ni 2+, Mg 2+ i Zn 2+, IGFBP-3 imunoreaktivni proteini se nisu, ili su se u malom procentu, vezali za smolu. Za razliku od Mg 2+ i Zn 2+ IMAC eksperimenata, kod Ni 2+ eksperimenta denzitometrijski zbir imunoreaktivnih traka u nevezanim i vezanim frakcijama je bio manji nego u polaznom uzorku, što je navelo na sumnju da je deo proteina ostao i dalje vezan posle standardnog eluiranja. Na isti način, ali u daleko većoj meri, je primećen gubitak proteina nakon ispiranja i eluiranja proteina sa smole sa imobilizovanim jonima Cu 2+. Sa ove poslednje smole su eluirani proteini tek rastvorom EDTA, koji je jak helator jona. Drugim rečima, proteini su eluirani zajedno sa vezanim jonima Cu 2+, za koje je poznato da čvrsto interaguju sa polipeptidima [376]. Dobijeni rezultati su pokazali da se kompleksi IGFBP-3/Tf (a i sam IGFBP-3) afinitetno 64

82 vezuju samo za neke jone metala i da se potpuno eluiraju pod relativno blagim uslovima (FP) samo sa smole na kojoj su imobilizovani joni gvožđa. Slika 16. Imunoblot vezanih (V), nevezanih (N) i EDTA eluiranih (EE) frakcija posle IMAC koristeći matrikse sa imobilizovanim metalnim jonima (identitet jona je naveden na slici). Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3 antitelom. U drugoj grupi eksperimenata su rezultati dobijeni metodom IMAC potvrđeni analizom izolovanih IGFBP-3/Tf kompleksa (dvostrukom imunoprecipitacijom iz seruma zdravih ljudi) metodom masene spektrometrije SELDI-TOF. Korišćen je čip IMAC30, koji na svojoj površini ima helator metala NTA. Imobilizovani su isti metalni joni koji su testirani u IMAC. Kompleksi IGFBP-3/Tf su, nakon interakcije sa čipom IMAC30, jonizovani i fragmentisani. Dobijeni maseni spektri su prikazani na Slici 17 (reprezentativni profili proteinskih fragmenata). 65

83 Slika 17. SELDI-TOF MS analiza IGFBP-3/Tf kompleksa izolovanih imunoprecipitacijom iz uzoraka seruma, koristeći IMAC30 čip sa imobilizovanim metalnim jonima (identitet jona je naveden na samoj slici). Fragmenti koji potiču od kompleksa IGFBP-3/Tf su se javili u oblasti spektra m/z, a pošto su svi joni bili jednostruko naelektrisani, to su ujedno bile i mase fragmenata izražene u Da. I u ovom eksperimentu su se, na sličan način kao ranije, grupisali rezultati dobijeni sa pojedinim jonima. Postojala je izvesna sličnost između svih ostalih spektara osim onog dobijenog sa imobilizovanim jonom Cu 2+. Sa ovog čipa je jako malo proteinskih fragmenata letelo, što potvrđuje jaku interakciju. Ukupni intenzitet svih traka na masenim spektrima dobijenim sa imobilizovanim jonima Ni 2+, Mg 2+ i Zn 2+ bio je znatno veći od intenziteta traka dobijenih sa čipovima na kojima su vezani joni Fe 2+ /Fe 3+, što opet ukazuje na jaču interakciju kompleksa sa jonima gvožđa nego sa ovim drugim. U trećoj seriji eksperimenata je ispitan značaj navedenih metalnih jona za formiranje samih kompleksa IGFBP-3/Tf. U tom cilju su uzorci seruma filtrirani na molekulskim sitima (ultrafiltracija na Millipore filterima). U retenatu na molekulskom situ od 100 kda pretežno su zaostali kompleksi IGFBP-3/Tf. Filtrat je dalje filtriran na situ od 30 kda, propuštajući fragmente, a zadržavajući monomere IGFBP-3 i Tf. Retenati na 30 kda su pojedinačno inkubirani sa jonima Fe 3+, Ni 2+, Mg 2+, Zn 2+ i Cu 2+ preko noći, a zatim je rađena SDS-PAGE praćena imunoblotom. Rezultati IGFBP-3 imunoblota su prikazani na Slici 18 (reprezenatativni profili imunoreaktivnih proteina). 66

84 Slika 18. Imunoblot IGFBP-3 reaktivnih vrsta nakon ultrafiltracije i inkubacije retenata na filterima od 30 kda sa metalnim jonima (identitet jona je naveden na slici). Kontrolni uzorak je retenat bez dodatih metalnih jona (BM). Imunoblotom je pokazano da su se formirale značajne količine novih kompleksa IGFBP-3/Tf od monomera u prisustvu jona Fe 3+, dok je u prisustvu drugih jona taj efekat bio znatno slabiji. Istovremeno sa formiranjem kompleksa, verovatno su dodatno nastali i dimeri IGFBP-3 (traka na molekulskoj masi između markera od 66 i 97 kda). U slučaju inkubacije uzoraka sa Cu 2+ jonima nije detektovana ni jedna proteinska traka (provereno bojenjem membrane sa Ponso S bojom), niti jedan imunoreaktivni molekul. Naknadnom proverom gela, utvrđeno je da je došlo do taloženja proteina u gelu za koncentrovanje. Dalje je testiran efekat različitih koncentracija jona, od sub- do suprafizioloških, za svaki jon pojedinačno. Rezultati su pokazali da nema dozne zavisnosti kada se pređe fiziološka granica koncentracije jona. U slučaju Fe 3+ jona analiziran je uticaj koncentracija µm, a dobijeni su isti kvantitativni rezultati od koncentracije 10 µm. Ovakav rezultat navodi na pitanje da li svi molekuli IGFBP-3 i Tf mogu graditi kompleks ili samo neki sa karakterističnom mikrostrukturom. Eksperimentima koji su opisani u ovom poglavlju je potvrđena specifična uloga jona gvožđa u formiranju kompleksa IGFBP-3/Tf, kao i reaktivnost već formiranog kompleksa sa njima. Na osnovu ovih rezultata se može pretpostaviti da kompleksi IGFBP-3/Tf imaju određenu ulogu u metabolizmu gvožđa i da je kompleks deo fiziološke mreže proteina koji vezuju gvožđe u cirkulaciji, zajedno sa Tf, hemoglobinom i feritinom 67

85 [297]. U prilog ovde prikazanim rezultatima ide rad Weinzimer-a i saradnika, koji su pokazali da je Tf zasićen gvožđem imao veći afinitet prema IGFBP-3 nego holo Tf [200] Ispitivanje glikana na izolovanim IGFBP-3/Tf kompleksima Oba gradivna proteina kompleksa IGFBP-3/Tf su glikoproteini [122, 258]. Poznato je da su glikani odgovorni za tercijarnu strukturu glikoproteina, da su posrednici u interakcijama sa drugim fiziološkim molekulima na površini ćelija (receptorima) koji prepoznaju specifične ugljene hidrate, neki glikani produžavaju poluživot glikoproteina u cirkulaciji (npr. oni sa terminalnom sijalinskom kiselinom), što može imati i pozitivan i negativan opšti efekat (npr. u slučaju tumorskih molekula koji dužim ostankom u telesnim tečnostima podstiču metastazu tumora), a u nekim slučajevima glikani su antigeni [ ]. Uzevši u obzir sve nabrojano, kao i prethodne rezultate dobijene metodom LAC, prema kojima ni jedan od 11 primenjenih lektina nije bio sposoban da veže i izoluje IGFBP-3/Tf komplekse direktno iz seruma, urađena je analiza šećerne komponente izolovanih kompleksa metodom lektinskog blota, koristeći HRPkonjugovane lektine koji su u LAC eksperimentima prepoznali IGFBP-3 i/ili Tf [399]. Rezultati su dobijeni samo u lektinskom blotu sa SNA i ECL, čime je utvrđeno da glikani na kompleksima IGFBP-3/Tf sadrže terminalnu sijalinsku kiselinu i Galβ4GlcNAc (Slika 19, lektinski blot za četiri nezavisna uzorka izolovanih kompleksa). Prisustvo drugih ugljenohidratnih struktura, koje su nađene na monomerima IGFBP-3 i Tf, kao što su biantenarni visokomanozni glikani [400, 401], nije potvrđeno na kompleksima. Slika 19. Lektinski blot IGFBP-3/Tf kompleksa izolovanih imunoprecipitacijom iz uzoraka seruma (Z1-Z4), koristeći SNA, odnosno ECL lektin. 68

86 5.2.3 Ispitivanje nekih fizičko-hemijskih karakteristika izolovanog IGFBP-3/Tf kompleksa metodom SELDI-TOF MS Metoda SELDI-TOF MS se, kao što je već rečeno, zasniva na interakciji ispitivanog proteina sa čipovima različitih reaktivih površina pre jonizacije i fragmentacije [ ]. U ovom radu su analizirani izolovani IGFBP-3/Tf kompleksi koristeći čipove sa pozitivnim (CM10) i negativnim naelektrisanjem (Q10), sa hidrofobnom površinom (H50), kao i čipovi sa imobilizovanim metalnim jonima (IMAC30). Na Slici 20 su prikazani dobijeni maseni spektri za jedan isti uzorak, na četiri vrste čipa. Fragmenti su detektovani u opsegu m/z Kompleksi IGFBP-3/Tf su se vezivali za sve čipove i analizom spektara se moglo zaključiti da je veliki broj fragmenata bio zajednički na svim čipovima. Drugim rečima, pojedinačni molekuli kompleksa imaju svoje pozitivno i negativno naelektrisane domene, kao i hidrofobni domen. Već ranije je ustanovljeno da se kompleksi IGFBP-3/Tf vezuju za metalne jone. Slika 20. SELDI-TOF MS analiza IGFBP-3/Tf kompleksa izolovanih imunoprecipitacijom iz uzoraka seruma, koristeći čipove sa različitim reaktivnim površinama (identitet čipova je naveden na samoj slici). kompleksima Ispitivanje prisustva karbonilnih grupa na izolovanim IGFBP-3/Tf Karbonilne grupe na proteinima mogu biti prisutne kao sastavni deo osnovne strukture polipetidnog lanca (ostaci Asp, Glu, deo peptidne veze), a mogu nastati i oksidacijom aminokiselinskih ostataka već formiranog polipeptida ili oksidativnim 69

87 cepanjem peptidnog lanca [408]. Pošto će u nastavku ovog rada biti ispitivan uticaj oksidativnog stresa kod pacijenata sa tumorom debelog creva na strukturu kompleksa IGFBP-3/Tf, bilo je neophodno utvrditi prisustvo karbonila u kompleksima izolovanim iz seruma zdravih ljudi. Prisustvo karbonila je određivano nakon DNP derivatizacije proteina seruma, a zatim imunoprecipitacije kompleksa IGFBP-3/Tf. Ovaj redosled je bio neophodan (umesto najpre izolovanja, te derivatizacije kompleksa), pošto se derivatizacijom stabilizuju karbonilne grupe, pa se dalje ne menjaju u postupku izolovanja. Istovremeno se izbegava da se oksidativne promene, do kojih može doći u postupku izolovanja, registruju kao primarne u strukturi [164]. DNP derivatizovane grupe su detektovane u imunoblotu sa anti-dnp antitelom (Slika 21, reprezentativni profili derivatizovanih proteina u četiri nezavisna uzorka seruma i u IGFBP-3/Tf kompleksima izolovanih iz ovih seruma). Slika 21. Imunoblot DNP derivatizovanih proteina seruma (A) i izolovanih kompleksa IGFBP-3/Tf (B). Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-dnp antitelom. Uzorci zdravih osoba su izabrani tako da pokazuju opseg dobijenih rezultata. 5.3 Određivanje koncentracije IGFBP-3/Tf kompleksa u serumu zdravih odraslih osoba Koncentracija kompleksa IGFBP-3/Tf određena je merenjem koncentracije IGFBP-3 komercijalnim ELISA testom preparata IGFBP-3/Tf koji je izolovan 70

88 dvostrukom imunoprecipitacijom iz uzoraka seruma zdravih odraslih osoba (n=112). Metoda za izolovanje kompleksa je prethodno optimizovana, tako da je izolovana celokupna količina kompleksa iz date zapremine seruma. Istovremeno su u uzorcima seruma određene koncentracije i odnosi ostalih parametara važnih za metabolizam gvožđa: slobodnih jona gvožđa, Tf, TIBC (ukupni kapacitet vezivanja gvožđa), hemoglobina, feritina, IGFBP-3, ukupnih proteina, odnosa IGFBP-3/Tf. Rezultati su prikazani u Tabeli 5. Tabela 5. Određivanje biohemijskih parametara važnih za metabolizam gvožđa (n=112). Mereni parametar Zdrave osobe (jedinice) (X ± SD) Gvožđe (μm) 18,9 ± 2,82 Referentni opseg Muškarci: Žene: 7 26 Transferin (g/l; mm) 2,8 ± 0,37; 34 ± 4,0 2,0 3,6; TIBC (μm) 61,5 ± 6, Gvožđe/TIBC (% zasićenosti) 31,7 ± 3,1 Hemoglobin (g/l) 133 ± 8,2 Ferritin (mg/l) 74 ± 30,2 Muškarci: Žene: Muškarci: Žene: Muškarci: Žene: 4 82 IGFBP-3 (mg/l; nm) 3,7 ± 0,76; 77 ± 18,6 2,0 7,6; Ukupni proteini (g/l) 77,1 ± 5, IGFBP-3/Tf odnos (mmol/mol) IGFBP-3 u kompleksu sa Tf (μg/l; nm) 2,3 ± 0,56 Nije određen 241 ± 62; 5,4 ± 1,02 Nije određen Određivanjem međusobnog odnosa IGFBP-3 i Tf pokazano je da je koncentracija IGFBP-3 u serumu oko 1000 puta manja od koncentracije Tf, tako da se može zaključiti 71

89 da je IGFBP-3 determinanta koja presuđuje koja će količina kompleksa IGFBP-3/Tf biti formirana. Drugim rečima, koncentraciju kompleksa u serumu treba određivati preko koncentracije IGFBP-3, što je i učinjeno. Takođe, zbog opsega koncentracija koje se mere, test za IGFBP-3 je osetljiviji od testa za Tf. Na osnovu izmerene koncentracije IGFBP-3 u izolovanim kompleksima sa Tf mogao se dalje izarčunati udeo IGFBP-3 u kompleksima u odnosu na ukupni IGFBP-3 u cirkulaciji i on je iznosio 5-7%. Ovaj udeo nije zanemarljiv kad govorimo o fiziološkim uslovima. 5.4 Uticaj intenzivne fizičke aktivnosti na koncentraciju kompleksa IGFBP-3/Tf u serumu zdravih osoba Kod sportista koji redovno treniraju povećava se potreba organizma za kiseonikom, što se u dugotrajnom smislu odražava na zasićenje hemoglobina kiseonikom i koncentraciju hemoglobina, a posredno i na sve ostale proteine koji učestvuju u metabolizmu gvožđa [ , 409, 410]. Podaci koji se odnose na koncentraciju IGF-I i IGFBP-3 su kontradiktorni. Naime, u studijama na sportistima koji su trenirali različite sportove nađena su i povećanja i smanjenja koncentracija IGF-I i IGFBP-3, a po nekim rezultatima uopšte nije bilo promena [ ]. Pokazalo se da su dužina i tip vežbanja (aerobni/anaerobni, vežbe snage/izdržljivosti), vrsta sporta koji se trenira, kao i trenutak uzorkovanja (pre/u toku/posle treninga, posle pauze od par dana u vežbanju, tokom redovne igračke sezone i tokom intenzivnih priprema) od velikog uticaja na rezultate merenja, te da se saznanja o promenama (ili njihovom izostanku) ne smeju uopštavati. Trebalo bi imati u vidu da se tokom vežbanja intenziviraju katabolički procesi praćeni povećanom proteolitičkom, citokinskom i hormonskom aktivnošću, pa je krajnji efekat svakako zbir dugoročnih i trenutnih uticaja. Pošto je fiziološka uloga kompleksa IGFBP-3/Tf nepoznata, a dosadašnji rezultati ovog rada su ukazali na njihovu ulogu u metabolizmu gvožđa, ideja je bila da se ispita da li se koncentracija kompleksa IGFBP-3/Tf u cirkulaciji menja kod sportista u toku velikog fizičkog napora. Kao model grupa analizirane su rukometašice prvoligaškog tima iz Srbije, koje su radile test opterećenja trčanjem na traci. Tokom testa je mereno VO2, a uzorci krvi su vađeni pre testa, kod dostizanja VO2max i 10 minuta nakon testa. Testovi opterećenja i uzorkovanja su urađeni u dve prilike, posle redovne igračke sezone i posle 72

90 mesec dana intenzivnih priprema u kampu, pod nadzorom trenera i lekara. Pri tome, od svake osobe je uzeto šest uzoraka krvi. Antropometrijski parametri rukometašica se nisu značajno promenili posle priprema, kao ni koncentracija gvožđa u serumu, što se vidi iz Tabele 6 (uzorci uzeti pre izvođenja testa opterećenja). Sa druge strane, došlo je do povećanja koncentracije hemoglobina. Pošto su izmerene koncentracije gvožđa pre i posle priprema bile slične, a koncentracija hemoglobina se povećala, može se pretpostaviti da je došlo do povećanja koncentracije gvožđa tokom priprema, ali je ono upotrebljeno za sintezu hemoglobina. Tabela 6. Antropometrijski i biohemijski parametri rukometašica pre i posle priprema na planini. Karakteristika Pre priprema Posle priprema Godine 17 ± 1,1 17 ± 1,2 Visina (cm) 171 ± 7,7 172 ± 7,5 Težina (kg) 65 ± 8,1 66 ± 9,1 BMI (kg/m 2 ) 22 ± 1,2 23 ± 2,2 Procenat masti (%) 23 ± 4,4 22 ± 5,3 Telesna voda (kg) 36 ± 5,2 37 ± 5,2 Koncentracija hemoglobina (g/l) 116 ± 8,2 125 ± 7,9* Koncentracija gvožđa (µm) 13,8 ± 5,53 14,1 ± 6,31 *Statistički značajna razlika između dva termina uzorkovanja (p<0.05). Prisustvo IGFBP-3, Tf i kompleksa IGFBP-3/Tf je praćeno u uzorcima seruma metodom imunoblota. Na Slici 22 su prikazani reprezentativni profili imunoreaktivnih proteina za jednu osobu (uzorci 1-3 su uzeti pre priprema, a 4-6 posle). 73

91 Slika 22. Imunoblot proteina seruma iste osobe pre (1-3) i posle priprema (4-6). Uzorci 1 i 4 su uzeti pre testa opterećenja, 2 i 5 za vreme testa pri dostizanju VO2max, a 3 i 6 10 minuta posle završetka testa. Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti- IGFBP-3, odnosno anti-tf antitelom. Denzitometrijska analiza je pokazala da se koncentracije IGFBP-3 i Tf u uzorcima uzetim pre i posle priprema (upareni uzorci prema periodu uzorkovanja) ne razlikuju značajno. Na Slici 22 se vidi da se koncentracije IGFBP-3 i Tf povećavaju kod maksimalnog opterećenja (uzorci 2 i 5), dok je koncentracija IGFBP-3/Tf kompleksa ostala gotovo nepromenjena tokom testa. Takođe, nije bilo razlike između testa izvedenog pre i posle priprema. Na osnovu ovih rezultata bi se moglo zaključiti da IGFBP-3/Tf kompleks nema ključnu ulogu u metabolizmu gvožđa kod ove grupe sportista. 5.5 Ispitivanje fiziološke uloge kompleksa IGFBP-3/Tf Svi dosadašnji rezultati upućuju na povezanost IGFBP-3/Tf kompleksa i metabolizma gvožđa. Da bi gvožđe moglo da ispuni svoju fiziološku ulogu, pre svega da postane sastavni deo proteinskih kompleksa koji imaju specifične funkcije u organizmu, neophodno ga je transportovati do ćelija u kojima se koristi. Kao što je već rečeno, Tf je glavni nosilac jona gvožđa, a internalizuje se u ćelije posredstvom transferinskog receptora [281]. Ovaj receptor postoji u rastvornom obliku u cirkulaciji i vezan za membrane velikog broja ćelija [ ]. Postoje dva tipa receptora TfR1 i TfR2, koji se ne razlikuju značajno u strukturi. TfR1 je glavni receptor za Tf i njegova uloga u 74

92 internalizaciji Tf je potvrđena. TfR2 je nađen na ćelijama jetre [280], u malom broju u poređenju sa TfR1, i njegova uloga u regulaciji metabolizma gvožđa deluje zanemarljivo. Različite ćelije su sposobne da sintetišu IGFBP-3 i izlučuju ga u okolinu, što je već navedeno u Uvodu [60, ]. Jedna od uloga IGFBP-3, koja nije povezana sa IGF prisustvom, je kontrola i podsticanje apoptoze ćelija kada dođe vreme za njihovo uklanjanje [95, 98, 162, 165, 175]. Pretpostavka je da se IGFBP-3 koji obavlja ovu funkciju doprema u ćeliju iz okoline, mada on ispoljava i autokrino i parakrino dejstvo [ ]. U ćeliji se dalje transportuje do jedra gde utiče na ekspresiju pro-apoptotskih signalnih molekula. Signalni putevi internalizovanog IGFBP-3 vode do aktiviranja retinoidnog X receptora [204, 358], receptora retinolne kiseline [205, 361] ili mehanizama koji se zasnivaju na aktivaciji NFκB i p53 [187, 188, 224, 225]. Ako se podsetimo da je uloga IGFBP-3 kao transportera IGF peptida mitogena i anabolička, a IGF nezavisna uloga pro-apoptotska, molekul IGFBP-3 se može videti kao saobraćajac na raskrsnici biohemijskih puteva koje vode do umnožavanja i rasta ćelija, sa jedne strane, odnosno do ćelijske smrti, sa druge. Koji sve faktori opredeljuju ulogu IGFBP-3 i šta ih kontroliše, ostaje u velikoj meri nepoznanica. U Uvodu je rečeno da više različitih molekula na ćelijskim membranama mogu vezati IGFBP-3 i učestvovati u njegovoj internalizaciji, međutim mehanizmi i značaj interakcija su uglavnom nepoznati (Slika 5) [61, 98, 111, 118, 120, 175, 197]. Nedavno je objavljeno postojanje specifičnog IGFBP-3 receptora, ali iza tog nalaza stoji samo jedna istraživačka grupa i treba sačekati potvrdu rezultata [186]. Jedan od receptora za koji je nađeno da vezuje IGFBP-3 je TfR posredstvom Tf. Direktne interakcije IGFBP-3 i TfR nema [120]. Pošto je pretpostavka da su IGFBP-3/Tf kompleksi povezani sa metabolizmom gvožđa, ideja je bila da se utvrdi u kojoj meri se ovi kompleksi vezuju za TfR na ćelijama, u odnosu na interakcije sa drugim strukturama koje prepoznaju IGFBP- 3. Iako postoje radovi u kojima je dokumentovana interakcija IGFBP-3 i TfR, u svima njima je model sistem ćelijska kultura [120, 200]. Cilj naših istraživanja je bio ispitivanje interakcija na fiziološkom model sistemu, odnosno tkivu čoveka. Izabrano je tkivo debelog creva kao model sistem, s obzirom da epitelne ćelije sintetišu i internalizuju IGFBP-3 i poseduju TfR na membrani [411, 412]. Kao što je opisano u poglavlju Materijal i metode (3.9), zdravo tkivo debelog creva je dobijeno u postupku odstranjivanja tumora debelog creva pacijentima sa kolorektalnim karcinomom (CRC). Odsustvo tumorskih ćelija u tkivu je potvrđeno histopatološkom analizom u KBC Bežanijska kosa. 75

93 5.5.1 Ispitivanje interakcije IGFBP-3/Tf kompleksa sa receptorima na zdravom tkivu debelog creva Da bi se ispitala interakcija IGFBP-3/Tf sa TfR, primenjena su dva pristupa: imunoprecipitacija sa imobilizovanim anti-tfr1 antitelom i dvostepeno imunohistohemijsko bojenje tkivnih isečaka koristeći primarna anti-igfbp-3 i anti-tfr1 antitela i dva sekundarna antitela konjugovana sa dve različite fluorofore. Imunoprecipitacijom su odvojeno analizirane solubilizovane ćelijske membrane i citosolna frakcija, koji su dobijeni nakon homogenizacije tkiva debelog creva i diferencijalnog centrifugiranja. Imunohistohemijsko bojenje je urađeno na parafinskim isečcima tkiva istih osoba. Pre ovih eksperimenata urađen je imunoblot membranske i citosolne frakcije, da se potvrdi prisustvo IGFBP-3, Tf i TfR1 (Slika 23, reprezentativni imunoblotovi za četiri nezavisna uzorka). Imunoblot je dokazao prisustvo monomera IGFBP-3 i Tf, kao i TfR1, dok kompleksi IGFBP-3/Tf nisu bili vidljivi. Iz ovih rezultata se moglo pretpostaviti da kompleksa nema, ili je njihova koncentracija jako mala i ispod detekcionog limita metode imunoblota. Slika 23. Imunoblot membranske (A-C) i citosolne (D-F) frakcije ćelija izolovanih iz netumorskog (zdravog) tkiva debelog creva. Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3 (A, D), anti-tf (B, E), odnosno anti-tfr antitelima (C, F). 76

94 Za potrebe eksperimenta imunoprecipitacije, anti-tfr1 antitela su imobilizovana na smoli iz kompleta Pierce Co-Immunoprecitation i omogućeno je proteinima iz membranske i citosolne frakcije da interaguju (iste polazne koncentracije). U eluatu sa smole je imunoblotom detektovano prisustvo IGFBP-3, Tf i TfR1 (Slika 24, zbirni uzorak za sva tkiva). Slika 24. Dot blot citosolne i membranske frakcije ćelija izolovanih iz netumorskog (zdravog) tkiva debelog creva. Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti- IGFBP-3, anti-tf, odnosno anti-tfr antitelima. Sa slike se vidi da je (očekivano) neuporedivo više TfR1 na membrani nego u citosolu (frakcija internalizovanih TfR1), da je zasićenje membranskih receptora sa Tf neuporedivo manje nego u slučaju citosolnih TfR1 (internalizuju se receptori tek po vezivanju Tf) i da je u oba slučaja prisutan IGFBP-3 (znatno više u citosolu, u kompleksu sa Tf). U eksperimentima imunohistohemijske detekcije, na tkivnim preparatima je dvostepeno testirano prisustvo IGFBP-3, uz primarna kozija antitela i sekundarna antikoziji IgG antitela konjugovana sa fluorescentnom bojom AlexaFluor 488 (emisija zelene svetlosti), a zatim prisustvo TfR1, uz primarna kunićeva antitela i sekundarna antikunić IgG antitela konjugovana sa fluorescentnom bojom AlexaFluor 555 (emisija crvene svetlosti). Koristeći imunofluorescenti mikroskop, nezavisno je detektovan položaj IGFBP-3 i TfR1 molekula, a zatim su polja preklopljena dajući žuto-narandžasti signal na mestima ko-lokalizacije IGFBP-3 i TfR1 (Slika 25, reprezentativni prikaz za isti tkivni preparat). Uočen je veliki stepen ko-lokalizacije ova dva molekula na ćelijskom nivou (na membranama i unutar ćelija), što upućuje na pretpostavku da je put 77

95 internalizacije kompleksa IGFBP-3/Tf pretežno preko TfR1, ali i da je vezivanje egzogenog IGFBP-3 za ćeliju u najvećoj meri preko ovog kompleksa, a ne preko drugih struktura koje prepoznaju IGFBP-3 (slab fluorescentni signal IGFBP-3 nezavisan od TfR1). Prisustvo Tf nije dokazano, pošto se IGFBP-3 može vezati za TfR samo posredstvom Tf, te se ono u ovom slučaju podrazumevalo. Radi provere nespecifičnih interakcija, kontrolni isečci su inkubirani sa odgovarajućim ne-imunim serumom, umesto primarnih antitela, a rezultat je bio potpuno odsustvo fluorescentnog signala. Slika 25. Imunohistohemijska detekcija prisustva IGFBP-3 i TfR1 u netumorskom (zdravom) tkivu debelog creva i potvrda njihove ko-lokalizacije (označeno strelicama). Razmerna crta predstavlja dužinu od 20 μm. Poslednja serija eksperimenata potvrdila je da IGFBP-3/Tf kompleksi obavljaju svoju funkciju posredstvom TfR1 i da je ispoljavaju u sinhronizaciji sa Tf. Da bi se ovi nalazi potvrdili, dalje su rađeni eksperimenti koristeći uzorke osoba sa poremećajem u metabolizmu gvožđa. Pošto je imunohistohemijski ustanovljeno da se ulazak IGFBP-3 u ćeliju odvija prvenstveno preko TfR1 kao medijatora, dalje je ispitana raspodela receptora i kompleksa u tkivu koje potiče od tumora debelog creva. 5.6 Ispitivanje promene strukture i distribucije IGFBP-3/Tf kompleksa kod osoba u određenim patofiziološkim stanjima U daljem radu su ispitane promene u strukturi i distribuciji IGFBP-3/Tf kompleksa kod osoba sa izrazito malom ili velikom koncentracijom gvožđa u serumu. 78

96 Izabrane su grupe ljudi koje nisu imale druge promene u organizmu, a kod osoba sa velikom koncentracijom gvožđa (znatno iznad referentne vrednosti) izabrane su osobe kod kojih još uvek nije došlo do patofizioloških promena tipa hemohromatoze. Na ovaj način je izbegnut mogući uticaj promena na drugim organima (npr. na jetri), što bi se moglo odraziti na IGFBP-3/Tf komplekse kao posledica kombinovanog efekta. Pored uzoraka osoba sa izraženom anemijom, analizirani su i uzorci osoba sa tumorom debelog creva, serum i tkivo. Pacijenti sa tumorom debelog creva često imaju krvarenja, smanjena im je apsorpcija hranljivih materija u gastointestinalnom traktu, mogu imati fizičke teškoće pri gutanju, bolove, povraćanje, gubitak apetita [ ]. Česta posledica je anemija. U odnosu na običnu anemiju, kod ovih pacijenata se aktivira veliki broj biohemijskih puteva kao deo stresnog kataboličkog stanja. Tumorske ćelije debelog creva se dele drugačijom brzinom od zdravih, eksprimiraju drugačiji odnos membranskih i unutarćelijskih molekula [ ], te je cilj dela eksperimenata bio da ispita prisustvo IGFBP-3/Tf kompleksa i interakciju sa TfR1 u uzorcima tumora Isptivanje promene koncentracije IGFBP-3/Tf kompleksa u cirkulaciji osoba sa izmenjenim metabolizmom gvožđa Kao što je gore navedeno, analizirani su serumi osoba sa anemijom, sa velikom koncentracijom gvožđa i serumi pacijenata sa anemijom izazvanom postojanjem tumora debelog creva. U Tabeli 7 su prikazani izmereni parametri važni za metabolizam gvožđa. Ovi rezultati su upoređivani sa rezultatima dobijenim kod zdrave populacije (Tabela 5), kao i međusobno. Podaci za koncentraciju IGFBP-3/Tf su dobijeni iz imunoprecipitata, na isti način kao i kod zdravih osoba. Statistički značajne razlike su označene. Tabela 7. Koncentracije i relativni odnosi biohemijskih parametara u cirkulaciji osoba sa povišenom koncentracijom gvožđa (n=39), osoba sa anemijom (n=55) i osoba sa dijagnostikovanim CRC (n=97). Rezultati su dati kao srednja vrednost ± SD. Parametar Osobe sa velikom Osobe sa Osobe sa (jedinice) koncentracijom gvožđa anemijom dijagnozom CRC Gvožđe (μm) 40,8 ± 3,46* 3,1 ± 0,87*, ** 5,0 ± 1,55* TIBC (μm) 51,9 ± 6,85 69,6 ± 13,34*, ** 30.6 ± 5,36*, *** 79

97 Gvožđe/TIBC (% zasićenosti) 83 ± 8,0* 4,0 ± 1,7*, ** 15 ± 4,3*, *** Hemoglobin (g/l) 141,0 ± 11,7* 94,0 ± 16,8*, ** 85 ± 13,4*, *** Feritin (mg/l, 7 ± 5,4; 16 ± 246 ± 103,4; ± 58,4; 240 ± 128.8* nm) 11,0*, ** ± 228, 9*, *** Ukupni proteini (g/l) 73,4 ± 7,95 70,8 ± 6,88 52,9 ± 5,4 *, *** Transferin (g/l, 3,8 ± 0,38; 48.7 ± 1,3 ± 0.29; 14.3 ± 2,3 ± 0,43; 28,6 ± 6,39 mm) 5,99*, ** 4,95*, *** IGFBP-3 (mg/l, 3,8 ± 0,55; 85 ± 1,9 ± 0,36; 40 ± 4,2 ± 0,66; 96 ± 14,0 μm) 13,2 7,6*, *** IGFBP-3/Tf odnos (mmol/mol) 3,2 ± 0,69* 1,7 ± 0,30*, ** 3,0 ± 0,71*** IGFBP-3 u 215 ± 25; 4,6 ± 80 ± 22; 1,8 ± kompleksu sa Tf 279 ± 34; 6.2 ± 0,76 0,56** 0,48*, *** (mg/l, nm) *Statistički značajna razlika između zdrave populacije i posmatrane grupe (p<0.05). **Statistički značajna razlika između osoba sa velikom koncentracijom gvožđa i anemijom (p<0.05). ***Statistički značajne razlika između pacijenata sa CRC i osoba sa anemijom (p<0.05). Kao što se iz Tabele 7 može videti, kod osoba sa velikom koncentracijom gvožđa povećana je bila koncentracija hemoglobina i feritina, a smanjen je ukupni kapacitet vezivanja gvožđa (TIBC) i Tf. Shodno tome, zasićenje Tf gvožđem (izraženo preko odnosa Fe/TIBC) je bilo povećano. Ovakvi rezultati ukazuju na očekivan odgovor organizma na veliku koncentraciju gvožđa [315]. Koncentracija ukupnih proteina nije značajno promenjena, a koncentracija IGFBP-3 je bila nešto veća nego kod kontrolne grupe. Krajnji rezultat kombinacije svih navedenih parametara je bio povećan odnos IGFBP-3:Tf i nešto veća koncentracija IGFBP-3/Tf kompleksa (mada ne statistički značajno). 80

98 Kod osoba sa anemijom, očekivano je bila smanjena koncentracija hemoglobina i feritina, a povećana Tf i, shodno tome, TIBC [ ]. Koncentracija ukupnih proteina i IGFBP-3 je bila nepromenjena u poređenju sa kontrolnom grupom. Stepen zasićenja Tf gvožđem je bio višestruko smanjen, kao i odnos IGFBP-3:Tf i koncentracija kompleksa IGFBP-3/Tf. Upoređivanjem prethodne grupe i ove, ustanovljena je značajna razlika u koncentraciji IGFBP-3/Tf kompleksa, uz nepromenjenu koncentraciju IGFBP-3 i desetostruko manju koncentraciju gvožđa. S obzirom da Tf molekula ima oko 1000 puta više nego IGFBP-3 u cirkulaciji, ovi rezultati potvrđuju na fiziološkom nivou da je koncentracija kompleksa IGFBP-3/Tf direktno zavisna od koncentracije gvožđa. Kod treće grupe ispitanika, očigledno je došlo do smanjene sinteze proteina u jetri i/ili njihovog gubitka (krvarenje, povraćanje), pošto je osim pada ukupnih proteina smanjena koncentracija IGFBP-3 i Tf (koji je, inače, i negativni pokazatelj akutne faze) [424]. Ovi pacijenti, za razliku od osoba sa anemijom, imaju znatno povećanu koncentraciju feritina, koji je i akutno fazni reaktant i marker funkcije jetre [425, 426]. Rezultat disproporcije proteina daje odnos IGFBP-3:Tf veći nego kod osoba sa anemijom, ali je koncentracija IGFBP-3/Tf kompleksa trostruko manja. Iz ovih rezultata se može zaključiti da osim gvožđa, na koncentraciju IGFBP-3/Tf kompleksa značajno utiče i koncentracija IGFBP-3. Iako kompleksi količinski čine samo nekoliko procenata ukupnog IGFBP-3, pa teorijski koncentracija kompleksa ne bi morala biti u tolikoj meri smanjena, pretpostavka je da se porastom koncentracije feritina menja ravnoteža u distribuciji gvožđa. Feritin je protein koji može vezati čak 4500 jona gvožđa [298], te i mala promena u njegovoj koncentraciji (a kod ovih pacijenata je velika) značajno utiče na raspoloživost gvožđa. Da bi se potvrdila ovako velika razlika u koncentraciji IGFBP- 3 i Tf kod pacijenata sa CRC, urađen je imunoblot seruma (Slika 26, četiri nezavisna uzorka seruma iz grupe zdravih ljudi i pacijenata sa CRC). 81

99 Slika 26. Imunoblot seruma zdravih osoba (Z) i pacijenata sa tumorom debelog creva (T). Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3 (A), odnosno anti-tf antitelom (B). Profil reprezentativnih uzoraka ukazuje na opseg dobijenih rezultata Isptivanje promene strukture IGFBP-3/Tf kompleksa i reaktivnosti IGFBP-3 u cirkulaciji osoba sa tumorom debelog creva Pacijenti sa tumorom debelog creva su pod povećanim oksidativnim stersom [427, 428], zbog izraženog katabolizma izmenjena je sinteza proteina u jetri (količina, a moguće i post-translaciona dorada peptida) [429], a zbog povećanog otpuštanja proteaza i drugih enzima iz ćelija [423, 430] dolazi do naknadnih modifikacija proteina u samoj cirkulaciji. Svi ovi uticaji se mogu odraziti na strukturu IGFBP-3/Tf kompleksa. Kompleksi IGFBP-3/Tf, koji su izolovani imunoprecipitacijom iz seruma pacijenata sa tumorom debelog creva, su analizirani imunoblotom, lektinskim blotom i metodom SELDI-TOF MS. Na Slici 27 su prikazani rezultati IGFBP-3 imunoblota, SNA i ECL lektinskog blota, DNP imunoblota (po četiri nezavisna uzorka iz grupe zdravih ljudi i pacijenata sa CRC) i SELDI-TOF MS spektri (po jedan reprezentativni uzorak iz svake grupe). 82

100 Slika 27. IGFBP-3 imunoblot (A), SNA (B) i ECL lektin blot (C), DNP imunoblot (D) i SELDI-TOF MS spektri na čipovima Q10 (E), CM10 (F), IMAC30 (G) i H50 (H) IGFBP-3/Tf kompleksa izolovanih iz seruma zdravih osoba (Z) i pacijenata sa tumorom debelog creva (T). Kompleksi IGFBP-3/Tf izolovani iz seruma pacijenata, kojih je bilo manje nego u izolatima zdravih ljudi (Slika 27A), su u većoj meri interagovali sa lektinima SNA i ECL (ka 27B i C), ukazujući na povećano prisustvo terminalne sijalinske kiseline i disaharida Galβ4GlcNAc. Ovi kompleksi su, takođe, u proseku bili jače prepoznati anti-dnp antitelima nakon derivatizacije (Slika 27D). Prilikom SELDI-TOF MS analize, uočena je razlika u reaktivnosti kompleksa iz dve grupe ispitanika. Prisustvo fragmenata iz kompleksa pacijenata bilo je značajno manje u slučaju anjonskog (Slika 27E) i katjonskog čipa (Slika 27F), što ukazuje na smanjen sadržaj naelektrisanih grupa. Sa druge strane, na metal-afinitetnom čipu (Slika 27G) rezultat je bio obrnut, ukazujući na veću reaktivnost kompleksa iz uzoraka pacijenata sa metalnim jonom. Razlike između dve grupe uzoraka nije bilo na hidrofobnom čipu (Slika 27H), što bi moglo značiti da je hidrofobni region očuvan i/ili da je manje podložan strukturnim promenama. Sve uočene razlike su kvantitativno prikazane u Tabeli 8 (izražene preko denzitomerijskih jedinica, DJ). Pošto uloga kompleksa IGFBP-3/Tf još nije dokazana, jedini način da se ispita uticaj svih navedenih strukturnih promena na proteine je na nivou poznate funkcije 83

101 pojedinačnih komponenti kompleksa. U ovom radu izabran je metod ligand blota koristeći serume dve grupe ispitanika i 125 I-IGF-I. Praćena je reaktivnost monomera IGFBP-3 (40-45 kda) sa obeleženim ligandom (Slika 28, po četiri reprezentativna uzorka). Denzitometrijska analiza traka je pokazala da je vezivanje 125 I-IGF-I oko 9 puta manje za IGFBP-3 iz seruma pacijenata nego iz seruma zdavih ljudi. Pošto je pad ukupne koncentracije IGFBP-3 u serumu pacijenata sa tumorom debelog creva manji (Tabela 7, Slika 26) od pada reaktivnosti (u relativnim odnosima), može se zaključiti da posttranslacione modifikacije drastično menjaju funkciju IGFBP-3, te vrlo verovatno i kompleksa u čijem je sastavu. Slika 28. Ligand blot seruma zdravih osoba (Z) i pacijenata sa tumorom debelog creva (T). Reaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa 125 I-IGF-I. 84

102 Tabela 8. Relativni odnosi IGFBP-3/Tf kompleksa izolovanih metodom imunoprecipitacije (ukupni, lektin-reaktivni i karbonilovani) i relativno prisustvo karakterističnih fragmenta detektovanih metodom SELDI-TOF MS koristeći različite čipove. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SD. Relativna količina IGFBP-3/Tf kompleksa Zdrave osobe n=25 Pacijenti sa CRC n=45 Ukupna količina kompleksa (DJ) 233 ± 44,1 181 ± 19,3* SNA-reaktivni kompleksi (DJ) 74 ± 10,3 103 ± 7,2* ECL-reaktivni kompleksi (DJ) 115 ± 37,1 205 ± 16,4* Karbonilovani kompleksi (DJ) 52 ± 38,0 147 ± 64,6* Relativna količina IGFBP-3/Tf fragmentana u SELDI-TOF MS Zdrave osobe n=25 Pacijenti sa CRC n=45 Q10-reaktivni fragment 1 (DJ) 798 ± 32,0 475 ± 145,5* CM10-reaktivni fragment 1 (DJ) 200 ± 27,0 151 ± 12,5* IMAC30-reaktivni fragment 1 (DJ) 190 ± 20,0 231 ± 31,1* H50-reaktivni fragment 1 (DJ) 118 ± 20,5 120 ± 18,7 Q10-reaktivni fragment 2 (DJ) 478 ± 88,8 250 ± 99,7* CM10-reaktivni fragment 2 (DJ) 655 ± 133,2 438 ± 102* IMAC30-reaktivni fragment 2 (DJ) 841 ± 111, ± 204,4* H50-reaktivni fragment 2 (DJ) 716 ± 82,3 707 ± 64,1 *Statistički značajna razlika između zdrave populacije i pacijenata sa tumorom debelog creva (p<0.05). 85

103 5.6.3 Ispitivanje promene strukture i distribucije IGFBP-3/Tf kompleksa u tkivu debelog creva pacijenata sa tumorom Prisustvo kompleksa IGFBP-3/Tf u tumorskom tkivu debelog creva i interakcija sa TfR1 su ispitivani na isti način kao kod netumorskog uzorka: imunoblotom, imunoprecipitacijom sa anti-tfr1 antitelom i imunohistohemijski (poglavlje 5.5.1). Pored toga, ispitan je i stepen karbonilovanja proteina tkiva debelog creva, da se utvrdi u kojoj meri su oni izloženi oksidativnom stresu. Tumorsko i netumorsko tkivo je dobijeno od iste osobe, a iz svakog uzorka je nezavisno analizirana membranska i citosolna frakcija. Rezultati IGFBP-3, Tf i TfR1 imunoblota su prikazani na Slici 29 (po četiri para uzoraka), rezultati imunoprecipitacije i dot blota sa anti-igfbp-3, anti-tf i anti-tfr1 antitelima dati su na Slici 30 (zbirni uzorak za membranske i citosolne preparate tumorskih i netumorskih tkiva), a rezultati imunohistohemijskog bojenja su prikazani na Slici 31 (reprezentativni uzorak tumorskog tkiva, iste osobe čije je netumorko tkivo prikazano na Slici 25). DNP imunoblot derivatizovanog tkivnog proteoma je prikazan na Slici 32 (po četiri para uzoraka). Slika 29. Imunoblot membranske (A-C) i citosolne (D-F) frakcije ćelija izolovanih iz netumorskog (zdravog) i tumorskog tkiva debelog creva (tkiva su prikazana u paru za istu osobu). Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3 (A, D), anti- Tf (B, E), odnosno anti-tfr antitelima (C, F). 86

104 - Slika 30. Dot blot citosolne i membranske frakcije ćelija izolovanih iz netumorskog (zdravog) i tumorskog tkiva debelog creva (tkiva su prikazana u paru za istu osobu). Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-igfbp-3 (A), anti-tf (B), odnosno anti-tfr antitelima (C). Slika 31. Imunohistohemijska detekcija prisustva IGFBP-3 i TfR1 u tumorskom tkivu debelog creva i potvrda njihove ko-lokalizacije (označeno strelicama). Razmerna crta predstavlja dužinu od 20 μm. 87

105 Slika 32. Imunoblot DNP derivatizovanih proteina netumorskog (zdravog) i tumorskog tkiva debelog creva (tkiva su prikazana u paru za istu osobu). Imunoreaktivni proteini su prepoznati u interakciji sa anti-dnp antitelom. Denzitometrijskom analizom IGFBP-3, Tf, TfR1 i DNP imunoblotova (Slike 29 i 32) dobijeni su kvantitativni podaci, koji su prikazani u Tabeli 9. Statistička obrada rezultata nije ukazala na značajnu razliku između tumorskih i netumorskih uzoraka za IGFBP-3 i Tf, dok je primećeno karakteristično odsustvo TfR1 trake na imunoblotu za citosol. Imunoprecipitacijom sa anti-tfr1 antitelom je potvrđeno prisustvo IGFBP-3 u kompleksu, u sličnim kvantitativnim odnosima IGFBP-3:Tf:TfR1 u citosolu tumorskog i netumorskog tkiva, dok je na membranama ćelija tumora uočen veći stepen zasićenja receptora samim Tf, ali ne i kompleksom (Slika 30). Sličan je bio intenzitet signala za IGFBP-3 u oba tipa membranskih uzoraka. Imunohistohemijski je potvrđena kolokalizacija IGFBP-3 i TfR1 i u tumorskom tkivu (Slika 31), ali bez statistički značajne razlike u stepenu prisustva između dve grupe uzoraka (Tabela 9). Stepen prisustva je određen upoređivanjem intenziteta signala (gradacijom) na standardni način. Uočeno je da su kompleksi u većoj meri lokalizovani na površini ćelija (strelice na Slici 31). Na kraju, DNP imunoblot je pokazao da je skoro tri puta više proteinskih karbonilnih grupa u uzorcima tumorskog nego netumorskog tkiva (Slika 32 i Tabela 9). 88